JP6419460B2 - ビオチン化合物、ビオチン標識化剤及びタンパク質集合体 - Google Patents

Description

本発明は、ビオチン化化合物、ビオチン標識化剤、及びタンパク質集合体に関する。

ゲノム情報ならびにタンパク質構造情報の蓄積に伴い、タンパク質の機能性分子としての価値が高まっている。また、タンパク質を単体として利用するのみならず、積極的に多量体化したり、異種分子と複合化したりすることで、タンパク質機能の効果の上昇が期待出来る。そのような研究においては、タンパク質本来の機能を損なわずに、タンパク質間を部位特異的に連結する技術が必要とされる。

バイオリファイナリーとは、再生可能資源であるバイオマスを資源として、バイオ燃料や化学製品を生産することを言い、石油使用量や二酸化炭素発生量の減少などの利点から、近年注目を集めている。しかしながら、植物性バイオマス中の約１／２を占めるセルロースは、多数のグルコース分子がグリコシド結合により直鎖状に重合した天然高分子である分子内・分子間及び層間水素結合により極めて安定した結晶構造を取るため、その分解には強酸や高温、高圧といった過酷な条件下で多量のエネルギーが必要となることが実利用の観点から問題とされている。

また植物性バイオマスは作物系と木質系の２つに大別されるが、食料問題との競合から糖化・発酵の行い易い作物系ではなく、特に結晶構造が強固な木質系バイオマスをいかにグルコースへと分解するかが肝要となっている。一方で、自然界においてセルロースは、セルロース分解性の微生物によって常温、常圧下で分解されている。この反応を行っているのがセルロース分解酵素セルラーゼであり、将来的にセルロース系バイオマスを資源として利用するためには、このセルラーゼを上手く利用して酵素糖化率を向上させる必要がある。

自然界ではこれに加えて、バイオマス分解酵素群を高度に集積化させた集合体“セルロソーム”を形成することにより、糖化反応効率を向上させている。セルロソームとは、セルロース系バイオマスに作用して、その分解を行う複合酵素集合体であり、セルラーゼやヘミセルラーゼ等の酵素が、相互作用を行う足場タンパク質であるコヘシンとドックリンとの特異的相互作用により高度に集積した構造を有し、セルロース結合ドメインによってセルロース基質への吸着を促進する機能も有している。セルロソーム形成により、異なる機能を有するタンパク質やペプチドを１次元に集積化することで、遊離酵素と比べて大幅な糖化効率の向上が達成されている。

これまでにアビジン―ビオチン相互作用を用いて二量体酵素であるアルカリホスファターゼの特定部位をビスビオチン化し、これをストレプトアビジンと混合することで、自発的に１次元状の酵素集合体を得られることが知られている（図１、特許文献１）。具体的には二量体型酵素の対角線上の特定の位置に、ストレプトアビジンの４次構造に合わせた２分岐型のビスビオチン化基質を用いて修飾を行い、ストレプトアビジンと混合することで”ひも状”の１次元酵素集合体の構造制御に成功している。

国際公開２０１３／０８４５２６号パンフレット

特許文献１に開示されている２分岐型のビスビオチン化基質を用いる際には、タンパク質が少なくとも多量体構造を有していなければならず、単量体タンパク質を集合体化することが困難である。また、集合体化を施すにしても、タンパク質又はペプチドが発揮する機能を妨げないような特定の位置を探索して、その位置にビスビオチン化を施すといった工夫が必要となっている。さらに、多量体構造を有するタンパク質全体の立体構造や多量体タンパク質であっても、サブユニット同士の結合が脆弱であれば、多量体構造を維持させることが困難である。

本発明は、タンパク質又はペプチドがとる立体構造に影響されることなく、容易にタンパク質又はペプチドの集合体を作製することを目的とする。

本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、新規ビオチン化合物を設計・合成し、これをテトラビオチン型のラベル化試薬としてトランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）と共に用いて、単量体構造を有する酵素をテトラビオチン化することで、斯かる酵素の集合体が形成できることを見出した。

本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を包含するものである。

項１ 式（１）又は式（２）で表されるビオチン化合物：

（式（１）及び（２）のＲ１〜Ｒ７は、同一又は異なってアミノ酸残基又はペプチド残基であり、該アミノ酸残基のカルボキシル基又はペプチド残基のカルボキシル末端のカルボキシル基は、式（１）又は式（２）のＲ１〜Ｒ７のそれぞれに隣接するアミノ基とペプチド結合を形成し、該アミノ酸残基のアミノ基又はペプチド残基のアミノ末端のアミノ基は、式（１）又は式（２）のＲ１〜Ｒ７のそれぞれに隣接するカルボニル基とペプチド結合を形成する。）。

項２ Ｒ１〜Ｒ７に示されるアミノ酸残基が、同一又は異なってグリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、プロリン残基、及びセリン残基からなる群より選択される１種である、請求項１に記載のビオチン化合物。

項３ Ｒ１〜Ｒ７に示されるペプチド残基が、グリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、プロリン残基、及びセリン残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、上記項１に記載のビオチン化合物
項４ 式（３）又は式（４）で表されるビオチン化合物：

項５ 上記項１〜項４の何れか１項に記載のビオチン化合物を含む、タンパク質又はペプチドに対するビオチン標識化剤。

項６ 前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を少なくとも一つ含む上記項５に記載のビオチン標識化剤。

項７ 上記項５又は上記６に記載のビオチン標識化剤とトランスグルタミナーゼを含む、タンパク質又はペプチドのビオチン標識化キット。

項８ トランスグルタミナーゼが微生物由来である、上記項７に記載のビオチン標識化キット。

項９ 以下の工程１〜３を含む、ビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法：
（１）項１〜項４の何れか１項に記載のビオチン化合物とタンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合して接触させる工程（１）、
（２）工程（１）にて得られる混合物を、前記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程（２）、及び
（３）工程（２）にて得られる混合物から、ビオチン標識化タンパク質又はペプチドを回収する工程（３）。

項１０ 前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含む上記項９に記載の製造方法。

項１１ トランスグルタミナーゼが微生物由来である、上記項８又は上記項９に記載の製造方法。

項１２ 以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、タンパク質又はペプチドの集合体の製造方法：
（Ａ）項１〜項４の何れか１項に記載のビオチン化合物を用い、トランスグルタミナーゼの存在下でビオチン標識化されたタンパク質又はペプチドと、アビジン化合物とを混合して接触させる工程（Ａ）及び
（Ｂ）工程（Ａ）にて得られる混合物から、タンパク質又はペプチドの集合体を回収する工程（Ｂ）。

