JP6460104B2 - Measuring chip, measuring method and measuring device - Google Patents
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Description
本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定する測定方法および測定装置、ならびにこの測定方法および測定装置に用いられうる測定チップに関する。 The present invention relates to a measurement method and a measurement apparatus that measure the amount of a substance to be measured in a specimen including at least a part of blood using surface plasmon resonance, and a measurement chip that can be used in the measurement method and the measurement apparatus. .
臨床検査などにおいて、血液中のタンパク質やDNAなどの微量の被測定物質を高感度かつ定量的に測定することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、血液中の被測定物質を高感度かつ定量的に測定できる方法が求められている。 In a clinical test or the like, if a minute amount of a substance to be measured such as protein or DNA in blood can be measured highly sensitively and quantitatively, it becomes possible to quickly grasp the patient's condition and perform treatment. Therefore, there is a need for a method that can measure a substance to be measured in blood with high sensitivity and quantitative.
血液中の被測定物質を高感度に測定できる方法として、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance:以下「SPR」と略記する)法および表面プラズモン励起増強蛍光分光法(Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy:以下「SPFS」と略記する)が知られている。これらの方法では、所定の条件で光を金属膜に照射すると表面プラズモン共鳴(SPR)が生じることを利用する(例えば特許文献1参照)。 Surface plasmon resonance (SPR) method and surface plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy (hereinafter referred to as “Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy”) (Abbreviated as “SPFS”). These methods utilize the fact that surface plasmon resonance (SPR) occurs when a metal film is irradiated with light under predetermined conditions (see, for example, Patent Document 1).
たとえば、SPFSでは、被測定物質に特異的に結合できる捕捉体(例えば1次抗体)を金属膜上に固定化して、被測定物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被測定物質を含む検体(例えば血液)を提供すると、被測定物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された捕捉体(例えば2次抗体)を反応場に提供すると、反応場に結合した被測定物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被測定物質を標識する蛍光物質は、SPRにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被測定物質の存在またはその量を検出することができる。SPFSでは、SPRにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被測定物質を測定することができる。 For example, in SPFS, a capture body (for example, a primary antibody) that can specifically bind to a substance to be measured is immobilized on a metal film to form a reaction field for specifically capturing the substance to be measured. When a specimen (for example, blood) containing a substance to be measured is provided in the reaction field, the substance to be measured is bound to the reaction field. Next, when a capture body (for example, a secondary antibody) labeled with a fluorescent substance is provided to the reaction field, the substance to be measured bound to the reaction field is labeled with the fluorescent substance. When the metal film is irradiated with excitation light in this state, the fluorescent substance that labels the substance to be measured is excited by the electric field enhanced by SPR and emits fluorescence. Therefore, the presence or amount of the substance to be measured can be detected by detecting the fluorescence. In SPFS, a fluorescent substance is excited by an electric field enhanced by SPR, so that a substance to be measured can be measured with high sensitivity.
一方、SPR法やSPFSなどに限らず、各種測定方法で液体中の被測定物質を測定する場合、通常、測定値は、液体の単位体積当たりの被測定物質の質量や、それに相当するシグナル量などで示される。したがって、検体として血液を用いる場合、測定値は、血液中の液体成分(血漿または血清)の単位体積当たりの被測定物質の質量や、それに相当するシグナル量などで示される。血液中の液体成分の割合は個々人で異なるため、血液の測定値を一律に液体成分の測定値に変換することはできない。このため、検体として血液を用いる場合は、その血液のヘマトクリット値(血液中の血球の体積の割合)を測定し、ヘマトクリット値を用いて血液の測定値を液体成分(血漿または血清)の測定値に変換することが行われている。従来のヘマトクリット値の測定方法としては、血液を遠心分離するミクロヘマトクリット法や溶血させた血液のヘモグロビン濃度からヘマトクリット値を求める方法(例えば特許文献2参照)などがある。 On the other hand, when measuring a substance to be measured in a liquid by various measuring methods, not limited to the SPR method and SPFS, the measured value is usually the mass of the substance to be measured per unit volume of the liquid and the signal amount corresponding thereto. Etc. Therefore, when blood is used as the specimen, the measured value is indicated by the mass of the substance to be measured per unit volume of the liquid component (plasma or serum) in the blood, the signal amount corresponding thereto, and the like. Since the ratio of the liquid component in the blood varies from person to person, the blood measurement value cannot be uniformly converted into the liquid component measurement value. For this reason, when blood is used as a specimen, the hematocrit value (ratio of the volume of blood cells in the blood) of the blood is measured, and the blood measurement value is measured using the hematocrit value as the measurement value of the liquid component (plasma or serum). The conversion is done. As a conventional method for measuring a hematocrit value, there are a microhematocrit method for centrifuging blood, a method for obtaining a hematocrit value from a hemoglobin concentration of hemolyzed blood (for example, see Patent Document 2), and the like.
SPR法やSPFSなどのSPRを利用する測定方法および測定装置において、上記従来のヘマトクリット値の測定方法を採用すると、遠心分離機やヘモグロビン濃度の測定装置などのヘマトクリット値を測定するための装置を新たに用意しなければならず、製造コストおよび測定コストが増大してしまう。 In the measuring method and measuring apparatus using SPR such as SPR method and SPFS, when the above conventional method for measuring hematocrit is adopted, a new apparatus for measuring hematocrit value such as a centrifuge or a hemoglobin concentration measuring apparatus is newly provided. Therefore, the manufacturing cost and the measurement cost increase.
本発明の第1の目的は、SPRを利用する測定方法および測定装置であって、新たな装置を追加することなく、ヘマトクリット値などの血液の内容物の特定値を用いて測定値の補正を行うことができる測定方法および測定装置を提供することである。また、本発明の第2の目的は、この測定方法および測定装置に用いられうる測定チップを提供することである。 A first object of the present invention is a measurement method and a measurement device using SPR, and corrects a measurement value using a specific value of a blood content such as a hematocrit value without adding a new device. It is to provide a measurement method and a measurement apparatus that can be performed. The second object of the present invention is to provide a measuring chip that can be used in this measuring method and measuring apparatus.
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定する方法であって、入射面、出射面および成膜面を有する誘電体のプリズムと、前記成膜面上に配置され、前記検体を収容するための収容部と、前記成膜面上に離間して配置され、少なくとも1つに捕捉体が固定されているとともに少なくともその一部が前記収容部内に露出している複数の金属膜とを有する測定チップに、前記検体を提供して前記被測定物質を前記捕捉体に結合させる工程と、前記複数の金属膜のうち、前記収容部内に露出している2つの金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記2つの金属膜の間に電圧を印加することで前記検体の電気的特性を測定し、得られた測定値を用いて前記検体における血液の内容物の特定値を求める工程と、前記被測定物質と前記捕捉体とが結合した状態であって、かつ前記収容部に前記検体が存在しない状態で、前記入射面を介して前記捕捉体が固定されている領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射して、励起された蛍光物質から放出された蛍光の光量、または前記成膜面で反射され前記出射面から出射された励起光の光量を測定して、前記検体中の前記被測定物質の量を示す第1のシグナル値を得る工程と、前記血液の内容物の特定値を用いて、前記第1のシグナル値を、前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第2のシグナル値に変換する工程と、を含む。 In order to solve the above problems, a measurement method according to an embodiment of the present invention is a method for measuring the amount of a substance to be measured in a specimen including at least a part of blood using surface plasmon resonance. A dielectric prism having an entrance surface, an exit surface, and a film formation surface; and a storage unit disposed on the film formation surface, for accommodating the specimen, and spaced apart on the film formation surface, The sample is provided to a measurement chip having at least one capture body fixed and a plurality of metal films, at least a part of which is exposed in the housing portion, and the target substance is captured by the capture body. A voltage between the two metal films in a state in which the specimen exists on and between the two metal films exposed in the housing portion among the plurality of metal films. Applying electricity to the specimen Measuring the characteristics, obtaining the specific value of the blood content in the specimen using the obtained measurement value, and the state in which the substance to be measured and the capturing body are combined, and in the container In the absence of the specimen, the back surface of the metal film corresponding to the region where the capturing body is fixed is irradiated through the incident surface, and excitation light is irradiated to emit fluorescence emitted from the excited fluorescent material. Measuring the amount of light or the amount of excitation light reflected from the film formation surface and emitted from the exit surface to obtain a first signal value indicating the amount of the substance to be measured in the sample; and the blood Converting the first signal value into a second signal value indicating the amount of the substance to be measured in the liquid component of the specimen using the specific value of the content of
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定チップは、表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定するためのチップであって、入射面、出射面および成膜面を有する誘電体のプリズムと、前記成膜面上に配置され、前記検体を収容するための収容部と、前記成膜面上に離間して配置され、少なくとも1つに捕捉体が固定されているとともに少なくともその一部が前記収容器内に露出している複数の金属膜と、を有する。 In order to solve the above problems, a measurement chip according to an embodiment of the present invention is a chip for measuring the amount of a substance to be measured in a specimen including at least a part of blood using surface plasmon resonance. A dielectric prism having an entrance surface, an exit surface, and a film formation surface; an accommodation portion disposed on the film formation surface for accommodating the specimen; and spaced apart on the film formation surface. And a plurality of metal films having a capturing body fixed to at least one and at least a part of which is exposed in the container.
