JP6854792B2 - ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズム（ｐａｒａｄｉｇｍ） - Google Patents

ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズム（ｐａｒａｄｉｇｍ） Download PDF

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Description

他の出願との関係
本出願は、２０１１年１０月２６日に出願された「ＰＡＴＨＷＡＹ ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭ ＵＳＩＮＧ ＤＡＴＡ ＩＮＴＥＧＲＡＴＩＯＮ ＯＮ ＧＥＮＯＭＩＣ ＭＯＤＥＬＳ（ＰＡＲＡＤＩＧＭ）」と題される米国仮特許出願第１３／３１７，７６９号明細書に関連するとともにその優先権を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、一部において、以下の米国連邦機関からの資金を用いて行われた：ＮＳＦ ＣＡＲＥＥＲ賞第０８４５７８３号、米国国立癌研究所契約／助成金番号第５Ｒ２１ＣＡ１３５９３７−０２号及び第１Ｕ２４ＣＡ１４３８５８−０１号、並びに米国国立保健研究所訓練助成金番号第Ｔ３２ ＧＭ０７０３８６−０１号。米国連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の技術分野
（００１）本発明は、個体又は対象における生物学的パスウェイの構成要素を同定し、その個体又は対象が臨床レジメン又は治療に対する候補かどうかを決定する方法に関する。本発明はまた、対象が癌、自己免疫疾患、細胞周期障害、又は他の障害に罹りやすいかどうかを診断するために該方法を用いることにも関する。
（００２）現代の癌治療では、診断時に集められた関連臨床情報（例えば、患者病歴、腫瘍組織学及び病期）並びに続く臨床経過観察データ（例えば、治療レジメン及び疾患再発事象）と共に、腫瘍のゲノム、転写及びエピゲノムの特徴に基づき癌を層別化することで、患者の診断、予後診断、リスク評価、及び治療反応予測を向上させ得ることを主な前提としている。
（００３）癌の分子詳細を探るためのいくつかのハイスループット技術が利用可能になっているものの、このパラダイムに基づいて実現された成功例はほんの一握りである。例えば、ＥＲＢＢ２成長因子受容体チロシンキナーゼの特定の増幅又は過剰発現を呈する乳癌患者の２５％は、現在、この受容体を標的とするモノクローナル抗体であるトラスツズマブで治療することができる（Ｖｏｇｅｌ Ｃ，Ｃｏｂｌｅｉｇｈ ＭＡ，Ｔｒｉｐａｔｈｙ Ｄ，Ｇｕｔｈｅｉｌ ＪＣ，Ｈａｒｒｉｓ ＬＮ，Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ Ｌ，Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ，Ｍｕｒｐｈｙ Ｍ，Ｎｏｖｏｔｎｙ ＷＦ，Ｂｕｒｃｈｍｏｒｅ Ｍ，Ｓｈａｋ Ｓ，Ｓｔｅｗａｒｔ ＳＪ．Ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ，ｓｉｎｇｌｅ−ａｇｅｎｔ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００１ Ｊａｎ．；３７ Ｓｕｐｐｌ １：２５−２９）。
（００４）しかしながら、この成功談でさえ、トラスツズマブから実際に何らかの治療利益を得るのはＥＲＢＢ２陽性乳癌患者の５０％未満であるという事実により陰りを帯び、これは、この十分な研究がなされた発癌パスウェイ及びＥＲＢＢ２陽性乳癌に固有の多くの治療耐性機構について、我々の理解が不完全であることを強調するものである（Ｐａｒｋ ＪＷ，Ｎｅｖｅ ＲＭ，Ｓｚｏｌｌｏｓｉ Ｊ，Ｂｅｎｚ ＣＣ．Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｉｅｓ ｏｆ ＨＥＲ２．Ｃｌｉｎ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ２００８ Ｏｃｔ．；８（５）：３９２−４０１．）。
（００５）基礎癌生物学において現代進歩の解釈のこの全体的な失敗は、一部には、現在実質的にいかなる種類の癌に関しても技術的に入手可能なオミクス的特徴の全てを総合的に体系化し、かつ統合する我々の能力の無さに起因する。組織学的に類似している癌は、実際にはそれぞれ臨床的挙動が著しく異なる多数の分子サブタイプの複合体であるという確かな証拠があるにもかかわらず、予後診断及び治療の選択肢と十分に相関する確固たる痕跡がないため、この知識は実際面で適用されることはほとんどない。
（００６）癌は、細胞系の調節不能を引き起こす異常な変化と関連付けられるゲノム疾患である。明らかでない点は、どのようにゲノムの変化が癌表現型の根底にある遺伝的パスウェイに絡むのかである。ハイスループット機能ゲノミクス研究は、過去十年間で著しい進歩を遂げている（Ａｌｉｚａｄｅｈ ＡＡ，Ｅｉｓｅｎ ＭＢ，Ｄａｖｉｓ ＲＥ，Ｍａ Ｃ，Ｌｏｓｓｏｓ ＩＳ，Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ Ａ，Ｂｏｌｄｒｉｃｋ ＪＣ，Ｓａｂｅｔ Ｈ，Ｔｒａｎ Ｔ，Ｙｕ Ｘ，Ｐｏｗｅｌｌ ＪＩ，Ｙａｎｇ Ｌ，Ｍａｒｔｉ ＧＥ，Ｍｏｏｒｅ Ｔ，Ｈｕｄｓｏｎ Ｊ，Ｌｕ Ｌ，Ｌｅｗｉｓ ＤＢ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ Ｒ，ＳＨＥＲＬＯＣＫ Ｇ，Ｃｈａｎ ＷＣ，Ｇｒｅｉｎｅｒ ＴＣ，Ｗｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ ＤＤ，Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ，Ｗａｒｎｋｅ Ｒ，Ｌｅｖｙ Ｒ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｗ，Ｇｒｅｖｅｒ ＭＲ，Ｂｙｒｄ ＪＣ，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｂｒｏｗｎ ＰＯ，Ｓｔａｕｄｔ ＬＭ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ２０００ Ｆｅｂ．；４０３（６７６９）：５０３−５１１．；Ｇｏｌｕｂ ＴＲ，Ｓｌｏｎｉｍ ＤＫ，Ｔａｍａｙｏ Ｐ，Ｈｕａｒｄ Ｃ，Ｇａａｓｅｎｂｅｅｋ Ｍ，Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ，Ｃｏｌｌｅｒ Ｈ，Ｌｏｈ ＭＬ，Ｄｏｗｎｉｎｇ ＪＲ，Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ ＭＡ，Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ ＣＤ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｃｌａｓｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃｌａｓｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ Ｏｃｔ．；２８６（５４３９）：５３１−５３７．；ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ ＭＪ，Ｈｅ ＹＤ，ｖａｎ ｔ Ｖｅｅｒ ＬＪ，Ｄａｉ Ｈ，Ｈａｒｔ ＡＡＭ，Ｖｏｓｋｕｉｌ ＤＷ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ＧＪ，Ｐｅｔｅｒｓｅ ＪＬ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｃ，Ｍａｒｔｏｎ ＭＪ，Ｐａｒｒｉｓｈ Ｍ，Ａｔｓｍａ Ｄ，Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ Ａ，Ｇｌａｓ Ａ，Ｄｅｌａｈａｙｅ Ｌ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅ Ｔ，Ｂａｒｔｅｌｉｎｋ Ｈ，Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ Ｓ，Ｒｕｔｇｅｒｓ ＥＴ，Ｆｒｉｅｎｄ ＳＨ，Ｂｅｒｎａｒｄｓ Ｒ．Ａ Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓ ａ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２ Ｄｅｃ．；３４７（２５）：１９９９−２００９．）。
（００７）しかしながら、複数のデータソースを統合して腫瘍の発生及び進行の再現可能かつ解釈可能な分子サインを同定するという課題は、依然として捉え所がないままである。ＴＣＧＡなどによる最近のパイロット研究は、癌細胞で観察される変化を理解するために、パスウェイレベルでゲノム摂動を理解する必要があることを明確に示している。このような知見から、患者が異なる遺伝子におけるゲノム変化又は異常発現を有する場合であっても、これらの遺伝子は多くの場合、共通のパスウェイに関与していることが実証されている。加えて、及び更に特筆すべきは、これらの観察される変化（例えば、欠失対増幅）は、多くの場合、全てがパスウェイ活性を高めるか、又は全てがパスウェイ活性を減少させるかのいずれかで、パスウェイ出力を同じ方向に変化させる（Ｐａｒｓｏｎｓ ＤＷ，Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｌｉｎ ＪＣＨ，Ｌｅａｒｙ ＲＪ，Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ Ｐ，Ｍａｎｋｏｏ Ｐ，Ｃａｒｔｅｒ Ｈ，Ｓｉｕ Ｉ，Ｇａｌｌｉａ ＧＬ，Ｏｌｉｖｉ Ａ，ＭｃＬｅｎｄｏｎ Ｒ，Ｒａｓｈｅｅｄ ＢＡ，Ｋｅｉｒ Ｓ，Ｎｉｋｏｌｓｋａｙａ Ｔ，Ｎｉｋｏｌｓｋｙ Ｙ，Ｂｕｓａｍ ＤＡ，Ｔｅｋｌｅａｂ Ｈ，Ｄｉａｚ ＬＡ，Ｈａｒｔｉｇａｎ Ｊ，Ｓｍｉｔｈ ＤＲ，Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ＲＬ，Ｍａｒｉｅ ＳＫＮ，Ｓｈｉｎｊｏ ＳＭＯ，Ｙａｎ Ｈ，Ｒｉｇｇｉｎｓ ＧＪ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ，Ｋａｒｃｈｉｎ Ｒ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ，Ｐａｒｍｉｇｉａｎｉ Ｇ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ＶＥ，Ｋｉｎｚｌｅｒ ＫＷ．Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８ Ｓｅｐ．；３２１（５８９７）：１８０７−１８１２．；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｏｒｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８ Ｏｃｔ．；４５５（７２１６）：１０６１−１０６８を参照のこと）。
（００８）ゲノムワイドの癌データを解釈する手法では、特定の表現型又は疾患状態と高度に相関する遺伝子発現プロファイルを特定することに重点が置かれており、有望な結果をもたらしている。分散分析、偽発見、及びノンパラメトリック法を用いる方法が提案されている。（Ｔｒｏｙａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００２を参照のこと）が提案されている。Ａｌｌｉｓｏｎ ＤＢ，Ｃｕｉ Ｘ，Ｐａｇｅ ＧＰ，Ｓａｂｒｉｐｏｕｒ Ｍ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｆｒｏｍ ｄｉｓａｒｒａｙ ｔｏ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２００６ Ｊａｎ．；７（１）：５５−６５．；Ｄｕｄｏｉｔ Ｓ，Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ Ｊ．Ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ ａ ｄａｔａｓｅｔ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２００２ Ｊｕｎ．；３（７）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３６−ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３６．２１．；Ｔｕｓｈｅｒ ＶＧ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ Ｒ，Ｃｈｕ Ｇ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００１ Ａｐｒ．；９８（９）：５１１６−５１２１；Ｋｅｒｒ ＭＫ，Ｍａｒｔｉｎ Ｍ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ ＧＡ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２０００；７（６）：８１９−８３７；Ｓｔｏｒｅｙ ＪＤ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３ Ａｕｇ．；１００（１６）：９４４０−９４４５；及びＴｒｏｙａｎｓｋａｙａ ＯＧ，Ｇａｒｂｅｒ ＭＥ，Ｂｒｏｗｎ ＰＯ，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ，Ａｌｔｍａｎ ＲＢ．Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００２ Ｎｏｖ．；１８（１１）：１４５４−１４６１．）。
（００９）いくつかのパスウェイレベルの手法は、遺伝子集合の過剰出現に基づく統計的検定を用いて、パスウェイが疾患状態で摂動を受けるかどうかを検出する。これらの手法では、遺伝子は、例えば示差的発現又はコピー数の変化のいずれかにより検出されるときの、その示差的活性の程度に基づき順位付けされる。次に、遺伝子集合濃縮解析（ＧＳＥＡ）において用いられるように、パスウェイの遺伝子が並べ替えたリストの最端部にどの程度近い順位に位置するかを反映する確率スコアが割り当てられる（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ，Ｔａｍａｙｏ Ｐ，Ｍｏｏｔｈａ ＶＫ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｅｂｅｒｔ ＢＬ，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ ＭＡ，Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ Ａ，Ｐｏｍｅｒｏｙ ＳＬ，Ｇｏｌｕｂ ＴＲ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ，Ｍｅｓｉｒｏｖ ＪＰ．Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５ Ｏｃｔ．；１０２（４３）：１５５４５−１５５５０．）。他の手法としては、遺伝子オントロジーを同定するための超幾何検定に基づく方法（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ Ｍ，Ｂａｌｌ ＣＡ，Ｂｌａｋｅ ＪＡ，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｂｕｔｌｅｒ Ｈ，Ｃｈｅｒｒｙ ＪＭ，Ｄａｖｉｓ ＡＰ，Ｄｏｌｉｎｓｋｉ Ｋ，Ｄｗｉｇｈｔ ＳＳ，Ｅｐｐｉｇ ＪＴ，Ｈａｒｒｉｓ ＭＡ，Ｈｉｌｌ ＤＰ，Ｉｓｓｅｌ−Ｔａｒｖｅｒ Ｌ，Ｋａｓａｒｓｋｉｓ Ａ，Ｌｅｗｉｓ Ｓ，Ｍａｔｅｓｅ ＪＣ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＥ，Ｒｉｎｇｗａｌｄ Ｍ，Ｒｕｂｉｎ ＧＭ，ＳＨＥＲＬＯＣＫ Ｇ．Ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０００ Ｍａｙ；２５（１）：２５−２９．）又はＭＩＰＳ哺乳動物タンパク質間相互作用（Ｐａｇｅｌ Ｐ，Ｋｏｖａｃ Ｓ，Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｄ Ｍ，Ｂｒａｕｎｅｒ Ｂ，Ｄｕｎｇｅｒ−Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ Ｉ，Ｆｒｉｓｈｍａｎ Ｇ，Ｍｏｎｔｒｏｎｅ Ｃ，Ｍａｒｋ Ｐ，Ｓｔｕｅｍｐｆｌｅｎ Ｖ，Ｍｅｗｅｓ Ｈ，Ｒｕｅｐｐ Ａ，Ｆｒｉｓｈｍａｎ Ｄ．Ｔｈｅ ＭＩＰＳ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００５ Ｍａｒ．；２１（６）：８３２−８３４．）示差的に発現した遺伝子において濃縮されたカテゴリー（Ｔａｍａｙｏ Ｐ，Ｓｌｏｎｉｍ Ｄ，Ｍｅｓｉｒｏｖ Ｊ，Ｚｈｕ Ｑ，Ｋｉｔａｒｅｅｗａｎ Ｓ，Ｄｍｉｔｒｏｖｓｋｙ Ｅ，Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ，Ｇｏｌｕｂ ＴＲ．Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｍａｐｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９ Ｍａｒ．；９６（６）：２９０７−２９１２．）を用いることが挙げられる。
（００１０）過剰出現分析は、パスウェイ関連性についての検出シグナルを増加させ得るパスウェイにおける遺伝子間の既知の相互依存性を組み込まないため、その有効性が限られている。加えて、過剰出現分析は全ての遺伝子変化を等しいものとして扱い、それは多くの生体系にとって妥当でないと思われる。
（００１１）問題を更に複雑にしているのは、多くの遺伝子（例えば、マイクロＲＮＡ）は多面的であり、いくつかのパスウェイにおいて異なる役割で作用するという事実である（Ｍａｄｄｉｋａ Ｓ，Ａｎｄｅ ＳＲ，Ｐａｎｉｇｒａｈｉ Ｓ，Ｐａｒａｎｊｏｔｈｙ Ｔ，Ｗｅｇｌａｒｃｚｙｋ Ｋ，Ｚｕｓｅ Ａ，Ｅｓｈｒａｇｈｉ Ｍ，Ｍａｎｄａ ＫＤ，Ｗｉｅｃｈｅｃ Ｅ，Ｌｏｓ Ｍ．Ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｒｅ ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｅｄ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．２００７ Ｊａｎ．；１０（１−２）：１３−２９）。これらの要因から、過剰出現分析では、多くの場合、境界域にある示差的活性を有する遺伝子を含む機能的に関連性のあるパスウェイが見落とされる。過剰出現分析ではまた、小さなパスウェイにおいて単一の遺伝子のみが著しく変化する場合に、多くの偽陽性が生じ得る。遺伝子間の詳細な相互作用及び遺伝子の表現型の結果に関する我々の全体的な知識は、急速に増えている。
（００１２）知識は従来、文献を通じて散在し、系統的に利用することが困難であったが、新たな取り組みにより、パスウェイ知識が公的に利用可能なデータベースに目録化されている。パスウェイトポロジーを含む一部のデータベースには、Ｒｅａｃｔｏｍｅ（Ｊｏｓｈｉ−Ｔｏｐｅ Ｇ，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ Ｍ，Ｖａｓｔｒｉｋ Ｉ，Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ Ｐ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｅ，ｄｅ Ｂｏｎｏ Ｂ，Ｊａｓｓａｌ Ｂ，Ｇｏｐｉｎａｔｈ ＧＲ，Ｗｕ ＧＲ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ Ｌ，Ｌｅｗｉｓ Ｓ，Ｂｉｒｎｅｙ Ｅ，Ｓｔｅｉｎ Ｌ．Ｒｅａｃｔｏｍｅ：ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎ．；３３（データベース版）：Ｄ４２８−３２；Ｏｇａｔａ Ｈ，Ｇｏｔｏ Ｓ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｆｕｊｉｂｕｃｈｉ Ｗ，Ｂｏｎｏ Ｈ，Ｋａｎｅｈｉｓａ Ｍ．ＫＥＧＧ：Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９ Ｊａｎ．；２７（１）：２９−３４．））及びＮＣＩパスウェイ相互作用データベース（Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）がある。これらのデータベースの更新では、遺伝子がどのように互いに調節及び情報交換し合うのかを明確に符号化することにより、生物系についての我々の理解を向上させるはずである。重要な前提は、これらのパスウェイの相互作用トポロジーはハイスループットデータセットを解釈する目的で利用することができるということである。
（００１３）最近まで、ハイスループットデータセットを解釈するためにパスウェイ知識を組み込むための利用可能な計算論的手法はほとんどなかった。しかしながら、パスウェイトポロジーを組み込むいくつかの最新の手法が提案されている（Ｅｆｒｏｎｉ Ｓ，Ｓｃｈａｅｆｅｒ ＣＦ，Ｂｕｅｔｏｗ ＫＨ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２００７；２（５）：ｅ４２５．）。シグナル伝達パスウェイ影響解析（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｍｐａｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＳＰＩＡ））と称される１つの手法は、ＧｏｏｇｌｅのＰａｇｅＲａｎｋと類似した方法を用いてパスウェイにおける遺伝子の影響を決定する（Ｔａｒｃａ ＡＬ，Ｄｒａｇｈｉｃｉ Ｓ，Ｋｈａｔｒｉ Ｐ，Ｈａｓｓａｎ ＳＳ，Ｍｉｔｔａｌ Ｐ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｋｉｍ ＣＪ，Ｋｕｓａｎｏｖｉｃ ＪＰ，Ｒｏｍｅｒｏ Ｒ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｍｐａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９ Ｊａｎ．；２５（１）：７５−８２．）。ＳＰＩＡでは、他の多くの遺伝子にリンクが出る遺伝子に対してより大きな影響が置かれている。ＳＰＩＡは種々の癌データセット（肺腺癌及び乳癌）への適用に成功し、これらの癌に関与することが知られているパスウェイを同定することについて、過剰出現分析及び遺伝子集合濃縮分析より優れていることが示された。ＳＰＩＡは、パスウェイトポロジーを用いた癌データセットの解釈における大きな前進を示す一方で、一種類のみのゲノムワイドデータの使用に限られている。
（００１４）コピー数、ＤＮＡメチル化、体細胞突然変異、ｍＲＮＡ発現及びマイクロＲＮＡ発現などの複数のゲノム変化を関係付けるために、新たな計算論的手法が必要とされている。単一のデータソースは単独では全体像を提供しそうにないため、統合パスウェイ解析は多量の観測結果セットの因果解釈における精度及び感度を高めることが予想される。
（００１５）ここ数年間で、複数レベルの観測に適合する因果ネットワークを学習するための確率的グラフィカルモデル（ＰＧＭ）における手法が開発された。効率的なアルゴリズムは、データからパスウェイを自動的に学習するために利用可能であり（Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｎ，Ｇｏｌｄｓｚｍｉｄｔ Ｍ．（１９９７）Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｕｐｄａｔｅ ｏｆ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｉｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（ＵＡＩ’９７），Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｐｐ．１６５−１７４；Ｍｕｒｐｈｙ Ｋ，Ｗｅｉｓｓ Ｙ．Ｌｏｏｐｙ ｂｅｌｉｅｆ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ：Ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｉｎ ＡＩ．１９９９）、遺伝子ネットワーク推論の問題によく適合している（Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｎ．Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４ Ｆｅｂ．；３０３（５６５９）：７９９−８０５．）。例として、グラフィカルモデルは、癌生物学における「モジュール」を形成する遺伝子集合を同定するために使用される（Ｓｅｇａｌ Ｅ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｎ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ Ｎ，Ｒｅｇｅｖ Ａ，Ｋｏｌｌｅｒ Ｄ．Ｆｒｏｍ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｔｏ ｍｏｄｅｌｓ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００５ Ｊｕｎ．；３７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ３８−４５）。グラフィカルモデルはまた、腫瘍遺伝子型と発現表現型との間の関係の解明するために（Ｌｅｅ Ｓ，Ｐｅ’ｅｒ Ｄ，Ｄｕｄｌｅｙ ＡＭ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｋｏｌｌｅｒ Ｄ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００６ Ｓｅｐ．；１０３（３８）：１４０６２−１４０６７．）、並びにタンパク質シグナルネットワーク（Ｓａｃｈｓ Ｋ，Ｐｅｒｅｚ Ｏ，Ｐｅ’ｅｒ Ｄ，Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ ＤＡ，Ｎｏｌａｎ ＧＰ．Ｃａｕｓａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｄａｔａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５ Ａｐｒ．；３０８（５７２１）：５２３−５２９．）及び組換え遺伝子制御コード（Ｂｅｅｒ ＭＡ，Ｔａｖａｚｏｉｅ Ｓ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｃｅｌｌ ２００４ Ａｐｒ．；１１７（２）：１８５−１９８．）を推論するために応用されている。特に、因子グラフを使用して発現データがモデル化されている（Ｇａｔ−Ｖｉｋｓ Ｉ，Ｓｈａｍｉｒ Ｒ．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ：ｔｈｅ ｏｓｍｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７ Ｍａｒ．；１７（３）：３５８−３６７．；Ｇａｔ−Ｖｉｋｓ Ｉ，Ｔａｎａｙ Ａ，Ｒａｉｊｍａｎ Ｄ，Ｓｈａｍｉｒ Ｒ．Ｔｈｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｒａｐｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎ：Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ Ｄ，Ｋａｎａｄｅ Ｔ，Ｋｉｔｔｌｅｒ Ｊ，Ｋｌｅｉｎｂｅｒｇ ＪＭ，Ｍａｔｔｅｒｎ Ｆ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＪＣ，Ｎａｏｒ Ｍ，Ｎｉｅｒｓｔｒａｓｚ Ｏ，Ｐａｎｄｕ Ｒａｎｇａｎ Ｃ，Ｓｔｅｆｆｅｎ Ｂ，Ｓｕｄａｎ Ｍ，Ｔｅｒｚｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ，Ｔｙｇａｒ Ｄ，Ｖａｒｄｉ ＭＹ，Ｗｅｉｋｕｍ Ｇ，Ｍｉｙａｎｏ Ｓ，Ｍｅｓｉｒｏｖ Ｊ，Ｋａｓｉｆ Ｓ，Ｉｓｔｒａｉｌ Ｓ，Ｐｅｖｚｎｅｒ ＰＡ，Ｗａｔｅｒｍａｎ Ｍ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；２００５ ｐ．３１−４７．；Ｇａｔ−Ｖｉｋｓ Ｉ，Ｔａｎａｙ Ａ，Ｒａｉｊｍａｎ Ｄ，Ｓｈａｍｉｒ Ｒ．Ａ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２００６ Ｍａｒ．；１３（２）：１６５−１８１．）。
（００１６）乳癌は臨床的及びゲノム的に異質であり、いくつかの病理学的及び分子的に異なるサブタイプから構成されている。従来のターゲット療法に対する患者の応答はサブタイプ間で異なり、マーカーガイド型の治療戦略の開発の動機付けとなっている。乳癌細胞株のコレクションは、腫瘍において認められる分子サブタイプ及びパスウェイの多くを反映し、候補治療化合物で細胞株を処置することにより、分子サブタイプ、パスウェイ及び薬物応答の間の関連性の同定が導かれ得ることが示唆される。７７個の治療化合物の試験では、ほぼ全ての薬物がこれらの細胞株間で示差的応答を示し、約半数がサブタイプ、パスウェイ及び／又はゲノム異常に特異的な応答を示している。これらの知見により、応答及び耐性の機構が、臨床薬剤開発並びに薬物を効果的に組み合わせる取り組みに情報を与え得ることが示唆される。
（００１７）様々なレベルにおけるハイスループット腫瘍分子プロファイルの蓄積は、世界的に時間及び費用のかかるプロセスとなっている。様々なレベルで遺伝子調節を複合的に分析することにより、複数の上皮癌で調節解除されている特定の生物学的機能及び分子パスウェイが示され、かつ個々に合わせた治療及びモニタリングのための新規な患者サブグループが明らかとなり得る。本発明者らは、約１１０人の乳癌患者からの、原発腫瘍、対応する血液、かつ既知の微小転移状態を有する新鮮な凍結試料から得られたいくつかの分子レベルでのハイスループットデータを収集した（以下、ＭｉｃＭａデータセットと称する）。これらの患者は、播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）の存在、再発についての長期経過観察及び全生存に関する情報を有する９００件を超える乳癌症例コホートの一部である。ＭｉｃＭａ集合は、全ゲノムｍＲＮＡ発現（１ Ｎａｕｍｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｒｉｓｋ ｗｉｔｈｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，１：１６０−１７１）、アレイＣＧＨ（Ｒｕｓｓｎｅｓ ＨＧ，Ｖｏｌｌａｎ ＨＫＭ，Ｌｉｎｇｊａｅｒｄｅ ＯＣ，Ｋｒａｓｎｉｔｚ Ａ，Ｌｕｎｄｉｎ Ｐ，Ｎａｕｍｅ Ｂ，Ｓｏｒｌｉｅ Ｔ，Ｂｏｒｇｅｎ Ｅ，Ｒｙｅ ＩＨ，Ｌａｎｇｅｒｏｄ Ａ，Ｃｈｉｎ Ｓ，Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ ＡＥ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＰＪ，Ｍａｎｅｒ Ｓ，Ｓｃｈｌｉｃｈｔｉｎｇ Ｅ，Ｂａｕｍｂｕｓｃｈ ＬＯ，Ｋａｒｅｓｅｎ Ｒ，Ｓｔｒａｔｔｏｎ ＭＰ，Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ，Ｃａｌｄａｓ Ｃ，Ｚｅｔｔｅｒｂｅｒｇ Ａ，Ｈｉｃｋｓ Ｊ，Ｂｏｒｒｅｓｅｎ−Ｄａｌｅ Ａ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｈｓ ａｎｄ ｆａｔｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０ Ｊｕｎ．；２（３８）：３８ｒａ４７）、ＤＮＡメチル化（Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇ ＪＡ，Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ Ｔ，Ｓｏｌｖａｎｇ ＨＫ，Ｎｏｒｄｇａｒｄ ＳＨ，Ｅｄｖａｒｄｓｅｎ Ｈ，Ｐｏｔａｐｅｎｋｏ Ｉ，Ｎｅｂｄａｌ Ｄ，Ｄａｖｉａｕｄ Ｃ，Ｇｕｔ Ｉ，Ｂｕｋｈｏｌｍ Ｉ，Ｎａｕｍｅ Ｂ，Ｂｏｒｒｅｓｅｎ−Ｄａｌｅ Ａ，Ｔｏｓｔ Ｊ，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｖ．Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１１ Ｆｅｂ．；５（１）：６１−７６）、全ゲノムＳＮＰ及びＳＮＰ−ＣＧＨ（Ｖａｎ，Ｌｏｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ，１０７：１６９１０−１６９１５４）、全ゲノムｍｉＲＮＡ発現解析（Ｅｎｅｒｌｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１），ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒｓ，６：ｅ１６９１５−）、ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｃｏｍｐｌｅｘ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ，４６２：１００５−１０１０）の並行するパイロット研究において使用されている。これは、単一の研究室によって同じ原発性乳房腫瘍集合に対して行われる包括的なハイスループット分子データ収集である。
（００１８）癌研究における極めて重要な主題は、癌の発症を促進するゲノム異常の同定である。ＭｉｃＭａコホートからの全ゲノムコピー数及び発現プロファイルを利用して、本発明者らは、各ステップが前のステップで選択された遺伝子の中から最も有望な候補を同定するよう設計されたいくつかのフィルタリングステップを定義した。最初の２つのステップは、一般的に異常な、かつ発現にインシス（ｉｎ−ｃｉｓ）相関する遺伝子、すなわちコピー数の変化が発現に実質的に影響する遺伝子の同定を含む。続いて、この方法は、選択された遺伝子のイントランス（ｉｎ−ｔｒａｎｓ）効果を考慮して、可能性のある新規な駆動遺伝子候補を更に絞り込む（Ｍｉｒｉａｍ Ｒａｇｌｅ Ａｕｒｅ，Ｉｓｒａｅｌ Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ Ｌａｒｓ Ｏｌｉｖｅｒ Ｂａｕｍｂｕｓｃｈ Ｋｎｕｔ Ｌｉｅｓｔｏｌ Ｄｏｒｏｎ Ｌｉｐｓｏｎ Ｂｊｏｒｎ Ｎａｕｍｅ Ｖｅｓｓｅｌａ Ｎ．Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ａｎｎｅ−Ｌｉｓｅ Ｂｏｒｒｅｓｅｎ−Ｄａｌｅ Ｏｌｅ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｌｉｎｇｊａｅｒｄｅ ａｎｄ Ｚｏｈａｒ Ｙａｋｈｉｎｉ，（２０１１）、Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｄｒｉｖｅｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）。最近、本発明者らは対立遺伝子特異的コピー数解析を開発し、これは本発明者らが固形腫瘍における対立遺伝子特異的コピー数を正確に分析することを可能とし（ＡＳＣＡＴ）、同時に腫瘍の倍数性及び異常でない細胞混合物の両方を推定かつ調整する（Ｖａｎ，Ｌｏｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ，１０７：１６９１０−１６９１５４）。これにより、ゲノムワイドな対立遺伝子特異的コピー数プロファイルの計算が可能となり、そこから獲得、喪失、コピー数中立イベント、及びヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を正確に決定することができる。ＤＮＡ異常を対立遺伝子に特異的な方法で観測することで、本発明者らは乳癌における対立遺伝子の歪みのゲノムワイドなマップを構築することができる。このマップは、一方の対立遺伝子が選択的に失われる一方で他方の対立遺伝子は選択的に獲得される遺伝子座を示す。本発明者らは、これらの選択的な対立遺伝子が乳癌の発症に対して異なる影響を有すると仮定する。本発明者らはまた、基底様乳癌が他のサブタイプと比較して著しく高頻度のＬＯＨを有し、そのＡＳＣＡＴプロファイルが腫瘍成長中のゲノム材料の大規模な喪失と、それに続く全ゲノム重複を示し、近三倍体ゲノムが生じることも認めることができた（Ｖａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）上記）。個別的な全域ＤＮＡメチル化プロファイルは、正常な乳房上皮細胞及び乳房腫瘍において報告されている。
（００１９）現在、疾患及び障害の特性評価、診断、予防、治療、及び転帰の判断に用いることができる方法を提供することが必要とされている。
発明の開示
（００２０）本発明者らは、複数のパスウェイ要素（典型的には、１つ以上のパスウェイ）の複数の属性の統合を可能とするパスウェイ解析の様々なシステム及び方法を発見した。少なくとも１つのパスウェイ要素は先験的に既知の属性を有し、少なくとも別のパスウェイ要素は仮の属性を有し、これらのパスウェイ要素を相互相関させ、かつ少なくとも１つのパスウェイへの特定の影響レベルを割り当てることにより、確率的パスウェイモデル（ＰＰＭ）を構築する。次に、患者試料の複数の要素についての計測属性をＰＰＭと共に使用することで、患者試料特有のダイナミックパスウェイマップ（ＤＰＭ）を作成する。
（００２１）本発明の主題の一態様において、本発明者はダイナミックパスウェイマップ（ＤＰＭ）の生成方法を検討し、この方法において、１つのステップでは、複数のパスウェイ要素を格納するパスウェイ要素データベースへのアクセスを提供し、各パスウェイ要素は少なくとも１つのパスウェイへのその関与により特徴付けられる。別のステップでは、パスウェイ要素データベースに結合された修正エンジンへのアクセスを提供し、修正エンジンを使用して第１のパスウェイ要素を少なくとも１つの先験的に既知の属性と関連付ける。また別のステップでは、修正エンジンを使用して第２のパスウェイ要素を少なくとも１つの仮の属性と関連付け、また更なるステップでは、修正エンジンを使用して、それぞれ既知の属性及び仮の属性を用いて、少なくとも１つのパスウェイについての第１のパスウェイ要素及び第２のパスウェイ要素を相互相関させて、少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当てることにより、確率的パスウェイモデルを形成する。最後に、分析エンジンを介して確率的パスウェイモデルを用いることにより、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性から、特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を有するＤＰＭを導き出す。
（００２２）もっとも好ましくは、パスウェイは調節パスウェイネットワーク内にあり、特に意図される調節パスウェイネットワークとしては、加齢パスウェイネットワーク、アポトーシスパスウェイネットワーク、恒常性パスウェイネットワーク、代謝パスウェイネットワーク、複製パスウェイネットワーク、及び免疫応答パスウェイネットワークが挙げられる。同様に、パスウェイはまた、シグナル伝達パスウェイネットワーク内、及び/又は個別的パスウェイネットワーク内にあってもよい。例えば、適切なシグナル伝達パスウェイネットワークには、カルシウム／カルモジュリン依存性シグナル伝達パスウェイネットワーク、サイトカイン媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、ケモカイン媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、成長因子シグナル伝達パスウェイネットワーク、ホルモンシグナル伝達パスウェイネットワーク、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達パスウェイネットワーク、ホスファターゼ媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、Ｒａｓスーパーファミリー媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、及び転写因子媒介性シグナル伝達パスウェイネットワークがある。
（００２３）更に、特に意図される態様において、好ましいパスウェイ要素はタンパク質である。例えば、好ましいタンパク質には、受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、メチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びヒストンデアセチラーゼがある。好ましいパスウェイ要素は核酸であり、このような核酸としては一般的に、タンパク質コード配列、ゲノム調節配列、調節ＲＮＡ、及びトランス活性化配列が挙げられる。
（００２４）最も一般的には、参照パスウェイ活性情報は、正常組織、罹患組織、加齢組織、及び／又は回復組織に関して特定のものである。既知の属性及び仮の属性は、一般的に、かつ独立して、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、又はタンパク質活性であり、一方で、計測属性は、好ましくは突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及び／又はタンパク質相互作用である。
