JP6255017B2 - Ｅｃｌ用の新規イリジウムベース錯体 - Google Patents

Description

本発明は、新規なイリジウムベースのＩｒ（ＩＩＩ）発光性錯体、これらの錯体を標識として含むコンジュゲート、およびたとえば電気化学発光ベースの分析物検出におけるそれらの適用に関する。

電気的に発生する化学発光（電気化学発光とも呼ばれ、ＥＣＬと略される）は、電極で発生した化学種が高エネルギー電子伝達反応を受けて励起状態を形成し、それにより光を発するプロセスである。最初の詳細なＥＣＬ研究は１９６０年代半ばにHerculesおよびBardらにより記載された。約５０年間の研究の後、ＥＣＬは現在きわめて有力な分析手法になり、たとえばイムノアッセイ、食品および水の検査、ならびに生物兵器作用物質検出の領域で広く用いられている。

有機発光デバイス(organic light emitting device（ＯＬＥＤ）)に使用するものとして関心がもたれると思われるきわめて多数の化合物がある。これらの化合物は固体材料中に用いるのに適切であり、あるいは有機流体に溶解できる。しかし、たとえば生物試料からの分析物の検出に必要な水性媒体中におけるそれらの有用性に関しては結論を得ることができない。

一般に、ＥＣＬベースの検出法は、Ｒｕ（ＩＩ^＋）を金属イオンとして含む水溶性ルテニウム錯体の使用に基づく。
この数十年間にわたってなされたかなりの改良にもかかわらず、より高感度の電気化学発光ベースの in vitro 診断アッセイがなお著しく必要とされている。

今回、意外にも、イリジウムベースの特定のＩｒ（ＩＩＩ^＋）発光性錯体が将来の高感度ＥＣＬベース検出法のためのきわめて有望な標識であることが見出された。

本発明は、式ＩＩのイリジウムベースの化学発光性化合物を開示する：

［式中：
式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）において、それぞれ独立して、各Ｒ１〜Ｒ１６は、独立して、水素、ハライド、シアノ基またはニトロ基、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート、あるいはＲ１７であり、その際、Ｒ１７は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル、分岐鎖アルキル、置換された分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アミノ−アルキル、置換アミノ−アルキル、アミノ−アルコキシ、置換アミノ−アルコキシ、アミノ−アリール、置換アミノ−アリール、アミノ−アリールオキシ、置換アミノ−アリールオキシであり、
Ｒ１〜Ｒ１２内において、または／およびＲ１３〜Ｒ１６内において、それぞれ、２つの隣接Ｒは芳香族環または置換された芳香族環を形成することができ、その際、置換基は水素、アルキル、置換アルキル、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネートから選択され、あるいは
Ｒ１〜Ｒ１２内において、または／およびＲ１３〜Ｒ１６内において、それぞれ、２つの隣接Ｒは脂肪族環または置換された脂肪族環を形成することができ、その際、置換基は水素、アルキル、置換アルキル、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネートから選択され、
Ｒ１〜Ｒ１７のいずれかに置換基が存在する場合、Ｒ１〜Ｒ１７における置換基は、それぞれ独立して、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、アルキルオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルアリールオキシ、ポリエチレンオキシ、ポリプロピレンオキシ、スルファニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネートから選択され、
ここで用いるアルキルは、１〜２０炭素原子の長さをもつ直鎖もしくは分岐鎖アルキル、またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む１〜２０原子の長さをもつヘテロアルキル鎖であり、アリールは、５、６もしくは７員アリール環系、またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５、６もしくは７員ヘテロアリール環系であり、
式Ｉ（ａ）のＲ１３〜Ｒ１６のうち少なくとも１つは−Ｑ１−Ｙであり、式Ｉ（ｂ）のＲ１３〜Ｒ１６のうち少なくとも１つはＱ２であり、その際、Ｑ１はリンカーであり、各Ｑ２は独立してリンカーまたは共有結合であり、（ｎ）は１〜５０の整数であり、Ｙは官能基である］。

本発明はまた、前記化合物およびそれに共有結合した親和性結合剤を含む、コンジュゲートを開示する。
本発明はさらに、水溶液中で、特に電気化学発光デバイスまたは電気化学発光検出システムで、発光測定または電気化学発光反応を実施するための、本発明において開示する化合物またはコンジュゲートの使用に関する。

さらに、本発明は、in vitro 法により分析物を測定するための方法であって、下記の工程を含む方法を開示する：（ａ）分析物を含む疑いがあるかまたは含むことが分かっている試料を用意し、（ｂ）その試料と本発明によるコンジュゲートを、分析物−コンジュゲート複合体の形成に適した条件下で接触させ、そして（ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得る。

前記に述べたように、in vitro 診断アッセイに使用するのに適した、金属ベースの新規な化学発光性化合物が必要とされている。
新規な式ＩＩのイリジウムベースの化学発光性化合物
本発明は、式ＩＩのイリジウムベースの化学発光性化合物に関する：

［式中：
式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）において、それぞれ独立して、各Ｒ１〜Ｒ１６は、独立して、水素、ハライド、シアノ基またはニトロ基、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート、あるいはＲ１７であり、その際、Ｒ１７は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル、分岐鎖アルキル、置換された分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アミノ−アルキル、置換アミノ−アルキル、アミノ−アルコキシ、置換アミノ−アルコキシ、アミノ−アリール、置換アミノ−アリール、アミノ−アリールオキシ、置換アミノ−アリールオキシであり、
Ｒ１〜Ｒ１２内において、または／およびＲ１３〜Ｒ１６内において、それぞれ、２つの隣接Ｒは芳香族環または置換された芳香族環を形成することができ、その際、置換基は水素、アルキル、置換アルキル、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネートから選択され、あるいは
Ｒ１〜Ｒ１２内において、または／およびＲ１３〜Ｒ１６内において、それぞれ、２つの隣接Ｒは脂肪族環または置換された脂肪族環を形成することができ、その際、置換基は水素、アルキル、置換アルキル、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネートから選択され、
Ｒ１〜Ｒ１７のいずれかに置換基が存在する場合、Ｒ１〜Ｒ１７における置換基は、それぞれ独立して、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、アルキルオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルアリールオキシ、ポリエチレンオキシ、ポリプロピレンオキシ、スルファニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート基から選択され、
ここで用いるアルキルは、１〜２０炭素原子の長さをもつ直鎖もしくは分岐鎖アルキル、またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む１〜２０原子の長さをもつヘテロアルキル鎖であり、アリールは、５、６もしくは７員アリール環系、またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５、６もしくは７員ヘテロアリール環系であり、
式Ｉ（ａ）のＲ１３〜Ｒ１６のうち少なくとも１つは−Ｑ１−Ｙであり、式Ｉ（ｂ）のＲ１３〜Ｒ１６のうち少なくとも１つはＱ２であり、その際、Ｑ１はリンカーであり、各Ｑ２は独立してリンカーまたは共有結合であり、（ｎ）は１〜５０の整数であり、Ｙは官能基である］。

１態様において、式Ｉ（ａ）のＲ１３〜Ｒ１６のうちの１つはＱ１−Ｙである。
１態様において、それぞれの式Ｉ（ｂ）のＲ１３〜Ｒ１６のうちの１つはＱ２である。
１態様において、式Ｉ（ａ）のＲ１３〜Ｒ１６のうちの１つはＱ１−Ｙであり、かつそれぞれの式Ｉ（ｂ）のＲ１３〜Ｒ１６のうちの１つはＱ２である。

１態様において、式Ｉ（ａ）と式Ｉ（ｂ）は、それぞれ、式Ｉ（ａ）のＱ１−Ｙおよび式Ｉ（ｂ）のＱ２を除いて同一である。
当業者に分かるように、Ｒ１〜Ｒ１７における置換基はさらに置換されていてもよく、たとえばアミノアルキル基中のアルキル基はさらにヒドロキシル、アミノ、カルボキシまたはスルホ基により置換されていてもよい。

付随する特許請求の範囲を含めて本明細書中で用いる置換基は、当業者に一般的に知られている意味をもつ。
アルキルは、好ましくは、１〜２０炭素原子の長さをもつ、好ましくは１〜１０炭素原子の長さをもつ、特に好ましくは１〜６炭素原子の長さをもつ、直鎖もしくは分岐鎖アルキル；またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む１〜２０原子の長さをもつ、好ましくは１〜１０炭素原子の長さをもつ、ヘテロアルキル鎖である。アルキル基の例にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、異性体ペンチル類、異性体ヘキシル類、異性体ヘプチル類、異性体オクチル類、およびドデシルが含まれるが、これらに限定されない。特定の好ましい態様において、アルキルはメチルまたはエチルである。

用語アルコキシとアルキルオキシ、および置換アルキルと置換アルコキシは、それぞれ互換性をもって使用できる。アルコキシおよびアルキルオキシは、式−ＯＲの部分を意味し、ここでＲは、好ましくは本明細書中で前記に定めたアルキル部分である。アルコキシ部分の例にはメトキシ、エトキシ、およびイソプロポキシが含まれるが、これらに限定されない。

１態様において、置換アルキルオキシについて好ましい置換基は、１〜４０個のエチレンオキシ単位を含む、または１〜２０個のエチレンオキシ単位を含む、または１〜１０個のエチレンオキシ単位を含む、エチレンオキシ鎖である。

アリールは、好ましくは５、６もしくは７員アリール環系、好ましくは６員アリール環系、またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５、６もしくは７員ヘテロアリール環系、好ましくは６員ヘテロアリール環系である。特定の好ましい態様において、アリールはフェニルである。

１態様において、式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）において、それぞれ独立して、各Ｒ１〜Ｒ１６は、独立して水素、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイルまたはスルホキシドである。

１態様において、式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）において、それぞれ独立して、各Ｒ１〜Ｒ１６は、独立して水素、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイルまたはスルホキシドである。

１態様において、式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）において、それぞれ独立して、各Ｒ１〜Ｒ１６は、独立して水素、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホネートまたはスルホキシドである。

１態様において、式Ｉ（ａ）および／または式Ｉ（ｂ）による化合物のＲ１〜Ｒ１６のうち少なくとも１つは、少なくとも１つの親水基、特に下記に定める少なくとも１つの親水基により置換されている。

１態様において、式Ｉ（ａ）および／または式Ｉ（ｂ）に含まれるフェニルフェナントリジン残基のＲ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つは、少なくとも１つの親水基、特に下記に定める少なくとも１つの親水基により置換されている。

好ましい親水基は下記のものである：アミノ、アルキルアミノ（アルキルは直鎖アルキル、たとえばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル鎖、または分岐鎖アルキル、たとえばイソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ．ブチル、好ましくは直鎖アルキル、たとえばメチルもしくはエチルを意味する）、置換アルキルアミノ（これはたとえば、Ｎ原子に結合した１または２つの分岐鎖または直鎖を含み、それらはさらに他の親水基、たとえばヒドロキシルまたはスルホにより置換され、好ましくはこの置換アルキルアミノは２つのヒドロキシプロピルまたはヒドロキシエチル残基を含む）、アリールアミノ（アリールは芳香族残基、たとえばフェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルを表わす）、置換アリールアミノ（アリールは前記に定めたものである）、ならびに親水基により形成されるさらに他の残基、アルキルアンモニウム（アルキルは前記に定めたものであり、好ましくはトリメチルアンモニウム残基またはトリエチルアンモニウム残基である）、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボン酸エステル（好ましくはアルキルエステル、たとえばメチルまたはエチルエステル）、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ（アルキルおよび置換アルキルは前記に定めたものである）、あるいはアリールオキシまたは置換アリールオキシ（アリールおよび置換アリールは前記に定めたものである）、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート。

好ましくは、そのような親水基はアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、ヒドロキシ、スルホ、スルフェノ、スルファモイル、スルホキシドおよびホスホネートから選択され、適用できる場合、それぞれは好ましくは上の節に定めたものである。

好ましい態様において、親水基はアルキルアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、ヒドロキシ、スルホ、スルフェノ、スルファモイル、スルホキシドおよびホスホネートから選択される。

さらなる特定の好ましい態様において、親水基はスルホ基およびスルファモイル基から選択される。
１態様において、式Ｉ、式ＩＩの式Ｉ（ａ）および／または式Ｉ（ｂ）に含まれるフェニルフェナントリジン残基のＲ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つは、それぞれ少なくとも１つの親水基により置換されている。