項１３ 前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含む上記項１２に記載の製造方法。

項１４ トランスグルタミナーゼが微生物由来である、上記項１２又は項１３に記載の製造方法。

項１５ アビジン化合物が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質、ブラダビジン、リザビジン、タマビジンからなる群より選択される少なくとも１種である上記項１２〜項１４の何れか１項に記載の製造方法。

本発明によると、タンパク質又はペプチドの立体構造に依らず、容易にタンパク質又はペプチドの集合体を形成させることができる。

本発明によって形成されたタンパク質又はペプチドの集合体は、斯かるタンパク質又はペプチドそのものが発揮する作用を減衰することなく、寧ろその作用が強まる。

従来のビオチン化合物を用いたタンパク質集合体の作成方法を説明する図。 実施例１におけるＲＰ−ＨＰＬＣによる解析結果を示す図。 実施例１におけるＲＰ−ＨＰＬＣによる解析結果を示す図。 実施例１におけるＳＥＣによる解析結果を示す図。 実施例１におけるＡＦＭ写真像。 実施例１におけるＳＥＣによる解析結果を示す図。 実施例１におけるセルロースの糖化反応を検討した実験結果を示す図。 実施例１におけるセルロースの糖化反応を検討した実験結果を示す図。 実施例２におけるＳＥＣによる解析結果を示す図。 実施例２におけるＯＶＡのＥＬＩＳＡ結果を示す図。 （ｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＥＧ）Ｋ）ＫＧＬＱＧ）のＭＳ解析結果を示す図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。 本願発明を説明する図。

＜ビオチン化合物＞
本発明に係るビオチン化合物は、下記式（１）又は式（２）にて表される。

式（１）及び式（２）のＲ１〜Ｒ７は、同一又は異なってアミノ酸残基又はペプチド残基であり、該アミノ酸残基のカルボキシル基又はペプチド残基のカルボキシル末端のカルボキシル基は、式（１）又は式（２）のＲ１〜Ｒ７のそれぞれに隣接するアミノ基とペプチド結合を形成し、該アミノ酸残基のアミノ基又はペプチド残基のアミノ末端のアミノ基は、式（１）又は式（２）のＲ１〜Ｒ７のそれぞれに隣接するカルボニル基とペプチド結合を形成している。

式（１）及び式（２）のＲ１〜Ｒ７がアミノ酸残基である場合のアミノ酸残基は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、それぞれ１つ以上のカルボキシル基とアミノ基を有する化合物であると定義される広義のアミノ酸から、それが有するアミノ基の水素原子及びカルボキシル基の水酸基が除かれて得られるアミノ酸残基であればよい。すなわち、アミノ酸残基とは、天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基であっても、非天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基であってもよい。

具体的なアミノ酸残基は、特に限定はされないが、例えば本発明に係るビオチン化合物が分子的に自己集合することなく、水に対する溶解度を高くする観点から、グリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、プロリン残基、セリン残基等が好ましい。

式（１）及び式（２）のＲ１〜Ｒ７がペプチド残基である場合のペプチド残基の種類はそれぞれ同一であっても異なっていてもよく、上述のアミノ酸残基がペプチド結合し、且つペプチド主鎖のアミノ末端のアミノ基から水素原子及びペプチド主鎖のカルボキシ末端のカルボキシル基から水酸基が除かれて得られるペプチド残基であればよい。

具体的なペプチド残基は、特に限定はされないが、例えば本発明に係るビオチン化合物が分子的に自己集合することなく、水への溶解度を高くする観点から、グリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、プロリン残基、セリン残基等のアミノ酸残基を含むペプチド残基であることが好ましい。

本発明に係るビオチン化合物の中でも、下記式（３）、下記式（４）等で表される化合物が好ましい。

なお、本明細書において式（３）にて表されるビオチン化合物を、ｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−Ｋ）−ＫＧＬＱＧと呼ぶことがあり、式（４）にて表される化合物を、ｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＥＧ）−Ｋ）−ＫＧＬＱＧと呼ぶことがある。

本発明のビオチン化合物は、ビオチン、各種構成アミノ酸残基に基づくアミノ酸を原料にし、例えば固相合成法のような一般的なＦｍｏｃペプチド合成方法を採用すれば製造すればよい。具体的なペプチド合成方法として、例えば以下の手順による方法が挙げられる。当然以下に示す方法に限定されることはなく、適宜変更を施したメソッドを採用してもよい。

１）ＰＤ−１０カラムを組み立て、その中に０．１ｍｍｏｌ分のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎを添加する。
２）３ｍＬのＤＭＦで一晩震盪し、樹脂の膨潤を行う。
３）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄し、安定剤の除去を行う。
４）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１回洗浄し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。
５）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１５分震盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。
６）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。
７）０．５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−各種アミノ酸及び０．４５ＭのＨＢＴＵ，２．１ｍＬのＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液、０．７ｍＬの０．９Ｍ ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液を加え、適当な時間で震盪する。
８）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。なお、ここでＫａｉｓｅｒテストによって未反応樹脂の確認を行ってもよい。テスト結果が陽性の場合、上記の７）に戻りアミノ酸を再伸長させてもよい。テスト結果が陰性の場合、以下の操作を先に進めればよい。
９）３ｍＬのＤＣＭで３回洗浄する。
１０）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。
１１）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１回洗浄し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。
１２）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１５分震盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。
１３）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。
１４）上記７）から１３）までを繰り返し、目的のビオチン化合物となるようにそれを構成するアミノ酸を伸長させる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ等の化合物を、適宜採用して伸長させる。
１５）アミノ酸を伸長させた樹脂に、ビオチン、及び０．４５ＭのＨＢＴＵ、２．１ｍＬのＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液、０．７ｍＬの０．９Ｍ ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液を加え、適当な時間で震盪する。
１６）３ｍＬのＤＣＭで５回、３ｍＬのＤＭＦで５回、３ｍＬのメタノールで５回洗浄後、一晩真空乾燥する。
１７）ＴＦＡ、ＴＩＳ、及び脱イオン水をそれぞれ９５：２．５：２．５で混合した２．５ｍＬのカクテルを添加して１時間攪拌し、樹脂からの切り出しを行う。
１８）全ての伸長操作の後切り出した溶液に対して、４０ｍＬのジエチルエーテルを添加して析出させ、凍結乾燥により粗ペプチドが得られる。
１９）得られた粗ペプチドを下記の条件でペプチド由来の２３０ｎｍの吸収を追跡する事でＨＰＬＣによって精製し、生成物に相当するフラクションを回収し、凍結乾燥させる。ＨＰＬＣの条件は、カラムとして、ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＡ−３（１０×２５０ｍｍ）を用い、移動相として０．１％のＴＦＡ／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ａ）及びアセトニトリルを用い、１０％の（Ｂ）から７０％の（Ｂ）を３０分でグラジエントをかけるか、７０％の（Ｂ）から１０％の（Ｂ）を４０分でグラジエントをかけるかすればよい。