（００２５）従って、本発明の主題の別の態様において、本発明者らはダイナミックパスウェイマップ（ＤＰＭ）の生成方法を検討し、この方法において、１つのステップでは、複数のパスウェイ要素を含む確率的パスウェイモデルを格納するモデルデータベースへのアクセスを提供する。前に記載したように、複数のパスウェイ要素の第１の数値を相互相関させ、かつ既知の属性に基づき少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当て、かつ複数のパスウェイ要素の第２の数値を相互相関させ、かつ仮の属性に基づき少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当てることが一般に好ましい。更なるステップでは、分析エンジンを介して、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を用いることにより確率的パスウェイモデルを修正してＤＰＭを得て、ＤＰＭは特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を有する。
（００２６）このような方法において、パスウェイは、調節パスウェイネットワーク、シグナル伝達パスウェイネットワーク、及び／又は個別的パスウェイネットワークのネットワーク内にあり、及び／又はパスウェイ要素はタンパク質（例えば、受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、メチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びヒストンデアセチラーゼなど）、又は核酸（例えばゲノム調節配列、調節ＲＮＡ、及びトランス活性化配列など）である。参照パスウェイ活性情報、既知の属性、仮の属性、及び計測属性に関しては、上記に概説したものと同様の考慮事項が適用される。
（００２７）従って、及び別の観点から見て、生物学的に関連性のある情報を分析する方法は、ダイナミックパスウェイマップ（ＤＰＭ）を格納するモデルデータベースへのアクセスを提供するステップを含み得、ＤＰＭは第１の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性によって確率的パスウェイモデルを修正することにより生成される。別のステップでは、第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を得て、分析エンジンを介して、ＤＰＭ及び第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を用いることにより、第２の細胞又は患者試料についての予測パスウェイ活性情報を決定する。
（００２８）このような方法の特に好ましい態様では、第１の細胞又は患者試料の複数の要素についての計測属性は、健常な細胞又は組織、細胞又は組織の特定の年齢、細胞又は組織の特定の疾患、罹患した細胞又は組織の特定の病期、特定の性別、特定の民族、特定の職業集団、及び／又は特定の人種に特徴的である。更に、第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及び／又はタンパク質相互作用についての情報を含むことに留意すべきである。
（００２９）最も一般的には、第１及び第２の試料は同じ細胞又は患者から得られ、第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を得る前に、細胞又は患者に処置（例えば、放射線照射、薬剤の投与）を提供し得ることが理解されるべきである。意図された方法が創薬の文脈で使用される場合、処置は細胞への候補分子の投与を含む（例えば、候補分子は候補分子ライブラリのメンバーである）。特に好ましい態様では、予測パスウェイ活性情報は、ある要素を少なくとも１つのパスウェイにおいて階層的に上位の要素として同定し、及び／又は要素を疾患に関連する少なくとも１つのパスウェイにおいて疾患の決定因子である要素として同定する。説明を容易にするために、予測パスウェイ活性情報のグラフィック表現が提供され得、及び／又は、少なくとも一部において予測パスウェイ活性情報に基づいて推奨処置が生成され得る。当然ながら、予測パスウェイ活性情報は、疾患についての診断、予後診断、又は処置オプションの選択肢、及び／若しくは食事指導から成る群より選択される推奨を考案するため、又は、後成的要因、ストレス適応、生物体の状態、及び／又は修復若しくは治癒の状態を特定するために用いられることが理解されるべきである。
（００３０）別の実施形態では、本発明はダイナミックパスウェイマップ（ＤＰＭ）の生成方法を提供し、この方法は、複数のパスウェイ要素を格納するパスウェイ要素データベースへのアクセスを提供するステップであって、各パスウェイ要素は少なくとも１つのパスウェイへのその関与により特徴付けられるステップと；パスウェイ要素データベースに結合された修正エンジンへのアクセスを提供するステップと；修正エンジンを使用して第１のパスウェイ要素を少なくとも１つの先験的に既知の属性と関連付けるステップと；修正エンジンを使用して第２のパスウェイ要素を少なくとも１つの仮の属性と関連付けるステップと；修正エンジンを使用して、それぞれ既知の属性及び仮の属性を用いて、少なくとも１つのパスウェイについての第１のパスウェイ要素及び第２のパスウェイ要素を相互相関させて、少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当てることにより確率的パスウェイモデルを形成するステップと；分析エンジンを介して確率的パスウェイモデルを用いることにより、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性から、特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を有するＤＰＭを導き出すステップと、を含む。１つの好ましい実施形態では、パスウェイ要素はタンパク質である。より好ましい実施形態では、タンパク質は、受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、メチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びヒストンデアセチラーゼから成る群より選択される。代替的な好ましい実施形態では、パスウェイ要素は核酸である。より好ましい実施形態では、核酸は、タンパク質コード配列、ゲノム調節配列、調節ＲＮＡ、及びトランス活性化配列から成る群より選択される。別のより好ましい実施形態では、参照パスウェイ活性情報は、正常組織、罹患組織、加齢組織、及び／又は回復組織に関して特定のものである。好ましい実施形態では、既知の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される。別の好ましい実施形態では、仮の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される。別の代替実施形態では、計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及びタンパク質相互作用から成る群より選択される。好ましい実施形態では、パスウェイは調節パスウェイネットワーク内にある。より好ましい実施形態では、調節パスウェイネットワークは、加齢パスウェイネットワーク、アポトーシスパスウェイネットワーク、恒常性パスウェイネットワーク、代謝パスウェイネットワーク、複製パスウェイネットワーク、及び免疫応答パスウェイネットワークから成る群より選択される。更により好ましい実施形態では、パスウェイはシグナル伝達パスウェイネットワーク内にある。代替的な更により好ましい実施形態では、パスウェイは個別的パスウェイネットワークのネットワーク内にある。最も好ましい実施形態では、シグナル伝達パスウェイネットワークは、カルシウム／カルモジュリン依存性シグナル伝達パスウェイネットワーク、サイトカイン媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、ケモカイン媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、成長因子シグナル伝達パスウェイネットワーク、ホルモンシグナル伝達パスウェイネットワーク、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達パスウェイネットワーク、ホスファターゼ媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、Ｒａｓスーパーファミリー媒介性シグナル伝達パスウェイネットワーク、及び転写因子媒介性シグナル伝達パスウェイネットワークから成る群より選択される。
（００３１）本発明はまた、ダイナミックパスウェイマップ（ＤＰＭ）の生成方法を提供し、この方法は、複数のパスウェイ要素を含む確率的パスウェイモデルを格納するモデルデータベースへのアクセスを提供するステップであって；複数のパスウェイ要素の第１の数値を相互相関させ、かつ既知の属性に基づき少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当て；複数のパスウェイ要素の第２の数値を相互相関させ、かつ仮の属性に基づき少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当てるステップと；分析エンジンを介して、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を用いることにより、確率的パスウェイモデルを修正してＤＰＭを得るステップであって、ＤＰＭは特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を有するステップと、を含む。
（００３２）好ましい一実施形態では、パスウェイは、調節パスウェイネットワーク、シグナル伝達パスウェイネットワーク、又は個別的パスウェイネットワークのネットワーク内にある。別の好ましい実施形態では、パスウェイ要素は、受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、メチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びヒストンデアセチラーゼから成る群より選択されるタンパク質であるか、又は核酸が、ゲノム調節配列、調節ＲＮＡ、及びトランス活性化配列から成る群より選択される。なお更に好ましい実施形態では、参照パスウェイ活性情報は、正常組織、罹患組織、加齢組織、又は回復組織に関して特定のものである。別の好ましい実施形態では、既知の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される。別の好ましい実施形態では、仮の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される。なお更に好ましい実施形態では、計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及びタンパク質相互作用から成る群より選択される。
（００３３）本発明は更に、生物学的に関連性のある情報を分析する方法を提供し、この方法は、ダイナミックパスウェイマップ（ＤＰＭ）を格納するモデルデータベースへのアクセスを提供するステップであって、ＤＰＭは第１の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性によって確率的パスウェイモデルを修正することにより生成されるステップと；第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を得るステップと；分析エンジンを介して、ＤＰＭ及び第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を用いることにより、第２の細胞又は患者試料についての予測パスウェイ活性情報を決定するステップと、を含む。好ましい一実施形態では、第１の細胞又は患者試料の複数の要素についての計測属性は、健常な細胞又は組織、細胞又は組織の特定の年齢、細胞又は組織の特定の疾患、罹患した細胞又は組織の特定の病期、特定の性別、特定の民族、特定の職業集団、及び特定の人種に特徴的である。別の好ましい実施形態では、第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての計測属性は、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、タンパク質活性、及びタンパク質相互作用から成る群より選択される。代替的な好ましい実施形態では、第１及び第２の試料は同じ細胞又は患者から得られ、第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性を得る前に細胞又は患者に処置を提供するステップを更に含む。より好ましい実施形態では、処置は、放射線照射、患者への薬剤の投与、及び細胞への候補分子の投与から成る群より選択される。別のより好ましい実施形態では、候補分子は候補分子ライブラリのメンバーである。別の好ましい実施形態では、予測パスウェイ活性情報は、ある要素を少なくとも１つのパスウェイにおいて階層的に上位の要素として同定する。より好ましい実施形態では、予測パスウェイ活性情報は、ある要素を疾患に関連する少なくとも１つのパスウェイにおいて疾患の決定因子である要素として同定する。代替実施形態では、この方法は更に予測パスウェイ活性情報のグラフィック表現を生成するステップを含む。代替実施形態では、この方法は更に、少なくとも一部において予測パスウェイ活性情報に基づいて推奨処置を生成するステップを含む。代替実施形態では、この方法は更に、予測パスウェイ活性情報を用いて、疾患についての診断、予後診断、又は処置オプションの選択肢、及び食事指導から成る群より選択される推奨を考案するステップを含む。代替実施形態では、この方法は更に、予測パスウェイ活性情報を用いて、後成的要因、ストレス適応、生物体の状態、及び修復又は治癒の状態を特定するステップを含む。
（００３４）別の実施形態では、本発明は、必要がある個体の臨床転帰を予測するための統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）の行列を作成する変形方法を提供し、この方法は、（ｉ）キュレーションされたパスウェイの集合を提供するステップであって、パスウェイは複数のエンティティを含むステップと；（ｉｉ）各キュレーションされたパスウェイを個別的な確率的グラフィカルモデル（ＰＧＭ）に変換するステップであって、ＰＧＭは各キュレーションされたパスウェイの因子グラフから導かれるステップと、（ｉｉｉ）個体からの生体試料を提供するステップであって、生体試料はキュレーションされたパスウェイの１つに含まれる少なくとも１つの内因性エンティティを含むステップと；（ｉｖ）生体試料中の内因性エンティティのレベルを決定するステップと；（ｖ）内因性エンティティのレベルを、別の個体からの既に決定済みの対照試料におけるエンティティのレベルと比較するステップと；（ｖｉ）対照エンティティレベルと比較して内因性エンティティレベルは活性化しているか、基準どおりであるか、又は不活性化しているかを決定するステップと；（ｖｉｉ）内因性エンティティに数値状態を割り当てるステップであって、活性化を表す状態は＋１であり、基準活性を表す状態は０であり、かつ不活性化を表す状態は−１であるステップと；（ｖｉｉｉ）別の内因性エンティティに対してステップｉｉ〜（ｖｉ）を繰り返すステップと；（ｘ）各内因性エンティティの数値状態を統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）の行列に蓄積するステップであって、（ｘ）統合パスウェイ活性の行列はＡであり、Ａijは生体試料ｊにおけるエンティティｉの推論活性を表すステップと、を含み、この方法により、個体の臨床転帰を予測する統合パスウェイ活性行列がもたらされる。
（００３５）一実施形態では、ＩＰＡ行列を作成する方法は、必要がある個体に対して、臨床転帰を予測するステップ、診断を提供するステップ、治療を提供するステップ、治療を送達するステップ、治療を施すステップ、治療を実施するステップ、治療を管理するステップ、又は治療を行うステップを含む。別の実施形態では、キュレーションされたパスウェイの集合は、ヒト生物学の分析によるものである。更に別の代替実施形態では、キュレーションされたパスウェイの集合は、非ヒト生物学の分析によるものである。別の実施形態では、対照エンティティレベルと比較して内因性エンティティレベルを決定するステップは、スチューデントのｔ検定を用いて実行される。代替実施形態では、対照エンティティレベルと比較して内因性エンティティレベルを決定するステップは、ＡＮＯＶＡを用いて実行される。別の実施形態では、変形方法は、２つ以上の個体からの複数の統合パスウェイ活性行列が組み合わされるステップを含み、組み合わせた複数の行列からクラスターが得られ、得られたクラスターの個々の行列間の距離が決定される。一実施形態では、決定された距離はＫ平均法クラスター分析を用いて分析される。別の代替実施形態では、決定された距離はＫ2平均法クラスター分析を用いて分析される。更に他の実施形態では、変形方法は、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップを含み、このステップは、抗体によって内因性エンティティを検出するステップ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定するステップを含む。代替実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、核酸プローブによって内因性エンティティを検出するステップ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定するステップを含む。別の代替実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、有機試薬によって内因性エンティティを検出するステップを含み、有機試薬は内因性エンティティに結合し、それにより検出可能なシグナルが得られ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定する。
（００３６）また更なる代替実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、無機試薬によって内因性エンティティを検出するステップを含み、無機試薬は内因性エンティティに結合し、それにより検出可能なシグナルが得られ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定する。別の代替実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、有機試薬によって内因性エンティティを検出するステップを含み、有機試薬は内因性エンティティと反応し、それにより検出可能なシグナルが得られ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定する。他の代替実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、無機試薬によって内因性エンティティを検出するステップを含み、無機試薬は内因性エンティティと反応し、それにより検出可能なシグナルが得られ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定する。好ましい実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、内因性エンティティに最適な波長で内因性エンティティの吸光度を計測するステップ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定するステップを含む。代替的な好ましい実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、内因性エンティティに最適な波長で内因性エンティティの蛍光を計測するステップ、かつそれにより内因性エンティティのレベルを決定するステップを含む。また更なる代替的な好ましい実施形態では、生体試料中の内因性エンティティレベルを決定するステップは、内因性エンティティを酵素と反応させるステップを含み、酵素は内因性エンティティを選択的に消化することにより少なくとも１つの生成物を生成し、その少なくとも１つの生成物を検出することで内因性エンティティのレベルを決定する。より好ましい実施形態では、内因性エンティティを酵素と反応させるステップにより、少なくとも２つの生成物の生成がもたらされる。更により好ましい実施形態では、少なくとも２つの生成物を生じる内因性エンティティを酵素と反応させるステップの次に、生成物を別の酵素で処理するステップが続き、酵素は生成物の少なくとも１つを選択的に消化することにより少なくとも第３の生成物を生成し、その少なくとも第３の生成物を検出することにより内因性エンティティのレベルを決定する。
（００３７）別の好ましい実施形態では、個体は、健常な個体、無症候の個体、及び症候を示す個体の群から選択される。より好ましい実施形態では、個体は、ある病態と診断された個体から成る群より選択され、その病態は疾患及び障害から成る群より選択される。好ましい実施形態では、病態は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック・東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎（ｄｅｒｍｎａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症；及び腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌、静坐不能（ａｋａｔｈｅｓｉａ）、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患 クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌から成る群より選択される。代替的な好ましい実施形態では、病態は、癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌；免疫障害、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、外傷、ブルトン型Ｘ連鎖性無γグロブリン血症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ａｇａｍｍａｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ ｏｆ Ｂｒｕｔｏｎ）、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩ）、ディジョージ症候群（胸腺低形成）、胸腺形成異常、ＩｇＡ単独欠損症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血小板減少症及び湿疹を伴う免疫不全症（ウィスコット・アルドリッチ症候群）、チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫性疾患、遺伝性血管神経性浮腫、及びクッシング病に関連する免疫不全症；並びに発達障害、例えば、尿細管性アシドーシス、貧血症、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成不全、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩、泌尿生殖器奇形、及び精神遅滞）、スミス・マゲニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経障害、例えばシャルコー・マリー・トゥース病及び神経線維腫症、甲状腺機能低下症、水頭症、発作性障害、例えばシデナム舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性麻痺、脊椎披裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴、並びに対象の任意の組織、臓器、又は系、例えば、脳、副腎、腎臓、骨格系又は生殖器系が関与する細胞成長及び分化、胚発生、並びに形態形成に関連する任意の障害から成る群より選択される。別の好ましい実施形態では、病態は、内分泌障害、例えば、性腺機能低下症、シーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド・シュラー・クリスチャン病、レッテラー・シーベ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、及び小人症を含む下垂体機能低下に関連する障害；先端巨大症、巨人症、及び抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を含む下垂体機能亢進症；並びに、甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染症を伴う急性甲状腺炎、ウイルス感染症を伴う亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、及びクレチン病を含む甲状腺機能低下に関連する障害；甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、及びプランマー病を含む甲状腺機能亢進に関連する障害；並びに、コン病（慢性高カルシウム血症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ））を含む副甲状腺機能亢進に関連する障害；呼吸器疾患、例えば、アレルギー、喘息、急性及び慢性の炎症性肺疾患、ＡＲＤＳ、気腫、肺うっ血及び肺浮腫、ＣＯＰＤ、間質性肺疾患、及び肺癌；癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌；並びに免疫不全症、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、並びに外傷から成る群より選択される。
（００３８）本発明はまた、本明細書に開示されるとおりの変形方法も提供し、ここでは次に元の構成データセットの代わりに行列Ａを使用して、臨床転帰との関連性を特定することができる。より好ましい実施形態では、キュレーションされたパスウェイは、生化学的パスウェイ、遺伝的パスウェイ、代謝パスウェイ、遺伝子調節パスウェイ、遺伝子転写パスウェイ、遺伝子翻訳パスウェイから成る群より選択される。別のより好ましい実施形態では、エンティティは、核酸、ペプチド、タンパク質、ペプチド核酸、炭水化物、脂質、プロテオグリカン、因子、補因子、生化学的代謝産物、有機組成物、無機組成物、及び塩から成る群より選択される。更に他の好ましい実施形態では、生体試料は、患者試料、対照試料、実験的に処理された動物試料、実験的に処理された組織培養物試料、実験的に処理された細胞培養物試料、及び実験的に処理されたインビトロ生化学組成物試料から成る群より選択される。より好ましい実施形態では、生体試料は患者試料である。
（００３９）本発明はまた、患者試料において変化する分子パスウェイを推論する出力を有する確率的グラフィカルモデル（ＰＧＭ）フレームワークも提供し、このＰＧＭは複数の因子グラフを含む。因子グラフは統合された生物学的データセットを表し、患者試料において変化する推論された分子パスウェイはデータから分かる分子パスウェイを含み、前記分子パスウェイは臨床的又は非臨床的な条件をもたらす。推論された分子パスウェイは臨床レジメン又は治療によって調整されることが既知であり、出力は臨床レジメンを示す。好ましい実施形態では、データは、実験データ、臨床データ、疫学データ、及び現象論的データから選択される。別の好ましい実施形態では、病態は、疾患及び障害から成る群より選択される。より好ましい実施形態では、病態は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック・東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎（ｄｅｒｍｎａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症；並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌、静坐不能（ａｋａｔｈｅｓｉａ）、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患 クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群、並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌から成る群より選択される。代替的なより好ましい実施形態では、病態は、癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌；免疫障害、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、外傷、ブルトン型Ｘ連鎖性無γグロブリン血症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ａｇａｍｍａｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ ｏｆ Ｂｒｕｔｏｎ）、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩ）、ディジョージ症候群（胸腺低形成）、胸腺形成異常、ＩｇＡ単独欠損症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血小板減少症及び湿疹を伴う免疫不全症（ウィスコット・アルドリッチ症候群）、チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫性疾患、遺伝性血管神経性浮腫、及びクッシング病に関連する免疫不全症；並びに発達障害、例えば、尿細管性アシドーシス、貧血症、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成不全、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩、泌尿生殖器奇形、及び精神遅滞）、スミス・マゲニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経障害、例えばシャルコー・マリー・トゥース病及び神経線維腫症、甲状腺機能低下症、水頭症、発作性障害、例えばシデナム舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性麻痺、脊椎披裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴、並びに対象の任意の組織、臓器、又は系、例えば、脳、副腎、腎臓、骨格系又は生殖器系が関与する細胞成長及び分化、胚発生、並びに形態形成に関連する任意の障害から成る群より選択される。更に他のより好ましい実施形態では、病態は、内分泌障害、例えば、性腺機能低下症、シーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド・シュラー・クリスチャン病、レッテラー・シーベ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、及び小人症を含む下垂体機能低下に関連する障害；先端巨大症、巨人症、及び抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を含む下垂体機能亢進症；並びに、甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染症を伴う急性甲状腺炎、ウイルス感染症を伴う亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、及びクレチン病を含む甲状腺機能低下に関連する障害；甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、及びプランマー病を含む甲状腺機能亢進に関連する障害；並びに、コン病（慢性高カルシウム血症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ））を含む副甲状腺機能亢進に関連する障害；呼吸器疾患、例えば、アレルギー、喘息、急性及び慢性の炎症性肺疾患、ＡＲＤＳ、気腫、肺うっ血及び肺浮腫、ＣＯＰＤ、間質性肺疾患、及び肺癌；癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌；及び免疫不全症、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、並びに外傷から成る群より選択される。
（００４０）図１はＰＡＲＡＤＩＧＭ法の概略を示している。ＰＡＲＡＤＩＧＭはパスウェイ概略図を機能的ゲノムデータと共に使用して、更に下流の分析に使用することのできるゲノム活性を推論する。ＴＣＧＡ ＧＢＭデータにおけるＮＣＩパスウェイ相互作用。ＮＣＩネイチャーパスウェイデータベース（Ｎａｔｕｒｅ Ｐａｔｈｗａｙ Ｄａｔａｂａｓｅ）においてＡは遺伝子Ｂの上流活性化因子であることが見出された全て（ｎ＝４６２）のペアについて、ＴＣＧＡ ＧＢＭデータから計算されるピアソン相関（ｘ軸）を２つの異なる方法で計算した。ヒストグラムは、Ａのコピー数とＢの発現との間の相関（Ｃ２Ｅ、実線赤色）及びＡの発現とＢの発現との間の相関（Ｅ２Ｅ、実線青色）をプロットする。ランダムにペアになった遺伝子間の相関のヒストグラムをＣ２Ｅ（破線赤色）及びＥ２Ｅ（破線青色）に示す。矢印は、Ｃ２Ｅ相関（赤色）及びＥ２Ｅ相関（青色）に認められる正の相関の濃縮を指し示している。 （００４１）図２は遺伝的パスウェイ図のＰＡＲＡＤＩＧＭモデルへの変換を示している。ＰＡＲＡＤＩＧＭ法の概略。ＰＡＲＡＤＩＧＭはパスウェイ概略図を機能的ゲノムデータと共に使用して、更に下流の分析に使用することのできるゲノム活性を推論する。Ａ．単一の患者に関するデータは、単一の遺伝子について、ＤＮＡコピー、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル、並びにタンパク質活性を表すその遺伝子についての４つの異なる生物学的エンティティの集合を用いて統合される。Ｂ．ＰＡＲＡＤＩＧＭは、標的に対する転写因子（左上）、複合体に凝集するサブユニット（右上）、翻訳後修飾（左下）、及び冗長な機能を果たすファミリーの遺伝子集合（右下）を含む遺伝子間の様々な種類の相互作用をモデル化する。Ｃ．モデルに表されるとおり、Ｐ５３、阻害薬ＭＤＭ２、及び高次プロセスのアポトーシスが関与する小さいサブパスウェイの小例（ｔｏｙ ｅｘａｍｐｌｅ）。 （００４２）図３は癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ：ＴＣＧＡ）プロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の多形性膠芽腫（ＧＭＢ）データにおける例示的なＮＣＩパスウェイ相互作用を示している。ＮＣＩネイチャーパスウェイデータベースにおいてＡは遺伝子Ｂの上流活性化因子（ｕｐｓｔｅｒａｍａ ｃｔｉｖａｔｏｒ）であることが見出された全て（ｎ＝４６２）のペアについて、ＴＣＧＡ ＧＭＢデータから計算されるピアソン相関（ｘ軸）を２つの異なる方法で計算した。ヒストグラムは、Ａのコピー数とＢの発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ）との間の相関（Ｃ２Ｅ、実線赤色）及びＡの発現とＢの発現との間の相関（Ｅ２Ｅ、実線青色）をプロットする。ランダムにペアになった遺伝子間の相関のヒストグラムをＣ２Ｅ（破線赤色）及びＥ２Ｅ（破線青色）に示す。矢印は、Ｃ２Ｅ相関（赤色）及びＥ２Ｅ相関（青色）に認められる正の相関の濃縮を指し示している。 （００４３）図４は抗アポトーシス性のセリン‐スレオニンキナーゼ１（ＡＫＴＩ）についての例示的な学習パラメータを示している。統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）は期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムの反復毎に収束するまで示される。点は、順序化サンプルからのＩＰＡを示し、丸は実サンプルからのＩＰＡを示している。赤色の線は実サンプルの平均ＩＰＡを表し、緑色の線はヌルサンプルの平均ＩＰＡ（ｍａｎ ＩＰＡ）を表している。 （００４４）図５はＰＡＲＡＤＩＧＭ及びシグナル伝達パスウェイ影響解析（ＳＰＩＡ）によるデコイパスウェイの実パスウェイとの識別を示している。パスウェイの各遺伝子に新たな遺伝子名を割り当てることにより、デコイパスウェイを作成した。次にＰＡＲＡＤＩＧＭ及びＳＰＩＡを用いてパスウェイ毎の摂動を計算した。各線は、摂動の順位を用いて実パスウェイをデコイパスウェイと識別する受信者動作特性を示している。例えば乳癌では、曲線下面積（ＡＵＣ）はＰＡＲＡＤＩＧＭ及びＳＰＩＡについてそれぞれ０．６６９及び０．６０２である。多形性膠芽腫（ＧＢＭ）では、ＡＵＣはそれぞれ０．６４２及び０．６０４である。 （００４５）図６は乳癌においてＡｋｔにより媒介されるクラスＩホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達イベントのｗｉｔｈｉｎ順列と比較した例示的な患者試料ＩＰＡを示している。（００４６）患者試料における平均ＩＰＡ（赤色）で生物学的エンティティを並べ替え、順列化（ｐｅｒｕｔｅｄ）試料の平均ＩＰＡと比較した。各平均の周りの色付きの範囲は、各集合の標準偏差（ＳＤ）を表している。右側のＩＰＡはＡＫＴ１、ＣＨＵＫ、及びＭＤＭ２を含む。 （００４７）図７はＥｒｂＢ２パスウェイの例示的なＣＩＲＣＬＥＭＡＰ表示を示している。各ノードについて、エストロゲン受容体（ＥＲ）状態、ＩＰＡ、発現データ、及びコピー数データは、それぞれ内側から外側に向かう同心円として表示される。アポトーシスノード及びＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３／ニューレグリン２複合体ノードは、これらのエンティティの直接的な観測値がないため、ＥＲ状態の円及びＩＰＡの円のみを有する。各患者のデータは１つの角度に沿って、円の中心から周縁に向かって表示される。 （００４８）図８はＴＣＧＡ ＧＢＭについてのＩＰＡの例示的なクラスタリングを示している。各列は単一の試料に対応し、各行は生体分子エンティティに対応する。階層的クラスタリング樹形図の下のカラーバーは、図９に使用するクラスターを表している。 （００４９）図９は図８のクラスターについてのカプラン・マイヤー生存プロットを示している。 （００５０）図１０は細胞株が治療化合物に対して広範囲の応答を示すことを示している。Ａ．ルミナル型細胞株及びＥＲＢＢ２ＡＭＰ型細胞株はＡＫＴ阻害に対して選択的に応答する。各バーはＳｉｇｍａ ＡＫＴ１−２阻害薬に対する単一の乳癌細胞株の応答を表している。細胞株は感受性（−ｌｏｇ10（ＧＩ50））が高い方から並べ、サブタイプに応じて着色する。Ｂ．同様の機構を有する化合物のＧＩ５０値は高度に相関する。ヒートマップは、様々な化合物で処理した乳癌細胞株の応答間の相関における階層的クラスタリングを示している。Ｃ．同様の作用機序を有する化合物は、細胞株パネル内で同様の応答パターンを示している。各列は１つの細胞株を表し、各行は試験化合物を表す。ＧＩ５０値は階層的にクラスター化される。有意なサブタイプ効果を有する化合物のみを含める。同様のサブタイプの細胞株は共にクラスター化される傾向にあり、それらは同じ化合物に応答性を有することが示される。灰色は欠測値を表している。Ｄ．ＣＮＡは関連する感受性である。箱ひげ図は、示されるゲノム遺伝子座に異常（Ａ）及び正常（Ｎ）なコピー数を有する細胞株についての応答感受性の分布を示している。薬物応答とＣＮＡとの間の関連性についてのＦＤＲ ｐ値が記載されている。ａ．９ｐ２１（ＣＤＫＮ２Ａ）欠失は、イクサベピロン、ビノレルビン（ｖｉｎｅｒｏｌｂｉｎｅ）及びファスカプリシンに対する応答と関連する。ｂ．２０ｑ１３（ＳＴＫ１５／ＡＵＲＫＡ）増幅は、ＶＸ−６８０及びＧＳＫ１０７０９１６と関連する。ｃ．１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）増幅は、カルボプラチン及びＧＳＫ１０７０９１６に対する応答と関連する。 （００５１）図１１は細胞株試料及びＴＣＧＡ試料の両方の非冗長ＰＡＲＡＤＩＧＭ活性のヒートマップを示している。クラスター系統樹は試料間のユークリッド距離を表し、Ｅｉｓｅｎ Ｃｌｕｓｔｅｒを使用して作成し、かつＪａｖａ Ｔｒｅｅｖｉｅｗを使用して描いた。系統樹の下のカラーバーは、試料サブタイプ（上）及び試料コホート（下）を表している。 （００５２）図１２は細胞株サブタイプが固有のネットワーク特徴を有することを示している。全てのパネルにおいて、グラフ中の各ノードは、タンパク質（丸）、多量体（六角形）、又は抽象的細胞プロセス（正方形）のいずれかに対応する種々のパスウェイ「概念」を表す。ノードの大きさは示差的活性スコアに比例して描かれており、ノードが大きいほど、非基底細胞型細胞株よりも基底細胞型細胞株とより高い相関を有する活性を含むパスウェイ概念に対応する。色は、その概念が基底細胞サブタイプと正の相関を有するか（赤色）、又は負の相関を有するか（青色）を示す。リンクはタンパク質間レベルの相互作用（破線）及び転写レベルの相互作用（実線）を含む異なる相互作用を表す。相互作用は、それらが平均絶対レベルより高い示差的活性の絶対レベルの概念を相互に連結するときのみ、マップに含めた。Ａ．ＭＹＣ／ＭＡＸ及びＥＲＫ１／２サブネットは基底細胞型乳癌細胞株で選択的に活性化する。Ｂ．ＣＴＴＮＢ１ネットワークはクローディン低型細胞株で活性化する。Ｃ．ＦＯＸＡ１／ＦＯＸＡ２ネットワークはルミナルサブタイプで上方制御される。Ｄ．ＥＲＢＢ２ＡＭＰサブタイプはＲＰＳ６ＫＢ１パスウェイの下方制御を示す。 （００５３）図１３はどのようにパスウェイ図を使用して治療応答を予測することができるかを示している。Ａ．上のパネル。基底細胞型乳癌細胞株はＤＮＡ損傷剤のシスプラチンに選択的に応答する。下のパネル。基底細胞型細胞株はＤＮＡ損傷応答に関連するパスウェイにおいて活性の増強を示し、シスプラチンがこれらの細胞株で作用することによる考えられる機構を提供する。Ｂ．上のパネル。ＥＲＢＢ２ＡＭＰ型細胞株はＨＳＰ９０阻害薬のゲルダナマイシンに対して感受性を有する。下のパネル。ＥＲＢＢ２−ＨＳＰ９０ネットワークはＥＲＢＢＰ２ＡＭＰ型株で上方制御される。Ｃ．上のパネル。ＥＲＢＢ２ＡＭＰ型細胞株はオーロラキナーゼ阻害薬のＶＸ−６８０に対して耐性を有する。下のパネル。耐性はＡＵＲＫＢ及びＣＣＮＢ１の同時制御によって媒介され得る。表記法は図１２のとおりである。 （００５４）図１４は乳癌細胞株の例示的なゲノムプロファイル及び転写プロファイルを示している。