１態様において、Ｒ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つは、置換された、または置換されていない、下記のものから選択される基である：スルホ−アルキル、スルホ−アリール、スルホ−アルコキシ、スルホ−アリールオキシ、スルホ、スルフィノ−アルキル、スルフィノ−アリール、スルフィノ−アルコキシ、スルフィノ−アリールオキシ、スルフィノ、スルフェノ−アルキル、スルフェノ−アリール、スルフェノ−アルコキシ、スルフェノ−アリールオキシ、スルフェノ、スルファモイル−アルキル、スルファモイル−アリール、スルファモイル−アルコキシ、スルファモイル−アリールオキシ、スルファモイル、アルカンスルホニル−アルキル、アルカンスルホニル−アリール、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル−アルキル、もしくはアレーンスルホニル−アリール、もしくはアレーンスルホニル、スルホアミノ−アルキル、スルホアミノ−アリール、スルホアミノ−アルコキシ、スルホアミノ−アリールオキシ、スルホアミノ、スルフィノアミノ−アルキル、スルフィノアミノ−アリール、スルフィノアミノ−アルコキシ、スルフィノアミノ−アリールオキシ、スルフィノアミノ、アルカンスルホニルアミノ−アルキル、アルカンスルホニルアミノ−アリール、アルカンスルホニルアミノ−アルコキシ、アルカンスルホニルアミノ−アリールオキシ、アルカンスルホニルアミノ、アレーンスルホニルアミノ−アルキル、アレーンスルホニルアミノ−アリール、アレーンスルホニルアミノ−アルコキシ、アレーンスルホニルアミノ−アリールオキシ、アレーンスルホニルアミノ、アルカンスルフィニルアミノ−アルキル、アルカンスルフィニルアミノ−アリール、アルカンスルフィニルアミノ−アルコキシ、アルカンスルフィニルアミノ−アリールオキシ、アルカンスルフィニルアミノ、アレーンスルフィニルアミノ−アルキル、アレーンスルフィニルアミノ−アリール、アレーンスルフィニルアミノ−アルコキシ、アレーンスルフィニルアミノ−アリールオキシ、アレーンスルフィニルアミノ、ホスホノ−アルキル、ホスホノ−アリール、ホスホノ−アルキルオキシ、ホスホノ−アリールオキシ、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル−アルキル、ヒドロキシホスフィノイル−アリール、ヒドロキシホスフィノイル−アルキルオキシ、ヒドロキシホスフィノイル−アリールオキシ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アルキル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アリール、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アルキルオキシ、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アリールオキシ、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル、ホスホノアミノ−アルキル、ホスホノアミノ−アリール、ホスホノアミノ−アルコキシ、ホスホノアミノ−アリールオキシ、ホスホノアミノ、または化学的に調和する場合は前記置換基の塩；ここで“アルキル”は、１〜２０炭素原子の長さをもつ直鎖もしくは分岐鎖アルキル、またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む１〜２０原子の長さをもつヘテロアルキル鎖であり、ここで用いる“アリール”は、５、６もしくは７員アリール環系、またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５、６もしくは７員ヘテロアリール環系である。

１態様において、Ｒ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つは、置換された、または置換されていない、下記のものから選択される基である：スルホ−アルキル、スルホ−アリール、スルホ−アルコキシ、スルホ−アリールオキシ、スルホ、スルファモイル−アルキル、スルファモイル−アリール、スルファモイル−アルコキシ、スルファモイル−アリールオキシ、スルファモイル、アルカンスルホニル−アルキル、アルカンスルホニル−アリール、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル−アルキル、アレーンスルホニル−アリール、アレーンスルホニル、アルカンスルホニルアミノ−アルキル、アルカンスルホニルアミノ−アリール、アルカンスルホニルアミノ−アルコキシ、アルカンスルホニルアミノ−アリールオキシ、アルカンスルホニルアミノ、アレーンスルホニルアミノ−アルキル、アレーンスルホニルアミノ−アリール、アレーンスルホニルアミノ−アルコキシ、アレーンスルホニルアミノ−アリールオキシ、アレーンスルホニルアミノ、ホスホノ−アルキル、ホスホノ−アリール、ホスホノ−アルキルオキシ、ホスホノ−アリールオキシ、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル−アルキル、ヒドロキシホスフィノイル−アリール、ヒドロキシホスフィノイル−アルキルオキシ、ヒドロキシホスフィノイル−アリールオキシ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アルキル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アリール、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アルキルオキシ、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル−アリールオキシ、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル、または化学的に調和する場合は前記置換基の塩；ここで“アルキル”は、１〜２０炭素原子の長さをもつ直鎖もしくは分岐鎖アルキル、またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む１〜２０原子の長さをもつヘテロアルキル鎖であり、ここで用いる“アリール”は、５、６もしくは７員アリール環系、またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５、６もしくは７員ヘテロアリール環系である。

１態様において、Ｒ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つは、スルホ−アルキル、スルホ−アリール、スルホ−アルコキシ、スルホ−アリールオキシ、スルホ、またはその塩（＝スルホネート）であり、その際、対イオンは好ましくはアルカリ金属の属からのカチオンである。

１態様において、Ｒ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つは、スルホ−アルキル、スルホ−アルコキシ、スルホ、またはその塩（＝スルホネート）であり、その際、対イオンはアルカリ金属の属からのカチオンである。

１態様において、Ｒ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つは、スルホ−メチル、Ｃ２〜Ｃ４アルキル鎖をもつスルホ−アルコキシ、またはその塩（＝スルホネート）であり、その際、対イオンはアルカリ金属の属からのカチオンである。

１態様において、式Ｉ（ａ）および／または式Ｉ（ｂ）の基Ｒ１〜Ｒ１２のうち少なくとも１つはスルホ基である。
１態様において、Ｒ１〜Ｒ１２のうち１〜３つは水素ではない。

１態様において、対イオンはリチウムカチオン、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、およびセシウムカチオンからなる群から選択されるアルカリ金属カチオンである。
１態様において、対イオンはナトリウムカチオンおよびセシウムカチオンからなる群から選択されるアルカリ金属カチオンである。

１態様において、対イオンはセシウムカチオンである。
１態様において、式Ｉ（ａ）および／または式Ｉ（ｂ）に含まれるフェニルフェナントリジン残基は、以下に挙げる置換フェニルフェナントリジン類から選択される。

本明細書中で用いる用語“リンカー”は、当業者に既知の意味をもち、分子のフラグメントを連結するために用いられる分子または分子群に関する。リンカーは、柔軟または剛直な骨格上に２以上の化学的にオルソゴナルな(orthogonal)官能基をもつことを特徴とする。共有結合は本発明の意味におけるリンカーではない。

本発明による化合物において、リンカーＱ１は、好ましくは１〜２００原子の主鎖長さをもつ。当業者に容易に認識されるように、式ＩＩのリンカーＱ１はｎ個の分岐部位を含み、そこにＱ２が結合する。言い換えると、式Ｉ（ａ）のピリジル環と官能基Ｙの間の最短結合は１〜２００原子からなる。

１態様において、Ｑ１は、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、Ｐ、Ｓ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖をもつ。

環系が存在する場合、リンカー長さを査定する際に環系中の最短数の原子を採用する。一例として、フェニレン環はリンカーにおいて４原子の長さを占める。
１態様において、リンカーＱ１は、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ１００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜１００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖をもつ。

１態様において、リンカーＱ１は、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ５０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜５０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖をもつ。

１態様において、リンカーＱ１は、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖をもつ。

１態様において、本発明の電気化学発光性錯体中のリンカーＱ１は、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、またはＣ１〜Ｃ２０アリールアルキル鎖（その際、たとえばフェニレン環は４炭素原子の長さを占める）、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた１〜２０原子の鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなり、少なくとも１つのアリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール基を含む主鎖を備えた１〜２０原子の鎖（その際、たとえばフェニレン環は４原子の長さを占める）である。

１態様において、本発明による化合物中のリンカーＱ１は、飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、またはＣ１〜Ｃ１２アリールアルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた１〜１２原子の鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなり、少なくとも１つのアリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール基を含む主鎖を備えた１〜１２原子の鎖（その際、たとえばフェニレン環は４原子の長さを占める）である。

１態様において、リンカーＱ１はペプチド鎖を含む。
１態様において、Ｑ２は−Ｃ_６Ｈ_４−（ＣＨ_２）_２−および−Ｃ_６Ｈ_４−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−からなる群から選択される。

式Ｉ（ｂ）およびＱ２は、式ＩＩによる化合物中に（ｎ）回存在し、（ｎ）は１〜５０の整数である。これら（ｎ）個のＱ２は、それぞれ独立して、共有結合であるか、あるいは主鎖として下記の鎖をもつリンカーである：直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、Ｐ、Ｓ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖。

１態様において、各Ｑ２は、独立して、共有結合であるか、あるいは主鎖として下記の鎖をもつリンカーである：直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ１００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜１００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖。

１態様において、各Ｑ２は、独立して、共有結合であるか、あるいは主鎖として下記の鎖をもつリンカーである：直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ５０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜５０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖。

１態様において、各Ｑ２は、独立して、共有結合であるか、あるいは主鎖として下記の鎖をもつリンカーである：直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖。

１態様において、各Ｑ２は、独立して、共有結合であるか、あるいは主鎖として下記の鎖をもつリンカーである：直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜１２原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖。

１態様において、各Ｑ２は、独立して、共有結合であるか、あるいは主鎖として下記の鎖をもつリンカーである：飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた１〜１２原子の鎖。

１態様において、リンカーＱ１は１個以上のアミノ酸を含む。
１態様において、リンカーＱ２は１個以上のアミノ酸を含む。
１態様において、リンカーＱ１およびＱ２は両方とも１個以上のアミノ酸を含む。

１態様において、リンカーＱ１は１個以上のヌクレオチドを含む。
１態様において、リンカーＱ２は１個以上のヌクレオチドを含む。
１態様において、リンカーＱ１およびＱ２は両方とも１個以上のヌクレオチドを含む。

式ＩＩにおいて、（ｎ）は１〜５０の整数であり、これは式ＩＩによる化合物中に式Ｉ（ｂ）およびＱ２が（ｎ）回存在することを示す。特定の態様において、（ｎ）は２から５０まで、または１から４０まで、または２から４０まで、または３から３１までの整数である。

式ＩＩにおいて、（ｎ）は１〜５０の整数であり、これは式ＩＩによる化合物中に式Ｉ（ｂ）およびＱ２が（ｎ）回存在することを示す。特定の態様において、（ｎ）は１から４９まで、１から４８まで、１から４７まで、１から４６まで、１から４５まで、１から４４まで、１から４３まで、１から４２まで、１から４１まで、１から４０まで、２から５０まで、２から４９まで、２から４８まで、２から４７まで、２から４６まで、２から４５まで、２から４４まで、２から４３まで、２から４２まで、２から４１まで、２から４０まで、３から３９まで、３から３８まで、３から３７まで、３から３６まで、３から３５まで、３から３４まで、３から３３まで、３から３２まで、３から３１まで、３から３０まで、４から２９まで、４から２８まで、４から２７まで、４から２６まで、４から２５まで、４から２４まで、４から２３まで、４から２２まで、４から２１まで、４から２０まで、５から１９まで、５から１８まで、５から１７まで、５から１６まで、５から１５まで、５から１４まで、５から１３まで、５から１２まで、５から１１まで、または５から１０までの整数である。

１態様において、式ＩＩにおいて（ｎ）は１である。
１態様において、式ＩＩにおいて（ｎ）は２である。
１態様において、式ＩＩにおいて（ｎ）は３である。

１態様において、本発明による式ＩＩのイリジウムベースの錯体に含まれる官能基Ｙは、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、ヒドラジン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホロアミダイトからなる群から選択される。

１態様において、本発明による式ＩＩのイリジウムベースの錯体に含まれる官能基Ｙは、カルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホロアミダイトからなる群から選択される。

特定の好ましい態様において、本発明による式ＩＩのイリジウムベースの錯体に含まれる官能基Ｙは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびマレイミドからなる群から選択される。

