JP6261048B2 - 破骨細胞が関与する疾患の予防又は治療剤 - Google Patents
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Description
〔2〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞による骨吸収抑制剤。
〔3〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨再生促進剤。
〔4〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨吸収性疾患の予防又は治療剤。
〔5〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬が、α7ニコチン性アセチルコリン受容体に対する阻害定数(Ki)が1μM以下の化合物であることを特徴とする前記〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の剤。
〔6〕ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、αブンガロトキシン若しくはメチルリカコニチン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする前記〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の剤。
〔7〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする前記〔1〕〜〔6〕のいずれか一項に記載の剤。
〔8〕骨吸収性疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収、又はそれらの2以上の組み合わせであることを特徴とする前記〔4〕に記載の予防又は治療剤。
〔9〕再生治療における骨組織形成又は骨組織再生を促進するために用いられるものであることを特徴とする前記〔3〕に記載の骨再生促進剤。
〔10〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞分化促進剤。
〔11〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療剤。
〔12〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル若しくはフェンセリン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする前記〔10〕又は〔11〕に記載の剤。
〔13〕破骨細胞の機能低下に起因する疾患が、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化又は骨化性筋炎であることを特徴とする前記〔11〕に記載の予防又は治療剤。
〔15〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体を破骨前駆細胞に添加することを含むことを特徴とする破骨細胞分化を抑制する方法。
〔16〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする破骨細胞による骨吸収を抑制する方法。
〔17〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする骨再生を促進する方法。
〔18〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする骨吸収性疾患の予防又は治療方法。
〔20〕破骨細胞分化を抑制することにより、破骨細胞による骨吸収抑制、骨再生促進、又は骨吸収性疾患の予防又は治療のために使用される、前記〔19〕に記載のα7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔21〕破骨細胞による骨吸収抑制用の、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔22〕骨再生促進用の、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔23〕骨吸収性疾患の予防又は治療用の、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔25〕ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、αブンガロトキシン若しくはメチルリカコニチン、又はその薬学的に許容される塩である前記〔14〕〜〔18〕及び〔24〕のいずれか一項に記載の方法、又は前記〔19〕〜〔24〕のいずれか一項に記載のα7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔26〕α7ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩である前記〔14〕〜〔18〕、〔24〕及び〔25〕のいずれか一項に記載の方法、又は前記〔19〕〜〔25〕のいずれか一項に記載のα7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔27〕骨吸収性疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収、又はそれらの2以上の組み合わせであることを特徴とする前記〔18〕に記載の方法、又は前記〔20〕若しくは〔23〕に記載のα7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔28〕再生治療における骨組織形成又は骨組織再生を促進するために用いられることを特徴とする前記〔17〕に記載の方法又は前記〔20〕若しくは〔22〕に記載のα7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔30〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を破骨前駆細胞に添加することを含むことを特徴とする破骨細胞分化を促進する方法。