Ａ．４３個の乳癌細胞株についてのＤＮＡコピー数異常を、ｙ軸上にＧＩＳＴＩＣ解析のｌｏｇ10（ＦＤＲ）及びｘ軸上に染色体位置をとってプロットする。コピー数増加は赤色で正のｌｏｇ10（ＦＤＲ）により示し、減少は緑色で負のｌｏｇ10（ＦＤＲ）により示す。Ｂ．遺伝子発現サインに基づいて３つのクラスター（クローディン低、ルミナル、基底細胞）を示す５５個の乳癌細胞株についての階層的コンセンサスクラスタリング行列。それぞれの細胞株の組み合わせについて、色の濃さはコンセンサスに比例する。 （００５５）図１５はＧＩ５０計算が高度な再現性を有することを示す。Ａ．各バー 再現薬物／細胞株の組み合わせの頻度のカウント。ほとんどの細胞株はある特定の化合物に対して１回のみ試験したが、一部の薬物／細胞株の組み合わせは複数回試験した。Ｂ．各箱ひげ図は、３回又は４回の反復での薬物／細胞株ペアについての平均偏差中央値の分布を表している。 （００５６）図１６は倍加時間が細胞株サブタイプ間で異なることを示している。Ａ．倍加時間中央値（時間）として計算した乳癌細胞株サブタイプの成長速度を箱ひげ図として示す。基底細胞及びクローディン低のサブタイプは、ルミナル及びＥＲＢＢ２AMPサブタイプと比較すると倍加時間中央値がより短い。クラスカル・ワリス ｐ値（ｐ＝０．００６）。Ｂ．ＡＮＣＯＶＡモデルは、５’ＦＵへの応答に対するサブタイプ及び成長速度の両方の強い効果を示している。ルミナル型乳癌株（黒色）及び基底細胞／クローディン低型乳癌株（赤色）は、それぞれ成長速度との有意な関連性を示すが、異なる傾きを有する。 （００５７）図１７は推論パスウェイ活性がコホート内よりサブタイプ内でより強く相関することを示している。異なるサブタイプの細胞株間におけるピアソン相関のｔ統計量（黒色）と比較した同じサブタイプの細胞株とＴＣＧＡ試料との間で計算したピアソン相関から得られるｔ統計量（赤色）のヒストグラムが示されている。ｘ軸はピアソン相関のｔ統計量に対応し；ｙ軸は（細胞株、細胞株）ペア又は（細胞株、ＴＣＧＡ試料）ペアの密度を示す。Ｋ−Ｓ検定（Ｐ＜１×１０-22）は、同じサブタイプの細胞株及びＴＣＧＡ試料が、他のサブタイプの細胞株と比べてより類似していることを示している。 （００５８）図１８はＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙから特定されたサブネットワークそれぞれの例示的ネットワーク構造を示している。図１８は基底細胞型パスウェイマーカーのネットワーク図を示している。グラフ中の各ノードは、タンパク質（丸）、多量体（六角形）、又は抽象的細胞プロセス（正方形）のいずれかに対応する種々のパスウェイ「概念」を表す。ノードの大きさは示差的活性スコアに比例して描かれており、ノードが大きいほど、非基底細胞型細胞株よりも基底細胞型細胞株とより高い相関を有する活性を含むパスウェイ概念に対応する。色は、その概念が基底細胞サブタイプと正の相関を有するか（赤色）、又は負の相関を有するか（青色）を示す。リンクはタンパク質間レベルの相互作用（破線）及び転写レベルの相互作用（実線）を含む異なる相互作用を表す。相互作用は、それらが平均絶対レベルより高い示差的活性の絶対レベルの概念を相互に連結するときのみ、マップに含めた。 （００６０）図１９はＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙから特定されたサブネットワークそれぞれの例示的ネットワーク構造を示している。図１９はクローディン低型パスウェイマーカーの例示的ネットワーク図を示している。表記法は図１８のとおりである。 （００６１）図２０はＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙから特定されたサブネットワークそれぞれの例示的ネットワーク構造を示している。図２０はルミナル型パスウェイマーカーの例示的ネットワーク図を示している。表記法は図１８のとおりである。 （００６２）図２１はＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙから特定されたサブネットワークそれぞれの例示的ネットワーク構造を示している。図２１はＲＢＢ２ＡＭＰ型パスウェイマーカーの例示的ネットワーク図を示している。表記法は図１８のとおりである。 （００６３）図２２はルミナル型細胞株、クローディン低型細胞株及び基底細胞型細胞株における例示的なＵＲＫＢ−ＦＯＸＭ１−ＣＣＮＢ１ネットワークを示している。Ａ．ルミナル型細胞株におけるＡＵＲＫＢ及びＦＯＸＭ１の周囲のネットワーク。ＣＣＮＢ１は有意に下方制御されなかったため、このパスウェイマップには現れていない。Ｂ．クローディン低型細胞株において、ＡＵＲＫＢ及びＦＯＸＭ１は両方とも上方制御される；ＣＣＮＢ１の活性は有意ではなかった。Ｃ．基底細胞型細胞株では、ＡＵＲＫＢ、ＦＯＸＭ１及びＣＣＮＢ１は全て上方制御される。表記法は図１８のとおりである。 （００６４）図２３はＣＮＡ、ｍＲＮＡ発現、ＤＮＡメチル化及びｍｉＲＮＡ発現によるＭｉｃＭａコホートの患者の例示的な教師なしクラスターの分布及び生存曲線を示している。各種類のゲノムレベルについて、各クラスターのサイズを左側にプロットし、右側に生存曲線を示す。示差的生存の有意性は２つの方法で評価する（実施例を参照のこと）。 （００６５）図２４は例示的な特定ＰＡＲＡＤＩＧＭクラスターの分布及び生存を示している。Ａ．各バーは各クラスターのサイズを示す。Ｂ．ＭｉｃＭａデータセットについてのＰａｒａｄｉｇｍ ＩＰＬのヒートマップ。Ｃ．Ｃｈｉｎ−Ｎａｄｅｒｉ−Ｃａｌｄａｓデータセットにマッピングした後のＭｉｃＭａ Ｐａｒａｄｉｇｍクラスターの生存曲線。 （００６６）図２５は各データセットについてのＰａｒａｄｉｇｍ ＩＰＬの例示的ヒートマップを示している。各行は、３つ全てのコホートにわたる遺伝子又は複合体のＩＰＬを示す。上部にわたるカラーバーは、図２にあるとおり、ＭｉｃＭａから得たＰａｒａｄｉｇｍクラスターを示す。対象のパスウェイのメンバーは、そのパスウェイ名を表示する。赤色は活性化したＩＰＬを表し、青色は不活性化したＩＰＬを表す。 （００６７）図２６はＦＯＸＭ１転写因子ネットワークを示している。上側のネットワーク図はクラスターｐｄｇｍ．３からのデータを要約し、一方、下側のクラスターはその他のクラスターからのデータを要約する。ノードの形は、各クラスター内で最も高頻度に摂動を受けたデータ型を表し、ノードの色は摂動の方向を表す。エッジの矢印は相互作用の兆候を表し、色は相互作用の種類を表す。 （００６８）図２７はｐ５３アポトーシスパスウェイのごく一部の小例を示す。ＮＣＩからのパスウェイ図を、隠れ状態と観測状態との両方を含む因子グラフに変換した。 （００６９）図２８は推論パスウェイ活性（ＩＰＡ）の例示的なヒートマップを示している。活性化した（赤色）又は不活性化した（青色）と推論される分子エンティティ（行）の１５９８個の推論を表すＩＰＡを、３１６個の患者腫瘍試料（列）の各々についてプロットする。ＩＰＡはパスウェイエンティティ及び腫瘍試料により階層的にクラスター化し、右側の表示は、個別のパスウェイのエンティティが濃縮されたヒートマップの区間を示す。カラーバーの凡例は底１０の対数である。 （００７０）図２９は全試料にわたるＦＯＸＭ１統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）を要約している。ＦＯＸＭ１転写因子ネットワークにおける各エンティティについての腫瘍試料間のＩＰＡ算術平均を赤色で示し、濃い赤色の陰影は２標準偏差を示す。灰色の線及び陰影は、１０００個の「ヌル」試料から導き出したＩＰＡの平均値及び２標準偏差を示す。 （００７１）図３０はＮＣＩパスウェイ相互作用データベースにおける、ＦＯＸＭ１のＩＰＡと他の検証転写因子（ＴＦ）のＩＰＡとの比較を示す。Ａ．非活性（ゼロ値）のＩＰＡを除いたＩＰＡのヒストグラム。ＦＯＸＭ１標的は他のＮＣＩ ＴＦよりも有意に活性化される（Ｐ＜１０-267；コルモゴルフ・スミルノフ（ＫＳ）検定）。Ｂ．非活性ＩＰＡを含む全てのＩＰＡのヒストグラム。全てのＩＰＡを用いると、他のＴＦに対するＦＯＸＭ１の活性はいくらかより高い有意性で解釈される（Ｐ＜１０-301；ＫＳ検定）。 （００７２）図３１はＦＯＸＭ１が漿液性卵巣癌と比較して卵管上皮では発現しないことを示している。Ｔｏｎｅらのデータ（ＰＭＩＤ：１８５９３９８３）を使用して、卵管でのＦＯＸＭ１の発現レベルを漿液性卵巣癌におけるそのレベルと比較した。ＦＯＸＭ１の発現は、ＢＲＣＡ１／２突然変異を有する試料を含め、卵管ではるかに低く、ＴＣＧＡ漿液性卵巣癌で観察されるＦＯＸＭ１の高度発現は、単に上皮サインだけに起因するものではないことを示している。 （００７３）図３２は低悪性度の癌対高悪性度の癌におけるＦＯＸＭ１転写因子ネットワーク遺伝子の発現を示している。低悪性度（Ｉ；黄褐色の箱；２６試料）及び高悪性度（ＩＩ／ＩＩＩ；青色の箱；２９６試料）の両方の卵巣癌について、ＦＯＸＭ１及び９個の選択されたＦＯＸＭ１標的（ＮＣＩ−ＰＩＤに基づく）の発現レベルをプロットした。９個中７個の標的は、高悪性度癌において有意に高いＦＯＸＭ１発現を有することを示した（スチューデントのｔ検定；ｐ値は箱ひげ図の下に示す）。ＣＤＫＮ２Ａもまた示差的に発現し得るが、境界域のｔ統計量（Ｐ＝０．０１）を有した。ＸＲＣＣ１は示差的に発現するものとして検出された。 （００７４）図３３は細胞株が治療化合物に対して広範囲の応答を示すことを示している。Ａ．ルミナル型細胞株及びＥＲＢＢ２ＡＭＰ型細胞株はＡＫＴ阻害に対して選択的に応答する。各バーはＳｉｇｍａ ＡＫＴ１−２阻害薬に対する単一の乳癌細胞株の応答を表している。細胞株は感受性（−ｌｏｇ10（ＧＩ50））が高い方から並べ、サブタイプに応じて着色する。Ｂ．同様の機構を有する化合物のＧＩ５０値は高度に相関する。ヒートマップは、様々な化合物で処理した乳癌細胞株の応答間の相関における階層的クラスタリングを示している。Ｃ．同様の作用機序を有する化合物は、細胞株パネル内で同様の応答パターンを示している。各列は１つの細胞株を表し、各行は試験化合物を表す。ＧＩ５０値は階層的にクラスター化される。有意なサブタイプ効果を有する化合物のみを含める。同様のサブタイプの細胞株は共にクラスター化される傾向にあり、それらは同じ化合物に応答性を有することが示される。灰色は欠測値を表している。Ｄ．ＣＮＡは関連する感受性である。箱ひげ図は、示されるゲノム遺伝子座に異常（Ａ）及び正常（Ｎ）なコピー数を有する細胞株についての応答感受性の分布を示している。薬物応答とＣＮＡとの間の関連性についてのＦＤＲ ｐ値が記載されている。ａ．９ｐ２１（ＣＤＫＮ２Ａ）欠失は、イクサベピロン、ビノレルビン（ｖｉｎｅｒｏｌｂｉｎｅ）及びファスカプリシンに対する応答と関連する。ｂ．２０ｑ１３（ＳＴＫ１５／ＡＵＲＫＡ）増幅は、ＶＸ−６８０及びＧＳＫ１０７０９１６と関連する。ｃ．１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）増幅は、カルボプラチン及びＧＳＫ１０７０９１６に対する応答と関連する。 （００７５）図３４は細胞株試料及びＴＣＧＡ試料の両方の非冗長ＰＡＲＡＤＩＧＭ活性のヒートマップ。クラスター系統樹は試料間のユークリッド距離を表し、Ｅｉｓｅｎ Ｃｌｕｓｔｅｒを使用して作成し、かつＪａｖａ Ｔｒｅｅｖｉｅｗを使用して描いた。系統樹の下のカラーバーは、試料サブタイプ（上）及び試料コホート（下）を表している。 （００７６）図３５は細胞株サブタイプが固有のネットワーク特徴を有することを示している。全てのパネルにおいて、グラフ中の各ノードは、タンパク質（丸）、多量体（六角形）、又は抽象的細胞プロセス（正方形）のいずれかに対応する種々のパスウェイ「概念」を表す。ノードの大きさは示差的活性スコアに比例して描かれており、ノードが大きいほど、非基底細胞型細胞株よりも基底細胞型細胞株とより高い相関を有する活性を含むパスウェイ概念に対応する。色は、その概念が基底細胞サブタイプと正の相関を有するか（赤色）、又は負の相関を有するか（青色）を示す。リンクはタンパク質間レベルの相互作用（破線）及び転写レベルの相互作用（実線）を含む異なる相互作用を表す。相互作用は、それらが平均絶対レベルより高い示差的活性の絶対レベルの概念を相互に連結するときのみ、マップに含めた。Ａ．ＭＹＣ／ＭＡＸ及びＥＲＫ１／２サブネットは基底細胞型乳癌細胞株で選択的に活性化する。Ｂ．ＣＴＴＮＢ１ネットワークはクローディン低型細胞株で活性化する。Ｃ．ＦＯＸＡ１／ＦＯＸＡ２ネットワークはルミナルサブタイプで上方制御される。Ｄ．ＥＲＢＢ２ＡＭＰサブタイプはＲＰＳ６ＫＢ１パスウェイの下方制御を示す。 （００７７）図３６はパスウェイ図を使用して治療応答を予測することができることを示している。Ａ．上のパネル。基底細胞型乳癌細胞株はＤＮＡ損傷剤のシスプラチンに選択的に応答する。下のパネル。基底細胞型細胞株はＤＮＡ損傷応答に関連するパスウェイにおいて活性の増強を示し、シスプラチンがこれらの細胞株で作用することによる考えられる機構を提供する。Ｂ．上のパネル。ＥＲＢＢ２ＡＭＰ型細胞株はＨＳＰ９０阻害薬のゲルダナマイシンに対して感受性を有する。下のパネル。ＥＲＢＢ２−ＨＳＰ９０ネットワークはＥＲＢＢＰ２ＡＭＰ型株で上方制御される。Ｃ．上のパネル。ＥＲＢＢ２ＡＭＰ型細胞株はオーロラキナーゼ阻害薬のＶＸ−６８０に対して耐性を有する。下のパネル。耐性はＡＵＲＫＢ及びＣＣＮＢ１の同時制御によって媒介され得る。表記法は図３６のとおりである。 （００７８）図３７はゲノムコピー数異常を示している。（ａ）１９７例の多形性膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍のプロファイル４６と比較した４８９例のＨＧＳ−ＯｖＣａのコピー数プロファイル。コピー数の増加（赤色）及び減少（青色）を正常なゲノムに沿った距離の関数としてプロットする。（ｂ）有意な局所的増幅領域（赤色）及び欠失領域（青色）をゲノム（ｇｎｏｍｅ）に沿ってプロットする。アノテーションには、２０個の最も有意性の高い増幅領域及び欠失領域、遺伝子が８個以下の極めて局所的な領域、及び既知の癌遺伝子又はゲノムワイドの機能喪失スクリーニングにより同定される遺伝子を有する領域が含まれる。各領域に含まれる遺伝子数を括弧内に示す。（ｃ）有意に増幅された（赤色）及び欠失した（青色）染色体腕。 （００７９）図３８は分子サブタイプの遺伝子及びｍｉＲＮＡ発現パターン並びにＨＧＳ−ＯｖＣａにおける転帰予測を示している。（ａ）遺伝子発現に基づいて４つのクラスターに分かれたＴＣＧＡ及びＴｏｔｈｉｌｌらの腫瘍。（ｂ）訓練データセットを使用して、予後診断遺伝子サインを定義し、検証データセットに適用した。（ｃ）４つの独立した発現プロファイルデータセットのカプラン・マイヤー分析、予測される高リスク患者の生存を低リスク患者の生存と比較する。リスク指標の単変量コックスｐ値が含まれる。（ｄ）ｍｉＲＮＡ発現に基づき３つのクラスターに分けられた腫瘍、示されるとおりの遺伝子に基づくクラスターと重複している。（ｅ）３つのｍｉＲＮＡに基づくクラスター間での患者生存の差。 （００８０）図３９はＨＧＳ−ＯｖＣａにおける変化したパスウェイを示している。（ａ）キュレーションした分析により特定されたＲＢ及びＰＩ３Ｋ／ＲＡＳパスウェイ、及び（ｂ）ＨｏｔＮｅｔ解析により特定されたＮＯＴＣＨパスウェイは、共通して変化する。変化は、体細胞突然変異、ＤＮＡコピー数変化により、又はある場合には二倍体腫瘍における発現と比較して有意な上方制御又は下方制御により定義される。変化頻度は全ケースに対する割合である；活性化遺伝子は赤色であり、不活化遺伝子は青色である。（ｃ）最大４９％のケースにおいてＨＲパスウェイの遺伝子が変化する。ＢＲＣＡ状態の生存分析は、ＢＲＣＡ野生型と比べてＢＲＣＡ突然変異ケースについて異なる転帰を示し（より良好な全生存を呈する）、及びＢＲＣＡ１を後成的にサイレンシングしたケースはより不良な生存を呈する。（ｄ）ＦＯＸＭ１転写因子ネットワークは８７％のケースで活性化される。各遺伝子は多重輪状の円として描かれ、そこにそのコピー数（外輪）及び遺伝子発現（内輪）を、輪の各「スポーク」が単一の患者試料を表すようにプロットし、試料はＦＯＸＭ１発現が増加する順に並べ替えている。興奮性の相互作用（赤色の矢印）及び阻害性の相互作用（青色の線）は、ＮＣＩパスウェイ相互作用データベースから入手した。破線は転写調節を示す。 （００８１）図４０は本発明の主題によるダイナミックパスウェイマップを作成するための例示的なコンピュータシステムの概略図である。
発明の詳細な説明
（００８２）本書に開示する実施形態は事例的かつ例示的であり、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の特許請求の範囲から逸脱することなく他の実施形態を利用することができ、構造上の変更を行うことができる。
（００８３）本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、文脈上明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数形の参照を含む。従って、例えば、「ａｎ ｍｉＲＮＡ」への参照は、複数の係るｍｉＲＮＡを含み、「医薬担体（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃａｒｒｉｅｒ）」への参照は、１個以上の医薬担体及びその均等物への参照である、等となる。
（００８４）本明細書で使用されるとき、用語「キュレーションされた」は、科学的及び／又は臨床的な原理に従い、当技術分野において周知の方法、例えば、分子生物学的技法、生化学的技法、生理学的技法、解剖学的技法、ゲノミクス技法、トランスクリプトミクス技法、プロテオミクス技法、メタボロミクス技法、ＡＤＭＥ、及びバイオインフォマティクス技法などを用いて、試験、分析、及び同定される生体分子及び／又は非生体分子の集合間の関係を意味する。この関係は、生化学的パスウェイ、遺伝的パスウェイ、代謝パスウェイ、遺伝子調節パスウェイ、遺伝子転写パスウェイ、遺伝子翻訳パスウェイ、ｍｉＲＮＡ調節パスウェイ、偽遺伝子調節パスウェイなどの生化学的なものであってよい。
（００８５）ハイスループットデータは、癌組織における分子変化の包括的な概観を提供している。新しい技術により、腫瘍試料及び癌細胞株のゲノムコピー数変動、遺伝子発現、ＤＮＡメチル化、及びエピジェネティクスの状態の同時ゲノムワイドアッセイが可能である。
（００８６）癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）、スタンド・アップ・トゥ・キャンサー（Ｓｔａｎｄ Ｕｐ Ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ：ＳＵ２Ｃ）など、及び更に多くの研究が、様々な腫瘍について近い将来に計画されている。現行のデータセットの解析から、患者間で遺伝的変化は異なり得るが、多くの場合に共通のパスウェイが関与することが認められる。従って、癌の進行に関与する関連パスウェイを同定し、それらが異なる患者においてどのように変化するかを検出することが決定的に重要である。
（００８７）本発明者らは、複数のパスウェイ要素の複数の属性を確率的パスウェイモデルに統合し、次に患者のデータを使用して修正してダイナミックパスウェイマップを生成するシステム及び方法を開発した。最も重要なのは、パスウェイ内のパスウェイ要素についての属性は、先験的に知られている必要はないことが理解されるべきである。実際に、少なくともいくつかのパスウェイ要素の属性のうちの少なくともいくつかは仮定される。次に、パスウェイ要素を相互相関させ、より多くのパスウェイへの特定の影響レベルを割り当てることにより確率的パスウェイモデルを構築し、これは好ましくは特定の参照状態（例えば、健康的又は病的）を表す。次に、患者試料の複数の要素についての計測属性を確率的パスウェイモデルと組み合わせて使用することで、１つ以上の特定のパスウェイについての参照パスウェイ活性情報を提供する患者試料特有のダイナミックパスウェイマップを作成する。
（００８８）特に、１つ以上のパスウェイ要素についての複数の種類の属性を、１つ以上の他のパスウェイ要素についての（合理的に）仮定された複数の種類の属性と組み合わせて統合することにより、著しく少ない制限された分析が可能となり、それにより高度な精度及び分解能を有する多因子分析が可能となることが理解されるべきである。実際に、意図されたシステム及び方法により、比較的少数の計測された患者試料属性に基づいて詳細かつ本質的な結果をもたらすことが可能となることに留意すべきである。当然ながら、また、意図されたされるシステム及び方法は、１つ以上のパスウェイ要素についての２種以上の属性の入力を可能とすることで、１つ以上のパスウェイ要素についての２種以上の属性の出力を生成し、入力及び出力された属性及びパスウェイ要素は完全に個別であってもよいことに留意すべきである。例えば、及び別の観点から見て、遺伝子活性、複合体、及び細胞プロセスの状態に関する患者特有のゲノム推論は、所定の確率的パスウェイモデルに基づいて引き出してもよい。
（００８９）以下の説明は、コンピュータ／サーバに基づいたパスウェイ解析システムについて描かれているが、様々な代替構成も適していると考えられ、かつ個別的に、又は集合的に動作するサーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラ、又は他の種類の計算装置を含む様々な計算装置を使用することができることに留意すべきである。計算装置は、有形で、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に格納されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを含むことが理解されるべきである。ソフトウェア命令は、好ましくは、開示された装置に関連して後述するように、役割、責任、又は他の機能を提供するように計算装置を構成する。特に好ましい実施形態では、標準化されたプロトコル又はアルゴリズムを用いた様々なサーバ、システム、データベース、又はインターフェース交換データは、おそらくＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開鍵‐秘密鍵の交換、ウェブサービスＡＰＩ、公知の金融取引プロトコル、又は他の電子情報交換方法に基づくものであった。データ交換は、好ましくは、パケット交換網、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、又は他の種類のパケット交換網上で行われる。
（００９０）更に、以下の説明から本発明の主題における多くの例示的な実施形態を提供する。各実施形態は本発明の要素の単一の組合せを表すが、本発明の主題は、開示要素の全ての可能な組み合わせを含むと考えられる。従って、一実施形態が要素Ａ、Ｂ及びＣを含み、第２の実施形態が要素Ｂ及びＤを含む場合、次に本発明の主題は、たとえ明示的に開示されていなくてもＡ、Ｂ、Ｃ又はＤの他の残りの組み合わせも含むものと考えられる。
（００９１）本発明者らは、遺伝子間のキュレーションされたパスウェイ相互作用を包含する患者特異的な遺伝的活性を推論するための新規方法を提示する。遺伝子は、因子グラフによって遺伝子及びその産物の発現及び既知の活性を符号化する相互に接続し合う変数の集合としてモデル化され、多種のオミクスデータを証拠として取り込むことが可能になる。
（００９２）本方法は、確率的推論を用いて、患者においてパスウェイの活性（例えば、内部遺伝子の状態、相互作用、又は高レベル「出力」）が変化する程度を予測する。ＳＰＩＡと称される競合するパスウェイ活性推論手法と比較して、本発明者らの方法は、限定されるものではないが多形性膠芽腫（ＧＢＭ）及び乳癌の両方のデータセットにおいて、より少ない偽陽性で癌関連パスウェイ活性の変化を特定する。
（００９３）ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズム（ＰＡＲＡＤＩＧＭ）は、遺伝子が分離して考慮される場合に見過ごされるＧＢＭ患者のサブセットについて、一貫したパスウェイレベル活性を特定した。更に、このアルゴリズムを用いてＧＢＭ患者の有意なパスウェイ摂動に基づきＧＢＭ患者をグループ化することで、ＧＢＭ患者は有意に異なる生存転帰を有する臨床的に関連性のあるサブグループに分けられる。
（００９４）これらの知見は、患者群又は個人の共通して摂動を受けるパスウェイにおいて重要な点にある遺伝子を標的とすることのできる治療法が選択され得ることを示唆している。
（００９５）本発明者らは、任意の数のゲノム及び機能的ゲノムのデータセットを統合して、患者試料において変化する分子パスウェイを推論することのできる因子グラフ（Ｋｓｃｈｉｓｃｈａｎｇ ２００１、上記）に基づいた確率的グラフィカルモデル（ＰＧＭ）フレームワークについて記載する。本発明者らは、膠芽腫及び乳癌の両方のデータセットのコピー数変動及び遺伝子発現データを使用してこのモデルを検証した。構造化したパスウェイモデルを用いて推論される活性は、膠芽腫患者を臨床的に関連性のあるサブタイプに層別化することに成功した。この結果から、パスウェイ情報に基づく推論は、遺伝子レベルのデータを分離して使用するより有益な情報を提供することが示唆される。
（００９６）より優れた予後診断及び診断を提供することに加えて、統合パスウェイの活性化は、疾患の進行を抑止するために用いることができる可能性のある治療についての重要な手掛かりをもたらす。
（００９７）本発明者らは、統合された患者データから遺伝的パスウェイの活性を推論するためのＰＡＲＡＤＩＧＭ（ＰＡｔｈｗａｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｕｓｉｎｇ Ｄａｔａ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ（ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズム））と称される手法を開発した。図１は、本手法の概要を示す。単一の患者試料に関する複数のゲノムスケールの計測値を組み合わせて、単一の米国国立癌研究所（ＮＣＩ）パスウェイの遺伝子、産物、及び抽象的プロセス入出力の活性を推論する。ＰＡＲＡＤＩＧＭは統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）の行列Ａを生成し、ここでＡijは、患者試料ｊにおけるエンティティｉの推論された活性を表す。次に、行列Ａを元の構成データセットの代わりに使用して、臨床転帰との関連性を特定することができる。
（００９８）本発明者らは、初めに各ＮＣＩパスウェイを個別的な確率モデルに変換した。ｐ５３アポトーシスパスウェイのごく一部の小例を図２（ｃ）に示す。ＮＣＩのパスウェイ図を、隠れ状態と観測状態との両方を含む因子グラフに変換した（図２）。因子グラフは、エンティティ間の既知の相互作用を表す構造により、遺伝子関連及び生物学的プロセス関連の状態情報に関する観測を統合する。
（００９９）生物学的パスウェイを因子グラフで表現するために、本発明者らは、特定のｍＲＮＡ又は複合体などの細胞中のエンティティの状態を変数を用いて記述し、かつこれらのエンティティ間の相互作用及び情報フローを因子を用いて表現する。これらの変数は各エンティティの示差的状態を、分子エンティティの直接的な濃度ではなく、「対照」又は正常レベルとの比較で表現する。この表現により、本研究者らは、多くの場合に遺伝子の示差的状態を直接計測するか、又は直接的な計測値を対応する対照との相対的な計測値に変換するかのいずれかであるＤＮＡマイクロアレイによって検出される遺伝子発現などの、多くのハイスループットデータセットをモデル化することが可能になる。また、遺伝子間の多種の調節関係についても可能になる。例えば、ｐ５３のＭＤＭ２媒介性ユビキチン依存性分解を表す相互作用は、ｐ５３タンパク質レベルを阻害する活性化ＭＤＭ２としてモデル化することができる。
（００１００）一実施形態では、本方法を用いて、様々な診断上及び治療上の適用、例えば、癌組織の検出、癌組織の病期分類、転移性組織の検出など；神経障害、例えば、限定されるものではないが、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、統合失調症、癲癇、及びこれらの合併症；ディジョージ症候群、自閉症などの発達障害、多発性硬化症などの自己免疫障害、糖尿病などの検出；感染症、例えば、限定されるものではないが、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、リーシュマニア、住血吸虫症、マラリア、条虫、象皮病、線虫、ネマチン（ｎｅｍａｔｉｎｅ）による感染症などの治療に使用することができる臨床情報を提供し得る。
（００１０１）一実施形態では、本方法を用いて、変化した遺伝子発現、ｍＲＮＡの発現過剰に対する非存在／存在を検出及び定量化し、又は治療介入中のｍＲＮＡレベルをモニタするための臨床情報を提供し得る。発現の変化に関連する病態、疾患又は障害としては、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック・東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎（ｄｅｒｍｎａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症；並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌が挙げられる。この診断アッセイでは、遺伝子発現の変化を検出するために、ハイブリダイゼーション又は増幅技法を用いて患者からの生体試料における遺伝子発現を標準試料と比較し得る。この比較のための定性的又は定量的方法は、当技術分野において周知である。
（００１０２）一実施形態では、本方法を用いて、変化した遺伝子発現；ｍＲＮＡの非存在、存在、又は過剰発現を検出及び定量化し；又は治療介入中のｍＲＮＡレベルをモニタするための臨床情報を提供し得る。発現の変化に関連する障害としては、静坐不能（ａｋａｔｈｅｓｉａ）、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患 クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌が挙げられる。
（００１０３）一実施形態では、本方法を用いて、哺乳動物タンパク質の発現又は活性の変化に関連する病態についての臨床情報を提供し得る。このような病態の例としては、限定されるものではないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック・東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症；並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌、静坐不能（ａｋａｔｈｅｓｉａ）、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患 クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌が挙げられる。
（００１０４）一実施形態では、本明細書に（ｅｒｅｉｎ）開示される方法を用いて、核酸配列の発現又は活性の低下に関連する障害を検出、病期分類、診断、及び／又は治療し得る。このような障害の例としては、限定されるものではないが、癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌；免疫障害、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、外傷、ブルトン型Ｘ連鎖性無γグロブリン血症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ａｇａｍｍａｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ ｏｆ Ｂｒｕｔｏｎ）、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩ）、ディジョージ症候群（胸腺低形成）、胸腺形成異常、ＩｇＡ単独欠損症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血小板減少症及び湿疹を伴う免疫不全症（ウィスコット・アルドリッチ症候群）、チェディアック・東症候群、慢性肉芽腫性疾患、遺伝性血管神経性浮腫、及びクッシング病に関連する免疫不全症；並びに発達障害、例えば、尿細管性アシドーシス、貧血症、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成不全、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩、泌尿生殖器奇形、及び精神遅滞）、スミス・マゲニス症候群、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経障害、例えばシャルコー・マリー・トゥース病及び神経線維腫症、甲状腺機能低下症、水頭症、発作性障害、例えばシデナム舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性麻痺、脊椎披裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴、並びに対象の任意の組織、臓器、又は系、例えば、脳、副腎、腎臓、骨格系又は生殖器系が関与する細胞成長及び分化、胚発生、並びに形態形成に関連する任意の障害が挙げられる。
（００１０５）一実施形態では、本明細書に（ｅｒｅｉｎ）開示される方法を用いて、核酸配列の発現に関連する障害を検出、病期分類、診断、及び／又は治療し得る。このような障害の例としては、限定されるものではないが、内分泌障害、例えば、性腺機能低下症、シーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド・シュラー・クリスチャン病、レッテラー・シーベ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、及び小人症を含む下垂体機能低下に関連する障害；先端巨大症、巨人症、及び抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を含む下垂体機能亢進症；並びに、甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染症を伴う急性甲状腺炎、ウイルス感染症を伴う亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、及びクレチン病を含む甲状腺機能低下に関連する障害；甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、及びプランマー病を含む甲状腺機能亢進に関連する障害；並びに、コン病（慢性高カルシウム血症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ））を含む副甲状腺機能亢進に関連する障害；呼吸器疾患、例えば、アレルギー、喘息、急性及び慢性の炎症性肺疾患、ＡＲＤＳ、気腫、肺うっ血及び肺浮腫、ＣＯＰＤ、間質性肺疾患、及び肺癌；癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌；及び免疫不全症、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、リンパ球毒素性偶発性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌、血液透析、及び体外循環の合併症、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症、並びに外傷が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、サザン解析若しくはノーザン解析、ドットブロット、又は他の膜ベースの技法；ＰＣＲ法；ディップスティックアッセイ、ピンアッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイ；並びにマイクロアレイにおいて、患者からの体液又は組織を利用して核酸配列発現の変化を検出するために用いられ得る。このような定性的又は定量的な方法は、当技術分野において周知である。
本発明の特徴付け及び最良の形態
ＰＡＲＡＤＩＧＭ：ＰＡＲＡＤＩＧＭを使用した多次元癌ゲノミクスデータからの患者特異的パスウェイ活性の推論。
（００１０６）パスウェイに基づく手法の１つの仮説は、パスウェイデータベースに含まれている遺伝的相互作用は、癌において検出される遺伝子発現変化の間の相関性を解釈するための情報を有するというものである。例えば、癌関連パスウェイが転写活性化因子Ａから標的遺伝子Ｔへのリンクを含む場合、本発明者らはＡの発現がＴの発現と正の相関（Ｅ２Ｅ相関）を有することを予想する。同様に、本発明者らはＡのコピー数とＴの発現との間に正の相関（Ｃ２Ｅ相関）があることを予想する。更に、本発明者らはＡにおける増幅は、必ずしもＡがより高度に発現することを意味するものでなく、それには次にＢの上方制御が必要なため、Ｃ２Ｅ相関はＥ２Ｅ相関より弱いことを予想する。このように、パスウェイの各リンクはデータに関する予想を提供する；多くの一貫性のあるリンクを含むパスウェイは、更なる考慮事項について関連性を有し得る。本発明者らはこれらの仮定を検証し、ＮＣＩパスウェイは、最近のＴＣＧＡ ＧＢＭデータを予測する多くの相互作用を含むことを見出した（Ｔｈｅ ＴＣＧＡ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｎｅｔｗｏｒｋ ２００８）。
（００１０７）本発明者らは、統合された患者データから遺伝的パスウェイの活性を推論するＰＡＲＡＤＩＧＭ（ＰＡｔｈｗａｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｕｓｉｎｇ Ｄａｔａ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ）と称される手法を開発した。
（００１０８） ＰＡＲＡＤＩＧＭ法は、既知のシグナル伝達パスウェイによって多様なハイスループットゲノミクス情報を統合し、遺伝子活性、複合体、及び細胞プロセスの状態に関する患者特異的ゲノミック推論を提供する。本方法の核心部は、様々なデータソースを組み合わせるために、因子グラフを用いて推論を利用することである。元のハイスループットデータセットの代わりに、又はそれと併せてこのような推論を使用することで、試料を臨床的に関連性のあるサブタイプに分類する本発明者らの能力が向上する。ＰＡＲＡＤＩＧＭで統合した活性に基づくＧＢＭ患者のクラスタリングにより、種々の生存プロファイルと相関する患者サブタイプが明らかとなった。対照的に、発現データ又はコピー数データのいずれかを用いる試料のクラスタリングでは、データセットにおいて有意なクラスターは何ら明らかとならなかった。
（００１０９）ＰＡＲＡＤＩＧＭは、ＧＢＭ及び乳癌の両方からの腫瘍試料において有意に変化した遺伝子活性のパスウェイ推論を生成する。ＳＰＩＡと称される競合するパスウェイ活性推論手法と比較して、本発明者らの方法は、癌関連パスウェイにおいて変化した活性をより少ない偽陽性で特定する。計算効率上、ＰＡＲＡＤＩＧＭは現在、ＮＣＩパスウェイをそのまま使用する。
（００１１０）ＰＡＲＡＤＩＧＭはＥＭを用いて隠れ量を推論するが、ＮＣＩパスウェイにまだ存在しない新しい相互作用を推論しようと試みるものではない。尤度関数を増加させる新しい相互作用を導入するようにこの手法を拡張することが想像され得る。この問題は概して厄介であるが、構造的ＥＭ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ（１９９７）上記）などの発見的手法を使用することにより、計算的な探索戦略を用いて相互作用を特定することができる。
（００１１１）新たに新規の連結を探索するのでなく、タンパク質間相互作用マップ又は有意な数の発現データセットにおいて相関する遺伝子ペアから得られた相互作用を提案することにより、著しく探索速度を加速することができる。このパスウェイベースの手法の力は、観測される生存差異の根底にある考えられる機構に関して手掛かりを提供し得ることである。有益な情報を提供するＩＰＡは、治療標的を示唆したり、又は臨床試験に最も適した患者を選択したりするのに有用であり得る。例えば、ＥｒｂＢ２増幅は、薬物のトラスツズマブにより治療可能な特定の乳癌型の周知のマーカーである。しかしながら、ＥｒｂＢ２増幅を有する一部の患者は治療抵抗性の腫瘍を有する。ＣｉｒｃｌｅＭａｐ表示を調査することにより、ＥｒｂＢ２増幅を有するが、ＰＡＲＡＤＩＧＭにより推論される通りＩＰＡが不活性又は不変のいずれかである患者を特定することができる。ＥｒｂＢ２増幅を有するが、予測される活性を有さない患者には、代替治療が検討され得る。
（００１１２）将来、より多次元のデータセットが利用可能となるに伴い、このようなパスウェイ推論がコホート間で一般化されるロバストなバイオマーカーを提供するかどうかを検証することは興味深いものになるであろう。
乳癌における抗癌化合物に対するサブタイプ及びパスウェイ特異的応答
（００１１３）現在、ヒト悪性腫瘍の治療に向けて８００種を超える小分子阻害薬及び生物製剤の開発が進められている（Ｎｅｗ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ｜ＰＨＲＭＡ．ｈｔｔｐ：／／ｎｅｗｍｅｄｓ．ｐｈｒｍａ．ｏｒｇ／（２０１０））。これらの薬剤の多くは、腫瘍を正常細胞と区別すると考えられる分子構造を標的とし、かつ代謝拮抗薬及びＤＮＡ架橋剤、例えばトラスツズマブ及びラパチニブを含めた、癌のサブセットにおいて調節解除される分子イベント及びパスウェイを選択的に標的化する広域特異性の従来の治療薬までの範囲に及ぶ（例えば、Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｐｌｕｓ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＥＲ２ ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈａｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ＨＥＲ２．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４４，７８３−７９２（２００１）；Ｖｏｇｅｌ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｇｅｎｔ ｉｎ ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０，７１９−７２６（２００２）；Ｒｕｓｎａｋ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＥｒｂＢ−２ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＧＷ２０１６，ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １，８５−９４（２００１）を参照のこと）。Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｏｎ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ １５−ｙｅａｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ rａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３６５，１６８７−１７１７（２００５）。
