JP6431373B2 - 女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクを予測する方法 - Google Patents

Description

本発明の内容は、女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクを予測する方法であって、以下のステップ：
・前記女性の対象から得た体液中のプロニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片のレベルを測定し、そして
・前記対象が心臓血管事象に罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン又はその断片のレベルとを、高いレベルが、心臓血管事象に罹患する高いリスクの予測となるように関連付けること、
を含む、前記方法である。
「高いレベル」という用語は、閾値レベルを上回るレベルを意味し得る。

ニューロテンシンは、プレプロニューロテンシン前駆体由来の１３アミノ酸神経ペプチドであって、安定した１１７アミノ酸ペプチドであるプロニューロテンシン（Ｐ−ＮＴ）と一緒に化学量論的に放出され、そして、その成熟ホルモンは、３種類の異なった受容体、Ｇタンパク質共役受容体であるニューロテンシン受容体１と２（Ｎｔｓｒ１とＮｔｓｒ２）及び非Ｇタンパク質共役受容体であり、且つ、Ｓｏｒｔｉｌｌｉｎ−１（ＳＯＲＴ１）としても知られているニューロテンシン受容体３（Ｎｔｓｒ３）に結合する。

ニューロテンシンは、小腸から末梢部に放出され、並びに視床下部から中枢部に放出される。ニューロテンシンの末梢分泌は、食物摂取、特に脂肪によって刺激され、消化管運動、並びに膵液分泌及び胆汁分泌を調整することが知られている。興味深いことに、ニューロテンシンは、ラットにおける中枢（脳室内）及び末梢（腹腔内）注射の後に、急性的に食物摂取を低減させたので、食欲抑制ホルモンとして食欲制御に関係し、そして、その効果は、ニューロテンシン１受容体（Ｎｔｓｒ１）を通して主に媒介されるようである。

正常体重ヒト対象と比較した肥満では、食後血漿ニューロテンシン濃度は、液状脂肪食の後に低下し（Ｗｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ １９９２， Ｒｅｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ； Ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｈａｍ ｆｅｅｄｉｎｇ （ＭＳＦ） ａｎｄ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｔｅｓｔ ｍｅａｌ）、ニューロテンシン分泌の調整が、肥満では乱されていることを示唆した。しかしながら、ニューロテンシンが肥満の程度に相関しているのか、そして、どのように相関しているのか、大規模な研究が全く調査されていない。興味深いことに、Ｐ−ＮＴは、肥満のＩＩ型糖尿病患者の大部分で正常血糖につながることが示されている手術である胃バイパス（Ｒｏｕｘ−ｅｎ−Ｙ）後に有意に増加するが、ニューロテンシンが通常、糖尿病の発症に関わるかどうか知られていない。さらに、Ｎｔｓｒ３（ＳＯＲＴ１）遺伝子の変異型は、ヒトで知られている最も一般的な冠動脈障害感受性遺伝子の１つなので、ニューロテンシン系は、冠動脈障害や心筋梗塞の発症に関与した。

肥満と癌との機構的なつながりは大部分が未知であるが、しかしながら、支配的な理論の１つは、過剰な脂肪沈着が末梢組織におけるアンドロゲンの高い芳香族化をもたらし、そしてそれが、高い循環エストロゲンレベルをもたらすというものである。加えて、肥満の顕著な特徴の１つである高インスリン血症が、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）の肝臓での産生を阻害し、これによりエストロゲンとアンドロゲンの両方の生物学的に利用可能レベルを増強することが示され、肥満が、それを通じて乳癌や前立腺癌などの癌の性ホルモン駆動形態の一般的な形態のリスクを高め得る形を示唆した。興味深いことに、ニューロテンシンとＮｔｓｒ１発現の両方が悪性乳管癌腫においてよく見られ、そして、ＮＴＳＲ１の実験的な薬理学的遮断又はＲＮＡサイレンシングが、マウスにおける腫瘍増殖を低減する。

乳癌細胞におけるニューロテンシン受容体１（ＮＴＳＲ１）の発現レベルは、乳癌に罹患している対象の予後を判断するために使用された（ＵＳ２０１１／０３０５６３３）。さらに、同じ著者らによって、おそらく肝臓による急速なクリアランスにより、循環ニューロテンシンと、膵臓、前立腺、又は髄様甲状腺腫瘍の病期との明らかな相関が、現在、説明されていないことが記載されている。興味深いことに、浸潤性乳管癌を患っている一連の５１人の患者において、すべての腫瘍のうちの９１％がニューロテンシン受容体１（ＮＴＳＲ１）に関して陽性であったが、すべての腫瘍のうちの３１％だけが前記組織中でニューロテンシンに関して陽性であることがわかった（Ｓｏｕａｚｅ ｅｔ． ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００６； ６６： （１２） ｐａｇｅｓ ６２４３−６２４９）。

癌の増殖、特に肺癌、膵臓癌、及び結腸癌にニューロテンシンとニューロテンシン受容体が関与するいくつかの徴候が存在する（Ｃａｒｒａｗａｙ ｅｔ ａｌ．； Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２７ （２００６） ２４４５−２４６０）。膵臓癌を患っている患者の血清のＮＴレベルが有意に上昇することが報告された（Ｐｉｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９； １９； １４４５−５０）。興味深いことに、このグループは、膵臓癌において両方の前立腺に対する疾患の進行によりＮＴレベルが低下することを見出した。それとは対照的に、Ｍｅｇｇｉａｔｏら；Ｔｕｍｏｒｉ １９９６； ８２； ５９２−５；は、血漿ＮＴレベルが、膵臓癌では正常であったが、膵炎と診断された場合には、高かったことを見出した。

