JP6411804B2 - 抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法に関する。特に、塗膜が形成された抗藻菌部材について、防カビ性能や防藻性能を評価する方法に関する。

住宅など建築物の外壁部に使用される外壁材の表面には、塗装が施されている。この塗装によって、外壁材は、風雨、光、熱などから住人を保護している。しかし、経年変化によって、外壁材の表面に変退色、チョーキング、汚れ、生物汚染などの劣化現象や不具合現象が生じることは避けられない。近年では、塗料の耐候性能力が大幅に向上してきている。そのため、変退色やチョーキングの不具合よりも、むしろカビや微細藻類などの微生物の増殖が問題となっている。これらの増殖によって、美観を損ねさせるだけでなく、外壁材の表面の塗膜が劣化してしまうからである。

また、外壁材の表面において病原性のカビが増殖した場合には、アレルギーや肺炎などの疾患の原因となる。一方、防カビ効果や防藻効果をもたらす薬剤を配合した防カビ塗料や防藻塗料は、カビや藻類だけでなく人体へも悪影響を及ぼしてしまう。そのため、外壁材の性能維持だけを考えて、防カビ塗料や防藻塗料の塗布量を増やすことには限界があった。加えて、塗膜中に含まれる薬剤の効果は、時間とともに低下してしまうという問題もあった。

これに対し、たとえば外壁材の表面に塗装された塗膜の防カビ性能を評価する方法としては、「かび抵抗性試験方法」（ＪＩＳ Ｚ ２９１１−２０００）およびそれに類似する方法（特許文献１）が知られていた。

特開２００８−２２９４９８号公報

しかしながら、いずれの方法においても、塗膜表面にカビ胞子の懸濁液を噴霧して所定時間培養し、塗膜表面に形成されるカビマットの占有面積を３段階で評価していた。そのため、塗膜の撥水性による植菌量の均一性や、面積算出の精度において、さらに改善の余地があった。

本発明はこうした状況に鑑みてなされており、その目的とするところは、簡便かつ正確に抗藻菌部材の抗藻菌性を定量的に評価することにある。

上記課題を解決するために、本発明におけるある態様の抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法は、評価対象となる抗藻菌部材の表面の少なくとも一部に対して、微生物が植菌される足場部材を少なくとも１つ配置する構築ステップと、足場部材に植菌された微生物を培養させる培養ステップと、微生物の生育の程度を測定する測定ステップと、を含む。

この態様によると、簡便かつ正確に抗藻菌部材の抗藻菌性を評価することができる。また、小型の装置を用いて定性的な評価を行うことができる。加えて、再現性に優れた客観的な評価を行うことができる。

抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法において、抗藻菌部材は、塗料によって表面に塗膜が形成されていてもよい。この態様によると、評価試験を行う必要性が高いが従来の方法では困難であった抗藻菌部材について、正確に評価を行うことができる。

抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法において、塗料は、水溶性の塗料であってもよい。この態様によると、配合成分の漏出という問題が起きるため抗藻菌性を評価する必要性が高い抗藻菌部材に対して、簡便かつ正確に抗藻菌部材の抗藻菌性を評価することができる。

表面に塗布される塗料の濃度が異なる複数の抗藻菌部材を用いてそれぞれの抗藻菌部材について測定ステップにより微生物の生育の程度を測定することによって、塗料の最小発育阻止濃度を決定するステップをさらに含んでもよい。この態様によると、抗藻菌部材の抗藻菌性を定量的に評価することができる。

抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法において、足場部材は、ペーパーディスクであってもよい。この態様によると、抗藻菌性の評価を簡便かつ省スペースにて行うことができる。

なお、上述した各要素を適宜組み合わせたものも、本件特許出願によって特許による保護を求める発明の範囲に含まれうる。

本発明によれば、簡便かつ正確に抗藻菌部材の抗藻菌性を評価することができる。

実施の形態に係る抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、培養前の状態を示す平面図である。図１（Ｂ）は、培養後の状態を示す平面図である。 予備試験１における実験方法および結果を示す図である。 予備試験２における実験の手順を示す図である。 予備試験２におけるＣ．ｖｕｌａｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０に関する試験結果を示す図である。 予備試験３におけるＣ．ｅｃｊｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９に関する試験結果を示す図である。 予備試験４におけるＫ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５に関する試験結果を示す図である。 予備試験５におけるＵ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＮＩＥＳ３２９に関する毒性試験の結果を示す図である。 予備試験６におけるＯ．ｌａｅｔｅｖｉｒｅｎｓ ＮＩＥＳ３１に関する毒性試験の結果を示す図である。 予備試験におけるＮｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ ＮＩＥＳ２４に関する毒性試験の結果を示す図である。 実施例１の実験手順を示す図である。 図１０の実験手順に従って得られた結果を示す図である。 実施例２の実験手順を示す図である。 図１２の実験手順に従って得られた結果を示す図である。