〔31〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療方法。
〔32〕破骨細胞分化促進用の、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔33〕破骨細胞分化を促進することにより、破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療のために使用される、前記〔32〕に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔34〕破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療用の、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔35〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル若しくはフェンセリン、又はその薬学的に許容される塩である前記〔29〕〜〔31〕のいずれか一項に記載の方法、又は前記〔32〕〜〔34〕のいずれか一項に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔36〕破骨細胞の機能低下に起因する疾患が、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化又は骨化性筋炎であることを特徴とする前記〔31〕に記載の方法、又は前記〔33〕若しくは〔34〕に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
例えば、本発明のα7ニコチン性アセチルコリン受容体を標的とする薬剤(α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とする薬剤)により、破骨細胞分化(破骨細胞形成)を効果的に阻害又は抑制することができる。このため本発明によれば、骨粗鬆症、関節リウマチ、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収等の骨吸収性疾患を効果的に予防、改善又は治療することができる。また、骨吸収を効果的に抑制できることから、骨の形成又は再生を促進できる。このため本発明は、例えば再生医療における骨の形成又は再生等にも有用である。さらに、本発明の破骨細胞分化抑制剤等の有効成分は、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬として作用の特異性が高いため、副作用が少なく安全性が高いという利点もある。また、例えば、選択的拮抗薬が低分子の化合物であると、バイオ医薬である抗体やペプチド製剤と比較して、安価で容易に合成が可能であるという利点もある。
本発明における「骨吸収性疾患」とは、骨吸収が骨形成を上回ることに起因する疾患、症状又は状態を意味する。このような疾患、症状又は状態の例としては、例えば、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病(歯周疾患)における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収等の1又は2以上の組み合わせが挙げられる。骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収等には、それらに伴う腰痛、背部痛等の痛み、骨変形、骨強度低下、骨折等も含まれる。中でも、本発明は、骨粗鬆症、関節リウマチ、抜歯窩における歯槽骨吸収等の骨吸収性疾患に、より好適に適用され、抜歯窩における歯槽骨吸収に特に好適に適用される。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩;アルミニウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。
中でも、薬学的に許容される塩は、無機酸との塩、有機酸との塩等が好ましく、有機酸との塩がより好ましい。無機酸との塩は、例えば、塩酸塩等が好ましい。有機酸との塩は、例えば、クエン酸との塩等が好ましい。
本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬として、メチルリカコニチン又はそのクエン酸塩等が特に好ましい。メチルリカコニチンのクエン酸塩は、水和物であってもよい。
溶解補助剤として、例えば、D−マンニトール、安息香酸ベンジル、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
保存剤として、例えば、パラオキシ安息香酸エチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。
また、好ましい投与対象は、例えば、上述した骨吸収性疾患の患者である。また、例えば骨吸収性疾患の予防に用いる場合には、骨吸収性疾患を発症する可能性がある哺乳動物が好ましい。
また、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収等の予防又は治療のためであれば、注射剤等の非経口投与の形態で、骨吸収が起こっている又は起こり得る部位(例えば、抜歯部位、歯槽骨増生術部位等)に局所投与することが好ましい。
本発明の破骨細胞分化抑制剤を投与する期間は特に限定されず、疾患又は症状等に応じて適宜設定すればよい。
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、生体(インビボ)又はインビトロにおいて、破骨細胞の分化を抑制するために使用することができる。本発明の破骨細胞分化抑制剤は、例えば、インビトロにおける破骨細胞分化抑制のためにも好適に用いられる。本発明の破骨細胞分化抑制剤を使用すると、例えば、インビトロで破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させる実験系で、α7ニコチン性アセチルコリン受容体を介した分化を特異的に阻害することができるため、破骨細胞の分化機構を探索するのに好適である。インビトロで破骨細胞分化を抑制する場合、破骨細胞分化抑制剤の破骨前駆細胞への添加量は、その有効成分の種類等により異なり適宜設定すればよいが、例えば、破骨前駆細胞を含む培地又は溶液中に、有効成分であるα7-nAChR選択的拮抗薬の濃度が0.01〜1000 nM程度となるように有効成分を添加し、細胞を培養すればよい。