今回、式ＩＩのイリジウムベースの化学発光性化合物が将来の高感度ＥＣＬベース検出法のための標識として適切であることが、意外にも予想外に見出された。
１態様において、本発明は下記の式ＩＩの化合物に関する：
式Ｉ（ａ）と式Ｉ（ｂ）は、それぞれ、式Ｉ（ａ）のＱ１−Ｙおよび式Ｉ（ｂ）のＱ２を除いて同一であり、
式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）において、それぞれ、Ｒ１〜Ｒ１２のうち１〜３つは、独立して、スルホ−アルキル、スルホ−アリール、スルホ−アルコキシ、スルホ−アリールオキシ、スルホ、またはその塩（＝スルホネート）であり、その際、対イオンは好ましくはアルカリ金属の属からのカチオンであり、他の基Ｒ１〜Ｒ１２は水素であり、
式Ｉ（ａ）中のＲ１３〜Ｒ１６のうちの１つは−Ｑ１−Ｙであり、式Ｉ（ａ）中の他の基Ｒ１３〜Ｒ１６は水素であり、
式Ｉ（ｂ）中のＲ１３〜Ｒ１６のうちの１つはＱ２であり、式Ｉ（ａ）中の他の基Ｒ１３〜Ｒ１６は水素であり、その際、Ｑ１はリンカーであり、Ｑ２はリンカーまたは共有結合であり、
（ｎ）は１から５０までの整数であり、
Ｙは官能基である。

前記に定める式ＩＩの化合物のいずれかの態様の組合わせはいずれも本発明の範囲に含まれるものとする。
新規な式Ｉのイリジウムベースの化学発光性化合物
他の観点において、本発明は、式Ｉによる化合物に関する：

［式中：
Ｒ１〜Ｒ１６は、水素、ハライド、シアノ基またはニトロ基、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート、あるいはＲ１７であり、その際、Ｒ１７は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル、分岐鎖アルキル、置換された分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アミノ−アルキル、置換アミノ−アルキル、アミノ−アルコキシ、置換アミノ−アルコキシ、アミノ−アリール、置換アミノ−アリール、アミノ−アリールオキシ、置換アミノ−アリールオキシであり、
Ｒ１〜Ｒ１２内において、または／およびＲ１３〜Ｒ１６内において、それぞれ、２つの隣接Ｒは芳香族環または置換された芳香族環を形成することができ、その際、置換基は水素、アルキル、置換アルキル、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネートから選択され、あるいは
Ｒ１〜Ｒ１２内において、または／およびＲ１３〜Ｒ１６内において、それぞれ、２つの隣接Ｒは脂肪族環または置換された脂肪族環を形成することができ、その際、置換基は水素、アルキル、置換アルキル、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネートから選択され、
Ｒ１〜Ｒ１７のいずれかに置換基が存在する場合、Ｒ１〜Ｒ１７における置換基は、それぞれ独立して、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、アルキルオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルアリールオキシ、ポリエチレンオキシ、ポリプロピレンオキシ、スルファニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート基から選択され、
ここで用いるアルキルは、１〜２０炭素原子の長さをもつ直鎖もしくは分岐鎖アルキル、またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む１〜２０原子の長さをもつヘテロアルキル鎖であり、アリールは、５、６もしくは７員アリール環系、またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５、６もしくは７員ヘテロアリール環系であり、
Ｒ１３〜Ｒ１６のうち少なくとも１つは−Ｑ−Ｙであり、その際、Ｑ−Ｙはマレイミドであり、あるいはＱは共有結合であるか、あるいは直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ２１〜Ｃ２００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた２１〜２００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖であり、Ｙは官能基である］。

式Ｉ、式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）の化合物は、それぞれ、式Ｉについて挙げた定義により定めるフェニルフェナントリジンから誘導される２つの配位子、および１つの第３配位子を含む。

他の態様において、Ｒ１〜Ｒ１７は式ＩＩの化合物のＲ１〜Ｒ１７について前記に述べたものと同じ意味をもつ。
１態様において、Ｑ−Ｙはマレイミドである。

１態様において、Ｑは共有結合である。
１態様において、Ｑは、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ２１〜Ｃ２００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた２１〜２００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖である。

１態様において、Ｑは、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ２１〜Ｃ１００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた２１〜１００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖である。

１態様において、Ｑは、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ２１〜Ｃ５０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた２１〜５０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環系を含む主鎖を備えた前記の鎖である。

１態様において、本発明による式Ｉのイリジウムベースの錯体に含まれる官能基Ｙは、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、ヒドラジン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホロアミダイトからなる群から選択される。

１態様において、本発明による式Ｉのイリジウムベースの錯体に含まれる官能基Ｙは、カルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホロアミダイトからなる群から選択される。

特定の好ましい態様において、本発明による式Ｉのイリジウムベースの錯体に含まれる官能基Ｙは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびマレイミドからなる群から選択される。

前記に定めた式Ｉの化合物のいずれかの態様の組合わせはいずれも本発明の範囲に含まれるものとする。
今回、式Ｉのイリジウムベースの化学発光性化合物が将来の高感度ＥＣＬベース検出法のための標識として適切であることが、意外にも予想外に見出された。

式ＩＩおよびＩの化合物を製造するための方法
本発明は、１観点において、それぞれ式Ｉの化合物および式ＩＩの化合物を製造するための新規方法に関する。

式Ｉによる化合物は、たとえば(Lamansky, S., Inorg. Chem. 40 (2001) 1704-1711に基づいて)下記に従って合成できる：置換フェニル−フェナントリジン二量体イリジウム錯体の合成；この二量体をＱ−Ｙの前駆体と反応させて、式Ｉによる生成物を得る。

この方法によれば、たとえば下記のスキーム１に示すように式Ｉの化合物を得ることができる。

スキーム１：式Ｉの化合物の合成。試薬および条件：(i)：Ｎａ_２ＣＯ_３／２−エトキシエタノール；ｍは１〜１５の整数
出発物質として用いる置換フェニル−フェナントリジン二量体イリジウム錯体は、実施例（参照：実施例２）に示す方法およびたとえばEP 12179056.2に記載される方法により得ることができる。

フェニル−フェナントリジン二量体イリジウム錯体の製造のための出発物質として用いられる化合物は市販されており、あるいはたとえば実施例（参照：実施例１）に示す当業者に既知の方法により得ることができる。

式ＩＩによる化合物は、たとえば(Lamansky, S., Inorg. Chem. 40 (2001) 1704-1711に基づいて)下記に従って合成できる：置換フェニル−フェナントリジン二量体イリジウム錯体の合成；この二量体を、２〜５０の第３配位子部分を含むリンカーＱの前駆体と反応させて、式ＩＩによる生成物を得る。

この方法によれば、たとえば下記のスキーム２に示すように式ＩＩの化合物を得ることができる。

スキーム２：式ＩＩの化合物の合成。試薬および条件：(i)：Ｃｓ_２ＣＯ_３，ＤＭＦ
化合物ＮＨ_２−ＵＵＸＵＥＵＸＵＥＵＸＵＵ−ＯＨにおいて、Ｕはベータ−アラニン残基であり、Ｅはグルタミン酸残基であり、Ｘは下記の残基である：

出発物質として用いる置換フェニル−フェナントリジン二量体イリジウム錯体は、たとえば実施例（参照：実施例２）に示す当業者に既知の方法により得ることができる。
フェニル−フェナントリジン二量体イリジウム錯体の製造のための出発物質として用いられる化合物は市販されており、あるいはたとえば実施例（参照：実施例１）に示す当業者に既知の方法により得ることができる。

式ＩＩによる化合物は他の方法でも合成できる：置換フェニル−フェナントリジン二量体イリジウム錯体（たとえば、実施例２．２を参照）をまず、官能基（−Ｑ−）Ｚを含む第３配位子の誘導体とさらに反応させて、単量体イリジウム錯体にする。単量体イリジウム錯体は、たとえば式Ｉに挙げたものである。しかし、式ＩＩによる錯体の合成に用いるためには、式Ｉに挙げる化合物はさらにリンカーＱが式ＩＩに定めるＱ２であるものを含むであろう。この単量体イリジウム錯体を次いでさらにＱ２の前駆体と反応させる；これは、単量体イリジウム錯体の官能基と反応して共有結合を形成できる２〜５０の基を含む；こうして、再び共有結合を形成した後に式ＩＩによる化合物が得られる。

この方法によれば、たとえば下記のスキーム３に示すように式ＩＩの化合物を得ることができる。

スキーム３：式ＩＩの化合物の合成
式ＩＩまたは式Ｉの新規化合物を含むコンジュゲートおよび本発明のさらなる観点
１観点において、本発明は、本明細書中で前記に開示および定義したそれぞれ式ＩＩまたは式Ｉのイリジウムベースの電気化学発光性化合物、ならびにそれに共有結合した生体物質を含む、コンジュゲートに関する。適切な生体物質の例は、細胞、ウイルス、細胞内粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、細胞代謝産物、ハプテン、ホルモン、薬理作用物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸および糖である。

１態様において、本発明によるコンジュゲートの生体物質、すなわちそれぞれ式ＩＩまたは式Ｉによる化合物に共有結合したものは、親和性結合剤である。親和性結合剤は、他の分子に、これらの分子間の誘引性相互作用のため分子結合し、その結果、それらの分子が互いに近接した安定会合を生じることができる分子である。この分子結合の結果、分子複合体が形成される。複合体の構成要素間の誘引性結合は、普通は共有結合より弱い。本発明の場合、結合剤は親和性結合剤である；これは、親和性複合体、すなわちそれぞれの条件（たとえば、標準的な条件下の水性媒体）下で安定な複合体を結合できることを意味する。分子結合に関与できる分子にはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、および有機小分子、たとえば薬物が含まれるが、これらに限定されない。したがって、分子結合の結果として生成する複合体のタイプには下記のものが含まれる：タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ホルモン、タンパク質−薬物、抗原−抗体、受容体−リガンド、ビオチン−アビジンもしくはストレプトアビジン、核酸−相補的核酸、または受容体−受容体（アンチ）アゴニスト。

当業者に認識されるように、本発明によるコンジュゲートにおいて、それぞれ式ＩＩまたは式Ｉによる化合物の官能基Ｙは、親和性結合剤上の基との共有結合を形成するために使われ、もはやそのままでは存在しない。親和性結合試薬そのものが基Ｙと結合または反応するのに適した基を含まない場合、十分に確立された方法によってそのような基を容易に親和性結合剤に導入できる。

１観点において、本発明は、それぞれ式ＩＩまたは式Ｉの化合物の官能基Ｙを、官能基Ｙについて本明細書中で定めるように、親和性結合剤の適切な反応基と反応させることによりコンジュゲートを製造することに関する。この方法は、当業者が当業者に既知の標準法を用いて実施できる。

１観点において、本発明は、前記のコンジュゲートの製造方法により得られるコンジュゲートに関する。
さらに限定するつもりはないが、明瞭にするために、親和性結合剤は下記のいずれかを含むことができる：抗原、タンパク質、抗体、ビオチンまたはビオチンアナログおよびアビジンまたはストレプトアビジン、糖およびレクチン、酵素、ポリペプチド、アミノ基、核酸または核酸アナログおよび相補的核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン封鎖剤、受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニスト。たとえば、親和性結合剤は特異的結合対の一方のパートナーであってもよく、その際、その結合対の他方のパートナーは細胞表面または細胞内構造体上のターゲットと会合しているか、あるいはターゲットである。

１態様において、コンジュゲートは、それぞれ式ＩＩまたは式Ｉの化合物、およびそれに結合した、下記のものからなる群から選択される親和性結合剤を含む：タンパク質、抗原、抗体、ビオチン、ビオチンアナログ、アビジン、ストレプトアビジン、糖、レクチン、酵素、ポリペプチド、アミノ基、核酸、核酸アナログ、相補的核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン封鎖剤、受容体アゴニスト、および受容体アンタゴニスト。

好ましくは、親和性結合剤は親和性結合対のパートナーまたはメンバーであり、あるいはそれは当業者により、特異的結合対のパートナーまたはメンバーとも呼ばれる。
親和性結合剤はそれのターゲットに対して、たとえば特異的結合対の一方のメンバー（たとえば抗体）は特異的結合対の他方のメンバー（たとえばそれの抗原）に対して、少なくとも１０^７ｌ／ｍｏｌの親和性をもつ。親和性結合剤はそれのターゲットに対して、好ましくは１０^８ｌ／ｍｏｌ、またはよりさらに好ましくは１０^９ｌ／ｍｏｌの親和性をもつ。

