JP6396532B2 - ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズム(paradigm) - Google Patents
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Description
本出願は、2011年10月26日に出願された「PATHWAY RECOGNITION ALGORITHM USING DATA INTEGRATION ON GENOMIC MODELS(PARADIGM)」と題される米国仮特許出願第13/317,769号明細書に関連するとともにその優先権を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
(001)本発明は、個体又は対象における生物学的パスウェイの構成要素を同定し、その個体又は対象が臨床レジメン又は治療に対する候補かどうかを決定する方法に関する。本発明はまた、対象が癌、自己免疫疾患、細胞周期障害、又は他の障害に罹りやすいかどうかを診断するために該方法を用いることにも関する。
(0020)本発明者らは、複数のパスウェイ要素(典型的には、1つ以上のパスウェイ)の複数の属性の統合を可能とするパスウェイ解析の様々なシステム及び方法を発見した。少なくとも1つのパスウェイ要素は先験的に既知の属性を有し、少なくとも別のパスウェイ要素は仮の属性を有し、これらのパスウェイ要素を相互相関させ、かつ少なくとも1つのパスウェイへの特定の影響レベルを割り当てることにより、確率的パスウェイモデル(PPM)を構築する。次に、患者試料の複数の要素についての計測属性をPPMと共に使用することで、患者試料特有のダイナミックパスウェイマップ(DPM)を作成する。
(0082)本書に開示する実施形態は事例的かつ例示的であり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の特許請求の範囲から逸脱することなく他の実施形態を利用することができ、構造上の変更を行うことができる。
PARADIGM:PARADIGMを使用した多次元癌ゲノミクスデータからの患者特異的パスウェイ活性の推論。
(00106)パスウェイに基づく手法の1つの仮説は、パスウェイデータベースに含まれている遺伝的相互作用は、癌において検出される遺伝子発現変化の間の相関性を解釈するための情報を有するというものである。例えば、癌関連パスウェイが転写活性化因子Aから標的遺伝子Tへのリンクを含む場合、本発明者らはAの発現がTの発現と正の相関(E2E相関)を有することを予想する。同様に、本発明者らはAのコピー数とTの発現との間に正の相関(C2E相関)があることを予想する。更に、本発明者らはAにおける増幅は、必ずしもAがより高度に発現することを意味するものでなく、それには次にBの上方制御が必要なため、C2E相関はE2E相関より弱いことを予想する。このように、パスウェイの各リンクはデータに関する予想を提供する;多くの一貫性のあるリンクを含むパスウェイは、更なる考慮事項について関連性を有し得る。本発明者らはこれらの仮定を検証し、NCIパスウェイは、最近のTCGA GBMデータを予測する多くの相互作用を含むことを見出した(The TCGA research network 2008)。
(00113)現在、ヒト悪性腫瘍の治療に向けて800種を超える小分子阻害薬及び生物製剤の開発が進められている(New Medicines Database|PHRMA.http://newmeds.phrma.org/(2010))。これらの薬剤の多くは、腫瘍を正常細胞と区別すると考えられる分子構造を標的とし、かつ代謝拮抗薬及びDNA架橋剤、例えばトラスツズマブ及びラパチニブを含めた、癌のサブセットにおいて調節解除される分子イベント及びパスウェイを選択的に標的化する広域特異性の従来の治療薬までの範囲に及ぶ(例えば、Slamon,D.J.et al.Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.N Engl J Med 344,783−792(2001);Vogel,C.L.et al.Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first−line treatment of HER2−overexpressing metastatic breast cancer.J Clin Oncol 20,719−726(2002);Rusnak,D.W.et al.The effects of the novel,reversible epidermal growth factor receptor/ErbB−2 tyrosine kinase inhibitor,GW2016,on the growth of human normal and tumor−derived cell lines in vitro and in vivo.Mol Cancer Ther 1,85−94(2001)を参照のこと)。Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15−year survival:an overview of the randomised trials.Lancet 365,1687−1717(2005)。
(00117)様々なレベルにおけるハイスループット腫瘍分子プロファイルの蓄積は、世界的に時間及び費用のかかるプロセスとなっている。様々なレベルで遺伝子調節を複合的に分析することにより、複数の上皮癌で調節解除されている特定の生物学的機能及び分子パスウェイが示され、かつ個々に合わせた治療及びモニタリングのための新規な患者サブグループが明らかとなり得る。本発明者らは、約110人の乳癌患者からの、原発腫瘍、対応する血液、かつ既知の微小転移状態を有する新鮮な凍結試料から得られるいくつかの分子レベルでのハイスループットデータを収集した(以下、MicMaデータセットと称する)。これらの患者は、播種性腫瘍細胞(DTC)の存在、再発についての長期経過観察及び全生存に関する情報を有する900件を超える乳癌症例コホートの一部である。MicMa集合は、全ゲノムmRNA発現(Naume,B.et al.,(2007),Presence of bone marrow micrometastasis is associated with different recurrence risk within molecular subtypes of breast cancer,1:160−17)、アレイCGH(Russnes,H.G.et al.,(2010),Genomic architecture characterizes tumor progression paths and fate in breast cancer patients,2:38ra472)、DNAメチル化(Ronneberg,J.A.et al.,(2011),Methylation profiling with a panel of cancer related genes:association with estrogen receptor,TP53 mutation status and expression subtypes in sporadic breast cancer,5:61−76)、全ゲノムSNP及びSNP−CGH(Van,Loo P.et al.,(2010),Allele−specific copy number analysis of tumors,107:16910−169154)、全ゲノムmiRNA発現解析(Enerly E,Steinfeld I,Kleivi K,Leivonen S,Aure MR,Russnes HG,Ronneberg JA,Johnsen H,Navon R,Rodland E,Makela R,Naume B,Perala M,Kallioniemi O,Kristensen VN,Yakhini Z,Borresen−Dale A.miRNA−mRNA integrated analysis reveals roles for miRNAs in primary breast tumors.PLoS ONE 2011;6(2):e16915)、TP53 mutation status dependent pathways and high throughput paired end sequencing(Stephens,P.J.et al.,(2009),Complex landscapes of somatic rearrangement in human breast cancer genomes,462:1005−1010)の並行するパイロット研究において使用されている。これは、単一の研究室によって同じ原発性乳房腫瘍集合に対して行われる包括的なハイスループット分子データ収集である。
(00123)コピー数及び遺伝子発現の両方の統合分析によって有意に変化するパスウェイを同定するため、本発明者らは最近開発したパスウェイ活性推論法PARADIGM(PMID:20529912)を適用した。この計算モデルはコピー数変化、遺伝子発現データ、及びパスウェイ構造を組み込み、パスウェイデータベースに存在する全ての遺伝子、複合体、及び遺伝的プロセスについて統合パスウェイ活性(IPA)を生成する。本発明者らは用語「エンティティ」を、それが遺伝子か、複合体か、又は小分子かを問わず、パスウェイにおける任意の分子を指して使用する。エンティティのIPAは最終活性のみを指す。遺伝子について、IPAはタンパク質の活性状態の推論された活性のみを指し、これは、パスウェイにおける他の遺伝子のコピー数、遺伝子発現、及びシグナル伝達から推論される。本発明者らはPARADIGMを卵巣試料に適用し、米国国立癌研究所のパスウェイ相互作用データベース(NCI−PID)に含まれるパスウェイに存在する多くの異なる遺伝子及びプロセスの変化を見出した。本発明者らは1000回のランダムシミュレーションを用いて推論された変化の有意性を評価し、これらのシミュレーションでは、同じ構造を有するパスウェイが使用されるが、パスウェイの種々の点に任意の遺伝子が割り当てられた。換言すれば、所定のパスウェイのあるランダムシミュレーションでは相互作用の集合は固定されたままであり、それ故任意の遺伝子集合はパスウェイ相互作用によって互いに連結された。全試料のIPAの有意性は同じヌル分布に対して評価し、各試料におけるエンティティ毎の有意水準を得た。標準偏差が少なくとも0.1のIPAを、図28にヒートマップとして表示する。
