JP6345670B2 - Ｄ３から誘導されたｄ−エナンチオマーの新規ペプチド及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、Ｄ３から誘導されたＤ−エナンチオマーのＡβオリゴマーに結合する新規ペプチド及びその使用、特に医薬品におけるその使用、に関する。

ここ数十年間の人口増加のために、加齢に伴う疾病を患う人の数は高まっている。ここでは特にいわゆるアルツハイマー病（ＡＤ、アルツハイマー型痴呆、ラテン語＝Morbus Alzheimer）を挙げることができる。

アルツハイマー病の特徴は、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ−ペプチド）の細胞外堆積である。プラーク中のＡβ−ペプチドの堆積は、典型的にはＡＤ患者の脳中で死後に確認できる。したがって、Ａβ−ペプチドの様々な形、例えばフィブリルが、前記疾病の発生及び進行の責任を負う。さらに、ここ数年のうちに、小さい自由拡散可能なＡβ−オリゴマーが、ＡＤの発生及び進行の主要な原因と見られている。
Ａβ−モノマーは、Ａβ−オリゴマーの構成成分であり、人体で常に発生しており、恐らくそれ自体では毒性でない。それどころか、Ａβ−モノマーは、神経保護機能さえ有する可能性がある。Ａβ−モノマーは、その濃度に依存して偶然に一緒に堆積することがある。この濃度は、体内のその形成速度及び分解速度に依存する。年齢が増加すると共に、体内でのＡβ−モノマーの濃度の向上が起こり、そして前記モノマーが自然発生的に一緒に堆積してＡβ−オリゴマーを生じる可能性がより確からしくなる。そうして発生するＡβ−オリゴマーは、プリオンに類似して増加し、そして最終的にはアルツハイマー病を生じる可能性がある。

これまでに、ＡＤの原因に対して効果がある作用物質又は医薬品は存在していない。これまでに使用され、認可されている医薬品は、ＡＤで発生する症状のいくつかを緩和する。しかし、これら医薬品は、疾病の進行を遅延させること又は治癒をもたらすことはできない。動物実験ではＡＤ予防で成功を示すが、（必ずしも）ＡＤ治療では成功を示さない、いくつかの物質が存在する。

ＡＤの予防と治療又は治癒との間の重要な相違点は、予防は既に最初のＡβ−オリゴマーの形成を妨げることで達成できる可能性がある、と言う事実にある。予防のためには、必ずしもＡβ−オリゴマーに対して高親和性かつ選択的でない、いくつかの、わずかなＡβ−リガンドが十分である。

多くのモノマーからのＡβ−オリゴマーの形成は、高オーダーの反応であり、そのため、Ａβ−モノマー濃度に高度に依存する。したがって、活性のあるＡβ−モノマー濃度を僅かに低下させることで既に、最初のＡβ−オリゴマーの形成が妨げられる。これまでの開発において見出されるどちらかと言えば予防によるセラピーコンセプト及び物質は、この作用機序に基づく。しかし、ＡＤの治療では、完全に異なる状況を前提としている。ここでは、Ａβ−オリゴマー又は場合によって既に比較的大きいポリマー又はフィブリルもが存在し、これらはプリオン類似の作用機序によって増加する。しかし、この増加は、低オーダーの反応であり、したがって、ほとんどＡβ−モノマー濃度には依存しない。

先行技術から知られている物質は、Ａβ−モノマー及び／又はオリゴマーの濃度を様々なやり方で低下させる。例えば、動物試験で予防に使用されていたγ−セクレターゼ−モジュレーターが知られている。
ＷＯ ０２／０８１５０５からは、Ａβ−ペプチドに結合するＤ−アミノ酸の様々な配列が知られている。Ｄアミノ酸からの前記配列は、解離定数（Ｋ_D値）４μｍｏｌでアミロイドβペプチドに結合する。
ＷＯ ２０１１／１４７７９７からは、アミノピラゾールと、Ａβ−オリゴマー化を妨げるペプチドとからなるハイブリッド化合物が知られている。

