JP6449198B2 - 化学的検出デバイス - Google Patents

Description

本発明は化学的検出のためのデバイスに関する。特に、本発明は、流体中のイオンの濃度に依存するデジタル出力信号を提供するために使用され得る。本発明は核酸の識別および配列決定に適用可能である。

従前の刊行物は、検出表面の近傍の化学薬品を検知するためのイオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）の能力を開示している。これは、化学反応の生成物の検出によって標的検体の存在を測定するために使用され得る。一実施例において、ＩＳＦＥＴは、核酸の終端でヌクレオチド挿入から結果として生じるｐＨの変化を検知することにより、核酸テンプレートの１つ以上の部分の同一性を決定するために、使用することができる。典型的には、水素イオン（プロトン）は反応の間に放出される。ＩＳＦＥＴの電気信号の強さは、放出された水素イオンの量に依存し、当該強さは、アナログ出力信号（それは電圧または電流信号のいずれかである）として表現される。

ＤＮＡ配列決定で使用されるような大規模なＩＳＦＥＴアレイについて、本発明者らは、このアナログデータの処理は、莫大な計算能力と、ギガビット／秒の帯域幅を必要とすることを認識した。

加えて、通常の方法は、正確なアナログ読み出し回路を必要とし、寄生成分と、環境上の電気雑音に敏感である。高精度かつ大規模なアナログ・システムは、処理速度および統合能力を制限し、これによって、検出効率とスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）が抑制されている。さらに、高性能のフロントエンドのインタフェース回路は、大量のシステム領域と電力を消費し、オンチップ・データ処理を非現実的なものにする。

本発明者らは、上記欠点の１つ以上を対処する、新規の半導体および方法を本明細書において提案する。

本発明の第１の態様によれば、第１の出力信号を有し、電気的入力を受け取るように配された変換器を含む半導体デバイスが提供される。前記変換器は、前記第１の出力信号をオン状態とオフ状態の間で切り替える。前記デバイスは、化学的入力を受け取るために配された変換器につながれた化学的検出表面を含む。信号発生器は、変換器の切り換え点を変えるために、前記入力の１つ以上を振動させる。

振動入力は、化学的入力および／または電気的入力であってもよい。

出力信号はパルスであってもよく、当該パルスのオンまたはオフの期間は、前記化学的入力によって変調された、振動入力によって決定される。

信号発生器は、化学薬品を放出または吸着するように配された滴定電極を含んでもよく、当該化学薬品は、化学的検出表面によって検知されたイオンの濃度に影響を及ぼす。信号発生器は、滴定電極に振動電流を供給するためにさらに制御装置を含み得る。

前記化学薬品は、好ましくは、水素イオンまたは水酸化物イオンである。

信号発生器は第１の出力信号を、第１の期間の間オンに、第２の期間の間オフに切り換えるために、化学的入力信号を振動させてもよい。信号発生器は、第１の期間の間、第１の電気的出力信号をオンに、第２の期間の間オフに切り換えるために、同様に電気的入力信号を振動させてもよく、さらに、前記化学的入力信号は、第１および第２の期間を変調する。

信号発生器は、ゲート、ソース、ドレインまたはバルクの１つで、変換器に含まれるトランジスタに、振動電気的入力信号を提供してもよい。

化学的検出表面の近傍の検知されるイオンは、第１の出力信号を変調する変換器にバイアスをかけるために、化学的入力信号を提供し得る。

変換器は、ＣＭＯＳインバータを形成するために、第２のタイプの第２のトランジスタに接続された第１のタイプの第１のトランジスタを含み得る。化学的に感知可能な表面は第１および第２のトランジスタのゲートに結合され得る。ゲートは浮遊ゲートであってもよい。