＜ビオチン標識化剤＞
本発明に係るビオチン標識化剤は、上述の本発明に係るビオチン化合物を含み、タンパク質又はペプチドをビオチン標識することに専ら好適に用いられる。

本発明に係るビオチン標識化剤１００重量部あたり、０．０００１〜１００重量部含まれていればよい。すなわち、上述の本発明に係るビオチン化合物をそのまま本発明に係るビオチン標識化剤としてもよく、タンパク質又はペプチドへのビオチン標識を妨げない範囲において、他の成分が含まれていてもよい。

本発明に係るビオチン標識化剤が対象とするタンパク質又はペプチドは、特に限定はされないが、斯かるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列内に配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでいることが好ましい。中でも、配列番号４に示すアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。

タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列内に配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列が含まれる位置は特に限定はされないが、例えば、タンパク質又はペプチドとして、エンドグルカネース又はβグルコシダーゼが採用される場合、上記配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列が、エンドグルカネース又はβグルコシダーゼのアミノ酸配列のＣ末端領域に含まれていることが好ましい。

このような配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドは、公知の遺伝子工学的手段又はペプチド合成手段を採用することによって容易に得ることができる。

＜ビオチン標識化キット＞
本発明に係るビオチン標識化キットは、上述のビオチン標識化剤及びトランスグルタミナーゼを含む。

トランスグルタミナーゼとは、グルタミン残基と、リジン残基又は一級アミン基を有する化合物との間でのアシル転移反応を触媒する酵素であれば特に限定はされないが、微生物由来のトランスグルタミナーゼであること好ましい。具体的な微生物も特に限定はされないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来のトランスグルタミナーゼであり、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ８ＫＲＪ２Ｐ８１４５３に示されるアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼが好ましい。

本発明に係るビオチン標識化キットには、更にキットを提供する分野で通常用いられているバッファー、マニュアル、ディスポーザブルカラム等といった公知の構成物品、試薬等が含まれていてもよい。

＜ビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法＞
本発明に係るビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法は、以下に示す工程（１）〜（３）を含む。

（１）本発明に係るビオチン化合物とタンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合して接触させる工程（１）、
（２）工程（１）にて得られる混合物を、前記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程（２）、及び
（３）工程（２）にて得られる混合物から、ビオチン標識化タンパク質又はペプチドを回収する工程（３）。

工程（１）について
本発明に係るビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法における工程（１）は、本発明に係るビオチン化合物とタンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合して接触させる工程である。

タンパク質又はペプチド並びにトランスグルタミナーゼは、共に特に限定されることなく、上述の本発明に係る＜ビオチン標識化剤＞にて説明した通りとすることができる。

接触させる際の条件等は、特に限定されることはなく、例えば特許文献１のビオチン標識化方法に記載された条件を適宜変更して採用すればよい。

本発明に係るビオチン化合物、及びタンパク質又はペプチドの使用量についても同様に、特許文献１のビオチン標識化方法に記載された条件を適宜変更して採用すればよい。

工程（２）について
本発明に係るビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法における工程（２）は、上記工程（１）にて得られる混合物を、前記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程である。

具体的なトランスグルタミナーゼの至適活性条件は、特に限定されることはなく、例えば特許文献１のビオチン標識化方法に記載された条件を適宜変更して採用すればよい。

トランスグルタミナーゼの使用量についても同様に、特許文献１のビオチン標識化方法に記載された条件を適宜変更して採用すればよい。

工程（３）について
本発明に係るビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法における工程（３）は、上記工程（２）にて得られる混合物から、ビオチン標識化タンパク質又はペプチドを回収する工程である。

工程（３）では、ビオチン標識化タンパク質又はペプチドを回収するとともに、適宜公知の手段を用いて更に精製する工程が含まれていてもよい。

本発明に係るビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法によって得られるビオチン標識化タンパク質又はペプチドは、アビジン化合物と共に用いることによって、分子生物学的検出手段に好適に用いることができる。特に、下記に示すようにアビジン化合物と共に用いることによるタンパク質又はペプチドの集合体を形成させるのに好適にも強いることができる。

＜タンパク質又はペプチドの集合体の製造方法＞
本発明に係るタンパク質又はペプチドの集合体の製造方法は、以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む。

（Ａ）本発明に係るビオチン化合物を用い、トランスグルタミナーゼの存在下でビオチン標識化されたタンパク質又はペプチドと、アビジン化合物とを混合して接触させる工程（Ａ）及び
（Ｂ）工程（Ａ）にて得られる混合物から、タンパク質又はペプチドの集合体を回収する工程（Ｂ）。

工程（Ａ）について
本発明に係るタンパク質又はペプチドの集合体の製造方法における工程（Ａ）は、本発明に係るビオチン化合物を用い、トランスグルタミナーゼの存在下でビオチン標識化されたタンパク質又はペプチドと、アビジン化合物とを混合して接触させる工程である。

タンパク質又はペプチド並びにトランスグルタミナーゼは、共に特に限定されることなく、上述の本発明に係る＜ビオチン標識化剤＞にて説明した通りとすることができる。

工程（Ａ）におけるビオチン標識化されたタンパク質又はペプチドの入手手段は特に限定はされないが、例えば、上述の本発明に係る＜ビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法＞を採用することができる。

アビジン化合物はビオチン標識化されたタンパク質又はペプチドの電荷等の特性に応じて適宜選択すればよく、特に限定はされないが、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質、ブラダビジン、リザビジン、タマビジン等が挙げられる。

接触させる際の条件等は、特に限定されることはなく、例えば特許文献１のタンパク質又はペプチド集合体の製造方法に記載された条件を適宜変更して採用すればよい。

ビオチン標識化されたタンパク質又はペプチド及びアビジン化合物の使用量についても同様に、特許文献１のビオチン標識化方法に記載された条件を適宜変更して採用すればよい。

工程（Ｂ）について
本発明に係るタンパク質又はペプチドの集合体の製造方法における工程（Ｂ）は、工程（Ａ）にて得られる混合物から、タンパク質又はペプチドの集合体を回収する工程である。