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定装置は、表面プラズモン共鳴を利用して、血液の少なくとも一部を含む検体中の被測定物質の量を測定するための装置であって、入射面、出射面および成膜面を有する誘電体のプリズムと、前記成膜面上に配置され、前記検体を収容するための収容部と、前記成膜面上に離間して配置され、少なくとも1つに捕捉体が固定されているとともに少なくともその一部が前記収容部内に露出している複数の金属膜とを有する測定チップを、保持するためのホルダーと、前記収容部内に露出している2つの金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記2つの金属膜の間に電圧を印加することで前記検体の電気的特性を測定する電気的特性測定部と、前記入射面に向かって光を照射する光照射部と、前記被測定物質と前記捕捉体とが結合した状態であって、かつ前記収容部に前記検体が存在しない状態で、前記入射面を介して前記捕捉体が固定されている領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射して、励起された蛍光物質から放出された蛍光の光量、または前記プリズムの前記成膜面で反射され前記出射面から出射された励起光の光量を検出する光検出部と、前記光検出部の検出結果に基づいて前記検体中の前記被測定物質の量を示す第1のシグナル値を算出し、かつ前記電気的特性測定部の測定結果に基づいて前記血液の内容物の特定値を算出するとともに、前記血液の内容物の特定値を用いて前記第1のシグナル値を前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第2のシグナル値に変換する処理部と、を有する。 In order to solve the above problems, a measuring apparatus according to an embodiment of the present invention is an apparatus for measuring the amount of a substance to be measured in a specimen including at least a part of blood using surface plasmon resonance. A dielectric prism having an entrance surface, an exit surface, and a film formation surface; an accommodation portion disposed on the film formation surface for accommodating the specimen; and spaced apart on the film formation surface. A holder for holding a measuring chip having a plurality of metal films having a capturing body fixed to at least one and at least a part of which is exposed in the housing, and exposed in the housing An electrical property measuring unit for measuring electrical properties of the specimen by applying a voltage between the two metallic films in a state where the specimen is present on and between the two metallic films. Toward the entrance surface The capturing body is fixed via the incident surface in a state where the light irradiation section for irradiating the target substance, the substance to be measured and the capturing body are combined, and the specimen is not present in the housing section. The back surface of the metal film corresponding to the region is irradiated with excitation light, and the amount of fluorescent light emitted from the excited fluorescent material or reflected from the film formation surface of the prism and emitted from the emission surface A light detection unit for detecting the amount of excitation light; a first signal value indicating the amount of the substance to be measured in the sample based on a detection result of the light detection unit; and the electrical characteristic measurement unit The specific value of the blood content is calculated based on the measurement result of the above, and the first signal value is calculated using the specific value of the blood content and the amount of the substance to be measured in the liquid component of the specimen To convert to a second signal value indicating It has a part, a.
本発明によれば、SPRを利用する測定方法および測定装置において、新たな装置を追加することなく、かつ測定時間の遅延を生じさせることなく、血液の内容物の特定値を利用して被測定物質の量を正確に測定することができる。 According to the present invention, in a measurement method and a measurement device using SPR, measurement is performed by using a specific value of the contents of blood without adding a new device and causing a delay in measurement time. The amount of substance can be accurately measured.
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定装置の代表例として、血液の少なくとも一部を含む検体に含まれる被測定物質の量を測定する表面プラズモン励起増強蛍光分析装置(SPFS装置)について説明する。本実施の形態では、血液の内容物の特定値として、血液のヘマトクリット値を求める場合について説明する。また、血液のヘマトクリット値を求めるための検体の電気的特性として、検体のインピーダンスの測定を行うSPFS装置について説明する。検体の例には、血液(分離および希釈をしていない血液)、血漿、血清、これらの希釈液が含まれる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. Here, as a representative example of the measuring apparatus according to the present invention, a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) that measures the amount of a substance to be measured contained in a specimen including at least a part of blood will be described. In the present embodiment, a case will be described in which the hematocrit value of blood is obtained as the specific value of the blood content. An SPFS apparatus that measures the impedance of the specimen as the electrical characteristics of the specimen for obtaining the hematocrit value of blood will be described. Examples of specimens include blood (blood that has not been separated and diluted), plasma, serum, and diluted solutions thereof.