第１の電気的出力信号は、論理回路を形成するために、１つ以上のさらなるトランジスタに供給され得る。

前記装置は、第１の電気的出力信号を受け取る復調器をさらに含んでもよく、当該復調器は、化学的入力信号の量を表す第２のデジタル出力信号を提供する。

復調器は、フェーズ復調器または時間デジタル変換器（ＴＤＣ）のいずれかであり得る。

前記装置は、第２の出力信号に接続されたエンコーダをさらに含んでもよく、該エンコーダは、２ビットのバイナリーコードを含む第３の出力信号を提供するように配される。

好ましくは、信号発生器の振動波形は、鋸波、正弦波または三角波の１つとして提供される。

本発明の第２の態様によれば、前記第１の態様による装置を用いて流体中の検体の１以上の成分を測定する方法が提供され、当該方法は、（ｉ）前記化学的検出表面に流体を供給する工程、（ｉｉ）変調された第１の出力信号を提供するために、入力の１つ以上を振動させる工程、（ｉｉｉ）第１のイオン濃度を表わす第１のデータを提供するために、変調された第１の出力信号を復調する工程、（ｉｖ）検体に特異的な試薬を流体と組み合わせる工程であって、これによって、前記試薬が前記検体と反応する場合にイオンが生成される、工程、（ｖ）変調された第１の出力信号を提供するために、入力の１つ以上を振動させる工程、（ｖｉ）第２のイオン濃度を表わす第２のデータを提供するために、変調された第１の出力信号を復調する工程、（ｖｉｉ）イオン濃度の変化を定量化するために、第１および第２のデータを比較する工程、ついで（ｖｉｉｉ）検体の成分を測定するために、試薬が検体と反応したか否かを決定するために、イオン濃度の変化と閾値とを比較する工程を含む。

前記方法は、イオン濃度を表す第１および第２のデジタル出力信号を提供するために、第１および第２の変調された出力信号を復調する工程と、ついで、流体中のイオン濃度の変化を定量化するために、第１および第２のデジタル出力信号を比較する工程をさらに含み得る。

前記方法は、工程（ｉｖ）の後に、流体から残存する試薬を取り除く工程をさらに含み得る。確かに、少なくとも工程（ｉｉ）から工程（ｖｉ）が繰り返され、検体のさらなる成分を測定することも好ましい。

検体は、好ましくは配列決定される核酸テンプレートであり、試薬は既知のタイプのヌクレオチドである。したがって、イオン濃度は、ヌクレオチドが核酸テンプレート上に挿入されるかどうかに依存して変化することが好ましい。

イオン濃度の変化は、理想的には、核酸テンプレート上に挿入されたヌクレオチド塩基の数と相関する。

エンコーダは、挿入されたヌクレオチドのタイプを表わす２ビットのバイナリーコードを提供し得る。

本発明の第３の態様によれば、緩衝流体中のイオン濃度を測定する方法が提供され、当該方法は、（ｉ）当該流体にさらされたＩＳＦＥＴからの電気的出力信号を監視する工程、（ｉｉ）前記出力信号があらかじめ決定された閾値に達するまで、前記イオン濃度を変化させるために、滴定電極から前記流体に化学薬品を放出または吸着する工程、および（ｉｉｉ）放出または吸着された前記化学薬品の量を測定する工程を含む。

前記方法は、緩衝能および放出あるいは吸着された化学薬品の量を知ることで、当初のイオン濃度を測定し得る。したがって、前記方法は、（ｉｖ）前記緩衝能および放出あるいは吸着された化学薬品の量を知ることで、当初のイオン濃度を測定する工程をさらに含み得る。また、前記工程は、さらに、２つの異なる時間に、または、異なる流体を用いて、前記工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返し得る。

そして、その後、各工程（ｉｉ）において放出あるいは吸着された化学薬品の量の差を知ることで、当初のイオン濃度の差を決定する工程（ｉｖ）を含み、各工程（ｉｉ）の前の緩衝能はほぼ同じである。

前記方法は、２つの異なる時間に、または、異なる流体を用いて、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返してもよく、ついで、工程（ｉｖ）は、各工程（ｉｉ）において、化学的に放出あるいは吸着された量を知ることで当初のイオン濃度の差を決定し、ここで、各工程（ｉｉ）の前の緩衝能はほぼ同じである。当該方法は、前記流体からのまたは前記流体へのほぼ同じ量の前記化学薬品を、滴定電極に吸着するか、あるいは、滴定電極から放出することによって、工程（ｉｉ）の効果を取り消すことを含んでもよい。

したがって、前記方法は、好ましくは、前記流体からのまたは前記流体へのほぼ同じ量の前記化学薬品を、滴定電極に吸着するか、あるいは、滴定電極から放出することによって、工程（ｉｉ）の効果を取り消すか、あるいは逆にすることを含んでもよい。したがって、当該方法は、好ましくは、前記流体からのまたは前記流体へのほぼ同じ量の第２の化学薬品を、滴定電極に吸着するか、あるいは、滴定電極から放出することによって、工程（ｉｉ）の効果を取り消すか、あるいは逆にすることを含んでもよい。