本実施の形態に係る抗藻菌部材２０の抗藻菌性の評価方法は、評価対象となる抗藻菌部材２０の表面２４の少なくとも一部に対して、微生物Ｐが植菌される足場部材３０を少なくとも１つ配置する構築ステップと、足場部材３０に植菌された微生物Ｐを培養させる培養ステップと、微生物Ｐの生育の程度を測定する測定ステップと、を含む。

図１は、実施の形態に係る抗藻菌部材２０の抗藻菌性の評価方法を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、培養前の状態を示す平面図である。図１（Ｂ）は、培養後の状態を示す平面図である。以下、本実施の形態に係る抗藻菌部材２０の抗藻菌性の評価方法に含まれる３つのステップを、図１を用いて順に説明する。

（１）構築ステップ
本ステップでは、評価対象となる抗藻菌部材２０の表面２４の少なくとも一部に対して、微生物Ｐが植菌される足場部材３０を少なくとも１つ配置する。図１（Ａ）には、本ステップ終了後の各部材の配置状態が示されている。

容器１６は、底面１０に静置した状態にて抗藻菌部材２０および足場部材３０を収容する。容器１６は、たとえば微生物を培養するための円形状のシャーレである。

抗藻菌部材２０は、抗藻菌性が付与された抗藻菌性の評価対象となる部材である。本実施の形態では、抗藻菌部材２０は板状のポリスチレン板等のプラスチック板、スレート板等の無機材、ステンレス板等の金属板などである。抗藻菌部材２０は、塗料によって表面に塗膜が形成されていることが好ましい。本実施の形態では、抗藻菌部材２０の抗藻菌性は、界面活性剤を含む塗料または抗カビ剤が所定の濃度にて表面に塗布されて塗膜が形成されることによる。塗料は、エマルション系塗料（水性塗料）として塗布されることが好ましい。このような塗料が使用された抗藻菌部材２０では、配合成分の漏出という問題が起きるため、抗藻菌性の評価をする必要性が高いためである。また、足場部材３０を用いた抗藻菌性の評価を行いやすいためである。しかし、抗藻菌部材２０の抗藻菌性の付与は、塗料の塗布には限られない。たとえば抗藻菌部材２０は、銀などの抗藻菌性を有する成分が含有されたプラスチックまたは繊維材料により形成されてもよい。

足場部材３０は、微生物Ｐが植菌される微生物Ｐが生育する足場となる部材である。本実施の形態では、３つの足場部材３０が使用されている。足場部材３０は、ろ紙から形成されたペーパーディスクであることが好ましい。これにより、抗藻菌性の評価を簡便かつ省スペースにて行うことができる。

本ステップでは、容器１６の底面１０に抗藻菌部材２０が配置される。その上に足場部材３０が配置される。足場部材３０には、あらかじめ微生物Ｐが植菌されていてもよいし、抗藻菌部材２０の上に配置されてから微生物Ｐが植菌されてもよい。

微生物Ｐは、抗藻菌部材２０の抗藻菌性を評価するために適した生物である。微生物Ｐとして、たとえば藻類であるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｅｃｈｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｏｒｍｉｄｉｕｍ ｆｌａｃｃｉｄｕｍ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｌａｅｔｅｖｉｒｅｎｓ、Ｎｏｓｔｏｃｃｏｍｍｕｎｅ、Ｕｌｏｔｈｒｉｘ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの１つ以上を使用することができる。また、カビとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍなどを使用することができる。微生物Ｐは、足場部材３０の中心付近に植菌される。これはたとえば滅菌された爪楊枝を用いて行われる。なお、微生物Ｐとして藻類に代えて、カビを含む他の微生物を用いて抗藻菌性を評価してもよい。

（２）培養ステップ
本ステップでは、図１（Ａ）に示した状態にて足場部材３０に植菌された微生物Ｐを培養させる。培養条件は、たとえば２５℃，１５００±１００Ｌｕｘ（１２Ｌ：１２Ｄ）にて１週間の静置培養である。本ステップ終了後に微生物Ｐが生育した場合には、図１（Ｂ）に示すように足場部材３０が変色する。また、足場部材３０の周囲には阻止円３２（ハロー）が形成されることもある。

