JP6431928B2 - 光音響顕微鏡及び光音響信号検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、光音響顕微鏡及び光音響信号検出方法に関するものである。

光音響とは、物質に吸収波長域の光を照射した際に生じる熱弾性過程において発生する弾性波の一種である。そのため、光音響は、吸収特性をイメージングする手法として注目されている。

光音響波を検出信号として、イメージングに適用する光音響顕微鏡では、観察対象物の吸収波長域に合わせたパルス光を励起光として用いる。この励起光を対物レンズにより集光して標本内を集光スポットにより走査する。これにより、各集光スポット位置で発生する光音響波をトランスデューサ等で検出する手法が用いられている。

光音響顕微鏡において、超解像画像を得る構成が、例えば、非特許文献１に提案されている。これは、光音響顕微鏡にて同じ場所を２回撮影する。１回目の撮影によりサンプルは、光学スポット中心のほうが光学スポット周辺に比べよりブリーチされる。同じ場所をもう一度測定し、信号の差分を求めると１回目の撮影でブリーチしたスポット径を得ることが出来る。結果として超解像画像を得ることが出来る。

J. Yao, L. Wang, C. Li, C. Zhang, and L. V. Wang, "Photoimprint Photoacoustic Microscopy for Three-Dimensional Label-Free Subdiffraction Imaging," Physical Review Letters 112(1), 014302(Jan. 2014)

しかしながら、非特許文献１に提案された手法では、観察対象物の同じ場所を２度撮影する必要がある。このため、画像を取得するために時間がかかってしまう。また、観察対象物である吸収体をブリーチさせる必要がある。このため、観察対象物にダメージを与えてしまう。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、観察対象物にダメージを与えることなく、一度の撮影で超解像画像を得ることができる光音響顕微鏡及び光音響信号検出方法を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の光音響顕微鏡は、
パルス光を発生させる光源と、
試料に、光源から発するパルス光を集光して照射する集光光学系と、
パルス光の照射により試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出部と、
音響信号に基づいて試料の画像信号を形成する画像信号形成部と、
試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報部と、
情報に基づいて光源からのパルス光の強度を変更するパルス光強度変更部と、を有し、
情報部は、試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を生成する情報生成部であり、
情報生成部は、情報に基づいてパルス光の強度に対する音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として算出する閾値算出部を有し、
閾値算出部により算出した閾値に基づいて、光源のパルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更部を有し、
パルス光強度変更部は、以下の条件式（１）を満足するように光源のパルス光の強度を変更することを特徴とする。
１．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
ただし、
ＩＴは閾値算出部により算出した閾値、
ＩＰは変更後のパルス光の集光位置における強度のピーク値、
である。
また、本発明に従う他の側面の光音響顕微鏡は、
パルス光を発生させる光源と、
試料に、光源から発するパルス光を集光して照射する集光光学系と、
パルス光の照射により試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出部と、
音響信号に基づいて試料の画像信号を形成する画像信号形成部と、
試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報部と、
情報に基づいて光源からのパルス光の強度を変更するパルス光強度変更部と、を有し、
情報部は、試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を格納している情報格納部であり、
情報格納部は、パルス光の強度に対する音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として格納し、
閾値に基づいて、光源のパルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更部を有し、
パルス光強度変更部は、以下の条件式（１）を満足するように光源のパルス光の強度を変更することを特徴とする。
１．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
ただし、
ＩＴは閾値、
ＩＰは変更後のパルス光の集光位置における強度のピーク値、
である。

また、本発明に従う他の側面の光音響信号検出方法は、
パルス光を発生させる発光工程と、
試料に、発光工程から発するパルス光を集光して照射する集光工程と、
パルス光の照射により試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出工程と、
音響信号に基づいて試料の画像信号を形成する画像信号形成工程と、
試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報工程と、
情報に基づいて光源からのパルス光の強度を変更するパルス光強度変更工程と、を有し、
情報工程は、試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を生成する情報生成工程であり、
情報生成工程は、情報に基づいてパルス光の強度に対する音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として算出する閾値算出工程を有し、
閾値算出工程により算出した閾値に基づいて、発光工程のパルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更工程を有し、
パルス光強度変更工程において、以下の条件式（１）を満足するように発光工程のパルス光の強度を変更することを特徴とする。
１．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
ただし、
ＩＴは閾値算出工程により算出した閾値、
ＩＰは変更後のパルス光の集光位置における強度のピーク値、
である。
また、本発明に従うさらに他の側面の光音響信号検出方法は、
パルス光を発生させる発光工程と、
試料に、発光工程から発するパルス光を集光して照射する集光工程と、
パルス光の照射により試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出工程と、
音響信号に基づいて試料の画像信号を形成する画像信号形成工程と、
試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報工程と、
情報に基づいて光源からのパルス光の強度を変更するパルス光強度変更工程と、を有し、
情報工程は、試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を格納している情報格納工程であり、
情報格納工程は、パルス光の強度に対する音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として格納し、
閾値算出工程により算出した閾値に基づいて、発光工程のパルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更工程を有し、
パルス光強度変更工程において、以下の条件式（１）を満足するように発光工程のパルス光の強度を変更することを特徴とする。
１．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
ただし、
ＩＴは閾値算出工程により算出した閾値、
ＩＰは変更後のパルス光の集光位置における強度のピーク値、
である。