１態様において、本発明は、親和性結合剤が抗原、抗体、ビオチンまたはビオチンアナログ、アビジンまたはストレプトアビジン、糖、レクチン、核酸または核酸アナログおよび相補的核酸、受容体およびリガンドからなる群から選択される、コンジュゲートに関する。

１態様において、本発明は、親和性結合剤が抗体、ビオチンまたはビオチンアナログ、アビジンまたはストレプトアビジン、および核酸からなる群から選択される、コンジュゲートに関する。

１態様において、コンジュゲートは、式ＩＩまたは式Ｉの化合物、およびタンパク質、抗原、抗体、ビオチン、ビオチンアナログ、アビジン、ストレプトアビジン、糖、レクチン、酵素、ポリペプチド、アミノ基、核酸、核酸アナログ、相補的核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン封鎖剤、受容体アゴニスト、または受容体アンタゴニストを含む。

１態様において、本発明によるコンジュゲートは、共有結合した状態で、本明細書中で前記に開示および定義したそれぞれ式ＩＩまたは式Ｉによる化合物、およびオリゴヌクレオチドまたは抗体である親和性結合剤を含む。

ビオチンアナログは、アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンである。
本明細書中で用いる用語“オリゴヌクレオチド”または“核酸”は、一般に、少なくとも８ヌクレオチド、最大で１０００ヌクレオチドを含む、短い、一般に一本鎖のポリヌクレオチドを表わす。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ヌクレオチドの長さをもつであろう。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチドを越えない長さをもつであろう。

用語オリゴヌクレオチドは幅広く理解すべきであり、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにそのアナログおよび修飾体を含む。
核酸アナログは、たとえば標準的な塩基であるデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、デオキシウラシル（ｄＵ）に置換基を保有する、置換ヌクレオチドを含むことができる。そのような置換された核酸塩基の例は下記のものである：５−置換ピリミジン類、たとえば５ メチルｄＣ、アミノアリルｄＵまたはｄＣ、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５−プロピニル−ｄＵまたは−ｄＣ、５ ハロゲン化−ｄＵまたは−ｄＣ；Ｎ置換ピリミジン類、たとえばＮ４−エチル−ｄＣ；Ｎ置換プリン類、たとえばＮ６−エチル−ｄＡ、Ｎ２−エチル−ｄＧ；８ 置換プリン類、たとえば８−［６−アミノ）−ヘキサ−１−イル］−８−アミノ−ｄＧまたは−ｄＡ、８ ハロゲン化ｄＡまたはｄＧ、８−アルキルｄＧまたはｄＡ；および２ 置換ｄＡ、たとえば２ アミノｄＡ。

核酸アナログは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドのアナログを含むことができる。すなわち、天然の核酸塩基をたとえば下記の核酸塩基アナログの使用により交換することができる：５−ニトロインドール−ｄ−リボシド；３−ニトロ−ピロール−ｄ−リボシド、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキシキサントシン（ｄＸ）；７ デアザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；８−アザ−ｄＡ、−ｄＧ、−ｄＩまたは−ｄＸ；ｄ−ホルマイシン(Formycin)；シュードｄＵ；シュードイソｄＣ；４ チオｄＴ；６ チオｄＧ；２ チオｄＴ；イソｄＧ；５−メチル−イソ−ｄＣ；Ｎ８−連結した８−アザ−７−デアザ−ｄＡ；５，６−ジヒドロ−５−アザ−ｄＣ；およびエテノ−ｄＡまたはピロロ−ｄＣ。当業者に自明のとおり、相補鎖中の核酸塩基は、デュプレックス形成が特異的なものであるように選択されるべきである。たとえば、５−メチル−イソ−ｄＣを一方の鎖（たとえば、（ａ））に用いる場合、イソｄＧが相補鎖（たとえば、（ａ’））中になければならない。

核酸アナログでは、オリゴヌクレオチド主鎖を、置換糖残基、糖アナログ、ヌクレオシド間リン酸部分における修飾体が含まれるように、および／またはＰＮＡであるように、修飾することができる。

オリゴヌクレオチドは、たとえば置換デオキシリボース、たとえば２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−メチルセレノ、２’−アリルオキシ、４’−メチルｄＮ（ここで、Ｎは核酸塩基、たとえばＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵである）をもつヌクレオチドを含むことができる。

糖アナログは、たとえば下記のものである：キシロース；２’，４’架橋リボース、たとえば（２’−Ｏ， ４’−Ｃ メチレン）−（ＬＮＡとして知られるオリゴマー）または（２’−Ｏ， ４’−Ｃ エチレン）−（ＥＮＡとして知られるオリゴマー）；Ｌ−リボース、Ｌ−ｄ−リボース、ヘキシトール（ＨＮＡとして知られるオリゴマー）；シクロヘキセニル（ＣｅＮＡとして知られるオリゴマー）；アルトリトール(altritol)（ＡＮＡとして知られるオリゴマー）；三環式リボースアナログ：Ｃ３’とＣ５’原子がエチレン橋により連結され、それがシクロプロパン環に縮合したもの（トリシクロＤＮＡとして知られるオリゴマー）；グリセリン（ＧＮＡとして知られるオリゴマー）；グルコピラノース（ホモＤＮＡとして知られるオリゴマー）；カルバリボース(carbaribose)（テトラヒドロフランサブユニットの代わりにシクロペンタンを含むもの）；ヒドロキシメチル−モルホリン（モルホリノＤＮＡとして知られるオリゴマー）。

ヌクレオシド間リン酸部分の多数の修飾がハイブリダイゼーション特性を妨げないことも知られており、そのような主鎖修飾を置換ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと組み合わせることもできる。例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネート型のオリゴヌクレオチドである。

ＰＮＡ（ホスフェートおよびｄ−リボースを含まない主鎖をもつもの）も、ＤＮＡアナログとして使用できる。
前記の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびオリゴヌクレオチド主鎖修飾体を、所望により本発明の意味におけるオリゴヌクレオチド中に組み合わせることができる。

本明細書において用語“抗体”は、最も広い意味で用いられ、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメント（それらが目的とする生物活性を示す限り）を含む。

“単離された”抗体は、同定され、そしてそれの自然環境の成分から分離および／または回収されたものである。それの自然環境の混在成分は、その抗体についての研究、診断または療法使用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む可能性がある。ある態様において、抗体は下記の程度にまで精製される：（１）たとえばローリー(Lowry)法により決定して、９５重量％を超える抗体にまで、ある態様においては９９重量％を超えるまで；（２）たとえばスピニングカップシークエネーター(spinning cup sequenator)の使用により、少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで、または（３）たとえばクーマシーブルーもしくは銀染色を用いて、還元性もしくは非還元性の条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性にまで。単離された抗体には、組換え細胞内の原位置にある抗体が含まれる；その抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないであろうから。しかし、通常は単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。

“天然抗体”は、通常は２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体状の糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結し、一方、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖間ではジスルフィド結合の数が異なる。重鎖および軽鎖それぞれも、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド橋をもつ。重鎖はそれぞれ一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多数の定常ドメインをもつ。軽鎖はそれぞれ一端に可変ドメイン（ＶＬ）、およびそれの他端に定常ドメインをもつ；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインとアラインし、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインしている。特定のアミノ酸残基類が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の境界を形成すると考えられる。

抗体の“可変領域”または“可変ドメイン”は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを表わす。重鎖の可変ドメインを“ＶＨ”と呼ぶことができる。軽鎖の可変ドメインを“ＶＬ”と呼ぶことができる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含む。

用語“可変”は、可変ドメインの特定部分の配列が抗体間で著しく異なり、特定の抗原に対する特定の抗体それぞれの結合および特異性に使われるという事実を表わす。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインにおいて、超可変領域(ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、概してベータシートコンフィギュレーションをとる４つのＦＲ領域を含み、それらが３つのＨＶＲにより連結され、これらはループを形成してベータシート構造を連結し、ある場合にはベータシート構造の一部を形成している。各鎖のＨＶＲはＦＲ領域によって互いに近接した状態に保持され、他方の鎖からのＨＶＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(参照：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991))。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接には関与しないが、さまざまなエフェクター機能、たとえば抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与を示す。

いずれかの脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の“軽鎖”は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明瞭に異なるタイプのうちの１つに配属できる。

抗体（免疫グロブリン）は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに配属できる。５つの主クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちの幾つかをさらにサブクラス（イソ型）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類できる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは周知であり、たとえば、Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co. (2000)に全般的に記載されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合により形成された、より大きな融合分子の一部である可能性がある。

用語“全長抗体”、“無傷抗体”、および“全抗体”は、本明細書中で互換性をもって用いられ、下記に定める抗体フラグメントではなく、実質的にそれの無傷形態の抗体を表わす。これらの用語は特にＦｃ領域を含む重鎖を備えた抗体を表わす。

“抗体フラグメント”は、無傷抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む部分を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ディアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。

抗体のパパイン消化により、それぞれ単一の抗原結合部位を備えた“Ｆａｂ”フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合性フラグメント、および残りの“Ｆｃ”フラグメント（それの名称はそれが容易に結晶化しうることを反映する）が生成する。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、それらは２つの抗原結合部位をもち、なお抗原を架橋できる。

“Ｆｖ”は完全な抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。１態様において、二本鎖Ｆｖ種は、緊密に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種においては、軽鎖と重鎖を二本鎖Ｆｖ種の場合と同様に“二量体”構造で会合させることができるように、柔軟なペプチドリンカーにより１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを共有結合させることができる。それぞれの可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面にある抗原結合部位を規定するのは、このコンフィギュレーションにおいてである。全体として、これら６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち、抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含む半分のＦｖ）ですら、結合部位全体より低い親和性においてではあるが、抗原を認識して結合する能力をもつ。

Ｆａｂフラグメントは重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、かつ軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）をも含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む数個の残基が付加されていることにより、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’の表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来、それらの間にヒンジシステイン類をもつ一対のＦａｂ’フラグメントとして生成した。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。

“一本鎖Ｆｖ”または“ｓｃＦｖ”抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、その際、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、ｓｃＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの総説については、たとえば、Plueckthun, : The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) pp. 269-315を参照。

用語“ディアボディ(diabody)”は、２つの抗原結合部位を備えた抗体フラグメントを表わし、それらのフラグメントは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で連結したものを含む。同一鎖上の２つのドメイン間で対合できるには短すぎるリンカーを用いることにより、それらのドメインは他の鎖の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を形成するように強制される。ディアボディは二価または二重特異性である可能性がある。ディアボディは、たとえばEP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134;およびHolliger, P. et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448に、より十分に記載されている。トリアボディ(triabody)およびテトラボディ(tetrabody)も、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134に記載されている。

本明細書中で用いる用語“モノクローナル抗体”は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を表わし、すなわちその集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在する可能性がある変異、たとえば自然に起きる変異を除いて、同一である。したがって、“モノクローナル”という修飾語は、別の抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。特定の態様において、そのようなモノクローナル抗体には一般にターゲットを結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、その際、ターゲットを結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一のターゲット結合ポリペプチド配列を選択するプロセスにより得られたものである。たとえば、この選択プロセスは、複数のクローンから、たとえばハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールから、ユニークなクローンを選択するものであってもよい。たとえば、ターゲットに対する親和性を改善する、ターゲット結合配列をヒト化する、細胞培養におけるそれの産生を改善する、それのインビボ免疫原性を低下させる、多重特異性抗体を作成する、などのために、選択したターゲット結合配列をさらに変更できること、またその変更されたターゲット結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解すべきである。一般に異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含有するポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。モノクローナル抗体調製物は、それらの特異性に加えて、一般に他の免疫グロブリンが混在しないという点で有利である。

前記のように、本明細書に開示する化合物およびコンジュゲートはきわめて好ましい特性をもつ。たとえば、開示する化合物またはコンジュゲートはそれぞれ、高いＥＣＬ効率を示す。この高い効率は、有機溶媒中で分析した場合にのみ高いＥＣＬ効率を示した多くのＥＣＬ標識と比較して、対応する測定を水性の系で実施しても存在する。たとえば、多くのＯＬＥＤ色素は、通常はアセトニトリル中で分析され、水溶液には溶解できないか、あるいは溶解できるとしても水溶液中では効率的な電気化学発光を示さない。