工程（ｉｉ）の時間は、２秒より長く、好ましくは、５秒、１０秒または３０秒よりも長い。

工程（ｉｉ）の時間は、２００秒未満であり、好ましくは、１００秒、６０秒または５０秒未満である。

前記出力信号とイオン濃度との関係は、既知であることが好ましい。

好ましくは、閾値は、出力信号のあらかじめ定義された変化、出力信号のあらかじめ定義された変化速度、あるいは、オンからオフへの変化またはその逆の出力信号の状態のうちの１つである。

イオン濃度の変化は、好ましくは化学反応による。放出された量あるいは吸着された化学薬品の量は、好ましくは、制御装置によって滴定電極に提供される合計の電荷として決定される。

本発明は、ＩＳＦＥＴ信号を処理するために単純化された構造を提供し、当該構造は、センサーおよび処理のシングルチップとの一体化の能力を増加させる。好ましい実施形態の固有のアナログ・デジタル変換は、信号調整およびアナログ処理のためのいくつかの工程の必要性を取り除くだけでなく、先行技術デバイスと比較して、これらの工程に関連した電気的雑音を減少させる。

したがって、さらなる態様では、上で議論した装置のアレイが提供される。該アレイは、どの第１の出力信号が復調されるかを選択するために、各デバイスに接続されたマルチプレクサーを含んでもよい。好ましくは、該アレイは、前記変換器がＣＭＯＳインバータを形成するために第２のタイプの第２のトランジスタに接続された第１のタイプの第１のトランジスタを含む、装置である。好ましくは、前記アレイは、個々のデバイスを作動させるまたは停止させるために、各々の前記第２のトランジスタに接続されたマルチプレクサーを含む。該アレイは、各デバイスからの出力信号を符号化するためにＣＤＭＡプロセッサーをさらに含み、好ましくは、前記出力信号が１つのチャネル上に送信されるのを可能にする。

本発明の特定の実施形態は、添付の図面を参照して、ほんの一例としてここに記載される。

好ましい実施形態のシステムのブロック図である。 変換器の４つの概略的な配置を示す。 読み出し回路の概略図である。 核酸反応の出力信号のグラフを示す。 振動化学的入力を有するシステムの入出力信号のグラフを示す。

本発明を含むシステムにおいて、センサーおよび信号処理部を収容する半導体基板は、典型的には、流体チャネルと１以上のチャンバーを含む基板によって覆われているだろう。チャンバーには、測定されるイオン濃度を有する流体が入る。イオン濃度は一定であってもよく、変化してもよい。該変化は、イオンを放出または吸着する化学反応の結果であってもよい。そのようなシステムの検出限界は、ａ）イオン濃度の変化を隠す流体中の緩衝の量、および、ｂ）電流が流れて、検知されるのを可能にするために、イオン電荷が電場を形成することを要求するトランジスタの電気的な特徴、によって管理される。これらは、超過すべき閾値とみなすことができる。本発明では、制御された振動信号がシステムに提供され、該信号は、検知可能な出力信号を提供するために、化学信号／イオン信号と組み合わせて、これらの閾値の一方または両方を超える。制御された信号の効果は、化学信号の寄与の効果を測定するために、出力信号から引かれる。制御された信号を振動させることによって、システムへの正味の効果は時間と共にゼロになる。振動信号は、理想的には、閾値が交わる点が決定され得るように、一定の期間、継続的に変化している。

１つの実施形態では、振動信号は、緩衝液中のイオン濃度を変更するために流体に提供される化学物質である。別の実施形態では、振動信号は、電気的な動作点を変更するためにセンサー変換器に提供される電気信号である。これらの実施形態の組み合わせが予想され、本発明の範囲内である。

そのようなシステムにおいて、化学信号は、出力信号を調節し、データ処理のために効率的な形でそれを行うとみなすことができる。理想的には、化学的濃度は、さらに処理されるデジタル信号に変換される。この信号の処理はハードウェアまたはソフトウェアで行なわれてもよい。