本発明は、観察対象物にダメージを与えることなく、一度の撮影で超解像画像を得ることができる光音響顕微鏡及び光音響信号検出方法を提供できるという効果を奏する。

（ａ）〜（ｄ）は、光音響信号による超解像の概略を示す図である。 （ａ）〜（ｆ）は、光音響信号による超解像の概略を示す図である。 （ａ）、（ｂ）は、閾値を算出するための概略を示す図である。 （ａ）は、第１実施形態に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。（ｂ）は、第１実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。 第１実施形態に係る光音響顕微鏡における光音響検出方法の手順を示すフローチャートである。 （ａ）、（ｂ）は、閾値の算出と、超解像に関して説明する図である。 （ａ）は、第２実施形態に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。（ｂ）は、第２実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。 （ａ）は、第３実施形態に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。（ｂ）は、第３実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。（ｃ）は、光源から出力されるパルス光の特性を示す図である。 （ａ）は、第４実施形態に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。（ｂ）は、第４実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡の概略構成を示す図である。（ｃ）は、光源から出力されるパルス光の特性を示す図である。

本実施形態の光音響顕微鏡及び光音響信号検出方法の構成による作用効果を説明する。なお、この実施形態によって本発明は限定されるものではない。すなわち、実施形態の説明に当たって、例示のために特定の詳細な内容が多く含まれるが、これらの詳細な内容に色々なバリエーションや変更を加えても、本発明の範囲を超えない。従って、以下で説明する本発明の例示的な実施形態は、権利請求された発明に対して、一般性を失わせることなく、また、何ら限定をすることもなく、述べられたものである。

（第１実施形態）
まず、第１実施形態の光音響顕微鏡における超解像に関して、説明する。
図１（ａ）は、本実施形態において観察対象物である試料に対して対物レンズで照射され、対物レンズで集光されたパルス光の１ラインにおける強度分布を示している。横軸は位置、縦軸は強度をそれぞれ示す。いずれも任意単位である。ここでは光学分解能限界まで集光していることとする。

図１（ｂ）は、パルス光１０がチャート１１を点線の方向に沿って走査する状態を示している。チャート１１は、光学観察では分解できない間隔で並んでいる２本の矩形のチャート１１ａ、１１ｂである。

図２（ｂ）は、光源からの光の試料への入射光の強度ＬＩ（横軸：任意単位）と、観察される音響信号の強度ＳＩ（縦軸：任意単位）との一般的な関係を示している。なお、以下の図面において、特に明示しない限り、横軸、縦軸は、任意単位である。図２（ｂ）に示すスケールにおいては、入射光の強度ＬＩと音響信号の強度ＳＩとは線形な直線１４の関係である。

図２（ｃ）は、入射光の強度ＬＩと音響信号の強度ＳＩとは線形な直線１４の関係である場合に、チャート１１ａ、１１ｂを光音響にて撮影した場合の光学像の強度分布１５ａ、１５ｂを示している。横軸は位置、縦軸は、像強度を示している。

図２（ｆ）中の強度分布１８は、光学像の強度分布１５ａ、１５ｂを加算した強度分布である。強度分布１８から明らかなように、光学的には解像できないチャートを、従来の光音響顕微鏡では解像できないことがわかる。
この場合に観察される像１２を、図１（ｃ）に示す。

一方、図２（ｄ）は、本実施形態における、試料に入射するパルス光の強度（横軸）と、試料から発生する音響信号の強度（縦軸）との関係を表す情報（曲線１６）を示す図である。図２（ｄ）において、例えば、像強度＝０．２よりも小さい領域では、像強度信号は曲線的に小さくなる。このため、ＬＩとＳＩのグラフを記載した場合の変曲点近傍の入射強度、例えばＬＩ＝０．３でチャートを撮影すると、図２（ｅ）に示すような２つの光音響信号１７ａ、１７ｂを得られる。この場合に、観察される像１３ａ、１３ｂを、図１（ｄ）に示す。

光音響信号１７ａ、１７ｂを加算した信号強度分布１９を図２（ｆ）に示す。信号強度分布１９から明らかなように、光学的には解像できないチャートを、本実施形態の光音響顕微鏡では解像できることがわかる。

また、図２（ｄ）のような関係は、信号の出だし部分に存在する場合がある。しかしながら、図２（ｄ）の曲線で示すような関係は、入射光調整最小単位よりも小さい入射光量部分の領域において発生していることが多い。例えば、図３（ａ）、（ｂ）の場合を考える。閾値ＩＰが０．０４にある場合、ＬＩを０．１単位で調整していると、入射光の強度ＬＩと音響信号の強度ＳＩとは図３（ａ）のような線形関係となる。
ここで、入射光の強度ＬＩを０．０１単位で調整した場合は、入射光の強度ＬＩと音響信号の強度ＳＩとは図３（ｂ）のような曲線関係となる。