動物実験でポジティブな結果を示した多くの物質では、この作用はヒトに対する臨床試験において確認することができない。第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相の臨床試験では、明白にＡＤと診断されたヒトだけが処置することが許されている。ここでは、Ａβ−モノマー濃度の僅かな低下は、例えばプリオン類似の作用機序によって既に存在するものからＡβ−オリゴマーを更に多く形成することを妨げるのに、もはや十分でない。しかし、Ａβ−オリゴマーの増加又はさらに好ましくはその分解又は無害化は、疾病の進行に影響を及ぼすために、必ず必要である。

これまでに、ＡＤは主として、既に痴呆症状が発生しているヒトに対する検査による神経心理学的試験によって診断されている。しかし、Ａβ−オリゴマー及び疾患進行において時間的にその後に続くフィブリル及びプラークは症状発生の２０年前までに患者の脳において発生し、そして既に不可逆的な損傷を引き起こしうることが知られている。但し、これまでには実地では、ＡＤを症状の発生前に診断する手段はなお存在していない。

したがって、さらに、極めて特異的にかつ高い親和性でＡβ−オリゴマーに結合し、そうしてその増殖を妨げる新規化合物（作用物質）についての要求が存在する。この化合物は、不所望な副作用を示さない、特に免疫反応を惹起しないことが望ましい。さらに、この化合物は、毒性のＡβ−オリゴマーを、ひいては小さい自由拡散可能なオリゴマーをも低濃度で認識する、完全に根絶する及び／又はその（プリオン類似の）増殖を妨げる、ことが望ましい。

さらに、特に疾病がなお大幅に進行しておらず、かつ、オリゴマーがまだ低濃度で発生する場合に、Ａβ−オリゴマーの認識及びマーキングのためのプローブとして使用可能である新規化合物に関する要求もある。

本発明の更なる課題は、先行技術から知られている大抵の化合物のように細胞外Ａβ−ペプチドのみに焦点を当てるのでなく、狙いを定めて溶解性のＡβ−オリゴマーに結合する物質を提供することであった。さらに、この新規化合物は、Ａβ−ペプチドのフィブリル形成を阻害又は妨げることが望ましい。
さらに、課題は、新規ペプチド、好ましくはＤ−エナンチオマーのＤ−ペプチドＤ３（配列番号１１）の誘導体であって、Ｄ３と比較してより効率的な特性を有するもの、を提供することであった。この特性は、特に、Ａβ−種への結合親和性及び結合特異性、Ａβ−フィブリル形成の阻害、Ａβ−細胞毒性の阻害、Ａβ−オリゴマーの沈殿、Ａβ−フィブリルの非毒性非アミロイド形成種への変換、である。

前記課題は、配列番号１（Ｄ３−Ｄｅｌｔａ−ＨＴＨ）、配列番号２（ＲＤ２）、配列番号３（ＲＤ１）、配列番号４（ＲＤ３）、配列番号５（ＤＢ３）、配列番号６（ＮＴ−Ｄ３）、配列番号７（ＤＢ１）、配列番号８（ＤＢ２）、配列番号９（ＤＢ４）及び／又は配列番号１０（ＤＢ５）に記載のアミノ酸配列及び／又はそのホモログ、断片及び部分を含むペプチドによって解決される。前記課題は、配列番号１（Ｄ３−Ｄｅｌｔａ−ＨＴＨ）、配列番号２（ＲＤ２）、配列番号３（ＲＤ１）、配列番号４（ＲＤ３）、配列番号５（ＤＢ３）、配列番号６（ＮＴ−Ｄ３）、配列番号７（ＤＢ１）、配列番号８（ＤＢ２）、配列番号９（ＤＢ４）及び／又は配列番号１０（ＤＢ５）及び／又はそのホモログのポリマーによっても解決される。