好ましい１態様において、本発明は、電気化学発光反応を水溶液中で実施するための、本発明に開示する化合物またはコンジュゲートそれぞれの使用に関する。水溶液は、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）の水を含むいずれかの溶液である。明らかに、そのような水溶液はさらに、緩衝化合物、界面活性剤、およびたとえばＥＣＬ反応における電子ドナーとしての第三級アミン、たとえばトリプロピルアミンなどの成分を含有することができる。

１観点において、本発明は、電気化学発光ベースの検出法における、本発明に開示する化合物またはコンジュゲートそれぞれの使用に関する。
１観点において、本発明は、分析物の検出における、本発明に開示する化合物またはコンジュゲートそれぞれの使用に関する。

本発明による分析物は、いずれかの無機分子または有機分子であってよく、これには目的とするいずれかの生体物質が含まれる。本発明の意味における分析物である適切な生体物質の例は、細胞、ウイルス、細胞内粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、細胞代謝産物、ハプテン、ホルモン、薬理作用物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸および糖である。

分析物は、ポリペプチド、炭水化物、および無機または有機の薬物分子からなる群から選択できる。
ポリペプチドまたはタンパク質は、本質的にアミノ酸から構成される、ペプチド結合により連結した少なくとも２つのアミノ酸をもつ分子である。本明細書に開示する方法で調べるべき目的分析物の場合、ポリペプチドは好ましくは少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５および３０ないし最大で約１０，０００個のアミノ酸からなるであろう。好ましくは、ポリペプチドは５から２，０００個まで、同様に好ましくは１０から１，０００個までのアミノ酸を含むであろう。

分析物が核酸である場合、これらの核酸は好ましくは天然のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
１観点において、本発明は、in vitro 法により分析物を測定するための方法であって、下記の工程を含む方法に関する：（ａ）分析物を含む疑いがあるかまたは含むことが分かっている試料を用意し、（ｂ）その試料と、親和性結合剤と本発明に開示する式ＩＩによる化合物とのコンジュゲートを、分析物−コンジュゲート複合体の形成に適した条件下で接触させ、（ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得る。

１態様において、分析物を測定するとは、試料中の分析物の量を検出することを意味する。
１態様において、分析物の検出のための前記方法における測定は、電気化学発光ベースの検出法を用いて実施される。同様に好ましくは、本方法は水溶液中で実施される。

以下の実施例は本発明の理解を補助するために提示され、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に述べられている。述べられた方法において本発明の精神から逸脱することなく改変を行なうことができると理解される。

本明細書に示したすべての特許および刊行物を全体として本明細書に援用する。

実施例１
置換フェニルフェナントリジン類の合成
実施例１．１
置換２−アミノビフェニル類の合成のための一般法：
Youn, S.W., Tetrahedron Lett. 50 (2009) 4598-4601により記載された鈴木−宮浦カップリング反応を用いて、市販の２−ブロモアニリン誘導体と対応するアリールボロン酸の間で、フェナントリジン類へのさらなる反応に必要な適切な２−アミノビフェニル類を合成することができる。

実施例１．２
置換フェナントリジン類の合成のための一般法：
２−アリールアニリン１（０．０１ｍｏｌ）のクロロホルム（２０ｍｌ）中における氷冷溶液に、アリール酸クロリド２（０．０１ｍｏｌ）を添加し、不活性条件下に室温で３０分間撹拌した。得られた混合物を、次いで２時間、撹拌しながら還流させた。反応混合物を、ピリジン（０．０２ｍｏｌ，１０ｍｌのクロロホルム中）の滴加により６０分間かけて処理した。混合物を室温に放冷し、一夜撹拌した。混合物を０．５Ｍ ＨＣｌで十分に洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより３：２ ヘキサン／酢酸エチルで精製して、純粋な生成物３を６６％の収率で得た；
ベンズアミド−２−ビフェニル３（０．０１ｍｏｌ）およびＰＯＣｌ_３（５ｍｌ）を２０ｍｌのトルエン中で窒素下に１８時間、還流および撹拌した；Lion, C., Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566に記載された方法に従う。冷却した反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍｌ）で希釈し、氷に注入し、２５％ ＮＨ_４ＯＨおよび蒸留水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空中で濃縮し、続いてフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル，１：１ ヘキサン／酢酸エチル）により生成物４である６−フェニルフェナントリジンを得た。

収率: 52%. 白色固体. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 7.54-7.85 (m, 9H), 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.67 (d, J = 8.4 Hz, 1H)。

２−ナフタレン−２−イル−フェニルアミンを２−アリール−アニリンの代わりに用いると下記のものが得られる：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.64 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.29 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.92 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 7.48 Hz, 1H), 7.79-7.75 (m, 2H), 7.69 (t, J = 14.0, 8.2 Hz, 1H), 7.63-7.61 (m, 2H), 7.53-7.46 (m, 4H), 7.19 (t, J = 14.3, 7.2 Hz, 1H).
MS: [M+H]⁺306.3。

ナフタレン−カルボニルクロリドをフェニル酸クロリドの代わりに用いると下記のものが得られる：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.65 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.27 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.97-7.94 (m, 2H), 7.90-7.85 (m, 2H), 7.80-7.69 (m, 2H), 7.62 (t, J= 14.2, 7.1 Hz, 1H), 7.59-7.55 (m, 2H).
MS: [M+H]⁺ 306.3。

実施例１．３
６−（２−スルホフェニル）フェナントリジンの合成方法
６−（２−スルホフェニル）フェナントリジンは、アリールアニリン（０．０１ｍｏｌ）を２−スルホ安息香酸 環状無水物（０．０１ｍｏｌ）と共にＣＨ_３ＣＮ中で６時間、穏やかに加熱することにより合成できる；Nicolai, E., Chem. Pharm. Bull. 42 (1994) 1617-1630に記載された方法を使用；
精製後、実施例１．２に記載された方法に基づいて生成物を適切なフェナントリジンに変換できる。

実施例１．４
６−フェニル−アルキルスルホニルフェナントリジンの合成方法
６−フェニル−アルキルスルホニルフェナントリジンは、アルキルスルホニル−アリールアニリン（０．０１ｍｏｌ）を安息香酸クロリド（０．０１ｍｏｌ）と共にクロロホルム中で穏やかに加熱することにより合成できる；Lion, C., Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566に記載された方法を使用；実施例１．２を参照；
精製後、実施例１．２に記載された方法に基づいて生成物を適切なフェナントリジンに変換できる。

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.92 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.75 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.68 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.35 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 15.3, 7.1 Hz, 1H), 7.81-7.73 (m, 3H), 7.64-7.56 (m, 3H) 3.12 (s, 3H).
MS: [M+H]+ 334,3
６−（４−メチルスルホフェニル）フェナントリジンも、Cymerman, J., J. Chem. Soc. (1949) 703-707に記載された方法に従って合成できる。

実施例１．５
６−［４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェニル］−フェナントリジンの合成

２，５，８，１１−テトラオキサトリデカン−１３−オール トシレートの合成：
方法: (JACS, 2007, 129, 13364) ２，５，８，１１−テトラオキサトリデカン−１３−オール（７ｇ，３３．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．９ｍｌ，３５．３ｍｍｏｌ）の、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍｌ）中における溶液に、４−トルエンスルホニルクロリド（６．７ｇ，３５．３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１２０ｍｇ）を添加した。混合物を室温で２０時間撹拌した。反応混合物を８０ｍＬのＨＣｌ（１Ｍ）、次いで水で洗浄した。抽出液を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発させた。残留物をそれ以上精製せずに次の工程に用いた。
収量: 11.0 g (90%)
NMR:
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.75 - 7.64 (m, 2H), 7.31 - 7.26 (m, 2H), 4.16 - 4.06 (m, 2H), 3.62 (m 2H), 3.59 - 3.40 (m, 10H), 3.30 (s, 3H), 2.38 (s, 3H).
¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 144.75 (s), 132.90 (s), 129.77 (s), 127.8 (s), 71.82 (s), 70.60 (s), 70.48 (s), 70.47 (s), 70.41 (s), 70.39 (s), 69.23 (s), 68.55 (s), 58.90 (s), 21.53 (s)。

４−ＰＥＧ４−安息香酸エチルエステルの合成：
方法：(JACS 129 (2007) 13364) 化合物２，５，８，１１−テトラオキサトリデカン−１３−イル ４−メチルベンゼンスルホン酸エチル（８．１ｇ，２２．３ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル（３．７ｇ，２２．３ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３（１５．４ｇ，１１１．５ｍｍｏｌ）および１８−クラウン−６（０．５９ｇ，２．２ｍｍｏｌ）の混合物を、アセトン（１２０ｍｌ）中で２２時間還流した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチルで抽出した。抽出液をＨ_２Ｏで洗浄し、無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過した。濾液を蒸発乾固し、残留物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝１００：１）により精製して、上記化合物（１．９３ｇ，８８％）を得た。
収量: 7 g (88%)
NMR:
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.01 - 7.84 (m, 2H), 6.96 - 6.85 (m, 2H), 4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.12 (dd, J = 5.4, 4.3 Hz, 2H), 3.82 (dd, J = 5.4, 4.2 Hz, 2H), 3.71 - 3.56 (m, 10H), 3.51 - 3.45 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 166.29 (s), 162.47 (s), 131.45 (s), 123.01 (s), 114.11 (s), 71.90 (s), 70.84 (s), 70.60 (s), 70.59 (s), 70.58 (s), 70.48 (s), 69.51 (s), 67.54 (s), 60.57 (s), 58.98 (s), 14.35 (s).
MS(+):
[M+Na⁺]⁺= 計算値 379.1727, 実測値 379.1743。

４−ＰＥＧ４−安息香酸の合成：
方法：(JACS, 2007, 129, 13364) 化合物４−（２，５，８，１１−テトラオキサトリデカン−１３−イルオキシ）安息香酸エチル（７ｇ，１９．６ｍｍｏｌ）およびＫＯＨ（２．３ｇ，４１．２４ｍｍｏｌ）の、２００ｍＬのＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１ ｖ／ｖ）中における混合物を、一夜還流した。冷却した後、混合物をＨＣｌ（２Ｎ）で中和した。得られた混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、蒸発乾固した。得られた白色固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサン中で再結晶した。
収量: 5.3 g (85%)
NMR:
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 11.17 (s, 1H), 8.14 - 7.89 (m, 2H), 7.03 - 6.75 (m, 2H), 4.29 - 4.02 (m, 2H), 3.92 - 3.81 (m, 2H), 3.78 - 3.57 (m, 10H), 3.57 - 3.46 (m, 2H), 3.35 (s, 3H).
¹³C{¹H} NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 171.46 (s), 163.24 (s), 132.30 (s), 121.98 (s), 114.33 (s), 71.96 (s), 70.91 (s), 70.67 (s), 70.66 (s), 70.64 (s), 70.54 (s), 69.55 (s), 67.66 (s), 59.08 (s).
MS(-):
[M-H]^-= 計算値 327.1438, 実測値 327.1456。

Ｎ−ビフェニル−２−イル−４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンズアミドの合成：
方法：４−（２，５，８，１１−テトラオキサトリデカン−１３−イルオキシ）安息香酸（３ｇ，９．１４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ ０．２ｍＬの、乾燥ＤＣＭ ３０ｍＬ中における溶液に、０℃で、塩化オキサリル（１．０５ｍＬ，１２．３４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。溶液を濃縮乾固した。油状残留物をそれ以上精製せずに次の工程に用いた；
２−フェニルアニリン（１．６ｇ）、ピリジン（２．４ｍＬ）の、クロロホルム（８０ｍＬ）中における溶液を、不活性雰囲気下で０℃にまで冷却した。２０ｍＬ中の（フェニル−４−（２，５，８，１１−テトラオキサトリデカン−１３−イルオキシ）ベンゾイルクロリド（３．１ｇ，９．１４ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加し、最終混合物を室温に達するまで放置した。この溶液を２時間還流し、室温で一夜撹拌した。反応混合物をＨＣｌ（１Ｍ，２×１００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ_３（１００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で抽出した。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、シリカゲルにおけるクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製した。
収量: 4.1 (90%)
NMR:
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.49 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.61 - 7.35 (m, 9H), 7.33 - 7.25 (m, 1H), 7.19 (m, 1H), 6.91 - 6.84 (m, 2H), 4.16 - 4.10 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.77 - 3.58 (m, 10H), 3.56 - 3.49 (m, 2H), 3.36 (s, 3H).
¹³C{¹H} NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 164.56 (s), 161.65 (s), 138.18 (s), 135.12 (s), 132.32 (s), 129.97 (s), 129.39 (s), 129.22 (s), 128.66 (s), 128.57 (s), 128.16 (s), 127.13 (s), 124.18 (s), 121.23 (s), 114.57 (s), 71.95 (s), 70.89 (s), 70.64 (s), 70.63 (s), 70.54 (s), 69.54 (s), 67.63 (s), 59.04 (s), 53.51 (s).
MS(+)
[M+H]⁺= 計算値 480.2386 実測値 480.2383; [M+Na]⁺= 計算値 502.2200, 実測値 502.2204。