[実施の形態1]
図1は、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置(SPFS装置)100の構成を示す模式図である。図1に示されるように、SPFS装置100は、電気的特性測定部105、励起光照射ユニット110、反射光検出ユニット120、蛍光検出ユニット130、送液ユニット140、搬送ユニット150および制御部160を有する。SPFS装置100は、搬送ユニット150のチップホルダー152に測定チップ10を装着した状態で使用される。そこで、測定チップ10について先に説明し、その後にSPFS装置100の各構成要素について説明する。[Embodiment 1]
FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) 100 according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 1, the
図2は、本実施の形態にて使用される測定チップ10を示す模式図である。図2Aは、測定チップ10の平面図であり、図2Bは、図2Aに示されるA−A線の断面図である。測定チップ10は、入射面21、成膜面22および出射面23を有するプリズム20と、成膜面22上に離間して配置された第1の金属膜30および第2の金属膜31と、成膜面22の上に配置された枠体35と、流路蓋40とを有する。
FIG. 2 is a schematic diagram showing the
図3Aは、プリズム20の平面図であり、図3Bは、枠体35の平面図であり、図3Cは、流路蓋40の平面図である。
3A is a plan view of the
前述したプリズム20、第1の金属膜30、第2の金属膜31、枠体35および流路蓋40により、液体が流れる流路41(収容部)が形成される。液体の例には、被測定物質を含む検体(血液、血漿、血清またはこれらの希釈液)や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。また、流路41は、検体のインピーダンスを測定するときに検体を収容するための被測定部42を含む。ここで、「被測定部」とは、インピーダンス測定の対象となる検体が存在する流路41内の領域をいう。本実施の形態では、被測定部42は、第1の金属膜30の一部および第2の金属膜31の一部を含む領域である。
The
プリズム20は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム20は、入射面21、成膜面22および出射面23を有する(図1参照)。入射面21は、励起光照射ユニット110からの励起光αをプリズム20の内部に入射させる。成膜面22上には、第1の金属膜30および第2の金属膜31が離間して配置されている。本実施の形態では、プリズム20の内部に入射した励起光αは、被測定物質が捕捉される第1の金属膜30に照射される。励起光αは、第1の金属膜30の裏面で反射して反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム20と第1の金属膜30との界面(成膜面22)で反射して反射光βとなる。出射面23は、反射光βをプリズム20の外部に出射させる。
The
プリズム20の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム20の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面22であり、一方の脚に対応する面が入射面21であり、他方の脚に対応する面が出射面23である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面21と出射面23とが対称になり、励起光αのS波成分がプリズム20内に滞留しにくくなる。
The shape of the
入射面21は、励起光αが励起光照射ユニット110に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード(以下「LD」ともいう)である場合、励起光αがLDに戻ると、LDの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面21に垂直に入射しないように、入射面21の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、第1の金属膜30に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面23から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、第1の金属膜30に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ10の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光(以下「プラズモン散乱光」という)δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面21と成膜面22との角度および成膜面22と出射面23との角度は、いずれも約80°である。
The
なお、測定チップ10の設計により、共鳴角(およびその極近傍にある増強角)が概ね決まる。設計要素は、プリズム20の屈折率や、第1の金属膜30の屈折率、第1の金属膜30の膜厚、第1の金属膜30の消衰係数、励起光αの波長などである。第1の金属膜30上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
The design of the
プリズム20は、第1の金属膜30および第2の金属膜31の間に電圧を印加したときにプリズム20を介して導通することを防ぐ観点から、絶縁体(誘電体)からなる。一方で、プリズム20は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム20の材料の例には、絶縁性の樹脂およびガラスが含まれる。プリズム20の材料は、好ましくは、屈折率が1.4〜1.6であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
The
第1の金属膜30および第2の金属膜31は、プリズム20の成膜面22上にそれぞれ離間して配置されている。第1の金属膜30および第2の金属膜31は、少なくともその一部が流路41(被測定部42)内に露出している。本実施の形態では、第1の金属膜30および第2の金属膜31は、検体のインピーダンスを測定するための電極として利用される。また、第1の金属膜30により、成膜面22に全反射条件で入射した励起光αの光子と、第1の金属膜30中の自由電子との間で相互作用(SPR)が生じ、第1の金属膜30の表面上に局在場光(一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる)を生じさせることもできる。
The
第1の金属膜30および第2の金属膜31の材料は、検体のインピーダンスを測定するための電極として使用でき、かつSPRを生じさせることができる金属であれば特に限定されない。第1の金属膜30および第2の金属膜31の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、第1の金属膜30および第2の金属膜31は、金薄膜である。第1の金属膜30および第2の金属膜31の形成方法は、特に限定されない。第1の金属膜30および第2の金属膜31の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。第1の金属膜30および第2の金属膜31の厚みは、特に限定されないが、30〜70nmの範囲内が好ましい。
The material of the
また、図2Bおよび図3Aに示されるように、第1の金属膜30の表面には、被測定物質を捕捉するための捕捉体50が固定化されている。捕捉体50を固定化することで、被測定物質を選択的に測定することが可能となる。本実施の形態では、第1の金属膜30上の所定の領域に、捕捉体50が均一に固定化されている。捕捉体50が固定化されている領域は、後述する一次反応および二次反応が起こる反応場となる。第1の金属膜30に固定化されている捕捉体50は、流路41内に露出している。捕捉体50の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体50は、被測定物質に特異的な抗体またはその断片である。
Further, as shown in FIGS. 2B and 3A, a capturing
図2Bおよび図3Bに示されるように、枠体35は、プリズム20の成膜面22、第1の金属膜30および第2の金属膜31と、流路蓋40との間に配置されている、第1の貫通孔36を有する薄板である。なお、枠体35は、成膜面22上に直接配置されていてもよい。第1の貫通孔36は、液体が流れる流路41の側面となる。第1の貫通孔36の形状は、液体が流れることができ、かつ検体を収容することができれば特に限定されず、用途に応じて適宜選択されうる。
As shown in FIG. 2B and FIG. 3B, the
枠体35の素材は、インピーダンス測定時に枠体35を介して導電するのを防止する観点から、絶縁体であることが好ましい。枠体35の素材は、絶縁体であれば特に限定されず、公知のマイクロプレートなどと同じ素材であってもよい。枠体35の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。また、枠体35は、両面に粘着性を有するシリコンシート(両面シール)などであってもよい。枠体35として両面シールを使用することで、プリズム20(または第1の金属膜30および第2の金属膜32)と、枠体35と、流路蓋40とを容易に固定することができる。
The material of the
図2Bおよび図3Cに示されるように、流路蓋40は、枠体35上に配置されている、2つの貫通孔を有する薄板である。2つの貫通孔は、それぞれ注入口60および排出口70となる。流路41の両端は、注入口60および排出口70にそれぞれ接続されている。
As shown in FIGS. 2B and 3C, the
流路蓋40は、第1の金属膜30上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋40の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋40の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋40は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより枠体35に接合されている。
The
なお、測定チップ10において、枠体35の代わりに、その裏面に流路溝を形成した流路蓋40を使用していてもよい。この場合、流路41(収容部)は、プリズム20、第1の金属膜30および流路蓋40のみにより形成される。このとき、流路蓋40は、インピーダンス測定時に流路蓋40を介して導電するのを防止する観点から、絶縁体であることが好ましい。
In the
図1に示されるように、励起光αは、入射面21でプリズム20内に入射する。プリズム20内に入射した励起光αは、第1の金属膜30に全反射角度(SPRが生じる角度)で照射される。このように第1の金属膜30に対して励起光αをSPRが生じる角度で照射することで、第1の金属膜30上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、第1の金属膜30上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが放出される。SPFS装置100は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を測定することで、被測定物質の量を測定する。
As shown in FIG. 1, the excitation light α enters the
次に、本実施の形態に係るSPFS装置100の各構成要素について説明する。前述のとおり、SPFS装置100は、電気的特性測定部105、励起光照射ユニット110、反射光検出ユニット120、蛍光検出ユニット130、送液ユニット140、搬送ユニット150および制御部160を有する。
Next, each component of the
電気的特性測定部105は、チップホルダー152に保持された測定チップ10の第1の金属膜30および第2の金属膜31の間に電圧を印加し、流路41内(被測定部42)に露出している第1の金属膜30上、第2の金属膜31上およびその間に亘って存在する検体のインピーダンスを測定する。電気的特性測定部105は、第1の金属膜30および第2の金属膜31の間に電圧を印加するための電源と、第1の金属膜30および第2の金属膜31の間を流れる電流を測定するための電流計とを有する。電源の種類は、特に限定されないが、交流電源を用いることが好ましい。交流を用いることにより検体の組成に変化を与えることなく、後述する検体のインピーダンス測定を行うことができる。本実施の形態では、電源と接続された電圧印加用の2つの端子が、注入口60および排出口70を介して第1の金属膜30および第2の金属膜31にそれぞれ接続される。電圧印加用の端子は、検体に接触するため測定ごとに交換されることが好ましい。電流計の種類は、例えば直流電流計や交流電流計、電流力計型電流計などである。
The electrical
励起光照射ユニット110は、チップホルダー152に保持された測定チップ10の入射面21に向かって励起光αを照射する。蛍光γまたはプラズモン散乱光δの測定時には、励起光照射ユニット110は、第1の金属膜30に対する入射角がSPRを生じさせる角度となるように、第1の金属膜30に対するP波のみを入射面21に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム20の入射面21を介して第1の金属膜30にSPRが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を第1の金属膜30の表面上に生じさせる光である。励起光照射ユニット110は、光源ユニット111、角度調整機構112および光源制御部113を含む。
The excitation
光源ユニット111は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、第1の金属膜30裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット111は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、APC機構および温度調整機構(いずれも不図示)を含む。
The light source unit 111 emits collimated excitation light α having a constant wavelength and light amount so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード(LD)である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。 The type of light source is not particularly limited, and is, for example, a laser diode (LD). Other examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources. When the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like. When the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like. Furthermore, when the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、第1の金属膜30にP波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、第1の金属膜30の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
The beam shaping optical system includes, for example, a collimator, a band pass filter, a linear polarization filter, a half-wave plate, a slit, and a zoom unit. The beam shaping optical system may include all of these or a part thereof. The collimator collimates the excitation light α emitted from the light source. The band-pass filter turns the excitation light α emitted from the light source into narrowband light having only the center wavelength. This is because the excitation light α from the light source has a slight wavelength distribution width. The linear polarization filter turns the excitation light α emitted from the light source into completely linearly polarized light. The half-wave plate adjusts the polarization direction of the excitation light α so that the P-wave component is incident on the
APC機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、APC機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、APC機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。 The APC mechanism controls the light source so that the output of the light source is constant. More specifically, the APC mechanism detects the amount of light branched from the excitation light α with a photodiode (not shown) or the like. The APC mechanism controls the input energy by a regression circuit, thereby controlling the output of the light source to be constant.