図３（ｂ）は、図３（ａ）において点線の丸で囲んだ部分を拡大して示している。図３（ｂ）において、実線で示す曲線のうち、直線状の部分を延長した点線と、強度ＳＩ＝０との交点である閾値ＩＰ＝０．０４が求められる。試料に照射される１パルスあたりのパワーＬＩが、閾値ＩＰであれば、図２（ｆ）の信号強度分布１９のように超解像の画像を得ることができる。

図４（ａ）は、第１実施形態の光音響顕微鏡１００の概略構成を示している。第１実施形態の光音響顕微鏡１００は、試料を自動的に測定する構成である。光源１０２は、パルス光を発生させる。集光光学系である対物レンズ１０３は、試料１０４に、光源１０２から発するパルス光を集光して照射する。

パルス光源１０２は、例えば、試料１０４が生体で、生体内の血管をイメージングする場合、ヘモグロビンの吸収波長の励起光を射出する。なお、観察対象は血管に限定するものではなく、メラニン等の内因性物質のイメージングに適用することができる。この際、パルス光（励起光）Ｌは対象となる物質の吸収波長の光を用いればよい。

また、蛍光体や金属ナノ粒子等の外因性物質のイメージングに適用することも可能である。この際、パルス光（励起光）Ｌは、蛍光体の場合には対象となる蛍光体の吸収波長域の光を、金属ナノ粒子の場合には対象となる金属ナノ粒子の共鳴波長域の光をそれぞれ用いればよい。

また、試料１０４内に複数の吸収物質が存在する場合には、観察対象物の特徴的な吸収スペクトルのピークの波長の光を用いるのが望ましい。パルス光源１０２は、制御部１０１によりパルス光の発光タイミングが制御される。

パルス光源１０２からのパルス光Ｌは、可変ＮＤフィルター１１３を透過して対物レンズ１０３に入射する。可変ＮＤフィルター１１３としては、例えば透過率が０〜１００％の範囲で可変な液晶フィルターを用いることができる。閾値ＩＰを求めるため、後述するフローチャートの手順に従って、可変ＮＤフィルター１１３により光量を調節する。

対物レンズ１０３を射出したパルス光（励起光）Ｌは、対物レンズ１０３の焦点位置に集光する。試料１０４はパルス光（励起光）Ｌの集光スポットと重なるように配置される。

音響信号検出部１０６は、パルス光の照射により試料から発生する音響信号を検出する。なお、少なくとも対物レンズ１０３と試料１０４との間、及び試料１０４と音響信号検出部１０６との間には、光音響波が伝搬し易い水等の光音響波伝達媒質が充填されることが望ましい。

音響信号検出部１０６は、例えば、光音響波を検出するトランスデューサである。音響信号検出部１０６は、時間変化に対する光音響波の波形を、出力信号として制御部１０１を介して、画像信号形成部１１０に出力する。画像信号形成部１１０は、音響信号に基づいて試料１０４の画像信号を形成する。

ここで、ステージ駆動部１０９は、ステージ１０５をパルス光Ｌと試料１０４との位置を相対的に２次元的（直交２軸、ｘｙ平面内）または３次元的（直交３軸、ｘｙｚ空間内）に移動させる。音響信号検出部１０６は試料側の先端部に、試料側に凹面を向けた音響レンズを有する。対物レンズ１０３と、音響レンズとは共焦点の関係を維持することが望ましい。このため、本実施形態では、共焦点位置に対して、ステージ１０５を２次元または３次元的に駆動する。これにより、試料１０４に関して、平面的または立体的な音響信号を取得することができる。

情報生成部１０７は、試料に入射するパルス光の強度と試料から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を生成する。情報生成部１０７は、情報部に対応する。

パルス光源１０２から射出した光は、可変ＮＤフィルター１１３を透過する。可変ＮＤフィルター１１３は、試料１０４を照射する光量を調節する機能を有する。

閾値算出部１１２は、情報に基づいてパルス光Ｌの強度に対する音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値ＩＰとして算出する。

次に、本実施形態における光音響信号検出方法の手順について、図５のフローチャートに基づいて説明する。

まず、ステップＳ１０１において、パルス光源１０２は、パルス光Ｌを射出する。このとき、制御部１０１は、光路中に配置された可変ＮＤフィルター１１３に関して、最も透過率が小さい状態（＝透過光量が最も小さい状態）にする。パルス光Ｌは、対物レンズ１０３により集光される。ステップＳ１０２において、集光されたパルス光Ｌは、試料１０４に照射される。