男性における癌リスクの予測の為の血管作用性ペプチドの使用は、Ｂｅｌｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ， Ｂｉｏｍａｒｋｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎにより報告されている。ＭＲ−ｐｒｏ−ＡＮＰ、ＭＲ−ｐｒｏ−ＡＤＭ及びコペプチンが、１９９１年〜１９９６年のベースライン試験の前に癌に罹患していなかったＭａｌｍｏ Ｄｉｅｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙの参加者（男性１７６８名、女性２２９３名）の空腹時血漿中で測定された。著者は、女性の間で、バイオマーカーと癌の発症との間で相関は無かったと述べている。

ＣＲＰ及びＰｒｏ−ＢＮＰは、集団内の心臓血管事象の公知の予測因子である（Ｍｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ． Ａｌ， ＪＡＭＡ． ２００９；３０２（ｌ）：４９−５７）。現在、ＣＶＤ終点におけるＣＲＰ及びＰｒｏ−ＢＮＰの予測能力の性別による差異についての情報は存在しない。

本発明の目的は、対象が心臓血管事象を発症するリスクを予測するためのＮＴの予測及び診断能力を調査することであった。

この問題に対処するために、我々は、前記スウェーデンの前向きコホート研究（Ｍａｌｍｏ Ｄｉｅｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ、Ｍｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ． ａｌ， ＪＡＭＡ． ２００９；３０２（ｌ）：４９−５７を参照されたい）における空腹時血漿中のプロニューロテンシンの安定な断片を評価して、１５年間の経過観察中の心臓血管事象の発症に対して、このバイオマーカーの基準濃度を関連付けた。

驚くべきことに、ニューロテンシンは、女性が心臓血管事象に罹患するリスクの予測において、強力かつ高度に顕著なバイオマーカーであることが示された。

従って、本発明の内容は、女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクを予測する方法であって、以下のステップ：
・前記女性の対象から得た体液中のプロニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片のレベルを測定し、そして
・前記対象が心臓血管事象に罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン又はその断片のレベルとを、高いレベルが、心臓血管事象に罹患する高いリスクの予測となるように関連付けること、
を含む、前記方法である。

本発明の特定の態様において、前記心臓血管事象は、心筋梗塞、心臓発作、急性心不全及び心筋梗塞、心臓発作、急性心不全に関連する心臓血管性の死からなる群から選択される、急性の心臓血管事象である。

本発明の特定の態様において、本発明の内容は、女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクを予測する方法であって、以下のステップ：
・前記女性の対象から得た体液中のプロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルを測定し、そして
・心臓血管事象に罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン１−１１７若しくはその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが、心臓血管事象に罹患する高いリスクの予測となるように関連付けること、
を含み、
当該心臓血管事象が、心筋梗塞、心臓発作、急性心不全及び心筋梗塞、心臓発作、急性心不全に関連する心臓血管性の死からなる群から選択される、急性の心臓血管事象であ、前記方法である。

心臓血管事象に罹患するリスクを予想させる、体液中のプロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルは、小腸から放出されてもよい。小腸からのニューロテンシンの放出は、食物摂取、特に脂肪によって刺激され、消化管運動及び膵液や胆汁分泌を調整することが知られている。プロニューロテンシン１−１１７及びその断片又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドは、ニューロテンシン及びプロニューロテンシン１−１１７とその断片又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドは、プロニューロテンシンから等モル量で放出されるので、放出されたニューロテンシンの代用マーカーとして使用される。

ニューロテンシン／プロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドの末梢組織における分泌が、心臓血管事象に罹患することに対する女性対象の感受性について暗示していることは、本発明の驚くべき知見である。これにより、脂肪摂取の削減としての食事療法は、前記女性の対象の前記リスクを軽減し得る。

本研究で得られたデータは、男性の対象の心臓血管事象の罹患のリスクと、当該対象の体液中のプロニューロテンシン又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片のレベルとの間の相関を明らかにしたが；斯かる相関は、現在のデータセットからは顕著ではなかった。従って、本発明の方法は男性の対象に対しても有効であると予想されるが、現在の研究では、観察された効果は強いものではなかった。

本明細書中、「対象」という用語は、生きたヒト又は非ヒト生物を意味する。好ましくは、本明細書中、対象はヒトである。

前記対象から得た体液中のプロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルと、心臓血管事象に罹患するリスクとの相関は連続的である、すなわち、レベルが高ければ高いほど、リスクもより高い。これは、例えば表１７のデータから認められる。第一の群と比較して、第二、第三及び第四の群は、それぞれより高いＨａｚａｒｄ Ｒｉｓｋを示す。

実用性のために、当業者は（単数若しくは複数の）閾値を使用してもよい。

これにより、「高いレベル」という用語は、閾値レベルを上回るレベルを意味し得る。

本発明の一つの態様において、体液中のプロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルは、プロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドの空腹時レベルである。空腹時レベルは、血液のサンプリングの前に１２時間食物摂取していないことを意味する。