工程（Ｂ）では、タンパク質又はペプチドの集合体を回収するとともに、適宜公知の手段を用いて更に精製する工程が含まれていてもよい。

本発明に係るタンパク質又はペプチドの集合体の製造方法によって得られるタンパク質又はペプチドの集合体は、集合体を形成するタンパク質又はペプチドそのものが発揮する効果よりも相乗的に上昇した効果を発揮する。例えば、斯かる効果がセルラーゼに起因するセルロース分解活性であれば、得れるタンパク質又はペプチドの集合体はセルロソームとして有用であり、ベータグルコシダーゼ活性であれば、免疫学的測定法における検出感度を著しく上昇させることができるといった効果が期待できる。

以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示すが、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。

＜実施例１＞
エンドグルカナーゼ（ＥＧ）の触媒ドメイン（ＣＤ_ＥＧ）とセルロース結合ドメイン（ＣＢＭ）からなる人工セルロソーム系を構築し、異種タンパク質からなる１次元タンパク質集合体の形成が可能なこと、それによる集合体の機能向上が可能なことを明らかにした。

１．新規テトラビオチン化基質Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ _４ のペプチド合成
化学式（３）に示すｔｅｔｒａ−ｂｉｏｔｉｎ化基質ペプチドｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−Ｋ）−ＫＧＬＱＧ（以下Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４と呼ぶこともある。）は、Ｆｍｏｃ固相合成法の手順に従って合成した。

樹脂はＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｌｋｏ ｒｅｓｉｎを用いた。合成スケールは０．２ｍｍｏｌで行った。縮合カクテルは、（１−Ｃｙａｎｏ−２−ｅｔｈｏｘｙ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌｉｄｅｎａｍｉｎｏｏｘｙ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ− ｃａｒｂｅｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを用いた。ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ｔｒｉｉｄｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ、脱イオン水を９５：２．５：２．５で混合したカクテル２．５ｍＬを添加し、１時間攪拌し、樹脂からの切り出しを行った。切り出した溶液に対して、ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒを４０ｍＬ添加し、析出させ、凍結乾燥により粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを表１に示す条件でペプチド由来の２３０ｎｍの吸収を追跡する事でＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、生成物に相当するフラクションを回収し、凍結乾燥させた。同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ及びＲＰ−ＨＰＬＣによって行った。

２．Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ _４ とＤａｎｓｙｌ Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ（ＤＣ）のＭＴＧ反応確認
今回合成したＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４がＭＴＧによって認識されるのかどうかを、ＭＴＧのＫ側（一級アミン）基質であるｄａｎｓｙｌ ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ（ＤＣ）を用いて確認した。酵素反応はＴＢＳ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．３７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）中に、最終濃度が１μＭ、２０μＭ、０．１Ｕ／ｍＬとなるようにＤＣ、Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４、ＭＴＧを加え、それらを良く攪拌し、２５°Ｃで３０分間静置させることで行った。反応後のサンプルを表１に示す条件でＲＰ−ＨＰＬＣを用いた分析を行い、このときＤＣ由来の３３３ｎｍの吸収を追跡する事によってＭＴＧの架橋反応を確認した。

３．Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ _４ を用いた各種タンパク質のビオチン化

Ｋ−ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎとＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４を用いて、ＭＴＧ架橋反応による各種タンパク質のビオチン化を行った。酵素反応はＴＢＳ緩衝液中に、最終濃度が１０μＭ、２００μＭ、０．５Ｕ／ｍＬとなるように、表２に示すようにＣ末端に変異が施された各種Ｋ−ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｋ−ｔａｇ ＣＤ_ＥＧ、Ｋ−ｔａｇ ＥＧ、Ｋ−ｔａｇ ＣＢＭ）、Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４、ＭＴＧを加え、それらを良く攪拌し、３７°Ｃで３時間静置させることで行った。

反応後のサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢによりゲルの染色を行った。Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製により、過剰の未反応の基質とビオチン化タンパク質（ｂ_４−ＣＤ_ＥＧ、ｂ_４−ＥＧ、及びｂ_４−ＣＢＭ）を単離し反応を終了させた。精製後のサンプルについてｖｉｖａ ｓｐｉｎカラムで回収緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌｐＨ、８．０）への交換を、溶出時の緩衝液が０．１％以下になるまで行った。

４．ＨＡＢＡ法によるビオチンラベル化率の算出
４−１．試薬の調製
２４．２ｍｇの４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−２’−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＨＡＢＡ）を９．９ｍＬの超純水に溶解させ、１００μＬの１ＭのＮａＯＨを添加した（ＨＡＢＡ溶液）。１０ｍｇの卵白由来ａｖｉｄｉｎを２０ｍＬのメスフラスコに入れ、先に調製したＨＡＢＡ溶液を６００μＬ加えた後、ＰＢＳでメスアップした（ＨＡＢＡ−ａｖｉｄｉｎ溶液）。

４−２．測定方法
１ｍＬ石英セルにＨＡＢＡ−ａｖｉｄｉｎ溶液を９００μＬとり、５００ｎｍに於ける吸収を測定した。この時の値をＡｂｓ（Ａ）とした。次に１０μＭｂ_４−ＣＤ_ＥＧ溶液１００μＬ添加し、吸光度が安定した時の５００ｎｍの吸収を測定した。この値をＡｂｓ（Ｂ）とした。吸光度を下記の数式に当てはめ、サンプル中のビオチン濃度からビオチンのラベル化率を算出した。

［ビオチン］＝１０^−３×（０．９×Ａｂｓ（Ａ）ーＡｂｓ（Ｂ））／３４
ビオチン化率＝［ビオチン］／［各種タンパク質］

以後、本明細書において［物質名］との記載は、物質名の濃度を意味する。

５．ｂ _４ −ＣＤ _ＥＧ 、ｂ _４ −ＥＧを用いたセルロースの糖化反応
酵素糖化反応は、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、最終濃度が０．５ｗｔ％のＡｖｉｃｅｌ（結晶性セルロース基質）若しくは０．０５ｗｔ％のｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＣＭＣ：可溶性セルロース基質）と、１００ｎＭのｂ_４−ＣＤ_ＥＧ、ｂ_４−ＥＧとなるように調製したサンプルを混合し、５０°Ｃで攪拌させることで行った。糖化反応の評価は、３，５，−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＳ）法を用いて生成した還元末端の定量にて行った。０、１、３、６、１２、２４、及び４８時間の時点で１００μＬサンプリングを行い、それぞれについて１００μＬのＤＮＳ試薬を加え、攪拌後９９°Ｃで５分間加熱した。加熱後すぐにヴォルテックスにて撹拌し、氷浴上で２分間静置することで常温まで冷却した。１５０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、得られた上清を９６穴プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌの量で添加し、プレートリーダーで５４０ｎｍの吸収を測定することで還元末端量の定量を行った。

