JP6261152B2 - 二次元電気泳動画像の解析方法、解析プログラム、及び解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、二次元電気泳動画像に存在する微量の荷電物質に起因するスポットを見落とすことなく解析することが可能な、二次元電気泳動画像の解析方法、解析プログラム、及び解析装置に関する。

生体内のタンパク質は生命活動の中心的な役割を担っており、生体の成長の過程や疾患などの様々なストレスによる生体の異変に応じて、翻訳修飾されて発現するタンパク質の種類や量が敏感に変化する。例えば、タンパク質の変化を捉えることにより、疾患の有無や程度を把握することができ、創薬や個人レベルでの治療につなげることが可能になる。そのため、タンパク質を網羅的に解析する技術が広く検討されており、中でも、等電点電気泳動によりタンパク質（ペプチドを含む）の荷電状態に基づく分離を行った後、スラブゲル電気泳動によりタンパク質の分子量に基づく分離を行う二次元電気泳動法は、数千種類に及ぶタンパク質を同時に分析することができる上に、分解能も高いため、極めて有効な技術である。

二次元電気泳動法では、泳動後のスラブゲルの状態を撮像した二次元電気泳動画像（デジタル画像）が、解析のために用いられる。例えば、泳動後のゲル上のタンパク質を銀染色等により染色し、染色後のゲルをカメラやスキャナ等を用いて撮像した画像が用いられることがあり、また、タンパク質に蛍光色素等のマーカーを結合させた後で二次元電気泳動を行い、泳動後にマーカーが発する蛍光等をＣＣＤカメラやスキャナ等を用いて撮影した画像が用いられることもある。画像には、被検試料に含まれるタンパク質に対応したスポットが多数認められる。各スポットは通常単一のタンパク質に対応し、スポットの体積を定量することによりタンパク質量が測定される。

ところで、二次元電気泳動法においては、泳動に用いられるゲルの歪みや撓み、ゲルに印加される電圧などの泳動条件のばらつき等の様々な原因により、同一の被検試料について泳動をおこなっても、得られる画像がばらついてしまうという問題がある。そのため、例えば、正常細胞におけるタンパク質成分と異常細胞におけるタンパク質成分との対比を行うために、正常細胞の抽出物を含む被検試料と異常細胞の抽出物を含む被検試料について１回ずつ二次元電気泳動実験を行い、各実験から得られた画像のスポットを対比しても、上述したばらつきの影響が大きく、対比が困難な場合がある。そこで、同一の被検試料について複数回、通常は３回以上の泳動実験を行い、これらの実験で得られたすべての画像を基に平均化した１枚の仮想画像を生成し、得られた仮想画像を用いてスポットを解析することが提案されている。

例えば、特許文献１（特表２００１−５００６１４号公報）には、オペレータにより選択された複数の画像からマスタ複合画像(平均化した仮想画像)が生成される工程が示されている。この工程では、選択された各画像のバックグラウンドから平均複合バックグラウンドが計算され、次いで、選択された各画像の対応するスポットの積分光学密度が平均されて平均複合積分光学密度が算出される。さらに、選択された各画像の対応するスポットについて、物理形状が平均され、スポット位置が平均され、さらに平均複合積分光学密度及び平均スポット位置の標準誤差が計算される（この文献の図３参照）。この文献では、得られたマスタ複合画像が、新しい画像と、オペレータにより選択された両画像に共通するアンカポイントに基づき、両画像の対応するアンカポイントが同じ位置になるように位置揃えされた後、対比されている。

特許文献２（特表２００１−５０３８６０号公報）にも、複数の画像を平均する工程が示されており、各スポットから局所的バックグラウンドを減算した上で、対応するスポットの積分光学密度、物理的形状、スポット位置を平均し、平均混成積分光学密度及び平均スポット位置の標準誤差を計算する工程が示されている。この文献の図４には、「正常１」、「正常２」、「正常３」と表示された正常対照細胞に関するゲル画像から「正常合成」と表示された平均画像を生成し、一方、「疾患１」、「疾患２」、「疾患３」と表示された発症細胞に関するゲル画像から「疾患合成」と表示された平均画像を生成し、両者を対比して疾患マーカーを特定するプロセスが模式的に示されている。

なお、特許文献１，２には詳細な記載がないが、バックグラウンドの減算（除去）方法としては、一定値をバックグラウンド値として減算する方法、各スポットに応じた計算値をバックグラウンド値として減算する方法（例えば特許文献３（特開平２−１２５７４号公報）参照）、ローリングボールアルゴリズムを適用する方法（非特許文献１（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ． １６（１）：２２−３４（１９８３））参照）等が知られており、複数の画像を位置揃えする方法としては、２枚の画像においてオペレータが指定した２種のスポットの位置データに基づき、データ変換率を算出し、この算出されたデータ変換率に基づいて一方の画像データの変換を行う方法（特許文献４（特開平２−１２９５４３号公報）の特に図３，４参照）、被検試料にマーカー物質を混合して二次元電気泳動を行い、得られた画像におけるマーカーのスポット座標が一致するように位置揃えする方法（特許文献５（特開昭６２−６９１４５号公報）参照）等が知られている。

特表２００１−５００６１４号公報 特表２００１−５０３８６０号公報 特開平２−１２５７４号公報 特開平２−１２９５４３号公報 特開昭６２−６９１４５号公報 特開平１１−５０５３２４号公報

Ｃｏｍｐｕｔｅｒ． １６（１）：２２−３４（１９８３） 電子情報通信学会論文誌 Ｄ−ＩＩ，Ｊ７６−Ｄ−ＩＩ−２，２８８／２９５（１９９３） Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍ Ｓｅｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍ． ８：１３５−１４６（１９９７）

しかし、特許文献１及び特許文献２に示された、平均化した仮想画像を用いる方法では、１枚の画像においてはスポットとして認識できるものの、残余の画像においてはスポットとして認識しにくいような、微量のタンパク質に起因するスポットが、平均化処理において、スポットとして認識される閾値以下の光学濃度となり、仮想画像においてスポットが消失してしまうおそれがある。この点は、特許文献２の図４において、「正常３」と表示された画像に含まれるスポットの一つが「正常合成」と表示された平均画像において消失しており、「疾患２」と表示された画像に含まれるスポットの一つが「疾患合成」と表示された平均画像において消失していることからも理解されるが、図１１及び図１２に示した具体的な二次元電気泳動画像を用いてさらに説明する。

図１１における画像Ａ及び画像Ｂは、ヒト由来株化細胞（ＨｅＬａ細胞）に関する二次元電気泳動画像である。一見すると両者は同じようであるが、詳細に観察すると相違が認められる。図１２の上段には図１１の各画像の左下の囲み部分が、図１２の下段には図１１の各画像の右上の囲み部分が、それぞれ拡大されて示されている。図１２の四角で囲まれた部分を対比すると、上段の画像では、画像Ｂでは明確に認められるスポットが画像Ａではほとんど認められず、下段の画像では、一方の画像において薄く認められるスポットが他方の画像ではほとんど認められないことが分かる。このような相違を含む画像がさらに何枚か存在すると、平均化処理において、特に薄く認められるスポットの平均化処理後の光学濃度がスポットとして認識される閾値以下となり、仮想画像においてスポットが消失してしまう。

二次元電気泳動画像において明瞭に認められるスポットは、すべての細胞において同様に発現し且つ発現量も多い、細胞膜やＤＮＡポリメラーゼ等のハウスキーピングタンパクに起因していることが多い。しかし、ストレスによる生体の異変等によるタンパク質の変化において重要であるのは、ハウスキーピングタンパクの変化ではなく、生体の異変に応じてわずかな量で発現したか或いは発現量が変化したタンパク質の変化である。したがって、二次元電気泳動画像の解析において、このわずかな量で発現したタンパク質を見落とさずに検出することが要求される。しかし、従来の平均化した仮想画像を用いる方法ではこの要求に答えることができない。同様の要求は、タンパク質に関する二次元電気泳動の画像解析ばかりでなく、ＤＮＡの制限酵素断片に関する二次元電気泳動等の、他の荷電物質に関する二次元電気泳動の画像解析においても存在する。

そこで、本発明の目的は、二次元電気泳動画像に存在する微量の荷電物質に起因するスポットを見落とすことなく解析することが可能な、二次元電気泳動画像の解析方法、解析プログラム、及び解析装置を提供することである。

発明者は、鋭意検討した結果、同一の被検試料について３回以上の電気泳動実験を行い、それぞれの実験で得られた画像についてバックグラウンドノイズを除去した後に位置揃えを行ったときに、少なくとも何枚かの画像の同じ位置にスポットが存在していれば、そのスポットが残りの画像においてほとんど認められないものであっても、被検試料中にはこのスポットに対応する荷電物質が存在していると判断すべきであるとの結論に至った。

そこで、本発明はまず、コンピュータによる二次元電気泳動画像の解析方法であって、上記コンピュータが、
ａ）同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込むステップ、
ｂ）読み込まれた上記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成するステップ、
ｃ）上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、上記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出するステップ、
ｄ）上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように分割するとともに、各ピクセルの座標を上記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換して、各ピクセルが上記高濃度領域と上記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データと変換後のピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成するステップ、
ｅ）得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（上記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において上記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
及び、
ｆ）上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、対応する上記データ表のスポット存在領域に含まれるピクセル座標を上記座標変換式に従ってバックグラウンド除去画像のピクセル座標に変換することにより変換スポット存在領域を認定し、認定された上記変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
を実行することを特徴とする、第１の二次元電気泳動画像の解析方法を提供する。ｄ）ステップにおける、高濃度領域と低濃度領域とへの分割と位置揃え後のピクセル座標への変換とは、どちらを先に実施しても良い。

第１の二次元電気泳動画像の解析方法では、上記コンピュータがさらに、
ｇ）上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像における各ピクセルの光学濃度から、上記モデル関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成するステップ、
ｈ）得られた差分画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように分割するとともに、各ピクセルの座標を上記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換して、各ピクセルが上記高濃度領域と上記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データと変換後のピクセル座標とを対応付けたデータ表を再生成するステップ
ｉ）再生成されたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、上記指定値以上の数のデータ表において上記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、再生成されたすべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
及び、
ｊ）上記差分画像のそれぞれについて、対応する上記再生成されたデータ表のスポット存在領域に含まれるピクセル座標を上記座標変換式に従って差分画像のピクセル座標に変換することにより変換スポット存在領域を認定し、認定された上記変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
からなるサイクルを実行するのが好ましい。上記ｇ）ステップから上記ｊ）ステップまでのステップからなるサイクルは、１回以上実行ことができる。ただし、２回目以降の上記ｇ）ステップにおいては、上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像における各ピクセルの光学濃度から、該ステップの実施前に得られたモデル関数の和関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成する。