６−［４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェニル］−フェナントリジンの合成：
方法：Ｎ−ビフェニル−２−イル−４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ベンズアミド（４ｇ，８．３４ｍｍｏｌ）、ＰＯＣｌ_３（１０ｍｌ）を、１０ｍｌのトルエン中で２０時間還流した。混合物を室温にまで冷却し、１００ｍｌのジクロロメタンを添加した。この溶液を氷に注入し、混合物をＮＨ_４ＯＨ（２０％）で中和した。有機相を抽出し、順に蒸留水およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた。得られた溶液をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル，酢酸エチル／ヘキサン １：１中，Ｒ_ｆ＝０．１４）により精製した。
収量: 1 g (25%)
NMR:
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.59 (dd, J = 8.1, 1.4 Hz, 1H), 8.23 (dd, J = 8.1, 1.1 Hz, 1H), 8.15 (dd, J = 8.3, 0.7 Hz, 1H), 7.84 (ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H), 7.79 - 7.57 (m, 5H), 7.15 - 7.03 (m, 2H), 4.29 - 4.19 (m, 2H), 3.93-3.90 (m, 2H), 3.80 - 3.60 (m, 12H), 3.59 - 3.49 (m, 2H), 3.37 (s, 3H).
¹³C{¹H} NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 160.92 (s), 159.45 (s), 143.84 (s), 133.59 (s), 131.26 (s), 130.61 (s), 130.26 (s), 129.05 (s), 128.90 (s), 127.19 (s), 126.85 (s), 125.39 (s), 123.70 (s), 122.29 (s), 122.01 (s), 114.68 (s), 72.02 (s), 70.97 (s), 70.74 (s), 70.72 (s), 70.69, 70.62 (s), 69.80 (s), 67.68 (s), 59.15 (s).
MS (+) JM358-F5, [M+H]⁺ 計算値 = 462,2280, 実測値 462.2275。

実施例１．６：
３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホン酸セシウム塩の合成

６−（４−メトキシフェニル）フェナントリジンを、前記の方法に従ってＮ−（ビフェニル−２−イル）−４−メトキシベンズアミド（２ｇ，６．５９ｍｍｏｌ）の環化により製造した。この化合物をクロマトグラフィーによりジクロロメタン／ヘキサン（勾配１：５−１：１）で精製した。収率：８７％。
NMR : ¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.84 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 8.18 - 8.05 (m, 2H), 7.97 (ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H), 7.86 - 7.62 (m, 5H), 7.23 - 7.07 (m, 2H), 3.88 (s, 3H).
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.70 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.61 (dd, J = 8.1, 1.3 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 8.3, 0.7 Hz, 1H), 7.86 (ddd, J = 8.3, 7.1, 1.3 Hz, 1H), 7.81 - 7.56 (m, 5H), 7.18 - 7.02 (m, 2H), 3.92 (s, 3H).
¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 160.95 (s), 160.33 (s), 143.72 (s), 133.67 (s), 132.12 (s), 131.36 (s), 130.71 (s), 130.20 (s), 129.13 (s), 128.97 (s), 127.23 (s), 126.92 (s), 125.40 (s), 123.73 (s), 122.33 (s), 122.03 (s), 114.03 (s), 55.57 (s).
MS [ESI-MS (+)]: [M+H⁺]^- 実測値 286.1231, 計算値 286.1226。

４−フェナントリジン−６−イル−フェノール：６−（４−メトキシフェニル）フェナントリジンの脱保護を、ＨＢｒを用いて達成した。６−（４−メトキシフェニル）フェナントリジン（１ｇ，３．５ｍｍｏｌ）の懸濁液１５ｍＬ（ＨＢｒ，４７％）を、１００℃で１２時間還流した。混合物を室温にまで冷却し、氷水に注入し、Ｎａ_２ＣＯ_３で中和した。生じた沈殿を濾別し、水およびＥｔ_２Ｏで洗浄した。この固体をクロマトグラフィーカラムによりジクロロメタン／ＭｅＯＨを用いて精製した。収率：９０％。
NMR: ¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 9.84 (s, 1H), 8.92 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.82 (dd, J = 8.2, 1.2 Hz, 1H), 8.20 - 8.11 (m, 1H), 8.08 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 1H), 8.02 - 7.88 (m, 1H), 7.84 - 7.64 (m, 3H), 7.64 - 7.49 (m, 2H), 7.06 - 6.89 (m, 2H).
MS [ESI-MS (-)]: [M-H⁺]^- 実測値 270.0922, 計算値 270.0924。

４−（フェナントリジン−６−イル）フェノール（３２０ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍｌ）中における溶液に、Ｃｓ_２ＣＯ_３（４８２．２ｍｇ，１．４８ｍｍｏｌ）および１，３−プロピルスルトン(1,3-propylsultone)（１５９ｍｇ，１．３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一夜撹拌した。反応混合物を濃縮乾固し、残留物をクロマトグラフィーカラム（シリカ）によりジクロロメタン／ＭｅＯＨ（勾配１０：１−５：１）を用いて精製した。収率：７２％。
NMR: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8.98 - 8.87 (m, 1H), 8.83 (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 1H), 8.12 (m, 2H), 7.97 (ddd, J = 8.3, 7.0, 1.3 Hz, 1H), 7.85 - 7.69 (m, 3H), 7.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.19 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.64 - 2.57 (m, 2H), 2.15 - 1.97 (m, 2H).
MS [EI-MS (-)]: [M-Cs⁺]^- 計算値 392.0956. 実測値 392.0962。

実施例２
クロロ架橋した二量体錯体の合成のための一般法：
一般法はNonoyama, M., J. Organomet. Chem. 86 (1975) 263-267により公開された；
イリジウム二量体を下記に従って合成した：ＩｒＣｌ_３・３Ｈ_２Ｏおよび２．５当量の６−フェニルフェナントリジンを窒素下に１２０℃で１８時間、２−エトキシエタノール／水混合物（３：１，ｖ／ｖ）中で加熱した。室温に冷却した後、沈殿を濾別し、順にメタノールおよびＥｔ_２Ｏで洗浄し、乾燥させて、目的とする二量体を得た。

実施例２．１
非置換フェニルフェナントリジンを含む錯体

［（６−フェニルフェナントリジン）_２ＩｒＣｌ］_２
収率: 71%. 褐色固体. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6.45 (d, J = 6.8, 4H), 6.58 (t, J = 7.1, 13.9 Hz, 4H), 6.95 (t, J = 7.1, 14.2 Hz, 4H), 7.56 (t, J = 7.4, 16.0 Hz, 4H), 7.68 (t, J = 8.1, 16.2 Hz, 4H), 7.93 (t, J = 8.0, 14.6 Hz, 4H), 8.07-8.13 (m, 8H), 8.80 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 8.93-9.01 (m, 12H)。

実施例２．２
置換フェニルフェナントリジンを含む錯体

６−［４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェニル］−フェナントリジン（１ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）、ＩｒＣｌ_３・３Ｈ_２Ｏ（３４６ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）の、１６ｍｌの２−ＥｔＯＥｔＯＨ：Ｈ_２Ｏ（１２：４）中における混合物を、窒素雰囲気下で一夜還流した。反応混合物を室温にまで冷却し、６０ｍｌの水を添加すると、油状沈殿が得られた。上清を廃棄し、５０ｍｌの水を残留物に添加した。混合物を１時間撹拌すると赤褐色の沈殿が得られた。この固体を濾過し、水（５０ｍｌ）およびＥｔ_２Ｏ（３０ｍｌ）で洗浄した。褐色の固体を比較的少量のジクロロメタンに溶解し、Ｅｔ_２Ｏを添加すると沈殿した。それをそれ以上精製せずに次の工程に用いた。
収量: 550 mg (50%)
NMR:
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.74 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 8.36 (dd, J = 8.0, 5.2 Hz, 8H), 7.90 (dd, J = 14.7, 7.7 Hz, 8H), 7.81 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 7.79 - 7.67 (m, 4H), 6.78 - 6.65 (m, 4H), 6.32 (dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 4H), 5.89-5.83 (m, 4H), 5.28 (d, J = 2.5 Hz, 4H), 3.67-3.10 (m, 100H, PEG鎖,若干の不純物を含有)
MS(ESI-MS(+)):
[M+2Na⁺]²⁺ 計算値 1171.3463, 実測値 1171.3473; [(C^N)₂Ir]⁺ = 計算値 1113.3877, 実測値 1113.3892。

３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホン酸セシウム塩を含むビス−イリジウム錯体の合成

配位子３−（４−（フェナントリジン−６−イル）フェノキシ）プロパン−１−スルホン酸セシウム（５００ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）およびＩｒＣｌ_３（１５９．５ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）の、２−ＥｔＯＥｔＯＨ：水（３：１，１６ｍｌ）混合物中における混合物を、窒素雰囲気下で３６時間還流した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残留物をそれ以上精製せずに次の工程に用いた。
MS [ESI-MS(-)]: [Ir(C^N)₂-2Cs⁺]^- 計算値 975.13858, 実測値 975.13882。

実施例３
Ａ）カルボキシアルキレンオキシ−ピコリン酸誘導体の合成：
３−ヒドロキシ−２−ピリジンカルボン酸（０．０１ｍｏｌ）、４−ブロモブタン酸エチルまたは６−ブロモヘキサン酸エチル（０．０２１ｍｏｌ）、およびＤＭＦ中の炭酸カリウム混合物（５当量）（２０ｍｌ）の混合物を、９０℃で２０時間、窒素下に加熱した。冷却した後、反応混合物を氷−水混合物に注入し、ジクロロメタン（３０ｍｌ）で３回抽出し、無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発乾固した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン／酢酸エチル ３：１）により精製して、生成物を得た(Patent US 5,219,847に基づく)；
形成されたエステルをＭｅＯＨ中のＮａＯＨ（ｐＨ＝１０）により加水分解した。次いで溶液のｐＨを６．０に調整し、室温で一夜撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物をヘキサン／アセトンから結晶化して、目的生成物を得た。

３−（カルボキシ−ペンチルオキシ）−ピリジン−２−カルボン酸. 収率: 51%. 灰色固体. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 1.39-1.45 (m, 2H), 1.51-1.57 (m, 2H), 1.67-1.74 (m, 2H), 2.19-2.23 (m, 2H), 4.04-4.07 (m, 2H), 7.47-7.50 (m, 1H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.1 Hz, 1H)。

Ｂ）５−［４−（２−カルボキシ−エチル）−フェニル］−ピリジン−２−カルボン酸の合成
アルゴン雰囲気下で、４ｍｌの１，２−ジメトキシエタンに、５−ブロモ−ピリジン−２−カルボン酸（９３ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、４−（２−カルボキシエチル）ベンゼンボロン酸（１０６ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、０．５１ｍｌの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液およびジクロロビス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（２０ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を９０℃で一夜撹拌し、水で冷却および停止する。酢酸エチルを添加し、混合物を１Ｍ塩酸でｐＨ＝２に調整する。酢酸エチルで３回抽出した後、有機層を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させる。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ジクロロメタン／メタノール ５：１）により精製する。

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.00 (d, J = 2 Hz, 1H), 8.25 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H), 8.11 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 15, 7.5 Hz, 2H), 2.61 (t, J = 15.1, 7.6 Hz, 2H).
MS: [M+H]⁺ 272.3。