（電気振動）
典型的なシステムのブロック図が図１に示される。検体の濃度（検体がサンプルにないゼロ濃度を含む）を含む流体サンプルは、検体の濃度をアナログ電気信号に変換するＩＳＦＥＴの化学的検出表面に接している。変換器は化学信号をアナログ信号に変換する。変換器は振動信号の入力部に接続される。化学信号および振動信号は組み合わせて振動出力信号を生成する。変換器がＣＭＯＳインバータのＩＳＦＥＴ形成部分を含む場合、変換器は、示されるようなパルス出力信号を生成するために電源をオンおよびオフするであろう。アナログ化学信号は、位相ずれまたはパルス幅が変わるように、出力信号を調節するのに貢献する。この変化は化学的濃度を表す。その後、時間−デジタルコンバータまたは位相復調器は、パルス信号を復号し、デジタル信号を出力する。振動入力信号からの寄与は、正味の化学的寄与を残すために差し引かれることができる。これらの信号はあらかじめ処理され、メモリに保存されてもよい。時間−デジタルコンバータは、以下に記載されるタイプであってもよい：Ｊｉａｎｊｕｎ Ｙｕ ｅｔ ａｌ， １２−Ｂｉｔ Ｖｅｒｎｉｅｒ Ｒｉｎｇ Ｔｉｍｅ−ｔｏ−Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ ｉｎ ０．１３ ｕｍ ＣＭＯＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＩＥＥＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＯＬＩＤ−ＳＴＡＴＥ ＣＩＲＣＵＩＴＳ， ＶＯＬ． ４５， ＮＯ． ４， Ａｐｒｉｌ ２０１０、または、 Ｇｏｒｄｏｎ Ｗ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｉｍｅ−ｔｏ−Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ−ｔｏ−Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒｓ， ＩＥＥＥ ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＯＮＳ ＯＮ ＣＩＲＣＵＩＴＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＩＩ： ＥＸＰＲＥＳＳ ＢＲＩＥＦＳ， ＶＯＬ． ５７， ＮＯ． ３， Ｍａｒｃｈ ２０１０。

以下にさらに議論されるように、信号は、断片化したＤＮＡ鎖の一連のヌクレオチド取り込み反応を表してもよく、その場合には、信号はアルゴリズムユニットをマッピングすることにより完全なＤＮＡを配列決定するためにさらに処理される。

図２ａで描かれた１つの実施形態では、化学的検出層（２３）は、インバータとして配された２つのトランジスタ（２４と２５）によって共有される浮遊ゲート（２０）に結合される。出力部（２２）は排水管に接続される。ゲート上の電圧は、出力が本質的にデジタルであるように、１つのトランジスタを作動させ、もう一方を作動させない効果を有するであろう。この配置と動作に関するさらなる引用については、国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／００２３７６を参照のこと。さらなるデバイスによる手法は、バルク入力調節を用いる２（ｂ）または２（ｃ）、または、偽りのＣＭＯＳロジックを用いる２（ｄ）にも拡張され得る。

トランジスタの端子に信号発生器を接続することによって、トランジスタは、出力が、必要に応じて、化学信号に出力を調節させることできるためのあらかじめ決められた形であるように、バイアスをかけられる。振動信号は、トランジスタのゲートに容量的に結合された半導体基板において信号発生器によって提供されてもよい。例えば、信号発生器からの振動信号は、設定時間の間作動させたり止めたりするために、トランジスタに電気的にバイアスをかけることができ、任意の化学信号が該設定時間を調節するためにバイアスに加えられる。典型的には、振動の電圧は、ＶｓｓとＶｄｄの間で継続的に変化するであろう。例えば、信号は０Ｖから３．３Ｖまで変化してもよい。鋸波形、正弦波形、または、三角波形が好ましい。振動信号の頻度は、アレイを走査する頻度、観察される化学反応の時間的間隔、および、イオン濃度の変化を検知するためにデジタル出力信号に必要とされる分解能などの因子によって決定される。

ＩＳＦＥＴインバータは、特定の頻度で、共通のまたは個々の信号によって駆動されることができ、出力信号位相は、水素または他の標的イオン濃度によって調節されるであろう。本質的に化学的に調節されたデジタル信号になる出力信号は、読み出しと処理のブロックを劇的に単純化し、ほとんどの電気的な雑音に影響されない。

変換器とチャンバーの数は用途に依存するであろうが、好ましい実施形態では、１０以上、１００以上、１，０００以上、１０，０００以上、１００，０００以上、または、１，０００，０００以上のアレイがある。多くの変換器とチャンバーを必要とする用途において、大きさは一般的により小さくなる。好ましい実施形態では、チャンバーの体積は、１ｍＬ未満、１０ｕＬ未満、１００ｎＬ未満、３０ｎＬ未満、１ｎＬ未満、または、１００ｐＬ未満である。

符号分割多重アクセス（ＣＤＭＡ）技術は、変換器のアレイにおいて各変換器ピクセルからのデータを符号化するために該システム中に取り込まれてもよく、これによって、すべてのピクセルデータが１つのチャネルに送られ得る。

