JP6345690B2 - 改変ａｘｌペプチド及び抗転移療法のａｘｌシグナル伝達阻害におけるその使用 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍の浸潤及び転移、例えばＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３及び／又はＧＡＳに関連した経路を介する腫瘍の浸潤又は転移の治療又は診断に関する。

浸潤及び転移は、癌の最も潜行的かつ重篤な局面である。最小の浸潤を伴うか又は全く浸潤のない腫瘍は成功裡に切除され得るが、新生物が一旦浸潤的になると、リンパ性及び／又は血管チャネルを介して複数の部位に播種され、完全な切除は非常に困難になる。浸潤及び転移は２つのプロセス、すなわち局所浸潤及び遠隔臓器へのコロニー形成及び損傷を介して宿主を殺す。局所浸潤は、局所圧縮、局所的破壊又は正常臓器機能の抑制によって関連組織の機能を損ない得る。しかしながら、癌における最も重要なターニングポイントは、遠隔転移の確立である。この時点では、もはや局所療法のみによっては患者は治癒され得ない。

転移のプロセスは、複数の宿主と腫瘍との相互作用を含む関連した連続ステップのカスケードである。この複雑なプロセスは、細胞が、血管又はリンパ循環に入り、遠隔の血管又はリンパ床で捕獲され、臓器の間質及び柔組織に活発に血管外遊出し、二次コロニーとして増殖することを必要とする。転移の可能性は、局所微小環境、血管新生、基質と腫瘍との相互作用、局所組織によるサイトカインの生成、並びに腫瘍及び宿主細胞の分子表現型によって影響を受ける。

遠隔転移が明らかでない又は遠隔転移が未だ始まっていないかもしれないが、局所微小浸潤は初期に生じ得る。腫瘍細胞は、インサイチュ(in situ)から浸潤性腫瘍への変遷中に、上皮基底膜を通過し、その下にある間質に入る。一旦腫瘍細胞が下にある間質に浸潤すると、それは、遠隔転移のためのリンパ管及び血管に到達すると同時にマトリックスフラグメント及び成長因子を放出する。良性腫瘍から浸潤性腫瘍への変遷中に、組織化、分布及び上皮基底膜量における全般的かつ広範な変化が生じる。

癌予防及び処置における治療的努力は、シグナル伝達経路又は選択的調節タンパク質のレベルに集中している。タンパク質キナーゼ活性、カルシウムホメオスタシス、及び癌タンパク質活性化は、駆動シグナルであり、そのため、治療介入の重要な制御部位となり得る。シグナル伝達経路において浸潤及び血管新生を制御するキナーゼは、転移の重要な制御因子であり得る。生化学的分子標的の最も大きなクラスの１つは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーである。これまでの最も一般的な受容体チロシンキナーゼの分子標的は、ＥＧＦ及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体である。より新規のキナーゼ分子標的は、ｃ−ｋｉｔ及びａｂｌのＩＩＩ型ＲＴＫファミリーを含む。これらの分子の阻害剤は、古典的な化学療法と組み合わせて投与されている。

転移は、結局のところ、癌に罹患し、それで亡くなる人の多くの原因となる。転移性癌細胞を特定する分子及び機能性マーカーを特定かつ標的化する、及びそれらを特異的に阻害するための薬物を作製する必要性が存在する。

当該分野での刊行物は、特に、Ｌｉ等 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２００９）２８（３９）：３４４２−５５；Ｕｌｌｒｉｃｈ等の米国特許出願第２００５０１８６５７１号；Ｂｅａｒｓｓ等の米国特許出願第２００８０２９３７３３号；Ｓｕｎ等 Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００４；６６（６）：４５０−７；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ等 Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００９）１５（１４）：４７４２−９； Ｗｉｍｍｅｌ等 Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００１、３７（１７）：２２６４−７４；Ｋｏｏｒｓｔｒａ等 Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９、８（７）：６１８−２６；Ｔａｉ等 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．（２００８）２７（２９）：４０４４−５５を含む。

受容体チロシンキナーゼＡＸＬ（Ｕｆｏ及びＴｙｒｏ７としても知られている）は、Ｔｙｒｏ３（Ｓｋｙ）及びＭｅｒ（Ｔｙｒｏ１２）を含むチロシン受容体のファミリーに属する。ＡＸＬファミリーの一般的なリガンドは、ＧＡＳ６（増殖停止特異的タンパク質６）である。ヒトＡＸＬは、８９４個のアミノ酸ポリペプチドの合成を指向することができる２，６８２−ｂｐのオープンリーディングフレームである。２つの変形体ｍＲＮＡが特徴付けられ、転写変形体１はＧｅｎｂａｎｋ、ＮＭ＿０２１９１３．３でアクセスされ、転写変形体２がＮＭ＿００１６９９．４でアクセスされ得る。天然のタンパク質のポリペプチド配列は配列番号：１で提供され、アミノ酸修飾に関して該配列に具体的な参照がなされ得る。ＧＡＳ６／ＡＸＬの重要な細胞性機能は、細胞接着、移行、食作用、及びアポトーシスの阻害を含む。ＧＡＳ６及びＡＸＬファミリー受容体は、組織の及び疾患特異的方法で高度に制御される。

ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３は、細胞内領域が受容体チロシンキナーゼの典型的構造を有し、細胞外ドメインがフィブロネクチンＩＩＩ及びカドヘリン型接着分子に類似するＩｇモチーフを含む点で、特有の分子構造によって各々特徴付けられる。発達中にはＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３は脳を含む様々な臓器で発現され、このことは、このＲＴＫが間葉及び神経発達に関連することを示唆する。成人では、ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３発現は低いが、様々な腫瘍で高発現レベルを示す。ＧＡＳ６は、今までのところ、ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３の、単一の活性化リガンドである。

受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、受容体二量化、次いで細胞質内ドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化を促進するリガンドによって一般的に活性化される。次いで、シグナル伝達タンパク質のこれらのリン酸化チロシン残基への結合は、下流シグナル調節をもたらす。ＲＴＫのＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３ファミリーは、それらが、典型的な成長因子よりもむしろ血液凝固因子に類似するビタミンＫ依存的タンパク質ファミリーのメンバーであるＧＡＳ６によって活性化される点で独特である。

本発明は、ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３及び／又はＧＡＳ６関連経路が腫瘍浸潤及び／又は転移に関連するとの発見に一部基づいている。従って、本発明は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３及び／又はＧＡＳ６関連経路の阻害を介して、腫瘍浸潤及び／又は転移を治療するために有用である組成物及び方法を提供する。加えて、本発明は、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲ、Ｔｙｒｏ３及び／又はＧＡＳ６の活性レベルを検出することによって、腫瘍が浸潤及び／又は転移する感受性又は可能性を決定するために有用な物質及び方法を提供する。

いくつかの実施形態において、例えばＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３、及び／又はＧＡＳ６関連経路の阻害を介して腫瘍の浸潤及び／又は転移を治療するために有用な物質は阻害剤である。いくつかの実施形態において、阻害剤は、（ａ）ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性の阻害剤、（ｂ）ＧＡＳ６活性の阻害剤、及び（ｃ）ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３−ＧＡＳ６相互作用の阻害剤からなる群より選ばれ、該阻害剤は、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて高い親和性でＧＡＳ６に結合することができる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、単一のＧＡＳ６上の２つ以上のエピトープに結合する。

いくつかの実施形態において、該エピトープの少なくとも１つが、ＧＡＳ６上の、主要又は副次ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３結合部位である。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、単一のＧＡＳ６上の、主要又は副次ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３結合部位に結合することができる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、ＧＡＳ６の主要ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３結合部位、及び単一のＧＡＳ６上の１つ以上の追加のＧＡＳ６エピトープに結合することができる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、ＧＡＳ６上の副次ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３結合部位、及び単一のＧＡＳ６上の１つ以上の追加のエピトープに結合することができる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、単一のＧＡＳ６上の２つ以上のエピトープに結合することができる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、主要又は副次ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を拮抗することができ、該受容体はＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３から選択される。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、主要ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を拮抗することができ、該受容体はＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３から選択される。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、副次ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を拮抗することができ、該受容体はＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３から選択される。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、ポリペプチド、ポリペプチド担体融合物、ポリペプチドＦｃ融合物、ポリペプチドコンジュゲート、ポリペプチド薬物コンジュゲート、抗体、二重特異性抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗体フラグメント、抗体関連構造体、又はそれらの組み合わせである。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、天然又は合成ポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、非抗体ポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、例えば、ダーピン、アビマー、アドネクチン、アンチカリン、アフィボディー、マキシボディー、もくしは他のタンパク質構造体、又はそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、ポリペプチドコンジュゲート又は抗体コンジュゲートである。

いくつかの実施形態において、該阻害剤はポリペプチドポリマーコンジュゲートであり、該ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＥＧ含有ポリマー、分解性ポリマー、生物適合性ポリマー、ヒドロゲル、及び他のポリマー構造体、又はそれらの組み合わせから選ばれる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤はポリペプチドであり、該ポリペプチドは、可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドであり、該ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ膜貫通ドメインを欠き、ＧＡＳ６への結合性におけるＡＸＬポリペプチドの親和性を向上させる、野生型に対する少なくとも１つの変異を有する。

いくつかの実施形態において、該阻害剤はポリペプチドであり、該ポリペプチドは可溶性ＭＥＲ変異体ポリペプチドを含み、該ＭＥＲ変異体ポリペプチドはＭＥＲ膜貫通ドメインを欠き、ＧＡＳ６への結合性におけるＭＥＲポリペプチドの親和性を向上させる、野生型に対する少なくとも１つの変異を有する。

いくつかの実施形態において、該阻害剤はポリペプチドであり、該ポリペプチドは可溶性Ｔｙｒｏ３変異体ポリペプチドであり、該Ｔｙｒｏ３変異体ポリペプチドはＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、ＧＡＳ６への結合性におけるＴｙｒｏ３ポリペプチドの親和性を向上させる、野生型に対する少なくとも１つの変異を有する。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ポリペプチドとＧＡＳ６タンパク質との間の結合をインビボ又はインビトロで阻害するＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠き、及び／又は野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠き、１つより多いＩｇ１ドメインを有し、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、２つのＩｇ１ドメインを有する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、３つのＩｇ１ドメインを有する。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠き、１つより多いＩｇ２ドメインを有し、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、２つのＩｇ２ドメインを有する。

いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドであり、そして、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、１つより多いＩｇ１ドメイン、１つより多いＩｇ２ドメインを有し、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドであり、そして、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠き、１つより多いＩｇ１ドメイン、１つより多いＩｇ２ドメインを有し、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、２つのＩｇ１ドメイン及び２つのＩｇ２ドメインを有する。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、直接的に結合された免疫グロブリンドメインを有する。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、間接的に結合された免疫グロブリンドメインを有する。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、単一のＧＡＳ６の主要及び副次結合部位の両方と結合することができ、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、１つのＩｇ１ドメインを有し、機能性Ｉｇ２ドメインを欠く。

いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドであり、そして、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、１つのＩｇ１ドメインを有し、機能性Ｉｇ２ドメインを欠き、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３に比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドであり、そして、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠き、機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠き、機能性Ｉｇ２ドメインを欠き、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質である。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、リンカーを更に含む。いくつかの実施形態において、該リンカーは１つ以上の（ＧＬＹ）_４ＳＥＲ単位を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３細胞内ドメインを欠く。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠き、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べて、ＧＡＳ６への結合性における該ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３配列に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の１）１５〜５０、２）６０〜１２０、及び３）１２５〜１３５からなる群より選ばれる領域内に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）の位置１９、２３、２６、２７、３２、３３、３８、４４、６１、６５、７２、７４、７８、７９、８６、８７、８８、９０、９２ ９７、９８、１０５、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、もしくは１２７、又はそれらの組合せにおいて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、１）Ａ１９Ｔ、２）Ｔ２３Ｍ、３）Ｅ２６Ｇ、４）Ｅ２７Ｇ又はＥ２７Ｋ、５）Ｇ３２Ｓ、６）Ｎ３３Ｓ、７）Ｔ３８Ｉ、８）Ｔ４４Ａ、９）Ｈ６１Ｙ、１０）Ｄ６５Ｎ、１１）Ａ７２Ｖ、１２）Ｓ７４Ｎ、１３）Ｑ７８Ｅ、１４）Ｖ７９Ｍ、１５）Ｑ８６Ｒ、１６）Ｄ８７Ｇ、１７）Ｄ８８Ｎ、１８）Ｉ９０Ｍ又はＩ９０Ｖ、１９）Ｖ９２Ａ、Ｖ９２Ｇ 又はＶ９２Ｄ、２０）Ｉ９７Ｒ、２１）Ｔ９８Ａ又はＴ９８Ｐ、２２）Ｔ１０５Ｍ、２３）Ｑ１０９Ｒ、２４）Ｖ１１２Ａ、２５）Ｆ１１３Ｌ、２６）Ｈ１１６Ｒ、２７）Ｔ１１８Ａ、２８）Ｇ１２７Ｒ又はＧ１２７Ｅ、及び２９）Ｇ１２９Ｅ、並びにそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）バリン９２；及び（ｄ）グリシ１２７に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体は、以下の位置：（ａ）アスパラギン酸８７；及び（ｂ）バリン９２に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）バリン９２；（ｄ）グリシ１２７、及び（ｅ）アラニン７２に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、以下の位置：アラニン７２に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドにおいて、グリシン３２残基がセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７残基がグリシン残基で置換され、バリン９２残基がアラニン残基で置換され、もしくはグリシン１２７がアルギニン残基で置換されている、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドにおいて、アスパラギン酸８７残基がグリシン残基で置換され、もしくはバリン９２残基がアラニン残基で置換されている、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドにおいて、アラニン７２残基がバリン残基で置換されている。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドにおいて、グリシン３２残基がセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７残基がグリシン残基で置換され、バリン９２残基がアラニン残基で置換され、グリシン１２７残基がアルギニン残基で置換され、もしくはアラニン７２残基がバリン残基で置換されている、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、以下の位置：（ａ）グルタミン酸２６；（ｂ）バリン７９；（ｃ）バリン９２；及び（ｄ）グリシ１２７に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドにおいて、グルタミン酸２６残基がグリシン残基で置換され、バリン７９残基がメチオニン残基で置換され、バリン９２残基がアラニン残基で置換され、もしくはグリシン１２７残基がアルギニン残基で置換されている、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬオリゴヌクレオチド（配列番号：１）のアミノ酸領域１９〜４３７、１３０〜４３７、１９〜１３２、２１〜１２１、２６〜１３２、２６〜１２１及び１〜４３７から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸領域を含み、１つ以上のアミノ酸修飾が該アミノ酸領域で起こる。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）アラニン７２；及びバリン９２に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変更を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドにおいて、グリシン３２はセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７はグリシン残基で置換され、アラニン７２はバリン残基で置換され、そして、バリン９２はアラニン残基で置換され、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、該可溶性ＡＸＬ変異体は、以下の位置：（ａ） グリシン３２； （ｂ） アスパラギン酸８７； （ｃ） アラニン７２； 及び（ｄ） バリン９２に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変更を含む。

いくつかの実施形態において、先の請求項のいずれかに記載の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドであり、該可溶性ＡＸＬポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、グリシン３２はセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７はグリシン残基で置換され、アラニン７２はバリン残基で置換され、そして、バリン９２はアラニン残基で置換され、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）アラニン７２；（ｄ）バリン９２；（ｅ）グリシン１２７に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、グリシン３２はセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７はグリシン残基で置換され、アラニン７２はバリン残基で置換され、バリン９２はアラニン残基で置換され、そしてグリシン１２７はアラニン残基で置換され、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、該ＡＸＬ変異体は、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）アラニン７２；及び（ｄ）バリン９２に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、グリシン３２はセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７はグリシン残基で置換され、アラニン７２はバリン残基で置換され、そしてバリン９２はアラニン残基で置換される、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、該ＡＸＬ変異体は、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）アラニン７２；（ｄ）バリン９２；及び（ｅ）グリシン１２７に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、グリシン３２はセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７はグリシン残基で置換され、アラニン７２はバリン残基で置換され、バリン９２はアラニン残基で置換され、そしてグリシン１２７はアルギニン残基で置換される、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、Ｉｇ２ドメインを欠き、該ＡＸＬ変異体は、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）アラニン７２；及び（ｄ）バリン９２に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、Ｉｇ２ドメインを欠き、グリシン３２はセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７はグリシン残基で置換され、アラニン７２はバリン残基で置換され、そしてバリン９２はアラニン残基で置換される、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、Ｉｇ２ドメインを欠き、該ＡＸＬ変異体は、以下の位置：（ａ）グリシン３２；（ｂ）アスパラギン酸８７；（ｃ）アラニン７２；（ｄ）バリン９２；及び（ｅ）グリシン１２９に野生型ＡＸＬ配列（配列番号：１）に対するアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、機能性ＦＮドメインを欠き、Ｉｇ２ドメインを欠き、グリシン３２はセリン残基で置換され、アスパラギン酸８７はグリシン残基で置換され、アラニン７２はバリン残基で置換され、バリン９２はアラニン残基で置換され、そしてグリシン１２７はアルギニン残基で置換される、又はそれらの組合せである。

いくつかの実施形態において、先の請求項のいずれかに記載の可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドであって、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、ＧＡＳ６に対して少なくとも約１×１０^−８Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍ、又は１×１０^−１２Ｍの親和性を有する。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬポリペプチドの親和性よりも、少なくとも約５倍強い、少なくとも約１０倍強い又は少なくとも約２０倍強いＧＡＳ６に対する親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、１つ以上の（ＧＬＹ）_４ＳＥＲ単位を含む。いくつかの実施形態において、該リンカーは、１、２、３又は５の（ＧＬＹ）_４ＳＥＲ単位を含む。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ポリペプチドとＧＡＳ６タンパク質との間の結合をインビボ又はインビトロで阻害する。

いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質である。

いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上の可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの治療上有効量を含む、医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、少なくとも１つの細胞毒性薬もしくは薬学的に許容される賦形剤又はそれらの組合せを更に含む。

いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物の患者における腫瘍の転移又は浸潤を治療、減少又は予防する方法を提供し、その方法は、本発明の阻害剤の有効量を該患者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、該記阻害剤は、先の請求項のいずれかに記載のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、治療する腫瘍は、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、結腸腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、及び膠芽細胞腫からなる群より選ばれる。

ＡＸＬの４つのドメイン、及び作製され試験されたＡＸＬ−Ｆｃコンストラクトの様々な組み合わせの、いくつかの実施態様を示す。 一価のＡＸＬ−Ｆｃコンストラクトの様々な組み合わせの、いくつかの実施態様を示す。

定義
以下の説明では、細胞培養の分野で慣用的に使用される多数の用語が広範に利用される。明細書及び請求の範囲、及びかかる用語に与えられるべき範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために以下に定義する。

転移性細胞又はそのリガンドＧＡＳ６に対するＡＸＬの「阻害剤」、「活性化因子」及び「調節因子」は、それぞれ、受容体もしくはリガンド結合又はシグナル伝達のためのインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定される、阻害、活性化又は調節する分子、例えばリガンド、受容体、アゴニスト、アンタゴニスト、及びそれらのホモログ及び類似体、を意味するために使用される。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、２つ以上のアミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書では交換可能に使用される。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学類似体、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーである、アミノ酸ポリマーに適用される。「抗体」及び「抗体（複数）」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、他の分子（しばしば抗原と呼ばれる）と相互作用する及び／又はそれに結合することができるポリペプチドを指す。抗体は、例えば、「抗原結合ポリペプチド」又は「標的分子結合ポリペプチド」を含み得る。本発明の抗原は、例えば、本発明に記載の任意のポリペプチドを含み得る。

「アミノ酸」という用語は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基アミノ基及びＲ基に結合するアルファ炭素、を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、を指す。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同一の基本化学構造を維持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物を指す。アミノ酸を表すために本発明で使用される全ての１文字は、当該分野で決まって使用される認知されたアミノ酸記号に従って使用され、例えばＡはアラニンを、Ｃはシステインを示す。アミノ酸は、関連する位置の前後の１文字によって表され、最初のアミノ酸（該位置の前）から変化したアミノ酸（該位置の後）までの変化を反映する。例えばＡ１９Ｔは、位置１９のアミノ酸アラニンがスレオニンに変化することを意味する。

「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、治療について評価されるべき及び／又は処置されるべき哺乳動物を指すために、本明細書では交換可能に使用される。１つの実施態様では、哺乳動物はヒトである。よって、「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、卵巣又は前立腺の腺癌、乳癌、膠芽腫等を含むがそれらに限定されない癌を有する個体を包含し、腫瘍性組織を除くために切除（外科手術）を受けたことがある又はその候補者である人を含む。対象は、ヒトでよく、他の哺乳動物、特にヒト疾患の研究室モデルとして有用である哺乳動物、例えばマウス、ラット等も含む。

本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、悪性であっても良性であっても全ての新生物細胞成長及び増殖、並びに全ての前癌及び癌細胞及び組織を指す。

「癌」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、自律した非制御型成長を示し、それによって細胞増殖を超える顕著な制御喪失によって特徴付けられる異常な成長表現型を示す細胞、を指す。一般的に、本願における検出、分析、分類又は処置のための対象の細胞は、前癌状態（例えば、良性）の、悪性の、転移前の、転移の及び非転移の細胞を含む。癌の例は、卵巣癌、膠芽腫、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、腎臓癌、腫瘍、メラノーマ、頭頚部癌、及び脳腫瘍をむが、これらに限定されない。

癌の「病因」は、患者の健康な状態を損なう全ての現象を含む。このことは、異常又は制御不可能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能の妨害、異常レベルでのサイトカイン又は他の分泌物の放出、炎症性又は免疫学的応答の抑制又は悪化、異常形成、前悪性、悪性、周囲又は遠隔組織又は臓器、例えばリンパ節の浸潤などを含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「癌再発」及び「腫瘍再発」並びにその文法的変形体は、癌の診断後に新生物性又は腫瘍性細胞の更なる増殖を指す。特に、癌性組織で更なる癌性細胞成長が起こる時に、再発が起こり得る。同様に、腫瘍細胞が局所又は遠隔組織及び臓器に播種される時に「腫瘍が拡がる」；そのため、腫瘍は腫瘍転移を包含する。腫瘍成長が局所的に拡がって、正常臓器機能の圧迫、崩壊又は抑制によって関連する組織の機能を損なう時に、「腫瘍浸潤」が起こる。

