JP6395251B2 - 光学顕微鏡システムおよびスクリーニング装置 - Google Patents
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Description
以下、本開示にかかる光学顕微鏡システム、および、スクリーニング装置の実施の形態について図面を参照しながら説明する。本実施形態にかかるスクリーニング装置は、本開示にかかる光学顕微鏡システムを備え、複数ウェル内の測定対象試料について自動的、連続的に生体細胞内の1分子についての動態測定が可能なものである。
図1は、本実施形態にかかるスクリーニング装置の概略構成を説明するためのブロック図である。
次に、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける、測定対象物である生体細胞に標識した蛍光性指標を励起させる励起光の照射について説明する。上記したように、本実施形態の光学顕微鏡システムの光学顕微鏡は、生体細胞内の1分子計測に好適な全反射照明におけるエバネッセント光によって試料の蛍光性指標を励起発光させる、全反射蛍光顕微鏡としての動作が可能となっている。
本実施形態の光学顕微鏡システムでは、撮像装置により撮像された試料に標識された蛍光性指標の拡大光像の撮像画像に基づいて、例えば測定対象である蛍光性指標の輝点について、経時的な位置変化から細胞分子の動きを求め、輝度変化から細胞分子の状態を判定することで、生体細胞内の1分子の動態を測定するものである。これら撮像画像データの具体的な処理・解析内容は、測定したい動態の種類によって異なるものである。例えば、分子が複数の拡散係数間を遷移するとして、各観測時刻にどの状態にあるか推定することができる。また、細胞膜(および膜タンパク質)に対して、結合解離するタンパク質を観測する場合には、結合から解離までの時間を統計的に調べることで、解離した分子がどの状態であったかを推定することができる。一方、輝度変化から細胞分子の状態を調べるケースとしては、分子の数が増えたことを検出すること、偏光計測やFRET計測によって細胞の構造変化を検出すること、環境感受性色素を使ったpH等の環境変化の計測を行うことなどができる。
まず、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおける自動化処理としての、オートフォーカス動作について説明する。
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、光学顕微鏡の撮像光学系により得られた撮像画像を用いて、当該撮像画像の拡大倍率を見積もるアルゴリズムを採用している。以下、光学顕微鏡において顕微鏡の測定倍率である測定視野のスケール換算を行う方法について、図7を用いて説明する。
図1に示したように、本実施形態にかかる光学顕微鏡では、撮像光学系と撮像装置を2系統備え、異なる発光色の蛍光性指標の発光を同時に観測することができる。このような2色の蛍光性指標を同時に観測することが可能な光学系を備えた光学顕微鏡では、拡大光像の波長選択を行うためのダイクロイックミラー等の測定波長分離手段、拡大レンズやミラーなどの拡大光学系を構成する光学部品の配置位置、さらに、撮像装置の取付けなどに極めて高い精度が要求される。また、実際の光学顕微鏡では、これらの光学部材それぞれについて、撮像画像を見ながら微調整が可能なようになっていて、異なる撮像画像系で得られた撮像画像相互のズレを解消することができる。
上記の処理によって、撮像倍率を検出して撮像光学系間のデータ補正を行った後に、撮像画像データを用いて生体細胞内の1分子測定が行われる。
測定対象となる細胞の位置は、低倍率の透過光計測によって決定するため、透過光像を効率よく二値化するための画像解析技術が必要になる。
本実施形態にかかる光学顕微鏡システムでは、測定対象の細胞を選択して高倍率での全反射蛍光測定によって細胞1分子の動態測定を行う。このとき、測定対象の細胞は同じクローンであっても、タンパク質の発現率が異なる場合がある。このため、同じ条件で蛍光性指標を付与した場合でも、1分子観察が可能な場合と、そうでない場合とが生じうる。以下、本実施形態にかかる光学顕微鏡システムにおいて、測定対象の1分子細胞が、十分に発現して観察対象となるのか否かを判別する手法の一例について図15および図16を用いて説明する。
以下、上記実施形態で説明した光学顕微鏡をスクリーニング装置として用いる場合に、光学顕微鏡システムに加えられる構成とデータ処理方法について、スクリーニング装置の実施形態として説明する。
まず、本実施形態にかかるスクリーニング装置として、測定対象のウェルプレートにおける各ウェルの中心位置の設定を行う。なお、以下の説明において、スクリーン具装置全体の構成については、既に説明した図1を適宜参照する。
本実施形態のスクリーニング装置では、大量の試料を網羅的に測定するためにマルチウェルプレートを使用する。また、上述したとおり、全反射照明での測定を行う際には、対物レンズと、試料が載置されたガラスプレートとしてのウェルの底面との間に光学的カップリング材としてのイマージョンオイルなどのオイル部材が充填された、油浸対物レンズが必要となる。
