JP6238910B2 - 免疫グロブリンを用いた粘膜炎の治療 - Google Patents

Description

本発明は、局所投与による粘膜炎の治療に使用するための免疫グロブリンを含む組成物に関する。特に、本発明は、粘膜炎を治療するためのＪ鎖含有ＩｇＡおよび分泌成分を含む組成物に関する。

癌患者は、様々な治療に関連する後遺症に苦しんでいる。消化管の粘膜炎は、化学療法および放射線療法の最も衰弱させる副作用の１つである（非特許文献１）。疼痛、粘膜潰瘍、および非経口栄養を必要とする食品摂取の困難性は、患者の快適さに深刻な影響を与え、局所感染および全身感染のリスクを増加させる（非特許文献２）。さらに、粘膜炎は、その後の化学療法または放射線療法のサイクルの遅延を生じさせる。これは、治療中断または化学療法の用量減少を必要とする場合があり、全生存に有害な影響を有することがある。また、粘膜炎の管理は費用の嵩む治療および長期入院を必要とするため、粘膜炎は経済的な問題として現れる。

粘膜炎に関する現在の標準的な治療は、主に、疼痛をコントロールするための姑息的手段に依るが、粘膜炎に関与する発症機序に対処していない。

粘膜炎の複雑な病態生理学を理解することは、予防策および／または治療策の考案に重要である。現在の概念は、５つの重複したフェーズ（非特許文献３）を伴う：（１）粘膜炎は、細胞毒性薬の投与または放射線照射中に開始される。損傷は、最初の可視的および臨床的に定量され得る変化が生じる（例えば、粘膜紅斑）数日前に始まり、おそらく、ＤＮＡ損傷および／または活性酸素種によって引き起こされる。（２）損傷応答経路および炎症促進性カスケードが活性化される。（３）これらのシグナル伝達経路の増幅を伴う悪循環、例えば、ＴＮＦ−αの放出、ＮＦ−κＢの活性化、および活性酸素種は、細胞死を増強し、それによって粘膜の損傷を媒介すると考えられている。（４）可視性潰瘍が発症し、粘膜表面上の複数菌叢の存在によって不利な影響を受け、炎症促進性サイトカイン放出を増強する（非特許文献４）。口腔および消化管の片利共生生物または通性病原体は潰瘍に侵入し、菌血症を引き起こす場合がある。（５）粘膜障壁の再生は、毒性刺激および炎症促進性シグナルが減少した後にだけ生じ、好中球数が回復している。

これらの戦略および病態生理学的な事象のいくつかは、インビトロおよび動物モデルでの研究で再現することができる。放射線、または化学療法に典型的に使用される化学物質（例えば、メトトレキサート）への上皮細胞の曝露は、局所的に存在する上皮細胞上での抗癌療法の効果と潜在的な副次的損傷をモデル化するための適切なアプローチである。これは、口腔粘膜炎の早期段階／開始段階（上述されるようにステージ１、２および３）に対応している。この目的のために使用され得る上皮細胞は、角化上皮細胞系（例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２）および非角化上皮細胞系（例えば、Ｈ３７６）を含む。同様に、口腔微生物叢に存在する日和見病原体への上皮細胞の曝露は、口腔粘膜炎の後期段階（ステージ３および４）を模倣し、特に、局所的に存在する微生物によって引き起こされる炎症の永続化は、このような系において研究し得る。口腔微生物叢に存在する典型的な日和見病原体には、ストレプトコッカス（Streptococcus）属種、特にＳ．ミチス（S.mitis）およびＳ．ニューモニエ（S.pneumoniae）が含まれ、ある程度はモラクセラ（Moraxella）属種も含まれ、例えば、Ｍ．カタラーリス（M.catarrhalis）が挙げられる（非特許文献５）（非特許文献６）。

加えて、ハムスター、ラットおよびマウスにおける様々なインビボモデルが十分に確立され、しばしば使用され、さらに、規制当局によって承認されている。最も一般的に使用されているモデルは、放射線または放射線療法と化学療法の組み合わせに曝露されたゴールデンシリアンハムスターに基づく；予防介入と治療介入の両方がモデルにおいて報告されている（非特許文献７）。

癌治療の強度と粘膜炎発症のリスクの間には直接的な相関がある。リスクの増加は、以前の治療サイクルにおいて粘膜炎を発症した患者において観察されている。不安などのストレス因子もリスクを高める。また、粘膜微生物叢の性質および程度、ならびに癌治療による既存の微生物叢の可能な修飾は、炎症性刺激を増強する場合がある。

炎症促進性シグナルの破壊および微生物負荷の低減は、粘膜炎を治療および／または予防するための潜在的な標的として同定されている。複数の比較無作為化試験において試験されたたった７つの試薬は有意な効果を有することが見出されたが、観察された改善は軽微であった。ポリミキシン、トブラマイシンおよびアムホテリシンＢを含有する経口トローチは、好影響を有することが見出されているが（非特許文献８；非特許文献９）、粘膜炎における局所的な抗菌剤の使用は、日常的に推奨されていない（非特許文献１０）。現在では、微生物は、粘膜炎の開始を引き起こさない可能性があり、後続の段階において役割を果たし得ると考えられている。最近では、組換えケラチノサイト増殖因子（ＫＦＧ）は、粘膜炎を有意に改善することが示された（非特許文献１１）。