体液は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ｃｓｆ）、及び唾液を含む群から選択され得る。

本発明の一つの態様において、前記女性の対象は、体液が採取される時点で急性の心臓血管事象と診断された履歴を有しない。他の態様において、当該女性の対象は、体液採取時点で心臓血管疾患又は糖尿病に罹患していると診断されている。

特定の態様において前記体液採取時点での心臓血管疾患は、心不全、アテローム性動脈硬化及び高血圧からなる群から選択されてもよい。

本データは、プロニューロテンシン又はその断片のレベルと、糖尿病、乳癌及び心臓血管疾患に罹患していない女性における、心臓血管事象との間に、強い相関関係を示唆している。

本データはまた、プロニューロテンシン又はその断片のレベルと、心臓血管疾患の一般的なハイリスク群である高血圧の女性における、心臓血管事象との間にも、強い相関関係を示唆している。

更に、本データは、プロニューロテンシン又はその断片のレベルと、正常血圧の女性における、心臓血管事象との間にも、強い相関関係を示唆している。更に、本データは、プロニューロテンシン又はその断片のレベルと、糖尿病の女性における、心臓血管事象との間にも、強い相関関係を示唆している。

本発明の他の態様において、体液採取時点で、女性の対象は、ＩＩ型糖尿病を有すると診断されている。本発明の特定の態様において、対象における第一の有害事象の予想、又は第一の有害事象に罹患するリスクが高い対象の同定は、ＣＲＰ、ＬｐＬＡ２、サイスタチンＣ及びＡ−型及びＢ−型のナトリウム利尿ペプチド、それらの前駆体、及びそれらの断片、ＡＮＰ、ｐｒｏＡＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ、ＭＲ−ｐｒｏＡＮＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰトリグリセリド、ＨＤＬコレステロール又はそのサブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｓ）、ＬＤＬコレステロール又はそのサブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｓ）、ＧＤＦ１５、ＳＴ２からなる群から選択される、１つ以上の更なるマーカーのレベルを追加で判定することにより改善される。

本発明の特定の態様において、体液中のプロニューロテンシン１−１１７若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルに加えて、以下のマーカー：ｐｒｏＢＮＰ又はその１２アミノ酸以上の断片又は前駆体、及び／又はＣＲＰのレベルが判定され、使用される。

本発明の他の特定の態様において、追加で１つ以上の臨床的パラメーターが判定され、当該パラメーターとして：収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧治療、ボディーマスインデックス、年齢、糖尿病の存在、喫煙が含まれる。

心臓血管事象（ＣＶＤ）は、環状動脈の事象又は致死的もしくは比致死的脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）として定義された。事象は、３つの登録（ｔｈｅ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ、ｔｈｅ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｄｅａｔｈ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ、及びｔｈｅ Ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ Ｍａｌｍｏ ｒｅｇｉｓｔｅｒ）を有する各スゥエーデン市民の１０桁の個人識別番号の連結を通じて同定された。心筋梗塞は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ９ｔｈ ａｎｄ １０ｔｈ ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ （ＩＣＤ−９及びＩＣＤ−１０）のそれぞれコード４１０及び１２１に基づいて定義された。致死的もしくは比致死的脳卒中は、コード４３０、４３１、４３４及び４３６（ＩＣＤ−９）並びに１６０、１６１、１６３及び１６４（ＩＣＤ−１０）を使用して定義された。

糖尿病の定義は、以下のとおりである：
医師による診断の履歴、抗糖尿病薬薬物療法をおこなっていること、又は基準検査において空腹時全血グルコース＞／＝６．１ｍｍｏｌ／ｌであること（これが血漿中では＝７．０ｍｍｏｌ／ｌであることに留意する）。

正常血圧／高血圧（ＨＢＰ）の定義は、以下のとおりである：
ＨＢＰ：収縮期ＢＰ＞／＝１４０ｍｍＨｇ若しくは拡張期ＢＰ＞／＝９０ｍｍＨｇ、又は降圧薬薬物療法をおこなっていること。正常血圧（ＢＰ）の対象は、その他のすべての対象である、すなわち、収縮期ＢＰ＜１４０ｍｍＨｇ若しくは拡張期ＢＰ＜９０ｍｍＨｇを有するか、又は降圧薬薬物療法をおこなっていない対象である。

体液中で測定され得るプロニューロテンシンの断片は、例えば以下の断片の群から選択されてもよい。
配列番号１（プロニューロテンシン１−１４７）

配列番号２（プロニューロテンシン１−１２５（長いニューロメジンＮ））

配列番号３（ニューロメジンＮ：）

配列番号４（ニューロテンシン）

配列番号５（プロニューロテンシン１−１１７）

配列番号６（プロニューロテンシン１−１３２）

配列番号７：（プロニューロテンシン１−１２５）

配列番号８（プロニューロテンシン１２０−１４０）

配列番号９（プロニューロテンシン１２０−１４７）

配列番号１０（プロニューロテンシン１２８−１４７）

本発明による方法のより具体的な実施形態において、プロニューロテンシン１−１１７のレベルが測定される。
具体的な実施形態において、プロニューロテンシン、特にプロニューロテンシン１−１１７若しくはその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルは、免疫学的アッセイで計測される。
より詳しく述べると、免疫学的アッセイは、Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２７ （２００６） １７８７−１７９３に記載されているように使用される。