断片及び部分は、本発明のペプチドと類似の又は同一の作用を示す。

変形において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０に記載のペプチド及びそのホモログは、実質的に、好ましくは少なくとも６０％、７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、９５％、特に９６％、９７％、９８％、９９％、１００％がＤ−アミノ酸からなる。

本発明の意味合いにおけるポリマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０及びそのホモログ（既にＡβ−オリゴマー）からなる群から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はそれ以上のモノマーから形成されている。本発明によれば、ポリマーは、同一のモノマーから又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の異なる、様々な上述モノマーの組み合わせから、いわゆる組み合わせモノマーとして構成されている。上記モノマーは、部分的に同一であってもよい。組み合わせポリマー中の同一モノマーの数は、自由に選択可能である。
一変法において、組み合わせポリマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０及び／又は配列番号１１及びそのホモログ並びにその部分又は断片からなる群から選択される少なくとも１のモノマー、及び
少なくとも１のＡβ−オリゴマーに結合するペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び／又は配列番号１１及びそのホモログ並びにその部分又は断片（好ましくは、実質的にＤ−エナンチオマーからなる）からなる群から選択されるモノマーと更なるモノマーとして異なるペプチド
を含む。

ポリマーは、例えば化学合成又はペプチド合成によって製造されてよい。

本発明の一態様において、モノマーは相互に共有結合している。更なる一態様において、モノマーは共有結合によらず相互に結合している。
モノマー単位の共有結合又は連結は、本発明の意味合いにおいて、ペプチドがヘッドｔｏヘッド、テイルｔｏテイル又はヘッドｔｏヘッドで、その間にリンカー又はリンカー基が使用されずに、鎖状に相互に連結される場合に存在する。

非共有連結とは、本発明の意味合いにおいて、モノマーがビオチン及びストレプトアビジン、特にストレプトアビジンテトラマーを介して相互に連結している場合に存在する。

本発明の変法において、モノマーは、特に上記のように、鎖状に相互に連結されていてよい。他の変法において、モノマーは、本発明のポリマーに対して分岐して相互に連結してよい。

分岐ポリマーの場合には、本発明によれば、モノマーが共有により又は共有によらないで相互に連結しているデンドリマーであってよい。

代替的に、モノマーは、プラットフォーム分子（例えばＰＥＧ又は糖）を用いて連結していてもよく、そうして分岐状ポリマーを形成してよい。

代替的に、上記選択肢の組み合わせも可能である。

モノマー及びポリマーは、以下では本発明のペプチドと称する。

本発明の変法では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列及び／又は５０％の同一性を有するそのホモログを有するペプチドである。
「ホモログ配列」又は「ホモログ」は、本発明の意味合いにおいて、アミノ酸配列が、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のモノマーの前述のアミノ酸配列の１との同一性を有することを意味する。「同一性」の概念の代わりに、本明細書では、「ホモログに」又は「ホモロジ−」との概念が同義に使用される。２つの核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、Smith, T.F.及びWaterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482−489 (1981))のアルゴリズムを基礎とするプログラムBESTFITを援用した比較により、アミノ酸についての以下パラメーターの調節下で計算される：Gap creation penalty: 8、Gap extension penalty: 2; 核酸についての以下パラメーター: Gap creation penalty: 50 、Gap extension penalty: 3。
好ましくは、２つの核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、それぞれ全ての配列長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって定義され、例えばNeedleman, S.B.及びWunsch, CD. (J. Mol. Biol. 48: 443−453)のアルゴリズムを基礎とするプログラムGAPを援用した比較により、アミノ酸についての以下パラメーターの調節下で計算される：Gap creation penalty: 8、Gap extension penalty: 2; 核酸についての以下パラメーター:Gap creation penalty: 50、Gap extension penalty: 3。
２つのアミノ酸配列は、本発明の意味合いにおいて、これらが同じアミン酸配列を有する場合に、同一である。