Ｓｏｎｉｓ ＳＴ（２００９年）Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ ４５、１０１５−２０頁 Ｅｌｔｉｎｇ、ＬＳら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ ９８：１５３１−９頁 Ｓｏｎｉｓ ＳＴ（１９９８年）Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ ３４：３９−４３頁 Ｒａｔｎｅｒ、ＡＪら（２００５年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３４２９−３４頁 Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０１２年）Ｎａｔｕｒｅ ４８６：２０７−２１４頁 Ｄｅｗｈｉｒｓｔ ＦＥ（２０１０年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９２：５００２−５０１７頁 Ｗａｔｋｉｎｓ Ｂ（２０１０年）Ｏｒａｌ Ｄｉｓ １６：６５５−６６０頁 Ｓｔｏｋｍａｎ ＭＡら（２００３年）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８８：１０１２−６頁 Ｗｉｊｅｒｓ ＯＢら（２００１年）Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉｏｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ５０：３４３−５２頁 Ｄｏｎｅｌｌｙ ＪＰら（２００３年）Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３：４０５−１２頁 Ｂｌｉｊｅｌｅｖｅｎｓ Ｎ ＆ Ｓｏｎｉｓ、Ｓ（２００７年）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １８：８１７−２６頁

したがって、癌関連の治療計画によって引き起こされる粘膜炎の効果的な治療法が強く求められている。新しいアプローチは、消化管の粘膜炎、特に口腔粘膜炎の予防および治療のために緊急に必要とされている。

本発明者らは、驚くべきことに、消化管の粘膜炎、特に口腔粘膜炎が、免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭの局所投与により効果的に治療され得ることを見出した。

したがって、本発明の一態様は、対象における局所投与による消化管の粘膜炎、特に口腔粘膜炎の予防または治療において使用するための免疫グロブリンを含む組成物である。

好ましくは、免疫グロブリンは、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭを含み、より好ましくは、免疫グロブリンは、Ｊ鎖含有ＩｇＡもしくはＪ鎖含有ＩｇＭまたはこれらの組み合わせを含む。好ましくは、免疫グロブリンは、血漿または血漿画分などの血液またはその成分から得ることができる。より好ましくは、本発明の組成物はまた分泌成分を含む。好ましくは、分泌成分は組換え分泌成分である。

本発明の好ましい態様において、組成物は分泌様ＩｇＡを含む。また、組成物は、別の免疫グロブリンと組み合わせて、好ましくはＩｇＭ、好ましくは分泌様ＩｇＭと組み合わせて、分泌様ＩｇＡを含んでもよい。

本発明のさらなる態様は、粘膜炎に罹患した（または罹患するリスクがある）粘膜領域との長期の接触時間を与えるように製剤化されている、上述される組成物である。好ましくは、組成物は、クリーム、ゲル、シロップ、ゼリー、罹患した粘膜近傍で溶解する固体形態、またはそれらの組み合わせとして製剤化される。別の好ましい組成物は、飲み込む前または吐き出す前の数分間、口中で保持するのに適するように製剤化される液体組成物である。好ましくは、液体製剤は、味が快適であるように香味物質を含む。このような物質は、イチゴ、リンゴ、モモ、ブルーベリーなどの果実の味；キャラメル、チョコレートの味を与えることができ；さらに、チーズまたはトマトなどの風味のいい味を使用してもよい。組成物はまた、免疫グロブリンの安定性を高める他の適切な添加剤、例えば安定化剤を含んでもよい。

本発明のさらに別の態様は、粘膜への局所投与が、細菌または真菌などの微生物（単数または複数）の付着および／または侵入を減少させる、上述される組成物である。微生物は、粘膜表面上の微生物叢の一部であってもよい。

本発明のさらなる態様は、粘膜への局所投与が粘膜創傷治癒を促進する、上述される組成物である。好ましくは、本発明の組成物は、増殖因子、例えば、ケラチノサイト増殖因子を分泌するように上皮細胞を刺激する。

本発明のなおさらなる態様は、粘膜への局所投与が抗炎症作用を及ぼす、本発明の組成物である。抗炎症作用は、
（ａ）炎症促進性サイトカイン発現の阻害；および／または
（ｂ）抗炎症性サイトカインの発現の刺激
であってもよい。

本発明の別の態様は、対象が、化学療法および／または放射線療法を受けているまたは受けようとしている癌患者のような消化管の粘膜炎を発症するリスクがある、上述される組成物である。特に、粘膜炎を発症するリスクがある対象は、以前の化学療法および／または放射線療法の処置の結果として粘膜炎を発症した癌患者である。以前の化学療法および／または放射線療法の処置は、化学療法および／または放射線療法を受けた後に寛解していた患者における一連の治療サイクルにおける初期の治療サイクル、または一連の治療サイクルの治療の一部であってもよいが、この場合、癌が再発しており、別の一連の化学療法および／または放射線療法が指示されている。好ましくは、患者の好中球数が減少し始めたときに組成物の投与が開始される。好ましくは、患者の好中球数が正常を下回っている期間中に治療が維持される。

本発明の組成物は、患者に、１日あたり最大６回まで、好ましくは１日あたり最大５回まで、より好ましくは１日あたり最大４回まで、さらにより好ましくは１日あたり最大３回まで、最も好ましくは１日あたり２回またはそれよりも少ない頻度で投与される。

本発明の別の態様において、組成物は、増殖因子または防腐剤などの粘膜炎の治療のための追加の有効な薬剤を含む。また、消化管の粘膜炎の治療における、同時の、個別のまたは逐次的な使用のための併用製剤として、本発明の組成物および第二の活性薬剤を含む製造物も本発明に含まれる。このような第二の活性薬剤は、例えば、増殖因子などの創傷治癒を促進する薬剤、防腐剤などの抗菌剤、例えば、殺菌性口内洗浄液、または抗炎症剤であってもよい。

上記したように、癌患者における粘膜炎、特に口腔粘膜炎は、依然として、主要な医学的問題であると考えられ、効果的な治療が求められている。そこで、本発明者らは、驚くべきことに、消化管の粘膜炎、特に口腔粘膜が、免疫グロブリン、特にＩｇＡおよび／またはＩｇＭの局所投与によって効果的に治療され得ることを見出した。