α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含む破骨細胞による骨吸収を抑制する方法も包含する。
本発明は、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含む骨の再生を促進する方法も包含する。
本発明の方法におけるα7-nAChR選択的拮抗薬の好ましい態様、その投与方法及び投与量等は、上述したとおりである。哺乳動物は、上述したヒト及びヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはヒトである。また、哺乳動物は、好ましくは上述した骨吸収性疾患の患者である。
本発明の方法は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記以外の工程等を含んでもよい。
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、1種であってもよく、2種以上であってもよい。また、本発明の破骨細胞分化促進剤は、有効成分のみからなるものであってもよいが、必要に応じて、後述するその他の成分等を含有する組成物であってもよい。
また、好ましい投与対象は、例えば、上述した破骨細胞の機能低下に起因する疾患の患者である。また、予防に用いる場合には、破骨細胞の機能低下に起因する疾患を発症する可能性がある哺乳動物が好ましい。
本発明の予防又は治療剤を異所性骨化、骨化性筋炎等の疾患の治療に用いる場合であれば、例えば、注射剤等の非経口投与の形態で、本発明の剤を患部に局所投与することが好ましい。
本発明の破骨細胞分化促進制剤及び予防又は治療剤を投与する期間は特に限定されず、疾患又は症状等に応じて適宜設定すればよい。
本発明の破骨細胞分化促進剤は、インビトロ又は生体(インビボ)における破骨細胞分化促進のために好適に用いられる。本発明の破骨細胞分化促進剤を使用すると、例えば、RANKLの添加量を従来破骨前駆細胞を分化させるために使用されていた量よりも少なくしても、インビトロで破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させることができる。そのため、例えば、高価なRANKL試薬を用いない、又は最小限のRANKL試薬の使用量で破骨細胞を分化誘導する実験の実施等が可能となる。インビトロで破骨細胞分化を促進する場合、破骨細胞分化促進剤の破骨前駆細胞への添加量は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の種類等により異なり適宜設定すればよいが、例えば、破骨前駆細胞を含む培地又は溶液中に、有効成分(アセチルコリンエステラーゼ阻害剤)濃度が0.01〜100μM程度となるように有効成分を添加し、細胞を培養すればよい。
1.実験方法
1.1 破骨前駆細胞及び破骨細胞の誘導
本研究では、マウス骨髄細胞由来マクロファージ系細胞(M-BMMφ)とマウス単球系細胞株RAW264.7細胞を破骨前駆細胞(破骨細胞前駆細胞)として用いた。
マウス骨髄細胞由来マクロファージ系細胞(M-BMMφ)及びマウス単球系細胞株RAW264.7細胞は、Egusa, H. et al. (2011). “The small molecule harmine regulates NFATc1 and Id2 expression in osteoclast progenitor cells”, Bone 49(2): 264-274.に記載の方法に従って調製した。
上記M-BMMφ由来破骨前駆細胞又はRAW264.7細胞に、sRANKLを添加して分化誘導する際に各薬物を添加し、各薬物が破骨細胞分化に及ぼす影響を評価した。分化誘導中の培地交換は、各薬物が添加された培地を用いて2〜3日毎に行った。
破骨細胞への分化の評価は、江草らの報告に従って(Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274)、細胞を酒石酸耐性フォスファターゼ(TRAP)法により染色し、3核以上のTRAP陽性細胞数を計測することにより行った。
TRAP染色は、江草ら(Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274)に記載の方法に従って、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した後、10% グルタルアルデヒドを用いて固定し、TRAP溶液(0.1 M 酢酸ナトリウム、0.1 M 酢酸、10 mg/ml Naphtol AS-MX Phosphate(シグマ)、0.1% Triton X-100、0.3 M 酒石酸カリウム、0.3 mg/ml Fast Red Violet LB Salt(シグマ))にて37℃で10分間反応させることにより行った。光学顕微鏡を使用して、3つ以上の核を有するTRAP陽性の暗赤色の細胞を多核の破骨細胞として計測した。
NFATc1(活性化T細胞核内因子c1(Nuclear Factor of Activated T cells c1))は、活性化T細胞核内因子(NFAT)ファミリーを構成する遺伝子の1つであり、破骨細胞分化におけるマスター転写因子である。
NFAT活性を指標に、小分子化合物ライブラリーLOPAC1280(登録商標)に対して破骨細胞分化に影響を与える物質を探索するためのスクリーニングを行うため、Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274に記載の方法に従って、以下の手順によりルシフェラーゼ遺伝子恒常保有株を作製した。詳細な実験条件等は、Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274に記載の方法に従った。