６．ストレプトアビジン添加による酵素集合体の形成
集合体の形成はＴＢＳ緩衝液中に、最終濃度が２μＭのｂ_４−ＣＤ_ＥＧ若しくはｂ_４−ＥＧ及び１、２、４、８、若しくは１６μＭとなるようにストレプトアビジン（以下、ＳＡと呼ぶことがある。）を加えたサンプルを激しく攪拌した後、３０分間室温で静置し集合体の形成を行った。このとき、サンプル中の混合比は［ＳＡ ｍｏｎｏｍｅｒ（ｍＳＡ）］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１／８、１／４、１／２、１、又は２である。集合体形成後のサンプルについてサイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて分画し、集合体形成の挙動を追跡した。ＳＥＣによる分析は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにて２８０ｎｍの吸収を追跡することにより行った。

同様にして、ｂ_４−ＥＧの最終濃度は２μＭで固定し、２、８，若しくは１８μＭの最終濃度となるようにしたｂ_４−ＣＢＭ又は４、１０、又は２０μＭのＳＡを加えたサンプルについて、激しく攪拌した後３０分間室温で静置し、集合体の形成を行った。このとき、サンプル中の混合比は［ＳＡ ｍｏｎｏｍｅｒ］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１である。集合体形成後のサンプルについてサイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて分画し、集合体形成の挙動を追跡した。ＳＥＣによる分析は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにて２８０ｎｍの吸収を追跡することにより行った。

７．新規自己集合性人工セルロソームを用いた結晶性セルロースの糖化反応
酵素糖化反応は、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、最終濃度が０．５ｗｔ％のＡｖｉｃｅｌ、及び１００ｎＭのｂ_４−ＣＤ_ＥＧ又はｂ_４−ＥＧを含む酵素集合体：（ＣＤ_ＥＧ−ＳＡ）_ｎ集合体、（ＥＧ−ＳＡ）_ｎ集合体、（ＥＧ／ＣＢＭ−ＳＡ）_ｎ集合体となるように調製したサンプルについて、５０°Ｃで攪拌させることで行った。生成還元末端の定量については実験項５と同様にして行った。

（結果と考察）
１．新規テトラビオチン化基質のペプチド合成
Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析結果を行った。図２に示すように、理論分子量によく一致した単一ピークが観察され、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいても単一のピークが観察されたことから、Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４の合成に成功したと判断し、以降の実験はこのサンプルを用いて検討を行った。

Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４：ｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）−Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ
白色粉末、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ ＭＳ；ｍ／ｚ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_９７Ｈ_１５５Ｎ_３１Ｏ_２９Ｓ_４Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）２３７０．６，ｆｏｕｎｄ２３７０．１

２．Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ _４ とＤａｎｓｙｌ Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ（ＤＣ）のＭＴＧ反応確認
Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４がＭＴＧによって認識されるか評価する為に、ＭＴＧのリジン残基側の基質であるＤＣとの架橋反応を試みた。評価はＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＤＣ由来の３３３ｎｍの吸収を追跡し、比較する事によって行った。結果を図３に示す。ＤＣ由来のピークが１７．０５７ｍｉｎにおいて観察され、Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４存在下でもピーク位置はほぼ変化しなかった。これに対し、ＭＴＧによる架橋化反応を行ったサンプルにおいては、新たに２８．２８５ｍｉｎにピークが出現した。ＰＲ−ＨＰＬＣにおけるピーク面積から算出された反応率は８６％であった。このピークに相当するフラクションを回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析を行った所、Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４とＤＣの架橋体に相当する分子量であったことから、よって今回新規に合成したビオチン化基質であるＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４はＭＴＧによって認識されることを確認した。

Ｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）−Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＧｌｙーＤＣ
ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ ＭＳ；ｍ／ｚ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_１１４Ｈ_１７７Ｎ_３３Ｏ_３１Ｓ_５Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）２６８９．１，ｆｏｕｎｄ ２６８９．４

３．Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ _４ を用いたタンパク質のビオチン化と評価
Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４を用いてＭＴＧによるビオチン化反応を行ったサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。３２ｋＤａ付近にＣＤ_ＥＧ由来のバンドが、４８ｋＤａ付近にＥＧ由来のバンドが、１３ｋＤａ付近にＣＢＭ由来のバンドが、そして３７ｋＤａ付近にＭＴＧ由来のバンドが観察された。ＭＴＧ反応後のレーンにおいて、修飾されたＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４に由来する高分子量側へのバンドシフトが観察された。このことから、ＭＴＧによってＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４が目的タンパク質に導入されたことが示唆された。同様に、反応時間の最適化を行った所、反応開始３時間でほぼ全てのＫ−ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎが反応している様子が観察された。また、ＨＡＢＡ法を用いてビオチン化率を測定した。結果を表３に示す。

ＨＡＢＡはｐＨ７．０〜７．６の範囲でａｖｉｄｉｎと結合し、５００ｎｍ（ε＝３４，０００ｄｍ^３／ｍｏｌｃｍ）に吸収を持つ黄橙色のＨＡＢＡ−ａｖｉｄｉｎ集合体を形成する。ＨＡＢＡ−ａｖｉｄｉｎのアフィニティ（Ｋ_ｄ＝１０^−８Ｍ^−１）に比べてａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ間のアフィニティが強いため（Ｋ_ｄ＝１０^−１５Ｍ^−１）、ｂｉｏｔｉｎが存在するとａｖｉｄｉｎと結合していたＨＡＢＡがｂｉｏｔｉｎに置換され、５００ｎｍにおける吸光値が減少する。

この吸光値の変化は溶液中のｂｉｏｔｉｎ分子数に相関するため、この原理を利用してビオチン化率を算出する。テトラビオチン化基質であるＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４が修飾されている場合、Ｋ−ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１分子につき４分子のｂｉｏｔｉｎが修飾されるため、理論値はビオチン化率４．００となる。今回調製したＫ−ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎのビオチン化率を表３に示す。

この結果より、３種類のＫ−ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎに対し、ほぼ定量的なビオチン化反応を達成した。

次に、ビオチン修飾後のサンプルについて活性測定を行い、ビオチン修飾後の残存活性を測定した。今回、基質として可溶性セルロース基質であるＣＭＣと結晶性セルロース基質であるＡｖｉｃｅｌを用いて活性測定を行った。ビオチン修飾前の活性を１．００とした比活性を表４に示す。

僅かに活性の低下が見られたものの、十分な活性を維持しており、これはＭＴＧによるペプチドタグ選択的ビオチン化によるものであると考えられた。活性の低下については、修飾されたｂｉｏｔｉｎ基が基質取り込みを阻害している可能性が考えられた。