したがって、本発明の一態様は、対象への局所投与による、消化管の粘膜炎、特に口腔粘膜炎の予防または治療に使用するための免疫グロブリンを含む組成物である。好ましくは、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。

好ましくは、免疫グロブリンは、ＩｇＡもしくはＩｇＭまたはこれらの組み合わせを含み、より好ましくは、免疫グロブリンは、Ｊ鎖含有ＩｇＡもしくはＪ鎖含有ＩｇＭまたはこれらの組成物を含む。好ましくは、免疫グロブリンは、血漿、脱クリオ（cryo-poor）血漿、または血漿画分などの血液または血液の成分から得ることができる。より好ましくは、免疫グロブリンは、他の血漿タンパク質、例えば、免疫グロブリンＧを精製するために血漿を処理中に得られる側画分から精製される。好ましくは、免疫グロブリンは、乳または初乳から得られない。好ましくは、免疫グロブリンは、例えば、マンノースまたはシアル酸またはガラクトースなどの糖残基の酵素的付加または除去によって、インビトロでグリコシル化を変化させることによって、精製後には修飾されない。好ましくは、免疫グロブリンは、純粋な抗ＴＮＦ抗体および抗体ＴＮＦに関して富化した免疫グロブリンではなく、またはＴＮＦ−αで免疫されたヒトもしくは動物ドナーから精製される。

本発明の別の態様において、組成物はまた分泌成分を含む。好ましくは、分泌成分は、組換え分泌成分、好ましくは哺乳動物細胞系において産生さる分泌成分である。

本明細書で使用される用語「分泌成分」は、Ｊ鎖含有免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質を意味し、高分子免疫受容体（ｐｌｇＲ）、好ましくは哺乳類ｐｌｇＲ、より好ましくは霊長類ｐｌｇＲ、最も好ましくはヒトｐｌｇＲ、の細胞外部分に関連し、またはそれから誘導可能であり、またはそれと同一である。好ましくは、分泌成分は、Ｊ鎖含有免疫グロブリンに対して増加した安定性を付与する。伝統的な狭い意味での分泌成分（本明細書では「天然の分泌成分」と称する。）は、通常、Ｊ鎖を含有する二量体もしくは多量体ＩｇＡまたは五量体ＩｇＭに、分泌中に関連付けられる、高分子免疫グロブリン受容体（ｐｌｇＲ）の細胞外部分である。Ｊ鎖含有ＩｇＡ／ＩｇＭは、上皮細胞の側底面で高分子免疫グロブリン受容体に結合し、トランスサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。次に、この受容体複合体は、上皮細胞の管腔表面に輸送される前に、細胞内コンパートメントを通過する。続いて、トランスサイトーシスされたＩｇＡ／ＩｇＭ−ｐｌｇＲ複合体は、タンパク質分解を通じて放出され、天然の分泌成分と称される高分子免疫グロブリン受容体（ｐｌｇＲ）の一部は、Ｊ鎖含有ＩｇＡ／ＩｇＭと結合して留まり、分泌性ＩｇＡ／ＩｇＧを放出する。しかしながら、ＩｇＡの逆トランスサイトーシス、すなわち管腔表面から側底面へのトランスサイトーシスもまた起こるという証拠がある。

ヒトｐｌｇＲは、クローニングされ、配列決定され、その配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーＰ０１８３３として利用可能であり、配列番号１に示される。ヒトｐｌｇＲは、７６４個のアミノ酸残基を有する糖タンパク質であり、シグナルペプチド（残基１〜１８）、細胞外部分（残基１９〜６３８）、膜貫通領域（残基６３９〜６６１）、および細胞質領域（残基６６２〜７６４）を含む。残基１９〜６０３は、上述されるようにＪ鎖含有ＩｇＡまたはＪ鎖含有ＩｇＭと結合するものと考えられ、この糖タンパク質の該部分は、通常、分泌成分（「天然の分泌成分」）と称される。

本発明の組成物に用いられる分泌成分は、Ｊ鎖含有ＩｇＡと結合することができる任意の細胞外ｐｌｇＲ配列を含むことができる。例えば、分泌成分は、哺乳類供給源、例えば、霊長類、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットもしくはマウスまたはそれらの変異体由来のｐｌｇＲの細胞外ドメインを含むことができる。また、いくつかの哺乳類種またはそれらの変異体由来の細胞外ドメインの機能的ハイブリッドは、本発明における使用のために意図され、例えば、分泌成分様タンパク質に異種由来の免疫グロブリン様ドメインを融合することによって調製される。機能的な分泌成分はまた、通常存在する免疫グロブリン様ドメインの選択を融合することによって形成することができ、例えば、ウサギ分泌成分は機能的であって、ドメイン１、４および５のみで構成されている。しかしながら、好ましくは、ヒト分泌成分またはその機能的変異体が用いられる。

したがって、本発明の組成物に用いられる分泌成分は、好ましくは、配列番号１の残基１９〜６０３またはそれらの機能的変異体を含む。機能的変異体は、欠失、挿入および／または置換を含んでもよく、好ましくは、置換は保存的置換であり、例えば、塩基性アミノ酸残基は別の塩基性アミノ酸に置換され、疎水性アミノ酸は別の疎水性アミノ酸で置換される。変異分泌成分は、配列番号１の残基１９〜６０３に対して配列において少なくとも５０％同一であり、好ましくは、配列番号１の残基１９〜６０３に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、より好ましくは少なくとも８５％またはさらには９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、９４％、９５％、９７％、９８％またはさらには９９％同一である。最も好ましくは、分泌成分は、配列番号１の残基１９〜６０３を含みまたはさらにはそれからなる。