（００１１４）今日の薬剤開発における一般的な傾向は、従来の薬物と比べて増強した効力及び低い毒性を示す標的化薬剤に向かっている（Ｓａｗｙｅｒｓ，Ｃ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２，２９４−２９７（２００４））。ＥＲＢＢ２／ＥＧＦＲ阻害薬のラパチニブなど、高い標的特異性を示す薬物もあれば、ＳＲＣ阻害薬のダサチニブなど、広範囲のキナーゼを阻害する薬物もある（Ｋａｒａｍａｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，１２７−１３２（２００８））。
（００１１５）臨床試験は応答の予測因子を含むべきであり、かつ試験に参加する患者を層別化すべきであるという認識が高まっている。多くの分子的に標的化された治療剤は、患者を分類するための明らかな分子構造を提供するが、ほとんどはそうでない。更に、腫瘍間での分子的及び生物学的な違い、標的化されたパスウェイの複雑なクロスカップリング及びフィードバック調節並びに不正確な標的特異性により、基本的機構の予測は多くの場合に複雑となる。分子マーカーに基づく臨床試験の過程では、応答性のサブセットが同定され得るが、この手法は手配が困難かつ高価であり、応答する可能性がもっとも高い選択された分集団において実験的化合物を最初に試験することができない。実際、現在開発中の薬物の大半は今後乳癌で試験されることはないため、乳癌患者の分集団においてのみ極めて有効な化合物が見落とされる確率が高い。有望な手法は、前臨床モデルから得られる応答の予測因子を使用して臨床試験に参加する患者を層別化することであり、それにより開発費用が低減され、患者サブセットで特に有効であり得る薬物が特定され得る。
（００１１６）細胞株パネルにおける前臨床試験は、初期臨床試験の指針として応答性の分子サブタイプを早期にかつ効率的に同定することを可能にする見込みがある。この手法の有用性についての証拠は、細胞株パネルが（ａ）ゲフィチニブに応答性を有するものとしてＥＧＦＲ変異を伴う肺癌を予測し（Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＥＧＦＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４，１４９７−１５００（２００４））、（ｂ）トラスツズマブ及び／又はラパチニブに応答性を有するものとしてＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２増幅を伴う乳癌を予測し（Ｎｅｖｅ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １０，５１５−５２７（２００６）；Ｋｏｎｅｃｎｙ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｌａｐａｔｉｎｉｂ（ＧＷ５７２０１６）ａｇａｉｎｓｔ ＨＥＲ−２−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ｔｒｅａｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６，１６３０−１６３９（２００６））、及び（ｃ）メシル酸イマチニブに耐性を有するものとして変異又は増幅したＢＣＲ−ＡＢＬを伴う腫瘍を予測する（Ｓｃａｐｐｉｎｉ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｍａｔｉｎｉｂ（ＳＴＩ５７１）ｉｎ ｔｗｏ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐ２１０ Ｂｃｒ／Ａｂｌ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ １００，１４５９−１４７１（２００４））ことを示す研究によってもたらされる。ＮＣＩのディスカバリー・セラピューティック・プログラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍ）はこの手法を大規模に追求し、約６０種の癌細胞株コレクションにおいて分子構造と１００，０００種超の化合物に対する応答との間の関連性を特定している（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｎ．Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：“Ｉｎｔｅｇｒｏｍｉｃ” ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＩ−６０ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ５，２６０１−２６０５（２００６）；Ｂｕｓｓｅｙ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｄａｔａ ｏｎ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＮＣＩ−６０ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｐａｎｅｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ５，８５３−８６７（２００６））。多様な応答を有する化合物の検出に有用であるものの、ＮＣＩ６０パネルはコレクション内での特定の癌サブタイプの比較的疎である代表性のために、間違いなくサブタイプに特異的な応答の検出力が制限される。例えば、このコレクションには６種類の乳癌細胞株しか含まれず、これは既知の多様性を適切に表現するには不十分である。従って本発明者らは、乳癌におけるインビトロ治療化合物応答と分子サブタイプと活性化したシグナル伝達パスウェイとの間の関連性をより統計的にしっかりと同定するため、約５０種の乳癌細胞株のコレクションの使用を図った。ここで本発明者らは、ＦＤＡ承認薬及び治験化合物の両方を含む７７種の化合物について、定量的な成長阻害応答とサブタイプを定義する分子構造と活性化したパスウェイとの間の関連性における評価を報告する。約半数が異常性又はサブタイプ特異性を示す。本発明者らはまた、遺伝子発現及びコピー数データの統合的分析により、観測されるサブタイプ関連応答の一部は特定のパスウェイ活性により説明できることも示している。
統合された分子プロファイルはＤｃｉｓにおけるインターロイキンシグナル伝達の歪み及び浸潤性乳癌における予後診断力の向上を明らかにする
（００１１７）様々なレベルにおけるハイスループット腫瘍分子プロファイルの蓄積は、世界的に時間及び費用のかかるプロセスとなっている。様々なレベルで遺伝子調節を複合的に分析することにより、複数の上皮癌で調節解除されている特定の生物学的機能及び分子パスウェイが示され、かつ個々に合わせた治療及びモニタリングのための新規な患者サブグループが明らかとなり得る。本発明者らは、約１１０人の乳癌患者からの、原発腫瘍、対応する血液、かつ既知の微小転移状態を有する新鮮な凍結試料から得られるいくつかの分子レベルでのハイスループットデータを収集した（以下、ＭｉｃＭａデータセットと称する）。これらの患者は、播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）の存在、再発についての長期経過観察及び全生存に関する情報を有する９００件を超える乳癌症例コホートの一部である。ＭｉｃＭａ集合は、全ゲノムｍＲＮＡ発現（Ｎａｕｍｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｒｉｓｋ ｗｉｔｈｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，１：１６０−１７）、アレイＣＧＨ（Ｒｕｓｓｎｅｓ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｈｓ ａｎｄ ｆａｔｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，２：３８ｒａ４７２）、ＤＮＡメチル化（Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，５：６１−７６）、全ゲノムＳＮＰ及びＳＮＰ−ＣＧＨ（Ｖａｎ，Ｌｏｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒｓ，１０７：１６９１０−１６９１５４）、全ゲノムｍｉＲＮＡ発現解析（Ｅｎｅｒｌｙ Ｅ，Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ Ｉ，Ｋｌｅｉｖｉ Ｋ，Ｌｅｉｖｏｎｅｎ Ｓ，Ａｕｒｅ ＭＲ，Ｒｕｓｓｎｅｓ ＨＧ，Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇ ＪＡ，Ｊｏｈｎｓｅｎ Ｈ，Ｎａｖｏｎ Ｒ，Ｒｏｄｌａｎｄ Ｅ，Ｍａｋｅｌａ Ｒ，Ｎａｕｍｅ Ｂ，Ｐｅｒａｌａ Ｍ，Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ Ｏ，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＶＮ，Ｙａｋｈｉｎｉ Ｚ，Ｂｏｒｒｅｓｅｎ−Ｄａｌｅ Ａ．ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１１；６（２）：ｅ１６９１５）、ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｃｏｍｐｌｅｘ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅｓ，４６２：１００５−１０１０）の並行するパイロット研究において使用されている。これは、単一の研究室によって同じ原発性乳房腫瘍集合に対して行われる包括的なハイスループット分子データ収集である。
（００１１８）本発明者らは以下にこれらの研究の知見を要約し、研究の各々では、ｍＲＮＡ発現をＤＮＡコピー数、ＤＮＡメチル化における調節解除又はｍｉＲＮＡ発現のいずれかと統合することを試みている。過去に本発明者ら及び他の研究者らは複数の分子レベルで乳癌機構を調べているが、ｍＲＮＡ、ＣＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びメチル化をパスウェイ文脈でモデル化することによりこれらの観点を統合する試みはごく僅かであった。本論において本発明者らは、乳癌からのこのようなデータを、摂動を受けるパスウェイ及び個別的な表現型特性を有する分子サブタイプの両方の検出と合わせて分析した。
（００１１９）ここで考察するＭｉｃＭａデータセットにおいて、本発明者らはメチル化プロファイルに基づき３つの大クラスター（及び１つの小クラスター）を特定した；大クラスターの１つは主として筋上皮起源の腫瘍からなり、他の２つの大クラスターは主に管腔上皮起源の腫瘍を含むものであった。クラスターは、ＴＰ５３突然変異及びＥＲ、及びＥｒｂＢ２発現状態、並びに悪性度に関して異なっていた。パスウェイ解析により、ＥＧＦ、ＮＧＦＲ及びＴＮＦなどの遺伝子を含むカノニカルな（キュレーションされた）パスウェイ、樹状細胞成熟及びＮＦ−κＢシグナル伝達パスウェイとの有意な関連性が特定された。ＤＣＩＳ及び浸潤癌からの試料に対する候補遺伝子のパイロシーケンシングから、ＡＢＣＢ１、ＦＯＸＣ１、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ及びＰＴＥＮはＤＣＩＳにおいてメチル化される新規遺伝子として同定された。どの病変が侵襲性となる「リスク」を有するかをより良く理解するためには、これらの後成的変化がどのように腫瘍進行の惹起に関与するかを理解することが重要である。
（００１２０）本発明者らはまた、ＭｉｃＭａデータセットにおけるｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ発現間の関係についても、それらの互いの、及び臨床的特徴との相関性の観点で調査した。本発明者らは、増殖、細胞接着及び免疫応答などのいくつかの細胞プロセスが特定のｍｉＲＮＡと強く関連することを示すことができた。分子固有サブタイプ間、及び異なる増殖レベルの試料間において、統計的に有意なｍｉＲＮＡ発現差異が認められた。本発明者らは、細胞株に対するハイスループットライセートマイクロアレイを用いて、ｍｉＲＮＡの増殖調節における役割を検証し、このプロセスの潜在的なドライバーを指摘した（Ｅｎｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）上記）。
（００１２１）この乳癌患者コホートにおいて、１０ｅ−６のｐ値カットオフレベルでＴＰ５３突然変異状態によって示差的濃縮を示す４０個超のＫＥＧＧパスウェイが同定された。パスウェイの示差的濃縮はまた、２つの異なるマイクロアレイプラットフォームに基づく、１８７個の乳癌試料から成るクロスプラットフォームのデータセットにおいても認められた。示差的に濃縮されたパスウェイは、ＴＰ５３シグナル伝達及び細胞周期などのいくつかの既知の癌パスウェイ、免疫応答及びサイトカイン活性化を含むシグナル伝達パスウェイ、及び脂肪酸代謝を含む代謝パスウェイ（Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ，２０１１ 上記）を含むものであった。
（００１２２）先述の研究の各々は、ハイスループット分子データから対様式で（ＣＮＡ／ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ、ＤＮＡメチル化／ｍＲＮＡ、ＴＰ５３／ｍＲＮＡ）生物学的相互作用を導き出そうと試みている。本研究では、本発明者らは調節解除されたパスウェイに焦点を合わせ、全ての分子レベルを同時に考慮した統合予後診断指標を開発しようと試みた。本発明者らは、ゲノムモデルに関するデータ統合を用いたパスウェイ認識アルゴリズム（ＰＡＲＡＤＩＧＭ）を適用することにより、様々な遺伝的パスウェイの相対活性を明らかにし、それらの共同の予後診断潜在力を評価した。次に、クラスター及びＰＡＲＡＤＩＧＭにより特定される調節解除されたパスウェイを別のデータセット（Ｃｈｉｎ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｕｓｉｎｇ ａｒｒａｙ−ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｆｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ，２６：１９５９−１９７０）で検証し、また、ＤＣＩＳ（非浸潤性乳管癌）などの、前癌性新生物のデータセット（Ｍｕｇｇｅｒｕｄ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ（ＤＣＩＳ）ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，４：３５７−３６８）で試験した。
卵巣漿液性癌において高頻度で変化するパスウェイ
（００１２３）コピー数及び遺伝子発現の両方の統合分析によって有意に変化するパスウェイを同定するため、本発明者らは最近開発したパスウェイ活性推論法ＰＡＲＡＤＩＧＭ（ＰＭＩＤ：２０５２９９１２）を適用した。この計算モデルはコピー数変化、遺伝子発現データ、及びパスウェイ構造を組み込み、パスウェイデータベースに存在する全ての遺伝子、複合体、及び遺伝的プロセスについて統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）を生成する。本発明者らは用語「エンティティ」を、それが遺伝子か、複合体か、又は小分子かを問わず、パスウェイにおける任意の分子を指して使用する。エンティティのＩＰＡは最終活性のみを指す。遺伝子について、ＩＰＡはタンパク質の活性状態の推論された活性のみを指し、これは、パスウェイにおける他の遺伝子のコピー数、遺伝子発現、及びシグナル伝達から推論される。本発明者らはＰＡＲＡＤＩＧＭを卵巣試料に適用し、米国国立癌研究所のパスウェイ相互作用データベース（ＮＣＩ−ＰＩＤ）に含まれるパスウェイに存在する多くの異なる遺伝子及びプロセスの変化を見出した。本発明者らは１０００回のランダムシミュレーションを用いて推論された変化の有意性を評価し、これらのシミュレーションでは、同じ構造を有するパスウェイが使用されるが、パスウェイの種々の点に任意の遺伝子が割り当てられた。換言すれば、所定のパスウェイのあるランダムシミュレーションでは相互作用の集合は固定されたままであり、それ故任意の遺伝子集合はパスウェイ相互作用によって互いに連結された。全試料のＩＰＡの有意性は同じヌル分布に対して評価し、各試料におけるエンティティ毎の有意水準を得た。標準偏差が少なくとも０．１のＩＰＡを、図２８にヒートマップとして表示する。
（００１２４）表３は、ＰＡＲＡＤＩＧＭにより見出された順列化試料に関して少なくとも３標準偏差だけ変化するパスウェイを示す。ＦＯＸＭ１転写因子ネットワークは、検証した全てのパスウェイの中で最多数の試料において変化した−試料間で平均化したとき６７％のエンティティが活性の変化を有した。それに対して、卵巣コホートにおいて次に最も高いレベルの活性の変化を有したパスウェイには、ＰＬＫ１シグナル伝達イベント（２７％）、オーロラＢシグナル伝達（２４％）、及びトロンボキサンＡ２受容体シグナル伝達（２０％）が含まれた。従って、ＮＣＩ−ＰＩＤのパスウェイの中では、卵巣試料に関して、ＦＯＸＭ１ネットワークは他のパスウェイと比べて有意により大きく変化する活性を含む。
（００１２５）ＦＯＸＭ１転写因子ネットワークは、最も高い割合の患者試料において、正常対照と比較して腫瘍試料において示差的に変化することが分かった（図２９）。ＦＯＸＭ１は、３つの既知の支配的なスプライシング型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング型の各々は、細胞増殖及びＤＮＡ修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。ＦＯＸＭ１ｃアイソフォームは、ＡＵＫＢ、ＰＬＫ１、ＣＤＣ２５、及びＢＩＲＣ５を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節する（ＰＭＩＤ：１５６７１０６３）。他方で、ＦＯＸＭ１ｂアイソフォームは、ＤＮＡ修復遺伝子のＢＲＣＡ２及びＸＲＣＣ１を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節する（ＰＭＩＤ：１７１０１７８２）。ＡＴＭの間接的制御下にあるＣＨＥＫ２は、ＦＯＸＭ１発現レベルを直接調節する。
（００１２６）本発明者らは、ＦＯＸＭ１転写因子自体のＩＰＡは、他の転写因子のＩＰＡよりも高度に変化するかという問いを立てた。本発明者らはＦＯＸＭ１の活性レベルをＮＣＩ−ＰＩＤにおける他の２０３個の転写因子の全てと比較した。ＮＣＩ集合の他の転写因子と比較しても、ＦＯＸＭ１転写因子は有意に高いレベルの活性を有した（ｐ＜０．０００１；ＫＳ検定）ことから、それは重要なサインであり得ることが更に示唆される（図３０）。
（００１２７）ＦＯＸＭ１はまた、上皮起源の多くの異なる正常組織においても発現するため、本発明者らは、ＰＡＲＡＤＩＧＭにより同定されるサインが、他の組織では正常と見なされ得る上皮サインに起因するかという問いを立てた。これに答えるため、本発明者らは卵管上皮及び卵巣腫瘍組織が顕微解剖されたＧＥＯからの独立したデータセットをダウンロードし（ＧＳＥ１０９７１）（ＰＭＩＤ：１８５９３９８３）、遺伝子発現をアッセイした。本発明者らはＦＯＸＭ１のレベルは正常試料と比較して腫瘍試料において有意に高いことを見出し、それ故実際に癌性組織においては、ＦＯＸＭ１調節は正常上皮組織に見られるものを超えて亢進することが示唆される（図３１）。
（００１２８）ＴＣＧＡ卵巣コホート全体が高悪性度の漿液性腫瘍に由来する試料を含んだため、本発明者らは、ＦＯＸＭ１サインは高悪性度漿液性に特異的であるのかという問いを立てた。本発明者らは、低悪性度及び高悪性度の両方の漿液性腫瘍の転写プロファイルが決定されているＥｔｅｍａｄｍｏｇｈａｄａｍ ｅｔ ａｌ．（２００９）のデータセットから（Ｅｔｅｍａｄｍｏｇｈａｄａｍ Ｄ，ｄｅＦａｚｉｏ Ａ，Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ Ｒ，Ｍｅｒｍｅｌ Ｃ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ，Ｇｅｔｚ Ｇ，Ｔｏｔｈｉｌｌ Ｒ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ，Ｒａｅｄｅｒ ＭＢ，ＡＯＣＳ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｈａｒｎｅｔｔ Ｐ，Ｌａｄｅ Ｓ，Ａｋｓｌｅｎ ＬＡ，Ｔｉｎｋｅｒ ＡＶ，Ｌｏｃａｎｄｒｏ Ｂ，Ａｌｓｏｐ Ｋ，Ｃｈｉｅｗ ＹＥ，Ｔｒａｆｉｃａｎｔｅ Ｎ，Ｆｅｒｅｄａｙ Ｓ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｄ，Ｆｏｘ Ｓ，Ｓｅｌｌｅｒｓ Ｗ，Ｕｒａｓｈｉｍａ Ｍ，Ｓａｌｖｅｓｅｎ ＨＢ，Ｍｅｙｅｒｓｏｎ Ｍ，Ｂｏｗｔｅｌｌ Ｄ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ ＤＮＡ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９ Ｆｅｂ．；１５（４）：１４１７−１４２７）、ＦＯＸＭ１及びその標的のいくつかの対数発現を得た。この独立したデータから、ＦＯＸＭ１及びその標的のいくつかは、低悪性度卵巣癌と比較して漿液性卵巣癌において有意に上方制御されることが確認された（図３２）。ＦＯＸＭ１転写因子ネットワークの２５個の遺伝子が、高悪性度疾患において発現がより高い遺伝子の有意な割合を含んていたかどうかを決定するため、本発明者らはＥｔｅｍａｄｍｏｇｈａｄａｍのデータを使用してスチューデントのｔ検定を実施した。ゲノム中７２３個の遺伝子（５．４％）は、０．０５の有意水準で低悪性度癌と比べて高悪性度癌において有意に上方制御されることが分かった（ベンジャミニ・ホッホバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）の方法を用いて複数の試験に対して補正）。ＦＯＸＭ１ネットワークは、その遺伝子のうち１３個（５２％）が示差的に調節されることが分かった。これは、超幾何検定に基づけば有意な割合である（Ｐ＜３．８*１０-12）。従ってＦＯＸＭ１ネットワーク遺伝子の高発現は、ゲノムにおける典型的な遺伝子の発現と比較したとき、高悪性度疾患と確かに特異的に関連するように思われる。
（００１２９）乳癌及び肺癌を含め、多くの異なる癌におけるＦＯＸＭ１の役割は十分に実証されているが、卵巣癌におけるその役割はいまだ調査されていない。ＦＯＸＭ１は、３つの既知のスプライシング型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング型の各々は、細胞増殖及びＤＮＡ修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。この分析に関連するＦＯＸＭ１の相互作用ネットワークの抜粋を図２７に示す。ＦＯＸＭ１ａアイソフォームは、ＡＵＫＢ、ＰＬＫ１、ＣＤＣ２５、及びＢＩＲＣ５を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節する。対照的にＦＯＸＭ１ｂアイソフォームは、ＤＮＡ修復遺伝子のＢＲＣＡ２及びＸＲＣＣ１を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節する。ＡＴＭの間接的な制御下にあるＣＨＥＫ２は、ＦＯＸＭ１の発現レベルを直接調節する。卵巣患者のほとんどにおけるＦＯＸＭ１の発現増加に加えて、小さいサブセットはまた、ＣＢＳにより検出されるコピー数増幅の増加も有する（１９％が、計測したゲノムにおける全遺伝子の上位５％分位内のコピー数増加を伴う）。従って、ＦＯＸＭ１の選択的スプライシング調節はＤＮＡ修復と細胞増殖との間の制御スイッチに関与し得る。しかしながら、個別のアイソフォーム活性を区別することは、アイソフォームを区別するエクソン構造及びエクソンアレイプローブの位置によって困難なため、現時点ではこの主張を裏付けるデータは不十分である。これらの試料のｍＲＮＡの将来のハイスループットシーケンシングは、ＦＯＸＭ１アイソフォームの示差的レベルの決定を促進し得る。ＰＡＲＡＤＩＧＭがこの転写因子に集中した最高レベルの活性変化を検出したという観測から、ＦＯＸＭ１は細胞において重要な調節ポイントにあることが示唆される。
診断
（００１３０）本明細書に記載の方法を用いて、変化した遺伝子発現、ｍＲＮＡの発現過剰に対する非存在／存在を検出及び定量化し、又は治療介入中のｍＲＮＡレベルをモニタし得る。発現の変化に関連する病態、疾患又は障害としては、特発性肺動脈高血圧症、二次性肺高血圧症、細胞増殖性障害、特に退形成乏突起膠腫、星状細胞腫、乏突起星細胞腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経節神経腫、神経細胞腫瘍、多発性硬化症、ハンチントン病、乳腺腺癌、前立腺腺癌、胃腺癌、転移性神経内分泌癌、非増殖性線維嚢胞性及び増殖性線維嚢胞性の乳腺疾患、胆嚢炎及び胆石症、変形性関節症、並びに関節リウマチ；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック・東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、血液透析、体外循環、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原虫、及び蠕虫の感染症；プロラクチン産生障害、不妊症、例えば、卵管疾患、排卵異常、及び子宮内膜症、性周期の乱れ、月経周期の乱れ、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍又は卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、子宮外妊娠、及び催奇形性；乳癌、乳腺線維嚢胞症、及び乳汁漏出症；精子形成の乱れ、精子の生理異常、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病、インポテンス、女性化乳房；日光角化症、動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性赤血球増加症、原発性血小板血症、癌の合併症、癌、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、脳癌、乳癌、頸癌、胆嚢癌、ガングリオンの癌、消化管癌、心臓癌、腎癌、肝癌、肺癌、筋肉癌、卵巣癌、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、前立腺癌、唾液腺癌、皮膚癌、脾臓癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、及び子宮癌が挙げられる。別の態様において、本発明の核酸。
（００１３１）本明細書に記載の方法を用いて、変化した遺伝子発現；ｍＲＮＡの非存在、存在、又は過剰発現を検出及び定量化し；又は治療介入中のｍＲＮＡレベルをモニタし得る。発現の変化に関連する障害としては、静坐不能（ａｋａｔｈｅｓｉａ）、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患 クロイツフェルト‐ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、癲癇、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、神経障害、パーキンソン病、ピック病、網膜色素変性症、統合失調症、季節性情動障害、老年性認知症、脳卒中、トゥレット症候群並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を含む癌、特に脳の癌が挙げられる。
（００１３２）遺伝子発現に関連する病態、疾患又は障害の診断のための基礎を提供するため、正常な又は標準の発現プロファイルを確立した。これは、正常な対象（動物又はヒトのいずれか）から採取した生体試料を、ハイブリダイゼーション条件又は増幅条件下でプローブと組み合わせることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な対象を用いて得られた値を、既知量の実質的に精製された標的配列が用いられる実験値と比較することにより定量化され得る。このようにして得られた標準値は、特定の病態、疾患、又は障害の症状を示す患者の試料から得られた値と比較され得る。標準の値から特定の病態に関連する値の方への偏差を使用して、当該病態を診断する。
（００１３３）また、このようなアッセイを用いて、動物試験及び臨床試験において特定の治療的処置レジメンの効力を評価し、又は個別の患者の治療をモニタし得る。病態の存在が確定し、かつ治療プロトコルが開始されると、診断アッセイは定期的に繰り返され、患者における発現レベルが正常な対象で観測されるレベルに近付き始めるかどうかが決定され得る。継続的なアッセイから得られる結果を使用して、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたる治療効力が示され得る。
モデル系
（００１３４）動物モデルは、ヒトと同様の毒性応答を示し、かつ曝露条件がヒト曝露に適切である場合に、バイオアッセイとして用いることができる。哺乳動物は最も一般的なモデルであり、低コスト、利用し易さ、及び豊富な毒性学の参考文献のために、ほとんどの毒性試験がラット又はマウスなどのげっ歯類で行われている。近交系げっ歯類は、対象遺伝子の過小発現又は過剰発現の生理学的影響の研究、及び疾患の診断及び治療方法の開発に好都合なモデルを提供する。特定の遺伝子（例えば、乳中に分泌されるもの）を過剰発現するように同系交配した哺乳動物もまた、当該遺伝子により発現する好都合なタンパク質供給源として機能し得る。
毒性学
（００１３５）毒性学は、薬剤の生物系に及ぼす影響の研究である。毒性試験の大半はラット又はマウスで行われ、これらの薬剤がヒトの健康に及ぼす影響を予測するのに役立つ。生理機能、行動、恒常作用、及び致死性における定性的及び定量的な変化の観測を用いて毒性プロファイルを生成し、薬剤への曝露後のヒトの健康に及ぼす影響を評価する。
（００１３６）遺伝毒性学では、遺伝子突然変異を生じさせる薬剤の能力が同定及び分析される。遺伝毒性薬剤は、通常、核酸との相互作用を促進する共通の化学的又は物理的な特性を有し、かつ染色体異常が子孫に伝わるとき最も有害である。毒性学的研究では、受胎前の親、妊娠中の母親、又は発育中の生物体のいずれかに投与される場合に、子孫における構造的又は機能的な異常の頻度を増加させる薬剤が同定され得る。マウス及びラットは、統計学的要件を満たすのに必要な生物体数を産生するそれらの生殖周期が短いため、これらの試験において最も高頻度で使用される。
（００１３７）急性毒性試験は、薬剤を対象に単回投与して、その薬剤の症候学又は致死性を決定することに基づくものである。３つの実験が行われる：（ａ）初回用量範囲を判断する実験、（ｂ）有効用量の範囲を絞り込む実験、及び（ｃ）用量反応曲線を確立するための最終実験。
（００１３８）長期毒性試験は、薬剤の反復投与に基づくものである。これらの試験にはラット及びイヌが一般的に用いられ、異なるファミリーの種からのデータが提供される。発癌を除いて、薬剤を高用量濃度で３〜４ヶ月間にわたり連日投与すると、成体動物におけるほとんどの毒性形態が明らかになるという多数の証拠がある。
（００１３９）１年以上の継続期間を伴う慢性毒性試験は、薬剤の毒性の欠如又は発癌可能性のいずれかを実証するために用いられる。試験がラットで行われる場合、最低３つの試験群＋１つの対照群が用いられ、動物は、開始時及び実験中所定間隔で検査及び観察される。
トランスジェニック動物モデル
（００１４０）対象遺伝子を過剰発現又は過小発現するトランスジェニックげっ歯類を同系交配し、ヒト疾患をモデル化又は治療剤若しくは毒物を試験するために用い得る。（参照により本明細書に援用される米国特許第４，７３６，８６６号明細書；同第５，１７５，３８３号明細書；及び同第５，７６７，３３７号明細書を参照のこと）。ある場合には、導入された遺伝子は、胎児発育中又は出生後に特定の時点で特定の組織型において活性化され得る。実験的薬物治療の投与前、投与中、及び投与後のトランスジェニック動物における表現型又は組織特異的ｍＲＮＡ発現を分析することにより、導入遺伝子の発現が観察される。
胚性幹細胞
（００１４１）げっ歯類の胚から単離された胚性幹細胞（ＥＳ）は、胚を形成する能力を保持している。ＥＳ細胞を担体の胚内に置くと、それらの細胞は正常な発生を再開し、生産動物の全ての組織に寄与する。ＥＳ細胞は、実験的ノックアウト及びノックインげっ歯類株の作製に使用される好ましい細胞である。マウス１２９／ＳｖＪ細胞株などのマウスＥＳ細胞は初期マウス胚に由来し、当技術分野において周知の培養条件下で成長させる。ノックアウト株用のベクターは、生体内で転写及び／又は翻訳を妨害するマーカー遺伝子を含むように修飾された疾患遺伝子候補を含む。ベクターは、当技術分野において周知の電気穿孔法、リポソーム送達、顕微注入法などの形質転換法によってＥＳ細胞に導入される。内因性げっ歯類遺伝子は、細胞分裂中に相同組換え及び組込みによって破壊疾患遺伝子に置き換えられる。形質転換ＥＳ細胞が同定され、かつ好ましくはＣ５７ＢＬ／６マウス株由来のものなどのマウス細胞胚盤胞に顕微注入される。胚盤胞は偽妊娠の雌親に外科的に移植され、得られたキメラの子孫の遺伝子型を決定し、繁殖させてヘテロ接合又はホモ接合の株が産生される。
（００１４２）ＥＳ細胞はまた、神経細胞、造血系、及び心筋細胞などのインビトロで様々な細胞型及び組織の分化の研究にも用いられる（Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８：３４２−３５７；Ｗｉｌｅｓ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１１：２５９−２６７；及びＫｌｕｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２１６−２２４）。最近の進展では、ヒト胚盤胞に由来するＥＳ細胞もまた、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍｎａｌ）の細胞型を含む８つの別個の細胞系統に分化するようインビトロで操作し得ることが実証されている（Ｔｈｏｍｓｏｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
ノックアウト解析
（００１４３）遺伝子ノックアウト解析では、ヒト疾患遺伝子候補の領域は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ；例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２を参照のこと）などの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素的に修飾される。挿入されたコード配列は標的化遺伝子の転写及び翻訳を妨害し、疾患候補タンパク質の生化学合成を妨げる。修飾された遺伝子は、培養胚性幹細胞（上記に記載される）に形質転換され、形質転換細胞はげっ歯類胞胚に注入され、かつ胞胚は偽妊娠の雌親に移植される。トランスジェニック子孫を異種交配させると、ホモ接合近交系が得られる。
ノックイン解析
（００１４４）胚発生初期に存在する全能性ＥＳ細胞を使用して、ノックインヒト化動物（ブタ）又はヒト疾患のトランスジェニック動物モデル（マウス又はラット）を作製することができる。ノックイン技術によってヒト遺伝子のある領域は動物ＥＳ細胞に注入され、ヒト配列は組換えによって動物細胞ゲノムに組み込まれる。組み込まれたヒト遺伝子を含む全能性ＥＳ細胞は、上記に記載したとおり操作される。近交系動物は試験及び処置され、類似のヒト病態に関する情報が得られる。このような方法は、いくつかのヒト疾患のモデル化に用いられている。（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１１３７１−１１３７６；Ｂａｕｄｏｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：１２０２−１２１６；及びＺｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：３３４０−３３４９を参照のこと）。
非ヒト霊長類モデル
（００１４５）動物試験の分野では、生理学、遺伝学、化学、薬理学及び統計学などの基礎科学からのデータ及び方法論を取り扱う。このようなデータは、非ヒト霊長類に対する治療剤の効果の評価において、それがヒトの健康に関係し得るために最も重要である。サルは、ワクチン及び薬物の評価においてヒトの代理として使用され、その応答は同様の条件下でのヒト曝露に関係する。カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、マカカ・ムラタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔａ））及びコモンマーモセット（カリトリクス・ヤックス（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ））が、これらの研究で使用される最も一般的な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。ＮＨＰコロニーの育成及び維持は巨費を伴うため、通常、初期研究及び毒性学的試験はげっ歯類モデルで行われる。薬物中毒などの行動測定を用いる試験では、ＮＨＰは第一選択肢の試験動物である。加えて、ＮＨＰ及びヒト個体は、多くの薬物及び毒素に対して示差的感受性を示し、これらの薬剤の「高代謝群」及び「低代謝群」として分類することができる。
本発明の例示的使用
（００１４６）オーダーメイド医療は、利益を受ける可能性が最も高い患者に特異的な治療を送達するのに有望である。本発明者らは、治療化合物の約半数は、臨床的に関連する転写上又はゲノム上の乳癌サブタイプの１つ以上において選択的に有効であることを示した。これらの知見は、乳癌治療において応答に関連する分子サブタイプを定義することの重要性を支持している。本発明者らはまた、細胞株に関する転写及びゲノムのデータのパスウェイ統合は、観測されるサブタイプ特異的応答についての機構的説明を提供するサブネットワークを明らかにすることも示す。細胞株と腫瘍との間のサブネット活性の比較分析により、サブタイプ特異的サブネットワークの大部分が細胞株と腫瘍との間で保存されていることが示される。これらの分析から、十分に特徴付けられた細胞株パネルにおける実験的化合物の前臨床スクリーニングにより、初期段階の臨床試験における感受性濃縮に使用し得る応答に関連する分子サイン候補を同定できるという着想が裏付けられる。本発明者らは、このインビトロ評価手法が、化合物の臨床開発開始前に応答性の腫瘍サブタイプが同定される可能性を高め、それにより費用が低減され、最終的にＦＤＡ承認される確率が高まり、場合によっては応答する可能性が低い患者の治療に伴う毒性が回避されることを示唆する。この研究において、本発明者らは、転写サブタイプを定義する分子サインのみを評価し、反復されるゲノムＣＮＡを選択した。本発明者らは、遺伝子突然変異、メチル化及び選択的スプライシングなどの更なる分子構造を解析に含めると、本手法の検出力及び精度が増加すると期待する。同様に、細胞株パネルのサイズが大きくなるほど、パネル内であまり一般的ではない分子パターンを評価する検出力が増加し、かつヒト乳癌に存在する多様性のより完全な範囲を表現する確率が高まる。
（００１４７）乳癌の発生は、自然免疫細胞と適応免疫細胞との両方の存在の有意な増加により特徴付けられ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージは腫瘍性間質に存在する最も豊富な白血球に相当する（ＤｅＮａｒｄｏ ＤＧ，Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ＬＭ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；９（４）：２１２）。腫瘍間質（及び血清）における高い免疫グロブリン（Ｉｇ）値、及び過剰な濾胞性Ｂ細胞、調節性Ｔ細胞の存在量の増加、及び原発性腫瘍又はリンパ節におけるＣＤ４／ＣＤ８又はＴＨ２／ＴＨ１ Ｔリンパ球の高い比は、腫瘍悪性度、病期、及び全患者生存と相関することが示されている（Ｂａｔｅｓ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ａｔ ｒｉｓｋ ｏｆ ｌａｔｅ ｒｅｌａｐｓｅ，２４：５３７３−５３８０）；細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含め、白血球によっては抗腫瘍活性を呈し（３４ Ｄｕｎｎ，Ｇ．Ｐ．，Ｋｏｅｂｅｌ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．，（２００６），Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ，６：８３６−８４８）、肥満細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒球、及びマクロファージなどの他の白血球は、腫瘍進行を妨げるか、又は増強するその能力を通して、より二極化した役割を呈する（３５ ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ，Ｋ．Ｅ．ａｎｄ Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．Ｍ．，（２００６），Ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３：１１８−１３７）。これらの研究における最も傑出した知見は、免疫応答（ＴＣＲ）及びインターロイキンシグナル伝達、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２及びＩＬ２３シグナル伝達における摂動の同定であり、これは予後診断値によるサブクラスの分類をもたらすものであった。ここで本発明者らは、これらのイベントがハイスループット分子データにおいて反映され、乳房腫瘍の分子的な細分類に強く干渉するという証拠を提供する。