実施例４
イリジウム錯体合成のための一般法
クロロ架橋した二量体錯体０．５ｍｍｏｌ、ピコリネート１．２５ｍｍｏｌおよびＮａ_２ＣＯ_３ ３ｍｍｏｌを、２−エトキシエタノール（１２ｍｌ）に混入し、１２０℃で１５時間加熱した。冷却した混合物に蒸留水（２５ｍｌ）を添加し、粗生成物を次いで濾別し、水、続いて少量ずつのｎ−ヘキサンおよびＥｔ_２Ｏで洗浄した。生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，ｎ−ヘキサン／ジクロロメタン）により精製して、赤色粉末を得た。
(Lamansky, S., Inorg. Chem. 40 (2001) 1704-1711に基づく)。

Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ピリジン−２−カルボン酸

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.17 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 9.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.71 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.62 (t, J = 14.8, 7.8 Hz, 2H), 8.43-8.33 (m, 4H), 8.23 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.92-7.77 (m, 4H), 7.65 (t, J = 15, 7.9 Hz, 2H), 7.57-7.46 (m, 3H), 7.36 (t, J = 14.8, 7.8 Hz, 1H), 7.19-7.16 (m, 2H), 7.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.04 (t, J = 14.2, 6.8 Hz, 1H), 6.92 (t, J = 14.1, 6.7 Hz, 1H), 6.80 (t, J = 13.7, 6.8 Hz, 1H), 6.67 (t, J = 13.7, 6.6 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 6.8 Hz, 1H).
MS: [M+H]+ 実測値 824.1891, 計算値 824.1886; [M+Na+]+ 実測値 846.1701, 計算値 846.1706。

Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ５−（メトキシ）ピリジン−２−カルボン酸：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.15 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 9.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.61 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.44-8.35 (m, 3H), 8.21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 2.7, 1H), 7.91-7.86 (m, 2H), 7.82-7.80 (m, 2H), 7.68 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.57-7.53 (m, 3H), 7.36 (t, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 15.1, 7.6 Hz, 1H), 7.08-6.93 (m, 4H), 6.78 (t, J = 14.9, 7.6 Hz, 1H), 6.65 (t, J = 14.8, 7.6 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H).
MS: [M+H]⁺ 854.2。

Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−カルボン酸：

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.14 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.87 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.73 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8,68 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.51 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 8.37 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.26-8.24 (m, 2H), 8.10 (t, J = 14.7, 7.3 Hz, 1H), 8.02-7.96 (m, 3H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 15.2, 7.1 Hz, 1H), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.39-7.37 (m, 2H), 7.16 (t, J = 15.3, 7.2 Hz, 1H), 7.10-7.04 (m, 2H), 6.86 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 6.78 (t, J = 14.2, 7.1 Hz, 1H), 6.67 (t, J = 14.9, 7.3 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.32 (s, 1H), 4.33 (s, 2H).
MS: [M+H]⁺ 854.2。

Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸：

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 9.06 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.65-8.57 (m, 3H), 8.46-8.41 (m, 2H), 8.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.94-7.78 (m, 5H), 7.72 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.58-7.55 (m, 2H), 7.40 (t, J = 14.0, 7.0 Hz, 1H), 7.15 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H), 7.05-6,95 (m, 5H), 6.77 (t, J = 13.7, 7.0 Hz, 1H), 6.66 (t, J = 13.6, 6.4 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 6.6 Hz, 1H).
MS: [M+H]⁺ 839.2。

Ｉｒ（６−フェニル−ベンゾフェナントリジン）_２ ピリジン−２−カルボン酸

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.04 (m, 4H), 8.82 (m, 2H), 8.77-8.70 (m, 1H), 8.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.29-8.27 (m, 2H), 8.15-8.09 (m, 4H), 7.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.78-7.71 (m, 4H), 7.65 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.62-7.553 (m, 2H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.23-7.17 (m, 1H), 7.13-7.05 (m, 3H), 7.05-7.00 (m, 1H), 6.83 (dd, J = 10.8, 4.0 Hz, 1H), 6.68 (dd, J = 10.9, 3.8 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H).
MS: [M+H]⁺ 924.2
Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸：

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.24 (m, 1H), 9.15 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.88 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.73 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.68 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.45 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.13-8.00 (m, 4H), 7.92 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 2H), 7.54-7.42 (m, 3H), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.17 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H), 7.10-7.06 (m, 3H), 7.02 (t, J = 15.7, 7.3 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 6.77 (t, J = 14.0, 7.1 Hz, 1H), 6.71 (t, J = 14.8, 7.0 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 2.86 (t, J = 15.2, 7.5 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 15.4, 7.7 Hz, 2H).
MS: [M+H]⁺ 972.3。

Ｉｒ（６−［４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェニル］−フェナントリジン）_２ ピリジン−２−カルボン酸の合成

Ｉｒ二量体（１５０ｍｇ，０，０６５ｍｍｏｌ）、ピコリン酸（１７ｍｇ，０．１３７ｍｍｏｌ）およびＮａ_２ＣＯ_３（７０ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）の、２０ｍＬのジクロロメタン／エタノール（４：１）中における懸濁液を、一夜還流した。冷却した後、混合物を濃縮乾固した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーによりジクロロメタン／ＭｅＯＨ（勾配 １００：０から１０：１まで）で精製した。化合物をジクロロメタン／Ｅｔ_２Ｏ中で再結晶した。
収率: 30%.
NMR:
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.06 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.98 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.61 (m, 3H), 8.46 - 8.21 (m, 4H), 8.13 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.83 (m, 4H), 7.61 (m, 2H), 7.57 - 7.41 (m, 3H), 7.30 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.24 - 7.12 (m, 1H), 6.89 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 8.9, 2.5 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 3.85 - 3.41 (m, 32H), 3.34 (s, 3H), 3.33 (s, 3H).
MS: [2M+2Na]²⁺計算値 1258.4012, 実測値 1258.4030. [M+H]⁺ 計算値 1236.4197, 実測値 1236.4227。

Ｉｒ（６−［４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェニル］−フェナントリジン）_２ カルボキシエチルフェニル−ピリジン−２−カルボン酸の合成

６−［４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェニル］−フェナントリジンを含むＩｒ二量体（ビス イリジウム錯体）（９６ｍｇ，０．０４１ｍｍｏｌ）、５−［４−（２−カルボキシ−エチル）−フェニル］−ピリジン−２−カルボン酸（２５ｍｇ，０．０９２ｍｍｏｌ）およびＮａ_２ＣＯ_３（２８ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）の、１２ｍｌのジクロロメタン：ＥｔＯＨ（５：１）混合物中における混合物を、一夜還流した。冷却した反応液にジクロロメタン（３０ｍｌ）を添加した。水を混合物に添加し、水相をｐＨ６になるまで酸性化した。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮乾固し、残留物をクロマトグラフィーカラム（シリカ，ジクロロメタン／ＭｅＯＨ）により精製した。
収率: 30%
NMR: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12.13 (bs, 1H), 9.23 - 9.11 (m, 1H), 9.07 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.98 - 8.90 (m, 1H), 8.89 - 8.78 (m, 1H), 8.75 - 8.67 (m, 1H), 8.70 - 8.62 (m, 2H), 8.47 (dd, J = 8.6, 1.3 Hz, 1H), 8.44 - 8.36 (m, 2H), 8.23 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.13 - 7.90 (m, 5H), 7.67 - 7.46 (m, 3H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.15 - 7.08 (m, 2H), 7.02 (ddd, J = 8.4, 6.9, 1.3 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 9.0, 2.6 Hz, 1H), 6.73 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 6.31 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 3.76 (dtd, J = 36.3, 10.8, 5.3 Hz, 4H), 3.45 - 3.10 (m, 28 H), 3.17 (s, 3H), 3.14 (s, 3H), 2.87 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.60 - 2.50 (m, 2H).
MS: [M+H]⁺計算値 1384.47231 実測値 1384.47466. [M+Na]⁺計算値 1406.45426, 実測値 1406.45556。

セシウム塩としてのＩｒ（３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホネート）_２ ピリジン−２−カルボン酸の合成

３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホン酸セシウム塩を含む化合物ビス−イリジウム錯体（１００ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）、ピコリン酸（１０ｍｇ，０．０８２ｍｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（３５ｍｇ，０．１０７ｍｍｏｌ）の、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中における混合物を、８０℃で窒素雰囲気下に一夜撹拌した。反応液を濃縮乾固し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０および溶離剤としてのＤＭＦで精製した。収量：２０ｍｇ（２０％）。
NMR: ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 9.15 - 9.00 (m, 2H), 8.91 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.66 (dd, J = 12.6, 8.6 Hz, 2H), 8.48 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.38 - 8.28 (m, 2H), 8.21 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.11 - 8.02 (m, 1H), 8.03 - 7.82 (m, 4H), 7.70 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.64 - 7.36 (m, 5H), 7.06 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 6.32 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.81 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.97 - 3.54 (m, 4H), 2.41 - 2.22 (m, 4H), 1.91 - 1.55 (m, 4H).
MS [ESI-MS(-)]: [Ir(C^N)₂(pic)-2Cs⁺]^2- 計算値 548.58196, 実測値 548.58446
ECL結果: 64978 (10ナノモル濃度) 標準 Ru(bpy)3 = 10000カウント; 10ナノモル濃度。

Ｉｒ（３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホネート）_２ カルボキシエチルフェニル−ピリジン−２−カルボン酸錯体の合成

３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホン酸セシウム塩を含む二量体またはビス−イリジウム錯体（１００ｍｇ，０．０３９２ｍｍｏｌ）、５−［４−（２−カルボキシ−エチル）−フェニル］−ピリジン−２−カルボン酸（２３ｍｇ，０．０８２３ｍｍｏｌ）およびＣｓ_２ＣＯ_３（６４ｍｇ，０．１９６ｍｍｏｌ）の、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中における混合物を、８０℃で窒素雰囲気下に一夜加熱した。反応混合物を濾別した。残留物をＭｅＯＨで洗浄し、両方の濾液を濃縮乾固した。この錯体は、シリカゲル６０ ＲＰ−１８を用いるＴＬＣ（ＭｅＯＨ：水 １：１）でＲｆ＝０．４５をもつ。この錯体をさらに分取ＨＰＬＣによりＲＰ−１８カラムおよび水：アセトニトリル勾配を用いて精製した。
MS [ESI-MS(-)]: [Ir(C^N)₂(5-[4-(2-カルボキシ-エチル)-フェニル]-ピリジン-2-カルボン酸)-2Cs⁺+Na⁺]^-計算値 1268.20571, 実測値 1268.20099
MS [HPLC-MS(+)]:[Ir(C^N)₂(RC5-[4-(2-カルボキシ-エチル)-フェニル]-ピリジン-2-カルボン酸)-3Cs⁺+3H⁺]⁺ 計算値 1248.4, 実測値 1248.4。

実施例５
新規なイリジウム錯体を用いるＥＣＬ
幾つかの金属錯体の電気化学発光信号を、ＥＬＥＣＳＹＳ（登録商標）分析計（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）で査定した。測定を均質法により、ストレプトアビジンコートした常磁性微粒子の非存在下で実施した。それぞれの金属錯体の０．１ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ原液をＰＢＳ緩衝液で希釈して、１０ｎＭ溶液にした。この１０ｎＭ溶液をサンプルとしてＥＬＥＣＳＹＳ（登録商標）分析計で操作した。２０μｌのサンプルを９０μｌの試薬１（ＰｒｏＣｅｌｌ）および９０μｌの試薬２（ＰｒｏＣｅｌｌ）と一緒に３７℃で９分間インキュベートし、その後、電気化学発光信号を定量した。
ＥＣＬ結果：
標準 Ｒｕ（ｂｐｙ）３＝１００００カウント；１０ナノモル濃度
− Ｉｒ（６−［４−（２−｛２−［２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−フェニル］−フェナントリジン）_２ ピリジン−２−カルボン酸 ｏｋ ＝３１２５８カウント；１０ナノモル濃度
− Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−カルボン酸＝４５５１２カウント；１０ナノモル濃度
Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−カルボン酸：

実施例６
バイオコンジュゲーションのための反応基を含むイリジウム錯体の合成
Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸（１５ｍｇ）を、乾燥アセトニトリル５ｍＬと乾燥ピリジン０．０１ｍＬの混合物に溶解した。炭酸ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）（１．５当量）を添加し、混合物を窒素下に室温で一夜撹拌した。この溶液をクロロホルム（１０ｍＬ）に添加し、０．５Ｍ ＨＣｌ（１×２ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１×２ｍＬ）および水（２×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空中で濃縮して、赤色粉末を得た；
Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル：