本ステップでは、培養液を定期的に交換することによって、足場部材３０を繰り返し雨水に晒される外壁に近づけた条件に置いて培養を行ってもよい。この場合に、所定時間のサイクルにて水洗／乾燥を間欠的に繰り返す実験系を用いて培養することがより好ましい。たとえば、足場部材３０を培養液中に１時間浸漬した後、２３時間乾燥させるサイクルを約２週間繰り返してもよい。

（３）測定ステップ
本ステップでは、図１（Ｂ）に示した状態において、微生物Ｐの生育の程度が測定される。

図１に示すように、本実施の形態では、３つの足場部材３０が使用されている。この場合、３つの足場部材３０に対してそれぞれ異なる微生物Ｐを植菌することによって、異なる微生物Ｐに対する評価を並行して行うことができる。または、たとえば３つの足場部材３０に同じ微生物Ｐを植菌することもできる。この場合には、たとえば２つの足場部材３０の周囲に阻止円３２（ハロー）が形成された場合には増殖率は約３３．３％、１つの足場部材３０の周囲にしか形成されなかった場合には増殖率は約６６．７％と算出される（定性的評価）。または、公知の方法を用いて足場部材３０における微生物Ｐの密度を計測することによって、定量的評価を行ってもよい。

本ステップに加えて、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するステップをさらに含んでもよい。従来技術における最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定では、ペーパーディスクに含浸させた薬剤が寒天平板にしみ出すことを利用して抗菌活性を測定していた。一方、本実施の形態における最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するステップは、足場部材３０に植えた微生物に対して、塗膜から足場部材３０に拡散してきた薬剤の抗菌活性を評価する点を特徴の１つとする。つまり、本実施の形態における最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するステップは、薬剤の移動方向と供試微生物の存在箇所が逆である点で、従来技術におけるステップとは明確に異なる。

このステップでは、表面に塗布される塗料（薬剤）の濃度が異なる複数の抗藻菌部材２０を用いて、それぞれの抗藻菌部材２０について測定ステップにより微生物Ｐの生育の程度を測定することによって、塗料の最小発育阻止濃度を決定する。これらの濃度は、たとえば約０．０１〜約１０．０％（ｖ／ｖ）または約０．００２〜約２．０％（ｖ／ｖ）程度の希釈系列によってもよい。この際には、実験の簡便性および省スペースを考慮して、マイクロプレートを用いることが好ましい。本ステップは、他のステップに先立って実行されてもよいし、他のステップより後に実行されてもよい。または、塗料（薬剤）の希釈系列を作成して（１）構築ステップおよび（２）培養ステップを行うことによって、他のステップに含められてもよい。実験の労力を減らすために、本ステップは他のステップに先立って実行されることが好ましい。この場合には、本ステップには足場部材３０が使用されなくてもよい。

以上、本実施の形態によると、簡便かつ正確に抗藻菌部材の抗藻菌性を評価することができる。また、小型の装置を用いて定性的な評価を行うことができる。加えて、再現性に優れた客観的な評価を行うことができる。また、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するステップを用いることによって、抗藻菌部材の抗藻菌性を定量的に評価することができる。

（有用性）
建造物などの外壁表面におけるカビや微細藻類の増殖は、単にその外観を損ねるのみならず建造物の強度劣化や感染症の発生源といった、より深刻なトラブルを引き起こす危険性がある。外壁の保護および意匠性を目的として建造物の外壁に塗装が施される場合が多い。その塗料中には、カビや微細藻類の増殖を抑えるような抗カビ剤や抗藻菌剤を配合された防カビ性または防藻性塗料が、実社会では広く用いられている。

しかし、実際の建造物の外壁は強い風雨に曝されており、塗膜も間欠的に水と接触している。この風雨による影響は、特にエマルション系塗料（水性塗料）において、配合成分の漏出といった問題として現れる。配合成分の漏出は、一面では抗カビ剤や抗藻菌剤の徐放によるカビや微細藻類の増殖抑止といった効果を発揮する。しかし、長期に渡る実曝において配合成分は徐々に消失してくる。そのため、結果としてカビや微細藻類が塗膜表面に増殖する。