本発明はまた、コンピュータによる二次元電気泳動画像の解析方法であって、上記コンピュータが、
ａ´）同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込むステップ、
ｂ´）読み込まれた上記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成するステップ、
ｃ´）上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、上記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出するステップ、
ｄ´）上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標を上記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換した位置揃え画像を生成し、得られた位置揃え画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように分割して、各ピクセルが上記高濃度領域と上記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データとピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成するステップ、
ｅ´）得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（上記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において上記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
及び、
ｆ´）上記位置揃え画像のそれぞれについて、対応する上記データ表のスポット存在領域におけるピクセル座標と同一のピクセル座標の領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
を含むことを特徴とする、第２の二次元電気泳動画像の解析方法を提供する。

第２の二次元電気泳動画像の解析方法では、上記コンピュータがさらに、
ｇ´）上記位置揃え画像のそれぞれについて、位置揃え画像における各ピクセルの光学濃度から、上記モデル関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成するステップ、
ｈ´）得られた差分画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように分割して、各ピクセルが上記高濃度領域と上記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データとピクセル座標とを対応付けたデータ表を再生成するステップ、
ｉ´）再生成されたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、上記指定値以上の数のデータ表において上記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、再生成されたすべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
及び、
ｊ´）上記差分画像のそれぞれについて、対応する上記再生成されたデータ表のスポット存在領域におけるピクセル座標と同一のピクセル座標の領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
からなるサイクルを実行するのが好ましい。上記ｇ´）ステップから上記ｊ´）ステップまでのステップからなるサイクルを１回以上実行することができる。ただし、２回目以降の上記ｇ´）ステップにおいて、上記位置揃え画像のそれぞれについて、位置揃え画像における各ピクセルの光学濃度から、該ステップの実施前に得られたモデル関数の和関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成する。

第１の二次元電気泳動画像の解析方法は、スポットへのモデル関数のフィッティングをバックグラウンド除去画像に基づき行う方法であり、第２の二次元電気泳動画像の解析方法は、スポットへのモデル関数のフィッティングを位置揃え画像に基づき行う方法である。以下、第１の二次元電気泳動画像の解析方法におけるａ）ステップ及び第２の二次元電気泳動画像の解析方法におけるａ´）ステップにおいて読み込まれる二次元電気泳動画像を「原画像」と表す。原画像、バックグラウンド除去画像、位置揃え画像、及び差分画像は、いずれも多数のピクセルから構成されており、各ピクセルはデカルト座標（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）を有する。ｘ_ｉは一次元目の電気泳動方向（以下、「ｘ軸の方向」と表す。）に並ぶピクセルのうちのｉ番目のピクセルに当たることを意味し、ｙ_ｉは二次元目の電気泳動方向（以下、「ｙ軸の方向」と表す。）に並ぶピクセルのうちのｉ番目のピクセルにあたることを意味する。本発明において、各ピクセルのデカルト座標（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）を「ピクセル座標」或いは単に「座標」と表す。また、各ピクセルは被検試料中の荷電物質の存在量に対応する光学濃度を有しており、各スポット領域に含まれるピクセルの光学濃度の合計値が「スポット体積」である。

本発明の第１の解析方法及び第２の解析方法において、同一の被検試料に関する原画像は３枚以上であれば枚数に制限がない。第１の解析方法におけるｅ）ステップ及びｉ）ステップ、第２の解析方法におけるｅ´）ステップ及びｉ´）ステップに示されている「指定値」は、原画像の数に依存して、２から（原画像の数−１）までの範囲の整数から選択される値である。例えば、原画像が３枚であるときには指定値は２であり、原画像が４枚であるときには指定値は２又は３であり、原画像が５枚であるときには指定値は２、３又は４である。好ましくは、原画像の数が増加しても、指定値として２又は３が選択される。

本発明の第１の解析方法及び第２の解析方法において、バックグラウンド除去のためには、上で例示したような、一定値をバックグラウンド値として減算する方法、各スポットに応じた計算値をバックグラウンド値として減算する方法、ローリングボールアルゴリズムを適用する方法等の公知の方法を特に限定なく使用することができる。ローリングボールアルゴリズムを適用すると、タンパク質に対応するスポットとバックグラウンドノイズとを精度良く分離することができるため好ましい。

また、本発明の第１の解析方法及び第２の解析方法において、画像の位置揃えのための座標変換式の導出のためには、上で例示したような、オペレータが指定したスポットの位置データに基づき座標変換式を導出する方法、被検試料に混合したマーカーのスポット座標が一致するように座標変換式を導出する方法等の公知の方法を特に限定なく使用することができる。電荷が等しく分子量がほぼ等しいものの放射する蛍光の波長が異なる蛍光色素の２種を含むセットを用いて、検出対象の荷電物質に一方の蛍光色素を結合させ、マーカーに他方の蛍光色素を結合させて、両者を含む被検試料を調製し、この被検試料について二次元電気泳動を行った後、各蛍光色素に対応する蛍光を別々に撮像することもできる。この方法では、検出対象の荷電物質とマーカーとを分離して検出できる上に、検出対象の荷電物質とマーカーとの荷電状態及び分子量が同一であれば、一回の二次元電気泳動において検出対象の荷電物質とマーカーとがゲルの同じ位置に泳動されるため、画像の位置揃えの精度が向上する。このようなセットに含まれる蛍光色素としては、特許文献６（特開平１１−５０５３２４号公報）に記載されているシアニン系色素のプロピルＣｙ−３−ＮＨＳ、メチルＣｙ−５−ＮＨＳ等が挙げられる。

第１の解析方法におけるｄ）ステップ及びｈ）ステップ、第２の解析方法におけるｄ´）ステップ及びｈ´）ステップでは、対象の画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように分割し、各ピクセルが上記高濃度領域と上記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データと位置揃え後のピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成する。上記高濃度領域は、解析対象の画像に存在する各スポットにおける最大の光学濃度を有するピクセル（頂点）及びその周辺のピクセルからなる領域に相当する。最大の光学濃度を有するピクセルからどれだけ離れた位置のピクセルまでを上記高濃度領域に含めるかという点に関しては、厳密な制限はなく、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように設定されれば良い。しかし、上記データ表をピクセル座標が揃うように重ね合わせたときに、例えば最大の光学濃度を有するピクセルのみで上記高濃度領域を構成するような狭すぎる高濃度領域では、位置揃えのわずかな誤差によっても、同一のタンパク質に起因するスポットの高濃度領域が重ならなくなるため好ましくなく、また、スポットのほぼ全体が上記高濃度領域に含まれるような広すぎる高濃度領域では、位置揃えのわずかな誤差によっても、隣に存在する他のタンパク質に起因するスポットの高濃度領域と重なってしまうため好ましくなく、上記高濃度領域に属するピクセルの数は位置揃えの誤差を考慮して設定される。

上記コンピュータにより実行される上記高濃度領域と上記低濃度領域とへの分割は、分割を施すべき画像にアイリスフィルタ及びリングオペレータからなる群から選択された画像処理アルゴリズムを適用し、該アルゴリズムの出力が所定値以上であるピクセルからなる領域を上記高濃度領域とすることにより実行されるのが好ましい。アイリスフィルタアルゴリズムは、画像中の濃度勾配ベクトルの集中度を評価するものであり、腫瘤影検出のために提案されたものである（非特許文献２（電子情報通信学会論文誌 Ｄ−ＩＩ，Ｊ７６−Ｄ−ＩＩ−２，２８８／２９５（１９９３））参照）が、円形凸領域を最も強く強調し、それからはずれる形状を有する領域を抑制するという性質があり、本発明における上記高濃度領域と上記低濃度領域とへの分割のために有効に利用することができる（図３参照）。また、ゲノムＤＮＡの二次元電気泳動画像のスポット検出のために画像処理アルゴリズムとしてリングオペレータを利用する方法が提案されているが（非特許文献３（Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍ Ｓｅｒ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍ． ８：１３５−１４６（１９９７）参照）、このアルゴリズムも同様に本発明における上記高濃度領域と上記低濃度領域とへの分割のために有効に利用することができる。

第１の解析方法におけるｅ）ステップ及びｉ）ステップ、第２の解析方法におけるｅ´）ステップ及びｉ´）ステップでは、直前のステップにおいて得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、上記指定値以上の数のデータ表において上記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、直前のステップにおいて得られたすべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定する。このことは、被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えされた画像を重ね合わせたときに、上記指定値以上の数の画像において上記高濃度領域が重なっていれば、重なった領域にスポットが存在するものとし、上記高濃度領域が重ならなかった画像においても、同じピクセル座標の領域にスポットがあるものして取り扱うことに相当する。そして、第１の二次元電気泳動画像の解析方法では、ｆ）ステップにおいて、上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、対応する上記データ表のスポット存在領域に含まれるピクセル座標を上記座標変換式に従ってバックグラウンド除去画像のピクセル座標に変換することにより変換スポット存在領域を認定し、認定された上記変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングし、また、ｊ）ステップにおいて、上記差分画像のそれぞれについて、同様の処理を行う。第２の二次元電気泳動画像の解析方法では、ｆ´）ステップにおいて、上記位置揃え画像のそれぞれについて、対応する上記データ表のスポット存在領域におけるピクセル座標と同一のピクセル座標の領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングし、また、ｊ´）ステップにおいて、上記差分画像のそれぞれについて、同様の処理を行う。