破骨細胞分化を制御する化合物のライブラリースクリーニングは、江草らの報告(Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274)に従って、小分子化合物ライブラリーLOPAC1280(登録商標、シグマ-アルドリッチ)を用いて行った。化合物のスクリーニングには、後述するルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイによるスクリーニングでは、各薬物化合物はすべて培地中で最終濃度が10 μMとなるように添加して使用した。
試験に使用した薬物は、以下のとおりである。
フェンセリン(シグマ、#P0111)、ドネペジル(シグマ、#D6821)はジメチエルスルホキシド(和光純薬工業)に対して溶解し、培地に対してジメチエルスルホキシドが0.1% となるように調整した上で使用した。
ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞を96ウェル培養プレートに播種して(5,000個/ウェル)37℃で培養した。翌日、ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞にsRANKL及び小分子化合物ライブラリーLOPAC1280(登録商標)の各薬物化合物を添加し、24時間後にLuciferase Assay System(製品名、プロメガ、#E1501)のプロトコルに従って溶解バッファー(Lysis Buffer)で細胞を溶解し、発光基質を加えた後、ルミノメーターとしてGloMax(登録商標) 20/20n Luminometer(プロメガ)を用いてルシフェラーゼ活性を検出した(Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274)。
実験結果は、平均値 ± 標準偏差で表し、ANOVAにて分散分析後Dunnett's test、又はTukey-Kramer testを用いて比較し、危険率5%以下を有意差ありと判定した。
2.1 M-BMMφ細胞から破骨細胞への誘導
M-BMMφ細胞をsRANKLの存在下で3〜6日間培養すると、TRAP陽性の多核巨細胞である破骨細胞への分化が誘導された(コントロール)。
上記1.4の手順により作製したルシフェラーゼ遺伝子恒常保有株を用いて、上記1.5に記載の方法で化合物のライブラリースクリーニングを行った。なお、ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞に導入されたpGL4.30ベクターは、NFAT応答エレメントをコードする遺伝子の下流にルシフェラーゼ遺伝子が結合した構造を有する。このため、ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞においてNFATc1が誘導又は活性化されると、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が誘導されてルシフェラーゼ活性が検出される。
フェンセリンはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤で、アルツハイマー病の治療薬として臨床応用されていることが報告されている。
NFATc1は破骨細胞分化におけるマスター転写因子であるため。フェンセリンが破骨細胞分化を亢進させることが予測された。上記1.1において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して破骨細胞に分化誘導した際にフェンセリンを添加した場合、破骨細胞分化を促進する結果が得られた(図1)。図1は、RAW264.7細胞(破骨前駆細胞)の分化誘導培地中に、フェンセリンを0nM(コントロール)、250nM、500nM、1μM又は2μMとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化(TRAP陽性多核破骨細胞数)を調べた結果である(図1中、*:P<0.01)。
ドネペジルは、フェンセリンと同様にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤で、アルツハイマー病の治療薬として臨床応用されていることが報告されている。
そのため、ドネペジルがフェンセリンと同様に破骨細胞分化を亢進させることが予測された。上記1.1において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して破骨細胞に分化誘導した際にドネペジルを添加した場合、破骨細胞分化を促進する結果が得られた(図2)。図2は、RAW264.7細胞(破骨前駆細胞)の分化誘導培地中に、ドネペジルを0nM(コントロール)、250nM、500nM、1μM又は10μMとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である(図2中、*:P<0.01)。
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤であるフェンセリンとドネペジルによって破骨細胞分化が促進されたことより、破骨細胞分化にアセチルコリンが関与しているかを検討するため、偽コリンエステラーゼ(シグマ社製、ウマ血清由来ブチリルコリンエステラーゼ)又はアセチルコリンエステラーゼ(R&D Systems社製、組換えマウスアセチルコリンエステラーゼ)を使用して破骨細胞分化への影響を検討した。上記1.1において、破骨前駆細胞(M-BMMφ由来破骨前駆細胞又はRAW264.7細胞)を、sRANKL存在下で5又は6日間(M-BMMφ由来破骨前駆細胞の場合は6日間、RAW264.7細胞の場合は5日間)培養して破骨細胞に分化誘導する際に、偽コリンエステラーゼ、加熱処理して失活させた偽コリンエステラーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼをそれぞれ添加した。