本出願では、エマルション系と塗料表面に設置した足場部材３０であるペーパーディスク表面では微細藻類が増殖できないこと、その原因が、塗料中に配合された水性もしくは両親媒性の界面活性剤に起因することを見出した。界面活性剤の微細藻類に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、後述する図２で示す寒天平板希釈法によって算出した。その結果、特に１００％非反応性ノニオン界面活性剤が強い防藻活性を発揮することが明らかとなった。さらに、抗藻菌部材２０の連続的および間欠的な水浸漬試験を実施した結果、水浸漬の進行によってアクリルエマルション系塗膜の防藻活性が消失することも見出した。この事実は、水浸漬によって塗膜中の毒性界面活性剤が漏出および消失することを含意する。

以上より、塗料中に存在する防藻活性物質（後述する実施例で確認した毒性界面活性剤に限らず、防カビ活性物質や防藻活性物質をも含む）は、暴露初期においては防カビ活性や防藻活性を発揮する。しかし、長期にわたる風雨によって塗膜中の防カビ活性物質や防藻活性物質が漏出や消失を来たす。その結果、カビや微細藻類の塗膜表面での増殖を招くものと考えられる。このような抗藻菌部材２０の特性を評価する方法として、本出願における防藻活性判定のための新規なアッセイ系（塗膜上ペーパーディスク法）は、塗膜中に存在する防藻あるいは防カビ活性物質の効果（力価）判定法として優れた手法であると考えられる。

（予備試験１：エマルジョン系塗料添加剤の微細藻類に対する毒性の確認）
本方法では、足場部材であるペーパーディスクには微細藻類を増殖させるために液体培地を含浸させた。この場合、ペーパーディスクに接している塗膜表面は常に水に接触している。したがって、塗膜中に含まれる水溶性の成分はペーパーディスク中の水相に抽出されて拡散することが想定された。エポキシ樹脂系および溶剤ウレタン系塗料が用いられる場合、両者はともに溶剤型であるため、水溶性の成分は配合されていないか、配合されていてもごく少量であると思われる。一方、アクリルエマルション系塗膜中には種々の水溶性または両親媒性の界面活性剤が相当な量配合されていると思われた。したがって、上記のアクリルエマルション型塗膜とモルタル板／エポキシ樹脂系塗膜／溶剤ウレタン型塗膜との増殖性の差異については、エマルション樹脂中に配合された水溶性もしくは両親媒性の添加剤、具体的には界面活性剤が寄与している可能性が高い。そこで、アクリルエマルション系塗料に配合されている界面活性剤および防カビ剤を用いて、それらの微細藻類Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０に対する毒性確認試験を、ペーパーディスクを用いて実施した。

図２は、予備試験１における実験方法および結果を示す図である。本予備試験では、アクリルエマルション系塗料中に配合されている添加剤など、微細藻類に対して毒性を発現する可能性のある界面活性剤７種類（２５％反応性アニオン、７０％非反応性ノニオン、キョーワノールＭ、９０％反応性アニオン、１００％非反応性ノニオン、１５％非反応性アニオン、５０％非反応性ノニオン）と防カビ剤の防藻活性を調べた。

Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０の細胞懸濁液（１×１０^７細胞／ｍｌ）１００μｌをＣ寒天平板（９０ｍｍ径）表面に植え、余分な水分を自然乾燥させた。その後、各界面活性剤のチャージ量が１５００、７５０、３７５、１８８μｇ／ディスクになるように、界面活性剤水溶液を８ｍｍφのペーパーディスク（抗生物質力価判定用、厚手）にチャージした。防カビ剤は界面活性剤に比べて水溶性が低いため、その濃度は界面活性剤の濃度の１／５とした。

界面活性剤または防カビ剤を上述した量チャージしたペーパーディスクを、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０を均一に塗布したＣ寒天培地平面に８枚設置し、培養温度２４℃、光照度１５００Ｌｕｘ、照明サイクル１２Ｌ：１２Ｄの条件下にて１週間静置培養した（図２：寒天平板希釈法）。培養終了後、ペーパーディスクの周囲に形成される阻止円３２（ハロー）の有無とサイズにより、界面活性剤と抗カビ剤の抗藻菌活性を判定した。