上述したように、本発明の第１の解析方法及び第２の解析方法では、被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えされた画像を重ね合わせたときに、上記指定値以上の数の画像において上記高濃度領域が重なっていれば、重なった領域にスポットが存在するものとし、上記高濃度領域が重ならなかった画像においても、同じピクセル座標の領域にスポットがあるものして取り扱い、モデル関数をフィッティングする。また、本発明の第１の解析方法及び第２の解析方法では、上記差分画像についても解析の対象とすることができる。差分画像の解析により、複数のスポットが部分的に重なっている領域において、他のスポットに隠れて検出されにくいスポットが好適に検出される。したがって、少なくとも３枚の原画像から得られるバックグラウンド除去画像のうち、上記指定値の数の画像において薄いスポットとして認められるものの、残余のバックグラウンド除去画像に対応するスポットが認められにくい場合（図１２の下段参照）でも、残余のバックグラウンド除去画像においてもスポットを見落とすことがない。また、少なくとも３枚の原画像から得られるバックグラウンド除去画像のうち、上記指定値の数の画像において２つのスポットが部分的に重なって認められるものの、残余のバックグラウンド除去画像においては一方のスポットが他方のスポットに隠れて認められない場合（図１２の上段参照）でも、残余のバックグラウンド除去画像においても隠れたスポットを見落とすことがない。

本発明の第１の解析方法及び第２の解析方法においてスポットに適用するモデル関数としては、これまでに提案されている公知のモデル関数を特に制限なく使用することができる。しかし、第１の解析方法では、上記ｆ）ステップ及び／又は上記ｊ）ステップにおいて、各スポットにおける最大の光学濃度を有するピクセルを通り且つ二次元目の泳動方向と平行な平面及びこれと垂直な平面を用いてスポットを４分割したときの最も小さな体積を示す分割部分にフィッティングするガウス関数又はローレンツ関数を、該スポット全体のモデル関数として適用するのが好ましい。

バックグラウンド除去画像において、単一の荷電物質に起因し且つ他のスポットと重なっていないスポットの広がりは、ｘ軸の方向及びｙ軸の方向において生じる。すなわち、各スポットの頂点を通り且つｘ軸と平行な平面でスポットを２つに分割すると、これらの分割部分はこの平面に対してほぼ対称となり、各スポットの頂点を通り且つｙ軸と平行な平面でスポットを２つに分割すると、これらの分割部分もまたこの平面に対してほぼ対称となる。また、単一の荷電物質に起因するスポットが隣接するスポットと重なっていれば、前者の広がりは重なった方向に伸びることになる。したがって、各スポットの頂点を通り且つｘ軸と平行な平面及びｙ軸と平行な平面を用いてスポットを４分割したときの最も小さな体積を示す分割部分にフィッティングする対称関数（ガウス関数又はローレンツ関数）を、スポット全体のモデル関数として適用することにより、他のスポットとの重なりの影響をできるだけ排除することができる。

また、第１の解析方法の上記ｆ）ステップ及び／又は上記ｊ）ステップにおいて、複数のスポットが部分的に重なっている重複部では、該重複部の端に位置するいずれか一つのスポットにモデル関数をフィッティングし、得られたモデル関数の積分値を重複部全体の体積から減算した後、残余部の端に位置するいずれか一つのスポットにモデル関数をフィッティングすることを繰り返して、上記重複部に含まれる複数のスポットを分離するのが好ましい。重複部の端に位置するスポットは、端に位置していないスポットに比較して、他のスポットの影響を受けにくい。したがって、重複部の端のスポットから順にモデル関数をフィッティングすることにより、スポット間の重なりの影響を低減することができる。

本発明はまた、コンピュータに、上記ａ）ステップ、上記ｂ）ステップ、上記ｃ）ステップ、上記ｄ）ステップ、上記ｅ）ステップ、及び上記ｆ）ステップを実行させるための、好適には、上記ｇ）ステップ、上記ｈ）ステップ、上記ｉ）ステップ、及び上記ｊ）ステップをさらに実行させるための、二次元電気泳動画像の解析プログラムを提供する。該プログラムとコンピュータとの協働により、本発明の第１の二次元電気泳動の解析方法を実行することができ、二次元電気泳動画像に存在する微量の荷電物質に起因するスポットを見落とすことなく解析することが可能である。

本発明はまた、コンピュータに、上記ａ´）ステップ、上記ｂ´）ステップ、上記ｃ´）ステップ、上記ｄ´）ステップ、上記ｅ´）ステップ、及び上記ｆ´）ステップを実行させるための、好適には、上記ｇ´）ステップ、上記ｈ´）ステップ、上記ｉ´）ステップ、及び上記ｊ´）ステップをさらに実行させるための、二次元電気泳動画像の解析プログラムを提供する。該プログラムとコンピュータとの協働により、本発明の第２の二次元電気泳動の解析方法を実行することができ、二次元電気泳動画像に存在する微量の荷電物質に起因するスポットを見落とすことなく解析することが可能である。

本発明はまた、
同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込む、画像読み込み手段、
読み込まれた上記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成する、バックグラウンド除去手段、
上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、上記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出する、座標変換式導出手段、
上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように分割するとともに、各ピクセルの座標を上記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換して、各ピクセルが上記高濃度領域と上記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データと変換後のピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成する、データ表生成手段、
得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（上記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において上記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定する、スポット認定手段、
及び、
上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、対応する上記データ表のスポット存在領域に含まれるピクセル座標を上記座標変換式に従ってバックグラウンド除去画像のピクセル座標に変換することにより変換スポット存在領域を認定し、認定された上記変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングする、フィッティング手段
を備えたことを特徴とする、二次元電気泳動画像の解析装置を提供する。

本発明はさらに、
同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込む、画像読み込み手段、
読み込まれた上記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成する、バックグラウンド除去手段、
上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、上記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出する、座標変換式導出手段、
上記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標を上記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換した位置揃え画像を生成し、得られた位置揃え画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う上記高濃度領域が上記低濃度領域によって分離されるように分割して、各ピクセルが上記高濃度領域と上記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データとピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成する、データ表生成手段、
得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（上記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において上記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定する、スポット認定手段、
及び、
上記位置揃え画像のそれぞれについて、対応する上記データ表のスポット存在領域におけるピクセル座標と同一のピクセル座標の領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングする、フィッティング手段
を備えたことを特徴とする、二次元電気泳動画像の解析装置を提供する。

これらの解析装置により、二次元電気泳動画像に存在する微量の荷電物質に起因するスポットを見落とすことなく解析することが可能である。

本発明の二次元電気泳動画像の解析方法、解析プログラム、及び解析装置によると、二次元電気泳動画像に存在する微量の荷電物質に起因するスポットを見落とすことなく解析することが可能である。

第１の実施の形態の二次元電気泳動画像の解析装置における機能ブロック図である。 図１に示した解析装置が原画像を読み込んでから各スポットへのモデル関数のフィッティングを完了するまでの基本的な流れを示したフローチャートである。 位置揃え画像から二値化画像を得、得られた二値化画像を重ね合わせるプロセスを説明する図である。 アイリスフィルタアルゴリズムの適用による出力の相違を説明する図であり、Ａ）はスポットの平面を、Ｂ）はスポットの断面を、それぞれ示している。 ピクセル座標ごとの強度値の集計のプロセスを示す図である。 モデル関数によるフィッティングのプロセスを説明する図であり、Ａ）はスポットの平面を、Ｂ）はスポットの断面を、それぞれ示している。 モデル関数のフィッティングを繰り返して行うプロセスを、スポットをその頂点を通る平面で切断した断面を用いて説明する図である。 モデル関数のフィッティングを繰り返して行ったときの、モデル関数から得られる二次元画像の相違を説明する図である。 第２の実施の形態の二次元電気泳動画像の解析装置における機能ブロック図である。 図９に示した解析装置が原画像を読み込んでから各スポットへのモデル関数のフィッティングを完了するまでの基本的な流れを示したフローチャートである。 ヒト由来株化細胞（ＨｅＬａ細胞）に関する２枚の二次元電気泳動画像である。 図１１の２枚の二次元電気泳動画像における四角の囲み部分を拡大した画像である。

１）第１の二次元電気泳動画像の解析方法
まず、第１の二次元電気泳動画像の解析方法と、この方法を実施するための解析装置及び解析プログラムについて、第１の実施の形態を用いて説明する。以下では、検出対象の細胞から抽出したタンパク質にメチルＣｙ−５−ＮＨＳを結合させ、位置揃えのためのマーカータンパク質にプロピルＣｙ−３−ＮＨＳを結合させて標識し、これらの混合物を含む被検試料を調製し、この被検試料について３回の二次元電気泳動実験を行った後、各泳動実験で得られたゲルについて、メチルＣｙ−５−ＮＨＳの蛍光を測定することにより検出対象タンパク質に関する原画像（以下、「タンパク質画像」と表す。）を、プロピルＣｙ−３−ＮＨＳの蛍光を測定することによりマーカータンパク質に関する原画像（以下、「マーカー画像」と表す。）を、それぞれ撮像し、これらの原画像を基礎として解析する例を用いて説明する。なお、マーカー画像はタンパク質画像を位置揃えするために使用されるにすぎず、本実施の形態における二次元電気泳動画像の数は、解析対象のゲルの数或いはタンパク質画像の数に相当する「３」である。

本実施の形態の解析装置は、演算処理部、記憶部、キーボード等の入力部、ディスプレー等の出力部等を備えた一般的なコンピュータにより構成されており、記憶部に記憶されているソフトウェア(解析プログラム)との協働により解析装置として動作するように構成されている。図１は、本実施の形態の解析装置における機能のブロック図を示している。

本実施の形態の解析装置１は、画像読み込み手段１０、バックグラウンド除去手段２０、座標変換式導出手段３０、データ表生成手段４０、スポット認定手段５０、フィッティング手段６０、モデル関数更新手段７０、及び、差分画像生成手段８０から構成されている。データ表生成手段４０は、位置揃え画像生成部４１、分割部４２、及びデータ表生成部４３から構成されており、スポット認定手段５０は、集計部５１、座標選択部５２、及びスポット認定部５３から構成されており、フィッティング手段６０は、座標変換部６１及びフィッティング部６２から構成されている。