「ホモログ」とは、変法において、上述のモノマーの相応するレトロインバース（retro−inverse）配列が理解される。「レトロインバース配列」との概念は、本発明では、アミノ酸からエナンチオマーの形で構成され（inverse:アルファＣ原子のキラル性が逆転している）、さらに当初アミノ酸配列に対する配列順序が反転している（retro＝逆向き）アミノ酸配列を指す。

更なる変法において、本発明のペプチドは、アミロイドβ−ペプチドの部分に結合する。

更なる変法において、本発明のペプチドは、記載の配列とは、３個までのアミン酸が異なる配列を有する。
さらに、ペプチドとして、上述の配列を含む配列も使用される。

更なる変法において、ペプチドは、上述の配列の断片を有するか、又は上述の配列に対するホモログ配列を有する。

本発明によれば、ペプチドは、医薬品において使用され、好ましくはアルツハイマー病の治療のために使用される。

本発明の一態様において、ペプチドは、実質的にＤ−アミノ酸からなる。
本発明の意味合いにおいて、「実質的にＤアミノ酸からなる」とは、本発明により使用すべきモノマーは、少なくとも５０％、６０％、好ましくは７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、９５％、特に９６％、９７％、９８％、９９％、１００％がＤアミノ酸から構成されていることを意味する。

本発明の一態様において、本発明のペプチドは、ＤエナンチオマーのＤ−ペプチドＤ３の誘導体である。本発明の意味合いにおいて、誘導体は、以下の３つの方法のうちのいずれかにより達成される、Ｄ３から誘導されるペプチド配列である：
ａ）Ｄ３中のアミノ酸構成成分の順序及び数の変更。この場合に、Ｄ３中に存在するアミノ酸のみ使用される。
ｂ）Ｄ３配列のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１個の欠失。
ｃ）他のアミノ酸、好ましくはＤ−エナンチオマーによるアミノ酸１、２、３、４、５又は６個の交換。

更なる変法において、本発明のペプチドは、アミロイドβ−ペプチドのフィブリル形成の阻害のためである。本発明のポリマーは、Ａβ−オリゴマー又はそこから形成されるポリマー並びにフィブリルを、それらに結合し、そうして毒性でない化合物に変換することで、解毒化する。相応して、本発明の主題は、Ａβ−オリゴマー、そこから形成されるポリマー又はフィブリルの解毒化方法でもある。

本発明の主題は、態様において、更なる物質と連結している本発明のペプチドでもある。
連結とは、本発明の意味合いにおいて、化学結合、例えばRoempp Chemie Lexikon, 第9版, 第1巻, 650頁〜, Georg Thieme Verlag Stuttgartに定義されている化学結合であり、好ましくは主原子価結合、特に共有結合である。
物質とは、変法において、薬事法（§２又は§４（１９）、２０１２年９月より）に定義されている医薬品又は作用物質である。代替的に、作用物質は、医薬的に作用物質として使用される、治療的に活性のある物質である。好ましくは、炎症抑制剤が使用される。
物質とは、更なる変法において、ペプチドの作用を強化する化合物である。
変法において、そのような化合物は、アミノピラゾール及び／又はアミノピラゾール誘導体である。アミノピラゾール誘導体は、本発明の意味合いにおいて、３−アミノピラゾール−５−カルボン酸又は３−ニトロピラゾール−５−カルボン酸並びに、複素環のＣＨ基が−ＣＲ−又は−Ｎ−又は−Ｏ−又はＳ−により交換されている全ての誘導体並びにそれらから誘導される全てのペプチド性のダイマー、トリマー又はテトラマー、好ましくはアミノピラゾール−トリマーである。
更に代替的に、ペプチドの溶解性及び／又は脳血液関門の通過を改善する化合物である。

更に代替的に、ペプチドは、本発明によれば、上述の変法、態様及び／又は代替物の少なくとも２以上の特徴の全ての任意の組み合わせを有する。

本発明の主題は、凝集したＡβ−ペプチドに結合するための本発明のペプチドでもある。

本発明の更なる主題は、ペプチド合成、例えば当業者に知られている通り、低分子量を有する任意の化合物（low−molecular weight Compounds）のための有機合成法及び／又は突然変異生成及び／又は組み換え製造による、本発明のペプチドの製造方法である。