当業者は、組換え技術によって分泌成分を製造する方法をよく知っている。ＣＨＯ細胞におけるヒト分泌成分の発現の例は、Ｐｈａｌｉｐｏｎら（Ｐｈａｌｉｐｏｎ Ａら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：１０７−１１５頁）によって報告されているが、本発明は、このシステムによって製造される分泌成分に限定されない。例えば、鋳型としてｐｌｇＲを発現する細胞または組織から単離したＲＮＡを用いて、所望のｃＤＮＡ配列は合成的に製造されまたはＲＴ−ＰＣＲを介してクローニングされ得る。次に、ｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３などの哺乳類発現ベクターに挿入することができる−多くの代替の発現ベクターが利用可能であり、当業者に周知である。続いて、組換え発現ベクターは、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫなどの適切な宿主細胞系に導入される。他の細胞系は入手可能であり、使用することもできる。細胞系にこのようなベクターを導入する方法には、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび当業者に周知の他の技術が含まれる。次に、通常、発現ベクターを保有し、対象とするタンパク質を発現する細胞を選択し、クローニングする。また、ウイルス発現系を用いることができ、例えば、ワクシニアウイルスを用いて、哺乳類細胞中に高レベルでタンパク質を発現させることができ、バキュロウイルス発現系を用いて、昆虫細胞中に高レベルでタンパク質を発現させることができる。酵母または細菌発現系も想定することができ、このような発現系は当業者に知られている。植物発現系もまた使用することができ、当業者に知られている。

本発明の組成物に使用される分泌成分またはその変異体はまた、得られるタンパク質の精製を助けることができるタグ、例えば、ヘキサ−ヒスチジンタグを含んでもよい。このようなタグが切断可能なリンカーを介して結合されている場合、タグは、本発明において使用する前に切断することができる。同様に、分泌成分は融合タンパク質として製造され得る。再度、融合パートナーが本発明において使用する前に分泌成分から切断され得るように、切断可能なリンカーを使用することができる。

続いて、当業者は、標準的な方法を用いて、発現したタンパク質を精製することができる。

分泌成分はまた、天然の供給源から得ることがある、好ましくは、乳、唾液もしくは粘液から得ることができる。好ましくは、分泌成分は、ヒト起源であるが、他の種由来の分泌成分もまた本発明において使用することができる。

組成物中の分泌成分とＪ鎖の間のモル比は、１：１０と１０：１の間、好ましくは、１：５と５：１の間、より好ましくは１：２と２：１の間である。

組成物に使用される分泌成分の量は、組成物における少なくとも５０部（重量比）のタンパク質に対して１部（重量比）の分泌成分であってもよく、好ましくは、組成物における少なくとも４０部、３０部、２０部、１５部、１０部に対して１部の分泌成分であってもよく、最も好ましくは、少なくとも５部のタンパク質に対して１部の分泌成分であってもよい。

本発明の好ましい態様において、組成物は分泌様ＩｇＡを含む。組成物はまた、別の免疫グロブリンと組み合わせて、好ましくは、ＩｇＭ、好ましくは分泌様ＩｇＭと組み合わせて、分泌様ＩｇＡを含んでもよい。本発明の別の好ましい態様において、組成物はまた、単独でまたは他の免疫グロブリンと組み合わせて分泌様ＩｇＭを含むことができる。

本発明のさらなる態様は、粘膜炎に罹患した（または罹患するリスクがある）粘膜領域との長期の接触時間を与えるように製剤化されている、上述される組成物である。「接触時間」とは、組成物またはその部分が罹患した粘膜表面またはリスクがある粘膜表面上で活性なままである時間量を意味する。好ましくは、接触時間は、数分より長く、より好ましくは数時間より長く、さらにより好ましくは数日より長く、最も好ましくは粘膜炎の予防または治療である生物学的効果を発揮するのに十分な長さである。好ましくは、組成物は、クリーム、ゲル、シロップ、ゼリー、罹患した粘膜近傍で溶解する固体状態またはそれらの組み合わせとして製剤化される。組成物はまた、１つまたはそれ以上の適切な添加剤、例えば、スクロース、ラクトース、マルトデキストリン、デンプン（例えば、トウモロコシ由来）、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロースまたはアクリル酸、メタクリル酸樹脂、油（例えば、オリーブ油）、蜜蝋または類似の薬剤を単独でまたは組み合わせて含む錠剤として製剤化されてもよい。また、発泡性成分を含むことができる。ゲルは、例えば、ブタゼラチンもしくはデンプン系の材料、プロピレングリコール、ＰＥＧ４０、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、サッカロース、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロースまたは類似の薬剤を用いて形成することができる。シロップは、糖類、グリセリンまたはソルビトールのような糖ポリオール、糖の再結晶化を防止するための酸、緩衝剤、キレート剤、香味剤および香味増強剤、着色剤の１つまたはそれ以上を添加することによって形成することができる。ゼリーは、例えば、ゼラチン、例えばブタゼラチンを用いることによって形成することができる。

あるいは、液体組成物は用いられ、飲み込む前または吐き出す前の数分間、口中で保持するのに適するように製剤化される。好ましくは、液体製剤は、味が快適であるように香味物質を含む。このような物質は、イチゴ、リンゴ、モモ、ブルーベリーなどの果実の味；キャラメル、チョコレート、ナッツまたは同様のものの味を与えることができ；さらに、チーズまたはトマトなどの風味のいい味を使用してもよい。組成物はまた、免疫グロブリンの安定性を高める他の適切な添加剤、例えば安定化剤、着色剤、緩衝物質などを含んでもよい。