単純化された読み出しシステムによって、本発明の方法およびは、個別のガラスＩＳＦＥＴまたはＣＭＯＳベースのＩＳＦＥＴのように、異なる技術で広く実施され得る。大規模な集積目的のためには、ＣＭＯＳベースのＩＳＦＥＴが望ましく、その実施についてさらに説明するために以下に記載される。

図２（ａ）の実施形態とは対照的に、振動信号は、図２（ｂ）に示されるようなバルクに接続されてもよい。図２（ｃ）は、化学的検出表面が１つのＦＥＴに接続され、インバータの第２のＦＥＴが行選択信号（２６）によってスイッチを入れたり切ったりされるような、横並びのデバイスの第３の実施形態を示す。変換器の二次元アレイについては、図２（ｄ）に示される実施形態が望ましい。

図２（ｄ）では、単一のピクセルは、検出用トランジスタ、パストランジスタ、および、選択トランジスタから構成される。選択トランジスタは、単一の行または列の最終出力（２２）を制御するために使用され得る。行選択制御部（２６）または列選択制御部（２７）のどちらかが、振動信号に接続され得る。出力信号がデジタルであるので、トランジスタの大きさは、さらにサブミクロンまで縮小化可能であり、化学的なセットアップによってのみ制限することができる。これらの形態のいずれかにおいて、デジタル出力が使用されるので、信号の損失と歪みは無視できる。

すべての変換器ピクセルは、１つのバッファと１つのフロントエンドの読み出しを共有することができる。しかしながら、さらに処理を迅速に行うために、１つの行（または列）の変換器は、１つの読み出しチャネルを共有することができる。各々の読み出しチャネルでは、デジタルパルスは、デジタルインバータ（またはビットバッファ）を用いてバッファされる。図３は、位相変調されたパルス信号を読み出し、デジタルシーケンスを出力するための計数システム（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を示す。

時間−デジタルコンバータの出力部は、化学信号の変化を表す短い長さに切断されるであろう。この形態は、扱うデータと必要なメモリを減らすことができる。例えば、通常１２ビットの分解能を有する総出力は４ビットに減らされて、メモリに保存されるであろう。ベースラインは共通の信号として扱われ、同様に保存されるであろう。したがって、各ピクセルについて、必要とされる最大のデータは、ベースカウント時間４ビットと１０ビットの共通モード信号である。

（核酸の検出と同定への適用）
遺伝子検査の分野で、核酸（ＤＮＡとＲＮＡのような）の１つ以上のヌクレオチドを同定することが望ましい。典型的には、核酸の一本鎖は、核酸上のある点が同定されるまで、または、該点を含んで、プローブによってアニール処理される。ヌクレオチドは、鎖を伸張するために、プローブの３’末端へと組み込まれるようになるであろう。この組み込み反応は、適切に処理された検出表面を備えたＩＳＦＥＴによって検知可能な水素イオンを放出すると示されてきた。例えば、該表面は、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、タンタル酸化物、または、水素イオンに対して感度を有すると示されたそれ以外のものであってもよい。

ヌクレオチドは、反対側のヌクレオチドに相補的な場合に、組み込まれるようになるであろう。加えられた既知の化合物（例えば、ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＮＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、または、アレル特異的なプローブのタイプ）を、出力信号の変化（またはその欠如）に相互に関連付けることによって、核酸上の関心点のヌクレオチドを同定することができる。そのような適用および実施の詳細は、引用によって本明細書に組み込まれる特許出願ＵＳ１１／６２５８４４および特許ＵＳ７６８６９２９、並びにＵＳ７８８８０１５に記載されている。

（配列決定）
核酸中の単一のヌクレオチド塩基の同定に対する延長として、数十から数百のヌクレオチド塩基の配列を同定することが望ましい。

ショットガン法として知られている１つの方法では、ＤＮＡの全体鎖は小片へと切り取られ、検出冗長性（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を増加させるためにコピーされる。小片はセンサーピクセルのアレイで分けられる。したがって、すべてのピクセルデータは、ＤＮＡ小片のコピーを表す。塩基配列の重複、言いかえれば、メモリ中のデータの類似性を同定することによって、ＤＮＡ塩基配列全体がもたらされる。この比較は、デジタル論理、例えば、ＸＯＲ、ＡＮＤ、ＮＯＲ、ＮＡＮＤなどによって実行することができる。デジタル処理ブロックは、比較結果に基づいて配列を鎖状につなぐことができる。該処理は、計算の複雑さとメモリの要件を減らすために、前段プロセス部分へフィードバックしたマッピングの結果を用いて、検出機能と並行して実行可能である。