プロニューロテンシン若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルを測定するのに有用である免疫学的アッセイは、実施例２の概要のステップを含み得る。すべての閾値及び値は、実施例２に従って使用される試験及び較正の観点から理解されるべきである。当業者は、閾値の絶対値が使用される較正によって影響を受けるであろうことを知っている可能性もある。このことは、本明細書中に与えられるすべての値及び閾値が、本明細書中で使用される較正に照らして理解されるべきであることを意味している（実施例２）。ヒトＰ−ＮＴ較正物質は、ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙで入手可能である。あるいは、アッセイは、合成又は遺伝子組み換えＰ−ＮＴ１−１１７若しくはその断片によって較正されてもよい（Ｅｒｎｓｔ ｅｔ． ａｌ， ２００６もまた参照のこと）。

本発明の方法に従って、女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクを決定するための閾値は、７８ｐｍｏｌ／ｌ超のＰＮＴであり、好ましい閾値は１００ｐｍｏｌ／ｌ超、さらに好ましい閾値は１５０ｐｍｏｌ／ｌ超である。具体的な実施形態において、前記閾値は約１００ｐｍｏｌ／１である。これらの閾値は、先に触れた較正法に関係している。前記閾値を上回るプロＮＴ値は、対象が心臓血管事象に罹患する高いリスクを有していることを意味する。

本発明の方法の特定の態様において、収縮性心臓血管事象における対象のリスクの予測は：１つ以上の検査パラメーター、又は空腹時血糖又は血漿グルコース、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール若しくはそのサブトラクション、ＬＤＬコレステロール若しくはそのサブトラクション、シスタチンＣ、インスリン、ＣＲＰ、バソプレシン若しくはその前駆体若しくは断片、及びＢＮＰ若しくはその前駆体若しくは断片からなる群から選択される更なるマーカーのレベルを追加で判定及び使用することにより改善される。

本発明の方法の特定の態様において、追加で１つ以上の臨床的パラメーターが判定され、当該パラメーターとして：年齢、性別、収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧治療（ＡＨＴ）、ボディーマスインデックス、胴囲、ウエストヒップ比、喫煙、年齢、糖尿病、遺伝的及び過去の心臓血管疾患（ＣＶＤ）が挙げられる。

本発明の目的は、先の態様に従い、対象が心臓血管事象に罹患するリスクを予測する方法、あるいは、心臓血管事象に罹患するリスクの高い対象を同定する方法であって、当該対象から採取した体液中のプロニューロテンシン又はその５アミノ酸残基以上の断片のレベルは単独で、又は他の予測に有用な検査パラメーター又は臨床のパラメーターと組み合せて、以下の選択肢から選択され得る方法によって、対象に有害事象が生じるリスクの予測のために使用される：

−健康な、又は見掛けが健康そうな対象集団における所定のサンプル一式の、プロニューロテンシン若しくはその断片又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルの中央値との比較、
−健康な、又は見掛けが健康そうな対象集団における所定のサンプル一式の、プロニューロテンシン若しくはその断片又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルの変位値との比較、
−コックス比例ハザード解析に基づく計算、又はＮＲＩ（純再分類指数）若しくはＩＤＩ（統合判別指数）などのＲｉｓｋ指数計算を使用することによる計算。

本発明の一つの態様において、前記方法は、女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクをモニタリングするために、２回以上実施される。本発明の他の特定の態様において、前記モニタリングは、前記女性の対象における、治療的処置又は予防的処置に対する応答を評価するために実施される。

本発明の方法の他の態様において、当該方法は、リスク群ごとに女性の対象を階層化するために使用される。

本発明は、本発明の方法を実施するためのポイントオブケアデバイスも想定する。

また、本発明は、本発明の方法を実施するためのアッセイ及び／又はキットも想定する。

本発明の内容はまた、女性の対象における心臓血管事象の予防又は治療における使用のための、ニューロテンシン又はニューロテンシン受容体に対する結合剤である。
本発明の一実施形態において、結合剤は、ニューロテンシンの生理活性を７０％以下に低減する。

本発明によると、ニューロテンシンに対する結合剤は、抗体、例えばＩｇＧ、典型的な完全長免疫グロブリン、又は、例えばＦａｂミニボディ、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価のＦａｂ抗体、例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２を含めたＦａｂ断片を、これだけに限定されることなく含む、例えば化学的に結合された抗体のような重鎖及び／又は軽鎖のＦ可変ドメインを少なくとも含む抗体断片（断片抗原結合）；ＣＨ３ドメインで二量化された二価のＦａｂ（ミニ抗体）；例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介して異種のドメインを用いた多量体化により形成された二価のＦａｂ又は多価のＦａｂ、例えばＦａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、多量体化した多価及び／又は多特異性ｓｃＦｖ断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ））、三官能性抗体、例えばＧと別のクラスからの多価抗体；単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物又は魚類の免疫グロブリンから得られたナノボディから成る群から選択される。