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。 The temperature adjustment mechanism is, for example, a heater or a Peltier element. The wavelength and energy of the light emitted from the light source may vary depending on the temperature. For this reason, the wavelength and energy of the light emitted from the light source are controlled to be constant by keeping the temperature of the light source constant by the temperature adjusting mechanism.
角度調整機構112は、第1の金属膜30(プリズム20と第1の金属膜30との界面(成膜面22))に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構112は、プリズム20の入射面21を介して第1の金属膜30の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー152とを相対的に回転させる。
The
たとえば、角度調整機構112は、光源ユニット111を励起光αの光軸と直交する軸(図1の紙面に対して垂直な軸)を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても第1の金属膜30上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における2つの励起光αの光軸の交点近傍(成膜面22上の照射位置と入射面21との間)に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
For example, the
前述のとおり、第1の金属膜30に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。測定チップ10のプリズム20の材料および形状、第1の金属膜30の膜厚、流路41内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路41内の蛍光物質の種類および量、プリズム20の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
As described above, among the incident angles of the excitation light α to the
光源制御部113は、光源ユニット111に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット111からの励起光αの出射を制御する。光源制御部113は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
The light
反射光検出ユニット120は、共鳴角の測定を行うために、測定チップ10への励起光αの照射によって生じた反射光βの光量を測定する。反射光検出ユニット120は、照射スポットを通る、第1の金属膜30に対する法線を挟んで、励起光照射ユニット110の反対側に配置されている。反射光検出ユニット120は、受光センサー121、角度調整機構122およびセンサー制御部123を含む。なお、蛍光検出ユニット130(後述)がプラズモン散乱光δの光量を測定することにより増強角を決定する場合は、反射光検出ユニット120は、無くてもよい。
The reflected
受光センサー121は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。受光センサー121の種類は、特に限定されない。たとえば、受光センサー121は、フォトダイオード(PD)である。
The
角度調整機構122は、第1の金属膜30に対する励起光αの入射角に応じて、受光センサー121の位置(角度)を調整する。角度調整機構122は、反射光βが受光センサー121に入射するように、受光センサー121とチップホルダー152とを相対的に回転させる。
The
センサー制御部123は、受光センサー121の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー121の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー121の感度の変更などを制御する。センサー制御部123は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
The
蛍光検出ユニット130は、第1の金属膜30への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット130は、第1の金属膜30への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光δも検出する。蛍光検出ユニット130は、受光ユニット131、位置切り替え機構132およびセンサー制御部133を含む。
The
受光ユニット131は、測定チップ10の第1の金属膜30の法線方向に配置される。受光ユニット131は、第1レンズ134、光学フィルター135、第2レンズ136および受光センサー137を含む。
The
第1レンズ134は、例えば、集光レンズであり、第1の金属膜30上から出射される光を集光する。第2レンズ136は、例えば、結像レンズであり、第1レンズ134で集光された光を受光センサー137の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行になっている。
The
光学フィルター135は、両レンズの間に配置されている。光学フィルター135は、蛍光成分のみを受光センサー137に導き、高いS/N比で蛍光γを検出するために、励起光成分(プラズモン散乱光δ)を除去する。光学フィルター135の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター135は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
The
受光センサー137は、蛍光γおよびプラズモン散乱光δを検出する。受光センサー137は、微小量の被測定物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー137は、例えば、光電子増倍管(PMT)やアバランシェフォトダイオード(APD)などである。
The
位置切り替え機構132は、光学フィルター135の位置を、受光ユニット131における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー137が蛍光γを検出する時には、光学フィルター135を受光ユニット131の光路上に配置し、受光センサー137がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター135を受光ユニット131の光路外に配置する。
The
センサー制御部133は、受光センサー137の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー137の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー137の感度の変更、などを制御する。センサー制御部133は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
The
送液ユニット140は、チップホルダー152に保持された測定チップ10の流路41内に、検体や標識液、洗浄液などを供給する。送液ユニット140は、液体チップ141、シリンジポンプ142および送液ポンプ駆動機構143を含む。
The
液体チップ141は、検体や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ141としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。 The liquid chip 141 is a container for storing a liquid such as a specimen, a labeling liquid, or a cleaning liquid. As the liquid chip 141, a plurality of containers are usually arranged according to the type of liquid, or a chip in which a plurality of containers are integrated is arranged.
シリンジポンプ142は、シリンジ144と、シリンジ144内を往復動作可能なプランジャー145とによって構成される。プランジャー145の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ144が交換可能であると、シリンジ144の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ144が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ144内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ144を交換せずに使用することが可能となる。
The syringe pump 142 includes a
送液ポンプ駆動機構143は、プランジャー145の駆動装置、およびシリンジポンプ142の移動装置を含む。シリンジポンプ142の駆動装置は、プランジャー145を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ142の送液量や送液速度を管理できるため、測定チップ10の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ142の移動装置は、例えば、シリンジポンプ142を、シリンジ144の軸方向(例えば垂直方向)と、軸方向を横断する方向(例えば水平方向)との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ142の移動装置は、例えば、ロボットアーム、2軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
The liquid feed
送液ユニット140は、液体チップ141より各種液体を吸引し、測定チップ10の流路41内に供給する。このとき、プランジャー145を動かすことで、測定チップ10中の流路41内を液体が往復し、流路41内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路41内における反応(例えば抗原抗体反応)の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、測定チップ10の注入口60は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ144がこの多層フィルムを貫通した時に注入口60を密閉できるように、測定チップ10およびシリンジ144が構成されていることが好ましい。
The
流路41内の液体は、再びシリンジポンプ142で吸引され、液体チップ141などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路41内の反応場に、蛍光物質で標識された被測定物質を配置することができる。
The liquid in the
搬送ユニット150は、測定チップ10を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット110が測定チップ10に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出ユニット120または蛍光検出ユニット130が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット140が測定チップ10の流路41内に液体を供給するか、または測定チップ10の流路41内の液体を除去する位置である。搬送ユニット150は、搬送ステージ151およびチップホルダー152を含む。チップホルダー152は、搬送ステージ151に固定されており、測定チップ10を着脱可能に保持する。チップホルダー152の形状は、測定チップ10を保持することが可能であり、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー152には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ151は、チップホルダー152を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ151も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ151は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