本発明は、さらに、特にアルツハイマー病の治療のための、本発明のペプチドを含む組成物にも関する。
本発明の主題は、さらに、特に毒性Ａβ−オリゴマーを妨げるための又はそこから形成されるポリマー若しくはフィブリルの分解のための、本発明のペプチドを含む組成物である。
本発明の「組成物」は、例えば、本発明のペプチドを専門知識に基づいて製造される処方物において含む、接種物質、医薬品（例えば、タブレット形状にある）、注入溶液、食品又は食品補助剤であってよい。

本発明は、さらに、本発明のペプチドを含むキットにも関する。
かかるキットにおいて、本発明のペプチドは、容器において、場合によって、緩衝液又は溶液と共に／緩衝液又は溶液の中に、包装されていてよい。キットの全ての成分は、同一の容器において又は相互に別個に包装されていてよい。さらに、キットは、その使用のための指示書を含んでよい。かかるキットは、例えば、本発明の、栓及び／又はセプタムを有する注入バイアルにおいて含んでよい。さらに、その中には、例えばディスポーザブルシリンジが含まれていてもよい。

本発明の更なる主題は、アミロイドβオリゴマー又はフィブリルの同定、定量測定及び／又は定性測定のためのプローブとしての本発明のペプチドの使用である。
本発明の主題は、アミロイドβオリゴマーの同定、定量測定及び／又は定性測定のための、本発明のペプチドを含むプローブでもある。

かかるプローブは、それを用いてＡＤの早期診断が可能になるため、重大な意義をもつ。早期診断を用いて、疾病は既に極めて早期の段階で対抗処置できる。
かかる分子プローブは、本発明のポリマー及び場合によって着色剤、蛍光着色剤、放射性同位体（ＰＥＴ他）、ガドリニウム（ＭＲＩ）並びにプローブの像形成に適した代替的な物質を含み、かつ、例えば静脈内注射によって、患者に注射されてよい。脳血液関門を介した通過性に応じて、プローブはＡβ−オリゴマー及び／又はプラークに結合してよい。そうしてマーキングされたＡβ−オリゴマー及び／又はプラークは、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴ、ＭＲＴ、プロトン−ＭＲ−分光法等といった任意の方法を用いて、可視可能にされてよい。

さらに、本発明は、アミロイドβ−オリゴマー及び／又はアミロイドβ−ペプチド−凝集体及び／又はアミロイドβ−フィブリルを妨げるためのペプチドの使用にも関する。

本発明のペプチドは、毒性アミロイドβオリゴマー及び／又は凝集体の解毒化のためにも使用される。特に、アミロイドβ−オリゴマー及び／又は凝集体に結合し、そうして無定形の、非毒性の凝集体を形成するために、使用される。

更なる主題は、アルツハイマー病の治療薬としての本発明のペプチドの使用である。

本発明のペプチドは、Ａβ−オリゴマー、特に溶解性Ａβ−オリゴマーに特に良好に結合する。

本発明のペプチドの標的分子への特に強い結合は、本発明のペプチドの標的分子への高い特異性及び／又は親和性によって引き起こされる。形成される複合体は、低い解離定数（Ｋ_D値）を有する。

チオフラビンＴ試験を用いて、本発明のペプチド、好ましくは配列番号１−５、特に配列番号１及び／又は配列番号５が、Ａβ−ペプチドのフィブリル形成を極めて効率的に阻害することが示されることができた。

更なる主題は、血液、血液生成物及び／又は器官の治療方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ）における本発明のペプチドの使用であって、血液、血液生成物及び／又は器官が、ヒト又は動物の体から取り出され、Ａ−（アミロイド）β−オリゴマーが除去及び／又は解毒化されることにより特徴付けられる使用である。