組成物は、対象が口腔粘膜炎を発症するリスクがある場合、口内に直接適用されてもよく、また、消化管の他の部分において組成物を放出するように設計された製剤として経口的に摂取されてもよい。また、組成物は、肛門に送達されてもよく、送達のこの形態に適した製剤として供給されてもよい。組成物は、消化管の特定の領域でその放出を制御する製剤として送達することができる。当業者は、所望により、粘膜との所望の接触時間を達成させるために、本発明の組成物を製剤化することができる。

本発明のさらに別の態様は、粘膜への局所適用が、細菌または真菌などの微生物（単数または複数）の付着および／または侵入を減少させる、上述される組成物である。微生物は、粘膜表面上の微生物叢の一部、例えば、口腔微生物叢または腸内微生物叢であってもよい。好ましくは、組成物は、微生物に結合する免疫グロブリンおよび／または微生物が産生する毒素を含む。好ましくは、例えば、表面に曝露されたＰＲＲまたは細胞内ＰＲＲ（パターン認識受容体、例えばＴｏｌｌ様受容体）との特異的な微生物表面成分（例えば、ＰＡＭＰ、病原体関連分子パターン）の結合からもたらされる、細胞内炎症促進性下流カスケードの活性化を防止するために、無傷または損傷した粘膜表面への微生物による付着および／または侵入は、少なくとも２５％減少され、好ましくは、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％減少され、より好ましくは、少なくとも５０％減少され、理想的には、さらに増加した程度、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％減少される。

本発明のさらなる態様は、粘膜への局所投与が粘膜創傷治癒を促進する、上述される組成物である。好ましくは、本発明の組成物は、増殖因子、例えば、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、または他の創傷治癒を促進する因子、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、形質転換増殖因子（例えば、ＴＧＦ−αまたはβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の１つまたはそれ以上を分泌するように上皮細胞を刺激する。したがって、組成物は、コラーゲン、ラミニンまたはフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの成分を分泌し、血管新生を促進させるために固有層の上皮細胞および線維芽細胞を刺激し得る。

好ましくは、増殖因子を分泌させる刺激は、生物学的に有意であり、例えば、増殖因子の分泌は、標的細胞における有意な効果が達成されるような程度まで刺激される。

本発明のなおさらなる態様は、粘膜への局所投与が抗炎症作用を及ぼす、本発明の組成物である。本発明の組成物の抗炎症作用は、さらに
（ａ）炎症促進性サイトカイン発現の阻害；および／または
（ｂ）抗炎症性サイトカインの発現の刺激
において特徴付けられ得る。

好ましくは、粘膜における１つまたはそれ以上の主要な炎症促進性サイトカインの発現が、本発明の組成物によって減少され、より好ましくは、２つまたはそれ以上の主要な炎症促進性サイトカインの発現が減少され、さらにより好ましくは、３つまたはそれ以上の炎症促進性サイトカインの発現が減少される。好ましくは、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＰ１０から選択される。好ましくは、発現の減少は、少なくとも２５％の減少、好ましくは、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％の減少、より好ましくは、少なくとも５０％の減少、理想的には、さらに増加した程度、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％またはさらにそれより高い減少である。

好ましくは、１つまたはそれ以上の主要な抗炎症性サイトカインの発現が、本発明の組成物によって刺激され、より好ましくは、２つまたはそれ以上の抗炎症性サイトカインの発現が刺激され、さらにより好ましくは、３つまたはそれ以上の抗炎症性サイトカインの発現が刺激される。好ましくは、抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−βから選択される。好ましくは、発現の刺激は、少なくとも２倍の刺激であり、より好ましくは少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍の刺激であり、さらにより好ましくは少なくとも１００倍の刺激であり、最も好ましくは５００倍またはそれを超える刺激である。

より好ましくは、炎症促進性サイトカインの発現の減少と抗炎症性サイトカインの発現の刺激の両方は、本発明の組成物によって提供される。

本発明の別の態様は、消化管の粘膜炎を発症するリスクがある対象が、化学療法および／または放射線療法を受けているまたは受けようとしている癌患者である、上述される組成物である。特に、粘膜炎を発症するリスクがある対象は、以前の化学療法および／または放射線療法の処置の結果として粘膜炎を発症した癌患者である。以前の化学療法および／または放射線療法の処置は、化学療法および／または放射線療法を受けた後に寛解していた患者における一連の治療サイクルにおける初期の治療サイクル、または一連の治療サイクルの治療の一部であってもよいが、この場合、癌が再発しており、別の一連の化学療法および／または放射線療法が指示されている。

本発明の組成物は、予防的に与えられてもよく、または活性な既存の粘膜炎の治療として与えられてもよい。好ましくは、治療は、発生している粘膜炎の症状に先立って開始される。治療は、化学療法および／または放射線療法の開始前、開始と同時、または開始後に始めてもよい。好ましくは、化学療法を受けている患者において、組成物の投与は、患者が好中球減少（すなわち、絶対好中球数（ＡＮＣ）＜０．５×１０^９／Ｌ）となり、したがって、粘膜炎を発症するリスクがあるときに開始される。好ましくは、治療は、好中球減少期間を通じて、ＡＮＣが回復するまたは０．５×１０^９／Ｌに到達し、粘膜炎が臨床的に解消するまで続けられる。粘膜炎を頻繁に誘発する化学療法剤には、とりわけ、メトトレキサート、アントラサイクリン、５−フルオロウラシル、および骨髄破壊的な化学療法レジメンが挙げられる。好ましくは、局所的な放射線療法を受けている患者において、組成物は、治療の全期間中、粘膜炎が解消するまで投与される。

本発明の組成物は、患者に、１日あたり最大６回まで、好ましくは１日あたり最大５回まで、より好ましくは１日あたり最大４回まで、さらにより好ましくは１日あたり最大３回まで、最も好ましくは１日あたり２回またはそれよりも少ない頻度で投与される。