図２において、阻止円３２（ハロー）が周囲に形成されているペーパーディスクを矢印で示す。界面活性剤については、１００％非反応性のノニオン性界面活性剤（Ｅ）が最も強い防藻活性を示した。そのＭＩＣは３７５μｇ／ディスクであった。５０％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｇ）も弱い防藻活性を示した。そのＭＩＣは１５００μｇ／ディスクであった。防カビ剤は１５０μｇ／ディスクのＭＩＣを示した。そのため、防カビ剤は防藻活性も発揮し得ることが確認された。

（予備試験２：Ｃ．ｖｕｌａｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０におけるエマルジョン系塗料添加剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定）
アクリルエマルション系塗料中に配合されている添加剤など、微細藻類に対して毒性を発現する可能性のある界面活性剤７種類と防カビ剤を対象に、Ｃ．ｖｕｌａｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０に対する増殖阻害を、マルチウエルプレートに調整した寒天平板を用いた寒天平板希釈法により調べた。ペーパーディスクを用いない寒天平板希釈法によって、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）をより詳細かつ広範に判定した。

図３は、予備試験２における実験の手順を示す図である。界面活性剤としては、予備試験１と同様に、２５％反応性アニオン、７０％非反応性ノニオン、キョーワノールＭ、９０％反応性アニオン、１００％非反応性ノニオン、１５％非反応性アニオン、５０％非反応性ノニオンの７種を用いた。これらの界面活性剤については、１０％（ｖ／ｖ）水溶液を出発とする２倍希釈系列で段階的に希釈した水溶液を、Ｃ培地あるいはＭＤＭ培地中で濃度が０．１〜０．００００２％（ｖ／ｖ）となるように混和した。これらを２４穴マルチウエルプレートに注入し、図３に示すような界面活性剤入り寒天平板の希釈系列を調整した。防カビ剤は界面活性剤と比べて水溶性が低かったため、界面活性剤の希釈系列の１／５の濃度系列とした。調整した界面活性剤あるいは防カビ剤希釈系列寒天平板の中央に、ＣあるいはＭＤＭ寒天平板上で増殖させた供試微細藻類を、爪楊枝を用いて少量植え、培養温度２４℃、光照度１５００±１００Ｌｕｘ、照明サイクル１２Ｌ：１２Ｄの条件下で１週間静置培養した。培養終了後、寒天平板上における供試微細藻類の増殖の有無を目視して、各界面活性剤並びに抗カビ剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を判定した。

図４は、予備試験２におけるＣ．ｖｕｌａｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０に関する試験結果を示す図である。キョーワノールＭ（Ｃ）、１００％非反応性ノニオン系（Ｅ）、１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）で防藻活性が認められた。各界面活性剤のＭＩＣ（％，ｖ／ｖ）は、それぞれ０．０５％（Ｃ）、０．００６３％（Ｅ）、０．０５〜０．１％（Ｆ）を示した。防カビ剤のＭＩＣは０．０１〜０．００５％となった。予備試験１に示したペーパーディスク法の結果と比較すると、１００％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｅ）が最も強い防藻活性を示す点では一致した。一方、ペーパーディスク法で防藻活性を示した５０％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｇ）は寒天平板希釈法では有意な防藻活性を示さなかった。代わりに、ペーパーディスク法では防藻活性が認められなかったキョーワノールＭ（Ｃ）と１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）で弱いながらも防藻活性が認められた。このようなアッセイ系による活性の違いは、水相中での拡散性、すなわち、寒天培地中での拡散性と寒天平板からペーパーディスク中の水相への拡散性の違いに起因すると思われた。１００％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｅ）は防カビ剤に匹敵する防藻活性を持つことが確認された。

（予備試験３：Ｃ．ｅｃｊｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９におけるエマルジョン系塗料添加剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定）
微細藻類としてＣ．ｅｃｊｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９を用いた以外は予備試験２と同様にして実験を行った。

図５は、予備試験３におけるＣ．ｅｃｊｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９に関する試験結果を示す図である。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０で防藻活性が認められたキョーワノールＭ（Ｃ）、１００％非反応性ノニオン系（Ｅ）、１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）に加えて、ペーパーディスク法で防藻活性が認められた５０％非反応性ノニオン（Ｇ）でも防藻活性が認められた。各界面活性剤のＭＩＣは、それぞれ０．０２５％（Ｃ）、０．００６３〜０．０００８％（Ｅ）、０．０２５％（Ｆ）、０．０５％（Ｇ）とであった。Ｃ．ｅｃｊｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９に対する防カビ剤のＭＩＣは０．０００６２％であった。そのため、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０よりも防カビ剤に対する感受性が高いことが示唆された。