The
制御部160は、電気的特性測定部105、角度調整機構112、光源制御部113、角度調整機構122、センサー制御部123、位置切り替え機構132、センサー制御部133、送液ポンプ駆動機構143および搬送ステージ151を制御する。また、制御部160は、電気的特性測定部105の測定結果に基づいて、検体が血液を含む検体であるか否か、すなわち血液もしくは血液の希釈液であるか、または血清、血漿もしくはこれらの希釈液であるかを判定する処理部としても機能する。さらに、制御部160は、検体が血液または血液の希釈液であると判定した場合に、電気的特性測定部105の測定結果に基づいて、検体に含まれる血液のヘマトクリット値を算出する処理部としても機能する。制御部160は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
The
次に、SPFS装置100の検出動作(本発明の実施の形態に係る測定方法)について説明する。図4は、SPFS装置100の動作手順の一例を示すフローチャートである。
Next, the detection operation of the SPFS device 100 (measurement method according to the embodiment of the present invention) will be described. FIG. 4 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the
まず、測定の準備をする(工程S10)。具体的には、SPFS装置100のチップホルダー152に測定チップ10を設置する。また、測定チップ10の流路41内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体50が適切に被測定物質を捕捉できるように、流路41内を洗浄して保湿剤を除去する。
First, preparation for measurement is performed (step S10). Specifically, the
次いで、検体のインピーダンスを指標として、検体が血液を含む検体(例えば、血液または血液の希釈液)であるか、それ以外の検体(例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液)であるかを判定する。また、検体が血液を含む検体である場合は、検体に含まれる血液のヘマトクリット値を測定する。流路41内では、抗原抗体反応によって、第1の金属膜30上に被測定物質が捕捉される(一次反応;工程S20)。なお、検体の種類判定および血液のヘマトクリット値の測定は、被測定物質を捕捉体50に結合させる工程中に(すなわち一次反応と並行して)行われてもよいし、被測定物質を捕捉体50に結合させる工程の後(すなわち一次反応の後)に行われてもよい。
Next, using the impedance of the specimen as an index, it is determined whether the specimen is a specimen containing blood (for example, blood or a diluted solution of blood) or other specimen (for example, plasma, serum, or a diluted solution thereof). To do. When the sample is a sample containing blood, the hematocrit value of blood contained in the sample is measured. In the
具体的には、制御部160は、搬送ステージ151を操作して、測定チップ10を送液位置に移動させる。この後、制御部160は、送液ユニット140を操作して、液体チップ141内の検体を流路41内に導入する。流路41内では、抗原抗体反応によって、第1の金属膜30上に被測定物質が捕捉される(1次反応)。次いで、制御部160は、搬送ステージ151を操作して、測定チップ10を測定位置に移動させる。次いで、注入口60および排出口70を介して電圧印加用の2つの端子を第1の金属膜30および第2の金属膜31にそれぞれ接続する。この後、制御部160は、電気的特性測定部105を操作して、検体のインピーダンスを測定する。インピーダンスの測定は、流路41内(被測定部42)に露出している第1の金属膜30上、第2の金属膜31上およびその間に亘って検体が存在する状態で、第1の金属膜30および第2の金属膜31の間に電圧を印加することで行う。測定値は、制御部160に記録される。このとき、第1の金属膜30および第2の金属膜31の間に印加される電圧(0.1〜1V程度)は、非常に小さい。また、インピーダンスの測定時間(数秒)は、一次反応を行う時間(数分)より、非常に短い。このため、一次反応に影響を及ぼすことなく、検体のインピーダンスを測定することができる。したがって、検体の種類判定および血液のヘマトクリット値の測定は、被測定物質を捕捉体50に結合させる間に行われてもよい。それにより、被測定物質の量の測定時間を短縮することができる。
Specifically, the
次いで、制御部160は、得られた検体のインピーダンスに基づいて、検体が血液を含む検体(例えば、血液または血液の希釈液)であるか、それ以外の検体(例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液)であるかを判定する。判定結果は、制御部160に記録される。検体が血液を含む検体である場合は、さらに、制御部160は、前述の検体のインピーダンスを用いて、検体に含まれる血液のヘマトクリット値を算出する。具体的には、あらかじめインピーダンスとHct値の検量線を取得しておき、測定されたインピーダンスからHct値に換算する。なお、インピーダンスの値からヘマトクリット値を算出する手段は、公知である。
Next, based on the obtained impedance of the specimen, the
次いで、光学ブランク値を測定する(工程S30)。ここで「光学ブランク値」とは、蛍光γの測定(工程S50)において測定チップ10の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部160は、搬送ステージ151を操作して、測定チップ10を送液位置に移動させる。この後、制御部160は、送液ユニット140を操作して、測定チップ10の流路41内の検体を除去するとともに、液体チップ141内の洗浄液を用いて流路41内を洗浄する。次いで、制御部160は、搬送ステージ151を操作して、測定チップ10を測定位置に移動させる。この後、制御部160は、励起光照射ユニット110および蛍光検出ユニット130を操作して、捕捉体50が固定されている領域に対応した第1の金属膜30の裏面に入射面21を介して励起光αを照射するとともに、受光センサー137の出力値(光学ブランク値)を記録する。このとき、制御部160は、角度調整機構112を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部160は、位置切り替え機構132を制御して、光学フィルター135を受光ユニット131の光路内に配置する。測定された光学ブランク値は、制御部160に記録される。
Next, the optical blank value is measured (step S30). Here, the “optical blank value” means the amount of background light emitted above the
次いで、第1の金属膜30上に捕捉されている被測定物質を蛍光物質で標識する(2次反応;工程S40)。具体的には、制御部160は、搬送ステージ151を操作して、測定チップ10を送液位置に移動させる。この後、制御部160は、送液ユニット140を操作して、蛍光物質で標識された捕捉体を含む液体(標識液)を測定チップ10の流路41内に導入する。流路41内では、抗原抗体反応によって、第1の金属膜30上に捕捉されている被測定物質が蛍光物質で標識される。この後、流路41内の標識液は除去され、流路41内は洗浄液で洗浄される。
Next, the substance to be measured captured on the
次いで、第1の金属膜30のプリズム20と対向しない面の近傍から放出される蛍光γの光量を測定して、検体中の被測定物質の量を示す第1のシグナル値を得る(工程S50)。具体的には、制御部160は、搬送ステージ151を操作して、測定チップ10を測定位置に移動させる。この後、制御部160は、励起光照射ユニット110および蛍光検出ユニット130を操作して、被測定物質と捕捉体50とが結合した状態であって、かつ流路41(収容部)に検体が存在しない状態で、プリズム20側から捕捉体50が固定されている領域に対応した第1の金属膜30の裏面に入射面21を介して励起光αを照射するとともに、受光センサー137の出力値を記録する。このとき、制御部160は、角度調整機構112を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部160は、位置切り替え機構132を制御して、光学フィルター135を受光ユニット131の光路内に配置する。制御部160は、検出値から光学ブランク値を引き、検体中の被測定物質の量を示す第1のシグナル値を算出する。第1のシグナル値は、必要に応じて、被測定物質の量や濃度などに換算される。第1のシグナル値は、制御部160に記録される。
Next, the amount of fluorescent γ emitted from the vicinity of the surface of the
次いで、検体が血液を含む検体(例えば、血液または血液の希釈液)であるか、それ以外の検体(例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液)であるかを判定する(工程S60)。この工程では、工程S20の判定結果をそのまま利用すればよい。検体が血液を含む検体(例えば、血液または血液の希釈液)である場合は、ヘマトクリット値を用いてシグナル値を変換する工程(工程S70)に進む。一方、検体がそれ以外の検体(例えば、血漿、血清またはこれらの希釈液)である場合は、ヘマトクリット値を用いたシグナル値の変換は不要であるため、検出動作を終了する。 Next, it is determined whether the sample is a sample containing blood (for example, blood or a diluted solution of blood) or another sample (for example, plasma, serum, or a diluted solution thereof) (step S60). In this step, the determination result of step S20 may be used as it is. When the sample is a sample containing blood (for example, blood or a diluted solution of blood), the process proceeds to the step of converting the signal value using the hematocrit value (step S70). On the other hand, when the sample is another sample (for example, plasma, serum, or a diluted solution thereof), the signal value conversion using the hematocrit value is unnecessary, and thus the detection operation is terminated.