本発明によると、ニューロテンシン受容体に対する結合剤は、抗体、例えばＩｇＧ、典型的な完全長免疫グロブリン、又は、例えばＦａｂミニボディ、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価のＦａｂ抗体、例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２を含めたＦａｂ断片を、これだけに限定されることなく含む、例えば化学的に結合された抗体のような重鎖及び／又は軽鎖のＦ可変ドメインを少なくとも含む抗体断片（断片抗原結合）；ＣＨ３ドメインで二量化された二価のＦａｂ（ミニ抗体）；例えばｄＨＬＸドメインの二量体化を介して異種のドメインを用いた多量体化により形成された二価のＦａｂ又は多価のＦａｂ、例えばＦａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、多量体化した多価及び／又は多特異性ｓｃＦｖ断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー）、三官能性抗体、例えばＧと別のクラスからの多価抗体；単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物又は魚類の免疫グロブリンから得られたナノボディ、あるいは、ペプチド拮抗薬、例えば［Ｄ−Ｔｒｐ^１１］−ニューロテンシン、［Ｔｙｒ（Ｍｅ）^１１］−ニューロテンシン（例えば、Ｑｕｉｒｏｎらによって記載された）、又は非ペプチド拮抗薬、例えばＬｅｖｏｃａｂａｓｔｉｎｅ、ＳＲ−４８６９２（ＮＴＳ１選択性）、ＳＲ−１４２９４８（非選択性）、ＳＲ−１４２９４８Ａ，ＣＰ９６３４５、［３Ｈ］ＳＲ−４８６９２、ＳＲ４８６９２、ＳＲ−４８５２７及びＳＲ−４９７１１、あるいは、結合剤足場、例えばテトラネクチンベースの非Ｉｇ足場（例えば、ＵＳ２０１０／００２８９９５に記載）、フィブロネクチン足場（ＥＰ１２６６０２５に記載）；リポカリンベースの足場（例えば、ＷＯ２０１１／１５４４２０に記載）；ユビキチン足場（例えば、ＷＯ２０１１／０７３２１４に記載）、移動足場（例えば、ＵＳ２００４／００２３３３４に記載）、プロテインＡ足場（例えば、ＥＰ２２３１８６０に記載）、アンキリン反復ベースの足場（例えば、ＷＯ２０１０／０６０７４８に記載）、マイクロタンパク質、好ましくはシスチンノット（ｋｎｏｔ）足場を形成するマイクロタンパク質（例えば、ＥＰ２３１４３０８に記載）、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインベースの足場（例えば、ＷＯ２０１１／０２３６８５に記載）、ＥＧＦＲ−Ａドメインベースの足場（例えば、ＷＯ２００５／０４０２２９に記載）及びＫｕｎｉｔｚドメインベースの足場（例えば、ＥＰ１９４１８６７に記載）から成る群から選択される。

典型的なＰ−ＮＴ用量／シグナルカーブを示す。 女性における累積ＣＶＤ事象を示すカプランマイヤーグラフ、カットオフ＞＜中央値＝１０９ｐｍｏｌ／ｌ Ｐ−ＮＴ．

実施例１
抗体の開発
免疫化のためのペプチド／複合体：
免疫化のためのペプチドを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へのペプチドの結合のために、追加のＮ末端システイン残基を用いて合成した（ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。そのペプチドを、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによってＢＳＡに共有結合で連結した。カップリング手順を、Ｐｅｒｂｉｏのマニュアルに従って実施した。

標識抗体（ＬＡ）ペプチド（Ｐ−ＮＴ１−１９）：

固相抗体（ＳＰＡ）ペプチド（Ｐ−ＮＴ４４−６２）：

前記抗体を、以下の方法に従って作製した：
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０及び１４日目に１００μｇのペプチド−ＢＳＡ複合体（１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化）、そして２１及び２８日目に５０μｇ（１００μｌの不完全フロイントアジュバンド中）で免疫した。
細胞融合実験を実施する３日前に、動物に、１回の腹腔内注射及び１回の静脈内注射として与えられる、１００μｌの生理食塩水中に溶解した５０μｇの複合体を与えた。

免疫したマウスからの脾細胞と、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞とを、３７℃にて３０分間、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを用いて融合した。洗浄後に、その細胞を、９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ハイブリッドクローンを、ＨＡＴ培地中での成長によって選択した［２０％のウシ胎仔血清及びＨＡＴサプリメントを補ったＲＰＭＩ１６４０培地］。２週間後に、ＨＡＴ培地を、３回の継代の間、ＨＴ培地に置き換え、それに続いて正常細胞培養培地に置き換えた。

融合の３週間後に、細胞培養上清を、抗原に特異的なＩｇＧ抗体について一次スクリーニングした。陽性の試験微量培養を、繁殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験後に、選択した培養物をクローニングし、限界希釈を使用することで再びクローニングし、そして、アイソタイプを決定した。

（Ｌａｎｅ， Ｒ．Ｄ． ″Ａ ｓｈｏｒｔ−ｄｕｒａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｕｓｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ″， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ８１ ： ２２３−２２８； （１９８５）， Ｚｉｅｇｌｅｒ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． ″Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ （ＧＡＤ） ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＧＡＤ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ″， Ｈｏｒｍ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｓ． ２８： １１−１５， （１９９６））

モノクローナル抗体産生
抗体を、標準的な抗体製造法によって産生させ（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ＡＴＬＡ ２５， １２１， １９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−クロマトグラフィーによって精製した。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づき＞９５％であった。