この結果、偽コリンエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼには破骨細胞分化を抑制する結果が得られた(図3〜図5、図3〜5中、*:p<0.01)。また、偽コリンエステラーゼを加熱処理して失活させることにより、この抑制効果は失われた(図3)。図3は、RAW264.7細胞をsRANKLで5日間培養して分化誘導した際の培地中に、偽コリンエステラーゼ又はこれを加熱処理して失活させたものをそれぞれ 500 mU/ml となるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。図4は、RAW264.7細胞をsRANKLで5日間培養して分化誘導した際の培地中に、アセチルコリンエステラーゼを25 ng/mlとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。図5は、M-BMMφ細胞をsRANKL存在下で6日間培養して分化誘導した際の培地中に、偽コリンエステラーゼ(500 mU/ml)又はアセチルコリンエステラーゼ(25 ng/ml又は2.5 ng/ml)を添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。
図3〜5において、コントロールでは、偽コリンエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼのいずれも添加しない以外は、同様に実験を行った。
アセチルコリン受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体とニコチン性アセチルコリン受容体に分類される。破骨細胞分化に関与している受容体を検討するために、RAW264.7細胞にそれぞれの受容体の拮抗薬を添加して破骨細胞分化への影響を調べた。ムスカリン性アセチルコリン受容体の拮抗薬であるスコポラミン臭化水素酸塩三水和物を添加したところ、破骨細胞分化への影響は認められなかった。一方で、ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬である塩酸メカミラミンを添加したところ、破骨細胞分化を抑制する結果が得られた(図6)。図6は、RAW264.7細胞をsRANKLで5日間培養して分化誘導した際の培地中に、スコポラミン臭化水素酸塩三水和物を1μM又は10μM、又は塩酸メカミラミンを10μMとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である(図6中、*:P<0.01)。コントロールでは、スコポラミン臭化水素酸塩三水和物及び塩酸メカミラミンのいずれも添加しない以外は、同様に実験を行った。
2.7.1 筋肉型受容体の拮抗薬の影響
ニコチン性アセチルコリン受容体は、主に、筋肉型(末梢型)と、神経型(中枢型)に分類されている。筋肉型受容体の拮抗薬として、ツボクラリンが知られている。ツボクラリンを用いて、これらが破骨細胞分化にどのような影響を及ぼすかを調べた。
RAW264.7細胞はマクロファージであるが、ニコチン性アセチルコリン受容体のうち、α4β2ヘテロ5量体がマクロファージに存在することが報告されている。α4β2ヘテロ5量体受容体の拮抗薬が、破骨細胞分化に与える影響を調べた。α4β2ヘテロ5量体受容体の拮抗薬として、α4β2ヘテロ5量体を特異的に阻害する拮抗薬として知られているジヒドロ−β−エリトロイジン臭化水素酸塩(DHE)を用いて実験を行った。図8は、上記1.1において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際の培地中にDHEを10nM、100nM又は1μMとなるように添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。コントロールでは、DHEを添加しない以外は、同様に実験を行った。図8から、α4β2ヘテロ5量体の特異的拮抗薬であるDHEを添加しても、コントロールと比較して、破骨細胞数の差は認められなかった。
ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬である塩酸メカミラミン、塩酸メマンチン、及びアソキシム塩酸塩、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬であるメチルリカコニチン クエン酸塩水和物(MLA)、及びα-ブンガロトキシンの破骨細胞分化への影響を調べた。上記1.1において破骨前駆細胞(M-BMMφ由来破骨前駆細胞又はRAW264.7細胞)をsRANKL存在下でM-BMMφ由来破骨前駆細胞の場合は6日間、RAW264.7細胞の場合は5日間培養して分化誘導した際の培地中に、各薬物を所定の濃度となるように添加し、破骨細胞への分化を調べた。
結果を図9〜13に示す(図9〜10及び11〜13中、*:P<0.01)。その結果、いずれのα7-nAChR拮抗薬も、破骨細胞分化を抑制した。特にMLAは破骨細胞への分化(破骨細胞形成)に強い抑制効果を示し、RAW264.7細胞をMLA存在下(1〜250nM)でRANKL刺激により破骨細胞に分化誘導した結果、MLAは破骨細胞形成を著明に抑制した。M-BMMφ由来破骨前駆細胞における破骨細胞分化誘導においても、MLAは同様の作用を示した。
(1)フェンセリンは、破骨前駆細胞においてNFATの活性化を亢進する。
(2)フェンセリンは破骨細胞分化を促進する。
(3)ドネペジルは、フェンセリンと同様、破骨細胞分化を促進する。
(4)アセチルコリンエステラーゼにより、破骨細胞分化は抑制される。
(5)α7-nACh受容体の拮抗作用を持つMLA等の選択的拮抗薬により、破骨細胞分化は効果的に抑制される。
メチルリカコニチン クエン酸塩水和物(MLA)の破骨細胞分化への影響を、ビスホスホネート(アレンドロン酸ナトリウム三水和物:シグマ社、#A4978)と比較した。