ステップＳ１０３において、音響信号検出部１０６は、パルス光Ｌの照射により試料から発生する音響信号を検出する。ステップＳ１０４において、制御部１０１は、音響信号が発生しているかを判定する。ステップＳ１０４の判定結果が偽（Ｎｏ）のとき、ステップＳ１０５へ進む。ステップＳ１０５において、制御部１０１は、可変ＮＤフィルター１１３の透過率を現在の状態よりも大きく、すなわち光量が大きくなるように調整する。

ステップＳ１０４の判定結果が真（Ｙｅｓ)のとき、ステップＳ１０６において、音響信号検出部は、試料１０４からの音響信号を検出する。そして、ステップＳ１０７において、制御部１０１は、可変ＮＤフィルター１１３の透過率を所定の幅で大きくする。そして、音響信号の検出を繰り返す。ステップＳ１０８において、音響信号の測定が指定回数だけ行われたか、について判定される。

ステップＳ１０８の判定結果がＮｏのとき、ステップＳ１０６へ進む。そして、試料１０４に対する入射光の光量、即ちパルス光源１０２から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルター１１３で変更した強度を変更して、音響信号の測定を行う。
ステップＳ１０８の判定結果がＹｅｓのとき、ステップＳ１０９へ進む。ステップＳ１０９において、情報生成部１０７は、パルス光源１０２から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルター１１３で変更した強度と試料１０４から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を生成する。

ステップＳ１１０において、閾値算出部１１２は、パルス光Ｌの強度に対する音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値ＩＰとして算出する。ステップＳ１１１において、閾値ＩＰが得られた可変ＮＤフィルター１１３の透過率に設定する。これにより、パルス光Ｌの光量を調整して、超解像された画像を得ることができる。

図６（ａ）は、本実施形態において得られた情報と閾値ＩＰを示す図である。パルス光源１０２から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルター１１３で変更した強度ＬＩ（横軸）と、試料１０４から発生する音響信号の強度Ｓ１（横軸）との関係をプロットすると実線で示す特性曲線を得られる。

ここで、閾値算出部１１２は、光源から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルターで変更した強度ＬＩに対する音響信号の強度ＳＩが増加し始めるパルス光強度を閾値ＩＰとして算出する。具体的には、実線で示す特性曲線のうちの直線部分を延長した直線（図中点線で示す）と、音響信号の強度ＳＩ＝０との交点を閾値ＩＰとする。

ここで、光源から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルターで変更した強度ＬＩと音響信号の強度ＳＩとが曲線関係にならない場合、即ち直線になる場合は、可変ＮＤフィルター１１３の最小調整単位よりも小さい領域に閾値ＩＰが存在する。

この場合、光路中に、例えば、光量を１／１０に調節する追加ＮＤフィルター１１３ａを挿入する。そして、上述の手順により閾値ＩＰを求める。図４（ａ）において、追加ＮＤフィルター１１３ａは、光路から退避した実線で示す位置と、光路に挿入された点線で示す位置とを選択的に移動可能に構成されている。

そして、追加ＮＤフィルター１１３ａが光路に挿入された状態において、図５を用いて説明した手順に従って光音響信号の検出を行う。これにより、可変ＮＤフィルター１１３の最小調整単位よりも小さい領域に閾値ＩＰが存在する場合でも、閾値ＩＰを算出することができる。

本実施形態では、可変ＮＤフィルター１１３は、閾値算出部１１２により算出した閾値ＩＰに基づいて、以下の条件式（１）を満足するようにパルス光源１０２のパルス光の強度を変更することが望ましい。
１．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
ただし、
ＩＴは閾値算出部１１２により算出した閾値、
ＩＰは変更後のパルス光の集光位置における強度のピーク値、
である。

条件式（１）は、適切な超解像画像を得られる条件を規定している。条件式（１）の下限値を下回ると、光源からパルス光が来ない状態となってしまう。条件式（１）の上限値を上回ると、超解像に必要な分解能を得られなくなる。

また、試料１０４への入射強度を大きくするとあまりコントラスト向上に寄与しない。図６（ｂ）は、レーリーリミットを示している。ピーク強度の３７％で、２点の強度分布が交差している。ゆえに、条件式の上限値は、１/０．３７＝２．７倍以下であると、レーリーリミット以下の２点を明確に分解できる。

（第１実施形態の変形例）
次に、図４（ｂ）に基づいて、第１実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡１５０に関して説明する。第１実施形態の光音響顕微鏡１００では、所定のフローチャートに基づいて、自動的に閾値ＩＰが算出され、その後、超解像画像を得ている。

これに対して、本変形例では、手動により、超解像画像を取得する構成である。本変形例の光音響顕微鏡１５０は、表示部１１１を有している。表示部１１１は、光源から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルター１１３で変更した強度ＬＩと、音響信号の強度ＳＩとの関係を表す情報を表示する。表示される情報は、上述のフローチャートのステップＳ１０１からステップＳ１０９により得られる。使用者（不図示）は、表示された情報に基づいて、閾値ＩＰを取得する。