10 光学顕微鏡システム
20 光学顕微鏡
21(21a、21b) 光源
30(30a、30b) 拡大光学系
31(31a、31b) 撮像装置
43 励起光
46 光像
50 解析部
Claims (18)
- 蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値/平均値画像であるCV画像を作成し、得られた前記CV画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行い、
さらに、前記解析部は、前記透過光による前記測定対象物の光像を取得する際に、前記フォーカス制御部を制御して、デフォーカス状態の撮像画像を含む複数の撮像画像を取得し、取得した複数の前記撮像画像の合成画像に基づいて前記測定対象となる細胞の選別を行う、光学顕微鏡システム。 - 蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記解析部が、同一の測定対象物についての全反射照明下における撮像画像と対物レンズの光軸上からの落射照明下における撮像画像とを取得し、これら2つの撮像画像の相関係数に基づいて当該撮像対象物の発現状態を判断する、光学顕微鏡システム。 - 蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記光学顕微鏡は、前記励起光を照射する照射光学系において、前記拡大光学系の対物レンズにおける焦点位置と共役点となる位置に配置された、前記励起光の少なくとも一部を遮蔽する遮蔽部材を備え、
前記解析部が、前記遮蔽部材の光像の輝度分布をガウス分布でフィッティングした統計量からコントラスト値を算出し、前記コントラスト値が最も大きくなる位置を前記対物レンズのフォーカス位置であると判断し、前記フォーカス制御部により前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作が行われる、光学顕微鏡システム。 - 蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値/平均値画像であるCV画像を作成し、得られた前記CV画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行う、光学顕微鏡システム。 - 前記光学顕微鏡は、前記励起光を照射する照射光学系において、前記拡大光学系の対物レンズにおける焦点位置と共役点となる位置に配置された、前記励起光の少なくとも一部を遮蔽する遮蔽部材を備え、
前記解析部が、前記遮蔽部材の光像に基づいて前記対物レンズのフォーカス位置を判断し、前記フォーカス制御部により前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作が行われる請求項1、2、および4のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。 - 前記照射光学系が、全反射照明と対物レンズの光軸上からの落射照明との2つの照射方法での前記測定対象物の照射が可能であり、前記遮蔽物の光像に基づく前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作を前記対物レンズの光軸上からの落射照明下で行い、前記測定対象物の1つの蛍光指標の動態測定のための撮像画像の取得を、全反射照明下で行う、請求項3または5に記載の光学顕微鏡システム。
- 前記解析部が、前記撮像画像に対して二値化処理を行って前記撮像画像の二値化情報を取得し、前記二値化情報を用いて前記撮像画像における前記遮蔽部材の境界部分のコントラストを数値化して、前記数値化されたコントラスト値が最も大きくなる位置が前記拡大光学系におけるフォーカス位置であると判断し、前記拡大光学系におけるオートフォーカス動作が行われる、請求項3、5、および6のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
- 前記解析部が、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像した前記撮像画像から、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔を求め、得られた位置間隔の平均値を用いて撮像倍率情報を取得する請求項1〜7のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
- 前記解析部が、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔から前記撮像画像における二次元の座標位置を特定し、前記特定された二次元の座標位置から、複数の撮像画像を並べて配置した撮像画像を取得する、請求項8に記載の光学顕微鏡システム。
- 前記光学顕微鏡は、光学的分光手段と前記光学的分光手段で分光されて得られた波長の異なる複数種類の光像それぞれからの撮像画像を取得可能な複数の撮像光学系を備え、