（予備試験４：Ｋ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５におけるエマルジョン系塗料添加剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定）
微細藻類としてＫ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５を用いた以外は予備試験２と同様にして実験を行った。

図６は、予備試験４におけるＫ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５に関する試験結果を示す図である。界面活性剤に対する感受性はＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０に類似した。つまり、キョーワノールＭ（Ｃ）、１００％非反応性ノニオン系（Ｅ）、１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）に対して感受性を示した。Ｃ．ｅｃｈｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９に対して毒性を発揮した５０％非反応性ノニオン（Ｇ）は、本株の対しては毒性を発現しなかった。各界面活性剤に対するＭＩＣは、それぞれ０．０２５％（Ｃ）、０．００６３〜０．０００８％（Ｅ）、０．０２５％（Ｆ）、０．０５％（Ｇ）と判定された。Ｃ．ｅｃｊｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９に対する防カビ剤のＭＩＣは０．０００６２％であって、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２２４９よりも抗カビ剤に対する感受性が高いことが示唆された。

（予備試験５：Ｕ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＮＩＥＳ３２９におけるエマルジョン系塗料添加剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定）
微細藻類としてＵ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＮＩＥＳ３２９を用いた以外は予備試験２と同様にして実験を行った。

図７は、予備試験５におけるＵ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＮＩＥＳ３２９に関する毒性試験の結果を示す図である。本株は、１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）を除く全供試界面活性剤および防カビ剤に対して強い抵抗性を示した。１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）のみが防藻活性を示した。そのＭＩＣは０．０５％であった。

（予備試験６：Ｏ．ｌａｅｔｅｖｉｒｅｎｓ ＮＩＥＳ３１におけるエマルジョン系塗料添加剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定）
微細藻類としてＯ．ｌａｅｔｅｖｉｒｅｎｓ ＮＩＥＳ３１を用いた以外は予備試験２と同様にして実験を行った。

図８は、予備試験６におけるＯ．ｌａｅｔｅｖｉｒｅｎｓ ＮＩＥＳ３１に関する毒性試験の結果を示す図である。本株も、多くの界面活性剤並びに防カビ剤に対して強い耐性を示した。１００％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｅ）のみが防藻活性を示した。そのＭＩＣは０．００３１％であった。

（予備試験７：Ｎｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ ＮＩＥＳ２４におけるエマルジョン系塗料添加剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定）
微細藻類としてＮｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ ＮＩＥＳ２４を用いた以外は予備試験２と同様にして実験を行った。

図９は、予備試験７におけるＮｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ ＮＩＥＳ２４に関する毒性試験の結果を示す図である。本株も、多くの界面活性剤並びに防カビ剤に対して強い耐性を示した。１００％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｅ）と１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）には弱いながらも感受性を示した。両界面活性剤に対するＭＩＳは、それぞれ０．０１２５〜０．００６３％（Ｅ）と０．０５％（Ｆ）であった。後者は培養２週間でその防藻活性が消失した。

（予備試験２〜７のまとめ）
寒天平板希釈法（図２参照）を利用して、６種の微細藻類に対する７種の界面活性剤と１種の抗カビ剤の毒性の程度を調べた。その結果を表１にまとめる。

供試界面活性剤の中では１００％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｆ）が最も高い防藻活性を有しており、１５％非反応性アニオン系界面活性剤（Ｆ）と５０％非反応性ノニオン系界面活性剤（Ｇ）に弱いながらも防藻活性が確認された。しかし、Ｕｌｏｔｈｒｉｘ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＮＩＥＳ３２９やＯｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｌａｅｔｅｖｉｒｅｎｓ ＮＩＥＳ３１、Ｎｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ ＮＩＥＳ２４はこれら３種の防藻性界面活性剤に対する感受性が低く、微細藻類の属種あるいは株と界面活性剤種で防藻活性の発現が大きく異なることが見出された。