そして、取得された閾値ＩＰとなるように、可変ＮＤフィルター１１３により光量を調節する。これにより、手動により、超解像画像を得ることができる。

（第２実施形態）
第２実施形態に係る光音響顕微鏡２００について説明する。図７（ａ）は、本実施形態に係る光音響顕微鏡２００の概略構成を示している。第２実施形態の光音響顕微鏡２００は、試料を自動的に測定する構成である。上記第１実施形態と同一の部分には、同一の符号を付し、重複する説明は省略する。

上記第１実施形態では、閾値算出部１１２は、異なる試料１０４を測定するごとに、初めの工程として、試料１０４ごとに閾値ＩＰを算出している。これに対して、本実施形態では、情報部として、情報格納部２０１を有する。情報格納部２０１は、試料１０４に入射するパルス光源１０２から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルター１１３で変更した強度と試料１０４から発生する音響信号の強度との関係を表す情報を格納している。

例えば、情報格納部２０１は、格納された情報と試料１０４の種類との対応関係を示すテーブルも有する。使用者は、観察する試料の種類をキーボート等のユーザインターフェースである入力部１０８から入力する。ここで、情報格納部２０１には、光音響顕微鏡の工場出荷時に、必要な情報を格納しておくこと、または予め異なる装置により測定された必要な情報を格納しておくことができる。

閾値算出部ＩＰは、情報格納部２０１に格納された情報に基づいて閾値ＩＰを算出する。そして、制御部１０１は、閾値ＩＰが算出できるように、光源から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルター１１３で変更した強度ＬＩを調整する。これにより、超解像画像を得ることができる。

また、情報格納部２０１は、情報に加えて、閾値ＩＰを格納していても良い。

（第２実施形態の変形例）
次に、図７（ｂ）に基づいて、第２実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡２５０に関して説明する。第２実施形態の光音響顕微鏡２００では、所定のフローチャートに基づいて、情報格納部２０１に格納された情報に基づいて閾値ＩＰが算出され、その後、超解像画像を得ている。

これに対して、本変形例では、手動により、超解像画像を取得する構成である。本変形例の光音響顕微鏡２５０は、表示部１１１を有している。表示部１１１は、光源から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルター１１３で変更した強度ＬＩと、音響信号の強度ＳＩとの関係を表す情報を表示する。表示される情報は、情報格納部２０１に格納されている。使用者（不図示）は、表示された情報に基づいて、閾値ＩＰを取得する。

そして、取得された閾値ＩＰとなるように、可変ＮＤフィルター１１３により光量を調節する。これにより、手動により、超解像画像を得ることができる。

（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態に係る光音響顕微鏡について説明する。図８（ａ）は、第３実施形態の光音響顕微鏡３００の概略構成を示している。第３実施形態の光音響顕微鏡３００は、試料を自動的に測定する構成である。上記第１実施形態と同一の部分には、同一の符号を付し、重複する説明は省略する。

上記第１実施形態、第２実施形態において、述べたように、光源から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルターで変更した強度ＬＩと音響信号の強度ＳＩとが曲線関係にならない場合、即ち直線になる場合は、可変ＮＤフィルター１１３の最小調整単位よりも小さい領域に閾値Ｐが存在する。

このため、上記第１実施形態、第２実施形態では、この場合、光路中に、例えば、光量を１／１０に調整する追加ＮＤフィルター１１３ａを挿入することで対応している。これにより、可変ＮＤフィルター１１３の最小調整単位よりも小さい領域に存在する閾値ＩＰを算出している。
これに対して、本実施形態では、追加ＮＤフィルター１１３ａを用いる代わりに、例えば、２つの異なる光源３０２、３０２を択一的に選択して使用する構成である点が異なる。

本実施形態の光音響顕微鏡３００は、パルス幅変更部３０１を有する。パルス幅変更部３０１は、光源のパルス光のパルス幅を変更する。パルス幅変更部３０１は、例えば、２つの異なる光源３０２、３０３を択一的に選択して使用する。光源３０２は、図８（ｃ）に示す強度分布３０２ａを有するパルス光を射出する。光源３０３は、図８（ｃ）に示す強度分布３０３ａを有するパルス光を射出する。

パルス幅変更部３０１は、情報生成部１０７（情報部）が有する光源から出力される１パルス当たりの強度と試料１０４から発生する音響信号の強度との関係を表す情報に応じて、パルス光のパルス幅を大きくするように、光源３０２、３０３を選択する。これにより、閾値ＩＰを得ることができる。この結果、超解像された画像を得られる。

また、パルス幅変更部３０１は、閾値ＩＰが予め定められた値よりも小さいときにパルス光のパルス幅を大きくすることが望ましい。閾値ＩＰがゼロに近い場合、試料１０４へ入射するパルス光の幅を長くすることで、さらに容易に閾値ＩＰを得ることができるようになる。この結果、超解像された画像を得られる。