(00130)本明細書に記載の方法を用いて、変化した遺伝子発現、mRNAの発現過剰に対する非存在/存在を検出及び定量化し、又は治療介入中のmRNAレベルをモニタし得る。発現の変化に関連する病態、疾患又は障害としては、特発性肺動脈高血圧症、二次性肺高血圧症、細胞増殖性障害、特に退形成乏突起膠腫、星状細胞腫、乏突起星細胞腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経節神経腫、神経細胞腫瘍、多発性硬化症、ハンチントン病、乳腺腺癌、前立腺腺癌、胃腺癌、転移性神経内分泌癌、非増殖性線維嚢胞性及び増殖性線維嚢胞性の乳腺疾患、胆嚢炎及び胆石症、変形性関節症、並びに関節リウマチ;後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック・東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症(SCID)、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、血液透析、体外循環、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症;プロラクチン産生障害、不妊症、例えば、卵管疾患、排卵異常、及び子宮内膜症、性周期の乱れ、月経周期の乱れ、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍又は卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、子宮外妊娠、及び催奇形性;乳癌、乳腺線維嚢胞症、及び乳汁漏出症;精子形成の乱れ、精子の生理異常、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病、インポテンス、女性化乳房;日光角化症、動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、癌の合併症、癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌が挙げられる。別の態様において、本発明の核酸。
(00134)動物モデルは、ヒトと同様の毒性応答を示し、かつ曝露条件がヒト曝露に適切である場合に、バイオアッセイとして用いることができる。哺乳動物は最も一般的なモデルであり、低コスト、利用し易さ、及び豊富な毒性学の参考文献のために、ほとんどの毒性試験がラット又はマウスなどのげっ歯類で行われている。近交系げっ歯類は、対象遺伝子の過小発現又は過剰発現の生理学的影響の研究、及び疾患の診断及び治療方法の開発に好都合なモデルを提供する。特定の遺伝子(例えば、乳中に分泌されるもの)を過剰発現するように同系交配した哺乳動物もまた、当該遺伝子により発現する好都合なタンパク質供給源として機能し得る。
(00135)毒性学は、薬剤の生物系に及ぼす影響の研究である。毒性試験の大半はラット又はマウスで行われ、これらの薬剤がヒトの健康に及ぼす影響を予測するのに役立つ。生理機能、行動、恒常作用、及び致死性における定性的及び定量的な変化の観測を用いて毒性プロファイルを生成し、薬剤への曝露後のヒトの健康に及ぼす影響を評価する。
(00140)対象遺伝子を過剰発現又は過小発現するトランスジェニックげっ歯類を同系交配し、ヒト疾患をモデル化又は治療剤若しくは毒物を試験するために用い得る。(参照により本明細書に援用される米国特許第4,736,866号明細書;同第5,175,383号明細書;及び同第5,767,337号明細書を参照のこと)。ある場合には、導入された遺伝子は、胎児発育中又は出生後に特定の時点で特定の組織型において活性化され得る。実験的薬物治療の投与前、投与中、及び投与後のトランスジェニック動物における表現型又は組織特異的mRNA発現を分析することにより、導入遺伝子の発現が観察される。
(00141)げっ歯類の胚から単離された胚性幹細胞(ES)は、胚を形成する能力を保持している。ES細胞を担体の胚内に置くと、それらの細胞は正常な発生を再開し、生産動物の全ての組織に寄与する。ES細胞は、実験的ノックアウト及びノックインげっ歯類株の作製に使用される好ましい細胞である。マウス129/SvJ細胞株などのマウスES細胞は初期マウス胚に由来し、当技術分野において周知の培養条件下で成長させる。ノックアウト株用のベクターは、生体内で転写及び/又は翻訳を妨害するマーカー遺伝子を含むように修飾された疾患遺伝子候補を含む。ベクターは、当技術分野において周知の電気穿孔法、リポソーム送達、顕微注入法などの形質転換法によってES細胞に導入される。内因性げっ歯類遺伝子は、細胞分裂中に相同組換え及び組込みによって破壊疾患遺伝子に置き換えられる。形質転換ES細胞が同定され、かつ好ましくはC57BL/6マウス株由来のものなどのマウス細胞胚盤胞に顕微注入される。胚盤胞は偽妊娠の雌親に外科的に移植され、得られたキメラの子孫の遺伝子型を決定し、繁殖させてヘテロ接合又はホモ接合の株が産生される。
(00143)遺伝子ノックアウト解析では、ヒト疾患遺伝子候補の領域は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo;例えば、Capecchi(1989)Science 244:1288−1292を参照のこと)などの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素的に修飾される。挿入されたコード配列は標的化遺伝子の転写及び翻訳を妨害し、疾患候補タンパク質の生化学合成を妨げる。修飾された遺伝子は、培養胚性幹細胞(上記に記載される)に形質転換され、形質転換細胞はげっ歯類胞胚に注入され、かつ胞胚は偽妊娠の雌親に移植される。トランスジェニック子孫を異種交配させると、ホモ接合近交系が得られる。
(00144)胚発生初期に存在する全能性ES細胞を使用して、ノックインヒト化動物(ブタ)又はヒト疾患のトランスジェニック動物モデル(マウス又はラット)を作製することができる。ノックイン技術によってヒト遺伝子のある領域は動物ES細胞に注入され、ヒト配列は組換えによって動物細胞ゲノムに組み込まれる。組み込まれたヒト遺伝子を含む全能性ES細胞は、上記に記載したとおり操作される。近交系動物は試験及び処置され、類似のヒト病態に関する情報が得られる。このような方法は、いくつかのヒト疾患のモデル化に用いられている。(例えば、Lee et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95:11371−11376;Baudoin et al.(1998)Genes Dev.12:1202−1216;及びZhuang et al.(1998)Mol.Cell Biol.18:3340−3349を参照のこと)。
(00145)動物試験の分野では、生理学、遺伝学、化学、薬理学及び統計学などの基礎科学からのデータ及び方法論を取り扱う。このようなデータは、非ヒト霊長類に対する治療剤の効果の評価において、それがヒトの健康に関係し得るために最も重要である。サルは、ワクチン及び薬物の評価においてヒトの代理として使用され、その応答は同様の条件下でのヒト曝露に関係する。カニクイザル(マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis)、マカカ・ムラタ(Macaca mulata))及びコモンマーモセット(カリトリクス・ヤックス(Callithrix jacchus))が、これらの研究で使用される最も一般的な非ヒト霊長類(NHP)である。NHPコロニーの育成及び維持は巨費を伴うため、通常、初期研究及び毒性学的試験はげっ歯類モデルで行われる。薬物中毒などの行動測定を用いる試験では、NHPは第一選択肢の試験動物である。加えて、NHP及びヒト個体は、多くの薬物及び毒素に対して示差的感受性を示し、これらの薬剤の「高代謝群」及び「低代謝群」として分類することができる。
(00146)オーダーメイド医療は、利益を受ける可能性が最も高い患者に特異的な治療を送達するのに有望である。本発明者らは、治療化合物の約半数は、臨床的に関連する転写上又はゲノム上の乳癌サブタイプの1つ以上において選択的に有効であることを示した。これらの知見は、乳癌治療において応答に関連する分子サブタイプを定義することの重要性を支持している。本発明者らはまた、細胞株に関する転写及びゲノムのデータのパスウェイ統合は、観測されるサブタイプ特異的応答についての機構的説明を提供するサブネットワークを明らかにすることも示す。細胞株と腫瘍との間のサブネット活性の比較分析により、サブタイプ特異的サブネットワークの大部分が細胞株と腫瘍との間で保存されていることが示される。これらの分析から、十分に特徴付けられた細胞株パネルにおける実験的化合物の前臨床スクリーニングにより、初期段階の臨床試験における感受性濃縮に使用し得る応答に関連する分子サイン候補を同定できるという着想が裏付けられる。本発明者らは、このインビトロ評価手法が、化合物の臨床開発開始前に応答性の腫瘍サブタイプが同定される可能性を高め、それにより費用が低減され、最終的にFDA承認される確率が高まり、場合によっては応答する可能性が低い患者の治療に伴う毒性が回避されることを示唆する。この研究において、本発明者らは、転写サブタイプを定義する分子サインのみを評価し、反復されるゲノムCNAを選択した。本発明者らは、遺伝子突然変異、メチル化及び選択的スプライシングなどの更なる分子構造を解析に含めると、本手法の検出力及び精度が増加すると期待する。同様に、細胞株パネルのサイズが大きくなるほど、パネル内であまり一般的ではない分子パターンを評価する検出力が増加し、かつヒト乳癌に存在する多様性のより完全な範囲を表現する確率が高まる。