図１は、ＲＤ２によるＡβ １〜４２の凝集挙動の調節、イオジキサノール密度勾配を用いた分析を示す図である。 図２は、種々のＡβ １〜４２ 立体配座に対するペプチドの結合の相対的定量化のためのＥＬＩＳＡを示す図である。 図３は、種々のペプチドの存在下での相対的フィブリル含有量の定量化のための、Ａβ １〜４２のＴｈＴ凝集試験を示す図である。 図４は、Pepchip実験の結果を示す図である。

１．
表１に記載のＤ３変異体は化学合成された。

表１：検査したＤ３誘導体のリスト

表に記載のペプチドの影響を、密度勾配遠心を用いてＡβ−凝集に対して検査した。この場合に、Ａβを、それぞれのペプチドと混合し、そのサイズに応じて発生する粒子の分離を行った。検査すべき試料を、密度勾配が提供される遠心管の表面に付与し、前記勾配はこの例において異なるイオジキサノール濃度の層からなっていた。数時間の分離の間に、分子は異なる速度で溶媒中に沈殿し、すなわち、粒子が大きいほどその速度は迅速である。適した時間点に遠心が終了すると、異なる層において試料の種々の成分が得られ、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析する。対照として、ペプチド添加なしのＡ−βを利用した。例示的に、図１において、Ａβ及びＲＤ２ありのＡβの経過の評価を示している。

図１から明らかである通り、Ａβ試料においては、全ての分画においてＡβを検出することができる。これは、ＲＤ２の添加によって変化する。ここでは、分画３−９（Ａβ−オリゴマー分画）においてはより少ないＡβ−オリゴマーを検出できる。分画１０−１５で検出可能な大きい凝集体が発生する。２０μＭの使用したペプチド濃度では、Ｄ３は効果を示さなかった。以前の研究では、Ｄ３はより高濃度でＡβ−オリゴマーを沈殿させ、大きい、無定形の、かつ非毒性の凝集体へと変換させることが明らかになった(Funke et al., ACS Chem. Neurosci. 2010)。Ａβを用いて上述の方法で特性決定されている全てのＤ−エナンチオマーのペプチドは、ＦＩＴＣでマーキングされている。分画１２において検出可能な染料の量を、その中でのそれぞれのＤ３誘導体のＡβ−オリゴマーへの結合強度又はそのオリゴマーを沈殿させる作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで見積もるために利用した。表２に、全てのペプチドについての結果が示されている。特にペプチドＲＤ２がＤ３に比べて、Ａβ−凝集に対する明白な作用を有することが示されている。

表２：様々なＤ３誘導体のＡβ−１〜４２凝集挙動の調節の結果のまとめ

２．
ペプチドをさらに、種々のＡβ−の立体配置（Ａβ−モノマー、−オリゴマー、−フィブリル）へのそのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合に関してＥＬＩＳＡにおいて試験した。全てのペプチドは、Ａβ−モノマーへの弱い結合を示すが、しかし、オリゴマー及びフィブリルへの比較的高い親和性を示した（図２）。興味深いことに、アミノ末端でビオチニル化したモノマーは検出されなかった一方で、カルボキシ末端のビオチニル化を有する「シードのない」モノマー（凝集核なしに沈殿）は弱く結合していた。これは、Ｄ３誘導体のアミノ末端に局在する結合エピトープ部を示唆する可能性があると解釈できる。

３．
いくつかのペプチドをチオフラビンＴ（ＴｈＴ）凝集試験において使用した。ＴｈＴは、蛍光色素であり、種々のアミロイドタンパク質のβシートリッチな構造に結合し、そして、４４０ｎｍの励起により蛍光を発する。この発光は、このようにして試料中の相対的なフィブリル含有量と相関させることができる。ＴｈＴ試験は、Ａβのフィブリル化の測定のために利用され、そして、Ａβ−凝集に対するこの可能性のある阻害作用を検出するために特にリガンドで使用される。ペプチドを、１０μＭのＡβ−溶液を用いて１：１０（Ａβ：ペプチド）の比で使用した。１５時間後に、Ａβコントロール中の飽和相に達した後に、リガンド添加なしに、Ｄ−ペプチドとＡβの共インキュベーションのＴｈＴ蛍光を評価し、Ａβ−コントロールインキュベーションに依存した％で示した。この場合に、全ての使用したペプチドがＡβフィブリル形成を明らかに減少させることが示された（図３）。