（結果）
６塩基長のＤＮＡに基づいたシミュレーション結果が図４で示され、ここで、グラフは、（ａ）反応時間全体（１６秒）にわたる４つのセンサーの各々での塩基の呼び出し順序と塩基の伸長、および、（ｂ）１つの反応全体（２秒）における各々のセンサーに関する振動基準信号と変調出力信号とを示す。

配列決定の方法の典型的なシミュレーションが、以下に記載され、図４に示される。設定されたパラメーターと出力は、処理の簡略化した結果を示す下の表で与えられる。同定される核酸（ＴＧＡＣＣＣ）はコピーされて切断され、１つのチャンバーに置かれた１つの断片を含む４つの断片（断片１、２、３、４）がもたらされる。各々のチャンバーは１つのセンサーを有する（センサー１、２、３、４）。通常、チャンバーには、所定の断片の何百万もの同一の複製物がある。プローブは、示された塩基まで（だが、該塩基を含まない）各々の断片に付けられる。プローブは理解しやすくするために示されていない。

加えられたヌクレオチドの順序（塩基の呼び出し順）は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）であり、これは、各々の断片が完全に伸長するまで繰り返される。流体は最初ｐＨ７に設定され、すべての塩基が加えられた後、ｐＨ７に再設定される。

この場合、２秒ごとに、新しい塩基が上に与えられた順に各チャンバーに加えられる。追加の塩基が水素イオンを放出するために反対側の塩基で断片に相補的ならば、伸長が生じるであろう。各々の塩基の伸長について、放出された水素は、特定のｐＨ減少、私たちの場合、塩基の伸長ごとに−０．２ｐＨの減少を引き起こすであろう。このｐＨは、ｐＨの変化（図４（ｂ））に関連する変調された幅または相を含む出力信号によって直接反映されるであろう。インバータが用いられる場合には、より多くのイオン放出をもたらすより多くの塩基の伸長が出力信号のＯＮ時間を減少させることに注意する。

センサーに対する振動入力信号は、図４（ｂ）に示されるような三角波であり、塩基追加の速度よりも頻度が高く、好ましくは、検知される最も小さな変化の速度よりも頻度が高い。

ｐＨ変化の量は、当初のパルス幅（すなわち、ｐＨ７）を取り除くことによって、この信号から抽出することができる。これは、１つの塩基当たりの変化速度で（私たちの場合、０．２ｐＨ／塩基）、ｐＨの変化を割ることによって、伸長された塩基の数へと変換される。図４（ａ）のセンサー出力を参照する。実際に、ｐＨ変化は、各々の塩基の伸長に関して直線的でなく、反応のあいだ瞬間的でもなく、安定してもいない。

既知の塩基の追加を伸長の数と相互に関連付けることによって、各断片の配列を同定することができる。各断片の塩基はエンコーダによって提供される２ビットのバイナリーコードによって表すことができる（例えば、００＝Ａ、０１＝Ｔ、１０＝Ｇ、１１＝Ｃ）。最後に、同定された断片は既知のマッピング技術（図示せず）を使用して再度集められる。

例えば、塩基追加の４秒間に、伸長反応からのｐＨ変化は１秒続くこともある。ｐＨの変化のピークと幅を捕らえて該変化を測定するために、ｐＨは、１秒間に１０回サンプリングされる。ＯＮ時間の幅は、４秒の反応窓にわたって変化するであろう。塩基伸長の定量化は、最小パルス幅、平均パルス幅、パルス幅の合計などを見る複雑なアルゴリズムを含んでもよい。

出力シーケンスがこの図式に容易に由来し得ることがわかる。

システムの好ましい実施形態の利点は以下のとおりである。
−ＩＳＦＥＴの新しい構造形態を使用することによって、単一の検出ピクセルのためのトランジスタの合計数は、２まで減らすことができる（選択トランジスタを含む）。
−アナログ処理回路は必要ない。

出力は、デジタル処理回路によって引き起こされた変換時間とほとんどの電気的な雑音に影響されない。

デジタル論理が採用されるためトランジスタのサイズをもっと小さくすることができ、トランジスタの不一致を無視できる。

処理ブロックとメモリブロックは、１つのチップに統合することができる。

すべての検出が同期されるので、配列決定と比較はすべてのピクセルに関して正確に起こりうる。配列決定は反応と同時に行なうことができ、処理時間を劇的に減らして処理精度を改善する。