(00156)従って、本発明の主題に係るシステムの使用は、一般的にパスウェイ要素データベースを含むものである。既に上述したように、データベースは物理的に単一のコンピュータに配置され得るが、分散型データベースも本明細書における使用に適していると考えられることが理解されるべきである。更に、このようなデータベースが複数のパスウェイ要素を格納及び検索できる限り、かつ各パスウェイ要素は少なくとも1つのパスウェイへのその関与により特徴付けられる限り、データベースの特定の形式は、本発明の主題に限定されるものではないことが理解されるべきである。
(00177)Chin(2007 上記)の乳癌コピー数データを、NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)から受託番号GPL5737に基づき、GSE8757からの関連するアレイプラットフォームアノテーションと共に入手した。
(00181)本発明者らは、米国国立癌研究所パスウェイ相互作用データベース(NCI PID)から利用可能なキュレーションされたパスウェイの集合を集めた(Schaefer:2009 上記)。各パスウェイは、内因性及び外因性の細胞以下レベル、細胞レベル、組織レベル、又は生物体レベルのイベント及び表現型を表す高次の生体分子過程の周辺で論理的にグループ化された相互作用の集合を表す。BioPAXレベル2フォーマットのパスウェイをダウンロードした。全てのエンティティ及び相互作用を、Rasqal RDFエンジンを使用してSPARQLクエリで抽出した。
(00185)本発明者らは、初めに各NCIパスウェイを個別の確率モデルに変換した。p53アポトーシスパスウェイのごく一部の小例を図2に示す。NCIのパスウェイ図を、隠れ状態及び観測状態の両方を含む因子グラフに変換した。因子グラフは、エンティティ間の既知の相互作用を表す構造により、遺伝子関連及び生物学的プロセス関連の状態情報に関する観測を統合する。
(00197)割り当ての集合D={x1=s1,x2=s2,x2,....,xk=sk}は、添え字1〜kが付与された観測変数に関する患者のデータの完全集合を表すとする。{SDX}は、Dにおける割り当てと一致する変数Xの集合のあらゆる可能な割り当ての集合を表すとする;すなわち隠れ変数は変化し得るが、任意の観測変数x1はDにおけるその割り当てに固定される。
(00205)本発明者らは、データの2つの異なる順列によりIPAスコアの有意性を評価する。「within」順列について、初めにランダムな実サンプルを選択し、次に同じパスウェイ内からランダムな遺伝子を選択することによって、新しいデータタプル(すなわち対応した遺伝子発現及び遺伝子コピー数)の選択を、パスウェイの各遺伝子についてタプルが選択されるまで行うことにより、順列化したデータサンプルを作成する。「any」順列も手順は同じであるが、ランダムな遺伝子を選択するステップは、ゲノムのどこからでも遺伝子を選択し得る。両方の順列タイプについて、1,000個の順列サンプルが作成され、順列化サンプル毎に摂動スコアが計算される。順列化サンプルからの摂動スコアの分布をヌル分布として用いて、真の試料の有意性を推定する。
(00206)Tarca(2009,上記)によるシグナル伝達パスウェイ影響解析(SPIA)をCで実行して実行時間を低減し、本発明者らの解析環境に適合するものとした。本発明者らはまた、より詳細な出力を提供する能力も追加して、SPIA出力とPARADIGM出力とを直接比較できるようにした。本発明者らのSPIAバージョンは、パスウェイのエンティティ毎に累積摂動及び摂動係数を出力することができる。このコードは要求に応じて利用可能である。
(00207)各癌データセットについてデコイパスウェイ集合を作成した。各NCIパスウェイを使用してデコイパスウェイを作成し、これは同じ構造から成るが、パスウェイのあらゆる遺伝子はRefGene社のランダム遺伝子に置換した。全ての複合体及び抽象的プロセスは同じままとし、PARADIGM及びSPIAの両方についての有意性分析を実パスウェイ及びデコイパスウェイの両方を含むパスウェイの集合に対して実行した。パスウェイは各方法内で順位付けし、全パスウェイに対する実パスウェイの割合を計算して視覚化した。
(00208)重心連結による非中心化相関階層的クラスタリングを、Eisen(1998 上記 1621頁)の方法を用いて膠芽腫データに対して実行した。75例の患者試料間で少なくとも0.25のシグナルを有するIPAのみをクラスタリングに使用した。目視検査により4つの明らかなクラスターが現れ、それをカプラン・マイヤー分析に使用した。Rを使用してカプラン・マイヤー曲線を計算し、ログランク統計によってp値を求めた。
(00209)EM訓練手順の質を評価するため、本発明者らは遺伝子発現とコピー数とのタプル(E,C)が遺伝子及び患者にわたって順列化されているヌルデータセットと比べた実際の患者データを使用して、EMの収束を比較した。予想どおり、PARADIGMは、真のデータセットではヌルデータセットと比べてはるかに急速に収束した。例として、本発明者らは遺伝子AKT1についてのIPAをEM反復の関数としてプロットした(図4)。活性が最初の数回の反復で急速に収束することが分かる。EMは実際の患者データで訓練したとき活性化レベルに急速に収束したが、一方、ランダムデータを入れたときは活性不変に収束した。この収束により、パスウェイ構造及び推論は、統合された患者データにおける活性パターンを成功裏に特定可能であることが示唆される。
(00213)本発明者らは、NCIパスウェイを本発明者らの順列解析により検出されたエンティティ当たりのその有意なIPAの平均数に従い並べ替え、乳癌(表1)及びGBM(表2)における上位15を計算した。
(00216)PARADIGM推論の結果を視覚化するため、本発明者らは、パスウェイにおける各遺伝子周りを中心として複数のデータセットを表示するための「CircleMap」視覚化を開発した(図7)。この表示では、遺伝子周りに同心円状の輪をプロットすることにより、各遺伝子がコホート間のその全てのデータと関連付けられ、各輪は、単一の種類の計測値又は計算推論に対応する。輪の中の各度数刻みは単一の患者試料に対応し、一方で色は活性化レベル(赤色)、不活性化レベル(青色)、又は不変化レベル(白色)の活性に対応する。本発明者らはErbB2パスウェイのサブセットについてCircleMapをプロットし、乳癌コホートからのER状態、IPA、発現、及びコピー数データを含めた。
(00220)生存分析から、クラスター4の患者は有意により良好な生存プロファイルを有することが明らかとなった。クラスター4は、網膜芽細胞腫抑制因子と共に作用するE2Fの上方制御を有することが分かった。従ってE2Fの上方制御は、クラスター4の患者からの腫瘍試料における細胞周期進行の能動的抑制と整合する。加えて、クラスター4はHIF−1−α転写因子の不活性と関連付けられた。第4のクラスターにおける不活性は、腫瘍がより酸素化されていて、それらがより小さい、又はより新しい腫瘍であり得ることを示唆するマーカーとなり得る。従って、PARADIGM IPAは、顕著に異なる生存転帰を有するサブタイプを描出するのに意味のあるプロファイル集合を提供する。
(00222)この報告では、489個の臨床的にアノテートされたステージII−IVのHGS−OvCa及び対応する正常なDNAの解析を取り上げている。患者は、HGS−OvCaと診断された個体の診断時の年齢、病期、腫瘍悪性度、及び手術転帰を反映した。臨床データは2010年8月25日現在のものであった。HGS−OvCa標本は全身的治療の前に外科的に切除され、但し全ての患者は白金剤の投与を受け、及び94%がタキサンの投与を受けた。このコホートの無進行生存及び全生存の中央値は、既に公表されている治験11、12と同様である。患者の25%は無病のままであり、及び45%は最終経過観察時に生存していた一方、31%は白金ベース療法の完了後6ヶ月以内に進行した。中央値の追跡は30ヶ月であった(範囲0〜179)。TCGA解析用の試料は、70%超の腫瘍細胞核、かつ20%未満の壊死を有するよう選択した。
(00224)316個のHGS−OvCa試料から単離したDNA及び各個体に対応する正常試料に対し、エキソームキャプチャー及びシーケンシングを実施した。キャプチャー試薬は、合計約33メガベースの非冗長配列の約18,500個の遺伝子から約180,000個のエクソンを標的化した。Illumina社のGAIIxプラットフォーム(236試料ペア)又はABI社のSOLiD 3プラットフォーム(80試料ペア)での超並列シーケンシングにより、試料当たり約14ギガベース(合計約9×109塩基)が得られた。平均して、コード塩基の76%が腫瘍及び対応する正常試料の両方において十分な深さで網羅され、確信的な突然変異検出が可能となった。19,356個の体細胞突然変異(腫瘍当たり約61個)をアノテートし、表4に分類した。HGSOvCa病態生理学において重要であり得る突然変異を、(a)バックグラウンドと比べて有意に増加した頻度で存在する非同義変異又はスプライス部位変異を探し出し、(b)この研究の突然変異をCOSMIC及びOMIMの突然変異と比較し、かつ(c)タンパク質機能に対する影響を予測することにより、同定した。
(00228)489個のHGS−OvCaゲノムに存在する体細胞性コピー数変化(SCNA)を同定し、図37Aにおいて多形膠芽腫(glioblastome multiforme)データと比較した。SCNAは、広範な染色体領域に影響を及ぼす領域性異常と、より小さい限局性異常とに分けた。領域性異常の統計的解析により8個の繰り返し起こる獲得及び22個の喪失が同定され、その全てが既に報告されている22(図37B)。獲得のうち5個及び喪失のうち18個は、50%超の腫瘍で起こった。
(00231)3つの異なるプラットフォーム(Agilent社、Affymetrix社のHuEx、Affymetrix社のU133A)からの11,864個の遺伝子についての発現計測値を、サブタイプを同定かつ転帰を予測するために組み合わせた。個々のプラットフォーム計測値は、限定的な、しかし統計的に有意なバッチ効果を受けたが、一方、組み合わせたデータセットはそれを受けなかった。組み合わせたデータセットの解析から約1,500個の本質的に変化し易い遺伝子が同定され、それらをNMFコンセンサスクラスタリングに使用した。この解析により4つのクラスターが得られた(図38a)。同じ解析手法をTothillらの公的に利用可能なデータセットに適用し、同様に4つのクラスターを得た。TothillのクラスターとTCGAクラスターとの比較により、明らかな相関が示された。従って本発明者らは、HGS−OvCaには少なくとも4つのロバストな発現サブタイプが存在すると結論付ける。