画像読み込み手段１０は、解析装置１のオペレータが指定したゲルの原画像（本実施の形態では、３枚のゲルから得られたタンパク質画像及びマーカー画像）を、スキャナ等の撮像装置（図示せず）から直接或いはこれらが記憶されている外部記憶装置や記憶媒体等（図示せず）から読み込み、読み込んだ画像をバックグラウンド除去手段２０に各画像が得られたゲルと関連づけて送信するものである。バックグラウンド除去手段２０は、画像読み込み手段１０から送信された原画像にローリングボールアルゴリズムを適用することによりバックグラウンドノイズを除去して、対応するバックグラウンド除去画像（本実施の形態では、３枚のゲルから得られた、タンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像及びマーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像）を生成し、各画像をゲルと関連づけて記憶するものである。座標変換式導出手段３０は、バックグラウンド除去手段２０が記憶したマーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像を読み出し、各画像におけるマーカーのスポットの位置が揃うように各画像のｘ軸及びｙ軸を局所的に伸長短縮し、伸長短縮の前後のピクセル座標の関係を座標変換式として導出し、各マーカー画像が得られたゲルと関連付けて記憶するものである。

データ表生成手段４０の位置揃え画像生成部４１は、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像（本実施の形態では３枚のゲルに基づく画像）或いは後述する差分画像生成手段８０が記憶した差分画像（本実施の形態では３枚のゲルに基づく画像）を読み出すとともに、座標変換式導出手段３０が記憶した各画像が得られたゲルに対応する座標変換式を読み出し、読みだした画像に座標変換式を適用することにより対応する位置揃え画像を生成し、分割部４２に各画像が得られたゲルと関連付けて送信するものである。位置揃え画像生成部４１は、１回目の動作においては、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像を読み出し、２回目以降の動作においては、差分画像生成手段８０が記憶した差分画像を読み出す。分割部４２は、位置揃え画像生成部４１から送信された位置揃え画像にアイリスフィルタアルゴリズムを適用し、該アルゴリズムの出力が０．８以上であるピクセル（高濃度領域に属するピクセル）に強度値「１」を、出力が０．８未満であるピクセル（低濃度領域に属するピクセル）に強度値「０」を、それぞれ与えることにより位置揃え画像を２つの領域に分割し、データ表生成部４３に分割した結果をゲルと関連付けて送信するものである。強度値「１」及び「０」は、位置揃え画像を２つの領域に分割するために与えられた所属データである。データ表生成部４３は、分割部４２から送信された分割結果に基づき、位置揃え後のピクセル座標と各ピクセルにおける強度値とを対応付けたデータ表を作成し、スポット認定手段５０の集計部５１に、各画像が得られたゲルと関連付けて送信するものである。なお、変形形態として、タンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像或いは差分画像にアイリスフィルタアルゴリズムを適用した後に位置揃え後のピクセル座標に変換するようにしても良い。

スポット認定手段５０の集計部５１は、データ表生成部４３から送信されたすべてのデータ表（本実施の形態では３枚の画像に対応する表）における同一のピクセル座標の強度値を合計し、ピクセル座標と合計値Ｓとの関係を生成し、座標選択部５２に送信するものである。座標選択部５２は、集計部５１から送信されたピクセル座標と合計値Ｓとの関係を参照して、合計値Ｓが２以上であるピクセル座標を選択し、スポット認定部５３に送信するものである。スポット認定部５３は、すべてのデータ表に対して、座標選択部５２から送信された選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定し、フィッティング手段６０の座標変換部６１に送信するものである。なお、スポット認定部５３は、すべてのデータ表に対して、同一のピクセル座標の領域に同一の識別番号を付与する。

フィッティング手段６０の座標変換部６１は、スポット認定部５３から送信された識別番号が付与されたスポット存在領域のピクセル座標に、座標変換式導出手段３０が記憶した各ゲルに対応する座標変換式を読み出して適用し、スポット存在領域のピクセル座標を各ゲルに対応するバックグラウンド除去画像又は差分画像のピクセル座標に変換し、すなわち、座標を位置揃え前のものに戻し、変換スポット存在領域として認定し、フィッティング部６２にゲルと関連付けて送信するものである。フィッティング部６２は、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像或いは差分画像生成手段８０が記憶した差分画像を読み出し、読み出した各画像について、座標変換部６１から送信された変換スポット存在領域ごとに、各画像における変換スポット存在領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするものである。フィッティング部６２は、１回目の動作においては、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像を読み出し、２回目以降の動作においては、差分画像生成手段８０が記憶した差分画像を読み出す。

モデル関数更新手段７０は、オペレータの指定により動作するものであり、オペレータが指定するフィッティング実施回数を記憶し、指定された回数のフィッティングが実施されたか否かを判定するとともに、フィッティング実施回数が指定された回数に満たない場合には、ゲルごとにフィッティング手段６０から送信された対応するモデル関数の和関数を生成し、差分画像生成手段８０にゲルと関連付けて送信するものである。なお、モデル関数更新手段７０には、初期値として、モデル関数ｆ_０（ｘ、ｙ）＝０が入力されている。

差分画像生成手段８０は、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像を読み出し、読みだしたバックグラウンド除去画像の各ピクセルの光学濃度から、モデル関数更新手段７０から送信された対応するモデル関数の和関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算して差分画像を生成し、記憶するものである。

次に、本実施の形態の解析装置１における具体的な処理について説明する。図２は、解析装置１が原画像を読み込んでから各スポットへのモデル関数のフィッティングを完了するまでの基本的な流れを示したフローチャートである。

オペレータにより解析装置１が起動され、解析対象の二次元電気泳動画像を指定するための情報とフィッティング実施回数ｍが入力される（Ｓ１）と、画像読み込み手段１０は、スキャナ等の撮像装置から直接或いは指定された画像が記憶されている外部記憶装置や記憶媒体等から、指定された３枚のゲルに基づくタンパク質画像及びマーカー画像をそれぞれ読み込む（Ｓ１０１、Ｓ２０１、Ｓ３０１）。フィッティング実施回数ｍは、モデル関数更新手段７０に送信されて記憶される。

次いで、バックグラウンド除去手段２０が、画像読み込み手段１０から送信された３枚のゲルに対応するタンパク質画像及びマーカー画像のそれぞれについて、ローリングボールアルゴリズムを適用することによりバックグラウンドノイズを除去して、対応するバックグラウンド除去画像（３枚のゲルから得られた、タンパク質画像に基づく画像及びマーカー画像に基づく画像）を生成して記憶する（Ｓ１０２、Ｓ２０２、Ｓ３０２）。さらに、座標変換式導出手段３０が、バックグラウンド除去手段２０が記憶したマーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像（３枚のゲルから得られた画像）に基づき、１枚のマーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像を基礎画像として選定し、残余のマーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像におけるマーカーのスポットの位置が基礎画像におけるマーカーのスポットの位置に揃うように、残余のマーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像のｘ軸及びｙ軸を局所的に伸長短縮し、伸長短縮の前後のピクセル座標の関係を座標変換式として導出し、ゲルと関連付けて記憶する（Ｓ１０３、Ｓ２０３、Ｓ３０３）。バックグラウンド除去画像において座標（ｘ_a、ｙ_ａ）を有するピクセルが、上述した位置揃えの処理によって、ｘ座標がＱだけ増加し、ｙ座標がＲだけ増加した座標に移動するときは、位置揃え前の座標（ｘ_a、ｙ_ａ）と位置揃え後の座標（ｘ_ｂ，ｙ_ｂ）との間で、以下の式（１）
で表される座標変換式が導出される。なお、座標変換式は各ピクセルに対して導出される。同じゲルから得られたタンパク質画像とマーカー画像とはそのピクセル座標が対応しているため、タンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像の位置揃えのためには、対応するマーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像から得られた座標変換式が適用される。

次いで、データ表生成手段４０における位置揃え画像生成部４１が、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像（本実施の形態では３枚の画像）のそれぞれについて、座標変換式導出手段３０が記憶した各画像に対応する座標変換式に基づいて位置揃えした位置揃え画像（本実施の形態では３枚の画像）を生成する（Ｓ１０４、Ｓ２０４、Ｓ３０４）。このステップにより、同じタンパク質に起因するスポットが、すべての位置揃え画像において、ほぼ同一のピクセル座標の位置に揃うことになる。次いで、分割部４２が、位置揃え画像生成部４１が生成した位置揃え画像のそれぞれにアイリスフィルタアルゴリズムを適用し（Ｓ１０５、Ｓ２０５、Ｓ３０５）、該アルゴリズムの出力が０．８以上であるピクセルに強度値「１」を、出力が０．８未満であるピクセルに強度値「０」を、それぞれ与えて位置揃え画像を２つの領域に分割する（Ｓ１０６、Ｓ２０６、Ｓ３０６）。次いで、データ表生成部４３が、位置揃え後のピクセル座標と強度値（「０」又は「１」）との関係を表すデータ表（本実施の形態では３枚の画像に対応する表）を生成する（Ｓ１０７、Ｓ２０７、Ｓ３０７）。

図３は、位置揃え画像にアイリスフィルタアルゴリズムを適用した後の出力を示す画像及びこれから得られたデータ表に基づいて作成された二値化画像を示している。理解の容易のため、２枚のゲルに関する画像が示されているが、本実施の形態ではさらに別の１枚のゲルに関する画像も存在する。位置揃え画像にアイリスフィルタアルゴリズムを適用すると、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセル（頂点）に「１」の出力が、隣接するピクセルの光学濃度よりも小さい光学濃度を有するピクセル（谷）に「０」の出力がそれぞれ与えられる。また、光学濃度が極めて小さく目視ではかなり薄く見えるスポットにおいても、スポットの頂点の位置に「１」の出力が、谷の位置に「０」の出力が与えられる。したがって、図３から把握されるように、位置揃え画像において目視では薄く認められるスポットも、アイリスフィルタアルゴリズムの適用後は明瞭に把握されるようになる。そして、アイリスフィルタアルゴリズムの出力が０．８以上であるピクセルに強度値「１」を、出力が０．８未満であるピクセルに強度値「０」を、それぞれ与えることにより、各スポットの光学濃度の大小に因らず、各スポットにおける高い光学濃度を示す高濃度領域と低い光学濃度を示す低濃度領域とを簡便且つ明瞭に分離することができる。図３の二値化画像では、強度値「１」が与えられたピクセルが白で、強度値「０」が与えられたピクセルが黒で、それぞれ示されている。