（００１４８）本開示はまた、ＨＧＳ−ＯｖＣａにおける異常についての初めての大規模な統合的見解も提供する。概して、突然変異スペクトルは驚くほど単純なものであった。ＴＰ５３における突然変異は優勢であり、ＨＧＳ−ＯｖＣａの少なくとも９６％において起こった一方、ＢＲＣＡ１／２は、生殖細胞突然変異と体細胞突然変異とを組み合わせたことにより、腫瘍の２２％で変異した。７つの他の有意に変異した遺伝子が同定されたが、ＨＧＳ−ＯｖＣａのわずか２−６％であった。対照的に、ＨＧＳ−ＯｖＣａは著しい度合いのゲノム配列の乱れ（ｄｉｓａｒｒａｙ）を実証する。高頻度のＳＣＮＡは、膠芽腫による先のＴＣＧＡの知見４６と顕著な対照をなし、ＴＣＧＡの知見では、反復的に変異する遺伝子がより多く、染色体腕レベル又は限局的なＳＣＮＡははるかに少なかった（図３７Ａ）。ＨＲ成分を含む推定ＤＮＡ修復遺伝子における突然変異及びプロモーターのメチル化の高率発生は、ＳＣＮＡの高率発生を説明し得る。突然変異スペクトルは、ＨＧＳ−ＯｖＣａを他のＯｖＣａ組織学的サブタイプとは完全に異なるものとして特徴付ける。例えば、明細胞ＯｖＣａはＴＰ５３突然変異が少ないが、反復されるＡＲＩＤ１Ａ及びＰＩＫ３ＣＡの突然変異を有し４７〜４９；類内膜ＯｖＣａは高頻度のＣＴＴＮＢ１、ＡＲＩＤ１Ａ、及びＰＩＫ３ＣＡの突然変異及びより低率のＴＰ５３を有する４８、４９一方、粘液性ＯｖＣａではＫＲＡＳ突然変異がよく見られる５０。卵巣癌サブタイプ間のこれらの差異は、病因学的効果と系統効果との組み合わせを反映していると思われ、サブタイプ別のケアによって卵巣癌転帰を改善する機会を表している。
（００１４９）新規治療手法の特定は、ＴＣＧＡの主目的である。ＨＲ欠損を含むＨＧＳ−ＯｖＣａの約５０％はＰＡＲＰ阻害薬によって利益を受け得る。更に、共通に調節解除されたパスウェイ、ＲＢ、ＲＡＳ／ＰＩ３Ｋ、ＦＯＸＭ１、及びＮＯＴＣＨは、治療的攻撃の機会を提供する。最後に、反復性の増幅領域における２２個の遺伝子に対する阻害薬は既に存在し（実施例ＸＩＩＩ以下を参照のこと）、標的遺伝子が増幅される場合のＨＧＳ−ＯｖＣａにおける評価を正当化する。総じてこれらの発見は、異常な遺伝子又はネットワークを検出し、かつこれらの特定の異常に有効となるよう選択される治療によって標的化されるＨＧＳ−ＯｖＣａの治療手法の土台を作るものである。
（００１５０）図４０では、パスウェイ解析エコシステム１００の例示的な概要を提示する。エコシステム１００は、好ましくは複数のパスウェイ要素１２５Ａ〜１２５Ｎ（総じてパスウェイ要素１２５と称する）を格納するパスウェイ要素データベース１２０を含むことができる。パスウェイ要素１２５の各々は、１つ以上のパスウェイへのその関与によって特徴付けることができる。要素１２５は、要素の特徴を表す１つ以上の特性又は値を含む別々に管理可能なデータオブジェクトと見なすことができる。いくつかの実施形態では、要素１２５は、特性又は値のｎタプルとみなすことができ、要素１２５タプルの各特性メンバーは、他の要素タプルの他の特性メンバーに対して比較、分析、対比するか、そうでなければ評価され得る。
（００１５１）修正エンジン１１０は、場合によりネットワークリンク（例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネット、ＶＰＮなど）を通じてパスウェイ要素データベース１２０と通信可能に連結する。いくつかの実施形態では、パスウェイ要素データベース１２０は、修正エンジン１１０の近傍にあってもよく、一方で他の実施形態では、パスウェイ要素データベース１２０は修正エンジン１１０から遠隔にあってもよい。例えば、パスウェイ要素データベース１２０は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｍｂｄａ Ｒａｉｌ（ＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｌｒ．ｎｅｔを参照のこと）やインターネットを介してアクセス可能である。更に、修正エンジン１１０、又はこのことに関してエコシステム１００は、ネットワークを通じて、場合によっては手数料と引き換えにユーザーがアクセスすることができる。
（００１５２）修正エンジン１１０は、分析のためにパスウェイ要素データベース１２０から１つ以上の要素１２５を取得する。好ましくは、修正エンジン１１０は、要素１２５の少なくとも１つ（例えば、要素１２５Ａ）を、少なくとも１つの先験的に既知の属性１３３と関連付ける。更に、修正エンジン１１０はまた別の要素、例えば要素１２５Ｎを仮の属性１３７と関連付ける。いくつかの実施形態では、修正エンジン１１０は、推論規則、プログラムによる命令、又は他の技術に基づいて、自動的に関連付けを行うことができる。例えば、既知の属性１３３は、公知の研究から得ることができ、一方で仮の属性１３７は、修正エンジン１１０が直列又は並列に仮の属性スペース間を通る属性パラメータ化スペースによって綿密に計画され得る。他の実施形態では、ユーザーは、場合によりＨＴＴＰサーバ又は他の適切なインターフェース技術により動作する１つ以上のユーザーインターフェース（図示しない）を介して、所望通りに属性１３３又は属性１３７を手動で関連付けることができる。
（００１５３）修正エンジン１１０は、更に既知の属性１３３及び仮の属性１３７を用いて、１つ以上のパスウェイについてのパスウェイ要素１２５を相互相関させる。更に、修正エンジン１１０は、要素１２５に１つ以上の影響レベル１４５を割り当てる。相互相関及び影響レベル１４５の割り当てによって、修正エンジン１１０はパスウェイが仮の属性１３７又は他の因子によってどのように影響され得るかを概説する確率的パスウェイモデル１４０を構築する。
（００１５４）いくつかの実施形態では、確率的パスウェイモデル１４０は、示唆されるように記録保管の目的で、又は分析のために、パスウェイモデルデータベース１５０内に格納され得る。要素１２５のように、確率的パスウェイモデル１４０はまた、場合によりｎタプルとして、モデルの特徴を表す特性又は値を有する個別的に管理可能なデータオブジェクトとして格納され得る。モデル１４５、又更には要素１２５も、任意の所望のスキーマによって格納され得る。要素データベース１２０又はモデルデータベース１５０を構築するために使用可能な例示的な適したデータベースとしては、ＭｙＳＱＬ、ＰｏｓｔｇｒｅＳＱＬ、Ｏｒａｃｌｅ、又は他の適切なデータベースが挙げられる。いくつかの実施形態では、データオブジェクト（例えば、要素１２５、確率的パスウェイモデル１４０など）には、簡単に検索や読み出しを可能にする方法で、その特性又は値により複数のインデックスを設けることができる。
（００１５５）エコシステム１００は、好ましくは、実際のデータに関連して確率的パスウェイモデル１４０を更に分析するよう構成された分析エンジン１６０を含む。示される例では、分析エンジン１６０は、場合によりユーザー又は研究者の指示の下で確率的パスウェイモデル１４０を取得し、ダイナミックパスウェイモデル１６５を導き出す。好ましくは、ダイナミックパスウェイモデル１６５は、患者試料からの１つ以上の計測属性１７３を確率的パスウェイモデル１４０と関連する属性と比較することによって導き出される。従って、分析エンジン１６０は、ダイナミックパスウェイモデル１６５を形成するために、確率的パスウェイモデル１４０を修正、更新、訂正するか、そうでなければ検証しようとする。完了すると、ダイナミックパスウェイモデル１６５は、モデルデータベース内に格納され得る。より好ましい実施形態では、分析エンジン１６０は、１つ以上の出力装置（例えば、ディスプレイ、プリンタ、ウェブサーバなど）を設定することで、ダイナミックパスウェイモデル１６５を提示することができる。
分析
（００１５６）従って、本発明の主題に係るシステムの使用は、一般的にパスウェイ要素データベースを含むものである。既に上述したように、データベースは物理的に単一のコンピュータに配置され得るが、分散型データベースも本明細書における使用に適していると考えられることが理解されるべきである。更に、このようなデータベースが複数のパスウェイ要素を格納及び検索できる限り、かつ各パスウェイ要素は少なくとも１つのパスウェイへのその関与により特徴付けられる限り、データベースの特定の形式は、本発明の主題に限定されるものではないことが理解されるべきである。
（００１５７）意図されるパスウェイ要素に関して、パスウェイの一部である全ての要素は本明細書に含まれることに留意されたい。従って、適切なパスウェイ要素としては、単独、又は他の細胞成分との複合体化する１種以上のタンパク質（例えば、グリコシル化、ミリストイル化などにより修飾されても又は修飾されなくてもよい）、天然の核酸又は組換え核酸であり得る様々な核酸（ゲノムＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）、脂質、ホルモン、セカンドメッセンジャー、及び治療剤又は予防剤として提供される薬学的に活性な薬剤が挙げられる。従って、及び別の観点から見て、意図されるパスウェイ要素は様々な機能を有し得、特に好ましい機能には種々の酵素機能がある。例えば、適切な機能は、キナーゼ／ホスファターゼ、ポリメラーゼ／ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、ヒドロラーゼ（特にＧＴＰアーゼ）、ヒドロキシラーゼ、メチルトランスフェラーゼ/メチラーゼなどである。
（００１５８）従って、パスウェイ要素がタンパク質である場合、適切なパスウェイ要素としては、様々な受容体、ホルモン結合タンパク質、キナーゼ、転写因子、開始因子、メチラーゼ及びメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、及びにヒストンデアセチラーゼが挙げられる。同様に、パスウェイ要素が核酸である場合、意図されるパスウェイ要素としては、タンパク質配列、１つ以上のゲノム調節配列、調節ＲＮＡ、及びトランス活性化配列をコードする核酸が挙げられる。
（００１５９）従って、特定のパスウェイ要素に応じて、パスウェイの性質はかなり変化し得、かつ全ての既知のパスウェイは本明細書における使用に適していると考えられることが理解されるべきである。例えば、意図されるパスウェイは、シグナル伝達、細胞周期、細胞増殖及び/又は代謝、修復機構（特にＤＮＡ修復）及び神経シグナル伝達に関与し得る。それ故、特に好ましいパスウェイとしては、カルシウム／カルモジュリン依存性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、サイトカイン媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、ケモカイン媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、成長因子シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、ホルモンシグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、ホスファターゼ媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、Ｒａｓスーパーファミリー媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワーク、並びに転写因子媒介性シグナル伝達パスウェイ及び機能的に関連するパスウェイのネットワークが挙げられる。従って、パスウェイは個々のパスウェイ、及びパスウェイネットワーク内のパスウェイ、更には個別的なパスウェイネットワークのネットワーク内のパスウェイであり得ることが理解されるべきである。例えば、本明細書において意図されるパスウェイは調節パスウェイネットワーク内にあってもよい。例えば、意図されるパスウェイネットワークには、加齢パスウェイネットワーク、アポトーシスパスウェイネットワーク、恒常性パスウェイネットワーク、代謝パスウェイネットワーク、複製パスウェイネットワーク、及び免疫応答パスウェイネットワークがある。
（００１６０）従って、パスウェイ要素の属性の種類及び数値は大幅に変化し得、かつ特定のパスウェイ要素は大部分において属性の種類及び数値を決定することは容易に明らかとなるはずである。例えば、パスウェイ要素が核酸である場合、属性は、コピー数、特定のハプロタイプ又は突然変異、調節要素の強度（例えば、プロモータ、リプレッサなど）、転写レベル又は翻訳レベルであり得る。更に、意図される属性はまた、クラス属性（例えば、遺伝子は、特定の転写因子によって活性化可能である、又は特定のホルモン応答要素に感受性がある、等）を含み、又は化合物属性（例えば、少なくとも２つの異なる属性を表す）であってもよい。同様に、パスウェイ要素がタンパク質である場合、属性は翻訳量、タンパク質活性、補因子の要件、活性をもたらすための多タンパク質複合体形成の要件などであり得る。
（００１６１）上記から容易に明らかであるように、パスウェイ要素の少なくともいくつかについての属性の少なくともいくつかは、先の研究及び刊行物から知られており、そのため、特定のパスウェイ要素についての先験的に既知の属性として意図されるシステム及び方法に使用することができる。一方で、数々の属性は、先験的に知られていないが、多種多様なこのような未知の属性は、合理的に良好な精度を期待して仮定できることが理解されるべきである。例えば、パスウェイ要素が受容体のゲノム配列であり、その配列はトランス活性化因子結合配列要素が先行する場合、パスウェイ要素の１つの属性はトランス活性化因子結合の要件であると合理的に仮定することができる。更に、トランス活性化の強度が同様の制御配列で知られている場合、パスウェイ要素の転写レベルは合理的に推論することができる。
（００１６２）従って、仮の属性は任意に仮定された値ではないが、仮定は少なくとも部分的に既知の情報に基づいていることに留意すべきである。更に、仮の属性の種類及び値はまた参照パスウェイの関数であることに留意すべきである。例えば、最も一般的には、参照パスウェイは健常な細胞のパスウェイである。このように、属性の数値範囲及び種類は、一般的に正常な細胞のそれを反映する。しかしながら、非正常細胞も参照パスウェイを確立するために使用され得ることを認識すべきである。
（００１６３）パスウェイ要素の属性は、多くの場合、少なくとも１つ以上の他のパスウェイ要素の１つ以上の属性に依存するので、現在多次元パスウェイマップは、各属性の量的範囲を必要とすることなく、概念的に単純かつ効果的な方法で構築することができることを特に認識すべきである。実際、数値線形値だけでなく、機能情報及び相互依存性も表現する属性を有するために、現在、複雑なパスウェイパターンを優れた分解能及び精度で確立することができる。
（００１６４）このようなパスウェイパターンは、一般的にはパスウェイ要素データベースに結合された修正エンジンを用いて生成され、修正エンジンを用いて（１）第１のパスウェイ要素を少なくとも１つの先験的に既知の属性と関連付け、（２）第２パスウェイ要素を少なくとも１つの仮の属性と関連付け、かつ（３）それぞれ既知の属性及び仮の属性を用いて、少なくとも１つのパスウェイについての第１パスウェイ要素及び第２パスウェイ要素を相互相関させて、少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当てることにより、最終的に確率的パスウェイモデルを形成する。例えば、第１のパスウェイ要素と少なくとも１つの先験的に既知の属性との関連付けは、多数の方法で行うことができる。しかしながら、属性はパスウェイ要素と直接関連付けられる属性のｎタプルの１つとして表現されることが特に好ましい。最も一般的には、既知の属性は論文審査された刊行物に由来する。しかしながら、２次情報源（例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＥＭＢＬ、ＯＭＩＭ、ＮＣＩ−ＰＩＤ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ、Ｂｉｏｃａｒｔａ、ＫＥＧＧなどの様々なデータベースで編集されて公的に入手可能な情報）も適していると考えられる。同様に、仮の属性は手動で、より好ましくは少なくとも半自動化された方法でパスウェイ要素と関連付けられる。
（００１６５）相互相関は多数の技術によって達成することができる。いくつかの実施形態では、パスウェイ要素は手動で相互相関され得る。しかしながら、より好ましい実施形態では、要素は１つ以上の自動化技術により相互相関され得る。例えば、多数の要素は、可能な相関を見出そうとする修正エンジンを介してその特性に関して分析され得る。修正エンジンは、多変量解析、遺伝的アルゴリズム、推論論法、又は他の技術を介して、このような相関を見出すように構成することができる。推論論法の例としては、演繹的論理、仮説論理、帰納論理、又は他の形態の論理を含む様々な形態の論理の適用が挙げられる。種々の形態の論理、特に仮説論理又は帰納論理を適用することにより、意図されるエンジンは可能性のある相関を発見することができ、それは別の方法では研究者は見落とすであろう。推論論法の別の例としては、確率伝搬、ループ確率伝搬、ジャンクションツリー、変数消去、又は他の推論方法などの確率モデルに推論を使用する適用が挙げられる。
（００１６６）影響レベルは、仮の属性が既知の属性を有する要素を含むパスウェイにおいて有する定量値を表すものである。影響レベルは、単一の値又は複数の値を含むことができる。単一の値の例は、場合により評価段階にあるパスウェイシステム内の他の既知の影響に対する絶対値、又は正規化値として、重み係数を含むことができる。例示的な多値の影響レベルは、可能な分布幅を有する値の範囲を含むことができる。更に、影響レベルの初期値は手動設定を含む様々な技術により確立することができる。より好ましい実施形態では、初期値は修正エンジンによって作成される手動の推定により確立することができる。例えば、１つ以上の要素又はパスウェイの特性による相対的な「距離」は、影響レベルを重み付けするために使用することができる。距離は、正確な距離であってもよく、又は距離の二乗であってもよい。別の例では、影響レベルは、パスウェイシステム内の他の全ての値の間の影響レベルにおける尤度を最大化することで決定することができる。
（００１６７）次に、相互相関及び影響の割り当ては、パスウェイ要素についての取得された属性及び仮の属性に基づいて確立される。更に、パスウェイ要素が既に既知のパスウェイ要素であるとき、要素のそれぞれのパスウェイへの関連性は先験的に確立されていることに留意されたい。しかしながら、また公知のシステム及び方法とは対照的に、そのように確立された確率的パスウェイモデルは、相互相関及び影響の割り当てを使用して、所定のパスウェイ内で各要素についての機能的相互関係及び重み付け効果を予測することを可能とする。当然ながら、確率的パスウェイモデルは、健常な細胞及び組織に対して、並びに老化、攻撃された、又はそうでなければ罹患した細胞又は組織に対して確立可能であることが理解されるべきである。
（００１６８）最も好ましくは、次に分析エンジンは確率的パスウェイモデルを使用して、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性からダイナミックパスウェイマップを導き出す。例えば、患者試料は、生体液、生検又は外科的検体に由来してもよく、一般的には、当技術分野で周知の方法を用いて分析される。従って、及び他の適切な属性の中で、計測属性には、突然変異、示差的遺伝子配列オブジェクト、１種以上の特定の遺伝子についての遺伝子コピー数、１種以上の特定の遺伝子についての転写レベル、１種以上の特定のタンパク質についての翻訳レベル、タンパク質活性、タンパク質相互作用、分析物（例えば代謝産物）の存在及び／又は量、又は疾患のマーカーなどがある。
（００１６９）特に好ましい態様では、計測属性は確率的パスウェイモデルに供給され、確率的パスウェイモデルからの逸脱を示すことができるダイナミックパスウェイマップに到達する。従って、ダイナミックパスウェイマップは、特定のパスウェイ（正常組織、罹患組織、加齢組織、又は組織回復などに対して特異的であり得る）についての参照パスウェイ活性情報をユーザーに提供することが理解されるべきである。従って、及び別の観点から見て、ダイナミックパスウェイマップは、比較的限られた数の計測属性に基づいて、患者試料中の１つ以上のパスウェイに関連する情報をユーザーが容易に識別することを可能にする。
（００１７０）従って、本発明者らはまた、ダイナミックパスウェイマップの生成方法も検討し、この方法は、複数のパスウェイ要素を含む確率的パスウェイモデルを格納するモデルデータベースへのアクセスをユーザーに提供する。当然ながら、特定のアクセスプロトコルが少なくとも部分的に特定の用途に基づいて決定されるように、このようなアクセスは様々な方法で制御することができる。しかしながら、アクセスは使用回数に応じて課金するアクセス又は事前に許可されたアクセスであることが一般に好ましい。あるいは、モデルデータベースはまた、公的にアクセス可能なネットワークを介してアクセス可能であってもよい。既に上記に記載したように、少なくともいくつかの複数のパスウェイ要素を相互相関させ、既知の属性に基づき少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当て、かつ別の数の複数のパスウェイ要素を相互相関させ、かつ仮の属性に基づき少なくとも１つのパスウェイについての影響レベルを割り当て、及び分析エンジンは、患者試料の複数の要素についての複数の計測属性により確率的パスウェイモデルを修正することでダイナミックパスウェイマップを取得し、ダイナミックパスウェイマップは特定のパスウェイについての最も好ましい参照パスウェイ活性を含むことが一般に好ましい。
（００１７１）当然ながら、意図されるシステム及び方法は、標準パスウェイモデル（例えば健康なドナーを表す）に対する第１の試料の分析に適しているだけでなく、このようなシステム及び方法は、健常組織に対する罹患組織の患者内分析も可能とし、組織についてのパスウェイ活性情報を予測することが理解されるべきである。従って、同じ患者からの２つの試料（すなわち罹患組織及び非罹患組織から）を使用して、特定の薬剤に対する罹患組織の感受性を予測することができる。それ故、本発明者らはまた、生物学的に関連する情報を分析する方法を検討し、この方法では、ダイナミックパスウェイマップを格納するモデルデータベースへのアクセスが提供され、ＤＰＭは、第１の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性によって確率的パスウェイモデルを修正することにより作成される。続いて、複数の計測属性は第２の細胞又は患者試料の複数の要素に対して取得され、次にダイナミックパスウェイマップ及び第２の細胞又は患者試料の複数の要素についての複数の計測属性は分析エンジンによって使用されて、第２の細胞又は患者試料についての予測パスウェイ活性情報を決定する。
（００１７２）それ故、第１の細胞又は患者試料の複数の要素についての計測属性は、健常な細胞又は組織、細胞又は組織の特定の年齢、細胞又は組織の特定の疾患、罹患した細胞又は組織の特定の病期、特定の性別、特定の民族、特定の職業集団、更には特定の人種に特徴的であり得る。このように計算された情報は、職業、薬品治療、疾患の素因などに関した実際の又は可能性が高いパスウェイの差異についての貴重な情報を提供し得る。従って、第１の試料及び第２の試料は、同時に同じ細胞又は患者から得られ、又は異なる時間（最も一般的には治療が開始された後）に得られる。本明細書に提示されるシステム及び方法の多くの用途が検討される一方で、特に好ましい用途には、ＤＰＭ及び創薬に基づいて１種以上の薬物に対する罹患細胞の感受性について患者を試験する用途がある。このような用途においては、患者又は患者試料は、処置（一般的には、手術、放射線照射及び薬剤の投与）が施された後に、潜在的な治療的価値の第２の薬剤を投与され得る。
（００１７３）このようなシステム及び方法を用いて、予測パスウェイ活性情報は、パスウェイ要素を少なくとも１つのパスウェイにおいて階層的に上位の要素として同定可能であり、及び／又はパスウェイ要素を疾患に関連する少なくとも１つのパスウェイにおいて疾患の決定因子である要素として同定可能であることが認識されるべきである。従って、高い可能性で所望の転帰を達成する標的様式において薬学的介入を使用することができる。予測パスウェイ活性情報が医師に提供される場合、予測パスウェイ活性情報のグラフィック表現を生成して、その情報を施術者のニーズにより適したものとすることが一般的に好ましい。更に、予測パスウェイ活性情報は、疾患についての診断、予後診断、又は推奨（例えば処置オプションの選択肢又は食事指導）を考案するために、システム及び/又はユーザーによって使用され得ることが意図される。或いは、又は更に、予測パスウェイ活性情報はまた、後成的要因、ストレス適応、生物体の状態、及び／又は修復若しくは治癒の状態を特定するために使用することができる。
（００１７４）既に説明したもの以外のさらに多くの変更が本明細書における本発明の概念から逸脱することなく可能であることは、当業者に明らかなはずである。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。更に、明細書及び特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈と一致して最も広い可能な様態で解釈されるべきである。特に、用語「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”ａｎｄ“ｃｏｍｒｉｓｉｎｇ”）は、非排他的態様で要素、成分、又はステップを指すものとして解釈されるべきであり、言及される要素、成分、又はステップは、明示的に言及されていない他の要素、成分、又はステップと存在、又は利用、又は組み合わせ可能であることを示唆する。明細書及び特許請求の範囲において、Ａ、Ｂ、Ｃ、．．．．及びＮから成る群より選択される何かの少なくとも１つを指す場合、文章は、Ａ＋Ｎ又はＢ＋Ｎなどではなく、群から１つの要素のみが必要とされるものとして解釈されるべきである。
（００１７５）更なる実施形態では、まだ開発されていない任意の分子生物学的技術において、そうした新しい技術が、限定されるものではないがトリプレット遺伝子コード及び特異的な塩基対相互作用などの特性を含む、現在公知の核酸分子の特性に頼るものであるならば、ポリヌクレオチド核酸が用いられ得る。
（００１７６）本発明は、以下の例を参照することにより、更に容易に理解されるであろう。これらの例は、本発明の特定の態様及び実施形態を単に例示する目的で含まれており、限定として含まれるものではない。
実施例Ｉ：データソース
（００１７７）Ｃｈｉｎ（２００７ 上記）の乳癌コピー数データを、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）から受託番号ＧＰＬ５７３７に基づき、ＧＳＥ８７５７からの関連するアレイプラットフォームアノテーションと共に入手した。
（００１７８）プローブアノテーションをＢＥＤ１５フォーマットに変換し、ＵＣＳＣ癌ゲノミクスブラウザ（ＵＣＳＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｂｒｏｗｓｅｒ）（Ｚｈｕ：２００９、上記）に表示して、続いて分析した。アレイデータをプローブＩＤによってプローブアノテーションにマッピングした。Ｎａｄｅｒｉ（２００７、上記）からの適合する発現データを、ＥＢＩ社のＭＩＡＭＩＥｘｐｒｅｓｓから受託番号Ｅ−ＵＣｏｎ−１を使用して入手した。Ｈｕｍａｎ １Ａ（Ｖ２）についてのプラットフォームアノテーション情報を、Ａｇｉｌｅｎｔ社のウェブサイトから入手した。発現データをプローブレベル中央値で正規化し、プローブＩＤによってＨＵＧＯ遺伝子名にマッピングした。
（００１７９）全てのデータを、全ての試料−プローブ値を含む順位付け手順を用いてノンパラメトリックに正規化し、順位に基づき各遺伝子−試料ペアに符号付きｐ値を与えた。０．０５の最大ｐ値を使用して、有意に変化した遺伝子−試料ペアを決定した。
（００１８０）ＴＣＧＡからの膠芽腫データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａプラットフォームにおいて２３０個の患者試料及び１０個の隣接する正常組織についての遺伝子発現を提供するＴＣＧＡ Ｄａｔａ Ｐｏｒｔａｌから入手した。患者試料のプローブを、各プローブの正常中央値を減じて正常組織に対して正規化した。加えて、同じ患者集合についてのＣＢＳでセグメント化（Ｏｌｓｈｅｎ：２００４ 上記 １６１８頁）されたコピー数データを入手した。両方のデータセットを、乳癌データと同じ手順を用いてノンパラメトリックに正規化した。
実施例ＩＩ：パスウェイ概論
（００１８１）本発明者らは、米国国立癌研究所パスウェイ相互作用データベース（ＮＣＩ ＰＩＤ）から利用可能なキュレーションされたパスウェイの集合を集めた（Ｓｃｈａｅｆｅｒ：２００９ 上記）。各パスウェイは、内因性及び外因性の細胞以下レベル、細胞レベル、組織レベル、又は生物体レベルのイベント及び表現型を表す高次の生体分子過程の周辺で論理的にグループ化された相互作用の集合を表す。ＢｉｏＰＡＸレベル２フォーマットのパスウェイをダウンロードした。全てのエンティティ及び相互作用を、Ｒａｓｑａｌ ＲＤＦエンジンを使用してＳＰＡＲＱＬクエリで抽出した。
（００１８２）本発明者らは、３つの物理的実態（タンパク質コード遺伝子、小分子、及び複合体）、遺伝子ファミリー、及び抽象的プロセスを含む５つの異なる種類の生物学的実体（エンティティ）を抽出した。ＢｉｏＰＡＸタンパク質についての相互参照が異なる遺伝子からのタンパク質を挙げるときは常に、遺伝子ファミリーを作成した。遺伝子ファミリーは、いずれの単一の遺伝子も特定の機能を果たすのに十分である遺伝子の集まりを表す。例えば、冗長な役割を有する相同体、及び互いを機能的に補うことが認められる遺伝子は、ファミリーに組み入れられる。
（００１８３）抽出により、種々のタイプを説明するアノテーション付きのパスウェイで使用されるあらゆるエンティティ及び相互作用のリストが作られた。本発明者らはまた、「アポトーシス」などの、ＮＣＩコレクションに存在し得る一般的なプロセスを指す抽象的プロセスも抽出した。例えば、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子が関与する相互作用を詳述するパスウェイはアポトーシス及び老化へのリンクを含み、それは機械学習による分類のための特徴として利用することができる。
（００１８４）予想どおり、Ｃ２Ｅ相関は中程度であったが、活性化相互作用間で、偶然で予想されるものと比べて正の相関に対して顕著な濃縮を有した（図３）。Ｅ２Ｅ相関は更に強く、同様に濃縮した。従って、特徴付けしにくい癌のこの例であっても、パスウェイ相互作用の有意なサブセットはゲノム変化を遺伝子発現における調節と連結し、パスウェイレベルの手法が追及するに値するという着想が裏付けられる。
実施例ＩＩＩ：生物学的パスウェイのモデル化及び予測
（００１８５）本発明者らは、初めに各ＮＣＩパスウェイを個別の確率モデルに変換した。ｐ５３アポトーシスパスウェイのごく一部の小例を図２に示す。ＮＣＩのパスウェイ図を、隠れ状態及び観測状態の両方を含む因子グラフに変換した。因子グラフは、エンティティ間の既知の相互作用を表す構造により、遺伝子関連及び生物学的プロセス関連の状態情報に関する観測を統合する。
（００１８６）生物学的パスウェイを因子グラフで表現するために、本発明者らは、特定のｍＲＮＡ又は複合体などの細胞中のエンティティの状態を変数を用いて記述し、かつこれらのエンティティ間の相互作用及び情報フローを因子を用いて表現する。これらの変数は各エンティティの示差的状態（＼ｔｅｘｔｉｔ｛ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ｝）を、分子エンティティの直接的な濃度ではなく、「対照」又は正常レベルとの比較で表現する。この表現により、本発明者らは、多くの場合に遺伝子の示差的状態を直接計測するか、又は直接的な計測値を対応する対照との相対的な計測値に変換するかのいずれかであるＤＮＡマイクロアレイによって検出される遺伝子発現などの、多くのハイスループットデータセットをモデル化することが可能になる。また、遺伝子間の多種の調節関係についても可能になる。例えば、ｐ５３のＭＤＭ２媒介性ユビキチン依存性分解を表す相互作用は、ｐ５３タンパク質レベルを阻害する活性化ＭＤＭ２としてモデル化することができる。
（００１８７）因子グラフは、各エンティティのランダム変数Ｘ＝｛ｘi，ｘi，．．．．，ｘn｝と、エンティティを制約して互いの関数として生物学的に意味のある値をとらせるｍ個の非負関数、すなわち因子の集合とを使用して細胞の状態を符号化する。ｊ番目の因子φjは、エンティティに関する部分集合Ｘj⊂Ｘの確率分布を定義する。
（００１８８）エンティティ及び因子のグラフ全体は、以下のとおりに全エンティティに関する同時確率分布を符号化する：
Figure 0006854792
 式中、Ｚ＝ΠjΣs xjφj（Ｓ）は正規化定数であり、Ｓ Ｘは、ＳがＸにおける変数の「セッティング」であることを表す。
（００１８９）各エンティティは、対照レベル（例えば、正常組織で計測されるとおりの）と比べて活性化、基準どおり、又は不活性化に対応する３つの状態のうちの１つをとることができ、それぞれ１、０、又は−１として符号化され得る。状態は、エンティティの種類（例えば、遺伝子、タンパク質等）に応じて様々に解釈され得る。例えば、活性化されたｍＲＮＡエンティティは過剰発現を表す一方、活性化されたゲノムコピーエンティティはゲノムに３コピー以上が存在することを表す。
（００１９０）図２は、単一のタンパク質コード遺伝子についての因子グラフの概念モデルを示している。パスウェイ中の各タンパク質コード遺伝子Ｇについて、エンティティを導入することによりゲノムのコピー数（ＧDNA）、ｍＲＮＡ発現（ＧmRNA）、タンパク質レベル（Ｇprotein）、及びタンパク質活性（Ｇprotein）（図２で「ＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「タンパク質」、及び「活性」と表示された楕円）を表現する。パスウェイの全ての化合物、タンパク質複合体、遺伝子ファミリー、及び抽象的プロセスに、本発明者らは分子タイプが「活性」の単一変数を含める。
（００１９１）図２の例は１つのプロセス（「アポトーシス」）のみを示すが、実際には多くのパスウェイは、遺伝子活性の出力（例えば、「アポトーシス」及び「老化」）から入力（例えば、「ＤＮＡ損傷」）に至る全てを表現するこのような複数のプロセスを有する。
（００１９２）因子の構成を単純にするため、本発明者らは初めにパスウェイを有向グラフに変換し、そのグラフの各エッジに正又は負のいずれかの影響のラベルを付与する。第一に、本発明者らは全てのタンパク質コード遺伝子Ｇについて、ＧDNAからＧmRNAに、ＧmRNAからＧproteinに、及びＧproteinからＧproteinにラベル「正」を有するエッジを加え、そのコピー数からその活性化形態のタンパク質産物の存在に至る遺伝子の発現を反映する。パスウェイ中の全ての相互作用は、有向グラフの単一のエッジに変換される。
（００１９３）この有向グラフを使用して、次に本発明者らは、因子グラフを特定する因子のリストを作成する。全ての変数ｘiについて、本発明者らは単一の因子φ（Ｘi）を加え、式中、Ｘi＝｛ｘi｝∪｛Ｐａｒｅｎｔｓ｝（ｘi）｝、及びＰａｒｅｎｔｓ（ｘi）は有向グラフにおけるｘiの全ての親を指す。全ての値のセッティングに対する因子の値は、ｘiがＰａｒｅｎｔｓ（ｘi）のセッティングによるその期待値に一致するかどうかに依存する。
（００１９４）この研究について、期待値は親変数の過半数の票に設定される。親が正のエッジにより連結される場合、それは、因子の値に対してそれ自体の状態の＋１倍の票に寄与する。逆に、親が負のエッジにより連結される場合、その変数はそれ自体の状態の−１倍を投票する。「最小」のラベルが付されたエッジによってｘiに連結される変数は、単一の票を獲得し、その票の値はこれらの変数の最小値であり、ＡＮＤ状の連結をもたらす。同様に、「最大」のラベルが付されたエッジによってｘiに連結される変数は、単一の票を獲得し、その票の値はこれらの変数の最大値であり、ＯＲ状の連結をもたらす。ゼロの票は棄権票として取り扱う。投票がない場合、期待される状態はゼロである。そうでない場合、過半数の票が期待される状態であり、かつ１と−１とが同点であると、抑制因子及び欠失により重点が置かれて−１の期待される状態となる。期待される状態のこの定義を考慮して、φi（ｘi，Ｐａｒｅｎｔｓ（ｘi））は以下のとおり特定される：
Figure 0006854792
（００１９５）ここに示す結果について、εは０．００１に設定したが、イプシロンの選択における桁の差異は結果に有意な影響を及ぼさなかった。最後に、本発明者らは因子グラフに観測変数及び因子を加えて、パスウェイ及び多次元機能的ゲノミクスデータの統合を完了する（図２）。離散化した機能的ゲノミクスデータセットの各々は、タンパク質コード遺伝子の分子タイプの１つに関連付けられる。
（００１９６）コピー数変化のアレイＣＧＨ／ＳＮＰ推定は「ゲノム」型に関連付けられる。遺伝子発現データは「ｍＲＮＡ」型に関連付けられる。ここでの結果に提示しないが、将来の拡張には、「ｍＲＮＡ」型のＤＮＡメチル化データ、並びに「タンパク質」型及び「活性」型のプロテオミクス及び遺伝子リシーケンシングのデータが含まれる。各観測変数はまた３つ組の値である。次に記載するとおり、各観測データ型に関連付けられる因子は全エンティティ間で共有され、データから学習される。
実施例ＩＶ：推論及びパラメータ推定
（００１９７）割り当ての集合Ｄ＝｛ｘ1＝ｓ1，ｘ2＝ｓ2，ｘ2，．．．．，ｘk＝ｓk｝は、添え字１〜ｋが付与された観測変数に関する患者のデータの完全集合を表すとする。｛ＳDＸ｝は、Ｄにおける割り当てと一致する変数Ｘの集合のあらゆる可能な割り当ての集合を表すとする；すなわち隠れ変数は変化し得るが、任意の観測変数ｘ1はＤにおけるその割り当てに固定される。
（００１９８）患者データを考慮して、本発明者らは、特定の隠れエンティティｘ1が状態ａであり得るかどうか、例えば、どの程度ＴＰ５３のタンパク質活性が−１（不活性化）であり得るか、又は「アポトーシス」が＋１（活性化）であり得るかを推定しようとする。これを行うには、本発明者らは患者のデータを観測する前にイベントの事前確率を計算しなければならない。Ａi（ａ）が単集合の割り当て集合｛ｘ1＝ａ｝を表し、かつφが完全に規定された因子グラフである場合、この事前確率は：
Figure 0006854792
 であり、式中、Ｚは方程式（１）に導入された正規化定数である。同様に、患者の全ての観測と共にｘ1が状態ａである確率は：
Figure 0006854792
 である。
（００１９９）本発明者らは、パスウェイの大部分にＨＵＧＩＮ最新版によるジャンクションツリー推論アルゴリズムを使用した。患者当たりの推論が３秒間より長くかかるパスウェイについては、本発明者らは、逐次更新、収束許容値１０-9、及び最大反復１０，０００回で信念伝搬法を使用する。全ての推論は、対数領域に対するものとしての実領域で実施し、ｌｉｂＤＡＩ（Ｍｏｏｉｊ：２００９ 上記）で実施した。
（００２００）観測因子のパラメータの学習に、本発明者らは期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズム（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ（１９７７）上記）を用いる。簡潔に言えば、ＥＭは、隠れ変数の確率を推論することと、隠れ変数の確率を所与とする尤度を最大化するようにパラメータを変更することとを反復して行うことにより、隠れ変数を含むモデルのパラメータを学習する。本発明者らはコードを書いてｌｉｂＤＡＩに提供し、ＥＭを実行した。各パスウェイについて、本発明者らは患者毎の因子グラフを作成し、患者データを適用し、かつ尤度の変化が０．１％未満になるまでＥＭを実行した。本発明者らは各パスウェイから学習したパラメータを平均化し、次にこれらのパラメータを使用して、各変数についての最終的な事後信念を計算した。
（００２０１）推論後、本発明者らは「活性」分子タイプを有する各変数について統合パスウェイ活性を出力した。本発明者らは方程式２及び３からの数量を使用して、エンティティｉの活性が上昇（ｕｏ）又は低下するという本発明者らの信念が患者データによって増加する程度を反映する対数尤度比を計算した：
Figure 0006854792
（００２０２）次に、本発明者らは、
Figure 0006854792
 として、対数尤度比に基づき遺伝子ｉについての単一の統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）を計算した。
（００２０３）直感的には、ＩＰＡスコアは、対数尤度比Ｌの符号付きの類似形を反映する。
（００２０４）遺伝子が活性化される可能性が高い場合、ＩＰＡはＬに設定される。或いは、遺伝子が不活性化される可能性が高い場合、ＩＰＡは対数尤度比の負値に設定される。遺伝子が変わらない可能性が最も高い場合、ＩＰＡはゼロに設定される。各パスウェイは、他のパスウェイとは独立して分析される。従って遺伝子は、１つの遺伝子がそれが現れる各パスウェイへと、複数の推論に関連付けられることができる。同じ遺伝子についての推論が異なることは、遺伝子のパスウェイ文脈に応じた代替的なデータ解釈と見ることができる。
実施例Ｖ：有意性評価
（００２０５）本発明者らは、データの２つの異なる順列によりＩＰＡスコアの有意性を評価する。「ｗｉｔｈｉｎ」順列について、初めにランダムな実サンプルを選択し、次に同じパスウェイ内からランダムな遺伝子を選択することによって、新しいデータタプル（すなわち対応した遺伝子発現及び遺伝子コピー数）の選択を、パスウェイの各遺伝子についてタプルが選択されるまで行うことにより、順列化したデータサンプルを作成する。
「ａｎｙ」順列も手順は同じであるが、ランダムな遺伝子を選択するステップは、ゲノムのどこからでも遺伝子を選択し得る。両方の順列タイプについて、１，０００個の順列サンプルが作成され、順列化サンプル毎に摂動スコアが計算される。順列化サンプルからの摂動スコアの分布をヌル分布として用いて、真の試料の有意性を推定する。
実施例ＶＩ：シグナル伝達パスウェイ影響解析（ＳＰＩＡ）
（００２０６）Ｔａｒｃａ（２００９，上記）によるシグナル伝達パスウェイ影響解析（ＳＰＩＡ）をＣで実行して実行時間を低減し、本発明者らの解析環境に適合するものとした。本発明者らはまた、より詳細な出力を提供する能力も追加して、ＳＰＩＡ出力とＰＡＲＡＤＩＧＭ出力とを直接比較できるようにした。本発明者らのＳＰＩＡバージョンは、パスウェイのエンティティ毎に累積摂動及び摂動係数を出力することができる。このコードは要求に応じて利用可能である。
実施例ＶＩＩ：デコイパスウェイ