(00237)いくつかの分析により、316例の完全に解析されたケースからのデータが統合され、HGS−OvCaに寄与する生物学が特定された。既知の癌関連パスウェイが1つ以上の突然変異、コピー数変化、又は遺伝子発現変化を含む頻度の解析から、RB1パスウェイ及びPI3K/RASパスウェイがそれぞれ67%及び45%のケースで調節解除されたことが示された(図39A)。HotNet33を使用して大規模タンパク質間相互作用ネットワーク32において変化したサブネットワークを調べることで、HGS−OvCa試料の23%で変化したNotchシグナル伝達パスウェイを含め、いくつかの既知のパスウェイが同定された(図39B)。
(00241)コピー数及び遺伝子発現の両方の統合解析によって有意に変化したパスウェイを同定するため、本発明者らはPARADIGMを適用した。この計算モデルはコピー数変化、遺伝子発現データ、及びパスウェイ構造を組み込み、パスウェイデータベースに存在する全ての遺伝子、複合体、及び遺伝的プロセスについて統合パスウェイ活性(IPA)を生成する。本発明者らは用語「エンティティ」を、それが遺伝子か、複合体か、又は小分子かを問わず、パスウェイにおける任意の分子を指して使用する。エンティティのIPAは、最終活性のみを指す。遺伝子について、IPAはタンパク質の活性状態の推論された活性のみを指し、これは、パスウェイにおける他の遺伝子のコピー数、遺伝子発現、及びシグナル伝達から推論される。本発明者らはPARADIGMを卵巣試料に適用し、米国国立癌研究所のパスウェイ相互作用データベース(NCI−PID)に含まれるパスウェイに存在する多くの異なる遺伝子及びプロセスの変化を見出した。本発明者らは1000回のランダムシミュレーションを用いて推論された変化の有意性を評価し、これらのシミュレーションでは、同じ構造を有するパスウェイが使用されるが、パスウェイの種々の点に任意の遺伝子が割り当てられた。換言すれば、所定のパスウェイのあるランダムシミュレーションでは、相互作用の集合は固定されたままであり、それ故任意の遺伝子集合はパスウェイ相互作用によって互いに連結された。全試料のIPAの有意性は同じヌル分布に対して評価し、各試料におけるエンティティ毎の有意水準を得た。IPA及びそれらが有意である試料の割合及び標準偏差が少なくとも0.1のIPAを、図28にヒートマップとして表示する。
(00248)コピー数及び発現データの両方をPARADIGM推論に組み込んだ。8個の正常組織対照の集合が発現データにおける解析に利用可能であったため、患者の遺伝子値の各々を、正常な卵管対照で観察される遺伝子の中央値レベルを減じることにより正規化した。コピー数データは、腫瘍で検出された遺伝子レベルと、それに対する血液正常レベルとの間のコピー数の差異を反映するように正規化した。PARADIGMへの入力のために、発現データは、サブタイプ解析に使用したものと同じ統合データセットから取り、コピー数は、MSKCC Agilent社の1Mコピー数データのセグメント化コールから取った。
(00250)本発明者らは、コピー数、遺伝子発現、及び各エンティティのパスウェイ文脈を反映する統合パスウェイ活性(IPA)を割り当てるPARADIGMを使用した。
(00252)FOXM1ネットワーク内の全ての遺伝子を使用してランダムシミュレーションの間に統計的有意性を評価したが、FOXM1パスウェイの視覚化を可能とするため、図29により有意に変化したIPAを有するFOXM1に直接連結されたエンティティを、図27に含めるために選択した。これらのうち、DNA修復及び細胞周期制御において役割を有する遺伝子であって、FOXM1との相互作用について文献の裏付けがあると認められたものを表示した。元のNCI−PIDパスウェイに見出されなかったBRCC複合体メンバーを、NCI−PIDによればFOXM1の標的であるBRCA2と共にプロットに含めた。上流DNA修復標的を、他のNCIパスウェイにおけるCHEK2の上流調節因子を見つけることにより同定した(例えば、PLK3シグナル伝達パスウェイにおいてATMからの間接的リンクが見出された)。
(00253)活性及び非活性の確率の変化を直接的に表す推論活性の使用により、様々な種類のエンティティをまとめて1つのヒートマップにクラスター化することが可能となる。PARADIGM推論の結果を包括的に視覚化するため、Eisen Cluster 3.0を使用して特徴フィルタリング及びクラスタリングを実施した。0.1の標準偏差フィルタリングにより7204個中1598個のパスウェイエンティティが残り、エンティティ及び試料の両方に対して平均連結法、非中心化相関階層的クラスターを実施した。
(00254)臨床的に関連する分子的応答予測因子の同定に対する細胞株の有用性は、腫瘍における応答を決定する多様な分子機構が細胞株内でどの程度機能するかに依存する。本発明者らは、転写物及びゲノムコピー数の両方のレベルでの細胞株モデルと原発腫瘍との間の類似性に関して以前に報告しており9、本発明者らはここでこの比較を、より高分解能のプラットフォーム及び解析技法を用いて改良する。具体的には、本発明者らは遺伝子発現プロファイルの階層的コンセンサスクラスタリング(HCC)を使用して、50個の乳癌細胞株及び5個の非悪性乳房細胞株を3つの転写サブタイプ:ルミナル、基底細胞及び新しく記載するクローディン低に分類した(図14A)。これらのサブタイプは先述したものの改良版であり、基底細胞及びクローディン低(caludin−low)は、それぞれ先に指定した基底細胞A及び基底細胞Bのサブタイプに対応する、表7。改良版高分解能SNPコピー数解析(図14B)により、細胞株パネルは、8q24(MYC)、11q13(CCND1)、17q12(ERBB2)、20q13(STK15/AURKA)の繰り返し生じる増幅領域、及び原発腫瘍に見られる9p21(CDKN2A)のホモ接合性欠失をモデル化することが確認される。トラスツズマブ及びラパチニブ療法により決定されるとおりのERBB2腫瘍サブタイプの臨床的関連性を考慮すると、本発明者らは、ERBB2AMPと指定される特別なサブタイプとして、ERBB2のDNA増幅を伴う細胞株を調べた。概して、ルミナル型、基底細胞型、クローディン低型及びERBB2AMP型の細胞株における本発明者らの同定は、臨床生物学と一致している。
(00255)本発明者らは、77種の治療化合物に対する本発明者らの細胞株パネルの感受性を調べた。本発明者らは細胞成長アッセイを用い、定量的終点は9つの濃度の各薬剤に3日間連続的に曝露した後に計測した。試験した抗癌化合物には、従来の細胞傷害剤(例えば、タキサン、プラチノール、アントラサイクリン(anthracyline))と標的化薬剤(例えば、SERM及びキナーゼ阻害薬)との混合物が含まれた。多くの場合、いくつかの薬剤は同じタンパク質又は分子的作用機構を標的化した。本発明者らは、各化合物についての応答の定量的尺度を、50%だけ成長を阻害するのに必要な濃度(GI50と称する)として決定した。基礎となる成長データは高品質であるものの、50%阻害が達成されなかった場合、本発明者らはGI50を試験した最高濃度に設定した。GI50値は全ての化合物について表8に提供する。本発明者らは、3つの化合物(PS1145、セツキシマブ及びバイカレイン)は細胞株応答の変動が最小限であったため更なる解析から除外した。
(00257)本研究の主な前提は、細胞株における予測性のある分子構造がヒト腫瘍に反映される場合に、前臨床細胞株分析で認められる応答と分子サブタイプとの間の関連性が診療室で繰り返し起こり得ることである。本発明者らは、ノンパラメトリックANOVAを用いて応答−サブタイプの関連性を確立し、転写サブタイプ及びゲノミクスサブタイプ間のGI50値を比較した。
(00260)概して、本発明者らは、ルミナル型サブタイプの細胞株は基底細胞型又はクローディン低型の細胞より成長が遅く(クラスカル・ワリス検定 p=0.006、図16A及び表7)、倍加時間の範囲が広かった(18〜300時間)ことを見出した。これにより、最も感受性が高い細胞株は最も速く成長する細胞株である可能性が提起された。そうであるならば、次に観測されたサブタイプとの関連性は共変量との関連性を表し得る。本発明者らは、この仮説を共分散分析(ANCOVA)を用いてサブタイプ及び倍加時間の効果を同時に評価することにより検証し、33個中22個のサブタイプ特異的化合物は、倍加時間よりサブタイプとより良好な関連性を有したことが分かった(p値の平均対数比=0.92、標準偏差1.11)。これは、サブタイプの構成員は成長速度よりも良好な応答予測因子であるという着想を支持するものである。更に、33個中15個のサブタイプ特異的化合物は、よりゆっくりと成長するルミナル型細胞株において有効性がより高かった(表7)。1つの薬剤、5−フルオロウラシル(5−florouracil)は、サブタイプの検証単独では有意ではなかったが、ANCOVAモデルではクラス及び倍加時間の両方に対して強い有意性を示した。5−フルオロウラシル(5−florouracil)に対する応答は、ルミナル型細胞株及び基底細胞型細胞株の両方で倍加時間が増加するにつれて低下した(図16B)。本発明者らは、ほとんどの場合に、3日間の成長阻害アッセイは、成長速度によって強い影響を受けない分子サイン特異的応答を検出していると結論付ける。
(00261)本発明者らは、ネットワーク解析ツールのPARADIGM24を使用して、細胞株パネルのサブタイプ間におけるパスウェイ活性の差異を同定した。この解析は、キュレーションされたパスウェイが部分的に重複するという事実によって複雑化する。例えばEGFR、PI3キナーゼ及びMEKは、実際にはそれらが単一のより大きいパスウェイの構成要素であるときに、別個のパスウェイとしてキュレーションされることが多い。この問題に対処するため、PARADIGMは約1400個のキュレーションされたシグナル伝達パスウェイ、転写パスウェイ及び代謝パスウェイを単一の重畳パスウェイ(SuperPathway)にまとめ合わせ、このような冗長性を排除する。特定の細胞株についてのコピー数データ及び遺伝子発現データの両方を用いて、PARADIGMはパスウェイ相互作用を使用することにより、全ての遺伝子、複合体、及び細胞プロセスについての統合パスウェイレベル(IPL)を推論する。