（実施例１：塗料添加剤の水洗除去効果と防藻活性アッセイ系の構築）
エマルション系塗料中に配合されている界面活性剤の中には微細藻類に対して増殖阻害作用を示すものが複数種含まれている。さらには、表１に示したように、アクリルエマルション系塗膜表面に設置したペーパーディスク上に植えた微細藻類の増殖性が、モルタル板、エポキシ樹脂クリア系、溶剤ウレタン系塗膜表面に設置したペーパーディスク上に比べて、著しい増殖阻害を受けることが確認されている。したがって、モルタル板やエポキシ樹脂クリア系、溶剤ウレタン系塗膜中には存在しない水溶性もしくは両親媒性の毒性界面活性剤が塗膜より水によって漏出し、これが微細藻類に対して増殖阻害を引き起こしていると推論される。この仮定は、防カビ・抗藻菌性能を謳っている実際のエマルション系塗膜の防カビ・抗藻菌塗膜でさえも、長期に渡る実曝試験あるいは実際の商品において、その防カビ・抗藻菌性能が低下してくるという事実に対し、整合的なものである。すなわち、塗膜中に配合された防カビ・抗藻菌剤、あるいは本研究で確認された防藻活性を示す界面活性剤が、長期に渡る風雨の影響で、塗膜中から徐々に漏出および消失してしまい、その結果、カビや微細藻類が塗膜表面で増殖してくると考えることができる。

以上の仮説を検証するために、抗藻菌部材の水洗に伴って防藻活性の低下が生じるか否かを検討した。アクリルエマルション系塗膜と溶剤ウレタン系塗膜について、繰り返し水洗による添加剤の除去性を調べた。

図１０は、実施例１の実験手順を示す図である。両塗膜とも、厚さ３ｍｍのスレート板上に塗装され、２０×２０ｍｍのサイズの塗板に裁断した。１００ｍｌ用のポリプロピレン（ＰＰ）製ビーカーに逆浸透膜濾過水（ＲＯ水）を１００ｍｌ入れ、これに上記の塗板を１枚づつ投入した。貯蔵は冷蔵庫内で静置条件にて行い、３日毎にＲＯ水全量の交換を繰り返した。合計１２回、４週間に渡る繰り返し浸漬の後に塗板を回収し、余分な水分を風乾させた後、３５ｍｍφのディスポーザブルシャーレに設置した。８ｍｍφのペーパーディスクをこれらの塗板中央に設置し、１．０×１０^７細胞／ｍｌのＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０の懸濁液を５０μｌチャージした。ペーパーディスクの乾燥を防ぐため、２日毎にＣ培地を５０μｌ追加し、培養温度２４℃、光照度１５００Ｌｕｘ、照明サイクル１２Ｌ：１２Ｄの条件下で１０日間静置培養した。

図１１は、図１０の実験手順に従って得られた結果を示す図である。ペーパーディスク中にはＣ培地が含浸しているため、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０は光照射下で旺盛に増殖でき、培養３日目にはブランク（塗板なし）でペーパーディスクは緑色を呈した。また、２〜４週間にわたって水洗を繰り返した塗板についても培養３日目で早くもＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０の増殖がペーパーディスク上で確認された。一方、水洗１週間の塗板表面に設置したペーパーディスクについては、培養３日目でのＣ．ｖｕｌａｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０の増殖は認められず、培養を１０日間に延長してもその増殖は確認できなかった。このことより、１週間程度の水洗（ＲＯ水で１００ｍｌ×２回）程度の水洗では塗膜中の毒性界面活性剤は十分には漏出されないが、２週間（ＲＯ水で１００ｍｌ×６回）以上水洗を繰り返すことによって毒性界面活性剤は塗膜中から漏出・除去され、結果としてＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０が増殖できたものと考えられる。

（実施例２：塗料添加剤の水洗除去効果と防藻活性アッセイ系の構築）
実際の建造物外壁の塗膜は、橋梁等の水圏に連続接触している場合を除き、自然環境において連続的に水に接触しているわけではない。家屋に代表される建造物の外壁は、間欠的に風雨にさらされ、かつ、乾燥するサイクルにある。したがって、実塗膜の水洗のモデルとしては、実施例１で採用した実験系よりも、水洗／乾燥を間欠的に繰り返す実験系を採用する方がより好ましいと考えられた。そこで、本実施例では、ＲＯ水への浸漬を１時間、乾燥を２３時間で２週間繰り返す実験系を用いた。