本明細書で使用される用語「転移」は、最初の癌性腫瘍の臓器に直接的に結合されない臓器又は体部における癌性腫瘍の増殖を指す。転移は、最初の癌性腫瘍の臓器に直接的に結合されない臓器又は体部における癌細胞の検出不可能な量の存在である、微小転移を含むと理解される。転移は、最初の腫瘍部位からの癌細胞の出発、及び体の他の部位への癌細胞の移動及び／又は浸潤等の、プロセスの数個のステップとしても定義され得る。そのため、本発明は、最初の癌性腫瘍の臓器に直接結合されない臓器又は体における、１つ以上の癌性細胞の更なる成長の危険性を決定する方法、及び／又は該成長をもたらすプロセスにおける任意のステップを決定する方法を企図する。

癌の性質に依存して好適な患者試料が得られる。本明細書で使用される「癌性組織試料」という表現は、癌性腫瘍から得られた任意の細胞を指す。転移していない固形腫瘍の場合には、外科的に除かれた腫瘍由来の組織試料は、典型的には、慣用的な技術によって試験するために得られ調製されることになる。

該定義は、血液及び生物学的起源の他の液体試料、固形組織試料、例えば生検試料もしくは組織培養物又はそれら由来の細胞及びその子孫を包含する。該定義は、その取得後に、試薬によって処理され；洗浄され；又は癌細胞等のある細胞集団を豊富にする等の任意の方法で操作された試料も含む。該定義は、分子の特定の種類、例えば核酸、ポリペプチド等が豊富にされた試料も含む。「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、臓器、骨髄、血液、血漿、血清等も含む。「生体試料」は、患者の癌細胞から得られた試料、例えば患者の癌細胞から得られるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む試料（例えば、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む細胞溶解物又は他の細胞抽出物）；及び患者由来の癌細胞を含む試料を含む。患者由来の癌細胞を含む生体試料は、非癌性細胞も含み得る。

「診断」という用語は、本明細書では、分子的状態又は病状、疾患又は症状、例えば乳癌、前立腺癌又は他の癌種の分子的サブタイプの特定を指すために使用される。

「予後」という用語は、本明細書では、新生物疾患、例えば卵巣癌の再発、転移的な拡がり、及び薬物耐性を含む、癌による死又は癌の進行の可能性の予測を指すために使用される。「予測」という用語は、観察、実験又は科学的推論に基づいて予知又は見積る行為を指すために使用される。１例では、医師は、癌再発のないある時期での原発腫瘍の外科的除去及び／又は化学療法の後に、患者が生存するであろう可能性を予測することができる。

本明細書で使用される「治療」、「治療すること」等の用語は、効果を得る目的で、薬物を投与すること、又は手段（例えば、放射線、外科的手段等）を実施することを指す。効果は、疾患又はその症候を完全に又は部分的に予防する点で予防であり、及び／又は疾患及び／又は疾患の症候のための部分的又は完全な治癒をもたらす点で治療であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける任意の転移性腫瘍の任意の治療を含み、（ａ）疾患に罹りやすいが未だ該疾患を有しているとは診断されていない対象において疾患又は疾患の症候が起こらないようにすること（例えば、原発疾患に関連し得る又はそれによって起こり得る疾患を含む）；（ｂ）該疾患を阻害すること、すなわち、その進行を食い止めること；及び（ｃ）該疾患を緩和すること、すなわち該疾患の後退を引き起こすこと、を含む。腫瘍（例えば、癌）治療において、治療薬は腫瘍細胞の転移を直接に減少させることができる。

治療することは、減退のような客観的又は主観的パラメータ；寛解；症状を減少させ、又は疾患症状を患者により寛容性にする；変性又は減退の速度を遅くすること；あるいは、変性の最終ポイントの衰弱を少なくさせることを含む、癌の治療又は緩和又は予防における成功の任意の兆候を指すことがある。症候の治療又は緩和は、医師による試験の結果を含む、客観的又は主観的パラメータに基づき得る。従って、「治療すること」という用語は、新生物、例えば腫瘍又は癌に関連した症候又は症状の進行を抑制又は遅延するために、緩和するために、又は停止又は阻害するために、本発明の化合物又は薬物の投与を含む。「治療的効果」という用語は、対象における疾患、症状の症候又は疾患の副作用の減少、除去又は抑制を指す。

「組み合わせて」、「併用療法」及び「組み合わせ生成物」とは、ある実施態様では、本明細書で使用される第１治療薬及び化合物の患者への同時投与を指す。組み合わせて投与される時に、各々の成分は、異なった時点で任意の順で同時に又は順次投与され得る。従って、各成分は、所望の治療的効果を提供するように別箇に、しかし十分に近い時間で投与され得る。

本発明によれば、第１の治療薬は、任意の好適な治療薬、例えば細胞毒性薬でよい。細胞毒性薬の１例は化学療法剤であり、例えば、それらはＡＸＬ又はＧＡＳ６シグナル伝達を阻害するための治療と組み合され得る。具体的な細胞毒性薬は、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミホスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペチタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、シサプド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ソキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エポエチンアルファ、アトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲンシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、レウコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキアート、メトクロプラミド、ミトマイシン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル（タキソール（商標））、ピロカルピン、プロクロロペラジン、リツキシマブ、サプロイン、タモキシフェン、タキソール、トポテカン塩酸塩、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビン酒石酸塩を含むが、これらに限定されない。卵巣がん治療のために、ＡＸＬ又はＧＡＳ６シグナル伝達阻害剤と併用できる好ましい化学療法剤は、タキソール（商標）である。

他の併用療法は、放射線、外科手術、及びホルモン除去（Ｋｗｏｎ等．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１５０７４−９，１９９９）である。血管新生阻害剤も本発明の方法と組み合され得る。

公知の癌治療薬と本発明の医薬組成物との「同時投与」は、公知の薬物及び本発明の組成物の両方が治療効果を有することになるような時点での該薬物及びＡＸＬ阻害剤の投与が治療的効果を有することになる、ことを意味する。かかる同時投与は、本発明の化合物の投与に関して薬物の同時（すなわち、同一の時間に）、前、又は後の投与を含み得る。当業者は、本発明の具体的な薬物及び組成物の投与の、好適な時点、順序及び投薬量を決定する困難性はないであったろう。

本明細書で使用される「疾患のない生存」という表現は、患者の寿命に対する癌の効果に関して、かかる腫瘍再発及び／又は拡がりの欠如、及び診断後の患者の運命を指す。「全体的な生存」という句は、患者の死因が直接、癌の効果に因るものではないとの可能性にもかかわらず、診断後の患者の運命を指す。「疾患なしの生存の可能性」、「再発の危険」という表現及びそれらの変形は、癌の診断後の患者における腫瘍再発又は拡がりの可能性であって本発明のプロセスに従って決定される可能性を指す。

本明細書で用いる「相関する」又は「と相関する」という用語及び類似の用語は、事象が数字、データ群等を含む、２つの事象例間の統計的な関係を指す。例えば、事象が数字を含む時には、正の相関（本明細書では「直接相関」とも称される）は、１つが増加すると、他も増加することを意味する。負の相関（本明細書では「逆相関」とも称される）は、１つが増加すると、他は減少することを意味する。

「投薬単位」は、治療されるべき具体的個体のための１単位投薬量として作り変えられた物理的に不連続な単位を指す。各単位は、必要とされた医薬担体と一緒になって所望の治療的効果（複数）を生じるように計算された活性化合物（複数）の所定量を含み得る。投薬単位の仕様は、（ａ）活性化合物（複数）の固有の特徴、達成されるべき具体的な治療効果（複数）、及び（ｂ）かかる活性化合物（複数）を調合する当該分野に固有の限定、によって決定される。

「薬学的に許容される賦形剤」は、一般的に安全で、非毒性で及び望ましい医薬組成物を調整する点で有用である賦形剤を意味し、動物的使用及びヒト医薬的使用に許容される賦形剤を含む。かかる賦形剤は、エアロゾル組成物、ガス性の場合には、固体、液体、準固体でよい。

「薬学的に許容される」、「生理学的に許容される」という用語及びその文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤及び薬物を指す場合には、交換可能に使用され、そして、物質が、組成物の投与を禁止する程度の望ましくない生理学的効果の発生なしにヒトに対してヒトに投与することができることを示す。

「治療上有効量」は、疾患を治療するために対象に投与される時に、該疾患の治療効果に十分な量を意味する。

詳細な説明
ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３は、３つの受容体タンパク質チロシンキナーゼであって、そのリガンドがＧＡＳ６である。したがって、本発明は、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３受容体とＧＡＳ６リガンドとの相互作用を阻害及び／又は拮抗する阻害剤の発見に一部基づく。

本発明によれば、かかる阻害剤は、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性の阻害剤、ＧＡＳ６活性の阻害剤、及びＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３−ＧＡＳ６相互作用の阻害剤から選択され、該阻害剤は野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３に比べてＧＡＳ６に向上した親和性で結合することができる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、単一のＧＡＳ６分子上の２つ以上のエピトープに結合する。該２つ以上のエピトープは、ＧＡＳ６上のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３主要及び／又は副次結合部位のうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態において、該エピトープは、分離した又は別箇のエピトープである。いくつかの実施形態において、該エピトープは重複する。いくつかの実施形態において、該エピトープは重複しない。いくつかの実施形態において、該エピトープは隣接している。いくつかの実施形態において、該エピトープは隣接していない。いくつかの実施形態において、該エピトープは、ＧＡＳ６上の主要及び／又は副次ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３結合部位を含む。本発明のこれらのＧＡＳ６エピトープであって、本発明の阻害剤が結合するエピトープは、１つ以上のＧＡＳ６分子上に位置付けられ得る。いくつかの実施形態において、該エピトープは単一のＧＡＳ６分子上に位置付けられる。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、単一のＧＡＳ６上の主要及び／又は副次ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３結合部位に結合することができる。いくつかの実施形態において、該阻害剤は、ＧＡＳ６の主要ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３結合部位、及び１つ以上の更なるＧＡＳ６エピトープに結合することができる。他のいくつかの実施形態において、該阻害剤は、ＧＡＳ６上のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３副次結合部位、及び１つ以上の更なるＧＡＳ６エピトープに結合することができる。いくつかの実施形態において、該阻害剤は、ＧＡＳ６上の２つ以上の別箇のエピトープに結合することができる。該更なるＧＡＳ６エピトープは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３に比べて、ＧＡＳ６に結合する阻害剤の向上した親和性及び／又は向上した結合力をもたらすＧＡＳ６上の任意のエピトープを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに結合する、いくつかの実施形態において、該２つのエピトープは、主要及び副次ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３結合部位である。

本発明によれば、ＧＡＳ６受容体は、ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３を含む。本発明の阻害剤はまた、いくつかの実施形態において、主要及び／又は副次ＧＡＳ６／受容体相互作用を拮抗し得る。いくつかの実施形態において、該阻害剤は、主要及び／又は副次ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を拮抗することができる。他のいくつかの実施形態において、該阻害剤は、副次ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を拮抗することができる（例えば、主要ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を妨害するか及び／又は阻害する）。いくつかの実施形態において、該阻害剤は、副次ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を拮抗することができる（例えば、副次ＧＡＳ６／受容体結合相互作用を妨害するか及び／又は阻害する）。