１つの実施形態では、基準信号は、任意のバックグラウンドのイオン濃度（例えば、前の挿入工程から残っている濃度）を補償する各ヌクレオチドの挿入工程の前にリセットされる。バックグラウンドの化学信号とともにリセットされた基準信号は、このように一貫した前挿入基準出力信号、すなわち、現在のヌクレオチド挿入工程による濃度変化を表す出力信号に対する任意のその後の変調をもたらす。

核酸の配列決定に加えて、該デバイスは、他の化学薬品を同定するために使用されてもよい。例えば、様々な種類のいくつかの識別可能な要素を有する複合分子は、検体特異性試薬による段階的な（または、繰り返される）反応を用いて同定することができる。デジタル出力は分子の正確な種類を同定するであろう。

（化学振動）
上述の通り、ひとつの実施形態において、システムへの化学的入力は、当初のイオン濃度が出力信号を変調するために作用するように制御された化学信号によって変えられてもよい。組み合わされた化学信号は、（ａ）緩衝液中のイオン濃度を検査するために、および（ｂ）トランジスタの電気的な動作点（閾値下、線形、飽和）を検査するために、ある範囲にわたって掃引（ｓｗｅｅｐ）され得る。前者は、当初のイオン濃度が、任意の小さな変化が緩衝液によりマスキングされるような緩衝能内であるときに有用である。後者は、上述のように、当初のイオン濃度により変調された幅の出力パルスを生成するために、インバータで操作され得る。２つの効果は、追加の滴定液がイオン濃度の作動点を緩衝能以上に引き上げ、インバータの切り換え点も越えるように組み合わされ得る。

効果を図５に示す。グラフ５（ａ）において、制御量の滴定液は第１の期間にわたって流体に加えられ、第２の期間にわたって除去される。したがって正味の化学効果がシステムへ与える影響はゼロである。グラフ５（ｂ）において、２つの事例のｐＨが同期間にわたり示されている。第１の事例（実線）では、水素イオン濃度は緩衝能に比べて低く、そのため検出可能なｐＨ変化が生じるまで長い時間がかかる。第２の事例（破線）では、水素イオン濃度は緩衝能に比べて高く、そのため検出可能なｐＨ変化が生じるまでにかかる時間は短い。イオン濃度が緩衝能を超過するとき、加えられた滴定液の量当たりのｐＨ変化速度は早くなる。これは、水平な緩衝線のあとの急な勾配として見られる。

当初のイオン濃度は、勾配が閾値勾配に達するか、ｐＨ変化が閾値（加えられた滴定液の量）を超過するまで、時間により測定され得る。時間と濃度との関係が逆であることは明らかである。関係は化学システムのモデルにより測定され得るか、実験的に測定され得る。関係はメモリに参照表として記憶され得る。

グラフ５（ｂ）におけるｐＨは、検出および測定するＩＳＦＥＴからのアナログ出力信号を生成するために使用され得る。上述のとおり、イオン感応性スイッチを形成することも可能であり、２つのＦＥＴは、イオン濃度が閾値を超過する（図５（ｂ）における上位の水平線と同定される）際にスイッチを入れられるようにバイアスをかけられたインバータとして配置される。このようにして出力はオンまたはオフとなり、オンの期間は図５（ｃ）に示されるように当初のイオン濃度によって決まる。

滴定反応は元来緩慢であり、そのため好ましい実施形態における振動期間は、２秒より長く、好ましくは５秒より長く、１０秒より長く、または３０秒より長い。しかしながら、前記期間は、イオン濃度の変化を逃したり検出時間を遅らせたりるほど長くなってはならない。したがって好ましい実施形態において、振動期間は、２００秒未満、好ましくは１００秒未満、６０秒未満、または５０秒未満である。

当初のイオン（Ｉ）を加えた滴定されたイオン（Ｔ）の濃度が緩衝能（Ｂ）を上回るとき、閾値は達成され得る。

イオン濃度の変化が検出される事例において、当初のイオン濃度は上述および図５に示される工程を使用して、第１の時間に測定される。工程は、閾値に達するためにより多くまたはより少ない滴定液が必要であったかどうかを測定するために、第２の時間に反復される。