（００２０７）各癌データセットについてデコイパスウェイ集合を作成した。各ＮＣＩパスウェイを使用してデコイパスウェイを作成し、これは同じ構造から成るが、パスウェイのあらゆる遺伝子はＲｅｆＧｅｎｅ社のランダム遺伝子に置換した。全ての複合体及び抽象的プロセスは同じままとし、ＰＡＲＡＤＩＧＭ及びＳＰＩＡの両方についての有意性分析を実パスウェイ及びデコイパスウェイの両方を含むパスウェイの集合に対して実行した。パスウェイは各方法内で順位付けし、全パスウェイに対する実パスウェイの割合を計算して視覚化した。
実施例ＶＩＩＩ：クラスタリング及びカプラン・マイヤー分析
（００２０８）重心連結による非中心化相関階層的クラスタリングを、Ｅｉｓｅｎ（１９９８ 上記 １６２１頁）の方法を用いて膠芽腫データに対して実行した。７５例の患者試料間で少なくとも０．２５のシグナルを有するＩＰＡのみをクラスタリングに使用した。目視検査により４つの明らかなクラスターが現れ、それをカプラン・マイヤー分析に使用した。Ｒを使用してカプラン・マイヤー曲線を計算し、ログランク統計によってｐ値を求めた。
実施例ＩＸ：ＰＡＲＡＤＩＧＭの検証
（００２０９）ＥＭ訓練手順の質を評価するため、本発明者らは遺伝子発現とコピー数とのタプル（Ｅ，Ｃ）が遺伝子及び患者にわたって順列化されているヌルデータセットと比べた実際の患者データを使用して、ＥＭの収束を比較した。予想どおり、ＰＡＲＡＤＩＧＭは、真のデータセットではヌルデータセットと比べてはるかに急速に収束した。例として、本発明者らは遺伝子ＡＫＴ１についてのＩＰＡをＥＭ反復の関数としてプロットした（図４）。活性が最初の数回の反復で急速に収束することが分かる。ＥＭは実際の患者データで訓練したとき活性化レベルに急速に収束したが、一方、ランダムデータを入れたときは活性不変に収束した。この収束により、パスウェイ構造及び推論は、統合された患者データにおける活性パターンを成功裏に特定可能であることが示唆される。
（００２１０）本発明者らは次に、乳癌及びＧＢＭの両方のコホートに対してＰＡＲＡＤＩＧＭを実行した。本発明者らは統計的シミュレーション手順を開発し、負の分布から予想され得るものと比べてどのＩＰＡが有意に異なるかを決定した。本発明者らは負の分布をパスウェイにおける全ての患者間及び遺伝子間で順列化することにより作成した。経験的に、本発明者らは、各遺伝子がネットワークにより決定される異なるトポロジー的文脈を有するという事実の補正を促進するには、パスウェイの遺伝子間のみでの順列化が必要であることが分かった。乳癌データセットでは、５６，１７２個のＩＰＡ（全体の７％）が、対応する陰性対照と比べて有意に高い又は低いことが分かった。平均して、ＮＣＩパスウェイは患者当たり４９７個の有意なエンティティを有し、１２７個中１０３個のパスウェイは２０％以上の患者で変化した少なくとも１つのエンティティを有した。ＧＢＭデータセットでは、１４１，６８２個のＩＰＡ（全体の９％）が、対応する陰性対照と比べて有意に高い又は低いことが分かった。平均して、ＮＣＩパスウェイは患者当たり６１６個の有意なエンティティを有し、１２７個中１１０個のパスウェイは２０％以上の患者で変化した少なくとも１つのエンティティを有した。
（００２１１）別のコントロールとして、本発明者らは、ＮＣＩパスウェイの遺伝子と同じように連結される任意の遺伝子から統合活性を得ることができるかという問いを立てた。これを行うため、本発明者らは偽発見率を推定し、それをＳＰＩＡ（Ｔａｒｃａ：２００９ 上記）と比較した。多くの遺伝的ネットワークが癌に関係していることが分かっているため、本発明者らは陰性対照集合として模擬「デコイ」パスウェイを使用することを選択した。各ＮＣＩパスウェイについて、本発明者らはＮＣＩパスウェイと同じネットワーク構造を使用してゲノム中のランダム遺伝子を互いに連結することにより、デコイパスウェイを作成した。
（００２１２）次に本発明者らはＰＡＲＡＤＩＧＭ及びＳＰＩＡを実行して、ＮＣＩパスウェイ及びデコイパスウェイの両方のＩＰＡを導き出した。ＰＡＲＡＤＩＧＭについては、本発明者らはパスウェイサイズで正規化した後に患者間で有意であることが分かったＩＰＡの数により、各パスウェイを順位付けした。ＳＰＩＡについては、パスウェイは、それらの計算された影響係数に従い順位付けした。本発明者らは、ＰＡＲＡＤＩＧＭはＳＰＩＡと比べて最上位の活性化パスウェイからより多くのデコイパスウェイを除外することを見出した（図５）。例えば乳癌では、ＰＡＲＡＤＩＧＭは、上位１０に１個、上位３０に２個、及び上位５０に４個のデコイを順位付けする。それに対してＳＰＩＡは、上位１０に３個、上位３０に１２個、及び上位５０に２２個のデコイを順位付けする。ＮＣＩ ＩＰＡの順位の全体的な分布は、順位の累積分布をプロットすることで観察すると、ＳＰＩＡよりもＰＡＲＡＤＩＧＭの方が高い（Ｐ＜＄０．００９、Ｋ−Ｓ検定）。
実施例Ｘ：乳癌及びＧＢＭにおける上位ＰＡＲＡＤＩＧＭパスウェイ
（００２１３）本発明者らは、ＮＣＩパスウェイを本発明者らの順列解析により検出されたエンティティ当たりのその有意なＩＰＡの平均数に従い並べ替え、乳癌（表１）及びＧＢＭ（表２）における上位１５を計算した。
（００２１４）上位１５のうちのいくつかのパスウェイは、既にそのそれぞれの癌に関連付けられている。乳癌では、ＳＰＩＡ及びＰＡＲＡＤＩＧＭの両方が、エストロゲン関連パスウェイ及びＥｒｂＢ２関連パスウェイを検出することができた。最近の主なメタ分析研究では（Ｗｉｒａｐａｔｉ Ｐ，Ｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｃ，Ｋｕｎｋｅｌ Ｓ，Ｆａｒｍｅｒ Ｐ，Ｐｒａｄｅｒｖａｎｄ Ｓ，Ｈａｉｂｅ−Ｋａｉｎｓ Ｂ，Ｄｅｓｍｅｄｔ Ｃ，Ｉｇｎａｔｉａｄｉｓ Ｍ，Ｓｅｎｇｓｔａｇ Ｔ，Ｓｃｈｕｔｚ Ｆ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＤＲ，Ｐｉｃｃａｒｔ Ｍ，Ｄｅｌｏｒｅｎｚｉ Ｍ．Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｔｏｗａｒｄ ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；１０（４）：Ｒ６５）、Ｗｉｒａｐｅｔｉらは、エストロゲン受容体及びＥｒｂＢ２の状態が、乳癌における僅か３つの主要な予後診断サインのうちの２つであることを見出した。ＰＡＲＡＤＩＧＭはまた、ＡＫＴ１関連ＰＩ３Ｋシグナル伝達パスウェイを、いくつかの試料において有意なＩＰＡを有する最上位のパスウェイとして特定することができた（図６を参照のこと）。
Figure 0006854792
Figure 0006854792
（００２１５）抗アポトーシスＡＫＴ１セリン−スレオニンキナーゼは乳癌に関与することが知られており、ＥＲＢＢ２パスウェイと相互作用する（Ｊｕ Ｘ，Ｋａｔｉｙａｒ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｃ，Ｌｉｕ Ｍ，Ｊｉａｏ Ｘ，Ｌｉ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｔｕｒｎｅｒ Ｊ，Ｌｉｓａｎｔｉ ＭＰ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＲＧ，Ｍｕｅｌｌｅｒ ＳＣ，Ｏｊｅｉｆｏ Ｊ，Ｃｈｅｎ ＷＳ，Ｈａｙ Ｎ，Ｐｅｓｔｅｌｌ ＲＧ．Ａｋｔ１ ｇｏｖｅｒｎｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００７ Ｍａｙ；１０４（１８）：７４３８−７４４３）。ＧＢＭでは、ＦＯＸＭ１及びＨＩＦ−１−αの両方の転写因子ネットワークが広範に研究されており、高悪性度の膠芽腫においては悪性度の低い神経膠腫と比べて過剰発現することが示されている（Ｌｉｕ Ｍ，Ｄａｉ Ｂ，Ｋａｎｇ Ｓ，Ｂａｎ Ｋ，Ｈｕａｎｇ Ｆ，Ｌａｎｇ ＦＦ，Ａｌｄａｐｅ ＫＤ，Ｘｉｅ Ｔ，Ｐｅｌｌｏｓｋｉ ＣＥ，Ｘｉｅ Ｋ，Ｓａｗａｙａ Ｒ，Ｈｕａｎｇ Ｓ．ＦｏｘＭ１Ｂ ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ａｐｒ．；６６（７）：３５９３−３６０２；Ｓｅｍｅｎｚａ ＧＬ．ＨＩＦ−１ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ：ｏｎｅ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０００ Ａｕｇ．；１４（１６）：１９８３−１９９１）。
実施例ＸＩ：データセットの視覚化
（００２１６）ＰＡＲＡＤＩＧＭ推論の結果を視覚化するため、本発明者らは、パスウェイにおける各遺伝子周りを中心として複数のデータセットを表示するための「ＣｉｒｃｌｅＭａｐ」視覚化を開発した（図７）。この表示では、遺伝子周りに同心円状の輪をプロットすることにより、各遺伝子がコホート間のその全てのデータと関連付けられ、各輪は、単一の種類の計測値又は計算推論に対応する。輪の中の各度数刻みは単一の患者試料に対応し、一方で色は活性化レベル（赤色）、不活性化レベル（青色）、又は不変化レベル（白色）の活性に対応する。本発明者らはＥｒｂＢ２パスウェイのサブセットについてＣｉｒｃｌｅＭａｐをプロットし、乳癌コホートからのＥＲ状態、ＩＰＡ、発現、及びコピー数データを含めた。
（００２１７）遺伝子発現データは、様々な癌の分子サブタイプを定義することに成功している。癌サブタイプは、薬物感受性及び全生存などの種々の臨床転帰と相関することが分かっている。本発明者らは、ＧＢＭについて、生の発現データではなくＰＡＲＡＤＩＧＭ ＩＰＡを使用して有益な情報を提供するサブタイプを同定できるかという問いを立てた。ＩＰＡを使用することの利点は、ＩＰＡが、コピー数、発現、及び遺伝子間の既知の相互作用における要約を提供し、従って意味のある患者サブグループを明らかにするためのよりロバストなサインを提供し得ることである。本発明者らは、初めに、ＧＢＭ試料間で少なくとも中程度に繰り返し活性化した全てのＩＰＡを決定し、１，７５５個のエンティティが２２９例中少なくとも７５例の試料で０．２５のＩＰＡを有したことを見出した。本発明者らはこれらのエンティティの全てのＩＰＡを活性行列に集めた。次に試料及びエンティティを、非中心化ピアソン相関及び重心連結による階層的クラスタリングを用いてクラスター化した（図８）。
（００２１８）目視検査から、ＩＰＡに基づき４つの明らかなサブタイプが明らかとなり、第４のサブタイプは最初の３つと明らかに異なった。第４のクラスターは、明らかなＨＩＦ−１−α転写因子ネットワークの下方制御並びにＥ２Ｆ転写因子ネットワークの過剰発現を示す。ＨＩＦ−１−αは、低酸素状態への応答の調節に関与する主転写因子である。対照的に、最初の３つのクラスターのうちの２つは、ＥＧＦＲサインが高く、かつＧＡＴＡインターロイキン転写カスケードを含む不活性ＭＡＰキナーゼカスケードを有する。興味深いことに、ＥＧＦＲの突然変異及び増幅は高悪性度の神経膠腫並びに膠芽腫と関連付けられている（Ｋｕａｎ ＣＴ，Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ＣＪ，Ｂｉｇｎｅｒ ＤＤ．ＥＧＦ ｍｕｔａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖＩＩＩ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ ２００１ Ｊｕｎ．；８（２）：８３−９６）。増幅及び特定の突然変異により、二量体の自己刺激又はリガンド非依存性の活性化のいずれかを介して構成的に活性なＥＧＦＲが生じ得る。ＥＧＦＲが構成的に活性化すると、腫瘍形成及び固形腫瘍の進行が促進され得る。ＥＧＦＲを標的化することが公知の分子であるゲフィチニブは、現在、他のＥＧＦＲ駆動の癌におけるその効力について調査されている。従って、定性的にはクラスターは患者を層別化し得る生物学的に有意義な論題に焦点を合わせているように思われる。
（００２１９）これらの観測を定量化するため、本発明者らは、ＰＡＲＡＤＩＧＭにより同定される種々のＧＢＭサブタイプが種々の生存プロファイルと一致するかという問いを立てた。本発明者らは、４つのクラスターの各々について、初回診断後の月数に対して生存患者の割合をプロットすることにより、カプラン・マイヤー曲線を計算した。本発明者らは４つのクラスターの各々についてカプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、個別的なＩＰＡサインと関連付けられる任意のクラスターが生存転帰を予測するかどうかを確かめた（図９）。第４のクラスターは他のクラスターと大きく異なる（Ｐ＜２．１１×１０-5；コックス比例ハザード検定）。最初の３つのクラスターの患者の半数は１８ヶ月を超えて生存する；クラスター４の患者について生存は有意に増加し、半数が３０ヶ月超生存する。加えて、２０〜４０ヶ月の範囲にわたり、クラスター４の患者は他のクラスターの患者の２倍生存する可能性が高い。
実施例ＸＩＩ：クラスターについてのカプラン・マイヤー生存プロット
（００２２０）生存分析から、クラスター４の患者は有意により良好な生存プロファイルを有することが明らかとなった。クラスター４は、網膜芽細胞腫抑制因子と共に作用するＥ２Ｆの上方制御を有することが分かった。従ってＥ２Ｆの上方制御は、クラスター４の患者からの腫瘍試料における細胞周期進行の能動的抑制と整合する。加えて、クラスター４はＨＩＦ−１−α転写因子の不活性と関連付けられた。第４のクラスターにおける不活性は、腫瘍がより酸素化されていて、それらがより小さい、又はより新しい腫瘍であり得ることを示唆するマーカーとなり得る。従って、ＰＡＲＡＤＩＧＭ ＩＰＡは、顕著に異なる生存転帰を有するサブタイプを描出するのに意味のあるプロファイル集合を提供する。
（００２２１）比較のため、本発明者らはまた、発現データ又はＣＮＡデータのみを用いた患者のクラスタリングにより、患者サブタイプを導き出すことを試みた。これらのデータソースのいずれを用いたクラスタリングからも明らかな群は見出されず、このデータセットの元のＴＣＧＡ解析における知見と一致した（ＴＣＧＡ：２００８）（図１４を参照のこと）。これは、遺伝子間の相互作用及び結果的に生じる個々の遺伝子発現の組み合わせ出力は、患者転帰としてのこのような複雑な表現型のより優れた予測因子を提供し得ることを示唆している。
実施例ＸＩＩＩ：卵巣癌の統合ゲノム解析：試料及び臨床データ。
（００２２２）この報告では、４８９個の臨床的にアノテートされたステージＩＩ−ＩＶのＨＧＳ−ＯｖＣａ及び対応する正常なＤＮＡの解析を取り上げている。患者は、ＨＧＳ−ＯｖＣａと診断された個体の診断時の年齢、病期、腫瘍悪性度、及び手術転帰を反映した。臨床データは２０１０年８月２５日現在のものであった。ＨＧＳ−ＯｖＣａ標本は全身的治療の前に外科的に切除され、但し全ての患者は白金剤の投与を受け、及び９４％がタキサンの投与を受けた。このコホートの無進行生存及び全生存の中央値は、既に公表されている治験１１、１２と同様である。患者の２５％は無病のままであり、及び４５％は最終経過観察時に生存していた一方、３１％は白金ベース療法の完了後６ヶ月以内に進行した。中央値の追跡は３０ヶ月であった（範囲０〜１７９）。ＴＣＧＡ解析用の試料は、７０％超の腫瘍細胞核、かつ２０％未満の壊死を有するよう選択した。
（００２２３）独立した部位に複数の分子アッセイを用いる協調分子解析を、表４に記載のとおり（データはｈｔｔｐ：／／ｔｃｇａ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄａｔａｐｏｒｔａｌで入手可能）二階層で実施した。階層１のデータセットは公開されているが、階層２のデータセットは個人を特定し得る臨床情報又はゲノム情報を含むため、ｈｔｔｐ：／／ｔｃｇａ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄａｔａｐｏｒｔａｌ／ｄａｔａ／ａｃｃｅｓｓ／ｃｌｏｓｅｄ／に記載されるとおり資格を必要とする。
実施例ＸＩＶ：突然変異解析。
（００２２４）３１６個のＨＧＳ−ＯｖＣａ試料から単離したＤＮＡ及び各個体に対応する正常試料に対し、エキソームキャプチャー及びシーケンシングを実施した。キャプチャー試薬は、合計約３３メガベースの非冗長配列の約１８，５００個の遺伝子から約１８０，０００個のエクソンを標的化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＧＡＩＩｘプラットフォーム（２３６試料ペア）又はＡＢＩ社のＳＯＬｉＤ ３プラットフォーム（８０試料ペア）での超並列シーケンシングにより、試料当たり約１４ギガベース（合計約９×１０9塩基）が得られた。平均して、コード塩基の７６％が腫瘍及び対応する正常試料の両方において十分な深さで網羅され、確信的な突然変異検出が可能となった。１９，３５６個の体細胞突然変異（腫瘍当たり約６１個）をアノテートし、表４に分類した。ＨＧＳＯｖＣａ病態生理学において重要であり得る突然変異を、（ａ）バックグラウンドと比べて有意に増加した頻度で存在する非同義変異又はスプライス部位変異を探し出し、（ｂ）この研究の突然変異をＣＯＳＭＩＣ及びＯＭＩＭの突然変異と比較し、かつ（ｃ）タンパク質機能に対する影響を予測することにより、同定した。
（００２２５）２つの異なるアルゴリズムにより、非同義変異又はスプライス部位変異の数が突然変異分布モデルに基づき予想される数を有意に上回った９個の遺伝子が同定された（表５）。公表されている結果１３と一致して、ＴＰ５３は３１６個中３０３個の試料において突然変異し（２８３個は自動化された方法により、かつ２０個は手動検査後）、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２は、それぞれ９％及び８％のケースで生殖細胞系列突然変異を有し、両方とも更に３％のケースで体細胞突然変異を示した。６つの他の統計的に繰り返し突然変異した遺伝子が同定された；ＲＢ１、ＮＦ１、ＦＡＴ３、ＣＳＭＤ３、ＧＡＢＲＡ６、及びＣＤＫ１２。ＣＤＫ１２はＲＮＡスプライシング調節に関与するもので１４、これまでに肺及び大腸の腫瘍に関係付けられた１５、１６。９個のＣＤＫ１２突然変異のうちの５個はナンセンス又はインデルのいずれかであったことから、潜在的な機能喪失が示唆され、一方４個のミスセンス突然変異（Ｒ８８２Ｌ、Ｙ９０１Ｃ、Ｋ９７５Ｅ、及びＬ９９６Ｆ）はそのプロテインキナーゼドメインにおいてクラスター化された。ＧＡＢＲＡ６及びＦＡＴ３は、両方とも有意に突然変異したと見られたが、ＨＧＳ−ＯｖＣａ又は卵管組織では発現しないようであったため、これらの遺伝子の突然変異がＨＧＳ−ＯｖＣａにおいて有意な役割を果たす可能性は低い。
（００２２６）本研究による突然変異をＣＯＳＭＩＣ１７及びＯＭＩＭ１８のデータベースの突然変異と比較して、一般的にそれほど突然変異しない更なるＨＧＳ−ＯｖＣａ遺伝子を同定した。これにより、ＢＲＡＦ（Ｎ５８１Ｓ）、ＰＩＫ３ＣＡ（Ｅ５４５Ｋ及びＨ１０４７Ｒ）、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）、及びＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｒ）における突然変異を含め、それぞれ４７７個及び２１１個のマッチが得られた。これらの突然変異は形質転換活性を呈することが示されているため、本発明者らは、これらの突然変異はまれであるものの、ＨＧＳ−ＯｖＣａにおける重要なドライバーであると考える。
（００２２７）本発明者らは、タンパク質ファミリー及び全脊椎動物ゲノムの配列アラインメントからの進化情報と、予測される局所的なタンパク質構造と、選択されるヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質特徴とを組み合わせることにより、既知の癌遺伝子及び腫瘍抑制因子における突然変異に関する訓練後に、ＣＨＡＳＭを使用して推定ドライバー突然変異を同定した１９、２０。ＣＨＡＳＭにより、腫瘍形成性を有すると予測される１２２個のミスセンス突然変異が同定された。タンパク質機能における突然変異により駆動される変化を、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ａｓｓｅｓｓｏｒを使用してタンパク質ファミリー配列アラインメント及び既知の又は相同性に基づく三次元タンパク質構造における残基配置を比較することによって、全ての確認済みの体細胞ミスセンス突然変異についての進化情報から推測した。ミスセンス突然変異の２７パーセントはタンパク質機能に影響を与えると予測された。
実施例ＸＶ：コピー数解析。
（００２２８）４８９個のＨＧＳ−ＯｖＣａゲノムに存在する体細胞性コピー数変化（ＳＣＮＡ）を同定し、図３７Ａにおいて多形膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍｅ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）データと比較した。ＳＣＮＡは、広範な染色体領域に影響を及ぼす領域性異常と、より小さい限局性異常とに分けた。領域性異常の統計的解析により８個の繰り返し起こる獲得及び２２個の喪失が同定され、その全てが既に報告されている２２（図３７Ｂ）。獲得のうち５個及び喪失のうち１８個は、５０％超の腫瘍で起こった。
（００２２９）ＧＩＳＴＩＣを使用して、繰り返し起こる限局性ＳＣＮＡを同定した。これにより、８個以下の遺伝子をコードする２６領域を含む６３領域の限局性増幅（図３７Ｃ）が得られた。最も一般的な限局性増幅はＣＣＮＥ１、ＭＹＣ、及びＭＥＣＯＭをコードし（図３７Ｃ）、各々２０％超の腫瘍で高度に増幅された。ＨＧＳ−ＯｖＣａにおける新たな極めて限局化された増幅ピークは、活性化Ｃキナーゼ受容体のＺＭＹＮＤ８；ｐ５３標的遺伝子のＩＲＦ２ＢＰ２；ＤＮＡ結合タンパク質阻害薬のＩＤ４；胚発生遺伝子のＰＡＸ８；及びテロメラーゼ触媒サブユニットのＴＥＲＴをコードした。３つのデータソース：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ／、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａを使用して、増幅された過剰発現遺伝子の潜在的治療阻害因子を同定した。この調査により、少なくとも１０％のケースで増幅されたＭＥＣＯＭ、ＭＡＰＫ１、ＣＣＮＥ１及びＫＲＡＳを含め、治療標的である２２個の遺伝子が同定された。
（００２３０）ＧＩＳＴＩＣにより５０個の限局的な欠失も同定された。腫瘍の少なくとも２％において、既知の腫瘍抑制遺伝子であるＰＴＥＮ、ＲＢ１、及びＮＦ１はホモ接合性欠失領域にあった。重要なことには、ＲＢ１及びＮＦ１はまた有意に変異した遺伝子の中にもあった。１つの欠失は、５個の非同義変異及び２個のフレームシフト突然変異を有する必須細胞周期制御遺伝子のＣＲＥＢＢＰを含め、３つの遺伝子のみを含んだ。
実施例ＸＶＩ：ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの発現並びにＤＮＡメチル化解析。
（００２３１）３つの異なるプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＨｕＥｘ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＵ１３３Ａ）からの１１，８６４個の遺伝子についての発現計測値を、サブタイプを同定かつ転帰を予測するために組み合わせた。個々のプラットフォーム計測値は、限定的な、しかし統計的に有意なバッチ効果を受けたが、一方、組み合わせたデータセットはそれを受けなかった。組み合わせたデータセットの解析から約１，５００個の本質的に変化し易い遺伝子が同定され、それらをＮＭＦコンセンサスクラスタリングに使用した。この解析により４つのクラスターが得られた（図３８ａ）。同じ解析手法をＴｏｔｈｉｌｌらの公的に利用可能なデータセットに適用し、同様に４つのクラスターを得た。ＴｏｔｈｉｌｌのクラスターとＴＣＧＡクラスターとの比較により、明らかな相関が示された。従って本発明者らは、ＨＧＳ−ＯｖＣａには少なくとも４つのロバストな発現サブタイプが存在すると結論付ける。
（００２３２）本発明者らは、その４つのＨＧＳ−ＯｖＣａサブタイプを、クラスターに含まれる遺伝子及び先行する観測２５に基づき、免疫反応型、分化型、増殖型及び間葉型と名付けた。Ｔ細胞ケモカインリガンドのＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ１０、並びに受容体のＣＸＣＲ３は、免疫反応型サブタイプを特徴付けた。ＨＭＧＡ２及びＳＯＸ１１などの転写因子の高発現、卵巣腫瘍マーカー（ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６）の低発現並びにＭＣＭ２及びＰＣＮＡなどの増殖マーカーの高発現は、増殖型サブタイプを定義した。分化型サブタイプはＭＵＣ１６及びＭＵＣ１の高発現並びに分泌性卵管マーカーのＳＬＰＩの発現と関連付けられ、より成熟した発達段階が示唆された。ＨＯＸ遺伝子の高発現並びに筋線維芽細胞（ＦＡＰ）及び微小血管周皮細胞（ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１）などの間質成分の増加を示唆するマーカーが、間葉型サブタイプを特徴付けた。
（００２３３）ＤＮＡメチル化の上昇及び腫瘍発現の低下により、１６８個の遺伝子は、卵管対照と比較してＨＧＳ−ＯｖＣａにおいて後成的にサイレンシングされたものとして関係付けられた２６。ＤＮＡメチル化は全試料にわたり遺伝子発現の低下と相関した。ＡＭＴ、ＣＣＬ２１及びＳＰＡＲＣＬ１は、大多数の腫瘍でプロモーター過剰メチル化を示したため、注目に値した。奇妙にも、卵巣癌で増幅及び過剰発現することが以前に報告されているＲＡＢ２５もまた、腫瘍のサブセットにおいて後成的にサイレンシングされるようであった。ＢＲＣＡ１プロモーターは、既に報告されているとおり、４８９個中５６個（１１．５％）の腫瘍で過剰メチル化及びサイレンシングされた。腫瘍間での様々なＤＮＡメチル化のコンセンサスクラスタリングにより、年齢、ＢＲＣＡ不活性化イベント、及び生存における差異と有意に関連付けられた４つのサブタイプが同定された。しかしながら、これらのクラスターは中程度の安定性しか示さなかった。
（００２３４）ＴＣＧＡデータセットにおける転写サブタイプについて、生存期間に有意な差異はなかった。増殖型群はＭＹＣ増幅及びＲＢ１欠失の速度低下を示したのに対し、免疫反応型サブタイプは３ｑ２６．２（ＭＥＣＯＭ）増幅頻度の増加を示した。ＤＮＡメチル化クラスターと遺伝子発現サブタイプとの間の中程度の、しかし有意な重複が指摘された（ｐ＜２．２*１０-16、カイ二乗検定、調整ランド指数＝０．０７）。
（００２３５）２１５個の試料からの統合した発現データセットを用いて、全生存を予測し得る１９３個の遺伝子の転写サインを定義した。一変量コックス回帰分析の後、１０８個の遺伝子は不良な生存率と相関し、かつ８５個は良好な生存率と相関した（０．０１のｐ値カットオフ）。独立した２５５個のＴＣＧＡ試料の集合並びに３個の独立した発現データセットにおいて予測力を検証した２５、２９、３０。検証試料の各々に、その発現プロファイルと予後診断遺伝子サインとの間の類似性を反映して、予後診断遺伝子スコアを割り当てた３１（図３８ｃ）。このサインのカプラン・マイヤー生存分析から、全ての検証データセットにおいて生存率との統計的に有意な関連性が示された（図３８ｄ）。
（００２３６）ｍｉＲＮＡ発現データのＮＭＦコンセンサスクラスタリングにより、３つのサブタイプが同定された。興味深いことに、ｍｉＲＮＡサブタイプ１はｍＲＮＡ増殖型サブタイプと重複し、かつｍｉＲＮＡサブタイプ２はｍＲＮＡ間葉性サブタイプと重複した（図３８ｄ）。生存期間はｉＲＮＡサブタイプ間で有意に異なり、ｍｉＲＮＡサブタイプ１腫瘍の患者の生存は有意に長かった（図３８ｅ）。
実施例ＸＶＩＩ：疾患に影響するパスウェイ。
（００２３７）いくつかの分析により、３１６例の完全に解析されたケースからのデータが統合され、ＨＧＳ−ＯｖＣａに寄与する生物学が特定された。既知の癌関連パスウェイが１つ以上の突然変異、コピー数変化、又は遺伝子発現変化を含む頻度の解析から、ＲＢ１パスウェイ及びＰＩ３Ｋ／ＲＡＳパスウェイがそれぞれ６７％及び４５％のケースで調節解除されたことが示された（図３９Ａ）。ＨｏｔＮｅｔ３３を使用して大規模タンパク質間相互作用ネットワーク３２において変化したサブネットワークを調べることで、ＨＧＳ−ＯｖＣａ試料の２３％で変化したＮｏｔｃｈシグナル伝達パスウェイを含め、いくつかの既知のパスウェイが同定された（図３９Ｂ）。
（００２３８）公表された研究では、突然変異した若しくはメチル化したＢＲＣＡ１又は突然変異したＢＲＣＡ２を含む細胞は相同組換え（ＨＲ）欠陥を有し、ＰＡＲＰ阻害薬に高度な応答性を有することが示されている３５〜３７。図３９Ｃは、ＨＧＳ−ＯｖＣａの２０％がＢＲＣＡ１／２に生殖細胞系列突然変異又は体細胞突然変異を有し、１１％がＤＮＡ過剰メチル化によってＢＲＣＡ１発現を失っており、かつＢＲＣＡ１の後成的サイレンシングはＢＲＣＡ１／２突然変異と相互排他的である（Ｐ＝４．４×１０-4、フィッシャーの直接確率検定）ことを示している。ＢＲＣＡ状態の一変量生存分析から（図３９Ｃ）、ＢＲＣＡ突然変異ケースはＢＲＣＡ野生型ケースと比べて全生存（ＯＳ）がより良好であることが示された。興味深いことに、後成的にサイレンシングしたＢＲＣＡ１ケースは、ＢＲＣＡ１／２ ＷＴ ＨＧＳ−ＯｖＣａと同様の生存を示した（ＯＳ中央値４１．５ヶ月対４１．９ヶ月、Ｐ＝０．６９、ログランク検定）。これは、ＢＲＣＡ１が相互排他的なゲノム機構及びエピゲノム機構により不活性化されること、及び患者生存が不活性化機構に依存することを示唆している。この研究で見出された、細胞をＰＡＲＰ阻害薬に対して感受性にし得る他のＨＲ遺伝子におけるゲノム変化としては、ＥＭＳＹの増幅又は突然変異（８％）、ＰＴＥＮの限局的な欠失又は突然変異（７％）；ＲＡＤ５１Ｃの過剰メチル化（３％）、ＡＴＭ／ＡＴＲの突然変異（２％）、及びファンコニ貧血遺伝子の突然変異（５％）が挙げられる。概して、ＨＲ欠陥はＨＧＳ−ＯｖＣａの約半数に存在し得るもので、腫瘍これらのＨＲ関連異常を標的化するＰＡＲＰ阻害薬の臨床試験に対する理論的根拠を提供する。
（００２３９）ＢＲＣＡ不活性化イベントの完全集合を全ての繰り返し変化したコピー数ピークと比較することにより、ＢＲＣＡ不活性化のケースにおいて予想外に低いＣＣＮＥ１の増幅頻度が明らかとなった（ＢＲＣＡ野生型ケースの２６％と比べて、ＢＲＣＡが変化したケースの８％はＣＣＮＥ１増幅を有した、ＦＤＲ調整Ｐ＝０．００４８）。既に報告されているとおり３９、全生存はＣＣＮＥ１増幅を有する患者について、他の全てのケースと比較して短くなる傾向があった（Ｐ＝０．０７２、ログランク検定）。しかしながら、ＢＲＣＡ野生型のケースのみを調べたとき、ＣＣＮＥ１が増幅したケースについての生存上の不利は見られなかったため（Ｐ＝０．２４、ログランク検定）、既に報告されているＣＣＮＥ１の生存の差異は、ＢＲＣＡが突然変異したケースのより良好な生存により説明され得ることが示唆される。
（００２４０）最後に、確率的グラフィカルモデル（ＰＡＲＡＤＩＧＭ４０）により、ＮＣＩパスウェイ相互作用データベースにおける変化したパスウェイを調べ、ＦＯＸＭ１転写因子ネットワーク（図３９Ｄ）を８７％のケースで有意に変化したものとして同定した。ＦＯＸＭ１及びその増殖関連標的遺伝子；ＡＵＲＢ、ＣＣＮＢ１、ＢＩＲＣ５、ＣＤＣ２５、及びＰＬＫ１は、一貫して過剰発現したが、転写調節の指標となるＤＮＡコピー数変化によっては変化しなかった。ＴＰ５３はＤＮＡ損傷後にＦＯＸＭ１を抑制することから４２、ＨＧＳ−ＯｖＣａにおける高率のＴＰ５３突然変異はＦＯＸＭ１の過剰発現に寄与することが示唆される。他のデータセットにおいて、ＦＯＸＭ１パスウェイは隣接上皮組織と比べて腫瘍で有意に活性化され、ＨＧＳ−ＯｖＣａと関連付けられる。
実施例ＸＶＩＩＩ：卵巣漿液性癌において高頻度で変化したパスウェイ
（００２４１）コピー数及び遺伝子発現の両方の統合解析によって有意に変化したパスウェイを同定するため、本発明者らはＰＡＲＡＤＩＧＭを適用した。この計算モデルはコピー数変化、遺伝子発現データ、及びパスウェイ構造を組み込み、パスウェイデータベースに存在する全ての遺伝子、複合体、及び遺伝的プロセスについて統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）を生成する。本発明者らは用語「エンティティ」を、それが遺伝子か、複合体か、又は小分子かを問わず、パスウェイにおける任意の分子を指して使用する。エンティティのＩＰＡは、最終活性のみを指す。遺伝子について、ＩＰＡはタンパク質の活性状態の推論された活性のみを指し、これは、パスウェイにおける他の遺伝子のコピー数、遺伝子発現、及びシグナル伝達から推論される。本発明者らはＰＡＲＡＤＩＧＭを卵巣試料に適用し、米国国立癌研究所のパスウェイ相互作用データベース（ＮＣＩ−ＰＩＤ）に含まれるパスウェイに存在する多くの異なる遺伝子及びプロセスの変化を見出した。本発明者らは１０００回のランダムシミュレーションを用いて推論された変化の有意性を評価し、これらのシミュレーションでは、同じ構造を有するパスウェイが使用されるが、パスウェイの種々の点に任意の遺伝子が割り当てられた。換言すれば、所定のパスウェイのあるランダムシミュレーションでは、相互作用の集合は固定されたままであり、それ故任意の遺伝子集合はパスウェイ相互作用によって互いに連結された。全試料のＩＰＡの有意性は同じヌル分布に対して評価し、各試料におけるエンティティ毎の有意水準を得た。ＩＰＡ及びそれらが有意である試料の割合及び標準偏差が少なくとも０．１のＩＰＡを、図２８にヒートマップとして表示する。
（００２４２）表３は、ＰＡＲＡＤＩＧＭにより見出された順列化試料に関して少なくとも３標準偏差だけ変化するパスウェイを示す。ＦＯＸＭ１転写因子ネットワークは、検証した全てのパスウェイの中で最多数の試料において変化した−試料間で平均化したとき６７％のエンティティが活性の変化を有した。それに対して、卵巣コホートにおいて次に最も高いレベルの活性の変化を有したパスウェイには、ＰＬＫ１シグナル伝達イベント（２７％）、オーロラＢシグナル伝達（２４％）、及びトロンボキサンＡ２受容体シグナル伝達（２０％）が含まれた。従って、ＮＣＩ−ＰＩＤのパスウェイの中では、卵巣試料に関して、ＦＯＸＭ１ネットワークは他のパスウェイと比べて有意により大きく変化する活性を含む。
（００２４３）ＦＯＸＭ１転写因子ネットワークは、最も高い割合の患者試料において、正常対照と比較して腫瘍試料において示差的に変化することが分かった（図２９）。ＦＯＸＭ１は、３つの既知の支配的なスプライシング型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング型の各々は、細胞増殖及びＤＮＡ修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。ＦＯＸＭ１ｃアイソフォームは、ＡＵＫＢ、ＰＬＫ１、ＣＤＣ２５、及びＢＩＲＣ５を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節する。他方で、ＦＯＸＭ１ｂアイソフォームは、ＤＮＡ修復遺伝子ＢＲＣＡ２及びＸＲＣＣ１を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節する。ＡＴＭの間接的制御下にあるＣＨＥＫ２は、ＦＯＸＭ１発現レベルを直接調節する。
（００２４４）本発明者らは、ＦＯＸＭ１転写因子自体のＩＰＡは、他の転写因子のＩＰＡよりも高度に変化するかという問いを立てた。本発明者らはＦＯＸＭ１の活性レベルをＮＣＩ−ＰＩＤにおける他の２０３個の転写因子の全てと比較した。ＮＣＩ集合の他の転写因子と比較しても、ＦＯＸＭ１転写因子は有意に高いレベルの活性を有した（ｐ＜０．０００１；ＫＳ検定）ことから、それは重要なサインであり得ることが更に示唆される（図３０）。
（００２４５）ＦＯＸＭ１はまた、上皮起源の多くの異なる正常組織においても発現するため、本発明者らは、ＰＡＲＡＤＩＧＭにより同定されるサインが、他の組織では正常と見なされ得る上皮サインに起因するかという問いを立てた。これに答えるため、本発明者らは卵管上皮及び卵巣腫瘍組織が顕微解剖されたＧＥＯからの独立したデータセットをダウンロードし（ＧＳＥ１０９７１）、遺伝子発現をアッセイした。本発明者らはＦＯＸＭ１のレベルは正常試料と比較して腫瘍試料において有意に高いことを見出し、それ故実際に癌性組織においては、ＦＯＸＭ１調節は正常上皮組織に見られるものを超えて亢進することが示唆される（図３１）。
（００２４７）乳癌及び肺癌を含め、多くの異なる癌におけるＦＯＸＭ１の役割は十分に実証されているが、卵巣癌におけるその役割はいまだ調査されていない。ＦＯＸＭ１は、３つの既知のスプライシング変異型を有する多機能性転写因子であり、スプライシング変異型の各々は、細胞増殖及びＤＮＡ修復において様々な役割を有する個別的な遺伝子サブセットを調節する。この分析に関連するＦＯＸＭ１の相互作用ネットワークの抜粋を図２７に示す。ＦＯＸＭ１ａアイソフォームは、ＡＵＫＢ、ＰＬＫ１、ＣＤＣ２５、及びＢＩＲＣ５を含めた、細胞増殖において既知の役割を有するいくつかの標的を直接調節する。対照的にＦＯＸＭ１ｂアイソフォームは、ＤＮＡ修復遺伝子のＢＲＣＡ２及びＸＲＣＣ１を含む完全に異なる遺伝子サブセットを調節する。ＡＴＭの間接的な制御下にあるＣＨＥＫ２は、ＦＯＸＭ１の発現レベルを直接調節する。卵巣患者のほとんどにおけるＦＯＸＭ１の発現増加に加え、小さいサブセットはまた、ＣＢＳにより検出されるコピー数増幅の増加も有する（１９％が、計測したゲノムにおける全遺伝子の上位５％分位内のコピー数増加を伴う）。従って、ＦＯＸＭ１の選択的スプライシング調節はＤＮＡ修復と細胞増殖との間の制御スイッチに関与し得る。しかしながら、個別のアイソフォーム活性を区別することは、アイソフォームを区別するエクソン構造及びエクソンアレイプローブの位置によって困難なため、現時点ではこの主張を裏付けるデータは不十分である。これらの試料のｍＲＮＡの将来のハイスループットシーケンシングは、ＦＯＸＭ１アイソフォームの示差的レベルの決定を促進し得る。ＰＡＲＡＤＩＧＭがこの転写因子に集中した最高レベルの活性変化を検出したという観測から、ＦＯＸＭ１は細胞において重要な調節ポイントにあることが示唆される。
実施例ＸＩＸ：データセット及びパスウェイ相互作用
（００２４８）コピー数及び発現データの両方をＰＡＲＡＤＩＧＭ推論に組み込んだ。８個の正常組織対照の集合が発現データにおける解析に利用可能であったため、患者の遺伝子値の各々を、正常な卵管対照で観察される遺伝子の中央値レベルを減じることにより正規化した。コピー数データは、腫瘍で検出された遺伝子レベルと、それに対する血液正常レベルとの間のコピー数の差異を反映するように正規化した。ＰＡＲＡＤＩＧＭへの入力のために、発現データは、サブタイプ解析に使用したものと同じ統合データセットから取り、コピー数は、ＭＳＫＣＣ Ａｇｉｌｅｎｔ社の１Ｍコピー数データのセグメント化コールから取った。
（００２４９）１３１個のパスウェイ、１１，５６３個の相互作用、及び７，２０４個のエンティティを含むＮＣＩ−ＰＩＤからパスウェイの集合体を入手した。エンティティは、ＰＡＲＡＤＩＧＭのグラフィカルモデルにおいて「ノード」として表現される分子、複合体、小分子、又は抽象概念である。抽象概念は、一般的な細胞プロセス（「アポトーシス」又は「光の吸収」など）、及びシグナルトランスデューサーのＲＡＳファミリーなどの機能的活性を共有する遺伝子ファミリーに対応する。本発明者らは、タンパク質間相互作用、転写調節相互作用、リン酸化及びユビキチン化などのタンパク質修飾相互作用を含む相互作用を収集した。
実施例ＸＸ：パスウェイ文脈における統合分子活性の推論。
（００２５０）本発明者らは、コピー数、遺伝子発現、及び各エンティティのパスウェイ文脈を反映する統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）を割り当てるＰＡＲＡＤＩＧＭを使用した。
（００２５１）データの遺伝子特異的及び患者特異的な断面の順列を使用して、ＩＰＡの有意性を評価した。ゲノム中の各遺伝子についての遺伝子発現とコピー数とのペアの値を無作為に選択することにより、１０００個の「ヌル」患者のデータを作成した。ＰＡＲＡＤＩＧＭ ＩＰＡの有意性を評価するため、本発明者らはパスウェイ構造を維持しながらパスウェイにランダム遺伝子を割り当てることにより、ヌル分布を作成した。
実施例ＸＸＩ：ＦＯＸＭ１パスウェイの同定
（００２５２）ＦＯＸＭ１ネットワーク内の全ての遺伝子を使用してランダムシミュレーションの間に統計的有意性を評価したが、ＦＯＸＭ１パスウェイの視覚化を可能とするため、図２９により有意に変化したＩＰＡを有するＦＯＸＭ１に直接連結されたエンティティを、図２７に含めるために選択した。これらのうち、ＤＮＡ修復及び細胞周期制御において役割を有する遺伝子であって、ＦＯＸＭ１との相互作用について文献の裏付けがあると認められたものを表示した。元のＮＣＩ−ＰＩＤパスウェイに見出されなかったＢＲＣＣ複合体メンバーを、ＮＣＩ−ＰＩＤによればＦＯＸＭ１の標的であるＢＲＣＡ２と共にプロットに含めた。上流ＤＮＡ修復標的を、他のＮＣＩパスウェイにおけるＣＨＥＫ２の上流調節因子を見つけることにより同定した（例えば、ＰＬＫ３シグナル伝達パスウェイにおいてＡＴＭからの間接的リンクが見出された）。
実施例ＸＸＩＩ：クラスタリング
（００２５３）活性及び非活性の確率の変化を直接的に表す推論活性の使用により、様々な種類のエンティティをまとめて１つのヒートマップにクラスター化することが可能となる。ＰＡＲＡＤＩＧＭ推論の結果を包括的に視覚化するため、Ｅｉｓｅｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０を使用して特徴フィルタリング及びクラスタリングを実施した。０．１の標準偏差フィルタリングにより７２０４個中１５９８個のパスウェイエンティティが残り、エンティティ及び試料の両方に対して平均連結法、非中心化相関階層的クラスターを実施した。
実施例ＸＸＩＩＩ：細胞株は多くの重要な腫瘍のサブタイプ及び特徴をモデル化する。
（００２５４）臨床的に関連する分子的応答予測因子の同定に対する細胞株の有用性は、腫瘍における応答を決定する多様な分子機構が細胞株内でどの程度機能するかに依存する。本発明者らは、転写物及びゲノムコピー数の両方のレベルでの細胞株モデルと原発腫瘍との間の類似性に関して以前に報告しており9、本発明者らはここでこの比較を、より高分解能のプラットフォーム及び解析技法を用いて改良する。具体的には、本発明者らは遺伝子発現プロファイルの階層的コンセンサスクラスタリング（ＨＣＣ）を使用して、５０個の乳癌細胞株及び５個の非悪性乳房細胞株を３つの転写サブタイプ：ルミナル、基底細胞及び新しく記載するクローディン低に分類した（図１４Ａ）。これらのサブタイプは先述したものの改良版であり、基底細胞及びクローディン低（ｃａｌｕｄｉｎ−ｌｏｗ）は、それぞれ先に指定した基底細胞Ａ及び基底細胞Ｂのサブタイプに対応する、表７。改良版高分解能ＳＮＰコピー数解析（図１４Ｂ）により、細胞株パネルは、８ｑ２４（ＭＹＣ）、１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）、１７ｑ１２（ＥＲＢＢ２）、２０ｑ１３（ＳＴＫ１５／ＡＵＲＫＡ）の繰り返し生じる増幅領域、及び原発腫瘍に見られる９ｐ２１（ＣＤＫＮ２Ａ）のホモ接合性欠失をモデル化することが確認される。トラスツズマブ及びラパチニブ療法により決定されるとおりのＥＲＢＢ２腫瘍サブタイプの臨床的関連性を考慮すると、本発明者らは、ＥＲＢＢ２AMPと指定される特別なサブタイプとして、ＥＲＢＢ２のＤＮＡ増幅を伴う細胞株を調べた。概して、ルミナル型、基底細胞型、クローディン低型及びＥＲＢＢ２AMP型の細胞株における本発明者らの同定は、臨床生物学と一致している。