実施例２
ヒトプロニューロテンシンの定量化のための免疫学的アッセイ
使用される技術は、Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍエステル標識に基づいたサンドイッチコートしたチューブの発光イムノアッセイであった。

化標識合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）ＬＡ（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１０μｌのＡｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ＮＨＳ−エステル（アセトニトリル中に１ｍｇ／ｍｌ、ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＥＰ０３５３９７１）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。標識したＬＡを、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ４００−５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）によるゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製したＬＡを、（３００ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）中に希釈した。終濃度は、２００μｌあたり約８００．０００相対発酵単位（ＲＬＵ）の標識化合物（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステル化学発光を、ＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ）を使用することによって評価した。

固相：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ， Ａｕｓｔｒｉａ）を、ＳＰＡ（１．５μｇのＳＰＡ／０．３ｍｌの１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）で被覆した（室温にて１８時間）。５％のウシ血清アルブミンでブロッキングした後に、そのチューブを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、そして、真空乾燥水した。

較正：
Ｐ−ＮＴ含有ヒト血清の希釈物を使用して、アッセイを較正した。高いＰ−ＮＴ免疫反応性を有するヒト血清プール（ＩｎＶｅｎｔ Ｄｉａｇｏｓｔｉｋａ， Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ウマ血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ， Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で希釈した（アッセイ基準物質）。
標準物質を、ヒトＰｒｏ−ＮＴ校正物質（ＩＣＩ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用によって較正した。あるいは、アッセイは、合成又は遺伝子組み換えＰ−ＮＴ１−１１７又はその断片によっても較正され得る（Ｅｒｎｓｔ ｅｔ． ａｌ， ２００６もまた参照のこと）。

Ｐｒｏ−ＮＴ免疫学的アッセイ：
５０μｌのサンプル（又は較正物資）をＳＰＡコートチューブ内にピペットで計り取り、標識したＬＡ（２００μｌ）を加えた後に、そのチューブを１８〜２５℃で１６〜２２時間インキュベートした。洗浄液（２０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって、結合していないトレーサーを取り除いた。
チューブに結合したＬＡを、ＬＢ９５３を使用することによって計測した。
図１には、典型的なＰ−ＮＴ用量／シグナルカーブを示す。

実施例３
集団調査
我々は、１９９１〜１９９４年のＭａｌｍｏ Ｄｉｅｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ基準試験ベースの集団（人々の年齢５８±６歳、そして５９％が女性）の４３６２人の参加者からの空腹時血漿中のＰ−ＮＴを計測した。我々は、１２年を超える平均経過観察期間中の最初の事象の試験終点のそれぞれに対する、基準Ｐ−ＮＴ（対数変換Ｐ−ＮＴの標準偏差増大毎あたりのハザード比）を関連付けるために、多変数補正された（すべての従来の心疾患リスク因子、糖尿病リスク因子、そして、癌の分析において癌の遺伝も同様である）コックス比例ハザードモデルを使用した。終点は、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ， ｔｈｅ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ， ｔｈｅ Ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ Ｍａｌｍｏ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｇｉｓｔｒｙを通じて検索した。これらの登録簿を通じた終点の検索は、正当性が立証され、且つ、正確であることがわかっていた。

表１
全研究集団の臨床的特徴

表２
性別

表３
Ｑ＋日誌：アンケート又は日誌による基準での抗高血圧治療（Ｃ０２、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ０８、Ｃ０９）

表４
ＤＩＡＢ ＭＥＬＬ（ｆｂ＞６．０又はｐｏｓ Ｑ ＤＭ）

表５
現在の喫煙者０

表６
試験における女性の臨床的特徴
記述統計学

表７
Ｑ＋日誌：アンケート又は日誌による基準での抗高血圧治療（Ｃ０２、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ０８、Ｃ０９）

表８
ＤＩＡＢ ＭＥＬＬ（ｆｂ＞６．０又はｐｏｓ Ｑ ＤＭ）

表９
現在の喫煙者０

表１０
試験における男性の臨床的特徴
記述統計学

表１１
Ｑ＋日誌：アンケート又は日誌による基準での抗高血圧治療（Ｃ０２、Ｃ０３、Ｃ０７、Ｃ０８、Ｃ０９）

表１２
ＤＩＡＢ ＭＥＬＬ（ｆｂ＞６．０又はｐｏｓ Ｑ ＤＭ）

表１３
現在の喫煙者０

結果
心臓代謝リスク因子とＰ−ＮＴとの間の断面的関連性
研究集団の基準の特徴を図１に示す。女性は、男性と比較して僅かだが優位にＰ−ＮＴ（中間値（四分位間の幅））が高かった（１０９（７９−１５０）対９９（７１−１４４））ｐｍｏｌ／ｌ）（ｐ＜０．００１）。Ｐ−ＮＴと、肥満、心臓血管リスク因子及び糖尿病リスク因子の尺度との間の断面的関連性は、一般に弱く、両方の性において、空腹時インスリン濃度との相関が最も強かった（補充の表１）。変数減少及び保持ｐ値０．１０を有する線形回帰モデルにおいて、Ｐ−ＮＴの顕著な独立した決定因子は、女性において喫煙及び空腹時インスリン濃度、グルコース及びＨＤＬ（全て陽性）、男性において喫煙及び空腹時インスリン濃度及びＨＤＬ（陽性に関連）及び年齢及びＬＤＬ（陰性に関連）であった。