４．ＳＡ添加による酵素集合体の形成
ＳＥＣによる分析を行った結果を図４に示す。ｂ_４−ＣＤ_ＥＧ及びＳＡ単体では、溶出時間１５．６ｍＬ及び１６．０ｍＬの位置にピークが観察された。次に、ｂ_４−ＣＤ_ＥＧの濃度を一定にして、ＳＡを加えた場合、ｂ_４−ＣＤ_ＥＧのピーク強度が減少し、新たに溶出時間の早い高分子量側にブロードなピークが観察された。［ｍＳＡ］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１／８及び１／４においては、まず１３．１ｍＬ及び１４．０ｍＬにピークが観察されたが、検量線から分子量を算出した所、これらはそれぞれ分子量約１４０ｋＤａ及び９０ｋＤａに相当した。ｂ_４−ＣＤ_ＥＧ及びＳＡ４量体の分子量がそれぞれ約５０ｋＤａであることと、混合比から考えると、１３．１ｍＬ及び１４．０ｍＬのピークはそれぞれ、（ＣＤ_ＥＧ）−ＳＡ−（ＣＤ_ＥＧ）、（ＣＤ_ＥＧ）−ＳＡ集合体であることが推察された。更にＳＡを添加した［ｍＳＡ］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１／２の条件においては集合体の一部が排除体積で溶出されるほど大きな集合体（分子量＞１．３ＭＤａ）を形成し、系中のＳＡとｂｉｏｔｉｎの個数が等しくなる［ｍＳＡ］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１の条件においては、ＣＤ_ＥＧ由来のピークが完全に消失し、ほぼ全てが排除体積で溶出されるほどの大きな集合体となった。

こちらのサンプルについて原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いた直接観察を行った結果を図５に示す。ＳＡを添加する前、ｂ_４−ＣＤ_ＥＧのみの場合、直径１０−３０ｎｍ程度の島状の構造物が見られ、これはサンプル調製過程の乾燥操作時に、修飾したビオチン基の疎水性により凝集した結果と推察された。これに対し、ＳＡを添加した（ＣＤ_ＥＧ−ＳＡ）_ｎ集合体の場合、平均高さ５ｎｍ、長さ２００ｎｍ程度のヒモ状構造体の形成が見られた。これによりＳＡの４次構造に合わせた新規テトラビオチン化基質Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４の設計により、酵素集合体の構造制御が達成され、天然のセルロソームの構造を模した１次元状人工セルロソームの構築に成功した。

ｂ_４−ＥＧについてもＳＡの添加による集合体形成の検討を行った所、ｂ_４−ＣＤ_ＥＧと同様の巨大集合体を構築していることが明らかとなった。次にｂ_４−ＥＧについてｂ_４−ＣＢＭを１、４、又は９等量添加し、集合体形成を試みた。その結果を図６に示す。系中のタンパク質濃度が増加しても、ほぼ全てのＥＧおよびＣＢＭがａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ相互作用により集合体となることが明らかとなった。系中の全てのタンパク質を集合体化できるというのが本研究の強みであり、以上よりＣＢＭの添加によって集合体としての結晶性セルロース表面への結合力を増強した人工セルロソーム（ＥＧ／ＣＢＭ−ＳＡ）_ｎ集合体の構築に成功した。

５．人工セルロソームを用いた結晶性セルロース基質の糖化反応
最後に調製した（ＣＤ_ＥＧ−ＳＡ）_ｎ集合体を用いて糖化反応を行った。結果を図７に示す。反応開始４８時間後のＣＤ_ＥＧのみ遊離状態における比活性を１．０とする。その結果、遊離のｂ_４−ＣＤ_ＥＧと比較して、集合体を形成することによって糖化効率の向上が見られた。更に、ＳＡ添加量を［ｍＳＡ］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１／２及び１と増加させることで糖化効率は更に増大し、全てのｂ_４−ＣＤ_ＥＧが集合体を形成する条件のサンプルについて、最大で１．７倍の糖化効率の向上を得た。

一般的にセルラーゼの加水分解反応においては、ＣＢＭが重要な働きを示すことが知られており、ＣＢＭによる結晶性セルロース表面への吸着促進効果により、分解効率が向上する。そこで上記で使用したＣＤ_ＥＧをＥＧ（ＣＢＭ−ＣＤ）へと変更し、更に追加でＣＢＭを添加することで結合力を増強し、更なる糖化効率の向上を試みた。（ＥＧ／ＣＢＭ−ＳＡ）_ｎ集合体について糖化反応を行った結果を図８に示す。この結果、ｂ_４−ＣＤ_ＥＧと同様、ｂ_４−ＥＧについてもＳＡの添加による集合体形成により、１．４倍の増強効果を得た。ここで、ＣＢＭを添加して集合体の結合力を増強したところ、それに従い分解効率が増大し、最大で２．６倍の分解効率向上を達成した。これは人工セルソロームの形成により、不溶性基質への結合力が向上したこと、また触媒ドメインが局在化することにより可溶性オリゴ糖への分解が促進されたことなどが理由として推察された。

本発明の新規テトラビオチン化基質Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４を用いることで、ビオチン修飾された単量体型のセルラーゼをＳＡと混合するだけで簡便に集合体を形成することができ、系中のＳＡとビオチン基の濃度が等しい条件において、分子量１．３ＭＤａ以上、長さ２００ｎｍ程度の一次元状超巨大酵素集合体を形成することが出来た。更にこの人工セルロソームを用いて結晶性セルロースの分解反応を行うことで、最大２．６倍の分解効率の向上を達成した。

＜実施例２＞
（目的）
本検討では、新規テトラビオチン化基質であるＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４を用いることにより、単量体型酵素を簡便に集合体化できることを生かし、抗原抗体反応を用いた一般的な検出系であるＥＬＩＳＡへの応用を検討した。モデル酵素として単量体型酵素であるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ由来β-グルコシダーゼ（ＢＧＬ）を用い、バイオセンサー構築および評価を行った。比較検討として、特許文献１に記載された直鎖型ビオチン化基質ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧ、分岐型ビスビオチン化基質ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ、及び化学修飾によりビオチン化を行ったＢＧＬを用いた。

（実験操作）
１．Ｋ−ｔａｇ ＢＧＬの発現および精製
Ｋ−ｔａｇ ＢＧＬとして野生型ＢＧＬのＣ末端にＫ−ｔａｇ配列（−（ＧＧＧＳ）_２−ＭＲＨＫＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ）を遺伝子工学的に挿入し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）を発現ベクターとして用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株内に形質転換を行った。ＬＢ培地で培養、およびＩＰＴＧによる誘導発現を行った菌体について細胞破砕を行った。遠心分離後の上清についてＮｉ−ＮＴＡカラムを用いた精製を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した後、以降の検討に用いた。