¹H-NMR (400 MHz, CD₃CN) δ 9.25 (m, 1H), 9.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.75-8.68 (m, 1H), 8.60-8.54 (m, 3H), 8.47 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.43 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.06 (t, J = 15.4, 7.2 Hz, 1H), 7.97-7.95 (m, 3H), 7.77-7.70 (m, 2H), 7,61 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H), 7.52-7.44 (m, 3H), 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.18 (t, J = 15.2, 7.0 Hz, 1H), 7.12-7.09 (m, 3H), 7.04-6.98 (m, 2H), 6.78 (t, J = 14.9, 7.2 Hz, 1H), 6.71 (t, J = 14.8, 7.5 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3,07-3,01 (m, 4H), 2,80 (s, 4H).
MS: [M+H]⁺ 1069.3。

実施例７
ビオチンとのイリジウム錯体コンジュゲートの合成

Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２ ２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸 ＮＨＳエステル（１２ｍｇ）および４ｍｇのＮ−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン トリフルオロアセテートを、乾燥ＤＭＦ ５ｍＬに溶解した。ピリジン（０．０１６ｍＬ，２ｍＬのＤＭＦ中）を添加し、混合物を窒素下に室温で一夜撹拌した。この溶液をクロロホルム（１０ｍＬ）に添加し、０．５Ｍ ＨＣｌ（１×２ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１×２ｍＬ）および水（２×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空中で濃縮すると、赤色粉末が得られた。生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，ｎ−ヘキサン／酢酸エチル）により精製して、赤色粉末を得た。
MS: [M+H]⁺ 1328.6。

実施例８
イリジウム多重標識の合成
Ｎ−Ｆｍｏｃ−３−（２−ｔ−ブトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン
Helvetica Chimica Acta 1987, p.1307-1311 by H. Hilpertの記載に従って、ビス-エチルエステル保護されたラセミ体アミノ酸 ３−（２−エトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルを、文献と比較して４倍の規模で製造すると、６１２ｍｇの物質が得られる。この化合物を記載に従って^１Ｈ−ＮＭＲにより特性分析する。ラセミ体アミノ酸 ３−（２−エトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルを次いでアセトニトリルに溶解し、混合物を激しく撹拌することにより０，１Ｎ水酸化ナトリウムで５時間処理し、これによって優先的に２−エトキシ基が加水分解される。目的化合物３−（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルを、分取Ｃ４逆相クロマトグラフィーにより標準アセトニトリル−水勾配で混合物から単離する；一連の溶出ピークは、３−（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン、３−（２−エトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニンおよび３−（２−エトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルである。（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステル含有画分すべてをまとめて凍結乾燥した後、約２５０ｍｇの無色油状の凍結乾燥物を得ることができ、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／酢酸＝９：１：１；ＵＶ検出）により（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルと判定された。（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルの２−カルボキシ基をｔｅｒｔ．−ブチル化するために、２４０ｍｇを１０ｍｌの酢酸ｔｅｒｔ．−ブチルエステルに溶解する。１．２モル過剰の７０％過塩素酸水溶液を次いで添加する。室温で５日間の撹拌後に、混合物を氷冷０．５Ｎ塩酸で抽出する。抽出液を３Ｎ−水酸化ナトリウムでアルカリ性にし、塩化メチレンで抽出する。塩化マグネシウムで乾燥させた後、有機相を蒸発させ、残留液を蒸留すると、約２００ｍｇの３−（２−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルが得られる。３−（２−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルのアミノ基を可逆的に保護するために、１８０ｍｇの化合物を１０ｍｌのジオキサンに溶解し、次いで３００ｍｇのＦｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ）をジオキサンに溶解して添加する。最後に、３−（２−ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン エチルエステルに対比して２倍当量の炭酸水素ナトリウムを添加する。３時間の激しい撹拌後に、同体積の１Ｎ 水酸化ナトリウム溶液で反応体積を希釈して、カルボキシ基のエチルエステルを開裂させる。５時間後、蒸発により反応混合物の体積を著しく減少させる。全相を酸性にし、酢酸エチルエステルにより数回抽出する。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有機相を完全に蒸発させると、約２００ｍｇのＮ−Ｆｍｏｃ−３−（２−ｔ−ブトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニン（Ｄ）が無色の油として得られる。

β−アラニニル−β−アラニニル−３−（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニニル−β−アラニニル−グルタミニル−β−アラニニル−３−（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニニル−β−アラニニル−グルタミニル−β−アラニニル−３−（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニニル−β−アラニニル−β−アラニンまたはＮＨ２−ＵＵＸＵＥＵＸＵＥＵＸＵＵ−ＯＨ（Ｅ）
化合物（Ｅ）を、Ｆｍｏｃ−（フルオレニルメトキシカルボニル）−固相ペプチド合成により、多重ペプチド合成装置ＳＹＲＯ ＩＩ（Ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｅｃ）で、１５ｍｇの４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ）の数個の反応器において、０．５ｍｍｏｌ／ｇの装填量で製造する。上記アミノ酸配列中のＸを含む各位置についてＮ−Ｆｍｏｃ−３−（２−ｔ−ブトキシカルボニル−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニンを、Ｕを含む各位置についてＦｍｏｃ−β−アラニンを、Ｅを含む各位置についてＦｍｏｃ−グルタミン酸（ｔｅｒｔ．−ブチル−エステル）を、合成樹脂に固定化した成長しつつあるペプチド上へカップリングさせる。それぞれのＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸９０μｍｏｌを１００μｍｏｌの１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと一緒に２７０μｌのジメチルホルムアミドに溶解し、その後、１００μｍｏｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドをカップリング剤として添加し、次いでペプチド合成装置の反応器内でこの溶液に樹脂を分散させることにより、２回カップリングさせる。各カップリング工程は１時間続く。各カップリング工程後の一時性Ｆｍｏｃ基の開裂は、ジメチルホルムアミド中の５０％ピペリジン溶液により２０分以内で行なわれる。各反応工程の後、ジメチルホルムアミドによる洗浄工程が行なわれる。合成後の樹脂からの完成ペプチド（Ｅ）の開裂および持続性ｔｅｒｔ．−ブチルエステル保護基の開裂除去は、９５％トリフルオロ酢酸と５％エタンジチオールの混合物により２時間で行なわれる。樹脂ビーズを濾去した後、冷ジイソプロピルエーテルの添加により生成物を沈殿させ、沈殿を濾過により単離し、酢酸に再溶解し、凍結乾燥法により凍結乾燥させる。得られた３０ｍｇの粗製物質を逆相ＨＰＬＣにより精製すると、約１５ｍｇの少なくとも９５％純度の物質が得られる。分析用逆相ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳにより特性分析を行なう。

Ｉｒ（３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホネート）_２（２−カルボキシ−４−ピリジル）−ＤＬ−アラニニル錯体ベースの多重標識の合成
３−（４−フェナントリジン−６−イル−フェノキシ）−プロパン−１−スルホン酸セシウム塩を含む二量体化合物ビス−イリジウム錯体（１．５モル過剰）、ＮＨ２−ＵＵＸＵＥＵＸＵＥＵＸＵＵ−ＯＨ、Ｃｓ_２ＣＯ_３（二量体またはビス錯体に対して３モル過剰）の、ＤＭＦ中における混合物を、８０℃で窒素雰囲気下に一夜撹拌する。反応混合物を濃縮乾固し、反応生成物をさらに分取ＨＰＬＣにより精製する。

Claims (13)

1. 式ＩＩのイリジウムベースの化学発光性化合物：
   

   

   ［式中：
   式Ｉ（ａ）および式Ｉ（ｂ）において、それぞれ独立して、各Ｒ１〜Ｒ１６は、独立して、水素、ハライド、シアノ基またはニトロ基、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、スルファニル、置換または非置換アルキルスルホニル、置換または非置換アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシ−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート、あるいはＲ１７であり、その際、Ｒ１７は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル、分岐鎖アルキル、置換された分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アミノ−アルキル、置換アミノ−アルキル、アミノ−アルコキシ、置換アミノ−アルコキシ、アミノ−アリール、置換アミノ−アリール、アミノ−アリールオキシ、置換アミノ−アリールオキシであり、
   Ｒ１〜Ｒ１７のいずれかに置換基が存在する場合、Ｒ１〜Ｒ１７における置換基は、それぞれ独立して、ハライド、シアノ基またはニトロ基、親水基：アミノ、アルキルアミノ、アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボキレート、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、アルキルオキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルアリールオキシ、ポリエチレンオキシ、ポリプロピレンオキシ、スルファニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホネート、スルフィネート、スルフェネート、スルファモイル、スルホキシド、ホスホノ、ヒドロキシホスフィノイル、ヒドロキシル−アルキル−ホスフィノイル、ホスホネート、ホスフィネート基から選択され、
   ここで用いるアルキルは、１〜２０炭素原子の長さをもつ直鎖もしくは分岐鎖アルキル、またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む１〜２０原子の長さをもつヘテロアルキル鎖であり、アリールは、５、６もしくは７員アリール環系、またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５、６もしくは７員ヘテロアリール環系であり、
   式Ｉ（ａ）のＲ１３〜Ｒ１６のうち少なくとも１つは−Ｑ１−Ｙであり、式Ｉ（ｂ）のＲ１３〜Ｒ１６のうち少なくとも１つはＱ２であり、その際、Ｑ１はリンカーであり、各Ｑ２は独立してリンカーまたは共有結合であり、（ｎ）は１〜５０の整数であり、Ｙは官能基であり、
   ここで、リンカーＱ１が、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、Ｐ、Ｓ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環を含む主鎖を備えた前記の鎖を有し、
   ここで、各Ｑ２が、独立して、共有結合であるか、あるいはリンカーであって、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、Ｐ、Ｓ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環を含む主鎖を備えた前記の鎖を有し、その際、Ｑ２は（ｎ）回存在し、（ｎ）は１〜５０の整数であり；そして、
   官能基Ｙが、アルデヒド、カルボン酸、カルボン酸エステル、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、ヒドラジン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホロアミダイトからなる群から選択される、前記化合物。
2. リンカーＱ１が、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ１００アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜１００原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環を含む主鎖を備えた前記の鎖を有する、請求項１に記載の化合物。
3. リンカーＱ１が、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ５０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜５０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環を含む主鎖を備えた前記の鎖を有する、請求項２に記載の化合物。
4. リンカーＱ１が、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環を含む主鎖を備えた前記の鎖を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
5. 各Ｑ２が、独立して、共有結合であるか、あるいはリンカーであって、主鎖として、直鎖または分岐鎖、飽和、不飽和、非置換または置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる１〜２０原子の鎖、あるいは１以上の環式または複素環式の芳香族または非芳香族環を含む主鎖を備えた前記の鎖を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
6. Ｑ２が、独立して、共有結合であるか、あるいは主鎖として、飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、ならびに／あるいは炭素原子、置換された炭素原子、および／またはＯ、Ｎ、ＰおよびＳ、または置換されたＮ、ＰもしくはＳ原子から選択される１個以上の原子からなる主鎖を備えた１〜１２原子の鎖を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物およびそれに共有結合した親和性結合剤を含む、コンジュゲート。
8. 親和性結合剤が、抗原および抗体、ビオチンまたはビオチンアナログおよびアビジンまたはストレプトアビジン、糖およびレクチン、核酸または核酸アナログおよび相補的核酸、ならびに受容体およびリガンドからなる群から選択される、請求項７に記載のコンジュゲート。
9. 親和性結合剤が核酸または抗体である、請求項７または８に記載のコンジュゲート。
10. 水溶液中で電気化学発光反応を実施するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物または請求項７〜９のいずれか１項に記載のコンジュゲートの使用。
11. 電気化学発光ベースの検出法における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物または請求項７〜９のいずれか１項に記載のコンジュゲートの使用。
12. 分析物の検出における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物または請求項７〜９のいずれか１項に記載のコンジュゲートの使用。
13. in vitro 法により分析物を測定するための方法であって、
    ａ）分析物を含む疑いがあるかまたは含むことが分かっている試料を用意し、
    ｂ）その試料と請求項７〜９のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、分析物−コンジュゲート複合体の形成に適した条件下で接触させ、そして
    ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得る
    工程を含む方法。