検体が血液を含む検体である場合は、工程S20で測定された血液のヘマトクリット値を用いて、工程S50で測定された第1のシグナル値を、検体の液体成分中の被測定物質の量を示す第2のシグナル値に変換する(工程S70)。具体的には、検体が希釈していない血液の場合は、第1のシグナル値に、以下の式(1)で表される変換係数c1を掛けることで、第1のシグナル値を第2のシグナル値に変換する。一方、検体が血液の希釈液の場合は、第1のシグナル値に、以下の式(2)で表される変換係数c2を掛けることで、第1のシグナル値を第2のシグナル値に変換する。なお、第2のシグナル値は、特に限定されない。第2のシグナル値は、例えば、被測定物質の量や濃度などの換算値であってもよい。
以上の手順により、検体の液体成分中の被測定物質の量を測定することができる。 With the above procedure, the amount of the substance to be measured in the liquid component of the specimen can be measured.
本実施の形態に係るSPFS装置では、測定チップに設けられた金属膜を利用して検体のインピーダンス測定をすることができる。したがって、本実施の形態に係るSPFS装置は、遠心分離機やヘモグロビン濃度の測定装置などの新たな装置を追加することなく検体のヘマトクリット値を算出して、シグナル値を補正することができる。また、本実施の形態に係るSPFS装置では、一次反応と同時に検体のインピーダンス測定をすることができる。このため、検体の種類判定およびヘマトクリット値の算出のために別途時間を費やす必要がない。また、少量の検体でインピーダンスの測定を行うことができる。したがって、本実施の形態に係るSPFS装置では、少量の検体により被測定物質の量を短時間で正確に測定することができる。 In the SPFS apparatus according to the present embodiment, the impedance of the specimen can be measured using a metal film provided on the measurement chip. Therefore, the SPFS device according to the present embodiment can correct the signal value by calculating the hematocrit value of the specimen without adding a new device such as a centrifuge or a hemoglobin concentration measuring device. In addition, the SPFS apparatus according to the present embodiment can measure the impedance of the specimen simultaneously with the primary reaction. For this reason, it is not necessary to spend additional time for determining the type of specimen and calculating the hematocrit value. Moreover, impedance can be measured with a small amount of specimen. Therefore, in the SPFS apparatus according to the present embodiment, the amount of the substance to be measured can be accurately measured in a short time with a small amount of specimen.
[実施の形態2]
実施の形態2では、インピーダンスを測定するときに用いられる電圧印加用の端子を検体で濡らすことなく測定を行うことができるSPFS装置について説明する。本実施の形態でも、血液の内容物の特定値として、血液のヘマトクリット値を求める場合について説明する。[Embodiment 2]
In the second embodiment, an SPFS apparatus capable of performing measurement without wetting a voltage application terminal used for impedance measurement with a specimen will be described. Also in the present embodiment, a case where the hematocrit value of blood is obtained as the specific value of the blood content will be described.
図5Aは、実施の形態2に係る測定チップ200の平面図であり、図5Bは、図5Aに示されるA−A線の断面図である。なお、図2に示される実施の形態1に係る測定チップ10と同一の構成要素については、同一の符号を付して、その説明を省略する。
5A is a plan view of
実施の形態2に係る測定チップ200は、捕捉体50が捕捉されている第1の金属膜230および捕捉体50が固定されていない第2の金属膜231に加えて、さらに捕捉体50が固定されていない第3の金属膜232を含む。
In the
図5Aに示されるように、測定チップ200では、プリズム20、第1の金属膜230、第2の金属膜231、第3の金属膜232、枠体235および流路蓋240により液体が流れる流路241(収容部)が形成される。流路241は、検体のインピーダンスを測定するときに検体を収容するための被測定部242を含む。本実施の形態では、被測定部242は、第2の金属膜231の一部および第3の金属膜232の一部を含む領域である。また、枠体235の第1の貫通孔236は、被測定部242となる凸部を有する。また、枠体235および流路蓋240は、第2の貫通孔280および第3の貫通孔290をさらに有する。第2の金属膜231および第3の金属膜232は、少なくともその一部が流路241内(被測定部242)に露出している。第2の貫通孔280および第3の貫通孔290は、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路に影響を与えない位置であり、かつ第2の金属膜231および第3の金属膜232の少なくとも一部がそれぞれ露出するように配置されている。特に図示しないが、電圧印加用の2つの端子は、第2の貫通孔280および第3の貫通孔290を介して、それぞれ第2の金属膜31および第3の金属膜232に接続されうる。
As shown in FIG. 5A, in the
本実施の形態では、検体のインピーダンスの測定は、流路241内(被測定部242)に露出している第2の金属膜231上、第3の金属膜232上およびその間に亘って検体が存在する状態で、第2の金属膜231および第3の金属膜232の間に電圧を印加することで行う。
In the present embodiment, the measurement of the impedance of the specimen is performed on the
図6は、実施の形態2の変形例に係る測定チップ300の平面図である。図7Aは、チップホルダー352に設置された測定チップ300の平面図であり、図7Bは、図7AにおけるA−A線の断面図である。
FIG. 6 is a plan view of a
図6に示されるように、枠体335は、第2の貫通孔280および第3の貫通孔290の代わりに第1の切り欠き部380および第2の切り欠き部390を有していてもよい。また、チップホルダー352は、電圧印可用の2つの端子353を有する。電圧印加用の2つの端子353は、第1の切り欠き部380および第2の切り欠き部390を介して第2の金属膜231および第3の金属膜232にそれぞれ接続される。2つの端子353は、測定チップ300の位置決めにも利用される。図7Aおよび図7Bに示されるように、第1の切り欠き部380および第2の切り欠き部390に2つの端子353を挿入することで、測定チップ300が適切な位置に配置される。
As shown in FIG. 6, the
以上のように、本実施の形態に係る測定チップ200、300では、電圧印加用の2つの端子353を流路241外で第2の金属膜231および第3の金属膜232に接続させることができる。このため、本実施の形態に係る測定チップ200、300を使用する場合、電圧印加用の2つの端子353を検体で濡らすことなく、検体のインピーダンスを測定することができる。したがって、電圧印加用の端子353を交換することなく、複数回の測定を行うことが可能となる。
As described above, in the
なお、上記実施の形態では、SPFSを利用する測定方法および測定装置について説明したが、本発明に係る測定方法および測定装置は、SPFSを利用する測定方法および測定装置に限定されない。たとえば、本発明に係る測定方法および測定装置は、SPR法を利用する測定方法および測定装置であってもよい。この場合、測定装置100は、蛍光γの光量を測定せずに、第1のシグナル値として反射光βの光量を測定することで被測定物質を測定する。したがって、光学ブランク値の測定(工程S50)および2次反応(工程S60)は不要である。
In the above embodiment, the measurement method and the measurement apparatus using SPFS have been described. However, the measurement method and the measurement apparatus according to the present invention are not limited to the measurement method and the measurement apparatus using SPFS. For example, the measurement method and the measurement device according to the present invention may be a measurement method and a measurement device using the SPR method. In this case, the measuring
また、上記実施の形態では、不要な処理を避ける観点から、検体のインピーダンスの測定値を用いて検体の種類判定を行う測定方法および測定装置について説明したが、本発明に係る測定方法および測定装置は、検体の種類判定を含む測定方法および測定装置に限定されない。この場合、処理部は、検体の種類に関係なく、血液のヘマトクリット値を求め、かつ第1のシグナル値を第2のシグナル値に変換する。 Further, in the above embodiment, from the viewpoint of avoiding unnecessary processing, the measurement method and the measurement apparatus that perform the specimen type determination using the measurement value of the impedance of the specimen have been described. However, the measurement method and the measurement apparatus according to the present invention are described. Is not limited to a measurement method and a measurement apparatus including determination of the type of specimen. In this case, the processing unit obtains a hematocrit value of blood regardless of the type of the specimen, and converts the first signal value into the second signal value.