(00263)本発明者らは、サブタイプ間の差異の根底に固有のパスウェイ活性があるかという問いを立てた。そのため、本発明者らは、あるサブタイプの細胞株で他と比較して示差的に上方制御又は下方制御される遺伝子活性を含むSuperPathwayのサブネットワークを同定した。基底細胞型細胞株とコレクション内の他の全てとの間のパスウェイ活性の比較により、941本のエッジにより連結された965個のノードから構成されるネットワークを同定した。ここで、ノードはタンパク質、タンパク質複合体、又は細胞プロセスを表し、エッジはタンパク質リン酸化などの、これらの要素間の相互作用を表す(図18〜図22を参照のこと)。図35Aは、増殖、血管新生、及び腫瘍形成に関連するMYC/MAXサブネットワークの上方制御;及び細胞周期、接着、浸潤、及びマクロファージ活性化を制御するERK1/2サブネットワークの上方制御を示している。FOXM1及びDNA損傷サブネットワークもまた、基底細胞型細胞株において顕著に上方制御された。クローディン低サブタイプを他の全てと比較することにより、基底細胞型細胞株におけるものと同じサブネットワークの多くの上方制御が示され、但し、基底細胞型と比較したときのクローディン低型細胞株におけるβ−カテニン(CTNNB1)ネットワークの上方制御を含めて例外はあった(図35B)。β−カテニンは腫瘍発生に関与しているとされ、不良な予後と関連付けられる。ルミナル型細胞株を他の全てと比較することにより、黒色腫における腫瘍形成能を阻害するATF2ネットワークの下方制御、及びER調節遺伝子の転写を制御し、かつ良好な予後のルミナル型乳癌に関与するとされるFOXA1/FOXA2ネットワークの上方制御が示された(図35C)。ERBB2AMP型細胞株を他の全てと比較することにより、ルミナル型細胞と共通する多くのネットワーク特徴が示された−ほとんどのERBB2AMP型細胞はまたルミナル型細胞として分類されるため、これは意外ではない。しかしながら図35Dでは、ERBB2AMP型細胞株におけるRPS6KBP1を中心とする下方制御が示されている。
(00265)本発明者らは、77種の化合物の効力を本発明者らの55個の乳癌細胞株パネルにおいて評価した。このアッセイは既に記載されているとおり実施した(Kuo,W.L.et al.A systems analysis of the chemosensitivity of breast cancer cells to the polyamine analogue PG−11047.BMC Med 7,77,doi:1741−7015−7−77[pii]10.1186/1741−7015−7−77(2009))。簡潔に言えば、細胞を1:5の段階希釈(serial dillution)で一組の9用量の各化合物を用いて72時間処理した。Cell Titer Gloアッセイを用いて細胞生存率を決定した。未処理のウェルについての0hに対する72hの比から、倍加時間(DT)を推定した。
(00269)統計的解析に含まれた各薬物は、データの質についての以下のスクリーニング基準を満たした:1)欠測値:細胞株の集合全体でGI50値の40%以下が欠測していてもよい;2)ばらつき:少なくとも3つの細胞株について、GI50>1.5.mGI50又はGI50<0.5.mGI50のいずれか、式中mGI50は所定の薬物についてのGI50中央値である。これらの基準を満たさない化合物は解析から除外した。
(00270)Affymetrix社のGenome−Wide Human SNP Array6.0を使用して、DNAコピー数データを計測した。アレイ品質及びデータ処理は、R統計フレームワーク(http://www.r−project.org)を使用してaroma.affymetrixに基づき実行した。乳癌細胞株SNPアレイを、記載のとおり20個の正常試料アレイを使用して正規化した(Bengtsson,H.,Irizarry,R.,Carvalho,B.& Speed,T.P.Estimation and assessment of raw copy numbers at the single locus level.Bioinformatics(Oxford,England)24,759−767(2008))。データを、bioconductor社のパッケージのDNAcopyからサーキュラーバイナリセグメンテーション(CBS)を用いてセグメント化した(Olshen,A.B.,Venkatraman,E.S.,Lucito,R.& Wigler,M.Circular binary segmentation for the analysis of array−based DNA copy number data.Biostatistics(Oxford,England)5,557−572(2004))。MATLABベースの癌における有意な標的のゲノム同定(Genomic Identification of Significant Targets in Cancer:GISTIC)を使用して、有意なDNAコピー数変化を分析した(Beroukhim,R.et al.Assessing the significance of chromosomal aberrations in cancer:methodology and application to glioma.Proc Natl Acad Sci USA 104,20007−20012(2007))。生データはEuropean Genotype Archive(EGA)社において受託番号EGAS00000000059により利用可能である。
(00272)細胞株の遺伝子発現データは、Affymetrix社のGeneChip Human Gene 1.0 STエクソンアレイから得た。発現の遺伝子レベルの要約を、aroma.affymetrix Rパッケージを使用して、「HuEx−1_0−st−v2,core」チップタイプに基づく分位点正規化及び対数相加プローブレベルモデル(PLM)により計算した。転写物識別子を、BioMart Rパッケージを使用してEnsemblデータベースに問い合わせることによりHGNC遺伝子記号に変換した。続いて得られた発現プロファイルをフィルタリングし、全細胞株においてlog2スケールで1.0より大きい標準偏差を表す遺伝子のみを捕捉した。生データはArrayExpress(E−MTAB−181)において利用可能である。
(00273)階層的コンセンサスクラスタリングを用いて細胞株サブタイプを同定した(Monti,S.,Tamayo,P.,Mesirov,J.P.& Golub,T.A.Consensus Clustering:A Resampling−Based Method for Class Discovery and Visualization of Gene Expression Microarray Data.Machine Learning 52,91−118(2003)。コンセンサスは、細胞株の500サンプリング、試料当たり細胞株の80%、凝集型階層的クラスタリング、ユークリッド距離計量及び平均連結法を用いて計算した。
(00275)本発明者らは、3つのスキームを使用してGI50を比較した:1)ルミナル型対基底細胞型対クローディン低型;2)ルミナル型対基底細胞型+クローディン低型;及び3)ERBB2−AMP型対非ERBB2−AMP型。GI50群間の差異を、順位尺度で、必要に応じてノンパラメトリックANOVA又はt検定により比較した。本発明者らは、3組の検定のp値を組み合わせ、かつ偽発見率(FDR)を使用して複数の検定を補正した。3標本検定について、本発明者らは各群を他の全てと比較して、どの群が最も感度が高いかを決定することにより、有意なクラス効果を有する化合物に対して事後解析を実施した。事後検定のp値を合わせてFDR補正した。全ての場合において、FDR p<0.20を有意と見なした。スキーム2で基底細胞型+クローディン低型の群が有意であると分かったが、スキーム1ではそれらの群のうち1つのみが有意であったケースであった場合、本発明者らはクラス特異度を割り当てる際にその3標本ケースに優先度を与えた。解析はRで実施した。
(00276)本発明者らはt検定を用いて、繰り返し起こるコピー数変化(8q24(MYC)、11q13(CCND1)、20q13(STK15/AURKA)におけるもの)と薬物感受性との間の関連性を評価した。本発明者らは、増幅が低い、又はない細胞株を単一の群に組み合わせ、それを増幅が高い細胞株と比較した。欠失領域について同等の解析を行った。GI50が試験した最大濃度と等しかった細胞株は、解析から除外した。本発明者らは任意の群が5未満の試料数を有する場合、化合物を除外した。
(00277)細胞株クラス及び成長速度の薬物感受性に対する効果を評価するため、本発明者らは、上記に記載される3つの細胞株分類スキームの各々につき1つの、一組の二元配置共分散分析(ANCOVA)検定を実施した。これにより6組のp値が得られた(2つの主効果×3分類スキーム);本発明者らは1回のFDR補正により有意性を評価し、FDR p値<0.20が対象となることを宣言した。本発明者らはこれらの分析をRにおいて関数lm及びANOVAで実施した。これらの関数はcarパッケージの一部として利用可能である。
(00278)PARADIGMソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベル(IPL)を推論する。詳細は実施例XXXVを参照のこと。
(00279)本発明者らは、細胞株について推論された活性が、TCGA腫瘍試料におけるそのそれぞれのサブタイプでクラスター化されるかという問いを立てた。高度に連結されたハブ遺伝子及び高度に相関した活性によって生じるバイアスを回避するため、相関分析により決定された2351個の非冗長的活性の集合を使用して、細胞株及び腫瘍試料をクラスター化した。細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料とクラスター化される程度を、コルモゴルフ・スミルノフ検定を用いて計算し、同じサブタイプの細胞株と腫瘍試料とのペア間の相関から計算されたt統計量の分布を、異なるサブタイプの細胞株ペアから計算された分布と比較した。詳細は実施例XXXVIを参照のこと。