実施例ＸＩＶ：細胞株はほとんどの治療化合物に示差的感受性を示す。
（００２５５）本発明者らは、７７種の治療化合物に対する本発明者らの細胞株パネルの感受性を調べた。本発明者らは細胞成長アッセイを用い、定量的終点は９つの濃度の各薬剤に３日間連続的に曝露した後に計測した。試験した抗癌化合物には、従来の細胞傷害剤（例えば、タキサン、プラチノール、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｌｉｎｅ））と標的化薬剤（例えば、ＳＥＲＭ及びキナーゼ阻害薬）との混合物が含まれた。多くの場合、いくつかの薬剤は同じタンパク質又は分子的作用機構を標的化した。本発明者らは、各化合物についての応答の定量的尺度を、５０％だけ成長を阻害するのに必要な濃度（ＧＩ50と称する）として決定した。基礎となる成長データは高品質であるものの、５０％阻害が達成されなかった場合、本発明者らはＧＩ50を試験した最高濃度に設定した。ＧＩ50値は全ての化合物について表８に提供する。本発明者らは、３つの化合物（ＰＳ１１４５、セツキシマブ及びバイカレイン）は細胞株応答の変動が最小限であったため更なる解析から除外した。
（００２５６）Ｓｉｇｍａ ＡＫＴ１−２阻害薬に対する応答の変動を、関連する転写サブタイプと共に示す代表的なウォーターフォールプロットを図１０Ａに示す。この化合物に対する感受性はルミナル型及びＥＲＢＢ２AMP型の乳癌細胞株で最も高く、基底細胞型及びクローディン低型の乳癌細胞株ではより低かった。全ての化合物についての細胞株間のＧＩ50値の分布を示すウォーターフォールプロットを表示する。本発明者らは、３回又は４回の反復による２２９個の化合物／細胞株の組み合わせについてのＧＩ50値の絶対偏差中央値を計算することにより、データセット全体の再現性を確立した。これらの反復にわたる平均偏差中央値は０．１５であった（図１５）。本発明者らは、ＧＩ50値の集合間の対ピアソン相関を計算することにより、８種の化合物に対する応答の一致を評価した（図１５Ｂ．同様の作用機構を有する薬物のペアに対する感受性は高度に相関したことから、同様の作用機構が示唆される。
実施例ＸＶ：多くの化合物は細胞株のサブセットにおいて選択的に有効である。
（００２５７）本研究の主な前提は、細胞株における予測性のある分子構造がヒト腫瘍に反映される場合に、前臨床細胞株分析で認められる応答と分子サブタイプとの間の関連性が診療室で繰り返し起こり得ることである。本発明者らは、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡを用いて応答−サブタイプの関連性を確立し、転写サブタイプ及びゲノミクスサブタイプ間のＧＩ50値を比較した。
（００２５８）概して、試験した７４個中３３個の化合物は、転写サブタイプ特異的な応答を示した（ＦＤＲ ｐ＜０．２、表７及び表９）。図１０Ｃは、ルミナル、基底細胞、クローディン低及びＥＲＢＢ２AMPのサブタイプの１つ以上と有意な関連性を有する３４個の薬剤の階層的クラスタリングを示している。サブタイプと最も強い関連性を有する１１個の薬剤は、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達及びヒストンデアセチラーゼの阻害薬であり、ルミナル型及び／又はＥＲＢＢ２AMP型の細胞株において最も高い効力を有した。次に最も高い３つのサブタイプ特異的薬剤−エトポシド、シスプラチン、及びドセタキセル−は、臨床的に観察されるとおり、基底細胞型及び／又はクローディン低型の細胞株において選択的活性を示す。イクサベピロン、ＧＳＫ４６１３６４（ポロキナーゼ阻害薬）及びＧＳＫ１０７０９１６（オーロラキナーゼ阻害薬）を含む分裂装置を標的化する薬剤もまた、基底細胞型及びクローディン低型の細胞株に対して活性がより高かった。ＥＧＦＲ及び／又はＥＲＢＢ２を標的化するＡＧ１４７８、ＢＩＢＷ２９９２及びゲフィチニブの全ては、ＥＲＢＢ２増幅と正の関連性を有した。ＨＳＰ９０の阻害薬であるゲルダナマイシンもまた、ＥＲＢＢ２増幅と正の関連性を有した。興味深いことに、ＶＸ−６８０（オーロラキナーゼ阻害薬）及びＣＧＣ−１１１４４（ポリアミン類似体）は、両方ともＥＲＢＢ２増幅と負の関連性を有したことから、これらはＥＲＢＢ２AMP型腫瘍には比較的不適当な治療法であることが示される。
（００２５９）本発明者らは、応答と、繰り返し起こる限局的な高レベルのコピー数異常（ＣＮＡ；標本のｔ検定、ＦＤＲ ｐ＜０．２、表１０）との間に、７つの関連性（６つの固有の化合物）を同定した。図１０Ｄは以下を示す：（ａ）９ｐ２１（ＣＤＫＮ２Ａ及びＣＤＫＮ２Ｂ）におけるホモ接合性欠失は、ビノレルビン、イクサベピロン及びファスカプリシン（ｆａｓｃａｌｙｐｓｉｎ）に対する応答と関連性を有した。ファスカプリシン（ｆａｓｃａｌｙｐｓｉｎ）はＣＤＫ４を阻害し、この特異性は、ＣＤＫ４の阻害におけるＣＤＫＮ２Ａのｐ１６INK4A産物における役割と一致する20。（ｂ）２０ｑ１３（ＡＵＲＫＡをコードする）における増幅は、ＡＵＲＫＢ及びＡＵＲＫＣを標的化するＧＳＫ１０７０９１６及びＶＸ−６８０に対する感受性よりむしろ、耐性と関連性を有した23。これは、ＡＵＲＫＡの増幅がＡＵＲＫＢ及びＡＵＲＫＣ阻害薬に対する迂回機構を提供することを示唆する。（ｃ）１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）における増幅は、カルボプラチン及びＡＵＲＫＢ／Ｃ阻害薬のＧＳＫ１０７０９１６に対する感受性と関連性を有した。
実施例ＸＶＩ：サブタイプ特異性は成長速度効果を支配する。
（００２６０）概して、本発明者らは、ルミナル型サブタイプの細胞株は基底細胞型又はクローディン低型の細胞より成長が遅く（クラスカル・ワリス検定 ｐ＝０．００６、図１６Ａ及び表７）、倍加時間の範囲が広かった（１８〜３００時間）ことを見出した。これにより、最も感受性が高い細胞株は最も速く成長する細胞株である可能性が提起された。そうであるならば、次に観測されたサブタイプとの関連性は共変量との関連性を表し得る。本発明者らは、この仮説を共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を用いてサブタイプ及び倍加時間の効果を同時に評価することにより検証し、３３個中２２個のサブタイプ特異的化合物は、倍加時間よりサブタイプとより良好な関連性を有したことが分かった（ｐ値の平均対数比＝０．９２、標準偏差１．１１）。これは、サブタイプの構成員は成長速度よりも良好な応答予測因子であるという着想を支持するものである。更に、３３個中１５個のサブタイプ特異的化合物は、よりゆっくりと成長するルミナル型細胞株において有効性がより高かった（表７）。１つの薬剤、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｏｒｏｕｒａｃｉｌ）は、サブタイプの検証単独では有意ではなかったが、ＡＮＣＯＶＡモデルではクラス及び倍加時間の両方に対して強い有意性を示した。５−フルオロウラシル（５−ｆｌｏｒｏｕｒａｃｉｌ）に対する応答は、ルミナル型細胞株及び基底細胞型細胞株の両方で倍加時間が増加するにつれて低下した（図１６Ｂ）。本発明者らは、ほとんどの場合に、３日間の成長阻害アッセイは、成長速度によって強い影響を受けない分子サイン特異的応答を検出していると結論付ける。
実施例ＸＶＩＩ：コピー数及び転写計測値の統合により、サブタイプ特異的応答のパスウェイが同定される。
（００２６１）本発明者らは、ネットワーク解析ツールのＰＡＲＡＤＩＧＭ24を使用して、細胞株パネルのサブタイプ間におけるパスウェイ活性の差異を同定した。この解析は、キュレーションされたパスウェイが部分的に重複するという事実によって複雑化する。例えばＥＧＦＲ、ＰＩ３キナーゼ及びＭＥＫは、実際にはそれらが単一のより大きいパスウェイの構成要素であるときに、別個のパスウェイとしてキュレーションされることが多い。この問題に対処するため、ＰＡＲＡＤＩＧＭは約１４００個のキュレーションされたシグナル伝達パスウェイ、転写パスウェイ及び代謝パスウェイを単一の重畳パスウェイ（ＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）にまとめ合わせ、このような冗長性を排除する。特定の細胞株についてのコピー数データ及び遺伝子発現データの両方を用いて、ＰＡＲＡＤＩＧＭはパスウェイ相互作用を使用することにより、全ての遺伝子、複合体、及び細胞プロセスについての統合パスウェイレベル（ＩＰＬ）を推論する。
（００２６２）本発明者らは、ＰＡＲＡＤＩＧＭ ＩＰＬを用いて、細胞株を原発性乳房腫瘍とそれらのパスウェイ活性化によって比較した。細胞株−腫瘍比較データは、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）プロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により生成されたデータを使用して行われた。図１１は、階層的クラスタリング後の腫瘍及び細胞株の各々についてのパスウェイ活性を示している。各サブタイプについて上位５つのパスウェイ特徴を表１１に記載する。概して、腫瘍及び細胞株サブタイプは同様のパスウェイ活性を示し、かつ調節解除されたパスウェイは、元のサブタイプよりも転写サブタイプと良好な関連性を有した（図１３）。しかしながら、クローディン低型細胞株サブタイプと関連付けられるパスウェイは腫瘍では十分に表現されていない−おそらく、クローディン低サブタイプが細胞株コレクションにおいて大きな比率を占め、かつルミナルＡサブタイプが欠けているためである（図１２）。
実施例ＸＶＩＩＩ：サブタイプ特異的パスウェイマーカーの同定。
（００２６３）本発明者らは、サブタイプ間の差異の根底に固有のパスウェイ活性があるかという問いを立てた。そのため、本発明者らは、あるサブタイプの細胞株で他と比較して示差的に上方制御又は下方制御される遺伝子活性を含むＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙのサブネットワークを同定した。基底細胞型細胞株とコレクション内の他の全てとの間のパスウェイ活性の比較により、９４１本のエッジにより連結された９６５個のノードから構成されるネットワークを同定した。ここで、ノードはタンパク質、タンパク質複合体、又は細胞プロセスを表し、エッジはタンパク質リン酸化などの、これらの要素間の相互作用を表す（図１８〜図２２を参照のこと）。図３５Ａは、増殖、血管新生、及び腫瘍形成に関連するＭＹＣ／ＭＡＸサブネットワークの上方制御；及び細胞周期、接着、浸潤、及びマクロファージ活性化を制御するＥＲＫ１／２サブネットワークの上方制御を示している。ＦＯＸＭ１及びＤＮＡ損傷サブネットワークもまた、基底細胞型細胞株において顕著に上方制御された。クローディン低サブタイプを他の全てと比較することにより、基底細胞型細胞株におけるものと同じサブネットワークの多くの上方制御が示され、但し、基底細胞型と比較したときのクローディン低型細胞株におけるβ−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）ネットワークの上方制御を含めて例外はあった（図３５Ｂ）。β−カテニンは腫瘍発生に関与しているとされ、不良な予後と関連付けられる。ルミナル型細胞株を他の全てと比較することにより、黒色腫における腫瘍形成能を阻害するＡＴＦ２ネットワークの下方制御、及びＥＲ調節遺伝子の転写を制御し、かつ良好な予後のルミナル型乳癌に関与するとされるＦＯＸＡ１／ＦＯＸＡ２ネットワークの上方制御が示された（図３５Ｃ）。ＥＲＢＢ２AMP型細胞株を他の全てと比較することにより、ルミナル型細胞と共通する多くのネットワーク特徴が示された−ほとんどのＥＲＢＢ２AMP型細胞はまたルミナル型細胞として分類されるため、これは意外ではない。しかしながら図３５Ｄでは、ＥＲＢＢ２AMP型細胞株におけるＲＰＳ６ＫＢＰ１を中心とする下方制御が示されている。
（００２６４）ＩＰＬを使用した細胞株間における示差的な薬物応答の比較分析から、応答機構に関する情報を提供するパスウェイ活性が明らかとなった。例えば、基底細胞型細胞株は、ＤＮＡ損傷剤のシスプラチンに対して選択的な感受性を有し、また、シスプラチンに対する応答に関連する中心的存在であるＡＴＭ、ＣＨＥＫ１及びＢＲＣＡ１を含むＤＮＡ損傷応答サブネットワークの上方制御も示した34（図３６Ａ）。同様に、ＥＲＢＢ２AMP型細胞株はＨＳＰ９０の阻害薬であるゲルダナマイシンに対して感受性を有し、またＥＲＢＢ２−ＨＳＰ９０サブネットワークにおける上方制御を示した（図３６Ｂ）。この観測はゲルダナマイシンの作用機構と一致する：ゲルダナマイシンはＥＲＢＢ２に結合して、その分解（ｄｅｇｒｅｄａｔｉｏｎ）をもたらす。本発明者らは、ＥＲＢＢ２AMP型細胞株はオーロラキナーゼ阻害薬のＶＸ−６８０に耐性を示し（図３６Ｃ、上）、更に、この化合物に対する感受性は２０ｑ１３（ＡＵＲＫＡ）における増幅と関連性を有しなかったことを見出した。これにより、この耐性が、ＦＯＸＭ１によりＡＵＲＫＢと同時制御されるＣＣＮＢ１によって媒介され得る可能性が生じる。４つのサブタイプのうちＥＲＢＢ２AMPは、ＣＣＮＢ１の実質的な下方制御を示す唯一のものである（図３６Ｃ及び図２２）。この提案される機構は、原発腫瘍においてＣＣＮＢ１遺伝子発現がＡＵＲＫＢ遺伝子発現と有意に相関するという観察により裏付けられる。
実施例ＸＶＩＸ：細胞成長阻害アッセイ及び成長速度
（００２６５）本発明者らは、７７種の化合物の効力を本発明者らの５５個の乳癌細胞株パネルにおいて評価した。このアッセイは既に記載されているとおり実施した（Ｋｕｏ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ＰＧ−１１０４７．ＢＭＣ Ｍｅｄ ７，７７，ｄｏｉ：１７４１−７０１５−７−７７［ｐｉｉ］１０．１１８６／１７４１−７０１５−７−７７（２００９））。簡潔に言えば、細胞を１：５の段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ）で一組の９用量の各化合物を用いて７２時間処理した。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイを用いて細胞生存率を決定した。未処理のウェルについての０ｈに対する７２ｈの比から、倍加時間（ＤＴ）を推定した。
（００２６６）本発明者らは、非線形最小二乗法を使用して、以下のパラメータを用いゴンペルツ曲線にデータをフィットした：上側及び下側の漸近線、傾き及び変曲点。フィットした曲線を、ＮＣＩ／ＮＩＨ ＤＴＰ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓにより記載され、かつ以前に記載された方法を用いて、ＧＩ曲線に変換した（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ−ＮＣＩ−６０ ＤＴＰ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ．ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｂｔｂ／ｉｖｃｌｓｐ．ｈｔｍｌ．；Ｍｏｎｋｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８３，７５７−７６６（１９９１））。
（００２６７）本発明者らは、化合物の５０％成長を阻害するのに必要な濃度（ＧＩ50）、成長を完全に阻害するのに必要な濃度（全成長阻害、ＴＧＩ）及び５０％集団を減少させるのに必要な濃度（５０％致死濃度、ＬＣ50）を含め、様々な応答尺度を評価した。基礎をなす成長データの質は高いが終点応答（ＧＩ50、ＴＧＩ、ＬＣ50）に達しなかった場合、値を試験した最高濃度に設定した。ＧＩ50は最初に達する閾値を表し、従って最も正確な計測値集合を含む。
（００２６８）薬物応答データを、以下の基準を満たすようフィルタリングした：１）９つの三つ組のデータ点間における標準偏差中央値＜０．２０；２）特定の細胞株について、ＤＴ±２ＳＤのＤＴ中央値；３）フィットした曲線の傾き＞０．２５；４）明らかな応答がないデータセットについて、最高濃度での成長阻害＜５０％。薬物プレートの約８０％が全てのフィルタリング要件を満たした。本発明者らは、ロバストな形の標準偏差である絶対偏差中央値（ＭＡＤ）を使用して、本発明者らのＧＩ５０の反復計測の信頼性を評価した。曲線の当てはめ及びフィルタリングは、特別に書かれたＲパッケージで実施した。
実施例ＸＸ：薬物スクリーニング
（００２６９）統計的解析に含まれた各薬物は、データの質についての以下のスクリーニング基準を満たした：１）欠測値：細胞株の集合全体でＧＩ50値の４０％以下が欠測していてもよい；２）ばらつき：少なくとも３つの細胞株について、ＧＩ50＞１．５．ｍＧＩ50又はＧＩ50＜０．５．ｍＧＩ50のいずれか、式中ｍＧＩ50は所定の薬物についてのＧＩ50中央値である。これらの基準を満たさない化合物は解析から除外した。
実施例ＸＸＩ：ＳＮＰ Ａｒｒａｙ及びＤＮＡコピー数解析
（００２７０）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ Ｈｕｍａｎ ＳＮＰ Ａｒｒａｙ６．０を使用して、ＤＮＡコピー数データを計測した。アレイ品質及びデータ処理は、Ｒ統計フレームワーク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用してａｒｏｍａ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘに基づき実行した。乳癌細胞株ＳＮＰアレイを、記載のとおり２０個の正常試料アレイを使用して正規化した（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｈ．，Ｉｒｉｚａｒｒｙ，Ｒ．，Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ｂ．＆ Ｓｐｅｅｄ，Ｔ．Ｐ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｒａｗ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｃｕｓ ｌｅｖｅｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）２４，７５９−７６７（２００８））。データを、ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ社のパッケージのＤＮＡｃｏｐｙからサーキュラーバイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）を用いてセグメント化した（Ｏｌｓｈｅｎ，Ａ．Ｂ．，Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ，Ｅ．Ｓ．，Ｌｕｃｉｔｏ，Ｒ．＆ Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｂｉｎａｒｙ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｄａｔａ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）５，５５７−５７２（２００４））。ＭＡＴＬＡＢベースの癌における有意な標的のゲノム同定（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ：ＧＩＳＴＩＣ）を使用して、有意なＤＮＡコピー数変化を分析した（Ｂｅｒｏｕｋｈｉｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｌｉｏｍａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，２０００７−２００１２（２００７））。生データはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＧＡ）社において受託番号ＥＧＡＳ０００００００００５９により利用可能である。
（００２７１）コピー数の有意な変化を検出する確率が確実に最大となるようにするため、本発明者らは非悪性細胞株をＧＩＳＴＩＣ解析から除いた。各同質遺伝子細胞株ペアの一方のメンバーについてのＧＩＳＴＩＣスコアを使用して、他方のゲノム変化を推論した：ＡＵ５６５はＳＫＢＲ３から推論した；ＨＣＣ１５００はＨＣＣ１８０６から推論した；ＬＹ２はＭＣＦ７から推論した；ＺＲ７５ＢはＺＲ７５１から推論した。
実施例ＸＸＩＩ：エクソンアレイ解析
（００２７２）細胞株の遺伝子発現データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴエクソンアレイから得た。発現の遺伝子レベルの要約を、ａｒｏｍａ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｒパッケージを使用して、「ＨｕＥｘ−１＿０−ｓｔ−ｖ２，ｃｏｒｅ」チップタイプに基づく分位点正規化及び対数相加プローブレベルモデル（ＰＬＭ）により計算した。転写物識別子を、ＢｉｏＭａｒｔ Ｒパッケージを使用してＥｎｓｅｍｂｌデータベースに問い合わせることによりＨＧＮＣ遺伝子記号に変換した。続いて得られた発現プロファイルをフィルタリングし、全細胞株においてｌｏｇ2スケールで１．０より大きい標準偏差を表す遺伝子のみを捕捉した。生データはＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（Ｅ−ＭＴＡＢ−１８１）において利用可能である。
実施例ＸＸＩＩＩ：コンセンサスクラスタリング
（００２７３）階層的コンセンサスクラスタリングを用いて細胞株サブタイプを同定した（Ｍｏｎｔｉ，Ｓ．，Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．，Ｍｅｓｉｒｏｖ，Ｊ．Ｐ．＆ Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ａ．Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ：Ａ Ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｌａｓｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ．Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ５２，９１−１１８（２００３）。コンセンサスは、細胞株の５００サンプリング、試料当たり細胞株の８０％、凝集型階層的クラスタリング、ユークリッド距離計量及び平均連結法を用いて計算した。
（００２７４）実施例ＸＸＩＶ：臨床的に関連するサブタイプと治療剤に対する応答との関連性
（００２７５）本発明者らは、３つのスキームを使用してＧＩ５０を比較した：１）ルミナル型対基底細胞型対クローディン低型；２）ルミナル型対基底細胞型＋クローディン低型；及び３）ＥＲＢＢ２−ＡＭＰ型対非ＥＲＢＢ２−ＡＭＰ型。ＧＩ５０群間の差異を、順位尺度で、必要に応じてノンパラメトリックＡＮＯＶＡ又はｔ検定により比較した。本発明者らは、３組の検定のｐ値を組み合わせ、かつ偽発見率（ＦＤＲ）を使用して複数の検定を補正した。３標本検定について、本発明者らは各群を他の全てと比較して、どの群が最も感度が高いかを決定することにより、有意なクラス効果を有する化合物に対して事後解析を実施した。事後検定のｐ値を合わせてＦＤＲ補正した。全ての場合において、ＦＤＲ ｐ＜０．２０を有意と見なした。スキーム２で基底細胞型＋クローディン低型の群が有意であると分かったが、スキーム１ではそれらの群のうち１つのみが有意であったケースであった場合、本発明者らはクラス特異度を割り当てる際にその３標本ケースに優先度を与えた。解析はＲで実施した。
実施例ＸＸＶ：ゲノム変化と治療剤に対する応答との関連性
（００２７６）本発明者らはｔ検定を用いて、繰り返し起こるコピー数変化（８ｑ２４（ＭＹＣ）、１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）、２０ｑ１３（ＳＴＫ１５／ＡＵＲＫＡ）におけるもの）と薬物感受性との間の関連性を評価した。本発明者らは、増幅が低い、又はない細胞株を単一の群に組み合わせ、それを増幅が高い細胞株と比較した。欠失領域について同等の解析を行った。ＧＩ５０が試験した最大濃度と等しかった細胞株は、解析から除外した。本発明者らは任意の群が５未満の試料数を有する場合、化合物を除外した。
実施例ＸＸＶＩ：成長速度と治療剤に対する応答との関連性
（００２７７）細胞株クラス及び成長速度の薬物感受性に対する効果を評価するため、本発明者らは、上記に記載される３つの細胞株分類スキームの各々につき１つの、一組の二元配置共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）検定を実施した。これにより６組のｐ値が得られた（２つの主効果×３分類スキーム）；本発明者らは１回のＦＤＲ補正により有意性を評価し、ＦＤＲ ｐ値＜０．２０が対象となることを宣言した。本発明者らはこれらの分析をＲにおいて関数ｌｍ及びＡＮＯＶＡで実施した。これらの関数はｃａｒパッケージの一部として利用可能である。
実施例ＸＸＶＩＩ：統合パスウェイ解析
（００２７８）ＰＡＲＡＤＩＧＭソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベル（ＩＰＬ）を推論する。詳細は実施例ＸＸＸＶを参照のこと。
実施例ＸＸＶＩＩＩ：ＴＣＧＡ及び細胞株クラスタリング
（００２７９）本発明者らは、細胞株について推論された活性が、ＴＣＧＡ腫瘍試料におけるそのそれぞれのサブタイプでクラスター化されるかという問いを立てた。高度に連結されたハブ遺伝子及び高度に相関した活性によって生じるバイアスを回避するため、相関分析により決定された２３５１個の非冗長的活性の集合を使用して、細胞株及び腫瘍試料をクラスター化した。細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料とクラスター化される程度を、コルモゴルフ・スミルノフ検定を用いて計算し、同じサブタイプの細胞株と腫瘍試料とのペア間の相関から計算されたｔ統計量の分布を、異なるサブタイプの細胞株ペアから計算された分布と比較した。詳細は実施例ＸＸＸＶＩを参照のこと。
実施例ＸＸＩＸ：サブタイプパスウェイマーカーの同定
（００２８０）本発明者らは、まとめて特定のサブタイプに関する示差的活性を示す相互に連結された遺伝子を探索した。各サブタイプは、細胞株を２つの群に二分化するものとして扱った：一方の群は、そのサブタイプに属する細胞株を含み、第２の群は残りの細胞株を含んだ。本発明者らは、２クラスマイクロアレイ有意性解析（ＳＡＭ）アルゴリズムのＲインプリメンテーションを使用して（Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｒ．＆ Ｃｈｕ，Ｇ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，５１１６−５１２１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９１０６２４９８［ｐｉｉ］（２００１））、ＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙの概念毎に示差的活性（ＤＡ）スコアを計算した。サブタイプについては、正のＤＡは、そのサブタイプでの他の細胞株と比較したより高い活性に対応する。
（００２８１）ＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙにおける密接に関係する遺伝子の協調的な上方制御及び下方制御は、ＰＡＲＡＤＩＧＭにより推論される活性を補強する。隣接遺伝子の活性もまた特定の表現型と相関する場合、本発明者らは高いＤＡスコアのサブネットワーク全体が見出されることを予想する。本発明者らは、２つの概念を連結するリンクであって、両方の概念が平均ＤＡ絶対値より高いＤＡスコアを有したリンクのみを保持することにより、高いＤＡ絶対値の概念が相互連結されたＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙにおける領域を同定した。
実施例ＸＸＸ：統合パスウェイ解析
（００２８２）ＰＡＲＡＤＩＧＭソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した24。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベル（ＩＰＬ）を推論する。ＴＣＧＡ ＢＲＣＡデータは、２０１０年１１月７日付けのＴＣＧＡ ＤＣＣから入手した。ＴＣＧＡ及び細胞株遺伝子発現データは、個別に、各データセット内で中心となるプローブ中央値とした。データセット全体（細胞株又はＴＣＧＡ腫瘍試料のいずれか）の値を全て順位変換し、−ｌｏｇ１０順位比に変換してからＰＡＲＡＤＩＧＭに投入した。パスウェイは、ｈｔｔｐ：／／ｐｉｄ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／からＢｉｏＰａｘレベル２フォーマットで得られ、ＮＣＩ−ＰＩＤ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ、及びＢｉｏＣａｒｔａデータベースを含んだ。相互作用を組み合わせて、結合重畳パスウェイ（ＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）とした。遺伝子、複合体、及び抽象的プロセス（例えば「細胞周期」）をパスウェイ概念として保持した。遺伝子概念を結合する前に、全ての遺伝子識別子をＨＵＧＯ命名法に変換した。全ての相互作用が含まれ、矛盾する影響を解決することは試みなかった。Ｐ５３（最も多く連結された構成要素）を始端とする幅優先無向探査を実行し、１つの単一構成要素を構築した。得られた結合パスウェイ構造は、３４９１個のタンパク質、４７５７個の複合体、及び５２０個のプロセスを表す合計８７６８個の概念を含むものであった。ＰＡＲＡＤＩＧＭ用の期待値最大化パラメータを細胞株データで訓練し、次にＴＣＧＡ試料に適用した。次に細胞株及び腫瘍試料からのデータを組み合わせて単一のデータ行列とした。細胞株又は腫瘍試料のいずれのデータにおいても、０．５ＩＰＬを上回る少なくとも１つの値を有さないエントリーは全て、続く解析から除外した。
実施例ＸＸＸＩ：ＴＣＧＡ及び細胞株クラスタリング
（００２８３）ＰＡＲＡＤＩＧＭ ＩＰＬを使用して細胞株をＴＣＧＡ腫瘍試料と共にクラスター化し、細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料と類似しているかどうかを決定した。ＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙの十分に調べられた範囲は、多数の相互作用を有する遺伝子（ハブ）と、直接的なデータは利用できない多数の中間的な複合体及び抽象的プロセスの大きなシグナル伝達鎖とを含む。ハブへのバイアスを回避するため、クラスタリング前に、細胞株及び腫瘍試料の両方に高度に相関するベクトル（ピアソン相関係数＞０．９）を含むパスウェイ概念を、単一のベクトルに統一した。この統一により、元の８９３９個のパスウェイ概念から２３５１個の非冗長性ベクトルがもたらされた。
（００２８４）得られた非冗長性概念の集合を使用して、試料をクラスター化した。４７個の細胞株及び１８３個のＴＣＧＡ腫瘍試料の両方についての推論されたパスウェイ活性の行列を、Ｅｉｓｅｎ社のＣｌｕｓｔｅｒソフトウェアパッケージ バージョン３．０に実装される完全連結階層的凝集型クラスタリングを用いてクラスター化した。非中心化ピアソン相関をパスウェイ概念の計量として使用し、試料計量にユークリッド距離を使用した。
（００２８５）細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料とクラスター化される程度を定量化するため、本発明者らは、ピアソン相関から導き出されるｔ統計量の２つの分布を比較した。Ｃsをサブタイプｓの細胞株の集合とする。同様に、ＴsをサブタイプｓのＴＣＧＡ腫瘍試料の集合とする。例えば、Ｃbasal及びＴbasalは、それぞれ、全ての基底細胞型細胞株及び基底細胞型腫瘍試料の集合である。第１の分布は、同じサブタイプの細胞株及び腫瘍試料を含むあらゆる可能なペア間のピアソン相関から導き出されたｔ統計量から構成された；すなわち全てのサブタイプｓについて、ａ∈Ｃs及びｂ∈Ｔs’であるようなペア（ａ，ｂ）間のあらゆる対相関ｔ統計量を計算した。第２の分布は異なるサブタイプの細胞株間の相関ｔ統計量から構成された；すなわち、ａ∈Ｃs及びｂ∈Ｃs’及びｓ≠ｓ’であるようなペア（ａ，ｂ）に関して計算した。本発明者らはコルモゴルフ・スミルノフ検定を実施して分布を比較した。
実施例ＸＸＸＩＩ：統合パスウェイ解析
（００２８６）ＰＡＲＡＤＩＧＭソフトウェアを使用して、コピー数、遺伝子発現、及びパスウェイ相互作用データの統合を実施した24。簡潔に言えば、この手順は、単一の細胞株又は患者試料から、パスウェイ相互作用並びにゲノムデータ及び機能的ゲノムデータを使用して、遺伝子、複合体、及びプロセスについての統合パスウェイレベル（ＩＰＬ）を推論する。ＴＣＧＡ ＢＲＣＡデータは、２０１０年１１月７日付けのＴＣＧＡ ＤＣＣから入手した。ＴＣＧＡ及び細胞株遺伝子発現データは、個別に、各データセット内で中心となるプローブ中央値とした。データセット全体（細胞株又はＴＣＧＡ腫瘍試料のいずれか）の値を全て順位変換し、−ｌｏｇ１０順位比に変換してからＰＡＲＡＤＩＧＭに投入した。パスウェイは、ｈｔｔｐ：／／ｐｉｄ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から２０１０年１０月１３日付けのＢｉｏＰａｘレベル２フォーマットで得られ、ＮＣＩ−ＰＩＤ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ、及びＢｉｏＣａｒｔａデータベースを含んだ。相互作用を組み合わせて、結合重畳パスウェイ（ＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）とした。遺伝子、複合体、及び抽象的プロセス（例えば「細胞周期」）をパスウェイ概念として保持した。遺伝子概念を結合する前に、全ての遺伝子識別子をＨＵＧＯ命名法に変換した。全ての相互作用が含まれ、矛盾する影響を解決することは試みなかった。Ｐ５３（最も多く連結された構成要素）を始端とする幅優先無向探査を実行し、１つの単一構成要素を構築した。得られた結合パスウェイ構造は、３４９１個のタンパク質、４７５７個の複合体、及び５２０個のプロセスを表す合計８７６８個の概念を含むものであった。ＰＡＲＡＤＩＧＭ用の期待値最大化パラメータを細胞株データで訓練し、次にＴＣＧＡ試料に適用した。次に細胞株及び腫瘍試料からのデータを組み合わせて単一のデータ行列とした。細胞株又は腫瘍試料のいずれのデータにおいても、０．５ＩＰＬを上回る少なくとも１つの値を有さないエントリーは全て、続く解析から除外した。
実施例ＸＸＸＩＩＩ：ＴＣＧＡ及び細胞株クラスタリング
（００２８７）ＰＡＲＡＤＩＧＭ ＩＰＬを使用して細胞株をＴＣＧＡ腫瘍試料と共にクラスター化し、細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料と類似しているかどうかを決定した。ＳｕｐｅｒＰａｔｈｗａｙの十分に調べられた範囲は、多数の相互作用を有する遺伝子（ハブ）と、直接的なデータは利用できない多数の中間的な複合体及び抽象的プロセスの大きなシグナル伝達鎖とを含む。ハブへのバイアスを回避するため、クラスタリング前に、細胞株及び腫瘍試料の両方に高度に相関するベクトル（ピアソン相関係数＞０．９）を含むパスウェイ概念を、単一のベクトルに統一した。この統一により、元の８９３９個のパスウェイ概念から２３５１個の非冗長性のベクトルがもたらされた。得られた非冗長性概念の集合を使用して、試料をクラスター化した。４７個の細胞株及び１８３個のＴＣＧＡ腫瘍試料の両方についての推論されたパスウェイ活性の行列を、Ｅｉｓｅｎ社のＣｌｕｓｔｅｒソフトウェアパッケージ バージョン３．０に実装される完全連結階層的凝集型クラスタリングを用いてクラスター化した45。非中心化ピアソン相関をパスウェイ概念の計量として使用し、試料計量にユークリッド距離を使用した。
（００２８８）細胞株が同じサブタイプの腫瘍試料とクラスター化される程度を定量化するため、本発明者らは、ピアソン相関から導き出されるｔ統計量の２つの分布を比較した。Ｃsをサブタイプｓの細胞株の集合とする。同様に、ＴsをサブタイプｓのＴＣＧＡ腫瘍試料の集合とする。例えば、Ｃbasal及びＴbasalは、それぞれ、全ての基底細胞型細胞株及び基底細胞型腫瘍試料の集合である。第１の分布は、同じサブタイプの細胞株及び腫瘍試料を含むあらゆる可能なペア間のピアソン相関から導き出されたｔ統計量から構成された；すなわち全てのサブタイプｓについて、ａ∈Ｃs及びｂ∈Ｔs’であるようなペア（ａ，ｂ）間のあらゆる対相関ｔ統計量を計算した。第２の分布は異なるサブタイプの細胞株間の相関ｔ統計量から構成された；すなわち、ａ∈Ｃs及びｂ∈Ｃs’及びｓ≠ｓ’であるようなペア（ａ，ｂ）に関して計算した。本発明者らはコルモゴルフ・スミルノフ検定を実施して分布を比較した。
実施例ＸＸＸＩＶ：様々な遺伝子の分子レベルにおける腫瘍の分子サブタイプ
（００２８９）乳房腫瘍に関して行われる全ゲノム遺伝子発現解析の先駆的研究から、最も顕著にエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性基底細胞様サブグループ及びＥＲ陽性ルミナルサブグループに属する種々のサブクラスが同定されており（Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｕｒｓ，４０６：７４７−７５２）、その臨床転帰には違いがある（１４ Ｓｏｒｌｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２００１），Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｕｍｏｒ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９８：１０８６９−１０８７４）。いくつかの分子サブタイプの存在はまた、ＤＮＡコピー数解析（２Ｒｕｓｓｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）上記）、ＤＮＡメチル化（Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）上記）及びｍｉＲＮＡ発現解析（Ｅｎｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）上記）によっても観察されている。しかしながら、問題は、分子解析によって様々な新しい分子レベルで得られたこれらの新しいプロファイルが、ｍＲＮＡ発現により当初見出されたサブクラスをどの範囲まで再現するか、及び臨床上重要な新規患者サブグループを同定するこれらの新しい分類の潜在力はどのようなものか？である。これらの問いに取り組むため、本発明者らは初めにＭｉｃＭａデータセットの乳癌患者を、偏りのない教師なし方法を用いて、調査される各分子レベルによりクラスター化した（図２３）。分子レベル毎の患者のクラスタリングのヒストグラムを個別に、及び患者サブグループ毎の生存ＫＭプロットを、図２３に示す。興味深いことに、このクラスタリング手順により、Ｐａｍ５０分類から導き出されるクラスターと高度に相関した７つのｍＲＮＡ発現クラスターの同定がもたらされる。これはＰａｍ５０と一致するが、ルミナルＡクラスターはｅｘｐ１−４ ｍＲＮＡクラスターの間に、基底細胞及びＥＲＢＢ２は最後の３つ（ｅｘｐ５−７）のクラスターの間に分かれた。ｍｉＲＮＡレベルでは、（Ｅｎｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）上記）に既に記載されるとおり、３つの異なるクラスターが得られた；メチル化レベルでは、記載されるとおりの３つの主クラスターと、はるかに小さい１つが認められ、第４のクラスターはＲｏｎｎｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１，上記）でも観察されたが、それ以上は考察されていない。ＣＮＡレベルでは６つの異なるクラスターが出現した。明らかに、あらゆるレベルで個別的な患者クラスターが特定の生存パターンと関連付けられた（図２３）。次に、同じ患者が異なる分子レベルで対応するクラスターを形成したかどうかを評価した。実際、異なるレベルのクラスタリング間に、最も顕著にはＤＮＡメチル化及びｍＲＮＡ発現及びＤＮＡコピー数の間に、良好な一致が大いにあった（表１２）。しかしながら、試料によってはいかなるレベルでも常に共にクラスター化される一方で、他の試料は研究における特定の各分子終点に応じて異なる群にクラスター化される。
Figure 0006854792
（００２９０）１つの分子レベルに由来する１つのサブクラスを、もう１つによるクラスタリングにより一貫して分けることで、重要な生物学的意義が明らかとなり得る。例えば、（３）で考察されるとおり、メチル化とｍＲＮＡ発現との間の良好な相関に基づく分類が認められたが（ｐ＝２．２９・１０-6）、ルミナル−Ａクラス（ｍＲＮＡ発現による）は更に２つの異なるメチル化クラスターの間に分けられた。同じことが基底細胞様腫瘍にも該当したことから、ｍＲＮＡ発現クラスターとの強い一致にもかかわらず、ＤＮＡメチル化によるクラスタリングによって更なる情報が提供されたことが示唆される。異なるＤＮＡメチル化プロファイルを有するルミナルＡ試料は、生存が異なる（Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，５：６１−７６）。本発明者ら及び他の研究者の両方からの新しいデータセットの数が増えることで、将来、これらのクラスターがいくつかの最も高頻度及び多数の低頻度の組み合わせに収束するかどうかが明らかとなるであろう。