位置揃え画像を目視したときのスポットの外周の形状が類似していても、アイリスフィルタアルゴリズムの適用後の出力が異なることがある。この点を、図４に模式的に示した例を用いて説明する。図４のＡ）には、１〜３枚目の画像において、２つのスポットが重なったようにみえる部分の平面図が模式的に示されており、Ｂ）には、これらの部分のＩ−Ｉに関する断面図が模式的に示されている。アイリスフィルタアルゴリズムの適用により、１枚目の画像と２枚目の画像においては、頂点のＢ及びＤに「１」の出力が与えられ、谷のＡ、Ｃ及びＥに「０」の出力が与えられる。しかし、３枚目の画像においては、谷Ｃが認められないため、頂点Ｂのみに「１」の出力が与えられ、谷Ａ及びＥに「０」の出力が与えられる。言い換えると、頂点を検出することによりスポットの存在を判定する方法では、１枚目の画像と２枚目の画像においてはスポット１とスポット２とが存在すると判定されるものの、３枚目の画像ではスポット１しか存在しないと判定される。しかし、画像の目視においては、１〜３枚目の画像のすべてに２つのスポットが存在すると判断されるため、頂点を検出することによりスポットの存在を判定する方法は妥当でない。本実施の形態はこのような問題を解決する。

次いで、スポット認定手段５０の集計部５１が、データ表生成部４３から送信されたすべてのデータ表（本実施の形態では３枚の画像に対応する表）における同一のピクセル座標の強度値を合計し、ピクセル座標と合計値Ｓとの関係を生成する（Ｓ２）。

図５には、集計部５１が実施するプロセスの例として、図４のスポット２に関する強度値の集計の様子が示されている。図５の左側に示された１〜３枚目のデータ表は、それぞれ、ピクセル座標ごとに、「０」又は「１」の強度値を有している。集計部５１は、すべてのデータ表における同一のピクセル座標の強度値を合計する。得られたピクセル座標と合計値との関係が、図５の中央の図に示されている。

次いで、スポット認定手段５０の座標選択部５２が、集計部５１が生成したピクセル座標と合計値Ｓとの関係を参照して、合計値Ｓが２以上であるピクセル座標を選択する（Ｓ３）。図５の中央の図では、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域が太い実線で囲まれている。次いで、スポット認定手段５０のスポット認定部５３が、すべてのデータ表に対して、座標選択部５２により選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定する（Ｓ４）。このとき、スポット認定部５３は、すべてのデータ表に対して、同一のピクセル座標の領域に同一の識別番号を付与する。すなわち、図５の左側に示した１〜３枚目のデータ表のすべてにおいて、図５の中央の図で太い実線で囲まれているピクセル座標の領域と同じ座標の領域に、スポット２に対応する識別番号が付与される。この様子が、図５の右側に示されている。

集計部５１による強度値の集計は、図３の最下部に示した二値化画像（強度値「１」のピクセルを白で、強度値「０」のピクセルを黒で、表した画像）の重ね合わせと同義である。図３では、理解の容易のため、２枚の二値化画像の重ね合わせが表示されているが、本実施の形態では、３枚の二値化画像を重ね合わせたときに、２枚以上の二値化画像の白で表示された部分が重なっていれば、その重なった領域がスポット存在領域である。

次いで、フィッティング手段６０の座標変換部６１が、データ表のそれぞれについて、スポット認定手段５０から送信された識別番号が付与されたスポット存在領域のピクセル座標を、座標変換式導出手段３０に記憶された座標変換式に基づき、対応するバックグラウンド除去画像のピクセル座標に変換し、バックグラウンド除去画像における変換スポット存在領域として認定する（Ｓ１０８、Ｓ２０８、Ｓ３０８）。このプロセスは、位置揃え画像生成部４１が生成した位置揃え画像におけるピクセル座標をバックグラウンド除去手段２０に記憶されたタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像におけるピクセル座標に戻すためのプロセスであり、上記バックグラウンド除去画像に基づき各スポットへのモデル関数のフィッティングを行うためのプロセスである。

バックグラウンド除去画像において、単一のタンパク質に起因し且つ他のスポットと重なっていないスポットの広がりは、ｘ軸の方向及びｙ軸の方向において生じる。すなわち、各スポットの頂点を通り且つｘ軸と平行な平面でスポットを２つに分割すると、これらの分割部分はこの平面に対してほぼ対称となり、各スポットの頂点を通り且つｙ軸と平行な平面でスポットを２つに分割すると、これらの分割部分もまたこの平面に対してほぼ対称となる。したがって、バックグラウンド除去画像を使用すると、ガウス関数或いはローレンツ関数のような対称関数を用いることにより、フィッティングを精度良く行うことができる。一方、位置揃え画像を使用すると、位置揃えの過程で、スポットの広がりの方向がｘ軸の方向及びｙ軸の方からずれて斜めに伸びる場合があり、このような場合に対称関数を使用すると、フィッティングの精度が低下することになる。したがって、対称関数によりフィッティングを行うためにはバックグラウンド除去画像を使用することが好ましい。

次いで、フィッティング手段６０のフィッティング部６２が、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像（本実施の形態では３枚の画像）のそれぞれについて、座標変換部６１により認定された変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングする（Ｓ１０９、Ｓ２０９、Ｓ３０９）。

本実施の形態では、式（２）のガウス関数
を、スポット全体のモデル関数として適用する。式（２）において、ｆ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）におけるガウス関数の値であり、Ａはガウス関数の最大値であり、ｘ_０及びｙ_０はそれぞれガウス関数が最大値を示す位置のｘ座標とｙ座標であり、σ_ｘ及びσ_ｙはそれぞれガウス関数が最大となる位置からｘ軸方向及びｙ軸方向への広がりある。そして、本実施の形態では、各スポットにおける最大の光学濃度を有するピクセルを通り且つｘ軸と平行な平面及びｙ軸と平行な平面を用いてスポットを４分割したときの最も小さな体積を示す分割部分にフィッティングするガウス関数を、該スポット全体のモデル関数として適用する。

この点を、図６に示した例を用いてさらに説明する。図６のＡ）には、バックグラウンド除去画像における一つの頂点Ｐを有するスポットの外周が実線で示されており、Ｂ）には、頂点Ｐを通り且つｘ軸に平行な平面でスポットを切断したときの断面が実線で示されている。バックグラウンド除去画像において、単一のタンパク質に起因するスポットが隣接するスポットと重なっていれば、前者の広がりは重なった方向に伸びることになる。Ｗ_ｘ１は頂点Ｐからｘの値が減少する方向の半値半幅（頂点Ｐの光学濃度の半分の光学濃度を有するピクセルの座標と頂点Ｐのピクセル座標との距離）を表しており、Ｗ_ｘ２はｘの値が増加する方向の半値半幅を表しており、Ｗ_ｙ１はｙの値が減少する方向の半値半幅を表しており、Ｗ_ｙ２はｙの値が増加する方向の半値半幅を表している。上述したように、単一のタンパク質に起因し且つ他のスポットと重なっていないスポットにおいては、ほぼ、Ｗ_ｘ１＝Ｗ_ｘ２、Ｗ_ｙ１＝Ｗ_ｙ２となる。しかし、このスポットが隣接するスポットと重なっていれば、スポットの広がりは重なった方向に伸びることから、他のスポットと重なっている方向のＷ_ｘ及びＷ_ｙ（図６ではＷ_ｘ２とＷ_ｙ２）が、逆方向のＷ_ｘ及びＷ_ｙ（図６ではＷ_ｘ１とＷ_ｙ１）よりも大きくなる。したがって、頂点Ｐを通り且つｙ軸と平行な平面及びｘ軸と平行な平面を用いてスポットを４分割したときの最も小さな体積を示す分割部分（図６の斜線を付した部分）が、隣接するスポットとの重なりの影響を最も受けていない領域である。本実施の形態では、この斜線を付した領域に対してフィッティング処理を行う。そして、式（２）のガウス関数に、初期値として、頂点Ｐの光学濃度をＡに、頂点Ｐのｘ座標をｘ_０に、頂点Ｐのｙ座標をｙ_０に、頂点Ｐからｘの値が減少する方向の半値半幅Ｗ_ｘ１の０．８５倍の値をσ_ｘに、頂点Ｐからｙの値が減少する方向の半値半幅Ｗ_ｙ１の０．８５倍の値をσ_ｙに代入し、スポットの斜線を付した部分の実際の光学濃度の値との間で最小二乗法によりフィッティングを行い、モデル関数のパラメータＡ、ｘ_０、ｙ_０、σ_ｘ、σ_ｙを決定する。初期値として、頂点Ｐからｘの値が減少する方向の半値半幅Ｗ_ｘ１の０．８５倍の値をσ_ｘに、Ｐからｙの値が減少する方向の半値半幅Ｗ_ｙ１の０．８５倍の値をσ_ｙに、それぞれ代入するのは、ガウス関数の広がりが半値半幅の約０．８５倍の値になるからである。フィッティング処理により得られたガウス関数を、モデル関数として、スポット全体に適用する。

図６ではモデル関数が破線で示されている。図６において、実線で示された部分の体積（光学濃度の積分値）から点線で示されたモデル関数の積分値を減算すると、差分画像が得られる。この差分画像は、スポットが隣接するスポットと重なったことにより生じているため、差分画像を解析することにより、他のスポットのショルダー部分に隠れて発見しにくいスポットを発見することができる。本実施の形態では、以下に示すように、この差分画像についても解析する。

また、上述したように、本実施の形態では、スポット認定部５３がすべてのデータ表に対して同一のピクセル座標の領域に同一の識別番号を付与してスポット存在領域を認定するため、すべてのデータ表が同数のスポット存在領域を有する。したがって、すべてのバックグラウンド除去画像において、座標変換部６１がスポット存在領域を基礎として認定した変換スポット存在領域が同数存在する。そして、本実施の形態では、認定された変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングする。例えば、図４に示した３枚目の画像においても、スポット１に加えてスポット２に対してもモデル関数のフィッティングを行う。このとき、まずスポット１について上述した式（２）のガウス関数をフィッティングし、スポット１とスポット２とが重なった領域全体の体積（光学濃度の積分値）からスポット１について得られたモデル関数の積分値を減算した後、残余の体積に対して上述した式（２）のガウス関数のフィッティングを行うことにより、スポット２についてのモデル関数を得る。仮に、スポット２が存在すべき領域に含まれるピクセルすべての光学濃度が０であった場合には、式（２）のガウス関数のＡに０を、σ_ｘ、σ_ｙに１を与えることにより処理して、スポット２が存在することのみを示す。この方法により、３枚目の画像においても、スポット２の見落としが防止される。３つ以上のスポットが部分的に重なっている重複部においても、同様に、重複部の端に位置するいずれか一つのスポットにモデル関数をフィッティングし、得られたモデル関数の積分値を重複部全体の体積から減算した後、残余部の端に位置するいずれか一つのスポットにモデル関数をフィッティングすることを繰り返して、上記重複部に含まれる複数のスポットを分離することができる。