表１４
全体のＰＮＴの四分位数：
ＰＮＴ（ｐｍｏｌ／１）

表１５
女性のＰＮＴの四分位数：
ＰＮＴ（ｐｍｏｌ／１）

表１６
男性のＰＮＴの四分位数：
ＰＮＴ（ｐｍｏｌ／１）

表１７

Ｐ−ＮＴと、心臓血管疾患、心臓血管死亡率、及び全ての原因の死亡率の予測
基準の試験の前に心臓血管疾患の病歴の無い対象の内、５１９人が、１４．４±４．４年の間に、第一の心臓血管事象に罹患した。心臓血管リスク因子の基準レベルを完全に調整した後（年齢、性別、抗高血圧治療、収縮期血圧、ボディーマスインデックス、糖尿病、ＨＤＬ、ＬＤＬ、及び喫煙）、Ｐ−ＮＴの各ＳＤの増大は、心臓血管疾患のリスクの１７％の増大と関連した（表３）。Ｐ−ＮＴと女性の性別との間には強い相関があり（Ｐ＜０．００１）、性別階層化解析は、最高の四分位と最低の四分位との間で、全体の集団内での心臓血管疾患の発生するリスクの３７％の増大と関連し、女性においては６５％の増大と関連していた（表３）。空腹時インスリン濃度、即ちＰ−ＮＴの最も強い断面的関連因子における追加の調整は、結果に影響しなかった（データ無し）。

そして、全集団、男性及び女性のモデルを、全ての心臓血管リスク因子において調整して、全死亡率と心臓血管死亡率との間の関連性を評価した。Ｐ−ＮＴの各ＳＤの増大は、全集団において全ての死因の死亡率の有意な８％の増大、及び女性の全ての死因の死亡率のリスクの１３％の増大と関連していたが、男性において、Ｐ−ＮＴと関連したリスクの増大は見られなかった（表３）。ＳＤあたり２９％の主に心臓血管死によると見られる死の過剰のリスクは、全体の集団における心臓血管死のリスク及び女性の５０％の過剰リスクを増大させる。Ｐ−ＮＴの最高の四分位と最低の四分位に属する女性の対象とを比較すると、心臓血管死に罹患するリスクの増大は２倍以上であった（表３）。

基準Ｐ−ＮＴ対心臓血管疾患発症における多変量コックス比例ハザードモデル、全−ｃａｕｓｅ−及び心臓血管死亡率。

Ｐ−ＮＴ、Ｎ−ＢＮＰ及びＣＲＰの間の直接比較
Ｐ−ＮＴ及び確立された血漿バイオマーカーとの間の統計的強度及び研究された終点に対する効果の見積もりを比較するために、完全に調整されたモデルにおいて、Ｐ−ＮＴをＮ−ＢＮＰ及びＣＲＰと同時に入力した（ＣＲＰ及びＮ−ＢＮＰは、Ｍｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ． ２００９；３０２（ｌ）：４９−５７に記載のように測定された）。下記のように、全体の集団では、殆どの終点において、Ｐ−ＮＴの性能はＮ−ＢＮＰ及びＣＲＰと同等であったが、女性において、Ｐ−ＮＴの性能は、Ｎ−ＢＮＰ及びＣＲＰよりも明らかに優れていた（ＣＲＰ単独は女性では有意でなかった）。Ｎ−ＢＮＰ及びＰ−ＮＴを組み合わせる（Ｍｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ． ２００９；３０２（ｌ）：４９−５７参照）ことは、女性のＣＶＤにおける予測力を、１ＳＤあたり３３％ＨＲ改善した（Ｐ−ＮＴ単独に対して、Ｐ−ＮＴ及びＮ−ＢＮＰの組み合わせでは、１ＳＤあたり３４．８％の増大（ｐ＜０．００１））。

表１８
ＣＶＤ発症率−全体の対象

表１９
ＣＶＤ発症率−女性の対象

図２：女性における累積ＣＶＤ事象を示すカプランマイヤーグラフ、カットオフ＞＜中央値＝１０９ｐｍｏｌ／ｌ Ｐ−ＮＴ．

基準Ｐ−ＮＴによるＣＶＤ事象の予測は、完全な観察期間に渡り与えられた。

サブグループ解析
上記等式と同一の変数を使用して、ＣＶＤ、死亡、ＣＶＤ死亡率の予測のために様々なサブグループを調査した。ＣＶＤ事象の病歴のある対象は除外した。

表２０
ＣＶＤ事象の予測

ＣＶＤ事象の予測は、女性においてのみ関連していた。Ｐ−ＮＴの予測力は完全に健康な女性及び糖尿病やＨＢＰ等の高リスクの女性において類似していた。

表２１
ＣＶＤ死亡率の予測

Ｐ−ＮＴによるＣＶＤ死亡率の予測は、女性では強力だが、男性では顕著でなかった。Ｐ−ＮＴの予測力は健康な女性及び高リスク（糖尿病又はＨＢＰ）の女性において優れていた。

リスク群への女性の再分類
方法：
モデルｃ−統計を計算し、Ｎｅｔ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ （ＮＲＩ）を用いて、Ｐ−ＮＴを有する及び有しないモデルにおいて、様々な事象における１０年間の予想されるリスクのカテゴリー（それぞれ＜５％， ＞＝５−１０％， ＞＝ １０−２０％ ａｎｄ ＞＝２０％）に再分類した。