本発明の別の態様において、組成物は、増殖因子または防腐剤などの粘膜炎の治療のための追加の有効な薬剤を含む。また、消化管の粘膜炎の治療における、同時の、個別のまたは逐次的な使用のための併用調製物として、本発明の組成物および第二の活性薬剤を含む製造物も本発明に含まれる。このような第二の活性薬剤は、例えば、増殖因子などの創傷治癒を促進する薬剤、防腐剤などの抗菌剤、例えば、殺菌性口内洗浄液、または抗炎症剤であってもよい。

本発明は、以下の図面を参照して、以下の非限定的な例において例証される。

ゲルスロットの１ｍｍあたり０．５μｇ／ｍｌのタンパク質としたイムノブロット分析（１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、続くウエスタン転写、ならびにｍＡｂ１７Ｃ７（三量体と単量体のＵｓｐＡ１およびＵｓｐＡ２の両方に特異的である）［パネルＡ］、ｍＡｂ２４Ｂ５（単量体ＵｓｐＡ１に特異的である）［パネルＢ］、およびｍＡｂ１０Ｆ３（ＣｏｐＢに特異的である）［パネルＣ］を用いたＯＭＰの検出を示す図である。ＨＲＰをコンジュゲートした二次ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、一次抗体を検出するために使用した。 ゲルスロットの１ｍｍあたり０．４μｇ／ｍｌのタンパク質としたイムノブロット分析（１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、続くウエスタン転写、および一次抗体の供給源として、ヒトのプールされた唾液（０．３ｇ／ｌ）［パネルＡ］、血漿ＩｇＡ Ｆ４［パネルＢ］またはプールされた血漿ＩｇＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ（登録商標））［パネルＣ］、ならびに化学発光を用いた可視化のための適切なＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体を用いた抗体結合の検出を示す図である。 ＩｇＡ Ｆ４を用いた付着阻害アッセイを示す図である。ＭＥＭおよびＭＥＭ−ＰＢＳを陰性対照として使用した。５ｍｇ／ｍｌのＩｇＡ Ｆ４が補足されたＯ３５Ｅ．１およびＯ３５．１を陽性対照として使用した。全体のｐ値（一方向ＡＮＯＶＡ）は＜０．０００１であった；^＊は有意差＜０．０５を示す。 ＩｇＡ Ｆ５Ａを用いた付着阻害アッセイを示す図である。ＭＥＭおよびＭＥＭ−ＰＢＳを陰性対照として使用した。５ｍｇ／ｍｌのＩｇＡ Ｆ５Ａが補足されたＯ３５Ｅ．１およびＯ３５．１を陽性対照として使用した。全体のｐ値（一方向ＡＮＯＶＡ）は＜０．００１であった；^＊は有意差＜０．０５を示す。 ＩｇＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ（登録商標））を用いた付着阻害アッセイを示す図である。ＭＥＭ、ＭＥＭ−プロリンおよびＭＥＭ−ＰＢＳを陰性対照として使用した。１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧが補足されたＯ３５Ｅ．１およびＯ３５．１を陽性対照として使用した。全体のｐ値（一方向ＡＮＯＶＡ）は０．００９であった；カラム間の差はいずれも統計的有意差に至らなかった。 ＩｇＭ Ｆ５Ａを用いた付着阻害アッセイを示す図である。ＭＥＭおよびＭＥＭ−ＰＢＳを陰性対照として使用した。５ｍｇ／ｍｌのＩｇＭ Ｆ５Ａが補足されたＯ３５Ｅ．１およびＯ３５．１を陽性対照として使用した。全体のｐ値（一方向ＡＮＯＶＡ）は＜０．００１であった；^＊は有意差＜０．０５を示す。 １０ｍｇ／ｍｌ濃度のＩｇＡ Ｆ４が上皮細胞への細菌の浸潤を有意に阻害したことを実証するＭ．カタラーリス（M.catarrhalis）侵入アッセイを示す図である。全体的なｐ値（一方向ＡＮＯＶＡ）は０．０１４であった；^＊は有意差＜０．０５を示す。細胞侵入の完全な阻害を示す信頼性の高い対照を利用できなかった。 １０ｍｇ／ｍｌ濃度のプールされた血漿ＩｇＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ（登録商標））が上皮細胞への細菌の浸潤を有意に阻害したことを実証するＭ．カタラーリス（M.catarrhalis）侵入アッセイを示す図である。全体的なｐ値（一方向ＡＮＯＶＡ）は０．０１５であった；^＊は有意差＜０．０５を示す。細胞侵入の完全な阻害を示す信頼性の高い対照を利用できなかった。 ５および２．５ｍｇ／ｍｌ濃度のＩｇＭ Ｆ５Ａが上皮細胞への細菌の浸潤を有意に阻害したことを実証するＭ．カタラーリス（M.catarrhalis）侵入アッセイを示す図である。全体的なｐ値（一方向ＡＮＯＶＡ）は＜０．０００１であった；^＊は有意差＜０．０５を示す。細胞侵入の完全な阻害を示す信頼性の高い対照を利用できなかった。 ＩｇＡ Ｆ４の抗炎症活性は、Ｍ．カタラーリスの外膜タンパク質（ＯＭＰ）で刺激したＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞を用いて評価した図である。濃度増加させたＩｇＡをＯＭＰ刺激時の細胞に適用した。Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞によるＭＣＰ−１（Ａ）、ＩＬ−８（Ｂ）およびＩＬ−６（Ｃ）の分泌は、マルチプレックスサスペンションアレイ（ルミネックス技術）を用いて、刺激開始時（ｔ＝０）と２４時間後（ｔ＝２４）に測定された。陰性対照は、ＯＭＰを添加していない試料である。 ＩｇＡ Ｆ４の抗炎症活性は、Ｈ３７６細胞およびＨＧＦ−１細胞を用いて評価した図である。濃度増加させたＩｇＡを休止Ｈ３７６細胞とＨＧＦ−１細胞に適用し、または刺激時（ＨＧＦ−１細胞）に適用された。Ｈ３７６によるＩＰ−１０細胞（Ａ）とＧ−ＣＳＦ細胞（Ｂ）の分泌とＨＧＦ−１細胞（Ｃ）によるＩＰ−１０の分泌は、マルチプレックスサスペンションアレイ（ルミネックス技術）を用いて、刺激から２４時間後に測定された。 図１１−１の続き。 ＩｇＡ Ｆ４を用いて付着阻害アッセイを示す図である。ＩｇＡ Ｆ４は、Ｈ３７６細胞へのＳ．ニューモニエ（S.pneumoniae）Ｒ６（Ａ）とＳ．ミチス（S.mitis）（Ｂ）の付着能力を妨げる。 ＩｇＡ Ｆ４を用いた細胞毒性アッセイを示す図である。γ線照射によって誘導したＨ３７６細胞の細胞死におけるＩｇＡ Ｆ４の線量効果の減少。（Ａ）時系列に記述されるように実験を行った。（Ｂ）照射から２４時間後、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞死を測定した。数字は、ジギトニンで処理されたＨ３７６細胞試料中で測定された総細胞毒性と比較した特異的な細胞死に対応する。 ＩｇＡ Ｆ４を用いた創傷治癒アッセイを示す図である。（Ａ）時系列に記述されるように実験を行った。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）細胞単層における人工ギャップの閉鎖は、異なる時間間隔でのスクラッチの画像を取り込むことによって記録され、ギャップサイズが測定された。１００％創傷の再上皮形成は、人工ギャップの完全な回復に対応している。 上皮細胞系におけるＩｇＡ受容体の分析を示す図である。ＣＤ７１およびＣＤ８９（または関連するアイソタイプ対照）に対する染色は、Ｈ３７６細胞およびデトロイト細胞において行われ、フローサイトメーターを用いて分析された。 ＩｇＡ Ｆ４調製物およびＩｇＧ調製物における抗ＴＮＦ活性をＥＬＩＳＡによって評価した図を示す。ＥＬＩＳＡプレートのウェルをＴＮＦα（１μｇ／ｍｌ）で被覆し、さらにブロッキングした。濃度増加させたＩｇＡ Ｆ４、ＩｇＧおよび抗ＴＮＦα抗体（モノクローナル、インフリキシマブ）をウェルに適用した。いくつかのウェルでは、遊離ＴＮＦαを添加し、試験された抗体の特異的結合を阻害した（競合アッセイ；バー）。洗浄後、ＴＮＦαを結合した免疫グロブリンを、ＨＲＰ標識した特異的二次抗体を用いて明らかにした。