フィッティング手段６０がすべてのタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像について、各変換スポット存在領域を含むスポットへのモデル関数のフィッティングを終了した後（Ｓ１０９、Ｓ２０９、Ｓ３０９）、モデル関数更新手段７０が、オペレータが指定したフィッティング実施回数ｍが１であるか否かを判定する（Ｓ５）。ｍ＝１であれば、解析装置１は解析作業を終了する。ｍが１より大きければ、ｍ＝ｍ−１の計算がなされる（Ｓ６）。

次いで、モデル関数更新手段７０が、ゲルのそれぞれについて、フィッティング手段６０から送信されたモデル関数の和関数を生成する（Ｓ１１０、Ｓ２１０、Ｓ３１０）。モデル関数更新手段７０には、初期値として、モデル関数ｆ_０（ｘ、ｙ）＝０が入力されている。したがって、モデル関数更新手段７０の一回目の動作においては、和関数は、１回目のフィッティング手段６０の動作により得られたモデル関数ｆ_１（ｘ、ｙ）と同じになり、モデル関数更新手段７０の二回目の動作においては、和関数は、１回目のフィッティング手段６０の動作により得られたモデル関数ｆ_１（ｘ、ｙ）と２回目のフィッティング手段６０の動作により得られたモデル関数ｆ_２（ｘ、ｙ）との和関数となる。なお、ｆ_１（ｘ、ｙ）は、フィッティング手段６０の１回目の動作によりバックグラウンド除去画像のそれぞれについて得られたすべてのモデル関数の和関数であり、ｆ_２（ｘ、ｙ）は、フィッティング手段６０の２回目の動作により対応する差分画像について得られたすべてのモデル関数の和関数である。

次いで、差分画像生成手段８０が、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像のそれぞれについて、このバックグラウンド除去画像の各ピクセルの光学濃度から、モデル関数更新手段７０から送信された対応するモデル関数の和関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算して、差分画像を生成して記憶する（Ｓ１１１、Ｓ２１１、Ｓ３１１）。

以下、（Ｓ１０４，Ｓ２０４，Ｓ３０４）のステップから（Ｓ１０９，Ｓ２０９，Ｓ３０９）のステップまでが、バックグラウンド除去画像に代えて、差分画像生成手段８０に記憶された差分画像に基づいて繰り返され、モデル関数更新手段７０が、ｍが１であるか否かを判定し（Ｓ５）、ｍ＝１であれば解析装置１が解析作業を終了し、ｍが１より大きければ、ｍ＝ｍ−１の計算がなされ（Ｓ６）、モデル関数更新手段７０によるモデル関数の和関数生成のステップ（Ｓ１１０、Ｓ２１０、Ｓ３１０）と、差分画像生成手段８０による差分画像の生成及び記憶のステップ（Ｓ１１１、Ｓ２１１、Ｓ３１１）が実施され、以降（Ｓ１０４，Ｓ２０４，Ｓ３０４）のステップからのステップがｍ＝１になるまで繰り返される。

図７は、１つの頂点を有するスポットへのモデル関数のフィッティングを繰り返して行うプロセスを、スポットをその頂点を通る平面で切断した断面を用いて説明した図である。まず、バックグラウンド除去画像Ｒに対する１回目のフィッティングによりモデルＭ１のフィッティング画像（モデル関数の積分値）が生成され、次いで、ＲからＭ１が減算されて、差分画像（Ｒ−Ｍ１）が生成される。さらに、差分画像（Ｒ−Ｍ１）に対する２回目のフィッティングにより、モデルＭ２のフィッティング画像が生成され、次いで、和関数から得られたモデル（Ｍ１＋Ｍ２）のフィッティング画像が生成されて、Ｒから（Ｍ１＋Ｍ２）が減算される。このようなプロセスが、オペレータが指定したフィッティング実施回数に至るまで繰り返される。

図８は、モデル関数のフィッティングを繰り返して行ったときの、モデル関数から得られる二次元画像（平面図）の相違を説明する図である。１回目のフィッティングにより得られる画像（Ｍ１）と２回目までのフィッティングにより得られる画像（Ｍ１＋Ｍ２）との比較により、２回目までフィッティングを行うと、目視により薄く認められるスポットまで細かく検出することができていることが分かる。２回目までのフィッティングにより得られる画像（Ｍ１＋Ｍ２）と３回目までのフィッティングにより得られる画像（Ｍ１＋Ｍ２＋Ｍ２）との比較により、３回目までフィッティングを行うと、さらに薄く認められるスポットまで細かく検出することができていることが分かる。そして、Ｍ１よりもＭ１＋Ｍ２が、さらにＭ１＋Ｍ２よりもＭ１＋Ｍ２＋Ｍ３が、バックグラウンド除去画像Ｒに接近した画像であることが分かる。

したがって、本実施の形態の解析装置及び解析方法により、二次元電気泳動画像に存在する微量のタンパク質に起因するスポットを見落とすことなく解析することができる。

２）第２の二次元電気泳動画像の解析方法
次いで、第２の二次元電気泳動画像の解析方法と、この方法を実施するための解析装置及び解析プログラムついて、第２の実施の形態を用いて説明する。

第１の実施の形態では、各スポットへのモデル関数のフィッティングがバックグラウンド除去画像又はバックグラウンド除去画像に対応する差分画像に基づいて行われたが、第２の実施の形態では、各スポットへのモデル関数のフィッティングが位置揃え画像に基づいて行われる点で、両者は異なる。本実施形態においても、原画像の例として、第１の実施形態において使用した画像を使用する。本実施の形態においても、二次元電気泳動画像の数は、解析対象のゲルの数或いはタンパク質画像の数に相当する「３」である。

本実施の形態の解析装置も、演算処理部、記憶部、キーボード等の入力部、ディスプレー等の出力部等を備えた一般的なコンピュータにより構成されており、記憶部に記憶されているソフトウェア(解析プログラム)との協働により解析装置として動作するように構成されている。図９は、本実施の形態の解析装置２における機能のブロック図を示している。以下、第１の実施の形態における各手段と同じ機能を有する手段には同じ番号を付して説明を省略し、機能の異なる手段についてのみ説明する。

データ表生成手段４０ａの位置揃え画像生成部４１ａは、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像（本実施の形態では３枚のゲルに基づく画像）を読み出すとともに、座標変換式導出手段３０が記憶した各画像が得られたゲルに対応する座標変換式を読み出し、読みだした画像に座標変換式を適用することにより対応する位置揃え画像を生成し、各画像が得られたゲルと関連付けて記憶するものである。分割部４２ａは、位置揃え画像生成部４１ａが記憶した位置揃え画像又は差分画像生成手段８０ａが記憶した差分画像を読み出し、読み出した画像にアイリスフィルタアルゴリズムを適用し、該アルゴリズムの出力が０．８以上であるピクセル（高濃度領域に属するピクセル）に強度値「１」を、出力が０．８未満であるピクセル（低濃度領域に属するピクセル）に強度値「０」を、それぞれ与えることにより位置揃え画像を２つの領域に分割し、データ表生成部４３に分割した結果をゲルと関連付けて送信するものである。強度値「１」及び「０」は、位置揃え画像を２つの領域に分割するために与えられた所属データである。分割部４２ａは、１回目の動作においては、位置揃え画像生成部４０ａが記憶した位置揃え画像を読み出し、２回目以降の動作においては、差分画像生成手段８０ａが記憶した差分画像を読み出す。

スポット認定手段５０ａのスポット認定部５３ａは、データ表生成部４３が生成したすべてのデータ表に対して、座標選択部５２から送信された選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定し、座標変換部を有していないフィッティング手段６０ａに送信するものである。なお、スポット認定部５３ａは、すべてのデータ表に対して、同一のピクセル座標の領域に同一の識別番号を付与する。フィッティング手段６０ａは、位置揃え画像生成部４１ａが記憶した位置揃え画像或いは差分画像生成手段８０ａが記憶した差分画像を読み出し、読み出した各画像について、スポット認定部５３ａから送信されたスポット存在領域ごとに、各画像におけるスポット存在領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするものである。フィッティング手段６０ａは、１回目の動作においては、位置揃え画像生成部４０ａが記憶した位置揃え画像を読み出し、２回目以降の動作においては、差分画像生成手段８０ａが記憶した差分画像を読み出す。

差分画像生成手段８０ａは、位置揃え画像生成部４１ａが記憶した位置揃え画像を読み出し、読みだした位置揃え画像の各ピクセルの光学濃度から、モデル関数更新手段７０から送信された対応するモデル関数の和関数により得られた画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算して差分画像を生成し、記憶するものである。

次に、本実施の形態の解析装置２における具体的な処理について説明する。図１０は、解析装置２が原画像を読み込んでから各スポットへのモデル関数のフィッティングを完了するまでの基本的な流れを示したフローチャートである。以下、第１の実施の形態における各ステップと同じ動作のステップには同じ番号を付して説明を簡略化する。

オペレータにより解析装置２が起動され、解析対象の二次元電気泳動画像を指定するための情報とフィッティング実施回数ｍが入力される（Ｓ１）と、画像読み込み手段１０は、指定された３枚のゲルに基づくタンパク質画像及びマーカー画像をそれぞれ読み込む（Ｓ１０１、Ｓ２０１、Ｓ３０１）。フィッティング実施回数ｍは、モデル関数更新手段７０に送信されて記憶される。次いで、バックグラウンド除去手段２０が、３枚のゲルに対応するタンパク質画像及びマーカー画像のそれぞれについて、対応するバックグラウンド除去画像（３枚のゲルから得られた、タンパク質画像に基づく画像及びマーカー画像に基づく画像）を生成し（Ｓ１０２、Ｓ２０２、Ｓ３０２）、座標変換式導出手段３０が、マーカー画像に基づくバックグラウンド除去画像（３枚のゲルから得られた画像）に基づき、座標変換式を導出し、ゲルと関連付けて記憶する（Ｓ１０３、Ｓ２０３、Ｓ３０３）。