全ての解析は、Ｓｔａｔａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １１ （ＳｔａｔａＣｏｒｐ， Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｔｅｘａｓ）を用いて実施された。両側ｐ値＜０．５で、統計的に有意と見做した。

心臓血管死亡率において、全体のＮＲＩの顕著な増大が１１％の境界線が存在した。Ｐ−ＮＴは、実際に心臓血管死に至った女性の１９％をより高いリスクカテゴリーに正しく再分類したが、心臓血管死に至らなかった女性をより低いリスクカテゴリーに再分類したのは５％に留まった（表５）。女性の中で、１０年リスクが中間（１０〜２０％）、即ちバイオマーカーのサポートが、最初の予防的治療の開始に関する臨床決定を作成するのに特に重要と示唆された群の中で、伝統的な心臓血管リスク因子にＰ−ＮＴを加えることで、心臓血管死亡率において４０％の顕著な臨床ＮＲＩがもたらされ、心臓血管死に至った女性の２１％がより高いリスクカテゴリーに再分類され、心臓血管死に至らなかった女性の３０％がより低いリスクカテゴリーに再分類された。

文献：
Ｐｅｎｃｉｎａ ＭＪ， Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ＲＢ． Ｏｖｅｒａｌｌ Ｃ ａｓ ａ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ： ｍｏｄｅｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ． Ｓｔａｔ Ｍｅｄ． Ｊｕｌ １５ ２００４；２３（１３）：２１０９−２１２３．
Ｐｅｎｃｉｎａ ＭＪ， Ｄ’Ａｇｏｓｔｍｏ ＲＢ， Ｓｒ．， Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ＲＢ， Ｊｒ．， Ｖａｓａｎ ＲＳ． Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｄｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ： ｆｒｏｍ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ ｔｏ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓｔａｔ Ｍｅｄ． Ｊａｎ ３０ ２００８；２７（２）：１５７−１７２； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２０７−１１２．
Ｒｉｄｋｅｒ ＰＭ， Ｂｕｒｉｎｇ ＪＥ， Ｒｉｆａｉ Ｎ， Ｃｏｏｋ ＮＲ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ ｉｎ ｗｏｍｅｎ： ｔｈｅ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｒｉｓｋ Ｓｃｏｒｅ． Ｊａｍａ． Ｆｅｂ １４ ２００７；２９７（６）：６１ １−６１９．

Claims (16)

1. 女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクを予測する方法であって、以下のステップ：
   ・前記女性の対象から得た体液中のプロニューロテンシン１−１１７又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルを測定し、そして
   ・前記対象が心臓血管事象に罹患するリスクと、前記プロニューロテンシン１−１１７又はその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルとを、高いレベルが、心臓血管事象に罹患する高いリスクの予測となるように関連付けること、
   を含み、当該心臓血管事象が、心筋梗塞、心臓発作、急性心不全及び心筋梗塞、心臓発作、急性心不全に関連する心臓血管性の死からなる群から選択され、当該体液中のプロニューロテンシン１−１１７又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルが、空腹時レベルである、当該方法。
2. 前記女性の対象が、体液が採取される時点で心臓血管事象と診断された経験が無い、請求項１に記載の方法。
3. 前記体液採取時点で、女性の対象が、心臓血管疾患又は糖尿病と診断されている、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記体液採取時点で診断されている心臓血管疾患が、心不全、アテローム動脈硬化、及び高血圧からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記体液採取時点で、女性の対象が、ＩＩ型糖尿病と診断されている、請求項３に記載の方法。
6. 追加で、以下のマーカー：ｐｒｏ−ＢＮＰ若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片若しくは前駆体、及び／又はＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルが判定され使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 追加で、年齢、収縮期血圧、拡張期血圧、抗高血圧治療、ボディーマスインデックス、糖尿病の存在、喫煙からなる群から選択される、１つ以上の臨床的パラメーターが判定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記プロニューロテンシン１−１１７のレベルが判定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. プロニューロテンシン１−１１７又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドのレベルが免疫学的手法を用いて測定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 女性の対象が心臓血管事象に罹患するリスクをモニタリングするため、あるいは治療の経過をモニタリングするために、２回以上実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記モニタリングが、前記女性の対象における、治療的処置又は予防的処置に対する応答を評価するために実施される、請求項１０に記載の方法。
12. リスク群ごとに女性の対象を階層化するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を実施するためのデバイスの使用。
14. 前記デバイスがポイントオブケアデバイスである、請求項１３に記載の使用。
15. 心臓血管事象に罹患するリスクを予測するためのデバイスの使用であって、当該デバイスが、
    プロニューロテンシン１−１１７又は少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片、又はプロニューロテンシン１−１１７含有ペプチドに対する結合剤、及び
    ｐｒｏ−ＢＮＰ若しくは少なくとも５つのアミノ酸から成るその断片若しくは前駆体に対する結合剤、及び／又はＣＲＰに対する結合剤
    を備える、当該使用。
16. 請求項１５に記載の心臓血管事象に罹患するリスクを予測するためのデバイスの使用であって、前記結合剤が、抗体、抗体断片、及び非Ｉｇ足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）からなる群から選択される、当該使用。

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