阻害剤は、例えば、タンパク質骨格（すなわち、完全な抗体の大きさの例えば１０分の１でよい分子構造を用いて匹敵する親和性及び特異性を達成することができる、より小さなタンパク質）も含み得る。

該阻害剤は非抗体ポリペプチドも含み得る。いくつかの実施形態において、該阻害剤は非抗体ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、非抗体ポリペプチドは、ペプチドボディー、ダーピン、アビマー、アドネクチン、アンチカリン、アフィボディー、マキシボディー、又は他のタンパク質構造骨格、あるいはそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明によって提供される該阻害剤は、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチド、例えば、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ポリペプチドの結合活性と実質的に等しいか又は優れているＧＡＳ６に対する結合活性を有する、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドである。本発明のいくつかの実施形態において、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは治療剤として利用される。

配列番号：１の天然配列に関するＡＸＬタンパク質は、残基２７〜１２８の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、残基１３９〜２２２の第２のＩｇ様ドメイン、残基２２５〜３３２及び３３３〜４２７の３型フィブロネクチンドメイン、チロシンキナーゼドメインを含む残基４７３〜８９４の細胞内ドメインを含む。７７９、８２１及び８６６のチロシン残基は、受容体二量化の際に自己リン酸化し、細胞内シグナル伝達分子のためのドッキング部位として働く。該ポリペプチドの可溶性形態を放出する天然の開裂部位は残基４３７〜４５１にある。

本発明の目的のために、ＡＸＬの可溶性形態（ｓＡＸＬ）は、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に通常存在する、認識可能な親和性、例えば、高親和性でＧＡＳ６に結合するのに十分なポリペプチドの一部であり、すなわち、一般的には、おおよそ配列番号：１の残基１９〜４３７であるが、おおよそ残基１９、２５、３０、３５、４０、４５、５０からおおよそ残基１３２、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３７５、３５０〜３２１、例えば残基１９〜１３２の切断型を含むか又は本質的にそれから成り得る。本発明の方法によれば、配列番号：１は、配列番号：１のアミノ酸８〜８９４と交換可能に使用され得、それらの両方は野生型ＡＸＬ配列を指す。いくつかの実施形態において、ＡＸＬの可溶性形態は、膜貫通ドメインを欠き、場合により細胞内ドメインを欠く。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、ＡＸＬ膜貫通ドメインを欠き、及び野生型ＧＡＳ６と比べてＧＡＳ６に結合するＡＸＬポリペプチドの親和性を向上させる、野生型に対して少なくとも１つの変異を有する、可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドである。

配列番号：２の天然配列に関するＭＥＲタンパク質は、残基８１〜１８６の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、残基１９７〜２７３の第２のＩｇ様ドメイン、残基２８４〜３７９及び３８３〜４８２の３型フィブロネクチンドメイン、チロシンキナーゼドメインを含む残基５２７〜９９９の細胞内ドメインを含む。７４９、７５３、７５４及び８７２のチロシン残基は、受容体二量化の際に自己リン酸化し、細胞内シグナル伝達分子のためのドッキング部位として働く。

本発明の目的のために、ＭＥＲの可溶性形態（ｓＭＥＲ）は、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に通常存在する、認識可能な親和性、例えば、高親和性でＧＡＳ６に結合するのに十分なポリペプチドの一部であり、すなわち、一般的には、おおよそ配列番号：２の残基２１〜５２６であるが、切断型を含むか又は本質的にそれから成り得る。いくつかの実施形態において、ＭＥＲの可溶性形態は、膜貫通ドメイン（すなわち、一般的にはおおよそ配列番号：２の残基５０６〜５２６）を欠き、場合により細胞内ドメイン（一般的にはおおよそ配列番号：２の残基５２７〜９９９）を欠く。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、可溶性ＭＥＲ変異体ポリペプチドであって、該ＭＥＲポリペプチドは、ＭＥＲ膜貫通ドメインを欠き、及び野生型ＭＥＲと比べてＧＡＳ６への結合性におけるＭＥＲポリペプチドの親和性を向上させる、野生型に対する少なくとも１つの変異を有する。

配列番号：３の天然配列に関するＴｙｒｏ３タンパク質は、残基４１〜１２８の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、残基１３９〜２２０の第２のＩｇ様ドメイン、残基２２５〜３１７及び３２２〜４１３の３型フィブロネクチンドメイン、チロシンキナーゼドメインを含む残基４５１〜８９０の細胞内ドメインを含む。６８１、６８５、６８６及び８０４のチロシン残基は、受容体二量化の際に自己リン酸化し、細胞内シグナル伝達分子のためのドッキング部位として働く。

本発明の目的のために、Ｔｙｒｏ３の可溶性形態（ｓＴｙｒｏ３）は、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に通常存在する、認識可能な親和性、例えば、高親和性でＧＡＳ６に結合するのに十分なポリペプチドの一部であり、すなわち、一般的には、おおよそ配列番号：３の残基４１〜４５０であるが、切断型を含むか又は本質的にそれから成り得る。いくつかの実施形態において、ＡＸＬの可溶性形態は、膜貫通ドメイン（すなわち、一般的にはおおよそ配列番号：３の残基４３０〜４５０）を欠き、場合により細胞内ドメイン（一般的にはおおよそ配列番号：３の残基４５１〜８９０）を欠く。

いくつかの実施形態において、該阻害剤は、可溶性Ｔｙｒｏ３変異体ポリペプチドであって、該Ｔｙｒｏ３ポリペプチドは、Ｔｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、及び野生型Ｔｙｒｏ３と比べてＧＡＳ６への結合性におけるＴｙｒｏ３ポリペプチドの親和性を増加させる、野生型に対して少なくとも１つの変異を有する。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、可溶性変異体ポリペプチド、例えば、ｓＡＸＬ、ｓＭＥＲ又はｓＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドである。

いくつかの実施形態において、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３細胞内ドメインを欠く。

いくつかの実施形態において、本発明の阻害剤は、インビボ又はインビトロでの、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ポリペプチドとＧＡＳ６タンパク質との間の結合を阻害する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、インビボ又はインビトロでの、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ポリペプチドとＧＡＳ６タンパク質との間の結合を阻害する。

本発明の阻害剤はまた、亢進された又はより優れた薬物動態学的プロファイルを示し得る。いくつかの実施形態において、該亢進された又はより優れた薬物動態学的プロファイルは、例えば、より優れた吸収プロファイル、より優れた分布プロファイル、より優れた代謝プロファイル、より優れた排出プロファイル、より優れた解放プロファイル、増加した半減期、減少した半減期、作用のより速い速度、膜貫通ドメインを欠くＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３野生型ポリペプチドと比較してより長い効果期間を含むが、これらに限定されない。当業者は、例えば治療レジメを含む特定の要求のための好ましい薬物動態学的プロファイルパラメータ、及び治療レジメにおけるそのようなパラメータをどのように好適に実施するかを理解するだろう。

野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３は全て２つのフィブロネクチンドメインを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３ポリペプチドは、機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠く。機能性フィブロネクチンドメインの欠如又はそれを欠くことは、１又は２つのフィブロネクチンドメインの削除、及び／又は１又は２つのフィブロネクチンドメインの機能性を阻害し、減少させ又は除く変異を導入することを含むがこれらに限定されず、かかる変異は、例えば置換、削除及び挿入の変異を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドでは、フィブロネクチン１（ＦＮ）が削除、フィブロネクチン２（ＦＮ）が削除、又はＦＮ１及びＦＮ２の両方が削除されている。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＦＮ１を変異させ及び／又は削除した部分、ＦＮ１を変異させ及び／又は削除した部分、又はＦＮ１及びＦＮ２を変異させ及び／又は削除した部分を有する。

いくつかの実施形態において、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、機能性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３と比べてＧＡＳ６に結合する該ポリペプチドの向上した親和性を示す。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠き、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３と比べてＧＡＳ６に結合する該ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、機能性フィブロネクチンのこの欠如は、ＧＡＳ６への結合性におけるＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドの向上した親和性をもたらす。いくつかの実施形態において、この機能性フィブロネクチンの欠如は、例えば、機能性フィブロネクチンドメインを欠かない他の野生型ポリペプチド又は他のポリペプチドと比べて、より優れた吸収プロファイル、より優れた分布プロファイル、より優れた代謝プロファイル、より優れた排出プロファイル、より優れた解放プロファイル、増加した半減期、減少した半減期、作用のより速い速度、膜貫通ドメインを欠くＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３野生型ポリペプチドと比較してより長い効果期間を含むが、これらに限定されない亢進された又はより優れた薬物動態学的プロファイルをもたらす。当業者は、例えば治療レジメを含む特定の要求のための好ましい薬物動態学的プロファイルパラメータ、及び治療レジメにおけるそのようなパラメータをどのように好適に実施するかを理解するだろう。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠き、１つより多いＩｇ１ドメインを有し、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏと比べてＧＡＳ６への結合性におけるＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドの向上した親和性を示す。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドは、２つのＩｇ１ドメインを有する。いくつかの実施形態において、３つのＩｇ１ドメインを有する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドは、１つより多いＩｇ１ドメイン及び／又は１つより多いＩｇ２ドメインを有する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドは、２つのＩｇ２ドメインを有する。いくつかの実施形態において、２つのＩｇ１ドメイン及び２つのＩｇ２ドメインを有する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドは、例えば以下のＩｇドメイン構造の１つ、及びその任意の組合せ又はその変形体を含むが、これらに限定されない：

・Ｉｇ１
・Ｉｇ１−Ｉｇ２
・Ｉｇ１−Ｉｇ１
・Ｉｇ１−Ｉｇ１−Ｉｇ１
・Ｉｇ１−Ｉｇ２−Ｉｇ１
・Ｉｇ１−Ｉｇ２−Ｉｇ１−Ｉｇ２

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドはまた、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、ＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドの向上した親和性を示す。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠き、１つより多いＩｇ１ドメインを有し、１つより多いＩｇ２ドメインを有し、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏと比べてＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドの向上した親和性を示す。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３は、互いに直接的に結合した免疫グロブリンドメインを有する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３は、例えば、当該分野で公知の例えば任意のアミノ酸リンカーを含むリンカー分子によって、間接的に結合した免疫グロブリンドメインを有する。

いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ Ｉｇ１、及び／又は１つ以上のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ Ｉｇ２ドメインは、例えば、より優れた吸収プロファイル、より優れた分布プロファイル、より優れた代謝プロファイル、より優れた排出プロファイル、より優れた解放プロファイル、増加した半減期、減少した半減期、作用のより速い速度、膜貫通ドメインを欠く他のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３野生型ポリペプチド又は他のポリペプチドと比較してより長い効果期間を含む、亢進された又はより優れた薬物動態学的プロファイルをもたらす。当業者は、例えば治療レジメを含む特定の要求のための好ましい薬物動態学的プロファイルパラメータ、及び治療レジメにおけるそのようなパラメータをどのように好適に実施するかを理解するだろう。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、単一のＧＡＳ６上の２つ以上に結合することができる。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、単一のＧＡＳ６上の主要及び副次ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３結合部位の両方に結合することができる。いくつかの実施形態において、主要及び副次ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３結合の両方の結合は同時である。いくつかの実施形態において主要及び副次ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３結合部位の両方の結合は、単一のＧＡＳ６上で同時である。