(00280)本発明者らは、まとめて特定のサブタイプに関する示差的活性を示す相互に連結された遺伝子を探索した。各サブタイプは、細胞株を2つの群に二分化するものとして扱った:一方の群は、そのサブタイプに属する細胞株を含み、第2の群は残りの細胞株を含んだ。本発明者らは、2クラスマイクロアレイ有意性解析(SAM)アルゴリズムのRインプリメンテーションを使用して(Tusher,V.G.,Tibshirani,R.& Chu,G.Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.Proc Natl Acad Sci USA 98,5116−5121,doi:10.1073/pnas.091062498[pii](2001))、SuperPathwayの概念毎に示差的活性(DA)スコアを計算した。サブタイプについては、正のDAは、そのサブタイプでの他の細胞株と比較したより高い活性に対応する。
(00282)PARADIGMソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した24。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベル(IPL)を推論する。TCGA BRCAデータは、2010年11月7日付けのTCGA DCCから入手した。TCGA及び細胞株遺伝子発現データは、個別に、各データセット内で中心となるプローブ中央値とした。データセット全体(細胞株又はTCGA腫瘍試料のいずれか)の値を全て順位変換し、−log10順位比に変換してからPARADIGMに投入した。パスウェイは、http://pid.nci.nih.gov/からBioPaxレベル2フォーマットで得られ、NCI−PID、Reactome、及びBioCartaデータベースを含んだ。相互作用を組み合わせて、結合重畳パスウェイ(SuperPathway)とした。遺伝子、複合体、及び抽象的プロセス(例えば「細胞周期」)をパスウェイ概念として保持した。遺伝子概念を結合する前に、全ての遺伝子識別子をHUGO命名法に変換した。全ての相互作用が含まれ、矛盾する影響を解決することは試みなかった。P53(最も多く連結された構成要素)を始端とする幅優先無向探査を実行し、1つの単一構成要素を構築した。得られた結合パスウェイ構造は、3491個のタンパク質、4757個の複合体、及び520個のプロセスを表す合計8768個の概念を含むものであった。PARADIGM用の期待値最大化パラメータを細胞株データで訓練し、次にTCGA試料に適用した。次に細胞株及び腫瘍試料からのデータを組み合わせて単一のデータ行列とした。細胞株又は腫瘍試料のいずれのデータにおいても、0.5IPLを上回る少なくとも1つの値を有さないエントリーは全て、続く解析から除外した。
(00283)PARADIGM IPLを使用して細胞株をTCGA腫瘍試料と共にクラスター化し、細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料と類似しているかどうかを決定した。SuperPathwayの十分に調べられた範囲は、多数の相互作用を有する遺伝子(ハブ)と、直接的なデータは利用できない多数の中間的な複合体及び抽象的プロセスの大きなシグナル伝達鎖とを含む。ハブへのバイアスを回避するため、クラスタリング前に、細胞株及び腫瘍試料の両方に高度に相関するベクトル(ピアソン相関係数>0.9)を含むパスウェイ概念を、単一のベクトルに統一した。この統一により、元の8939個のパスウェイ概念から2351個の非冗長性ベクトルがもたらされた。
(00286)PARADIGMソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した24。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベル(IPL)を推論する。TCGA BRCAデータは、2010年11月7日付けのTCGA DCCから入手した。TCGA及び細胞株遺伝子発現データは、個別に、各データセット内で中心となるプローブ中央値とした。データセット全体(細胞株又はTCGA腫瘍試料のいずれか)の値を全て順位変換し、−log10順位比に変換してからPARADIGMに投入した。パスウェイは、http://pid.nci.nih.gov/から2010年10月13日付けのBioPaxレベル2フォーマットで得られ、NCI−PID、Reactome、及びBioCartaデータベースを含んだ。相互作用を組み合わせて、結合重畳パスウェイ(SuperPathway)とした。遺伝子、複合体、及び抽象的プロセス(例えば「細胞周期」)をパスウェイ概念として保持した。遺伝子概念を結合する前に、全ての遺伝子識別子をHUGO命名法に変換した。全ての相互作用が含まれ、矛盾する影響を解決することは試みなかった。P53(最も多く連結された構成要素)を始端とする幅優先無向探査を実行し、1つの単一構成要素を構築した。得られた結合パスウェイ構造は、3491個のタンパク質、4757個の複合体、及び520個のプロセスを表す合計8768個の概念を含むものであった。PARADIGM用の期待値最大化パラメータを細胞株データで訓練し、次にTCGA試料に適用した。次に細胞株及び腫瘍試料からのデータを組み合わせて単一のデータ行列とした。細胞株又は腫瘍試料のいずれのデータにおいても、0.5IPLを上回る少なくとも1つの値を有さないエントリーは全て、続く解析から除外した。
(00287)PARADIGM IPLを使用して細胞株をTCGA腫瘍試料と共にクラスター化し、細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料と類似しているかどうかを決定した。SuperPathwayの十分に調べられた範囲は、多数の相互作用を有する遺伝子(ハブ)と、直接的なデータは利用できない多数の中間的な複合体及び抽象的プロセスの大きなシグナル伝達鎖とを含む。ハブへのバイアスを回避するため、クラスタリング前に、細胞株及び腫瘍試料の両方に高度に相関するベクトル(ピアソン相関係数>0.9)を含むパスウェイ概念を、単一のベクトルに統一した。この統一により、元の8939個のパスウェイ概念から2351個の非冗長性のベクトルがもたらされた。得られた非冗長性概念の集合を使用して、試料をクラスター化した。47個の細胞株及び183個のTCGA腫瘍試料の両方についての推論されたパスウェイ活性の行列を、Eisen社のClusterソフトウェアパッケージ バージョン3.0に実装される完全連結階層的凝集型クラスタリングを用いてクラスター化した45。非中心化ピアソン相関をパスウェイ概念の計量として使用し、試料計量にユークリッド距離を使用した。
(00289)乳房腫瘍に関して行われる全ゲノム遺伝子発現解析の先駆的研究から、最も顕著にエストロゲン受容体(ER)陰性基底細胞様サブグループ及びER陽性ルミナルサブグループに属する種々のサブクラスが同定されており(Perou,C.M.et al.,(2000),Molecular portraits of human breast tumours,406:747−752)、その臨床転帰には違いがある(14 Sorlie,T.et al.,(2001),Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications,98:10869−10874)。いくつかの分子サブタイプの存在はまた、DNAコピー数解析(2Russnes et al.(2007)上記)、DNAメチル化(Ronneberg et al.(2011)上記)及びmiRNA発現解析(Enerly et al.(2011)上記)によっても観察されている。しかしながら、問題は、分子解析によって様々な新しい分子レベルで得られたこれらの新しいプロファイルが、mRNA発現により当初見出されたサブクラスをどの範囲まで再現するか、及び臨床上重要な新規患者サブグループを同定するこれらの新しい分類の潜在力はどのようなものか?である。これらの問いに取り組むため、本発明者らは初めにMicMaデータセットの乳癌患者を、偏りのない教師なし方法を用いて、調査される各分子レベルによりクラスター化した(図23)。分子レベル毎の患者のクラスタリングのヒストグラムを個別に、及び患者サブグループ毎の生存KMプロットを、図23に示す。興味深いことに、このクラスタリング手順により、Pam50分類から導き出されるクラスターと高度に相関した7つのmRNA発現クラスターの同定がもたらされる。これはPam50と一致するが、ルミナルAクラスターはexp1−4 mRNAクラスターの間に、基底細胞及びERBB2は最後の3つ(exp5−7)のクラスターの間に分かれた。miRNAレベルでは、(Enerly et al.(2011)上記)に既に記載されるとおり、3つの異なるクラスターが得られた;メチル化レベルでは、記載されるとおりの3つの主クラスターと、はるかに小さい1つが認められ、第4のクラスターはRonneberg et al.(2011,上記)でも観察されたが、それ以上は考察されていない。CNAレベルでは6つの異なるクラスターが出現した。明らかに、あらゆるレベルで個別的な患者クラスターが特定の生存パターンと関連付けられた(図23)。次に、同じ患者が異なる分子レベルで対応するクラスターを形成したかどうかを評価した。実際、異なるレベルのクラスタリング間に、最も顕著にはDNAメチル化及びmRNA発現及びDNAコピー数の間に、良好な一致が大いにあった(表12)。しかしながら、試料によってはいかなるレベルでも常に共にクラスター化される一方で、他の試料は研究における特定の各分子終点に応じて異なる群にクラスター化される。