（００２９１）異なる分子レベルでの再分類は、異なるレベルに影響を受ける新たな興味深い生物学的パスウェイが指示され得るため、更なる研究の価値があるが、このクラス間でのサンプルを水平に入れ替える中での情報量は限定的であり得る。パスウェイ毎にこれらのクラスター内で示差的に発現／変化する遺伝子を調べることは、先験的知識及び既知の相互作用の選択に依存し、新規のパスウェイを同定することは不可能である。更に、これらの手法は異なるデータセットにおける遺伝子及び計測値を独立変数として扱い、パスウェイにおける遺伝子の位置、又はその相互作用するパートナーの数（すなわちパスウェイのトポロジー）は考慮せず、遺伝子集合中の１つ又は少数の遺伝子の発現における大きい変動に対して脆弱であり得る。一般に、癌における多くの腫瘍で特定のパスウェイが調節解除され得るが、特定の遺伝子及び調節解除の方法は種々の腫瘍で変化することが観察されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｏｒｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８ Ｏｃｔ．；４５５（７２１６）：１０６１−１０６８）。従って、次に本発明者らは、パスウェイ及び関連する臨床データの文脈における腫瘍内での各遺伝子の活性レベルを特徴付けるため、単一の遺伝子に関する異なるデータ型の計測値間の相互作用並びに既知の遺伝子間相互作用をモデル化するパスウェイベースのモデリング法を適用した。本発明者らは各遺伝子の統合パスウェイレベル（ＩＰＬ）を用いて患者を直接同定し、これらの調節解除されたパスウェイに従い（分子データ型間で）分類して、次に様々な分子レベルにおける新しいクラスターと先述のクラスとの関係を調査した。
実施例ＸＸＸＶ：予後的意義により浸潤癌を分類するためのＰＡＲＡＤＩＧＭ
（００２９２）腫瘍表現型を説明し、かつ腫瘍を標的化治療され易いものにし得る個別の生物学的機能を、ゲノム変化がどのように妨害するかを理解するために、本発明者らはパスウェイレベルの摂動を理解する必要がある。ＰＡＲＡＤＩＧＭは、遺伝子を単一のレベルで調べた場合には区別できない患者サブセットにおいて、一貫した活性パスウェイを同定する。この方法は、既知のパスウェイ構造に対して、確率的グラフィカルモデル（ＰＧＭ）から統合機能ゲノミクスデータに至るまでの技術を用いる。これは既に、ＴＣＧＡ膠芽腫及び卵巣のデータセットからのコピー数及びｍＲＮＡ発現のデータ解析に適用されている。ＰＡＲＡＤＩＧＭ解析はまた、ＤＮＡメチル化又はコピー数、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ発現などの、複数のレベルでゲノム変化を関係付けるためにも用いることができ、従って個々の各試料における任意の数のオミクスデータ層を統合することができる。ＤＮＡメチル化及びｍｉＲＮＡ発現は、ここで観察された調節解除パスウェイに寄与し、かつＭｉｃＭａコホートにおいて各々それ自体で乳癌の予後診断及び分子プロファイルに明確な寄与を有するように思われるが（図２３）、本発明者らは、これらの２つの分子プロファイルタイプを追加することによるＰＡＲＡＤＩＧＭクラスターの予後診断値の向上は見出さなかった。これについての１つの説明は、ｍｉＲＮＡ及びＤＮＡメチル化解析の予後診断値が、それらの高い相関からｍＲＮＡ発現によって再現されるというものである。しかしながら、このように結論付けるには、例えば、解析プラットフォームの選択（メチル化についての限られたＩｌｌｕｍｉｎａ社の１５０５ ＣｐＧ癌パネル）及び真のｍｉＲＮＡ標的についての本発明者らの限られた知識が、総合的に計測し、かつｍｉＲＮＡ及びＤＮＡメチル化情報を有効にモデル化する本発明者らの能力を制限する要因となり得るかどうかに関して、更なる分析を要する。
（００２９３）ＭｉｃＭａコホートのｍＲＮＡ発現及びコピー数変化に基づくＰＡＲＡＤＩＧＭ解析により、５つの異なるクラスターの存在が同定され（図２４Ａ）、かつｍＲＮＡ発現とＤＮＡコピー数とを組み合わせると、個別に研究される分子レベルのいずれと比べても、予後に関して患者のより優れた判別につながることが示された（図２４Ｂ及び図２３）。その摂動がこの分類に最も強く寄与したパスウェイは、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｎｔｉｎ）受容体Ｔｉｅ２媒介性シグナル伝達のもの、及び最も顕著には、免疫応答（ＴＣＲ）及びインターロイキンシグナル伝達のものであり、ここではパスウェイにおけるほぼ全ての遺伝子又は複合体は正常値から外れた（図２５Ａ）。最も著明に認められたのは、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２及びＩＬ２３シグナル伝達であった。他の著明なパスウェイは、エンドセリン、同様に卵巣及び膠芽腫ＴＣＧＡデータセットで調節解除されるＦＯＸＭ１転写、並びに同様に乳癌及び卵巣癌で調節解除されることが既に分かっている及びＥＲＢＢ４であった。この解析に基づき、本発明者らは、有意に異なる予後診断を有する以下の患者群を同定した。これらの群は、おおまかに以下のとおり特徴付けることができる：
ｐｄｇｍ．１＝高ＦＯＸＭ１、高免疫シグナル伝達、
ｐｄｇｍ．２＝高ＦＯＸＭ１、低免疫シグナル伝達、マクロファージ優勢、
ｐｄｇｍ．３＝低ＦＯＸＭ１、低免疫シグナル伝達、
ｐｄｇｍ．４＝高ＥＲＢＢ４、低アンギオポエチンシグナル伝達、
ｐｄｇｍ．５＝高ＦＯＸＭ１、低マクロファージサイン。
（００２９４）２つの既に発表されているデータセットにおいてＰａｒａｄｉｇｍクラスターの同定を検証した。１つはＣｈｉｎ ｅｔ ａｌ ２００７（Ｃｈｉｎ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｕｓｉｎｇ ａｒｒａｙ−ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｆｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ，２６：１９５９−１９７０）によるもので、これはＭｉｃＭａデータセットと比較して、ＥＲ及び高悪性度腫瘍の頻度がより高かったとともに、更に一層興味深いことに、別の集合では非悪性ＤＣＩＳ（非浸潤性乳管癌）が濃縮された（１２ Ｍｕｇｇｅｒｕｄ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ（ＤＣＩＳ）ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，４：３５７−３６８）（図２５Ｂ、図２５Ｃ）。純粋なＤＣＩＳ腫瘍のヒートマップを図２５Ｄに示す２７。
（００２９５）ＭｉｃＭａにおいて最も不良な予後のクラスターｐｄｇｍ．２では、ＩＬ４シグナル伝達はＳＴＡＴ６と共に強く下方制御され、ＳＴＡＴ６はヒト乳癌細胞において成長阻害を妨げることが示されている（１６ Ｇｏｏｃｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈｒｉｓｔｙ，Ｂ．，ａｎｄ Ｙｅｅ，Ｄ．，（２００２），ＳＴＡＴ６ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，４：３２４−３３１）。ＩＬ４シグナル伝達の下方制御はまた、より高い腫瘍成長を支持し得るマスト細胞の活性化も促進している（１７ ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｅｉｃｈｔｅｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．Ｍ．，（２００６），Ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：２４−３７）。逆にｐｄｇｍ．５では、ＩＬ２３シグナル伝達により、マクロファージ活性化が低下し、ナチュラルキラー細胞活性が増加する。一方の側面でＴｈ−２細胞及びＢ細胞の動員に、他方でＴｈ−１の増殖に対する免疫応答において癌依存的分極化が考察されている（１ Ｕｒｓｉｎｉ−Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｖｏｒｓ ａ ｐｒｏｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，７０：７７７６−７７８７）。一定の条件下でＴｈ１／ＣＴＬ免疫応答は、マウスにおける過形成の腺腫への移行を妨げ得る一方、Ｔｈ２応答は、癌腫への移行を促進する慢性炎症状態を付与することにより得るという仮説が立てられている。ＩＬ４はＴｈ−２由来のサイトカインであり、Ｂ細胞分化及び癌細胞での慢性炎症を刺激する。更にＴｈ−２細胞は、これらの癌における免疫抑制を媒介するＩＬ１０を分泌する。この免疫抑制は、主に基底細胞癌及びＥＲＢＢ２癌で起こることが示されている。この裏付けとして、最近、「腫瘍促進性微小環境で抗腫瘍性獲得免疫プログラムが奪われ、代わりに、上皮細胞挙動の調節に機能的に関与する先天性免疫系の細胞成分が関わることにより悪性腫瘍が促進され得る」ことが示されている（ＤｅＮａｒｄｏ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｕｍｏｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，１６：９１−１０２）。
（００２９６）ここに提案されるこの免疫分類と、十分に確立されたｍＲＮＡ発現による分類（ルミナルＡ、Ｂ、基底細胞、ＥＲＢＢ２、正常様）との間には、相当の一致があった（図２４）。基底細胞及びＥＲＢＢ２のクラスターに属する試料は、主に、ｐｒｇｍ１（より不良な予後）、ルミナルＡ−ｐｒｇｍ ３（最も良好な予後）のものであった。しかしながら、Ｐａｒａｄｉｇｍクラスタリングは、ルミナルＡ（ｐｒｇｍ３）とルミナルＢ（ｐｒｇｍ４）とのクラスター間についてのかなり有意な区別、並びに予後が極めて不良な基底細胞型腫瘍サブセット（ｐｒｇｍ２）の同定を提供する。
実施例ＸＸＸＶＩ：パスウェイの摂動がＰＡＲＡＤＩＧＭクラスタリングに特異的に影響を与える同定された該パスウェイ
ＦＯＸＭ１転写
（００２９７）ＦＯＸＭ１は、細胞周期進行の主要調節因子であり、その内因性ＦＯＸＭ１発現は細胞周期の相に従い振動する。ヒト癌原遺伝子として確認されたＦＯＸＭ１は、肝癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸癌、膵癌、脳癌並びに最も一般的なヒト癌の基底細胞癌を含め、ヒト固形癌の大多数で上方制御されることが分かっている。ＦＯＸＭ１は、細胞周期及び染色体／ゲノム維持におけるその複数の役割によって腫瘍形成を促進すると考えられている（Ｗｏｎｓｅｙ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ，Ｍ．Ｔ．，（２００５），Ｌｏｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＦｏｘＭ１ ｃａｕｓｅｓ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｔｏｔｉｃ ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ，６５：５１８１−５１８９）。初代ヒト皮膚角化細胞におけるＦＯＸＭ１の異常な上方制御は、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）及びコピー数異常の形でのゲノム不安定性を直接誘導し得る。（Ｔｅｈ Ｍ，Ｇｅｍｅｎｅｔｚｉｄｉｓ Ｅ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｔ，Ｙｏｕｎｇ ＢＤ，Ｐｈｉｌｐｏｔｔ ＭＰ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＯＸＭ１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２０１０；９：４５）。最近の報告では、成人ヒト上皮幹細胞におけるＦＯＸＭ１の異常な上方制御は、３Ｄ器官型組織再生系において前癌表現型−ヒト過形成と同様の状態−を誘導することが示された（Ｇｅｍｅｎｅｔｚｉｄｉｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｂｙ ＦＯＸＭ１，７０：９５１５−９５２）。この著者らは、ＦＯＸＭ１の過剰発現は、分化経路に干渉し、それにより前駆細胞コンパートメントを拡大することによって幹細胞の固有の自己再生増殖能を利用することを示した。従って、ＦＯＸＭ１は幹細胞／前駆細胞の増殖によって癌の発生を誘導するという仮説が立てられた。本発明者らは、主にインターロイキンシグナル伝達活性に従い分けられた、このパスウェイの高い活性及び低い活性を有する２つの乳癌患者群を明らかに認めている。図２６は、クラスターｐｄｇｍ３（最良の予後）についての、このパスウェイの逆の活性化の仕方を示し（活性化されたとき赤色、対して不活性化されたとき青色）、これはより不良な生存及びそれに寄与する分子レベル（図の形に従いｍＲＮＡ、ＣＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＤＮＡメチル化）を伴うその他のクラスターとは対照的である。ｐｄｇｍ３におけるＭＭＰ２の下方制御はＤＮＡメチル化による一方、その他の腫瘍ではＤＮＡ欠失によることが分かる。ｍｉＲＮＡの中で、ｈａｓ−ｌｅｔ７−ｂはｐｇｍ３において上方制御され、その他では下方制御され、その標的のＡＵＲＫＢと相補的であった。ＤＮＡ増幅及びｍＲＮＡ発現の両方は発現の調節解除の原因と見られた。
アンギオポエチン受容体ｔｉｅ２媒介性シグナル伝達
（００２９８）Ａｎｇファミリーは、ヒト癌の発症及び成長の間の血管新生において重要な役割を果たす。Ａｎｇ２の血管新生における役割は、概してＡｎｇ１の拮抗体であって、血管成熟及び安定化に重要な、Ａｎｇ１促進性のＴｉｅ２シグナル伝達を阻害すると考えられる（２３）。Ａｎｇ２は、別の重要な血管新生因子である血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）と共に、協働的に血管新生を調整する（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２ ａｎｄ ＶＥＧＦ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ，７０：２２１３−２２２３）。新しいデータは、ヒト癌が進行する間の浸潤性表現型の癌細胞の血管新生におけるＡｎｇ２のより複雑な役割を示唆する。特定のアンギオポエチン（Ａｎｇ）ファミリーメンバーはＴｉｅ１を活性化することができ、例えばＡｎｇ１は内皮細胞においてＴｉｅ１リン酸化を誘導する（２ Ｙｕａｎ，Ｈ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｐｈａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｉｅ１ ｍｏｄｉｆｉｅｓ Ｔｉｅ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ，２１：３１７１−３１８３）。しかしながら、Ｔｉｅ２が内皮細胞において下方制御されるとき、Ａｎｇ１はＴｉｅ１リン酸化を誘導できず、及びＡｎｇ１が存在しない場合に、Ｔｉｅ１リン酸化は構成的に活性な形態のＴｉｅ２又はＴｉｅ２作動性抗体のいずれかにより誘導されるため、Ｔｉｅ１リン酸化はＴｉｅ２依存性である（２５ Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）上記）。Ａｎｇ１媒介性ＡＫＴ及び４２／４４ＭＡＰＫリン酸化は主にＴｉｅ２媒介性であり、Ｔｉｅ１はこのパスウェイを下方制御する。従ってＴｉｅ１の主な役割は、Ｔｉｅ２駆動性のシグナル伝達を下方制御するその能力及び内皮生存により、血管形態形成を調整することである。両方のＴｉｅ２媒介性シグナル伝達並びにＶＥＧＦＲ１及び２媒介性シグナル伝達及び特異的シグナルが、このデータセットにおいて観察された。
ＥＲＢＢ４
（００２９９）ＥＲＢＢ４は、乳房形態形成における増殖及び細胞運動並びにＥｒｂｂ４を発現する乳房原始上皮の方向性のある細胞運動に寄与する一方で、乳房細胞運命を促進する。Ｎｒｇ３／Ｅｒｂｂ４シグナル伝達の候補エフェクターは同定されており、ここでは初期の乳腺発生及び癌に関連する他のシグナル伝達パスウェイと相互作用することが示されている。ＥｒｂＢ４の生体内での主要な機能の１つは、妊娠及び泌乳誘導中の乳腺の成熟にある。妊娠及び長期の泌乳期間は乳癌リスクの低下と関連付けられており、従って腫瘍抑制におけるＥｒｂＢ４の役割は、泌乳におけるその役割と結び付けられ得る。ほとんどの報告は、思春期に他のＥｒｂＢファミリーメンバーにより引き起こされる成長刺激を反転させることにおけるＥｒｂＢ４の役割と一致するが、しかしながらＥＲＢＢ４発現との生存の有意な関連性は確認されていない（Ｓｕｎｄｖａｌｌ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００８），Ｒｏｌｅ ｏｆ ＥｒｂＢ４ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，１３：２５９−２６８）。
実施例ＸＸＸＶＩＩ：非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）における分類のためのＰＡＲＡＤＩＧＭ
（００３００）マウスモデルでの前癌性過形成腺における免疫応答の関与を考慮して（Ｕｒｓｉｎｉ−Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｖｏｒｓ ａ ｐｒｏｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，７０：７７７６−７７８７）、本発明者らは、ＤＣＩＳケースから構成される既に発表されたデータセットを分析し、浸潤性腫瘍で観察される強い免疫応答及びインターロイキンシグナル伝達が前癌期においても同様に存在するかどうかを見出した。非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）は非浸潤型の乳癌であり、一部の病変は急激に浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）に移行する一方、他の病変は変化しないままであると考えられている。本発明者らは、以前に、３１例の純粋なＤＣＩＳ、３６例の純粋な浸潤癌及び４２症例の混合診断（浸潤癌で非浸潤性要素を伴うもの）の遺伝子発現パターンを研究し（Ｍｕｇｇｅｒｕｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０）上記）、組織学的悪性度が高いＤＣＩＳ間でのトランスクリプトームの多様性を観測して、進行性腫瘍により類似した遺伝子発現特徴を有する個別的なＤＣＩＳサブグループを同定している。このコホート全体（ＩＤＣ及びＩＬＣを含む）についてのＰＡＲＡＤＩＧＭ結果のヒートマップは図２５Ｃ、及び純粋なＤＣＩＳ試料についてのヒートマップは図２５Ｄ。いずれの純粋なＤＣＩＳ腫瘍も、高マクロファージ活性に典型的なシグナル伝達によって特徴付けられるｐｒｇｍ２型ではなかった（図２５）。それと一致して、実験的研究から、原発性乳腺腺癌におけるマクロファージは、その血管新生促進特性の結果として後期発癌を調節するとともに（Ｌｉｎ，Ｅ．Ｙ．ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．，（２００７），Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，６７：５０６４−５０６６；Ｌｉｎ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｅｌａｙｅｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，１：２８８−３０２）、悪性乳房上皮細胞に上皮成長因子（ＥＧＦ）を提供することにより肺転移を助長することが実証されている。ここでも、ＤＣＩＳにおいてＰＡＲＤＩＧＭ解析により同定された上位の調節解除パスウェイには、ＩＬ２、４、６、１２、２３、及び２３シグナル伝達に関与するものがあった。
（００３０１）両方のデータセット（ＤＣＩＳ、ＭｉｃＭａ）において、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＴＣＲシグナル伝達は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を動員することが知られる多数のケモカインと共にリストの上位にあった。１つはＩＬ−１２であり、これは、ＮＫ細胞及びＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生を刺激することが示された抗原提示細胞により産生される。ＩＦＮ−γパスウェイは、調節解除されたパスウェイの１つで、ＤＣＩＳにおけるリストのより上位であった。ＩＦＮγはＴｈ１細胞及びＮＫ細胞から産生され、抗腫瘍免疫応答を惹起することが示された。第Ｉ相臨床試験において、トラスツズマブ（ハーセプチン）の臨床効果は、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍を有する患者にＩＬ−１２を同時投与することで増強されることが示されており、この効果はＮＫ細胞におけるＩＦＮγ産生の刺激により媒介される（２９）。ＤＣＩＳでは、他の最も強力な寄与体（表８）は８４＿ＮＯＸ４であった。酸素検知性ＮＡＰＨＤオキシダーゼのＮＯＸ４、及び食細胞型Ａオキシダーゼは、好中性顆粒球における多量の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、一次免疫応答に関与するものと同様である。また、ＦＮ１（フィブロネクチン）、及び血小板由来成長因子受容体であるＰＤＧＦＲＢも、ＣＯＬ１Ａ２、ＩＬ１２／ＩＬ１２Ｒ／ＴＹＫ２／ＪＡＫ２／ＳＰＨＫ２、ＥＳＲ１及びＫＲＴ１４と共に、ＤＣＩＳにおいて合わせて特異的に繰り返し現れた。
（００３０２）これらの遺伝子／パスウェイは全て、細胞外マトリックスにおける機能、細胞間相互作用、並びに線維症及び角質化に寄与しているように見える。例えば、フィブロネクチン−１、ＦＮ１は、細胞表面上、細胞外液、結合組織、及び基底膜に存在する高分子量糖タンパク質ファミリーに属する。フィブロネクチンは他の細胞外マトリックスタンパク質及び細胞リガンド、例えば、コラーゲン、フィブリン、及びインテグリンと相互作用する。フィブロネクチンは細胞の接着及び遊走プロセスに関与する。血小板由来成長因子受容体のＰＤＧＦＲは、上皮成長因子（ＥＧＦ）と共に、重要な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＥＧＦ及びＰＤＧＦの受容体を介してシグナルを伝達する。重要なことに、ここで特定のＤＣＩＳにおいて過剰発現することが分かったＰＤＧＦＲは、スニチニブの標的であり（Ｆｒａｔｔｏ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，１６１：４７５−４８２）、及びメシル酸イマチニブ（グリベック）の二次標的である（Ｗｅｉｇｅｌ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ ｏｎ ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，１０：４１２）。ＩＮＦγ産生を増加させることにより媒介される上記のトラスツズマブ（ハーセプチン）の免疫賦活の役割とは逆に、イマチニブはＴＣＲ活性化ＣＤ４（＋）Ｔ細胞によるインターフェロン−γ産生を阻害することが示された。これらの観察は、ＤＣＩＳ及び悪性細胞の表面に提示される成長因子受容体間の相互作用並びに免疫構成を明らかにする点で、本発明者らの議論にとって興味深い。ＰＤＧＦＲに対する刺激性自己抗体は、Ｉ型コラーゲンの発現増加をもたらすＲａｓ、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２、及び活性酸素種（ＲＯＳ）を含む細胞内ループを引き起こすと見られることが示された。これは、本発明者らの研究で同様にＤＣＩＳにおいて調節解除されるとして観察されたＣＯＬ１Ａ２発現と一致する。
実施例ＸＸＸＶＩＩＩ：材料及び方法
（００３０３）本解析は、約１１０例の乳癌から収集したデータに適用し、ｍＲＮＡ発現はＡｇｉｌｅｎｔ社の全ヒトゲノム４×４４Ｋ １色法オリゴアレイにより解析した。コピー数変化（ＣＮＡ）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｕｍａｎ−１ １０９Ｋ ＢｅａｄＣｈｉｐを使用して解析した。このＳＮＰアレイは遺伝子中心的であり、平均物理距離が３０ｋｂのゲノム全体を網羅するマーカーを含み、かつ１５，９６９個の固有の遺伝子を表す（２００４年５月構築、ｈｇ１７、ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３５）。各試料を全ゲノム増幅に供した。ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏ（ｖ．２．０、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用して、ｄｂＳＮＰ（ｂｕｉｌｄ １２５）の順方向の対立遺伝子の向きを参照して遺伝子型レポート及びｌｏｇＲ値を抽出し、ＣＮＡについてｌｏｇＲ値を調整した。
（００３０４）Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の「Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ（Ｖ２）」を使用して、製造者のプロトコルに従い全ＲＮＡからのｍｉＲＮＡプロファイリングを実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ社のＳｃａｎｎｅｒ Ｇ２５６５Ａでのスキャニング及びＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＦＥ）ｖ９．５を使用してシグナルを抽出した。重複ハイブリダイゼーションを用いて（９９試料）、種々のアレイ及び時間点で実験を行った。２つの試料は１回のみプロファイル決定した。複製プローブのｍｉＲＮＡシグナル強度をプラットフォームで平均化し、ｌｏｇ２変換して、７５パーセンタイルに正規化した。ＦＥ ｖ９．５の初期設定により、ｍｉＲＮＡ発現状態を各試料中における各遺伝子の存在又は非存在としてスコア化した。
（００３０５）ＤＮＡメチル化。ＥｐｉＴｅｃｔ ９６ 重亜硫酸キット（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ社、独国）を使用して、１マイクログラムのＤＮＡを重亜硫酸処理した。５００ｎｇの重亜硫酸処理したＤＮＡを、８０７個の癌関連遺伝子における１５０５ヶ所のＣｐＧ部位を同時に解析するＧｏｌｄｅｎＧａｔｅメチル化癌パネルＩ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ Ｉ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＣＡ、米国）を使用して解析した。遺伝子当たり少なくとも２つのＣｐＧ部位が解析され、ここで１つのＣｐＧ部位はプロモーター領域にあり、１つのＣｐＧ部位は最初のエクソンにあり、メチル化データの初期処理にはＢｅａｄ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを、製造者のプロトコルに従い使用した。各ＣｐＧ部位の検出ｐ値を使用して試料パフォーマンスを検証し、検出ｐ値に基づきデータセットをフィルタリングし、ここで検出ｐ値＞０．０５のＣｐＧ部位を以降の解析から除外した。
（００３０６）データ前処理及びＰａｒａｄｉｇｍパラメータ。コピー数をＣＢＳを用いてセグメント化し、次に、ｈｇ１８のＲｅｆＳｅｑ遺伝子座標にわたる全てのセグメントの中央値を取ることにより、遺伝子レベルの計測値にマッピングした。ｍＲＮＡ発現について、計測値は、各プローブについて発現値中央値を減じることにより、第１のプローブで正規化した。各プローブの製造者のゲノム位置を、ＵＣＳＣ社のｌｉｆｔＯｖｅｒツールを使用してｈｇ１７からｈｇ１８に変換した。次に、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子に重なる全てのプローブの中央値を取ることにより、遺伝子毎の計測値を得た。製造者の説明を用いてメチル化プローブを遺伝子と対応させた。各データセットを個別に分位点変換することにより、先のとおりＰａｒａｄｉｇｍを実行し（１０）、しかしデータは、５％及び９５％の分位点においてではなく、等しいサイズのビンに離散化した。パスウェイファイルは、先に解析したとおりＰＩＤ（３６）からであった。図２６は、各データ型における上のビン又は下のビンのいずれかの観測割合をカウントし、次に任意のデータ型において観測割合が最大のビンで各ノードをラベル化することによる、離散化した入力データの（及びＩＰＬ値ではない）要約を示す。
ＨＯＰＡＣＨ教師なしクラスタリング
（００３０７）
Ｒ バージョン２．１２上で動くＨＯＰＡＣＨ Ｒインプリメンテーション バージョン２．１０（３７）を使用して、クラスターを導き出した。全てのデータ型で相関距離計量を使用し、但しＰａｒａｄｉｇｍ ＩＰＬは例外で、非正規分布、かつゼロ値が見られたため、ｃｏｓａｎｇｌｅを使用した。５サンプル未満を含む任意のサンプルクラスターについては、各サンプルを、より大きいクラスター中の最も類似するサンプルと同じクラスターにマッピングした。ＭｉｃＭａデータセットのＰａｒａｄｉｇｍクラスターは、ＭｉｃＭａデータセットにおける各クラスターのメドイド（ｍｅｄｉｏｄ）（中央値関数を使用）を決定し、次に別のデータセットの各サンプルを、ｃｏｓａｎｇｌｅ距離により最も近かったいずれかのクラスターメドイド（ｍｅｄｉｏｄ）に割り当てることにより、他のデータ型にマッピングした。
（００３０８）カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｉｎ−Ｍｅｉｅｒ）、クラスター濃縮。Ｒ バージョン２．１２を使用して、カプラン・マイヤー統計、プロット、及びクラスター濃縮を決定した。ｃｏｘｐｈ（）比例ハザードモデルからワルド検定を使用してコックスｐ値を決定し、及びｓｕｒｖｄｉｆｆ（）関数からカイ二乗検定によりログランクｐ値を決定した。クラスタリングについての遺伝子の値又はパスウェイメンバーの値の全体的な濃縮をＡＮＯＶＡにより決定し、かつ特定のクラスターラベルについての遺伝子の濃縮を、特定のクラスターにおける遺伝子の値と、他の全てのクラスターにおける遺伝子の値とのＴ検定により決定した。ｐ値調整のベンジャミニとホッホバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）の方法を用いてＦＤＲを決定した。
実施例ＸＸＸＩＸ：データセット及びパスウェイ相互作用
（００３０９）コピー数及び発現データの両方をＰＡＲＡＤＩＧＭ推論に組み込んだ。８個の正常組織対照の集合が発現データにおける解析に利用可能であったため、患者の遺伝子値の各々を、正常な卵管対照で観察される遺伝子の中央値レベルを減じることにより正規化した。コピー数データは、腫瘍で検出された遺伝子レベルと、それに対する血液正常レベルとの間のコピー数の差異を反映するように正規化した。ＰＡＲＡＤＩＧＭへの入力のために、発現データは、サブタイプ解析に使用したものと同じ統合データセットから取り、コピー数は、ＭＳＫＣＣ Ａｇｉｌｅｎｔ社の１Ｍコピー数データのセグメント化コールから取った。
（００３１０）１３１個のパスウェイ、１１，５６３個の相互作用、及び７，２０４個のエンティティを含むＮＣＩ−ＰＩＤからパスウェイの集合体を入手した。エンティティは、ＰＡＲＡＤＩＧＭのグラフィカルモデルにおいて「ノード」として表現される分子、複合体、小分子、又は抽象概念である。抽象概念は、一般的な細胞プロセス（「アポトーシス」又は「光の吸収」など）、及びシグナルトランスデューサーのＲＡＳファミリーなどの機能的活性を共有する遺伝子のファミリーに対応する。本発明者らは、タンパク質間相互作用、転写調節相互作用、リン酸化及びユビキチン化などのタンパク質修飾相互作用を含む相互作用を収集した。
実施例ＸＬ：パスウェイ文脈における統合分子活性の推論
（００３１１）本発明者らは、コピー数、遺伝子発現、及び各エンティティのパスウェイ文脈を反映する統合パスウェイ活性（ＩＰＡ）を割り当てるＰＡＲＡＤＩＧＭを使用した。
（００３１２）データの遺伝子特異的及び患者特異的な断面の順列を使用して、ＩＰＡの有意性を評価した。ゲノム中の各遺伝子についての遺伝子発現とコピー数とのペアの値を無作為に選択することにより、１０００個の「ヌル」患者のデータを作成した。ＰＡＲＡＤＩＧＭ ＩＰＡの有意性を評価するため、本発明者らはパスウェイ構造を維持しながらパスウェイにランダム遺伝子を割り当てることにより、ヌル分布を作成した。
実施例ＸＬＩ：ＦＯＸＭ１パスウェイの同定
（００３１３）ＦＯＸＭ１ネットワーク内の全ての遺伝子を使用してランダムシミュレーションの間に統計的有意性を評価したが、ＦＯＸＭ１パスウェイの視覚化を可能とするため、図２９により有意に変化したＩＰＡを有するＦＯＸＭ１に直接連結されたエンティティを、図２７に含めるために選択した。これらのうち、ＤＮＡ修復及び細胞周期制御において役割を有する遺伝子であって、ＦＯＸＭ１との相互作用について文献の裏付けがあると認められたものを表示した。元のＮＣＩ−ＰＩＤパスウェイに見出されなかったＢＲＣＣ複合体メンバーを、ＮＣＩ−ＰＩＤによればＦＯＸＭ１の標的であるＢＲＣＡ２と共にプロットに含めた。上流ＤＮＡ修復標的を、他のＮＣＩパスウェイにおけるＣＨＥＫ２の上流直接因子を見つけることにより同定した（例えば、ＰＬＫ３シグナル伝達パスウェイにおいてＡＴＭからの間接的リンクが見出された）。
実施例ＸＬＩＩ：クラスタリング
（００３１４）活性及び非活性の確率の変化を直接的に表す推論活性の使用により、様々な種類のエンティティをまとめて１つのヒートマップにクラスター化することが可能となる。ＰＡＲＡＤＩＧＭ推論の結果を包括的に視覚化するため、Ｅｉｓｅｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ ３．０を使用して特徴フィルタリング及びクラスタリングを実施した。０．１の標準偏差フィルタリングにより７２０４個中１５９８個のパスウェイエンティティが残り、エンティティ及び試料の両方に対して平均連結法、非中心化相関階層的クラスターを実施した。
実施例ＸＬＩＩＩ ゲノムＤＮＡの単離
（００３１５）血液試料（２−３ｍｌ）を患者から採取し、使用時まで、ＥＤＴＡを含有する試験管に−８０℃で保存する。この血液試料から、ＤＮＡ単離キット（ＰＵＲＥＧＥＮＥ，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して製造者の指示に従いゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡ純度は、ベックマン分光光度計で計測した２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比（１ｃｍ光路；Ａ260／Ａ280）として計測される。
実施例ＸＬＩＶ：ＳＮＰの同定
（００３１６）患者のＤＮＡ試料からの遺伝子領域は、ＰＣＲにより、その領域用に特別に設計されたプライマーを使用して増幅する。ＰＣＲ産物は、上記に開示されるとおりの当業者に周知の方法を用いて配列決定する。配列トレースで同定されるＳＮＰを、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄソフトウェアを使用して検証し、ＮＣＢＩ ＳＮＰデータバンクに寄託されている既知のＳＮＰと比較する。
実施例ＸＬＶ：統計的解析
（００３１７）値は平均値±ＳＤとして表現される。χ2分析（Ｗｅｂ Ｃｈｉ Ｓｑｕａｒｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｌｉｎｇｕｉｓｔｉｃｓ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ワシントンＤ．Ｃ．）を使用して、正常な対象と障害を有する患者とにおける遺伝子型頻度間の差異を評価する。事後解析を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを示されるとおり実施して、異なる患者群間の血行動態を比較する。
（００３１８）当業者は、上述の実施形態の様々な適応例及び改良例を本発明の範囲及び精神から逸脱することなく構成し得ることを理解するであろう。当該技術分野において公知の他の好適な技術及び方法は、当業者によって数多くの具体的な様式で、かつ本明細書に記載される本発明の説明に照らして適用され得る。従って、本発明は本明細書に具体的に記載される以外でも実施され得ることが理解されるべきである。上記の説明は例示的であり、限定的であることを意図するものではない。上記の説明を検討することで、当業者には多数の他の実施形態が明らかであろう。従って本発明の範囲は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の係る特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。
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検証済みの突然変異は、独立したアッセイで確認されたものである。その多くは、同じ腫瘍由来の第２の独立したＷＧＡ試料を使用して検証される。未検証の突然変異では、独立した確認はまだ行われていないが、真の突然変異である尤度が高い。手計算により、ＴＰ５３において更なる２５個の突然変異が認められた。
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Claims (19)

  1. 生物学的に関連のある情報を分析する方法において、
    複数のパスウェイであって、前記パスウェイの少なくとも１つは、腫瘍性疾患との先験的な既知の関連を有し、前記複数のパスウェイの各々は、複数のそれぞれの先験的に既知のパスウェイ要素、および該先験的に既知のパスウェイ要素間の生物学的パスウェイ相互作用を表す因子を含み、前記先験的に既知のパスウェイ要素の少なくともいくつかは仮定の属性又は既知の属性を有する、複数のパスウェイを記憶するパスウェイデータベースへのアクセスを提供するステップと、
    パスウェイデータベースに結合された修正エンジンへのアクセスを提供するステップと、
    前記修正エンジンを介して、前記パスウェイ要素の少なくともいくつかを、患者試料から得られた少なくとも１つの計測属性とそれぞれ関連付けるステップと、
    第１のパスウェイ要素と相互作用を有するパスウェイ要素によりパスウェイの第１のパスウェイ要素がいかにして調節されるかを特定する示差的状態を、前記修正エンジンを介して決定するステップであって、該示差的状態が、（１）前記患者試料からの少なくとも１つの計測属性、（２）前記仮の属性又は前記既知の属性、および（３）示差的状態を提供するために（１）および（２）を修正する、第１のパスウェイ要素に連結されたパスウェイ要素の前記生物学的パスウェイ相互作用を表す因子に基づいて決定される、ステップと、
    前記修正エンジンを介して、前記パスウェイ要素の少なくともいくつかに対する前記示差的状態を使用して患者試料記録を更新するステップと、を含む方法。
  2. 前記パスウェイは調節パスウェイネットワーク内にある、請求項１に記載の方法。
  3. 前記調節パスウェイネットワークは、加齢パスウェイネットワーク、アポトーシスパスウェイネットワーク、恒常性パスウェイネットワーク、代謝パスウェイネットワーク、複製パスウェイネットワーク、及び免疫応答パスウェイネットワークから成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記腫瘍性疾患は、肝臓、乳房、肺、前立腺、子宮頸部、結腸、膵臓、脳及び皮膚の少なくとも１つの癌である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記腫瘍性疾患は、前立腺又は甲状腺の過形成である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記先験的に既知のパスウェイ要素の少なくともいくつかの前記仮の属性又は前記既知の属性は、正常組織を反映するものである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記先験的に既知のパスウェイ要素の少なくともいくつかの前記仮の属性又は前記既知の属性は、罹患組織を反映するものである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記仮の属性又は前記既知の属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記仮の属性又は前記既知の属性は、転写レベルである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記仮の属性又は前記既知の属性は、翻訳レベル又はタンパク質活性である、請求項８に記載の方法。
  11. 前記計測属性は、化合物属性、クラス属性、遺伝子コピー数、転写レベル、翻訳レベル、及びタンパク質活性からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記計測属性は転写レベルである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記計測属性は、翻訳レベル又はタンパク質活性である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記患者試料は罹患組織を含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記罹患組織は腫瘍性組織を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記示差的状態の決定は、前記生物学的パスウェイ相互作用を表す因子を用いる、前記少なくとも１つの計測属性と、前記パスウェイ要素の少なくともいくつかに対する前記仮の属性又は前記既知の属性との相互相関を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記相互相関は、前記少なくとも１つの計測属性と、前記パスウェイ要素の少なくともいくつかに対する前記仮の属性又は前記既知の属性とに関して、多変量解析、遺伝的アルゴリズム、及び推論論法のうちの少なくとも１つのインプリメンテーションを実行することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記示差的状態の決定は、統計的シミュレーションを実行することを含む、請求項１に記載の方法。
  19. 少なくとも１つのプロセッサに、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法を実行させるソフトウェア命令を記憶するコンピュータ可読媒体。
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