（第３実施形態の変形例）
次に、図８（ｂ）に基づいて、第３実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡３５０に関して説明する。第３実施形態の光音響顕微鏡３００では、所定のフローチャートに基づいて、自動的に閾値ＩＰが算出され、その後、超解像画像を得ている。

これに対して、本変形例では、手動により、超解像画像を取得する構成である。本変形例の光音響顕微鏡３５０は、表示部１１１を有している。表示部１１１は、光源から出力される１パルス当たりの強度ＬＩと、音響信号の強度ＳＩとの関係を表す情報を表示する。表示される情報は、上述のフローチャートのステップＳ１０１からステップＳ１０９により得られる。使用者（不図示）は、表示された情報に基づいて、閾値ＩＰを取得する。

そして、取得された閾値ＩＰとなるように、パルス光の強度分布３０２ａ、３０３ａを選択することにより光量を調節する。これにより、手動により、超解像画像を得ることができる。

なお、第３実施形態とその変形例において、光源から出力される１パルス当たりの強度ＬＩと、音響信号の強度ＳＩとの関係を表す情報をフローチャートに従って取得する代わりに、この情報を予め格納している情報格納部を有する構成とすることもできる。

（第４実施形態）
次に、本発明の第４実施形態に係る光音響顕微鏡について説明する。図９（ａ）は、第４実施形態の光音響顕微鏡４００の概略構成を示している。第４実施形態の光音響顕微鏡４００は、試料を自動的に測定する構成である。上記第１実施形態と同一の部分には、同一の符号を付し、重複する説明は省略する。

上記第１実施形態、第２実施形態において述べたように、光源から出力される１パルス当たりのパワーを可変ＮＤフィルターで変更した強度ＬＩと音響信号の強度ＳＩとが曲線関係にならない場合、即ち直線になる場合は、可変ＮＤフィルター１１３の最小調整単位よりも小さい領域に閾値Ｐが存在する。

このため、上記第１実施形態、第２実施形態では、この場合、光路中に、例えば、光量を１／１０に調整する追加ＮＤフィルター１１３ａを挿入することで対応している。これにより、可変ＮＤフィルター１１３の最小調整単位よりも小さい領域に存在する閾値ＩＰを算出している。

これに対して、本実施形態では、追加ＮＤフィルター１１３ａを用いる代わりに、連続的に発光するＣＷ光源１０２ａを有する。制御部１０１は、ＣＷ光源１０２ａを駆動する電圧、電流のパルスを制御する。これにより、図９（ｃ）に示すパルス光４０２ａ、パルス光４０２ｂを射出できる。

制御部１０１は、情報生成部１０７（情報部）が有する光源から出力される１パルス当たりの強度と試料１０４から発生する音響信号の強度との関係を表す情報に応じて、パルス光のパルス幅を大きくするように、ＣＷ光源１０２ａを駆動する電圧、電流のパルスを制御する。これにより、閾値ＩＰを得ることができる。この結果、超解像された画像を得られる。
例えば、閾値が予め定められた値よりも小さいとき前記パルス光のパルス幅を大きくする。

ここで、ＣＷ光源１０２ａからのパルス光のパルス幅は以下の条件式（２）を満足することが望ましい。
５０ｎｓ＜ＰＷ＜５００ｎｓ （２）
ただし、
ＰＷは光源のパルス光のパルス幅、
である。
これにより、効率的に閾値ＩＰを得ることができる。この結果、超解像された画像を得られる。

（第４実施形態の変形例）
次に、図９（ｂ）に基づいて、第４実施形態の変形例に係る光音響顕微鏡４５０に関して説明する。第４実施形態の光音響顕微鏡４００では、所定のフローチャートに基づいて、自動的に閾値ＩＰが算出され、その後、超解像画像を得ている。

これに対して、本変形例では、手動により、超解像画像を取得する構成である。本変形例の光音響顕微鏡４５０は、表示部１１１を有している。表示部１１１は、光源から出力される１パルス当たりの強度ＬＩと、音響信号の強度ＳＩとの関係を表す情報を表示する。表示される情報は、上述のフローチャートのステップＳ１０１からステップＳ１０９により得られる。使用者（不図示）は、表示された情報に基づいて、閾値ＩＰを取得する。

そして、取得された閾値ＩＰとなるように、ＣＷ光源１０２ａを駆動する電圧、電流のパルスを制御する。これにより、手動により、超解像画像を得ることができる。

なお、第４実施形態とその変形例において、光源から出力される１パルス当たりの強度ＬＩと、音響信号の強度ＳＩとの関係を表す情報をフローチャートに従って取得する代わりに、この情報を予め格納している情報格納部を有する構成とすることもできる。