(00292)腫瘍表現型を説明し、かつ腫瘍を標的化治療され易いものにし得る個別の生物学的機能を、ゲノム変化がどのように妨害するかを理解するために、本発明者らはパスウェイレベルの摂動を理解する必要がある。PARADIGMは、遺伝子を単一のレベルで調べた場合には区別できない患者サブセットにおいて、一貫した活性パスウェイを同定する。この方法は、既知のパスウェイ構造に対して、確率的グラフィカルモデル(PGM)から統合機能ゲノミクスデータに至るまでの技術を用いる。これは既に、TCGA膠芽腫及び卵巣のデータセットからのコピー数及びmRNA発現のデータ解析に適用されている。PARADIGM解析はまた、DNAメチル化又はコピー数、mRNA及びmiRNA発現などの、複数のレベルでゲノム変化を関係付けるためにも用いることができ、従って個々の各試料における任意の数のオミクスデータ層を統合することができる。DNAメチル化及びmiRNA発現は、ここで観察された調節解除パスウェイに寄与し、かつMicMaコホートにおいて各々それ自体で乳癌の予後診断及び分子プロファイルに明確な寄与を有するように思われるが(図23)、本発明者らは、これらの2つの分子プロファイルタイプを追加することによるPARADIGMクラスターの予後診断値の向上は見出さなかった。これについての1つの説明は、miRNA及びDNAメチル化解析の予後診断値が、それらの高い相関からmRNA発現によって再現されるというものである。しかしながら、このように結論付けるには、例えば、解析プラットフォームの選択(メチル化についての限られたIllumina社の1505 CpG癌パネル)及び真のmiRNA標的についての本発明者らの限られた知識が、総合的に計測し、かつmiRNA及びDNAメチル化情報を有効にモデル化する本発明者らの能力を制限する要因となり得るかどうかに関して、更なる分析を要する。
pdgm.1=高FOXM1、高免疫シグナル伝達、
pdgm.2=高FOXM1、低免疫シグナル伝達、マクロファージ優勢、
pdgm.3=低FOXM1、低免疫シグナル伝達、
pdgm.4=高ERBB4、低アンギオポエチンシグナル伝達、
pdgm.5=高FOXM1、低マクロファージサイン。
FOXM1転写
(00297)FOXM1は、細胞周期進行の主要調節因子であり、その内因性FOXM1発現は細胞周期の相に従い振動する。ヒト癌原遺伝子として確認されたFOXM1は、肝癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸癌、膵癌、脳癌並びに最も一般的なヒト癌の基底細胞癌を含め、ヒト固形癌の大多数で上方制御されることが分かっている。FOXM1は、細胞周期及び染色体/ゲノム維持におけるその複数の役割によって腫瘍形成を促進すると考えられている(Wonsey,D.R.and Follettie,M.T.,(2005),Loss of the forkhead transcription factor FoxM1 causes centrosome amplification and mitotic catastrophe,65:5181−5189)。初代ヒト皮膚角化細胞におけるFOXM1の異常な上方制御は、ヘテロ接合性の喪失(LOH)及びコピー数異常の形でのゲノム不安定性を直接誘導し得る。(Teh M,Gemenetzidis E,Chaplin T,Young BD,Philpott MP.Upregulation of FOXM1 induces genomic instability in human epidermal keratinocytes.Mol.Cancer 2010;9:45)。最近の報告では、成人ヒト上皮幹細胞におけるFOXM1の異常な上方制御は、3D器官型組織再生系において前癌表現型−ヒト過形成と同様の状態−を誘導することが示された(Gemenetzidis,E.et al.,(2010),Induction of human epithelial stem/progenitor expansion by FOXM1,70:9515−952)。この著者らは、FOXM1の過剰発現は、分化経路に干渉し、それにより前駆細胞コンパートメントを拡大することによって幹細胞の固有の自己再生増殖能を利用することを示した。従って、FOXM1は幹細胞/前駆細胞の増殖によって癌の発生を誘導するという仮説が立てられた。本発明者らは、主にインターロイキンシグナル伝達活性に従い分けられた、このパスウェイの高い活性及び低い活性を有する2つの乳癌患者群を明らかに認めている。図26は、クラスターpdgm3(最良の予後)についての、このパスウェイの逆の活性化の仕方を示し(活性化されたとき赤色、対して不活性化されたとき青色)、これはより不良な生存及びそれに寄与する分子レベル(図の形に従いmRNA、CNA、miRNA又はDNAメチル化)を伴うその他のクラスターとは対照的である。pdgm3におけるMMP2の下方制御はDNAメチル化による一方、その他の腫瘍ではDNA欠失によることが分かる。miRNAの中で、has−let7−bはpgm3において上方制御され、その他では下方制御され、その標的のAURKBと相補的であった。DNA増幅及びmRNA発現の両方は発現の調節解除の原因と見られた。
(00298)Angファミリーは、ヒト癌の発症及び成長の間の血管新生において重要な役割を果たす。Ang2の血管新生における役割は、概してAng1の拮抗体であって、血管成熟及び安定化に重要な、Ang1促進性のTie2シグナル伝達を阻害すると考えられる(23)。Ang2は、別の重要な血管新生因子である血管内皮増殖因子A(VEGFA)と共に、協働的に血管新生を調整する(Hashizume,H.et al.,(2010),Complementary actions of inhibitors of angiopoietin−2 and VEGF on tumor angiogenesis and growth,70:2213−2223)。新しいデータは、ヒト癌が進行する間の浸潤性表現型の癌細胞の血管新生におけるAng2のより複雑な役割を示唆する。特定のアンギオポエチン(Ang)ファミリーメンバーはTie1を活性化することができ、例えばAng1は内皮細胞においてTie1リン酸化を誘導する(2 Yuan,H.T.et al.,(2007),Activation of the orphan endothelial receptor Tie1 modifies Tie2−mediated intracellular signaling and cell survival,21:3171−3183)。しかしながら、Tie2が内皮細胞において下方制御されるとき、Ang1はTie1リン酸化を誘導できず、及びAng1が存在しない場合に、Tie1リン酸化は構成的に活性な形態のTie2又はTie2作動性抗体のいずれかにより誘導されるため、Tie1リン酸化はTie2依存性である(25 Yuan et al.(2007)上記)。Ang1媒介性AKT及び42/44MAPKリン酸化は主にTie2媒介性であり、Tie1はこのパスウェイを下方制御する。従ってTie1の主な役割は、Tie2駆動性のシグナル伝達を下方制御するその能力及び内皮生存により、血管形態形成を調整することである。両方のTie2媒介性シグナル伝達並びにVEGFR1及び2媒介性シグナル伝達及び特異的シグナルが、このデータセットにおいて観察された。
(00299)ERBB4は、乳房形態形成における増殖及び細胞運動並びにErbb4を発現する乳房原始上皮の方向性のある細胞運動に寄与する一方で、乳房細胞運命を促進する。Nrg3/Erbb4シグナル伝達の候補エフェクターは同定されており、ここでは初期の乳腺発生及び癌に関連する他のシグナル伝達パスウェイと相互作用することが示されている。ErbB4の生体内での主要な機能の1つは、妊娠及び泌乳誘導中の乳腺の成熟にある。妊娠及び長期の泌乳期間は乳癌リスクの低下と関連付けられており、従って腫瘍抑制におけるErbB4の役割は、泌乳におけるその役割と結び付けられ得る。ほとんどの報告は、思春期に他のErbBファミリーメンバーにより引き起こされる成長刺激を反転させることにおけるErbB4の役割と一致するが、しかしながらERBB4発現との生存の有意な関連性は確認されていない(Sundvall,M.et al.,(2008),Role of ErbB4 in breast cancer,13:259−268)。
(00300)マウスモデルでの前癌性過形成腺における免疫応答の関与を考慮して(Ursini−Siegel,J.et al.,(2010),Receptor tyrosine kinase signaling favors a protumorigenic state in breast cancer cells by inhibiting the adaptive immune response,70:7776−7787)、本発明者らは、DCISケースから構成される既に発表されたデータセットを分析し、浸潤性腫瘍で観察される強い免疫応答及びインターロイキンシグナル伝達が前癌期においても同様に存在するかどうかを見出した。非浸潤性乳管癌(DCIS)は非浸潤型の乳癌であり、一部の病変は急激に浸潤性乳管癌(IDC)に移行する一方、他の病変は変化しないままであると考えられている。本発明者らは、以前に、31例の純粋なDCIS、36例の純粋な浸潤癌及び42症例の混合診断(浸潤癌で非浸潤性要素を伴うもの)の遺伝子発現パターンを研究し(Muggerud et al.(2010)上記)、組織学的悪性度が高いDCIS間でのトランスクリプトームの多様性を観測して、進行性腫瘍により類似した遺伝子発現特徴を有する個別的なDCISサブグループを同定している。このコホート全体(IDC及びILCを含む)についてのPARADIGM結果のヒートマップは図25C、及び純粋なDCIS試料についてのヒートマップは図25D。いずれの純粋なDCIS腫瘍も、高マクロファージ活性に典型的なシグナル伝達によって特徴付けられるprgm2型ではなかった(図25)。それと一致して、実験的研究から、原発性乳腺腺癌におけるマクロファージは、その血管新生促進特性の結果として後期発癌を調節するとともに(Lin,E.Y.and Pollard,J.W.,(2007),Tumor−associated macrophages press the angiogenic switch in breast cancer,67:5064−5066;Lin,E.Y.et al.,(2007),Vascular endothelial growth factor restores delayed tumor progression in tumors depleted of macrophages,1:288−302)、悪性乳房上皮細胞に上皮成長因子(EGF)を提供することにより肺転移を助長することが実証されている。ここでも、DCISにおいてPARDIGM解析により同定された上位の調節解除パスウェイには、IL2、4、6、12、23、及び23シグナル伝達に関与するものがあった。