本発明はまた、単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに結合しないＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを提供する。本発明はまた単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに同時に結合しないＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、単一のＧＡＳ６上の２つのエピトープに結合することができず、これは、例えばモノマーＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、このモノマーＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは１つの１ｇ１ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該モノマーＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、単一のＧＡＳ６分子上の１つより多い部位に同時に結合しないＦｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに結合することができない該モノマーＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、２つのＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドであって、その各々は、単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに同時に結合することができない変異体ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに同時に結合することができない該モノマーＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、Ｉｇ１ドメインを有する。いくつかの実施形態において、単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに同時に結合することができない該モノマーＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、単一のＧＡＳ６分子上の２つのエピトープに結合することができるＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドと比べて、変更された半減期を有する。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、１つのＩｇ１ドメインを有し、機能性Ｉｇ２ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、該Ｉｇ１ドメインは、ＡＸＬのアミノ酸１〜１３１（配列番号：１；又はいくつかの実施形態において、配列番号：１のアミノ酸８〜１３８）を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドであり、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドはＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、１つのＩｇ１ドメインを有し、機能性Ｉｇ２ドメインを欠き、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３に比べてＧＡＳ６に結合する該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。いくつかの実施形態において、先の請求項のいずれかのポリペプチドであって、該ポリペプチドは、可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドであり、該可溶性ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドはＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３膜貫通ドメインを欠き、機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠き、１つのＩｇ１ドメインを有し、機能性Ｉｇ２ドメインを欠き、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３に比べてＧＡＳ６への結合性における該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの向上した親和性を示す。

野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３はすべてＩｇ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ及びＴｙｒｏ３ポリペプチドは、機能性Ｉｇ２ドメインを欠く。機能性Ｉｇ２ドメインの欠如又はそれを欠くことは、Ｉｇ２ドメインの削除、及び／又はＩｇ２ドメインの機能性を阻害し、減少させ又は除く変異を導入することを含むがこれらに限定されず、かかる変異は、例えば置換、削除及び挿入の変異を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドはＩｇ２ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドでは、機能性Ｉｇ２ドメインを欠き、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ Ｉｇ１ドメインを有する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、機能性Ｉｇ２ドメインを欠き、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ Ｉｇ１ドメインに対してＩｇ１ドメイン中に１つ以上の変異を有する。

いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、リンカーを含む。幅広い様々なリンカーが当該分野で知らており、任意の公知のリンカーが本発明の方法で作用され得る。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、１つ以上のリンカー又はリンカー単位を含む。いくつかの実施形態において、該リンカーは、その野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３配列とは異なる２、３、４又は５アミノ酸のアミノ酸配列を含むアミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態において、該リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の単位を有する。いくつかの実施形態において、該リンカーは（ＧＬＹ）_４ＳＥＲ（配列番号：１０）である。いくつかの実施形態において、該リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の（ＧＬＹ）_４ＳＥＲ単位を有する。いくつかの実施形態において、該リンカーは、１、２、３又は５の（ＧＬＹ）_４ＳＥＲ単位を有する。いくつかの実施形態において、該リンカーは、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドと融合ポリペプチドのＦｃ部分との間にある。いくつかの実施形態において、該リンカーは、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドと融合ポリペプチドのＦｃ部分との間にあり、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは機能性フィブロネクチンドメインを欠く。

いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドはまた、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３の可溶性形態内に１つ以上のアミノ酸修飾、例えばＧＡＳ６に対するその親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸修飾を含む。本発明によれば、アミノ酸修飾は、当該分野で知られた又は後に発見された、任意の天然の又は人工のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、任意の天然の変異、例えば置換、削除、付加、挿入等を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、既存のアミノ酸を別のアミノ酸、例えばそれらの保存的等価物と置き換えることを含む。更なる他のいくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、１つ以上の既存のアミノ酸を非天然アミノ酸と置き換えること、又は１つ以上の非天然アミノ酸を挿入することを含む。更なるいくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、少なくとも１、２、３、４、５、又は６又は１０アミノ酸変異又は変更を含む。

例となるいくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾は、例えば安定性、結合活性及び／又は特異性等に影響を与えるＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３の可溶性形態の性質を変更するために使用され得る。クローン化遺伝子のインビトロでの突然変異形成の技術が知られている。変異を走査するためのプロトコールの例は、Ｇｕｓｔｉｎ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：２２（１９９３）；Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ、３７：１１１−２３（１９８５）；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ等，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：５３７−９（１９８５）；及びＰｒｅｎｔｋｉ等，Ｇｅｎｅ、２９：３０３−１３（１９８４）に見出される。部位特異的突然変異形成のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、１９８９，ｐｐ．１５．３−１５．１０８；Ｗｅｉｎｅｒ等，Ｇｅｎｅ１２６：３５−４１（１９９３）；Ｓａｙｅｒｓ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：５９２−６（１９９２）；Ｊｏｎｅｓ及びＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２：５２８−３０（１９９２）；Ｂａｒｔｏｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：７３４９−５５（１９９０）；Ｍａｒｏｔｔｉ及びＴｏｍｉｃｈ，Ｇｅｎｅ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．６：６７−７０（１９８９）；及びＺｈｕ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７：１２０−４（１９８９）に見出される。

いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の残基１８〜１３０、残基１０〜１３５、残基１５〜４５、残基６０〜６５、残基７０〜８０、残基８５〜９０、残基９１〜９９、残基１０４〜１１０、残基１１１〜１２０、残基１２５〜１３０、残基１９〜４３７、残基１３０〜４３７、残基１９〜１３２、残基２１〜１３２、残基２１〜１２１、残基２６〜１３２、又は残基２６〜１２１、の１つ以上の領域内に、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、本発明野ＡＸＬ変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の残基２０〜１３０、残基３７〜１２４又は残基１４１〜２１２の１つ以上の領域内に、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置１９、２３、２６、２７、３２、３３、３８、４４、６１、６５、７２、７４、７８、７９、８６、８７、８８、９０、９２、９７、９８、１０５、１０９、１１２、１１３、１１６、１１８、１２７、又は１２９の１つ以上の位置での１つ以上のアミノ酸修飾を含む。

更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、１）Ａ１９Ｔ、２）Ｔ２３Ｍ、３）Ｅ２６Ｇ、４）Ｅ２７Ｇ又はＥ２７Ｋ、５）Ｇ３２Ｓ、６）Ｎ３３Ｓ、７）Ｔ３８Ｉ、８）Ｔ４４Ａ、９）Ｈ６１Ｙ、１０）Ｄ６５Ｎ、１１）Ａ７２Ｖ、１２）Ｓ７４Ｎ、１３）Ｑ７８Ｅ、１４）Ｖ７９Ｍ、１５）Ｑ８６Ｒ、１６）Ｄ８７Ｇ、１７）Ｄ８８Ｎ、１８）Ｉ９０Ｍ又はＩ９０Ｖ、１９）Ｖ９２Ａ、Ｖ９２Ｇ又はＶ９２Ｄ、２０）Ｉ９７Ｒ、２１）Ｔ９８Ａ又はＴ９８Ｐ、２２）Ｔ１０５Ｍ、２３）Ｑ１０９Ｒ、２４）Ｖ１１２Ａ、２５）Ｆ１１３Ｌ、２６）Ｈ１１６Ｒ、２７）Ｔ１１８Ａ、２８）Ｇ１２７Ｒ又はＧ１２７Ｅ、及び２９）Ｅ１２９Ｋ、並びにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上のアミノ酸修飾を含む。

更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置３２、８７、９２もしくは１２７又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｇ３２Ｓ；Ｄ８７Ｇ；Ｖ９２Ａ及び／又はＧ１２７Ｒを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置２６、７９、９２、１２７又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｅ２６Ｇ，Ｖ７９Ｍ；Ｖ９２Ａ及び／又はＧ１２７Ｅを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置３２、８７、９２及び／又は７２又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｇ３２Ｓ；Ｄ８７Ｇ；Ｖ９２Ａ；Ｇ１２７Ｒ及び／又はＡ７２Ｖを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置８７、９２及び／又は１２７又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｄ８７Ｇ；Ｖ９２Ａ；及び／又はＧ１２７Ｒを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置３２、９２及び／又は１２７又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｇ３２Ｓ；Ｖ９２Ａ；及び／又はＧ１２７を含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置３２、８７及び／又は１２７又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｇ３２Ｓ；Ｄ８７Ｇ；及び／又はＧ１２７Ｒを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置３２、８７及び／又は９２又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｇ３２Ｓ；Ｄ８７Ｇ；及び／又はＶ９２Ａを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置２６、７９、９２、１２７又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｅ２６Ｇ，Ｖ７９Ｍ；Ｖ９２Ａ及び／又はＧ１２７Ｅを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置８７及び９２又はそれらの組み合わせでの１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、Ｄ８７Ｇ及びＶ９２Ａを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬポリペプチド変異体は、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）の位置７２での少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、Ａ７２Ｖを含む。

本発明によれば、該阻害剤は、ポリペプチド、ポリペプチド担体融合物、ポリペプチドＦｃ融合物、ポリペプチドコンジュゲート、ポリペプチド薬物コンジュゲート、抗体、二重特異性抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗体フラグメント、抗体関連構造体、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本発明の阻害剤は、ペプチド又はポリペプチドを含み得る。本発明のペプチド又はポリペプチドは、天然及び／又は合成ポリペプチドを含み得る。合成ポリペプチド及び合成ポリペプチドの製造方法は当該分野で周知であり、合成ポリペプチドを製造するための任意の公知の方法が本発明の方法で採用され得る。いくつかの実施形態において、該阻害剤は天然及び／又は合成ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、該阻害剤は天然及び／又は合成ポリペプチド融合物である。いくつかの実施形態において、該阻害剤は天然及び／又は合成ポリペプチドＦｃ融合物である。いくつかの実施形態において、該天然又は合成ポリペプチド融合物は、別のタンパク質構造体類又は骨格との融合物であるか、あるいはポリマー又はヒドロゲル又は関連構造体とのポリペプチド融合物である。

本発明によれば、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、更に改変され得る、例えば、様々な目的のために幅広い他のポリヌクレオチド又はタンパク質に結合され得る。例えば、様々な翻訳後又は発現後改変は、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドに関して行われ得る。例えば、好適なコーディング配列を採用することによって、当業者はファルネシル化又はプレニル化を提供し得る。いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、ＰＥＧ化され得、そこでは、ポリエチレンオキシ基は血流中の亢進された存続期間を提供する。本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、他のタンパク質、例えばＩｇＧアイソタイプのＦｃと組み合わせてもよく、それは、毒素、例えばリシン、アブリン、ジフテリア毒等との補体結合、又は標的細胞上の特定の部分への標的化を可能にする特異的結合剤との補体結合でよい。本発明の阻害剤は、ポリペプチドコンジュゲート及び抗体コンジュゲートを含み得る。本発明の阻害剤は、ポリペプチドコンジュゲート及び抗体コンジュゲートである。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドコンジュゲートは薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態において、該ポリペプチド又はポリペプチドコンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドコンジュゲートは、ポリマーコンジュゲートである。本発明のポリマーは、ＰＥＧ、ＰＥＧ含有ポリマー、分解性ポリマー、生物適合性ポリマー、ヒドロゲル、及びポリペプチドにコンジュゲートし得る他のポリマー構造体を含むがこれらに限定されず、その組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、融合タンパク質、例えば、第２のポリペプチドにフレームで融合された融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、例えば該融合タンパク質が急速に循環系から排出されないように、該融合タンパク質のサイズを増大することができる。いくつかの実施形態において、該第２のポリペプチドは、Ｆｃ領域の一部又は全部である。いくつかの実施形態において、該第２のポリペプチドは、Ｆｃと実質的に同様である任意の好適なポリペプチド、例えば、増大したサイズ及び／又はＩｇ分子との追加の結合又は相互作用を提供するポリペプチドである。更なるいくつかの実施形態において、該第２のポリペプチドは、アルブミンタンパク質、ヒト血清アルブミンタンパク質の一部又は全部である。いくつかの実施形態において、該第２のポリペプチドはアルブミンに結合するタンパク質又はペプチドである。