以上説明したように、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変形例をとることができる。

以上のように、本発明は、観察対象物にダメージを与えることなく、一度の撮影で超解像画像を得ることができる光音響顕微鏡及び光音響信号検出方法に有用である。

１００、２００、３００、４００ 光音響顕微鏡
１０ パルス光
１１ チャート
１１ａ、１１ｂ チャート
１２、１３ａ、１３ｂ 像
１４ 直線
１５ａ、１５ｂ 光学像の強度分布
１６ 曲線
１７ａ、１７ｂ 光音響信号
１８ 強度分布
１９ 信号強度分布
１０１ 制御部
１０２ 光源
１０２ａ ＣＷ光源
１０３ 対物レンズ
１０４ 試料
１０５ ステージ
１０６ 音響信号検出部
１０７ 情報生成部（情報部）
１０８ 入力部
１０９ ステージ駆動部
１１０ 画像信号形成部
１１１ 表示部
１１２ 閾値算出部
１１３ 可変ＮＤフィルター
２０１ 情報格納部
３０１ パルス幅変更部
３０２、３０３ 光源
３０２ａ、３０３ａ 強度分布
４０２ａ、４０３ａ パルス光
Ｌ パルス光

Claims (36)

1. パルス光を発生させる光源と、
   試料に、前記光源から発する前記パルス光を集光して照射する集光光学系と、
   前記パルス光の照射により前記試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出部と、
   前記音響信号に基づいて前記試料の画像信号を形成する画像信号形成部と、
   前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報部と、
   前記情報に基づいて前記光源からの前記パルス光の強度を変更するパルス光強度変更部と、を有し、
   前記情報部は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を生成する情報生成部であり、
   前記情報生成部は、前記情報に基づいて前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として算出する閾値算出部を有し、
   前記閾値算出部により算出した閾値に基づいて、前記光源の前記パルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更部を有し、
   前記パルス光強度変更部は、以下の条件式（１）を満足するように前記光源の前記パルス光の強度を変更することを特徴とする光音響顕微鏡。
   １．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
   ただし、
   ＩＴは前記閾値算出部により算出した閾値、
   ＩＰは前記変更後の前記パルス光の集光位置における強度のピーク値、
   である。
2. さらに、前記情報部が有する前記情報を表示する表示部を有することを特徴とする請求項１に記載の光音響顕微鏡。
3. 前記情報部は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を格納している情報格納部であることを特徴とする請求項１または２に記載の光音響顕微鏡。
4. 前記情報格納部は、前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として格納していることを特徴とする請求項３に記載の光音響顕微鏡。
5. 前記光源のパルス光のパルス幅は以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡。
   ５０ｎｓ＜ＰＷ＜５００ｎｓ （２）
   ただし、
   ＰＷは前記光源のパルス光のパルス幅、
   である。
6. 前記光源のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更部を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡。
7. 前記パルス幅変更部は、前記情報部が有する前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報に応じて、前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項６に記載の光音響顕微鏡。
8. 前記光源のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更部を有し、前記パルス幅変更部は、前記閾値が予め定められた値よりも小さいときに前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項１または４に記載の光音響顕微鏡。
9. 前記パルス光と前記試料との位置を相対的に２次元または３次元的に移動させる走査部をさらに有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡。
10. パルス光を発生させる光源と、
    試料に、前記光源から発する前記パルス光を集光して照射する集光光学系と、
    前記パルス光の照射により前記試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出部と、
    前記音響信号に基づいて前記試料の画像信号を形成する画像信号形成部と、
    前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報部と、
    前記情報に基づいて前記光源からの前記パルス光の強度を変更するパルス光強度変更部と、を有し、
    前記情報部は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を格納している情報格納部であり、
    前記情報格納部は、前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として格納し、
    前記閾値に基づいて、前記光源の前記パルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更部を有し、
    前記パルス光強度変更部は、以下の条件式（１）を満足するように前記光源の前記パルス光の強度を変更することを特徴とする光音響顕微鏡。
    １．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
    ただし、
    ＩＴは前記閾値、
    ＩＰは前記変更後の前記パルス光の集光位置における強度のピーク値、
    である。
11. さらに、前記情報部が有する前記情報を表示する表示部を有することを特徴とする請求項１０に記載の光音響顕微鏡。
12. 前記情報部は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を生成する情報生成部であることを特徴とする請求項１０または１１に記載の光音響顕微鏡。
13. 前記情報生成部は、前記情報に基づいて前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として算出する閾値算出部を有することを特徴とする請求項１２に記載の光音響顕微鏡。
14. 前記光源のパルス光のパルス幅は以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡。
    ５０ｎｓ＜ＰＷ＜５００ｎｓ （２）
    ただし、
    ＰＷは前記光源のパルス光のパルス幅、
    である。
15. 前記光源のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更部を有することを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡。
16. 前記パルス幅変更部は、前記情報部が有する前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報に応じて、前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項１５に記載の光音響顕微鏡。
17. 前記光源のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更部を有し、前記パルス幅変更部は、前記閾値が予め定められた値よりも小さいときに前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項１０または１３に記載の光音響顕微鏡。