４．
さらに、Ａβ、特にＡβ−オリゴマーに対してＤ３に比較して高められた結合強度を、その凝集に対して少なくとも同じ作用でもって示すＤ３変異体を同定した。より強化された結合は、より効率的な治療効果であると推測される。
３００個よりも多くのＤ３変異体が固定されている、ＪＰＴ社（ベルリン）の膜を用いたＰｅｐＳｐｏｔ分析によって、Ａβ（１〜４２）オリゴマーに対してより親和性に結合する変異体を同定することを試みた。Ｄ３、変異アミノ酸配列を有するＤ３変異体（いわゆる飽和突然変異作成−全てのアミノ酸を、そのＤ−エナンチオマー形状にある全１９個の他の天然に存在するアミノ酸によって交換している）及び対照を、トリオキサ膜カルボキシ末端に固定化した。５μＭのＡβ（１〜４２）オリゴマーを用いた５分間のインキュベーション及び洗浄工程後に、結合したＡβのシグナルを、抗Ａβ抗体（６Ｅ１０）によって検出した。結合シグナルを、シグナル強度／表面積として評価した。分析の際に、Ｄ３オリジナルのシグナル強度（平均値）を誘導体のシグナル強度と比較した。Ａβ−オリゴマーのより強い結合を生じたアミノ酸交換を、表３にまとめて示している。

表３：第１行に太字でＤ３のＤアミノ酸配列を示してある。その下の行には、Ａβ−オリゴマーの結合強度の向上を生じたアミノ酸交換の手法及び場所が記載されている。

５．
この結果を確認するため、そして、表４に記載のアミノ酸交換の組み合わせによって、Ａβに対してさらにより強い親和性を有する新規変異体を獲得するために、更なるＤ３変異体を、Pepscan社のPepchipアレーにカップリングさせ、そしてそのＡβ結合強度について試験した。変異体選択では、既に記載の、Pepspot膜評価の結果を根拠にした。６個の独立した試験において、Ｄ３誘導体に結合するＡβを、カップリングしたＦＩＴＣマーキングを介して検出した。この場合に、５μＭのＡβ−ＦＩＴＣを使用した。検出を、マイクロアレースキャナー型番FLA8000（Fujifilm社）において行い、結合シグナルをＡＩＤＡアレーメトリックスソフトウェアを用いて測定し、Mathlabのバージョン7.10.0.449を用いて評価した。図４は、例として、選択されたPepchipの結合シグナルを示す。

Pepchipに固定化されたペプチド５個は、６個の試験のうち少なくとも４つにおいて限界値を上回り、そして、それによってＤ３に比較してＡβに対する顕著に高い結合親和性を示した。このペプチドの配列は表４にまとめてある。そのうち、表３からの組み合わせた交換を有する配列が見出される。

表４：Ｄ３に比較して固定化された形でより強いＡβモノマー結合強度を示すＤペプチドの配列

図面の説明
図１：ＲＤ２によるＡβ １〜４２の凝集挙動の調節、イオジキサノール密度勾配を用いて分析。イオジキサノール勾配を、１００μｌの８０μＭのＡβ １〜４２溶液及び１００μｌの８０μＭのＡβ及び２０μＭのＲＤ２混合物を用いて層を重ねた。引き続き、３時間４℃で２５９．０００×ｇで遠心分離した。１５個の分画（１５個の分画は、ローディングバッファーと沸騰させたペレットである）を、遠心分離工程の直後に手動で回収し、トリス−トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して引き続く銀染色を用いて分析した。２０μＭのＤ３を用いた同じ条件下の工程を実施する場合には、Ａβのみを用いた工程に比較して変更は生じなかった。