他のいくつかの実施形態において、該第２のポリペプチドは、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを取扱い、例えばＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの精製のために、又はインビトロもしくはインビボでの安定性を増加させるために有用である。例えば、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わされて、キメラ又は融合ポリペプチドを与える。これらの融合タンパク質は精製を促進し、インビボで増加した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの第１の２つのドメイン、及び哺乳動物免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の定常領域の様々なドメインから成るキメラタンパク質である。ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６，１９８８。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する融合タンパク質はまた、単量体性の分泌タンパク質又はタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合し中和する点でより効率的であり得る。Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４，１９９５。

更なるいくつかの実施形態において、該第２のポリペプチドは、マーカー配列、例えば融合ポリペプチドの精製を促進するポリペプチドである。例えば、マーカーアミノ酸配列は、特にヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥ ｖｅｃｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）で提供されたタグでよく、その多くは商業的に入手できる。Ｇｅｎｔｚ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４，１９８９に記載されているように、例えばヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、「ＨＡ」タグであり、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から得られたエピトープに相当する。Ｗｉｌｓｏｎ等，Ｃｅｌｌ ３７：７６７，１９８４。

更なるいくつかの実施形態において、該第２のオリゴヌクレオチドは、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチド変異体の特徴を改善するために有用な物質である。例えば、追加のアミノ酸、特に荷電したアミノ酸、の領域は、宿主細胞からの精製又はその後の操作及び保存の安定性及び持続性を改善するために、該オリゴヌクレオチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分は、精製を容易にするために本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチド変異体に付加され、続いて該ポリペプチドの最終的な調製前に除去され得る。ポリペプチドの操作を容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野ではとく知られた通例の技術である。

なお更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と少なくとも同等か又はそれよりも優れたＧＡＳ６に対する結合活性を有する。他のいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３のＧＡＳ６に対する結合活性又は親和性よりも、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍又は６倍高い該結合活性又は親和性を有する。他のいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、少なくとも約１×１０^−６、１×１０^−７、１×１０^−８又は１×１０^−９ Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍ又は１×１０^−１２ＭのＧＡＳ６に対する結合活性又は親和性を有する。更なる他のいくつかの実施形態において、本発明のｓＡＸＬポリペプチドは、インビボ、インビトロ又はその両方のいずれかで、ＧＡＳ６に結合する野生型ＡＸＬを阻害することができ、阻害し又は該野生型ＡＸＬと競合する。更なる他のいくつかの実施形態において、本発明のｓＡＸＬポリペプチドは、（ＷＯ２０１１／０９１３０５に記載されているように）ＡＸＬ Ｓ６−１、ＡＸＬ Ｓ６−２及び／又はＡＸＬ Ｓ６−５の結合を阻害し又はそれと競合する。更なる他のいくつかの実施形態において、本発明のｓＡＸＬポリペプチドは、ＷＯ２０１１／０９１３０５に記載された任意のｓＡＸＬの結合を阻害し又はそれと競合する。

本発明の阻害剤は、向上した親和性でＧＡＳ６に結合する。いくつかの実施形態において、該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３と比べてＧＡＳ６に結合する該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチドの向上した親和性を示す。いくつかの実施形態において、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３の親和性よりも、少なくとも約５倍強い、少なくとも約１０倍強い又は少なくとも約２０倍強い、５０倍強い、１００倍強い又は少なくとも２００倍強いなどの、ＧＡＳ６に対する親和性を示す。いくつかの実施形態において、該可溶性ＡＸＬは、野生型ＡＸＬポリペプチドの親和性よりも、ＧＡＳ６に対する約１１５倍強い親和性を有する。

ＧＡＳ６に結合する分子の能力は、例えば、アッセイプレート上に被覆されたＧＡＳ６に結合する推定上のリガンドの能力によって決定され得る。１つの実施態様では、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドのＧＡＳ６に対する結合能力は、リガンド、例えばＧＡＳ６、又はＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドのいずれかを固定することによってアッセイされ得る。例えば、該アッセイは、Ｎｉ−活性化ＮＴＡ樹脂ビーズ上にＨｉｓタグを融合したＧＡＳ６を固定するこを含んでよい。物質は好適なバッファに添加され、ビーズは所定の温度で一定時間インキュベートされ得る。非結合物質を除くための洗浄後に、結合したタンパク質は、例えば高いｐＨ等を有するバッファであるＳＤＳによって放出され、そして分析され得る。

更に他の実施態様では、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、野生型ＡＸＬのより優れた熱安定性を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの融点は、野生型ＡＸＬの融点よりも少なくとも５℃、１０℃、１５℃又は２０℃高い。

本発明によれば、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドはまた、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの主要配列を変化させない１つ以上の改変を含み得る。例えば、かかる改変は、ポリペプチドの化学的誘導化、例えばアセチル化、アミド化、カルボキシル化等を含み得る。かかる改変はまた、グルコシル化の改変、例えば、ポリペプチドの合成及び加工において又は更なる処理ステップにおいて、ポリペプチドのグルコシル化パターンを修飾することによって；例えば、グリコシル化に影響を与える酵素、例えば哺乳動物グリコシル化又は脱グルコシル化酵素に該ポリペプチドを曝露することによってなされたポリペプチドの化学的誘導化を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチド変異体は、ホスホリル化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホスレオニンを有するＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、タンパク質分解的な分解に対するＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの抵抗性を改善し、又は溶解性を最適化し、又は治療剤としてそれをより好適にさせるために更に改変されたＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを含む。例えば、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチド変異体は、天然のＬアミノ酸以外の残基、例えばＤアミノ酸又は非天然の合成アミノ酸を含むＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドの類似体を更に含む。Ｄアミノ酸はアミノ酸残基の一部又は全てについて置換され得る。

更なるいくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、共有結合的に又は非共有結合的に連結された少なくとも２つの同一又は異なったＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３ポリペプチド変異体は、例えば好適な大きさを有するが望ましくない凝集を避けるように、共有結合的に連結された２、３、４、５又は６つの同一又は異なったＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドを含む。

本発明によれば、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、当該分野で知られた又は後に発見された任意の好適な手段によって製造され、例えば、インビトロ等で合成された真核細胞又は原核細胞から製造され得る。該タンパク質が原核細胞から製造される場合には、アンフォールディング、例えば熱変性、ＤＴＴ還元等によって更にプロセスされ、当該分野で公知の方法を用いて更にリフォールディングされ得る。

該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、当該分野で公知の慣用的な方法を用いて、インビトロ合成によって調製され得る。様々な商業的な合成装置が入手でき、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｂｅｃｋｍａｎ等の自動合成装置である。自動合成装置を用いて、天然アミノ酸は、非天然アミノ酸で置換され得る。具体的な配列及び調製方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度等によって決定されることになる。

該ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチドは、組換え合成の慣用的な方法に従って単離され精製されてもよい。溶解物は発現宿主から調製され、該溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ、又は他の精製技術を用いて精製され得る。生成物の調製及びその精製方法に関連した不純物に関して、たいていは、使用される組成物は、所望の生成物の少なくとも２０重量％、より一般的には少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％を含むことになり、治療目的では、通常少なくとも約９９．５重量％を含むことなる。通常、パーセンテージは総タンパク質に基づくことになる。

当業者に周知である方法が、コーディング配列及び好適な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法は、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボでの組換え／遺伝子組換えを含む。あるいは、対象のペプチドをコードすることができるＲＮＡは、化学的に合成され得る。当業者は、周知のコドン対応表及び本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかのための好適なコーディング配列を提供するための合成方法を容易に利用することができる。直接的な化学合成法は、例えば、Ｎａｒａｎｇ等（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ等（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ等（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホロアミダート法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法を含む。化学合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを製造する。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、又は鋳型として一本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼとの重合化によって二本鎖ＤＮＡに変換され得る。ＤＮＡの化学合成は一般に約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列はより短い配列のライゲーションによって得られる。あるいは、サブ配列はクローン化され、好適なサブ配列は好適な制限酵素を用いて開裂され得る。

核酸は分離され、実質的な純度で得られる。通常、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかとしての核酸は、他の天然の核酸配列を実質的に含まず得られ、一般的には少なくとも約５０％、通常少なくとも約９０％の純度であり、典型的には、例えば通常、天然の染色体を伴わない１つ以上のヌクレオチドによって隣接される「組換え体」である。本発明の核酸は、直線分子として又は環状分子内に提供され、自己複製分子（ベクター）内に又は複製配列のない分子内に提供され得る。核酸の発現は、それ自体によって、又は当該分野で公知の他の制御配列によって制御され得る。本発明の核酸は、当該分野で利用できる様々な技術、例えばトランスフェリン・ポリカチオン介在ＤＮＡトランスファ、ネイキッド又はカプセル化された核酸を用いるトランスフェクション、リポソーム介在ＤＮＡトランスファ、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム介在トランスフェクション等を用いて、好適な宿主細胞に導入され得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、構成的に又は１もしくはそれ以上の制御要素下でのいずれかで、本発明の１つ以上のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ペプチド変異体のインビトロ又はインビボ発現のための発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、構成的に又は１もしくはそれ以上の制御要素下でのいずれかで、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ペプチド変異体を発現するための１つ以上の発現ベクターを含む細胞集団を提供する。

本発明の別の態様によれば、ＧＡＳ６タンパク質に特異的に結合する単離された抗体又はそのフラグメントを提供する。ＧＡＳ６（成長停止−特異的６）は、血漿ビタミンＫ依存的タンパク質のファミリーに構造的に属する。ＧＡＳ６は、同一のモジュラー組成を共有し、４０％配列同一性を有する、天然の抗凝血性タンパク質Ｓと高い構造的類似性を有する。ＧＡＳ６は、ＴＡＭファミリーの受容体チロシンキナーゼ；Ｔｙｒｏ３、ＡＸＬ及びＭＥＲとのその相互作用によって成長因子様性質を有する。ヒトＧＡＳ６は、リン脂質との結合を介在するガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）豊富ドメイン、４つの上皮成長因子様ドメイン、及び２つのラミニンＧ様（ＬＧ）ドメインから成る、６７８アミノ酸タンパク質である。ヒトＧＡＳ６の転写変異体の配列は、各々、ＧｅｎｂａｎｋのＮＭ＿００１１４３９４６．１；ＮＭ＿００１１４３９４５．１；及びＮＭ＿０００８２０．２でアクセスできる。

ＧＡＳ６は、そのビタミンＫ依存的ＧＬＡ（ガンマカルボキシグルタミン酸）モジュールとホスファチジルセリン含有膜と相互作用し、及びそのカルボキシ末端ＬａｍＧドメインとＴＡＭ膜受容体との相互作用する、独特な作用メカニズムを採用する。