閾値は、以下のとき第１の時間に達成される：

Ｔ１＋Ｉ１＞Ｂ

閾値は、以下のとき第２の時間に達成され：

Ｔ２＋Ｉ２＞Ｂ

したがって、（緩衝能（不明）を問わず）以下のようになる
（Ｉ１−Ｉ２）＝ΔＩ＝Ｔ２−Ｔ１

よって、当初のイオン濃度の変化は、閾値に達するための各時間で必要とされる滴定量からわかる。

当初のイオン濃度が一度だけ測定される事例において、第１の期間に滴定液が加えられるか取り除かれるが、第２の期間で効果が逆にならないように、滴定は一方向であり得る。絶対的な当初のイオン濃度を測定するために、流体の緩衝能および、閾値（例えば、勾配または変化）に達する容量を超過するように加えられた滴定液の量を知ることが必要である。

すなわち、Ｂ−Ｔ＝Ｉ

いずれの事例においても、滴定電極は化学薬品を加えるか放出するために作動され得、化学薬品は検出されるイオン濃度に影響を与える。効果は、イオン濃度を初期の濃度から増加あるいは減少させるためのものであり得る。

加えられた滴定液は、所定量である必要はなく、むしろ閾値のうちの一つが達成されるまで加えられてもよい。この場合、加えられた量は計算される。

滴定は滴定電極を流体にさらすことで達成され得る。電極は、制御量の電流を提供する制御装置へ接続されている。経時的に電流の積分を計算すると既知の変化量が得られ、これは電極に放出または吸着された滴定液の量に比例する。滴定電極はＢ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｏｏｔら“Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ， ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｅｎｓｏｒ−ａｃｔｕａｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｉｄｅａ ｔｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ”， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ １０５ （２００５）８８−９５に記載のタイプで有りうる。

負の電荷を帯びた電極での滴定反応は、以下のように示される：

２Ｈ_２Ｏ＋ｅ⁻→Ｈ_２（ガス）＋２ＯＨ⁻

これはpＨを上昇させる効果を有する。

正の電荷を帯びた電極での滴定反応は、以下のように示される：

２Ｈ_２Ｏ−ｅ⁻→Ｏ_２（ガス）＋４Ｈ^＋

これは、ｐＨを低下させる効果を有する。

本発明は、上記の好ましい実施形態の観点から説明されているが、これらの実施形態は一例にすぎず、請求の範囲はこれらの実施形態に限定されるものではないと理解されるべきである。当業者は、添付の請求の範囲内にあると考えられる本開示を考慮した上で、変更および代替案を加えることができる。例えば、接続に対する言及は、必要に応じて直接または間接的に為されてもよい。本明細書に開示または例示された各特徴は、単独であるか、あるいは本明細書に開示または例示された任意の他の特徴と適切に組み合わされているかに関らず、本発明に組み込まれ得る。

Claims (5)

1. 複数の鋳型ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、該方法は、
   流体中の検体の１以上の成分を測定する方法であって、
   前記方法は、
   （ｉ）化学的変換器に流体を供給する工程、
   （ｉｉ）第１の電気出力信号をオン状態とオフ状態の間で切り替えるために、前記化学的変換器に１以上の入力信号を振動させる工程であって、前記流体のイオンの濃度が前記第１の電気出力信号のオン状態又はオフ状態のパルス幅を変調する、工程
   （ｉｉｉ）検体に特異的な試薬を流体と組み合わせる工程であって、これによって、試薬が検体と反応する場合にイオンが生成される、工程、
   （ｉｖ）第２の電気出力信号をオン状態とオフ状態の間で切り替えるために、前記化学的変換器に１以上の入力信号を振動させる工程であって、前記流体のイオンの濃度が前記第２の電気出力信号のオン状態又はオフ状態のパルス幅を変調する、工程、
   （ｖ）流体のイオン濃度の変化を定量化するために、第１および第２の出力信号の位相ずれ又はパルス幅の変化を比較する工程、および、
   （ｖｉ）検体の成分を測定するために、試薬が検体と反応したか否かを決定すべく、イオン濃度の変化と閾値とを比較する工程を含む、ことを特徴とする方法。
2. イオン濃度を表す第１および第２のデジタル出力信号を提供するために、第１および第２の変調された出力信号を復調工程に続いて、流体のイオン濃度の変化を定量化するために、第１および第２のデジタル出力信号を比較する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（ｉｖ）の後に、流体から残存する試薬を取り除く工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 検体のさらなる成分を測定するために、前記工程（ｉｉ）から前記工程（ｖｉ）を繰り返す工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 検体は配列決定される核酸テンプレートであり、試薬は既知のタイプのヌクレオチドであり、
   イオン濃度は、ヌクレオチドが核酸テンプレート上に挿入されるかどうかに依存して変化する、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。