図２：種々のＡβ １〜４２ 立体配座に対するペプチドの結合の相対的定量化のためのＥＬＩＳＡ。カルボキシ末端でビオチニル化したＡβからのシードレスモノマー（明るい灰色のバー）及びアミノ末端ビオチニル化したＡβ−モノマーからのオリゴマー（暗い灰色のバー）及びフィブリル（黒色のバー）を、それぞれ５μｇ／ｍｌで固定化し、Ｄ−ペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で適用した。バックグラウンド吸収を差し引いた後の、４５０ｎｍでの吸収としての２回の測定におけるペプチドの結合の相対的定量化が示されている。

図３：種々のペプチドの存在下での相対的フィブリル含有量の定量化のための、Ａβ １〜４２のＴｈＴ凝集試験。Ａβの濃度は１０μＭであり、ペプチドを１：１０（Ａβ：ペプチド）の割合で添加した。１０μＭ Ａβの蛍光を１００％に設定し、残りのインキュベーションの値及び標準偏差を、この最大値のパーセント割合として記載している。いずれのペプチドもＡβなしに顕著なＴｈＴ蛍光を示さなかった。

図４：Pepchip実験の結果。Pepchipに種々のＤ３変異体を固定化した。Pepchipを、ＦＩＴＣマーキングしたＡβ（５μＭ）でインキュベーションした。ＦＩＴＣ蛍光強度を、それぞれのＤ３誘導体の結合強度の尺度として読み取った。チップ上の１１個の種々の位置に対して同様に設けたＤ３対照について、１１個の得られた値から平均値及び標準偏差を算出した。平均値及び標準偏差を加算して、Ｄ３と比較してＡβに対し明白により高い親和性を当てはめるために、Ｄ３誘導体が達成しなければならない限界値として結果を定義した。前記限界値を超える全てのペプチドの結合シグナルの積算が示されている。３つの正確に同じペプチドスポットの平均値が、個々のバーの基礎となっている。a.u.: arbitary units、相対蛍光単位。観察した結果の分散のために、この全ての試験を６回実施した。

Claims (15)

1. Ｄ−エナンチオマーのアミノ酸を少なくとも５０％含むペプチドであって、該ペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド単量体又は互いに同一又は異なる複数の該ペプチド単量体から構成されるペプチド多量体を含む、ペプチド：
   （１） 配列番号２、
   （２） 配列番号２と８０％以上の同一性を有し、アミロイドβペプチドに対する結合能を有するホモログ配列。
2. 更なる物質と連結されていることを特徴とする請求項１記載のペプチド。
3. 医薬品における使用のための請求項１又は２記載のペプチド。
4. アルツハイマー病の治療のための請求項１から３のいずれか１項記載のペプチド。
5. 少なくとも９０％がＤ−アミノ酸から構成されていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載のペプチド。
6. アミロイドβペプチドのフィブリル形成の阻害のための請求項１から５のいずれか１項記載のペプチド。
7. 凝集したアミロイドβペプチドへの結合のための請求項１から６のいずれか１項記載のペプチド。
8. ペプチドを、ペプチド合成又は突然変異生成により製造することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドの製造方法。
9. 請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドを含むキット。
10. 請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドを含む組成物。
11. 請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドからなる、アミロイドβフィブリル及び／又はアミロイドβオリゴマーの同定、定量測定及び／又は定性測定のためのプローブ。
12. 請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドを含む、アミロイドβオリゴマー及び／又はアミロイドβペプチド凝集体を妨げるための組成物。
13. 請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドを含む、毒性アミロイドβオリゴマー及び／又は凝集体の解毒化のための組成物。
14. アミロイドβオリゴマー及び／又は凝集体が、請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドと無定形の非毒性凝集体を形成することを特徴とする請求項１３記載の組成物。
15. 請求項１から７のいずれか１項記載のペプチドを含む、アルツハイマー病の治療又は予防薬。

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