試験例1の1.1において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際の培地中に、MLA又はビスホスホネート(ビス)をそれぞれ培地中の薬物濃度が0.1〜10nMとなるように添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を試験例1と同様にTRAP染色により調べた。コントロールでは、MLA及びビスホスホネートのいずれも添加しない以外は、同様に実験を行った。
雄性Spague-Dawley系ラット(10週齢)に全身麻酔を施した後、頭皮を剥離して骨膜弁を形成し、頭蓋骨矢状縫合の左右に直径5 mmの欠損を形成した。頭蓋骨欠損の形成には、動物手術用エンジンおよびトレフィンバー(インプラテックス、東京、Cat.#04949202)を用い、注水下にて作業を行った。生検トレパン(カイインダストリーズ株式会社、岐阜、Cat.# BP-50F)を用いて直系5 mmに切り出したコラーゲンスポンジ(テルダーミス(登録商標);テルモ、東京、Cat.# TD-A006N)に0.5、5、50または500 ngのメチルリカコニチン クエン酸塩水和物(MLA)を含む溶液を含浸させ、これを頭蓋骨欠損部に埋入し、骨膜で被覆し頭皮を縫合した。前記のMLA溶液を含浸させたコラーゲンスポンジを埋入後、3週間に亘り3、4日毎に0.5、5、50または500 ngのMLAを含む溶液を埋入部位に局所注射した。対照群(コントロール)には、同様の術式を用いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含浸させたコラーゲンスポンジの埋入およびPBSの局所注射を行った。
雌性Jcl:ICR系マウス(8週齡)に全身麻酔を施した後、通法に従い(下記URL参照)両側の卵巣を摘出し、閉経後骨粗鬆症モデル(OVX:n=12)を作製した。比較対象には、同マウスに疑似手術を行った群を用意した(Sham:n=4)。
http://www.rs-techno.co.jp/bone/bone_histomorphometry/basic/c03/03_01.html
1.雌性Jcl:ICR系マウス(8週齡)に短時間麻酔を行った。
2.麻酔後、背側を上に向け、最終肋骨部から腰椎部の正中線に沿ってバリカンで5cm、幅4cm以上の領域を刈った。
3.術野をガーゼで綺麗にふき取り、消毒液(手術用ヨード)を塗布した。
4.正中線上の最後肋骨から約2cmの尾部方向へ離れた部位の中央(脊柱の上)を有鈎ピンセットで軽くつまみ、ハサミ又はメスで1-1.5cm程度、皮膚を切開した。
5.切開した皮膚の一方を有鈎ピンセットで軽く引き上げ、皮下織を剥離し、左右のいずれか一方の正中から1-1.5cm腹側方向へ離れた部位の腹筋を軽く引き上げた。
6.引き上げた腹膜をハサミで腹方向に注意深く1cm程度切開し、切開部分から無鈎ピンセットを入れ、卵巣を探した。卵巣を軽く摘まみ上げるようにして引き出し、切除した。
7.切除した子宮端を消毒用アルコールで拭いた。
8.出血がないことを確かめ、子宮を静かに腹腔内にもどした。
9.同様の操作を反対側で行い、卵巣を摘出した。
10.最初に切開した皮膚を縫合し、消毒用ヨードで縫合部をきれいに拭いた。
なお、例えばMLAの投与量、投与間隔、投与方法等を適宜調節することにより、骨密度、骨塩量、及び骨体積をより効果的に増加させることも可能である。このため、例えばMLAの投与量、投与間隔、投与方法等を適宜調節することにより、より優れた骨粗鬆症の予防又は治療効果を得ることも可能である。
Claims (13)
- α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞分化抑制剤。
- α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞による骨吸収抑制剤。
- α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨再生促進剤。
- α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨吸収性疾患の予防又は治療剤。
- α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬が、α7ニコチン性アセチルコリン受容体に対する阻害定数(Ki)が1μM以下の化合物であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の剤。
- ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、αブンガロトキシン若しくはメチルリカコニチン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の剤。
- α7ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の剤。
- 骨吸収性疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収、又はそれらの2以上の組み合わせであることを特徴とする請求項4に記載の予防又は治療剤。
- 再生治療における骨組織形成又は骨組織再生を促進するために用いられるものであることを特徴とする請求項3に記載の骨再生促進剤。
- アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞分化促進剤。
- アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療剤。
- アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル若しくはフェンセリン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項10又は11に記載の剤。
- 破骨細胞の機能低下に起因する疾患が、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化又は骨化性筋炎であることを特徴とする請求項11に記載の予防又は治療剤。
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