図１２は、実施例２の実験手順を示す図である。アクリルエマルション系塗膜と溶剤ウレタン系塗膜について、繰り返し水洗／乾燥（浸漬１時間／乾燥２３時間）による添加剤の除去性を調べた。塗板サンプルは実施例１と同じとした。一方、供試株はＣ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０以外の２株、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｅｃｈｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９、Ｋｌｅｂｓｏｍｉｄｉｕｍ ｆｌａｃｃｈｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５を加えた計３株とした。１００ｍｌ容のポリプロピレン（ＰＰ）製ビーカーに逆浸透膜濾過水（ＲＯ水）を１００ｍｌ入れ、これに上記の塗板を１枚づつ投入した。浸漬１時間後に塗板サンプルを引き上げ、冷蔵庫内で２３時間保管した。翌日、新鮮なＲＯ水１００ｍｌに再び浸漬した後塗板サンプル板を引き上げ、冷蔵庫内で２３時間保管した。この操作を２週間繰り返した。繰り返し浸漬／乾燥操作後に塗板を回収し、余分な水分を風乾させた後、３５ｍｍφのディスポーザブルシャーレに設置した。８ｍｍφのペーパーディスクを図１２に示すように配置し、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０、Ｃ．ｅｃｈｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９、Ｋ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５の細胞懸濁液５０ｍｌをそれぞれチャージした。ペーパーディスクの乾燥を防ぐため、２日毎にＣ培地を５０μｌ追加し、培養温度２４℃、光照度１５００Ｌｕｘ、照明サイクル１２Ｌ：１２Ｄの条件下で１０日間静置培養した。

図１３は、図１２の実験手順に従って得られた結果を示す図である。Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０は、非水洗塗板上に設置したペーパーディスク上では２週間培養しても増殖できなかったが、水洗塗板上のペーパーディスク上では培養２週間で増殖が認められた。本実験系ではＲＯ水の交換回数ならびに使用量は実施例１の実験系と同じく、塗板１枚に対してそれぞれ６回、６００ｍｌであったが、浸漬時間は延べ６時間と短く、毒性界面活性剤の漏出・除去が実施例１の系よりも低かったことが推測される。そのために、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０の増殖速度が低下したものと考えられた。非水洗ウレタン系塗板に関しては、Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ ＮＩＥＳ２１７０のペーパーディスク上での増殖は１週間培養では低かったが、２週間培養では旺盛な増殖性が確認された（図１６）。

一方、Ｃ．ｅｃｈｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９とＫ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５は、水洗、非水洗に関わらず、アクリルエマルション塗膜上に設置したペーパーディスク上で増殖できなかった。アクリルエマルション系塗料には、表１に示した２５％反応性アニオン（Ａ）、７０％非反応性ノニオン（Ｂ）、キョーワノールＭ（Ｃ）の３種の界面活性剤が配合されている。予備試験２〜７で検討した寒天平板希釈法による界面活性剤のＭＩＣの判定結果（表１）より、これら３種の界面活性剤の毒性は低く、それぞれ単独では、上記３種の微細藻類の増殖を抑えることはできないものと考えられる。しかしながら、塗板中にはこれら３種の界面活性剤が混在している。このことより、これら３種の界面活性剤の相乗効果によって、Ｃ．ｅｃｈｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９とＫ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５に対して防藻効果が発揮されたものと考えられる。なお、溶剤ウレタン系塗膜に関しては、Ｃ．ｅｃｈｉｎｏｚｙｇｏｔｕｍ ＮＩＥＳ２２４９は培養１週間目、Ｋ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ ＮＩＥＳ２２８５は培養２週間目で旺盛な増殖が確認された（図１３）。

以上、本発明を上述の実施の形態を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態に限定されるものではなく、実施の形態の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれうる。

２０ 抗藻菌部材、 ２４ 表面、 ３０ 足場部材、Ｐ 微生物

Claims (3)

1. 評価対象となる抗藻菌部材の表面の少なくとも一部に対して、微生物が植菌される足場部材を少なくとも１つ配置する構築ステップと、
   前記足場部材に植菌された前記微生物を培養させる培養ステップと、
   前記微生物の生育の程度を測定する測定ステップと、を含み、
   前記微生物はカビまたは藻類であり、
   前記足場部材は、ペーパーディスクであり、
   前記抗藻菌部材は、塗料によって表面に塗膜が形成されており、
   前記微生物の成育の程度の測定は、前記足場部材上で増殖したカビまたは藻類を観察することによって行われることを特徴とする抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法。
2. 前記塗料は、水溶性の塗料であることを特徴とする請求項１に記載の抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法。
3. 表面に塗布される塗料の濃度が異なる複数の前記抗藻菌部材を用いてそれぞれの前記抗藻菌部材について前記測定ステップにより微生物の生育の程度を測定することによって、塗料の最小発育阻止濃度を決定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の抗藻菌部材の抗藻菌性の評価方法。