(00303)本解析は、約110例の乳癌から収集したデータに適用し、mRNA発現はAgilent社の全ヒトゲノム4×44K 1色法オリゴアレイにより解析した。コピー数変化(CNA)は、Illumina社のHuman−1 109K BeadChipを使用して解析した。このSNPアレイは遺伝子中心的であり、平均物理距離が30kbのゲノム全体を網羅するマーカーを含み、かつ15,969個の固有の遺伝子を表す(2004年5月構築、hg17、NCBI Build 35)。各試料を全ゲノム増幅に供した。BeadStudio(v.2.0、Illumina社)を使用して、dbSNP(build 125)の順方向の対立遺伝子の向きを参照して遺伝子型レポート及びlogR値を抽出し、CNAについてlogR値を調整した。
(00307)
R バージョン2.12上で動くHOPACH Rインプリメンテーション バージョン2.10(37)を使用して、クラスターを導き出した。全てのデータ型で相関距離計量を使用し、但しParadigm IPLは例外で、非正規分布、かつゼロ値が見られたため、cosangleを使用した。5サンプル未満を含む任意のサンプルクラスターについては、各サンプルを、より大きいクラスター中の最も類似するサンプルと同じクラスターにマッピングした。MicMaデータセットのParadigmクラスターは、MicMaデータセットにおける各クラスターのメドイド(mediod)(中央値関数を使用)を決定し、次に別のデータセットの各サンプルを、cosangle距離により最も近かったいずれかのクラスターメドイド(mediod)に割り当てることにより、他のデータ型にマッピングした。
(00309)コピー数及び発現データの両方をPARADIGM推論に組み込んだ。8個の正常組織対照の集合が発現データにおける解析に利用可能であったため、患者の遺伝子値の各々を、正常な卵管対照で観察される遺伝子の中央値レベルを減じることにより正規化した。コピー数データは、腫瘍で検出された遺伝子レベルと、それに対する血液正常レベルとの間のコピー数の差異を反映するように正規化した。PARADIGMへの入力のために、発現データは、サブタイプ解析に使用したものと同じ統合データセットから取り、コピー数は、MSKCC Agilent社の1Mコピー数データのセグメント化コールから取った。
(00311)本発明者らは、コピー数、遺伝子発現、及び各エンティティのパスウェイ文脈を反映する統合パスウェイ活性(IPA)を割り当てるPARADIGMを使用した。
(00313)FOXM1ネットワーク内の全ての遺伝子を使用してランダムシミュレーションの間に統計的有意性を評価したが、FOXM1パスウェイの視覚化を可能とするため、図29により有意に変化したIPAを有するFOXM1に直接連結されたエンティティを、図27に含めるために選択した。これらのうち、DNA修復及び細胞周期制御において役割を有する遺伝子であって、FOXM1との相互作用について文献の裏付けがあると認められたものを表示した。元のNCI−PIDパスウェイに見出されなかったBRCC複合体メンバーを、NCI−PIDによればFOXM1の標的であるBRCA2と共にプロットに含めた。上流DNA修復標的を、他のNCIパスウェイにおけるCHEK2の上流直接因子を見つけることにより同定した(例えば、PLK3シグナル伝達パスウェイにおいてATMからの間接的リンクが見出された)。
(00314)活性及び非活性の確率の変化を直接的に表す推論活性の使用により、様々な種類のエンティティをまとめて1つのヒートマップにクラスター化することが可能となる。PARADIGM推論の結果を包括的に視覚化するため、Eisen Cluster 3.0を使用して特徴フィルタリング及びクラスタリングを実施した。0.1の標準偏差フィルタリングにより7204個中1598個のパスウェイエンティティが残り、エンティティ及び試料の両方に対して平均連結法、非中心化相関階層的クラスターを実施した。
(00315)血液試料(2−3ml)を患者から採取し、使用時まで、EDTAを含有する試験管に−80℃で保存する。この血液試料から、DNA単離キット(PUREGENE,Gentra Systems社、ミネソタ州ミネアポリス)を使用して製造者の指示に従いゲノムDNAを抽出する。DNA純度は、ベックマン分光光度計で計測した260nm及び280nmにおける吸光度の比(1cm光路;A260/A280)として計測される。
(00316)患者のDNA試料からの遺伝子領域は、PCRにより、その領域用に特別に設計されたプライマーを使用して増幅する。PCR産物は、上記に開示されるとおりの当業者に周知の方法を用いて配列決定する。配列トレースで同定されるSNPを、Phred/Phrap/Consedソフトウェアを使用して検証し、NCBI SNPデータバンクに寄託されている既知のSNPと比較する。
(00317)値は平均値±SDとして表現される。χ2分析(Web Chi Square Calculator,Georgetown Linguistics,Georgetown University,ワシントンD.C.)を使用して、正常な対象と障害を有する患者とにおける遺伝子型頻度間の差異を評価する。事後解析を伴う一元配置ANOVAを示されるとおり実施して、異なる患者群間の血行動態を比較する。
検証済みの突然変異は、独立したアッセイで確認されたものである。その多くは、同じ腫瘍由来の第2の独立したWGA試料を使用して検証される。未検証の突然変異では、独立した確認はまだ行われていないが、真の突然変異である尤度が高い。手計算により、TP53において更なる25個の突然変異が認められた。
Claims (20)
- 患者特有の細胞パスウェイ活性推論コンピュータシステムであって、
患者から、遺伝子表現レベルを含む患者組織試料の計測属性を記憶し、ソフトウェア命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と、
前記非一時的なコンピュータ可読記憶媒体に連結され、前記ソフトウェア命令を実行することで分析エンジンとして機能するように構成された少なくとも1つのプロセッサと
を含み、
前記分析エンジンは、
前記患者組織試料における細胞の細胞プロセスのパスウェイネットワークを表した確率的パスウェイモデルであって、前記計測属性と少なくとも1つの仮の属性とを統合した確率的パスウェイモデルをパスウェイモデルデータベースから獲得し、
前記確率的パスウェイモデルに含まれる前記患者組織試料の前記計測属性を検索することで、転写因子を含む前記少なくとも1つの仮の属性を推定し、
前記確率的パスウェイモデルに基づく前記患者組織試料及び前記転写因子を含む前記推定された少なくとも1つの仮の属性に対する統合パスウェイ活性を生成し、
ディスプレイを介して、前記患者組織試料に対する前記統合パスウェイ活性と他の患者に関連する第2の統合パスウェイ活性との間のパスウェイ差異を表示する
ように構成されたシステム。 - 前記確率的パスウェイモデルは、前記計測属性の1つとして前記遺伝子表現レベルを統合する、
請求項1に記載のシステム。 - 前記確率的パスウェイモデルは、前記細胞プロセスの前記パスウェイネットワークを表す因子グラフの実装を含む、
請求項1に記載のシステム。 - 前記患者組織試料に対する前記統合パスウェイ活性と前記第2の統合パスウェイ活性との間の前記パスウェイ差異は、前記患者に対する臨床転帰を予測するために用いられる、
請求項1に記載のシステム。 - 前記確率的パスウェイモデルは、前記細胞プロセスの前記パスウェイネットワーク内のキュレーションされたパスウェイを表す、
請求項1に記載のシステム。 - 前記分析エンジンは、パスウェイ相互作用データベースから前記キュレーションされたパスウェイを得るように更に構成された、
請求項5に記載のシステム。 - 前記キュレーションされたパスウェイは、内因性及び外因性の細胞以下レベル、細胞レベル、組織レベル、又は生物体レベルのイベント及び表現型を表す高次の生体分子過程の周辺で論理的にグループ化された相互作用の集合を表す内因性エンティティを含む、
請求項5に記載のシステム。 - 前記分析エンジンは、前記内因性エンティティに、活性レベルを表現する数値状態を割り当てるように更に構成された、
請求項7に記載のシステム。 - 前記活性レベルは、活性化された状態、基準活性状態、非活性化された状態のうち1つの状態を表す、
請求項8に記載のシステム。 - 前記確率的パスウェイモデルに統合された前記計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及びタンパク質相互作用のうち少なくとも1つを含む、
請求項1に記載のシステム。 - 前記確率的パスウェイモデルに統合された前記少なくとも1つの仮の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、翻訳レベル、及びタンパク質活性のうち少なくとも1つを含む、
請求項1に記載のシステム。 - 前記確率的パスウェイモデルは、mRNA、CNA、miRNA及びDNAメチル化のうち1つ以上を統合する、
請求項1に記載のシステム。 - 前記確率的パスウェイモデルは、前記パスウェイネットワークとして転写因子パスウェイネットワークを表す、
請求項1に記載のシステム。 - 前記転写因子パスウェイネットワークは、FOXM1転写因子ネットワーク、HIF−1アルファ転写因子ネットワーク、HIF−2アルファ転写因子ネットワーク、FOXA2転写因子ネットワーク、及びFOXA3転写因子ネットワークのうち少なくとも1つを含む、
請求項13に記載のシステム。 - 前記パスウェイ差異は、上方制御された遺伝子活性を示す、
請求項1に記載のシステム。 - 前記パスウェイ差異は、下方制御された遺伝子活性を示す、
請求項1に記載のシステム。 - 前記パスウェイ差異は、腫瘍組織及び健康な組織に関する、
請求項1に記載のシステム。 - 前記パスウェイ差異は、患者間の示差的な薬物応答に関する、
請求項1に記載のシステム。 - 前記パスウェイ差異は、予後診断に関する、
請求項1に記載のシステム。 - 前記パスウェイ差異は、標準的なインターロイキンシグナル伝達からの偏差に関する、
請求項1に記載のシステム。
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