前記解析部は、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像して得られた前記複数の撮像光学系による撮像画像を用いて、各撮像光学系による前記撮像画像間の位置情報の誤差を補正する補正値を取得し、
前記補正値を用いて前記複数の撮像光学系により得られた撮像画像の誤差を補正する請求項1〜9のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。 - 前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値/平均値画像であるCV画像を作成し、得られた前記CV画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行う、請求項2または3に記載の光学顕微鏡システム。
- 前記解析部は、前記透過光による前記測定対象物の光像を取得する際に、前記フォーカス制御部を制御して、デフォーカス状態の撮像画像を含む複数の撮像画像を取得し、取得した複数の前記撮像画像の合成画像に基づいて前記測定対象となる細胞の選別を行う、請求項4または11に記載の光学顕微鏡システム。
- 前記解析部が、同一の測定対象物についての全反射照明下における撮像画像と対物レンズの光軸上からの落射照明下における撮像画像とを取得し、これら2つの撮像画像の相関係数に基づいて当該撮像対象物の発現状態を判断する、請求項1、3、および4のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。
- 前記請求項1〜請求項13のいずれかに記載された光学顕微鏡システムと、
それぞれに被測定物を収容可能な複数個のウェルを有するウェルプレートを移送し、各ウェルを順次前記拡大光学系の対物レンズ視野に配置可能なウェル移送手段と、
前記ウェル移送手段を制御して、それぞれのウェル内の測定対象物における生体細胞1分子の動態を計測するスクリーニング制御部とを備え、
各ウェル内に位置する複数の測定対象物における生体細胞1分子の自動スクリーニングを可能とする、スクリーニング装置。 - 蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備えた光学顕微鏡システムと、
それぞれに被測定物を収容可能な複数個のウェルを有するウェルプレートを移送し、各ウェルを順次前記拡大光学系の対物レンズ視野に配置可能なウェル移送手段と、
前記ウェル移送手段を制御して、それぞれのウェル内の測定対象物における生体細胞1分子の動態を計測するスクリーニング制御部と、
前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間の油浸オイルを供給するオイル供給装置と、
前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間に配置され前記拡大光学系の対物レンズの光軸の部分に開口部が形成されたオイルアダプタとを備え、
前記オイル供給装置は、前記油浸オイルを供給する一系統のオイル供給系と、前記油浸オイルを排出する二系統のオイル排出系を有し、前記二系統のオイル排出系のうち少なくとも一系統が前記油浸オイルを吸引排出するオイル排出系であり、
前記オイルアダプタは、
前記油浸オイルを前記オイルアダプタと前記対物レンズとの間の間隙部に供給する前記オイル供給系に接続されたオイル供給ケーブルと、
前記供給され、前記開口部から染み出した油浸オイルを前記オイルアダプタの上面側から吸引排出する前記オイル排出系に接続されたオイル吸引ケーブルと、
前記オイルアダプタの周辺部分に形成された溝部内の前記油浸オイルを排出する前記溝部の底面に形成されたオイル排出ケーブルとを備え、
各ウェル内に位置する複数の測定対象物における生体細胞1分子の自動スクリーニングを可能とする、スクリーニング装置。 - 前記スクリーニング制御部は、前記光学顕微鏡から得られる前記撮像画像に基づいて、前記ウェルプレートが有する複数のウェルの中心位置を予め認識してウェル中心情報を取得し、前記ウェル中心情報に基づいて前記ウェル移送手段を制御する請求項14または15に記載のスクリーニング装置。
- 前記ウェル内の前記測定対象物それぞれに、所定のタイミングで異なる刺激を与えることができる測定環境制御手段をさらに備える請求項14〜16のいずれかに記載のスクリーニング装置。
- ウェルと拡大光学系の対物レンズとの間に配置され、前記拡大光学系の対物レンズの光軸の部分に開口部が形成されたオイルアダプタであって、
油浸オイルを前記オイルアダプタと前記対物レンズとの間の間隙部に供給するオイル供給系に接続されたオイル供給ケーブルと、
前記供給され、前記開口部から染み出した油浸オイルを前記オイルアダプタの上面側から吸引排出するオイル排出系に接続されたオイル吸引ケーブルと、
前記オイルアダプタの周辺部分に形成された溝部内の前記油浸オイルを排出する前記溝部の底面に形成されたオイル排出ケーブルとを備えた、オイルアダプタ。
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