本発明によれば、本発明の単離された抗体は、ＧＡＳ６に対する認識可能な結合特異性を有する任意の単離された抗体を含む。いくつかの実施形態において、単離された抗体は、一部又は完全にヒト化された抗体である。他のいくつかの実施形態において、単離された抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。更なるいくつかの実施形態において、単離された抗体は、例えば、異なった起源由来の、定常（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ）領域、可変領域及び／又はＣＤＲ３、又はそれらの組み合わせを有する、キメラ抗体である。更なるいくつかの実施形態において、単離された抗体は、本明細書に記載の様々な特徴の組合せである。

本発明によれば、本発明の単離された抗体のフラグメントは、ＧＡＳ６に対するオリゴヌクレオチドの認識可能な特異的結合に十分である又はそのために必要である、（抗体構造体又は非抗体構造体のいずれかの関連で）抗体の領域を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体のフラグメントは、可変軽鎖、可変重鎖、重鎖又は軽鎖の１つ以上のＣＤＲ、又はそれら組み合わせ、例えばＦａｂ、Ｆｖ等を含む。いくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体のフラグメントは、１本鎖抗体を含むポリペプチド、例えばＳｃＦｖを含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体のフラグメントは、可変領域のみ、又はＦｃ領域の一部と組み合わせた可変領域、例えばＣＨ１領域を含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体のフラグメントは、ミニボディー、例えばＶＬ−ＶＨ−ＣＨ３、又はダイアボディーを含む。

いくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３と相互作用する１つ以上のアミノ酸領域を含むか又はそれによって表されるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＧＡＳ６の１つ以上のアミノ酸領域、例えばＧＡＳ６のＬ２９５−Ｔ３１７、Ｅ３５６−Ｐ３７２、Ｒ３８９−Ｎ３９６、Ｄ３９８−Ａ４０６、Ｅ４１３−Ｈ４２９及びＷ４５０−Ｍ４６８、に含まれるか又はそれによって表されるエピトープに結合する。

更なるいくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体は、１つ以上のアミノ酸領域、例えばＬＲＭＦＳＧＴＰＶＩＲＬＲＦＫＲＬＱＰＴ（配列番号：４），ＥｌＶＧＲＶＴＳＳＧＰ（配列番号：５）、ＲＮＬＶＩＫＶＮ（配列番号：６）、ＤＡＶＭＫＩＡＶＡ（配列番号：７）、ＥＲＧＬＹＨＬＮＬＴＶＧＩＰＦＨ（配列番号：８）、及びＷＬＮＧＥＤＴＴＩＱＥＴＶＶＮＲＭ（配列番号：９）を含むか又はそれによって表されるエピトープに結合する。

更なる他のいくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＧＡＳ６のＬ２９５−Ｔ３１７、Ｅ３５６−Ｐ３７２、Ｒ３８９−Ｎ３９６、Ｄ３９８−Ａ４０６、Ｅ４１３−Ｈ４２９及びＷ４５０−Ｍ４６８の領域中の、少なくとも１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸を含むか又はそれによって表されるエピトープに結合する。更なるいくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体は、ＧＡＳ６のＬＲＭＦＳＧＴＰＶＩＲＬＲＦＫＲＬＱＰＴ（配列番号：４）、ＥｌＶＧＲＶＴＳＳＧＰ（配列番号：５）、ＲＮＬＶＩＫＶＮ（配列番号：６）、ＤＡＶＭＫＩＡＶＡ（配列番号：７）、ＥＲＧＬＹＨＬＮＬＴＶＧＩＰＦＨ（配列番号：８）、及びＷＬＮＧＥＤＴＴＩＱＥＴＶＶＮＲＭ（配列番号：９）の領域中の、少なくとも１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸を含むか又はそれによって表されるエピトープに結合する。

更に他のいくつかの実施形態において、本発明の単離された抗体は、本発明の野生型ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３、又はＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３ポリペプチド変異体とＧＡＳ６との結合を阻害、することができ、阻害し又はそれと競合する。

本発明によれば、本発明のＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチド及び単離された抗体は、治療的使用、例えばヒトの治療に好適な医薬組成物で提供され得る。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明の１つ以上の治療物質、例えばＡＸＬポリペプチド変異体及び／又はＧＡＳ６に対する単離された抗体、又はその薬学的に許容される塩、エステルもしくは溶媒和物又はその任意のプロドラッグを含む。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、別の細胞毒性剤、例えば別の抗腫瘍剤と組み合わせて、本発明の１つ以上の治療物質を含む。更なるいくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、別の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、本発明の１つ以上の治療物質を含む。

更なるいくつかの実施形態において、本発明の治療物質は、活性治療剤、すなわち、様々な他の薬学的に許容される成分を含む医薬組成物として一般的に投与される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ著，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０参照）。好ましい形態は、意図した投与形態及び治療的適用に依拠する。組成物はまた、望まれる製剤に依存して、動物及びヒト投与のための医薬組成物を調合するために一般的に使用されるビヒクルとして決定される、薬学的に許容され、非毒性の担体又は希釈剤を含み得る。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンク溶液である。更に、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫学的安定剤等も含んでよい。

更なるいくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物はまた、大きな、緩慢に代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（例えば、ラテックス機能化セファロース（商標）、アガロース、セルロース等）、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集体（例えば、油滴又はリポソーム）を含み得る。更に、これらの担体は、免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能し得る。

本発明の更なる別の態様によれば、本発明は、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３シグナル伝達経路及び／又はＧＡＳ６シグナル伝達経路を阻害することによって腫瘍転移又は腫瘍浸潤を治療、減少又は予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＡＸＬ、ＭＥＲ、Ｔｙｒｏ３及び／又はＧＡＳ６の活性、あるいはＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３とＧＡＳ６との相互作用を阻害することを含む。例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲ、Ｔｙｒｏ３及び／又はＧＡＳ６の活性は、遺伝子発現レベル、ｍＲＮＡプロセシングレベル、翻訳レベル、翻訳後レベル、タンパク質活性化レベル等で阻害され得る。いくつかの他の例では、ＡＸＬ、ＭＥＲ、Ｔｙｒｏ３又はＧＡＳ６の活性は、小分子、生物学的分子、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体薬物コンジュゲート等によって阻害され得る。いくつかの他の例では、ＡＸＬ、ＭＥＲ、Ｔｙｒｏ３又はＧＡＳ６の活性は、本発明の、１つ以上のＡＸＬ、ＭＥＲ、又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチド又は単離された抗体によって阻害され得る。

更に他の例では、本発明の方法は、本発明の治療物質（例えば、阻害物質）、例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性の阻害剤、又はＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３とＧＡＳ６との相互作用の阻害剤の治療上有効量又は有効量を、治療を必要としている対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、例えば本明細書に記載の転移性癌の治療のための本発明の治療物質の有効量は、投与手段、標的部位、患者の身体状態、患者がヒトか又は動物か、投与される他の薬物、及び治療が予防的か又は治療的かを含む多くの様々な要因によって変動する。通常、患者は、ヒトであるがトランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物も治療され得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために決定されなければならない。

いくつかの実施形態において、投薬量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲でよい。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でよい。例示的な治療レジメは、毎２週間に１度、１ケ月に１度、毎３〜６ヶ月に１度の投与を必要とする。本発明の治療物質は、通常、複数回で投与される。単回投与間の間隔は、毎週、毎月、又は毎年でよい。間隔はまた、患者における治療物質の血中レベルを測定することによって示されるような不規則なものでよい。あるいは、本発明の治療物質は、あまり頻繁な投与が必要とされない徐放製剤として投与されてよい。投薬量及び頻度は患者におけるポリペプチドの半減期によって変動する。

予防的適用において、比較的低投薬量は、長期間にわたって比較的頻繁でない間隔で投与される。患者によっては、その余命のための治療を継続する。治療的適用において、疾患の進行が減少され又は停止されるまで、好ましくは患者が疾患の症候の部分的又は完全な緩和を示すまで、時には、比較的短い間隔での比較的高投薬量が必要とされることがある。その後、患者は予防的レジメを投与され得る。

更に他のいくつかの実施形態において、本発明の方法は、卵巣癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、胆嚢癌、膵臓癌、前立腺癌、及び／又は膠芽腫の腫瘍転移又は腫瘍浸潤を治療、減少又は予防することを含む。

更にまた他のいくつかの実施形態において、予防的適用のためには、医薬組成物又は医薬は、疾患又は症状のリスクに敏感な又はそのリスクのある患者に、該リスクを除去又は減少させ、疾患の生化学的、組織学的及び／又は行動症状、疾患の発症中に現れるその合併症及び中間的な病気の表現型を含む、疾患の重度を減少させ、又は疾患の発症を遅らせるために十分な量で投与される。

更に他のいくつかの実施形態において、治療的適用のためには、本発明の治療物質は、疾患の進行における疾患の合併症及び中間的な病原性表現型を含む、疾患の症状（生化学的、組織的及び／又は行動的）を治癒するか少なくとも部分的に抑えるために十分な量で、そのような疾患の疑いのある又は既に罹患している患者に投与される。治療的又は予防的処置を達成するために十分な量は、治療上又は予防上の有効量として定義される。予防的及び治療的レジメの両方において、薬物は、通常は、十分な応答が得られるまで複数の投与単位で投薬される。典型的には、該応答は監視され、癌の再発があれば、繰り返し投薬が行われる。

本発明によれば、転移性癌の治療のための組成物は、非経口的、局所的、静脈内、腫瘍内、皮下的、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内又は筋肉内手段によって投与され得る。最も典型的な投与経路は、他の経路も同等に効果的であり得るが、静脈内又は腫瘍内である。

非経口的投与のためには、本発明の組成物は、殺菌性液体、例えば水、油、食塩水、グリセロール又はエタノールでよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤中の薬物の溶液又は懸濁液の注射投薬量として投与され得る。更に、補助的物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤等が、組成物に存在してもよい。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、野菜又は合成起源、例えばピーナツ油、大豆油、及び鉱油の成分である。一般的に、グリコール、例えばグリコール又はポリエチレングリコールは、特に注射溶液のための好ましい液体担体である。抗体及び／又はポリペプチドは、活性成分の徐放を可能にするような方法で製剤化され得るデポー注射剤又はインプラント調製物の形態で投与され得る。例示的な組成物は、ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨ ７．４に調整された、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２１０ｍＭスクロース、５１ｍＭ Ｌ−アルギニン、０．０１％ポリソルベート２０からなる水性緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに調製されたポリペプチドを含む。

典型的には、組成物は、液体又は懸濁液のいずれかとして注射剤として調製される；注射前の、液体ビヒクルを含む溶液又は懸濁液に好適な固体形態も調製され得る。調製物はまた、リポソーム又は微粒子、例えばポリペプチド、ポリグリコリド、又は上で考察したような亢進されたアジュバント効果のためのコポリマー、中に乳化されるか又はカプセル化され得る。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０、及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７−１１９，１９９７。本発明の薬物は、活性成分の徐放又はパルス状放出を可能にするような方法で製剤化され得る、デポー注射剤又はインプラント調製物の形態で投与され得る。