18. 前記パルス光と前記試料との位置を相対的に２次元または３次元的に移動させる走査部をさらに有することを特徴とする請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の光音響顕微鏡。
19. パルス光を発生させる発光工程と、
    試料に、前記発光工程から発する前記パルス光を集光して照射する集光工程と、
    前記パルス光の照射により前記試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出工程と、
    前記音響信号に基づいて前記試料の画像信号を形成する画像信号形成工程と、
    前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報工程と、
    前記情報に基づいて光源からの前記パルス光の強度を変更するパルス光強度変更工程と、を有し、
    前記情報工程は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を生成する情報生成工程であり、
    前記情報生成工程は、前記情報に基づいて前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として算出する閾値算出工程を有し、
    前記閾値算出工程により算出した閾値に基づいて、前記発光工程の前記パルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更工程を有し、
    前記パルス光強度変更工程において、以下の条件式（１）を満足するように前記発光工程の前記パルス光の強度を変更することを特徴とする光音響信号検出方法。
    １．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
    ただし、
    ＩＴは前記閾値算出工程により算出した閾値、
    ＩＰは前記変更後の前記パルス光の集光位置における強度のピーク値、
    である。
20. さらに、前記情報工程における前記情報を表示する表示工程を有することを特徴とする請求項１９に記載の光音響信号検出方法。
21. 前記情報工程は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を格納している情報格納工程であることを特徴とする請求項１９または２０に記載の光音響信号検出方法。
22. 前記情報格納工程は、前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として格納することを特徴とする請求項２１に記載の光音響信号検出方法。
23. 前記発光工程におけるパルス光のパルス幅は以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の光音響信号検出方法。
    ５０ｎｓ＜ＰＷ＜５００ｎｓ （２）
    ただし、
    ＰＷは前記発光工程のパルス光のパルス幅、
    である。
24. 前記発光工程のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更工程を有することを特徴とする請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の光音響信号検出方法。
25. 前記パルス幅変更工程において、前記情報工程における前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報に応じて、前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項２４に記載の光音響信号検出方法。
26. 前記発光工程のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更工程を有し、前記パルス幅変更工程は、前記閾値が予め定められた値よりも小さいときに前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項１９または２２に記載の光音響信号検出方法。
27. 前記パルス光と前記試料との位置を相対的に２次元または３次元的に移動させる走査工程をさらに有することを特徴とする請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の光音響信号検出方法。
28. パルス光を発生させる発光工程と、
    試料に、前記発光工程から発する前記パルス光を集光して照射する集光工程と、
    前記パルス光の照射により前記試料から発生する音響信号を検出する音響信号検出工程と、
    前記音響信号に基づいて前記試料の画像信号を形成する画像信号形成工程と、
    前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を有する情報工程と、
    前記情報に基づいて光源からの前記パルス光の強度を変更するパルス光強度変更工程と、を有し、
    前記情報工程は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を格納している情報格納工程であり、
    前記情報格納工程は、前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として格納し、
    前記閾値算出工程により算出した閾値に基づいて、前記発光工程の前記パルス光の強度を閾値以上に変更するパルス光強度変更工程を有し、
    前記パルス光強度変更工程において、以下の条件式（１）を満足するように前記発光工程の前記パルス光の強度を変更することを特徴とする光音響信号検出方法。
    １．０５＜ＩＰ／ＩＴ＜２．７ （１）
    ただし、
    ＩＴは前記閾値算出工程により算出した閾値、
    ＩＰは前記変更後の前記パルス光の集光位置における強度のピーク値、
    である。
29. さらに、前記情報工程における前記情報を表示する表示工程を有することを特徴とする請求項２８に記載の光音響信号検出方法。
30. 前記情報工程は、前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報を生成する情報生成工程であることを特徴とする請求項２８または２９に記載の光音響信号検出方法。
31. 前記情報生成工程は、前記情報に基づいて前記パルス光の強度に対する前記音響信号の強度が増加し始めるパルス光強度を閾値として算出する閾値算出工程を有することを特徴とする請求項３０に記載の光音響信号検出方法。
32. 前記発光工程におけるパルス光のパルス幅は以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の光音響信号検出方法。
    ５０ｎｓ＜ＰＷ＜５００ｎｓ （２）
    ただし、
    ＰＷは前記発光工程のパルス光のパルス幅、
    である。
33. 前記発光工程のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更工程を有することを特徴とする請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の光音響信号検出方法。
34. 前記パルス幅変更工程において、前記情報工程における前記試料に入射する前記パルス光の強度と前記試料から発生する前記音響信号の強度との関係を表す情報に応じて、前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項３３に記載の光音響信号検出方法。
35. 前記発光工程のパルス光のパルス幅を変更するパルス幅変更工程を有し、前記パルス幅変更工程は、前記閾値が予め定められた値よりも小さいときに前記パルス光のパルス幅を大きくすることを特徴とする請求項２８または３１に記載の光音響信号検出方法。
36. 前記パルス光と前記試料との位置を相対的に２次元または３次元的に移動させる走査工程をさらに有することを特徴とする請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の光音響信号検出方法。

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