また、上記実施の形態では、2つの金属膜が配置された測定チップおよび3つの金属膜が配置された測定チップを用いたSPFS装置について説明したが、金属膜の数は2つ以上であれば特に限定されない。たとえば、金属膜の数は、4つ以上であってもよい。この場合、複数の金属膜のうち、収容部内に露出している2つの金属膜上およびその間に亘って検体が存在する状態で、当該2つの金属膜の間に電圧を印加することで検体の電気的特性を測定する。 In the above embodiment, the SPFS device using the measurement chip in which two metal films are arranged and the measurement chip in which three metal films are arranged has been described. However, if the number of metal films is two or more, There is no particular limitation. For example, the number of metal films may be four or more. In this case, by applying a voltage between the two metal films in a state where the specimen exists on and between the two metal films exposed in the accommodating portion among the plurality of metal films, Measure electrical characteristics.
また、上記実施の形態では、ヘマトクリット値を求めるために検体の電気的特性として検体のインピーダンスの測定を行った。しかし、本発明に係る測定方法および測定装置では、ヘマトクリット値を求めるための検体の電気的特性は、検体のインピーダンスに限定されない。たとえば、本発明に係る測定方法および測定装置では、ヘマトクリット値を求めるために検体のゼータ電位を測定してもよい。この場合も、SPRを利用する測定チップを用いて、ヘマトクリット値を求めることができる。 In the above embodiment, the impedance of the specimen is measured as the electrical characteristics of the specimen in order to obtain the hematocrit value. However, in the measurement method and measurement apparatus according to the present invention, the electrical characteristics of the specimen for obtaining the hematocrit value are not limited to the impedance of the specimen. For example, in the measuring method and measuring apparatus according to the present invention, the zeta potential of the specimen may be measured in order to obtain the hematocrit value. In this case as well, the hematocrit value can be obtained using a measuring chip that utilizes SPR.
また、上記実施の形態では、血液の内容物の特定値として、ヘマトクリット値を求める場合について説明した。しかし、本発明に係る測定方法および測定装置では、血液の内容物の特定値は、ヘマトクリット値に限定されない。血液の内容物の特定値の他の例には、ナトリウム(Na)濃度、カリウム(K)濃度、クロール(Cl)濃度、イオン化カルシウム(iCa)濃度、重炭酸イオン(HCO3 −)濃度、血液尿素窒素濃度、グルコース濃度、クレアチニン濃度、乳酸濃度、pH、二酸化炭素分圧(pCO2)、細胞外液のベースエクセス(BE)、Anion Gap、総二酸化炭素(tCO2)、酸素分圧(pO2)および酸素飽和度(sO2)が含まれる。In the above embodiment, the case where the hematocrit value is obtained as the specific value of the blood content has been described. However, in the measuring method and measuring apparatus according to the present invention, the specific value of the blood content is not limited to the hematocrit value. Other examples of specific values of blood contents include sodium (Na) concentration, potassium (K) concentration, chlor (Cl) concentration, ionized calcium (iCa) concentration, bicarbonate ion (HCO 3 − ) concentration, blood Urea nitrogen concentration, glucose concentration, creatinine concentration, lactic acid concentration, pH, carbon dioxide partial pressure (pCO 2 ), extracellular fluid base excess (BE), Anion Gap, total carbon dioxide (tCO 2 ), oxygen partial pressure (pO) 2 ) and oxygen saturation (sO 2 ).
本出願は、2014年6月18日出願の特願2014−125219に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。 This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2014-125219 filed on June 18, 2014. The contents described in the application specification and the drawings are all incorporated herein.
本発明に係る測定方法および測定装置は、血液中の被測定物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。 The measurement method and measurement apparatus according to the present invention can measure a substance to be measured in blood with high reliability, and thus are useful for, for example, examination of diseases.
10、200、300 測定チップ
20 プリズム
21 入射面
22 成膜面
23 出射面
30、230 第1の金属膜
31、231 第2の金属膜
35、235、335 枠体
36、236 第1の貫通孔
40、240 流路蓋
41、241 流路
42、242 被測定部
50 捕捉体
60 注入口
70 排出口
100 SPFS装置
105 電気的特性測定部
110 励起光照射ユニット
111 光源ユニット
112 角度調整機構
113 光源制御部
120 反射光検出ユニット
121 受光センサー
122 角度調整機構
123 センサー制御部
130 蛍光検出ユニット
131 受光ユニット
132 位置切り替え機構
133 センサー制御部
134 第1レンズ
135 光学フィルター
136 第2レンズ
137 受光センサー
140 送液ユニット
141 液体チップ
142 シリンジポンプ
143 送液ポンプ駆動機構
144 シリンジ
145 プランジャー
150 搬送ユニット
151 搬送ステージ
152、352 チップホルダー
160 制御部
232 第3の金属膜
280 第2の貫通孔
290 第3の貫通孔
353 電圧印加用の端子
380 第1の切り欠き部
390 第2の切り欠き部
α 励起光
β 反射光
γ 蛍光
δ プラズモン散乱光10, 200, 300
Claims (18)
入射面、出射面および成膜面を有する誘電体のプリズムと、前記成膜面上に配置され、前記検体を収容するための収容部と、前記成膜面上に離間して配置され、少なくとも1つに捕捉体が固定されているとともに少なくともその一部が前記収容部内に露出している複数の金属膜とを有する測定チップに、前記検体を提供して前記被測定物質を前記捕捉体に結合させる工程と、
前記複数の金属膜のうち、前記収容部内に露出している2つの金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記2つの金属膜の間に電圧を印加することで前記検体の電気的特性を測定し、得られた測定値を用いて前記検体における血液の内容物の特定値を求める工程と、
前記被測定物質と前記捕捉体とが結合した状態であって、かつ前記収容部に前記検体が存在しない状態で、前記入射面を介して前記捕捉体が固定されている領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射して、励起された蛍光物質から放出された蛍光の光量、または前記成膜面で反射され前記出射面から出射された励起光の光量を測定して、前記検体中の前記被測定物質の量を示す第1のシグナル値を得る工程と、
前記血液の内容物の特定値を用いて、前記第1のシグナル値を、前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第2のシグナル値に変換する工程と、
を含む、測定方法。A method for measuring the amount of a substance to be measured in a specimen including at least a part of blood using surface plasmon resonance,
A dielectric prism having an entrance surface, an exit surface, and a film formation surface; a storage unit disposed on the film formation surface; and a storage unit for storing the specimen; and spaced apart on the film formation surface; The sample is provided to a measurement chip having a capture body fixed to one and a plurality of metal films, at least a part of which is exposed in the housing portion, and the substance to be measured is applied to the capture body. Combining, and
The sample is applied by applying a voltage between the two metal films in a state where the sample exists on and between the two metal films exposed in the housing portion among the plurality of metal films. Measuring the electrical characteristics of, and using the obtained measurement value to determine a specific value of the blood content in the specimen;
The metal corresponding to a region where the capturing body is fixed via the incident surface in a state where the substance to be measured and the capturing body are combined and the specimen is not present in the housing portion. Irradiating the back surface of the film with excitation light, and measuring the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent substance or the amount of excitation light reflected from the film formation surface and emitted from the emission surface, Obtaining a first signal value indicative of the amount of the substance to be measured therein;
Converting the first signal value into a second signal value indicating the amount of the substance to be measured in the liquid component of the specimen, using the specific value of the blood content;
Including a measuring method.
前記検体の電気的特性の測定は、前記収容部内に露出している前記第1の金属膜上、前記第2の金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記第1の金属膜および前記第2の金属膜の間に電圧を印加することで行う、
請求項1または請求項2に記載の測定方法。The plurality of metal films include a first metal film to which the capturing body is fixed and a second metal film to which the capturing body is not fixed,
The electrical characteristics of the specimen are measured in the state where the specimen exists on the first metal film, the second metal film, and the space between the first metal film exposed in the container. By applying a voltage between the metal film and the second metal film,
The measuring method according to claim 1 or 2.