実施例に包含される研究は、免疫グロブリンが、組み合わせた抗菌および抗炎症／前創傷治癒効果を有し得、したがって、消化管の粘膜炎、特に口腔粘膜炎の効果的な予防および治療のための魅力的な選択肢であることを示す。

口腔咽頭腔の粘膜上皮細胞層を模倣するために上皮細胞系を用いた。このような研究に適した細胞系の一例は、ヒト咽頭細胞系Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３８）である。使用されるさらなる適切な細胞系は、Ｈ３７６の口腔底由来の扁平上皮癌細胞系、およびＨＧＦ−１の歯肉線維芽細胞系である。粘膜微生物叢の一部である微生物の例として、本発明者らは、典型的な鼻咽頭および口咽頭病原体であるモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ならびにストレプトコッカス属種などの口腔微生物叢に見出される他の細菌を使用した。このモデル実験系は、予備のインビトロ実験に適していると考えられた。これは、細胞系の起源が、経口投与された免疫グロブリンの作用の意図された（好ましい）部位に対応するためである。さらに、Ｄｅｔｒｏｉｔ細胞は、以前に、細菌（生存したもしくは不活性化された細菌全体または細菌表面成分）で曝露されたとき、炎症促進性活性化を示すことが示されている。通性病原体であり、唯一の天然生息域がヒト咽頭であるＭ．カタラーリスを選択した。これは、インビトロにおいてＤｅｔｒｏｉｔ細胞に付着し、浸潤するＭ．カタラーリスの能力に起因し、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびＧＭ−ＣＳＦなどの炎症促進性メディエータの分泌を誘導するためである。また、Ｍ．カタラーリスの特定の外膜タンパク質（例えば、ＵｓｐＡ１およびＵｓｐＡ２）は、付着および侵入を仲介し、さらにＣＥＡＣＡＭ１とＴＬＲ２に結合することによって、炎症促進性カスケードを誘発する。これらの外膜タンパク質の同質遺伝子ノックアウト変異体を利用することができる。Ｍ．カタラーリスのＵｓｐＡ１とＵｓｐＡ２は、ヒト免疫系によって認識される既知の免疫原であり、健康な個体に特定の血漿および唾液ＩｇＡおよびＩｇＭを誘導する。さらに、ストレプトコッカス属種、特にＳ．ミチスおよびＳ．ニューモニエは、口腔内に存在する典型的な日和見病原体として使用された。このようにして、このインビトロモデルは、細菌の付着および侵入、ならびに炎症の細菌誘導におけるヒト免疫グロブリン製剤の効果を評価するのに適している。