２．Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ _４ を用いたＫ−ｔａｇ ＢＧＬのビオチン化
Ｋ−ｔａｇ ＢＧＬとＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４を用いて、ＭＴＧ架橋反応によるタンパク質のビオチン化を行った。酵素反応はＴＢＳ緩衝液中に、最終濃度が１０μＭ、２００μＭ、０．５Ｕ／ｍＬとなるように、Ｋ−ｔａｇ ＢＧＬ、Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４、ＭＴＧを加え、３７°Ｃで３時間静置させることで行った。反応後のサンプルについてＮｉ−ＮＴＡカラムを用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製により、過剰の未反応の基質とビオチン化タンパク質（ｂ_４−ＢＧＬ）を単離し反応を終了させた。ＰＤ−１０カラムを用いて１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した後、以降の検討に用いた。

同様に、特許文献１に記載された方法にてｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＫＧＬＱＧ及びｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧを入手し、これらを用いてＭＴＧ架橋反応によるビオチン修飾を行い、最終的にビオチン化タンパク質（ｂ−ＢＧＬ、ｂ_２−ＢＧＬ）を調製し、ＰＤ−１０カラムを用いて１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した後、以降の検討に用いた。

３．化学修飾を用いたＫ−ｔａｇ ＢＧＬおよび抗ＯＶＡ抗体のビオチン化
Ｋ−ｔａｇ ＢＧＬと化学修飾ビオチン化基質であるＮＨＳ−ＰＥＯ_４−ｂｉｏｔｉｎを用いて、化学修飾によるタンパク質のビオチン化を行た。反応は５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）中に、最終濃度が１０μＭ又は２００μＭとなるようにＫ−ｔａｇ ＢＧＬとＮＨＳ−ＰＥＯ_４−ｂｉｏｔｉｎ加え、それらを良く攪拌し、３７°Ｃで３時間静置させることで行った。反応後のサンプルについてＮｉ−ＮＴＡカラムを用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製により、過剰の未反応の基質とビオチン化タンパク質（ｃｈｅｍ−ＢＧＬ）を単離し反応を終了させた。ＰＤ−１０カラムを用いて１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した後、以降の検討に用いた。抗ＯＶＡ抗体についても同様の検討を行い、ビオチン修飾抗ＯＶＡ抗体を得た。

４．ＨＡＢＡ法によるビオチンラベル化率の算出
４−１．試薬の調製
実施例１に記載の方法と同様に調製した。

４−２．測定方法
実施例１に記載の方法と同様に行った。

５．ビオチン修飾ＢＧＬの酵素反応
酵素糖化反応は、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、最終濃度が１００ｎＭ、１０ｍＭとなるようにビオチン修飾ＢＧＬと基質である４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐ−ＮＰＧ）を加え、５０°Ｃで静置させることで行った。酵素反応の評価は、ＵＶ−ｖｉｓ分光高度計で４１０ｎｍの吸収を追跡する事で行った。

６．ＳＡ添加による集合体の形成
集合体の形成はＴＢＳ緩衝液中に、最終濃度が２μＭのビオチン化ＢＧＬ（ｂ−ＢＧＬ、ｂ_２−ＢＧＬ及びｂ_４−ＢＧＬ）と２、４、及び８μＭとなるようにＳＡを加えたサンプルについて、激しく攪拌した後３０分間室温で静置し、サイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて分画し、集合体の分子量を分析した。このとき、サンプル中のＳＡ単量体とビオチンの濃度比は［ｍＳＡ］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１である。ＳＥＣによる分析は２０ｍＭのＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにて２８０ｎｍの吸収を追跡することにより行った。

７．ＢＧＬ集合体を用いたＥＬＩＳＡによるＯＶＡ検出（直接法）
まず１０^０−１０^６ｎｇ／ｍＬとなるように調製した抗原であるＯＶＡを１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、４°Ｃで１２時間静置することで固相化を行った。２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで５回洗浄後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７°Ｃで２時間静置することでブロッキングを行った。２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで５回洗浄後、ビオチン化ａｎｔｉ−ＯＶＡマウス由来抗体の１０，０００倍希釈溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７°Ｃで２時間静置した。２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで５回洗浄後、１．０（ｂ_４−ＢＧＬ及びｃｈｅｍ−ＢＧＬ）、０．５（ｂ_２−ＢＧＬ）、及び０．２５μＭ（ｂ−ＢＧＬ）の各濃度のＳＡ溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、３７°Ｃで３０分静置した後、１．０μＭのビオチン化ＢＧＬ溶液をそれぞれ加え、３７°Ｃで３０分静置した。このとき、サンプル中のＳＡ単量体とビオチンの濃度比は［ｍＳＡ］／［ｂｉｏｔｉｎ］＝１である。

上記作成したプレートを２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳＴで５回洗浄後、ｐ−ＮＰＧを基質として用いた活性測定を行った。活性測定は、１０ｍＭのｐ−ＮＰＰを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の条件下、５０°Ｃで行い、ｐ−ＮＰに由来する４１０ｎｍの吸収を追跡することによって活性測定を行った。

（実験結果）
１．ビオチン修飾ＢＧＬの特性評価
ビオチン修飾ＢＧＬについて活性測定およびビオチン修飾数の算出を行った結果を以下に示す；ビオチン修飾ＢＧＬ（比活性，ビオチン修飾数）：ｂ_４−ＢＧＬ（０．９４±０．０３，３．８７±０．０９）、ｂ−ＢＧＬ（０．９７±０．０２，０．９７±０．０４）、ｂ_２−ＢＧＬ（１．０１±０．０３，１．９２±０．０８）、ｃｈｅｍ−ＢＧＬ（０．７５±０．０３，６．８７±０．５９）。この結果ＭＴＧを用いて、ＢＧＬのＫ−ｔａｇ特異的にビオチン修飾を行ったサンプルについては、ほぼ定量的かつ活性を維持したままでのビオチン修飾が達成された。これに対し、化学修飾を行ったサンプルは、ランダムな修飾による活性の低下が見られ、またビオチン修飾数の制御も困難であった。上記検討により、単量体型モデル酵素であるＢＧＬに対してビオチン修飾が確認されたため、以後の検討に用いた。