次いで、データ表生成手段４０ａにおける位置揃え画像生成部４１ａが、バックグラウンド除去手段２０が記憶したタンパク質画像に基づくバックグラウンド除去画像（本実施の形態では３枚の画像）のそれぞれについて、座標変換式導出手段３０が記憶した各画像に対応する座標変換式に基づいて位置揃えした位置揃え画像（本実施の形態では３枚の画像）を生成して記憶する（Ｓ１０４ａ、Ｓ２０４ａ、Ｓ３０４ａ）。このステップにより、同じタンパク質に起因するスポットが、すべての位置揃え画像において、ほぼ同一のピクセル座標の位置に揃うことになる。次いで、分割部４２ａが、位置揃え画像生成部４１ａが生成し記憶した位置揃え画像のそれぞれにアイリスフィルタアルゴリズムを適用し（Ｓ１０５ａ、Ｓ２０５ａ、Ｓ３０５ａ）、該アルゴリズムの出力が０．８以上であるピクセルに強度値「１」を、出力が０．８未満であるピクセルに強度値「０」を、それぞれ与えて位置揃え画像を２つの領域に分割する（Ｓ１０６、Ｓ２０６、Ｓ３０６）。次いで、データ表生成部４３が、位置揃え画像のピクセル座標と強度値（「０」又は「１」）との関係を表すデータ表（本実施の形態では３枚の画像に対応する表）を生成する（Ｓ１０７、Ｓ２０７、Ｓ３０７）。

次いで、スポット認定手段５０の集計部５１が、データ表生成部４３から送信されたすべてのデータ表（本実施の形態では３枚の画像に対応する表）における同一のピクセル座標の強度値を合計し、ピクセル座標と合計値Ｓとの関係を生成する（Ｓ２）。次いで、座標選択部５２が、集計部５１が生成したピクセル座標と合計値Ｓとの関係を参照して、合計値Ｓが２以上であるピクセル座標を選択する（Ｓ３）。さらに、スポット認定部５３ａが、すべてのデータ表に対して、座標選択部５２により選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定する（Ｓ４）。このとき、スポット認定部５３ａは、すべてのデータ表に対して、同一のピクセル座標の領域に同一の識別番号を付与する。

次いで、フィッティング手段６０ａが、位置揃え画像生成部４１ａが記憶した位置揃え画像（本実施の形態では３枚の画像）のそれぞれについて、スポット認定部５３により認定されたスポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングする（Ｓ１０９ａ、Ｓ２０９ａ、Ｓ３０９ａ）。本実施の形態でも、第１の実施の形態と同様のフィッティング処理が行われる。

フィッティング手段６０ａがすべての位置揃え画像について各スポット存在領域を含むスポットへのモデル関数のフィッティングを終了した後（Ｓ１０９ａ、Ｓ２０９ａ、Ｓ３０９ａ）、モデル関数更新手段７０が、オペレータが指定したフィッティング実施回数ｍが１であるか否かを判定する（Ｓ５）。ｍ＝１であれば、解析装置２は解析作業を終了する。ｍが１より大きければ、ｍ＝ｍ−１の計算がなされる（Ｓ６）。

次いで、モデル関数更新手段７０が、ゲルのそれぞれについて、フィッティング手段６０ａから送信されたモデル関数の和関数を生成する（Ｓ１１０、Ｓ２１０、Ｓ３１０）。次いで、差分画像生成手段８０ａが、位置揃え画像生成部４１ａが記憶した位置揃え画像のそれぞれについて、この位置揃え画像の各ピクセルの光学濃度から、モデル関数更新手段７０から送信された対応するモデル関数の和関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算して、差分画像を生成して記憶する（Ｓ１１１ａ、Ｓ２１１ａ、Ｓ３１１ａ）。

以下、（Ｓ１０５ａ，Ｓ２０５ａ，Ｓ３０５ａ）のステップから（Ｓ１０９ａ，Ｓ２０９ａ，Ｓ３０９ａ）のステップまでが、位置揃え画像に代えて、差分画像生成手段８０ａに記憶された差分画像に基づいて繰り返され、モデル関数更新手段７０が、ｍが１であるか否かを判定し（Ｓ５）、ｍ＝１であれば解析装置２が解析作業を終了し、ｍが１より大きければ、ｍ＝ｍ−１の計算がなされ（Ｓ６）、モデル関数更新手段７０によるモデル関数の和関数生成のステップ（Ｓ１１０、Ｓ２１０、Ｓ３１０）と、差分画像生成手段８０ａによる差分画像の生成及び記憶が実施され、以降（Ｓ１０５ａ，Ｓ２０５ａ，Ｓ３０５ａ）のステップからのステップがｍ＝１になるまで繰り返される。

以上、第１の実施の形態及び第２の実施の形態を用いて本発明を説明したが、本発明はこれらの実施の形態に限定されず、請求項に示された発明の範囲を逸脱しない範囲内での変更が許容される。例えば、本発明はタンパク質に関する二次元電気泳動画像の解析に限定されず、他の荷電物質に関する二次元電気泳動画像の解析にも適用される。また、処理される画像の枚数も３枚に限定されず３枚以上であれば良い。処理される画像が多数に及んでも、上記指定値以上の数のデータ表の上記高濃度領域が重なっていれば、その重なり部分にはスポットが存在するものとして扱われる。原画像の枚数が増加しても通常は指定値として２が選択されるが、ノイズが多い原画像を解析するときには指定値として３以上が選択される。ただし、指定値は解析対象の原画像の数より小さい。指定値は、オペレータにより、解析対象の原画像の数より小さい値で設定されるようにしても良い。また、第１の実施の形態及び第２の実施の形態において、オペレータが指定したフィッティング実施回数になるまで各スポットへのモデル関数のフィッティングを繰り返したが、オペレータが指定したモデル関数の個数、言い換えるとモデル関数をフィッティングするスポットの個数になるまでフィッティングを繰り返すようにしても良く、差分画像の体積が所定値以下になるまでフィッティングを繰り返すようにしても良い。

さらに、バックグラウンド除去、画像の位置揃えも、公知の方法により行っても良く、上記高濃度領域の設定もアイリスフィルタアルゴリズムの適用による設定に限定されない。例えば、リングオペレータの使用によっても、上記高濃度領域の設定を好適に行うことができる。リングオペレータは同心の２つの円を使用するアルゴリズムである。リングオペレータを解析対象の画像に適用して２つの円の中心を画像の全体に移動させると、内側の円内に存在するピクセルにおける光学濃度の最大値が内側の円と外側の円との間に存在するピクセルにおける光学濃度の最大値より大きい場合には正の出力が、前者が後者より小さい場合には負の出力が得られる。したがって、２つの円のサイズを適切に設定することにより、スポットの頂点及びその周辺でのみ正の出力を得ることができ、正の出力が得られる領域を上記高濃度領域とすることができる。リングオペレータにより、アイリスフィルタと同様に、目視では薄く認められるスポットが明瞭に把握されるようになる。この他、上記高濃度領域の設定のために分水界法などを使用することもできる。さらに、第１の実施の形態及び第２の実施の形態では、アイリスフィルタアルゴリズムが０．８以上の出力を示す領域を上記高濃度領域としたが、解析対象の画像における各スポットの分離状態や位置揃えの誤差に応じて、上記高濃度領域を設定するための出力を変更することができる。好ましくは出力が０．７以上、特に好ましくは出力が０．８以上である領域を上記高濃度領域とするのが好ましい。

また、第１の実施の形態及び第２の実施の形態では、アイリスフィルタアルゴリズムが０．８以上の出力を示す領域に強度値「１」を、０．８未満の出力を示す領域に強度値「０」を与えたが、集計部５１が上記高濃度領域に属するピクセルか否かを判定することができる限り、上記高濃度領域と上記低濃度領域とにどのような数値或いは記号を与えても良い。例えば、データ表生成部４３が、アイリスフィルタアルゴリズムの出力をそのまま用いてデータ表を作成しても良く、この場合には、集計部５１が、ピクセル座標ごとに０．８以上の出力を示すデータ表の数をカウントすれば良い。さらに、スポットにフィッティングされるモデル関数も、これまでに提案されている公知のモデル関数を特に制限なく使用することができる。例えば、以下の式（３）に示すローレンツ関数をモデル関数としても良い。
上式において、ｆ（ｘ，ｙ）は、座標（ｘ，ｙ）におけるローレンツ関数の値であり、Ａはローレンツ関数の最大値であり、ｘ_０及びｙ_０はそれぞれローレンツ関数が最大値を示す位置のｘ座標とｙ座標であり、Ｗ_ｘ及びＷ_ｙはそれぞれローレンツ関数が最大となる位置からｘ軸方向及びｙ軸方向への半値半幅である。

また、本発明の解析装置は、第１の実施の形態及び第２の実施の形態に示した各手段に加えて、他の手段を備えることができる。例えば、得られたモデル関数に基づき各スポットの体積を定量するステップを実施するためのスポット体積定量手段を備えていても良い。例えば、スポット体積定量手段は、解析対象の二次元電気泳動画像に対応するバックグラウンド除去画像或いは位置揃え画像のそれぞれについて、該画像の所定のピクセル座標（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）における光学濃度Ｉ_０（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）と、このピクセル座標（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）において０より大きな出力を示すすべてのモデル関数ｆ_ａ（ｘ，ｙ）、ｆ_ｂ（ｘ，ｙ）、・・・、ｆ_ｎ（ｘ，ｙ）（ここで、ｆ_ｎ（ｘ，ｙ）は、スポットｎにフィッティングされたモデル関数を意味する。）の出力値ｆ_ａ（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）、ｆ_ｂ（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）、・・・、ｆ_ｎ（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）と、を用いて以下の式（４）によってモデル関数ｆ_ｎ（ｘ，ｙ）のピクセル座標（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）における光学濃度Ｉ_ｎ（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）を算出し、次いで、モデル関数ｆ_ｎ（ｘ，ｙ）が０より大きな出力を示すピクセル座標の範囲に関して得られた光学濃度Ｉ_ｎ（ｘ，ｙ）を合計することによって、モデル関数ｆ_ｎ（ｘ、ｙ）に対応するスポットの体積を定量することができる。