他の投与形式に好適な追加の製剤は、経口の、鼻腔の及び肺の製剤、座薬、及び経皮適用を含む。

座薬のために、結合剤及び担体は、例えば、グリコール及びトリグリセリドを含み；かかる座薬は０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。経口製剤は、賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース及び炭酸マグネシウムのを含む。これらの組成物は、液剤、座薬、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放製剤又は粉末の形態をとり、活性成分の１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％を含む。

局所適用は、経皮又は皮内送達をもたらし得る。局所投与は、コレラ毒素又は解毒化したその誘導体もしくはそのサブユニット、又は他の類似の細菌毒素と薬剤を共投与することによって促進され得る。Ｇｌｅｎｎ等 Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８５１，１９９８。共投与は、混合物、又は化学的架橋もしくは融合タンパク質としての発現によって得られた架橋分子として成分を用いることによって達成され得る。

あるいは、経皮送達は、皮膚パッチを用いて又はトランスファーソームを用いて達成され得る。Ｐａｕｌ等 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３５２１−２４，１９９５；Ｃｅｖｃ等 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６８：２０１−１５，１９９８。

医薬組成物は、一般的に、殺菌性の、実質的に等張で、米国食品衛生局の全てのＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）規制を完全に満たすものとして製剤化される。

好ましくは、本明細書に記載の抗体組成物の治療上有効量は、実質的に毒性を起こすことなく、治療上利益を提供するだろう。

本明細書に記載のタンパク質の毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手段によって、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％の致死量）又はＬＤ_１００（集団の１００％の致死量）を決定することによって。決定される。毒性と治療的効果との間の投薬量比が治療的指標である。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用に毒性でない投薬量範囲を調合する時に使用され得る。本明細書に記載のタンパク質の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか又は全くない有効量を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、採用された投薬剤形及び使用された投薬経路に基づいてこの範囲内で変動し得る。正確な調合、投薬経路、及び投薬量は、患者の症状の点から各医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ等，１９７５，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１参照）。

また、本発明の範囲内には、本発明の組成物（例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲ又はＴｙｒｏ３変異体ポリペプチド及びその製剤）及び使用のために教示を含むキットがある。キットは、少なくとも１つの追加の試薬を含み得る。キットは、典型的には、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上に又はキットと一緒に供給されるあるいはキットに付随する任意の表示又は記載資料を含む。

本発明の更に別の態様によれば、問題の対象由来の生体試料中のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性あるいはＧＡＳ６活性のレベルを検出及び／又は決定することによって腫瘍浸潤及び／又は転移を受ける腫瘍の能力を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性あるいはＧＡＳ６活性のレベルは、ｍＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現レベル、タンパク質活性化レベル又はＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３、又はＧＡＳ６の活性に相当する任意のインジケータによって直接又は間接に測定される。いくつかの実施形態において、生体試料中のＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性あるいはＧＡＳ６活性のレベルが、所定のレベル、例えば、腫瘍浸潤又は腫瘍転移を発症していない腫瘍由来の試料又は正常組織由来の試料の集団に基づいて、正常レベル、又はＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性あるいはＧＡＳ６活性のレベルの範囲を確立することによって得られた標準的レベル、と更に比較される。例えば、ＡＸＬ、ＭＥＲ及び／又はＴｙｒｏ３活性あるいはＧＡＳ６活性のレベルの、所定レベル又は標準的レベルを超える増加は、腫瘍浸潤又は腫瘍転移を受ける腫瘍の傾向の指標である。

本明細書で引用された全ての刊行物及び特許は、あたかも各々の刊行物又は特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれ、該刊行物に関連して引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために、本明細書に参照により組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示について、先発明の観点から本発明がこれら刊行物に先行されることにより権利を有しないことを自認すると解釈されるべきではない。更に、提供された刊行物の日付は、実際の刊行物の日付とは異なる可能性があり、個別に確認される必要があり得る。

この開示を読んだ当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例証された個々の実施態様の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施態様のいずれかの特徴とは容易に分離され又は組み合わされる別箇の成分及び特徴を有する。いずれの記載した方法も、記載された事象の順で又は論理的に可能である任意の他の順で実施され得る。以下に、本発明の一部を例証するために実施例を記載する。本明細書で使用された用語は特定の実施態様を記載する目的であることも理解されたい。

実施例１−様々なＡＸＬ ＦＣコンストラクトの親和性
図１は、ＡＸＬび４つのドメイン、及び作製され試験されたＡＸＬ Ｆｃコンストラクトの様々な組み合わせを示す。

以下のＡＸＬ Ｆｃコンストラクトが作製された：
ａ 完全長の野生型Ｆｃ融合物
ｂ 完全長ＡＸＬペプチド１融合物
ｃ ＡＸＬペプチド１ Ｆｎ（−） Ｆｃ融合物（これはＦｎ−コンストラクト）
ｄ 副次ＧＡＳ６結合部位がノックアクトされた、完全長ＡＸＬペプチド１融合物
ｅ ＡＸＬペプチド１ Ｆｎ（−） Ｆｃ融合物、ＦｃとＡＸＬとの間の３ｘ ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー
ｆ ＡＸＬペプチド１ Ｆｎ（−） Ｆｃ融合物、ＦｃとＡＸＬとの間の５ｘ ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー
ｇ ＡＸＬペプチド１ Ａ７２Ｖ Ｆｎ（−） Ｆｃ融合物、ＦｃとＡＸＬとの間の３ｘ ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー

以下の表１はＧＡＳ６の上記コンストラクトの親和性の概要を説明する。比較として野生型ＡＸＬを示す。

上の表１に示したデータから導かれるいくつかの結論がある。

Ｆｃ融合コンストラクトは、単量体を超える親和性の増加を提供する。例えば：野生型ＡＸＬ Ｉｇ１（単量体）は約３３ｐＭの親和性を有し、それに対して野生型Ｆｃ融合物は約９ｐＭの親和性を有し、ＡＸＬペプチド１ Ｉｇ１（単量体）は約３ｐＭの親和性を有し、それに対してＡＸＬペプチド１−Ｆｃ融合物は約０．４ｐＭの親和性を有する。

野生型ＡＸＬを超えるＡＸＬペプチド１の顕著な親和性改善。加えて、ＡＸＬペプチド１及びＡ７２Ｖ変異は（コンストラクト（ｇ）と比較したコンストラクト（ｅ））野生型ＡＸＬを超える、親和性の更なる亢進を有する。

Ｆｃ融合物における親和性の増加のメカニズムは、単一のＧＡＳ６分子に対する多価結合からもたらされる。具体的には、融合物の１つのアームは主要ＡＸＬ結合部位に結合するが、他方のアームは副次ＡＸＬ結合部位に結合する。この結論は、以下の実験データに基づいた：
ａ ＡＸＬペプチド１ Ｉｇ１（モノマー）は、上記表のＡＸＬペプチド１ Ｆｎ（−） Ｆｃ融合物である （ｃ） と同じ親和性を有する。このことは、ＡＸＬの２つのコピーを単に有することが親和性改善を提供するために十分でないことを示唆している。
ｂ 除かれた副次結合部位を有する完全長ＡＸＬペプチド１はモノマー及びＦｎ（−）融合物と同じ親和性を有する。このことは、副次結合部位が親和性改善に明確な役割を有していることを示している。
ｃ 副次結合部位が大きなＧＡＳ６分子に近づかないように、Ｆｎ（−）コンストラクトが配置される。ＡＸＬとＦｃとの間のリンカーの付加は、更なる柔軟性及び空間を提供し、それによって親和性の２倍改善が得られる。このことは、副次結合部位が重要であるという考えを更に支持する。

総括すると、実施例１は、ＡＸＬ ＥＣＤのＦｃ融合物が野生型ＡＸＬと比べてＧＡＳ６に対する改善された親和性を有し得ることを示す。理論に拘束されるものではないが、この改善された親和性の根底にある１つのメカニズムは、ＧＡＳ６上の主要ＡＸＬ結合部位へのコンストラクトの１アームとＧＡＳ６上の副次ＡＸＬ結合部位への他のアームとの同時結合である。

実施例２−様々なＡＸＬ ＦＣコンストラクトの親和性
配列：ＡＸＬペプチド２−Ｆｃ．ＡＸＬペプチド２は、ＡＸＬのアミノ酸１〜１３１を含み、Ｉｇ２ドメインを欠失し、両方のＦＮドメインを欠失する。

このコンストラクトは、ヒトＩｇＧ１に融合したＡＸＬのアミノ酸１〜１３１を、この２つのドメインを連結する１つのＧｌｙ_４Ｓｅｒリンカーとともに、含む（図２）。更に、コンストラクトは、本発明によって記載されるように、分子のＡＸＬ部分に様々な変異を含む。例えば、実施態様は、ＡＸＬペプチド１ Ｉｇ１ Ｆｃ融合物又はＡＸＬペプチド１及びＡ７２Ｖを有することを含む。

ＡＸＬペプチド１ Ｉｇ１−Ｆｃの、ヒトＧＡＳ６への親和性は、１．７±０．０３ｐＭであると測定された。

総括すると、実施例２は、ＡＸＬ Ｉｇ１ドメインのＦｃ融合物が野生型ＡＸＬと比べてＧＡＳ６に対する改善された親和性を有し得ることを示す。

上述の本発明は、理解の明確性の目的で例証及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、本発明の趣旨から離脱することなく、本発明にある変更及び修正がなされ得ること、及び、添付の請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことは、本発明の教示の点から当業者には容易に明らかであろう。

当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様に対する多くの等価形態を理解又は確認することができるだろう。かかる等価形態は添付の請求の範囲に包含される。

Claims (4)

1. ＧＡＳ６の阻害剤であって、前記阻害剤が可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドであり、
   前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドが
   ＡＸＬ膜貫通ドメインを欠き、
   機能性フィブロネクチン（ＦＮ）ドメインを欠き、
   Ｉｇ１ドメインおよびＩｇ２ドメインを有し、
   配列番号：１のＧ３２、Ａ７２、Ｄ８７、Ｖ９２およびＧ１２７の位置またはＧ３２、Ｄ８７、Ｖ９２およびＧ１２７の位置に対するアミノ酸置換のセットを含み、
   （ＧＬＹ） _４ ＳＥＲ（配列番号：１０）単位の１つまたは複数を含むリンカーによって前記ＡＸＬ変異体ポリペプチドに連結されたＦｃドメインを含み；および
   前記ＡＸＬ変異体ポリペプチドが、野生型ＡＸＬ（配列番号：１）と比較して増加したＧＡＳ６への結合親和性を示す；
   ことを特徴とするＧＡＳ６の阻害剤。
2. 請求項１に記載のＧＡＳ６の阻害剤において、前記可溶性ＡＸＬ変異体ポリペプチドが
   Ｇｌｙ３２Ｓｅｒ、Ａｓｐ８７Ｇｌｙ、Ｖａｌ９２ＡｌａおよびＧｌｙ１２７Ａｒｇ；ならびに
   Ｇｌｙ３２Ｓｅｒ、Ａｌａ７２Ｖａｌ、Ａｓｐ８７Ｇｌｙ、Ｖａｌ９２ＡｌａおよびＧｌｙ１２７Ａｒｇ
   から選択されるアミノ酸置換のセットを含むことを特徴とするＧＡＳ６の阻害剤。
3. 請求項１または２に記載のＧＡＳ６の阻害剤および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
4. 哺乳類患者においてＧＡＳ６を発現する腫瘍の成長または転移を低減するための請求項３に記載の医薬組成物。