２．ＳＡの添加によるＢＧＬ集合体の形成
上記操作によりビオチン修飾が得られたため、次にＳＡと混合することによって、アビジン−ビオチン相互作用による集合体の形成を試みた。形成した集合体についてＳＥＣを用いて集合体の分子量を分析した結果を図９に示す。ＳＥＣにおいては大きな分子量を持つ集合体が早く溶出される。まずＫ−ｔａｇＢＧＬのみを流した所、溶出時間１５．８ｍＬ付近にＢＧＬ由来のピークが観察された。直鎖型ビオチン化基質を修飾したｂ−ＢＧＬについて集合体形成を試み、ＳＥＣにより分析すると、１２ｍＬ付近にピークが得られた。４量体を形成しているＳＡとｂ−ＢＧＬの組み合わせの場合、形成される集合体は４分子のＢＧＬがＳＡに結合した集合体ＢＧＬ_４−ＳＡ集合体と推察された。次に分岐型ビスビオチン化基質を修飾したｂ_２−ＢＧＬの集合体は溶出時間１４ｍＬにピークが観察され、形成される集合体としてはＢＧＬ１分子で２分子のビオチン基を持つことになるため、ＢＧＬ_２−ＳＡ集合体を形成していると考えられた。これに対し、４分岐型新規テトラビオチン化基質Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４を修飾したｂ_４−ＢＧＬ集合体を形成させた場合、用いたカラムの排除体積で溶出される程の超巨大酵素集合体を形成しており、分子量は１．３ＭＤａ以上と推定された。以上より、単量体型酵素に対してビオチン修飾を行い、集合体の形成を試みる場合には、テトラビオチン化基質を用いた場合においてのみ、超巨大酵素集合体の形成が可能となると言える。

３．ＢＧＬ集合体を用いたＯＶＡの検出
最後に調製したＢＧＬ集合体を用いて、バイオセンサーへの応用を試みた。抗原タンパク質としてはＯｖａｌｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）を選択し、ＯＶＡを固層化したプレートに対し、ビオチン修飾抗ＯＶＡ抗体、ＳＡ、ビオチン化ＢＧＬと順に添加した後、ＢＧＬの酵素反応によってＯＶＡの検出を行った。結果を図１０に示す。

その結果、まず化学修飾を行ったｃｈｅｍ−ＢＧＬについては、修飾による活性の低下から、検出感度が一番低く、シグナルの急激な減少が確認された。これに対し、テトラビオチン化基質を用いて調製したｂ_４−ＢＧＬ集合体を用いた場合において、酵素反応によるシグナル増強とＯＶＡ濃度１０ｎｇ／ｍＬまでの検出が可能であった。これはｂ−ＢＧＬやｂ_２−ＢＧＬの場合はＯＶＡ１分子に対し、ＢＧＬが１−３分子しか結合できないのに対し、ｂ_４−ＢＧＬの場合は、ＯＶＡ１分子に対し、複数の酵素からなるＢＧＬ集合体が結合することで、より多くのＢＧＬが検出酵素として働くことが出来るようになったためと推察された。

（結論）
テトラビオチン化基質を用いて調製した単量体型モデル酵素を用いることで、超巨大集合体の形成とそれを用いた高感度検出を達成した。

＜実施例３＞
実施例１にて作製したＱ−ｂｉｏｔｉｎ_４、すなわちｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−Ｋ）−ＫＧＬＱＧのＧＧＧにおける二番目のＧ（グリシン残基）に代えてＥ（グルタミン酸）としたビオチン化合物を作製した。具体的には化学式（４）にて示されるビオチン化合物であり、本明細書においてｂｉｓ（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＥＧ）−Ｋ）−ＫＧＬＱＧとも呼ぶ。

製造方法は、Ｑ−ｂｉｏｔｉｎ_４の製造方法と同様に、Ｆｍｏｃ固相合成法の手順に従って合成した。得られたビオチン化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳデータを図１１に示す。

図１１に示すように、化学式（４）に示すビオチン化合物が合成されたことが明らかとなった。

Claims (15)

1. 式（１）又は式（２）で表されるビオチン化合物：
   

   

   

   （式（１）及び（２）のＲ１〜Ｒ７は、同一又は異なってアミノ酸残基又はペプチド残基であり、該アミノ酸残基のカルボキシル基又はペプチド残基のカルボキシル末端のカルボキシル基は、式（１）又は式（２）のＲ１〜Ｒ７のそれぞれに隣接するアミノ基とペプチド結合を形成し、該アミノ酸残基のアミノ基又はペプチド残基のアミノ末端のアミノ基は、式（１）又は式（２）のＲ１〜Ｒ７のそれぞれに隣接するカルボニル基とペプチド結合を形成する。）。
2. Ｒ１〜Ｒ７に示されるアミノ酸残基が、同一又は異なってグリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、プロリン残基、及びセリン残基からなる群より選択される１種である、請求項１に記載のビオチン化合物。
3. Ｒ１〜Ｒ７に示されるペプチド残基が、グリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、プロリン残基、及びセリン残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のビオチン化合物
4. 式（３）又は式（４）で表されるビオチン化合物：
   

   

   
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のビオチン化合物を含む、タンパク質又はペプチドに対するビオチン標識化剤。
6. 前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を少なくとも一つ含む請求項５に記載のビオチン標識化剤。
7. 請求項５又は６に記載のビオチン標識化剤とトランスグルタミナーゼを含む、タンパク質又はペプチドのビオチン標識化キット。
8. トランスグルタミナーゼが微生物由来である、請求項７に記載のビオチン標識化キット。
9. 以下の工程１〜３を含む、ビオチン標識化タンパク質又はペプチドの製造方法：
   （１）請求項１〜４の何れか１項に記載のビオチン化合物とタンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合して接触させる工程（１）、
   （２）工程（１）にて得られる混合物を、前記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程（２）、及び
   （３）工程（２）にて得られる混合物から、ビオチン標識化タンパク質又はペプチドを回収する工程（３）。
10. 前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を少なくとも一つ含む請求項９に記載の製造方法。
11. トランスグルタミナーゼが微生物由来である、請求項８又は９に記載の製造方法。
12. 以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、タンパク質又はペプチドの集合体の製造方法：（Ａ）請求項１〜４の何れか１項に記載のビオチン化合物を用い、トランスグルタミナーゼの存在下でビオチン標識化されたタンパク質又はペプチドと、アビジン化合物とを混合して接触させる工程（Ａ）及び
    （Ｂ）工程（Ａ）にて得られる混合物から、タンパク質又はペプチドの集合体を回収する工程（Ｂ）。
13. 前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を少なくとも一つ含む請求項１２に記載の製造方法。
14. トランスグルタミナーゼが微生物由来である、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
15. アビジン化合物が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質、ブラダビジン、リザビジン、タマビジンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１２〜１４の何れか１項に記載の製造方法。

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