本発明により、二次元電気泳動画像に存在する微量の荷電物質に起因するスポットを見落とすことなく解析することができる。

１，２ 解析装置
１０ 画像読み込み手段
２０ バックグラウンド除去手段
３０ 座標変換式導出手段
４０，４０ａ データ表生成手段
５０，５０ａ スポット認定手段
６０，６０ａ フィッティング手段

Claims (14)

1. コンピュータによる二次元電気泳動画像の解析方法であって、前記コンピュータが、
   ａ）同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込むステップ、
   ｂ）読み込まれた前記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成するステップ、
   ｃ）前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、前記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出するステップ、
   ｄ）前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う前記高濃度領域が前記低濃度領域によって分離されるように分割するとともに、各ピクセルの座標を前記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換して、各ピクセルが前記高濃度領域と前記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データと変換後のピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成するステップ、
   ｅ）得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（前記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において前記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
   及び、
   ｆ）前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、対応する前記データ表のスポット存在領域に含まれるピクセル座標を前記座標変換式に従ってバックグラウンド除去画像のピクセル座標に変換することにより変換スポット存在領域を認定し、認定された前記変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
   を実行することを特徴とする、二次元電気泳動画像の解析方法。
2. 前記コンピュータがさらに、
   ｇ）前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像における各ピクセルの光学濃度から、前記モデル関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成するステップ、
   ｈ）得られた差分画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う前記高濃度領域が前記低濃度領域によって分離されるように分割するとともに、各ピクセルの座標を前記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換して、各ピクセルが前記高濃度領域と前記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データと変換後のピクセル座標とを対応付けたデータ表を再生成するステップ
   ｉ）再生成されたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、前記指定値以上の数のデータ表において前記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、再生成されたすべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
   及び、
   ｊ）前記差分画像のそれぞれについて、対応する前記再生成されたデータ表のスポット存在領域に含まれるピクセル座標を前記座標変換式に従って差分画像のピクセル座標に変換することにより変換スポット存在領域を認定し、認定された前記変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
   からなるサイクルを１回以上実行し、
   ただし、２回目以降の前記ｇ）ステップにおいて、前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像における各ピクセルの光学濃度から、該ステップの実行前に得られたモデル関数の和関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成する、請求項１に記載の二次元電気泳動画像の解析方法。
3. 前記ｆ）ステップ及び／又は前記ｊ）ステップにおいて、各スポットにおける最大の光学濃度を有するピクセルを通り且つ二次元目の泳動方向と平行な平面及びこれと垂直な平面を用いてスポットを４分割したときの最も小さな体積を示す分割部分にフィッティングするガウス関数又はローレンツ関数を、該スポット全体のモデル関数として適用する、請求項１又は２に記載の二次元電気泳動画像の解析方法。
4. 前記ｆ）ステップ及び／又は前記ｊ）ステップにおいて、複数のスポットが部分的に重なっている重複部では、該重複部の端に位置するいずれか一つのスポットにモデル関数をフィッティングし、得られたモデル関数の積分値を重複部全体の体積から減算した後、残余部の端に位置するいずれか一つのスポットにモデル関数をフィッティングすることを繰り返して、前記重複部に含まれる複数のスポットを分離する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二次元電気泳動画像の解析方法。
5. 前記ｄ）ステップ及び／又は前記ｈ）ステップにおける前記高濃度領域と前記低濃度領域とへの分割を、分割を施すべき画像にアイリスフィルタ及びリングオペレータからなる群から選択された画像処理アルゴリズムを適用し、該アルゴリズムの出力が所定値以上であるピクセルからなる領域を前記高濃度領域とすることにより実行する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二次元電気泳動画像の解析方法。
6. コンピュータによる二次元電気泳動画像の解析方法であって、前記コンピュータが、
   ａ´）同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込むステップ、
   ｂ´）読み込まれた前記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成するステップ、
   ｃ´）前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、前記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出するステップ、
   ｄ´）前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標を前記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換した位置揃え画像を生成し、得られた位置揃え画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う前記高濃度領域が前記低濃度領域によって分離されるように分割して、各ピクセルが前記高濃度領域と前記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データとピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成するステップ、
   ｅ´）得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（前記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において前記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
   及び、
   ｆ´）前記位置揃え画像のそれぞれについて、対応する前記データ表のスポット存在領域におけるピクセル座標と同一のピクセル座標の領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
   を実行することを特徴とする、二次元電気泳動画像の解析方法。
7. 前記コンピュータがさらに、
   ｇ´）前記位置揃え画像のそれぞれについて、位置揃え画像における各ピクセルの光学濃度から、前記モデル関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成するステップ、
   ｈ´）得られた差分画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う前記高濃度領域が前記低濃度領域によって分離されるように分割して、各ピクセルが前記高濃度領域と前記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データとピクセル座標とを対応付けたデータ表を再生成するステップ、
   ｉ´）再生成されたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、前記指定値以上の数のデータ表において前記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、再生成されたすべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定するステップ、
   及び、
   ｊ´）前記差分画像のそれぞれについて、対応する前記再生成されたデータ表のスポット存在領域におけるピクセル座標と同一のピクセル座標の領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングするステップ
   からなるサイクルを１回以上実行し、
   ただし、２回目以降の前記ｇ´）ステップにおいて、前記位置揃え画像のそれぞれについて、位置揃え画像における各ピクセルの光学濃度から、該ステップの実行前に得られたモデル関数の和関数から得られたフィッティング画像における同一の座標のピクセルの光学濃度を減算することにより、差分画像を生成する、請求項６に記載の二次元電気泳動画像の解析方法。
8. 前記ｄ´）ステップ及び／又はｈ´）ステップにおける前記高濃度領域と前記低濃度領域とへの分割を、分割を施すべき画像にアイリスフィルタ及びリングオペレータからなる群から選択された画像処理アルゴリズムを適用し、該アルゴリズムの出力が所定値以上であるピクセルからなる領域を前記高濃度領域とすることにより実行する、請求項６又は７に記載の二次元電気泳動画像の解析方法。
9. コンピュータに、請求項１に示されている前記ａ）ステップ、前記ｂ）ステップ、前記ｃ）ステップ、前記ｄ）ステップ、前記ｅ）ステップ、及び前記ｆ）ステップを実行させるための、二次元電気泳動画像の解析プログラム。
10. コンピュータに、請求項２に示されている前記ｇ）ステップ、前記ｈ）ステップ、前記ｉ）ステップ、及び前記ｊ）ステップをさらに実行させるための、請求項９に記載の二次元電気泳動画像の解析プログラム。
11. コンピュータに、請求項６に示されている前記ａ´）ステップ、前記ｂ´）ステップ、前記ｃ´）ステップ、前記ｄ´）ステップ、前記ｅ´）ステップ、及び前記ｆ´）ステップを実行させるための、二次元電気泳動画像の解析プログラム。
12. コンピュータに、請求項７に示されている前記ｇ´）ステップ、前記ｈ´）ステップ、前記ｉ´）ステップ、及び前記ｊ´）ステップをさらに実行させるための、請求項１１に記載の二次元電気泳動画像の解析プログラム。
13. 同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込む、画像読み込み手段、
    読み込まれた前記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成する、バックグラウンド除去手段、
    前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、前記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出する、座標変換式導出手段、
    前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルとからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う前記高濃度領域が前記低濃度領域によって分離されるように分割するとともに、各ピクセルの座標を前記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換して、各ピクセルが前記高濃度領域と前記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データと変換後のピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成する、データ表生成手段、
    得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（前記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において前記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定する、スポット認定手段、
    及び、
    前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、対応する前記データ表のスポット存在領域に含まれるピクセル座標を前記座標変換式に従ってバックグラウンド除去画像のピクセル座標に変換することにより変換スポット存在領域を認定し、認定された前記変換スポット存在領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングする、フィッティング手段
    を備えたことを特徴とする、二次元電気泳動画像の解析装置。
14. 同一の被検試料に関する少なくとも３枚の二次元電気泳動画像を読み込む、画像読み込み手段、
    読み込まれた前記二次元電気泳動画像のそれぞれについて、画像を構成する各ピクセルの光学濃度からバックグラウンドノイズを減算してバックグラウンド除去画像を生成する、バックグラウンド除去手段、
    前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、前記被検試料に含まれる同一の荷電物質に起因するスポットが画像のほぼ同一のピクセル座標に位置するように位置揃えするための、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標と位置揃え後のピクセル座標との関係を示す座標変換式を導出する、座標変換式導出手段、
    前記バックグラウンド除去画像のそれぞれについて、バックグラウンド除去画像におけるピクセル座標を前記座標変換式に従って位置揃え後のピクセル座標に変換した位置揃え画像を生成し、得られた位置揃え画像のそれぞれについて、隣接するピクセルの光学濃度よりも大きい光学濃度を有するピクセルとその周辺のピクセルからなる高濃度領域と残余のピクセルからなる低濃度領域とに、隣り合う前記高濃度領域が前記低濃度領域によって分離されるように分割して、各ピクセルが前記高濃度領域と前記低濃度領域のいずれに属するかを示す所属データとピクセル座標とを対応付けたデータ表を生成する、データ表生成手段、
    得られたすべてのデータ表における同一のピクセル座標の所属データを集計し、２から（前記二次元電気泳動画像の数−１）までの範囲の整数からなる群から選択された指定値以上の数のデータ表において前記高濃度領域に属することを示す集計結果が得られたピクセル座標を選択し、すべてのデータ表において、選択されたピクセル座標のひとかたまりの領域ごとに同一の識別番号を付与し、識別番号が付与された領域をスポット存在領域と認定する、スポット認定手段、
    及び、
    前記位置揃え画像のそれぞれについて、対応する前記データ表のスポット存在領域におけるピクセル座標と同一のピクセル座標の領域ごとに、該領域を含むスポットにモデル関数をフィッティングする、フィッティング手段
    を備えたことを特徴とする、二次元電気泳動画像の解析装置。