前記検体の電気的特性の測定は、前記収容部内に露出している前記第2の金属膜上、前記第3の金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記第2の金属膜および前記第3の金属膜の間に電圧を印加することで行う、請求項1または請求項2に記載の測定方法。The plurality of metal films include a first metal film to which the capturing body is fixed, a second metal film to which the capturing body is not fixed, and a third metal film to which the capturing body is not fixed. Including
The electrical characteristics of the specimen are measured in the state where the specimen exists on the second metal film, the third metal film, and the space between the second metal film exposed in the container. The measurement method according to claim 1, wherein the measurement is performed by applying a voltage between the metal film and the third metal film.
前記第1のシグナル値を第2のシグナル値に変換する工程では、前記検体が血液または血液の希釈液であると判定した場合に、前記被測定物質の量を示す第2のシグナル値に変換する、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の測定方法。In the step of obtaining a specific value of the content of the blood, the obtained measurement value is used to determine whether the sample is blood or blood dilution, or serum, plasma, or dilutions thereof. , When it is determined that the specimen is blood or a diluted blood solution, the specific value of the blood content is obtained using the obtained measurement value,
In the step of converting the first signal value into the second signal value, when it is determined that the sample is blood or a blood dilution, it is converted into a second signal value indicating the amount of the substance to be measured. To
The measuring method as described in any one of Claims 1-4.
前記検体が希釈をしていない血液の場合は、前記第1のシグナル値に、以下の式(1)で表される変換係数c1を掛けることで、前記第1のシグナル値を前記第2のシグナル値に変換し、
前記検体が血液の希釈液の場合は、前記第1のシグナル値に、以下の式(2)で表される変換係数c2を掛けることで、前記第1のシグナル値を前記第2のシグナル値に変換する、
請求項6に記載の測定方法。
When the specimen is undiluted blood, the first signal value is multiplied by the conversion coefficient c 1 represented by the following equation (1) to obtain the first signal value. To the signal value of
When the sample is a diluted blood solution, the first signal value is multiplied by a conversion coefficient c 2 represented by the following equation (2) to obtain the first signal value as the second signal. Convert to value,
The measurement method according to claim 6.
入射面、出射面および成膜面を有する誘電体のプリズムと、
前記成膜面上に配置され、前記検体を収容するための収容部と、
前記成膜面上に離間して配置され、少なくとも1つに捕捉体が固定されているとともに少なくともその一部が前記収容部内に露出している複数の金属膜と、
を有する、測定チップ。A chip for measuring the amount of a substance to be measured in a specimen including at least a part of blood using surface plasmon resonance,
A dielectric prism having an entrance surface, an exit surface, and a deposition surface;
A storage unit disposed on the film formation surface for storing the specimen;
A plurality of metal films that are spaced apart from each other on the film-forming surface, the capturing body is fixed to at least one, and at least a part of the metal film is exposed in the housing portion;
Having a measuring chip.
入射面、出射面および成膜面を有する誘電体のプリズムと、前記成膜面上に配置され、前記検体を収容するための収容部と、前記成膜面上に離間して配置され、少なくとも1つに捕捉体が固定されているとともに少なくともその一部が前記収容部内に露出している複数の金属膜とを有する測定チップを、保持するためのホルダーと、
前記収容部内に露出している2つの金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記2つの金属膜の間に電圧を印加することで前記検体の電気的特性を測定する電気的特性測定部と、
前記入射面に向かって光を照射する光照射部と、
前記被測定物質と前記捕捉体とが結合した状態であって、かつ前記収容部に前記検体が存在しない状態で、前記入射面を介して前記捕捉体が固定されている領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射して、励起された蛍光物質から放出された蛍光の光量、または前記プリズムの前記成膜面で反射され前記出射面から出射された励起光の光量を検出する光検出部と、
前記光検出部の検出結果に基づいて前記検体中の前記被測定物質の量を示す第1のシグナル値を算出し、かつ前記電気的特性測定部の測定結果に基づいて前記血液の内容物の特定値を算出するとともに、前記血液の内容物の特定値を用いて前記第1のシグナル値を前記検体の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第2のシグナル値に変換する処理部と、
を有する、測定装置。An apparatus for measuring the amount of a substance to be measured in a specimen including at least a part of blood using surface plasmon resonance,
A dielectric prism having an entrance surface, an exit surface, and a film formation surface; a storage unit disposed on the film formation surface; and a storage unit for storing the specimen; and spaced apart on the film formation surface; A holder for holding a measurement chip having a plurality of metal films each having a capturing body fixed to one and at least a part of which is exposed in the housing;
Electricity for measuring electrical characteristics of the specimen by applying a voltage between the two metal films on the two metal films exposed in the accommodating portion and between the two metallic films. Characteristic measurement unit,
A light irradiator for irradiating light toward the incident surface;
The metal corresponding to a region where the capturing body is fixed via the incident surface in a state where the substance to be measured and the capturing body are combined and the specimen is not present in the housing portion. Light that irradiates the back surface of the film with excitation light and detects the amount of fluorescence emitted from the excited fluorescent material, or the amount of excitation light reflected from the film formation surface of the prism and emitted from the emission surface A detection unit;
A first signal value indicating the amount of the substance to be measured in the specimen is calculated based on the detection result of the light detection unit, and the blood content of the blood is calculated based on the measurement result of the electrical property measurement unit A processing unit that calculates a specific value and converts the first signal value into a second signal value indicating the amount of the substance to be measured in the liquid component of the specimen by using the specific value of the contents of the blood When,
A measuring device.
前記電気的特性測定部は、前記収容部内に露出している前記第1の金属膜上、前記第2の金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記第1の金属膜および前記第2の金属膜の間に電圧を印加することで前記検体の電気的特性の測定を行う、請求項12に記載の測定装置。The plurality of metal films include a first metal film to which the capturing body is fixed and a second metal film to which the capturing body is not fixed,
The electrical property measurement unit is configured to perform the first metal film on the first metal film exposed in the housing unit, on the second metal film, and in a state where the specimen exists between the first metal film and the second metal film. The measurement apparatus according to claim 12, wherein the electrical characteristics of the specimen are measured by applying a voltage between the second metal film and the second metal film.
前記電気的特性測定部は、前記収容部内に露出している前記第2の金属膜上、前記第3の金属膜上およびその間に亘って前記検体が存在する状態で、前記第2の金属膜および前記第3の金属膜の間に電圧を印加することで前記検体の電気的特性の測定を行う、請求項12に記載の測定装置。The plurality of metal films include a first metal film to which the capturing body is fixed, a second metal film to which the capturing body is not fixed, and a third metal film to which the capturing body is not fixed. Including
The electrical property measurement unit is configured to provide the second metal film on the second metal film exposed in the storage unit, the third metal film, and the specimen in a state where the sample exists between the second metal film and the third metal film. The measurement apparatus according to claim 12, wherein the electrical characteristics of the specimen are measured by applying a voltage between the third metal film and the third metal film.
前記検体が希釈をしていない血液の場合は、前記第1のシグナル値に、以下の式(1)で表される変換係数c1を掛けることで、前記第1のシグナル値を前記第2のシグナル値に変換し、
前記検体が血液の希釈液の場合は、前記第1のシグナル値に、以下の式(2)で表される変換係数c2を掛けることで、前記第1のシグナル値を前記第2のシグナル値に変換する、
請求項16に記載の測定装置。
When the specimen is undiluted blood, the first signal value is multiplied by the conversion coefficient c 1 represented by the following equation (1) to obtain the first signal value. To the signal value of
When the sample is a diluted blood solution, the first signal value is multiplied by a conversion coefficient c 2 represented by the following equation (2) to obtain the first signal value as the second signal. Convert to value,
The measuring device according to claim 16.
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