〔実施例１〕
血漿由来および唾液由来の免疫グロブリン製剤はＭ．カタラーリスを認識する抗体を含む
本発明者らの免疫グロブリン製剤が抗菌作用を有することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、最初に、口咽頭管の粘膜表面に見られる潜在的な病原体を認識する抗体を含むかどうかを確立しようとした。このような微生物の例として、Ｍ．カタラーリスを使用した。

１．１．細菌株およびヒト細胞系。Ｍ．カタラーリス株２５２３８をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。実験室株Ｏ３５Ｅは、耳炎の子供からの中耳単離物である。細菌は、脳−心臓浸出液（ＢＨＩ）寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）上で３７℃にて５％ＣＯ_２雰囲気下で培養され、またはＢＨＩブロス中で３７℃にて毎分２００回（ｒｐｍ）で培養された。いくつかの実験において、細菌は、ＰＢＳ中で生存している細菌の再懸濁および６０℃にて６０分間のインキュベーションによって熱不活性化された。ヒト咽頭細胞系Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３８）は、１０％の熱不活化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１×非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補足されたＥａｇｌｅ最小必須培地（ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に３７℃にて５％ＣＯ_２下で維持された。

１．２．試薬。プールされたヒト免疫グロブリンアイソタイプ（それぞれ、ＩｇＡ（「ＩｇＡ Ｆ４」［５０ｍｇ／ｍｌ］、「ＩｇＡ Ｆ５Ａ」［５０ｍｇ／ｍｌ］）、ＩｇＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ（登録商標）［１００ｍｇ／ｍｌ］）およびＩｇＭ（「ＩｇＭ Ｆ５Ａ」［１０ｍｇ／ｍｌ］）をＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得た。ＩｇＧ製剤は、市販のヒト静脈のＩｇＧ（ＩＶＩＧ）製剤（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ（Ｒ））である。精製されたヒト血漿のＩｇＡおよびＩｇＭ画分は実験製造物である。ＩｇＡは、ＭＰＨＱカラムの連続溶出、続くアフィニティークロマトグラフィーによる分離によって血漿から製造された。ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＩＶＩｇの製造プロセスのＡＩＥＸクロマトグラフィー工程から、画分Ｆ４は、１０ｍＭリン酸塩／３０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ６．５）を用いたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅ、ＣＡ）カラムの後洗浄後、５５ｍＭ酒石酸塩／５ｍＭ酢酸塩（ｐｈ７．６）による溶出によって得られた。その後、画分Ｆ５は、５０ｍＭリン酸塩／２５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５．０）を用いて溶出された。Ｆ４とＦ５は、限外／透析ろ過によってＰＢＳ中で約１ｍＧ／ｍＬにされ、次に、ＩｇＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによってＩｇＧを枯渇させた。ＩｇＡ Ｆ４は、Ｆ４充填のＩｇＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーのフロースルーにおいて直接回収された。ＩｇＡ Ｆ５を得るために、Ｆ５充填のＩｇＳｅｌｅｃｔのフロースルーは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＭ樹脂（Ｂｉｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｍｐａｎｙ ＢＡＣ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによってＩｇＭを枯渇させた。このＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトＩｇＭ樹脂の溶出は、ここで使用されるＩｇＭ Ｆ５画分をもたらした。ＩｇＡ Ｆ４、ＩｇＡ Ｆ５およびＩｇＭ Ｆ５は、限外／透析ろ過によって最終濃度にした。

１．３．イムノブロット解析。２５２３８およびＯ３５Ｅ菌株の外膜タンパク質（ＯＭＰ）調製物は、ＥＤＴＡバッファー法（Ｍｕｒｐｈｙ ＴＦ ＆ Ｌｏｅｂ ＭＲ（１９８９年）Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ ６：１５９−７４頁）によって調製され、それぞれ図１と２において、ゲルスロットの０．５と０．４μｇ／ｍｍのタンパク質濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）によって分別された。その後、ゲルは、ＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）にエレクトロトランスファーされた。イムノブロット分析は、モノクローナル抗体（１７Ｃ７（Ａｅｂｉ Ｃら（１９９７年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：４３６７−７７頁）、２４Ｂ５（Ｃｏｐｅ ＬＤら（１９９９年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：４０２６−３４頁）、１０Ｆ３（Ａｅｂｉ Ｃら（１９９８年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：３１１３−９頁）［０．５％のｍＡｂ上清、絶対濃度は不明である］）、および唾液または上記したプールされたヒトＩｇＡまたはＩｇＧ（０．４μｇ／ｍｌ）を一次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した、１：４０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＡまたはＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を二次抗体として使用して行われた。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、抗体結合を検出するために使用した。

図１は、ＡＴＣＣ２５２３８菌株のＯＭＰが、主要なＯＭＰ ＵｐＡ１（ｍＡｂ １７Ｃ７およびｍＡｂ ２４Ｂ５）、ＵｓｐＡ２（ｍＡｂ１７Ｃ７）およびこれらのｍＡｂを生じさせ、Ｍ．カタラーリスの主要でより臨床的に関連した系統発生上の系統１（Ｍｅｉｅｒ ＰＳら（２００５年）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：２０００−８頁）の標準的な代表であるＯ３５Ｅ菌株（Ｈｅｌｍｉｎｅｎ ＭＥら（１９９３年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６１：２００３−１０頁；Ｈｅｌｍｉｎｅｎ ＭＥら（１９９４年）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７０：８６７−７２頁；Ｃｏｐｅ ＬＤら（１９９９年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：４０２６−３４頁）に類似したＣｏｐＢ（ｍＡｂ１０Ｆ３）、に指向される３つのモノクローナル抗体と強く反応することを示す。

その後、本発明者らは、ヒト血漿および唾液が、標準的なイムノブロットアッセイ（Ｓｔｕｔｚｍａｎら（２００３年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１：６７９３−８頁）を用いて、ＡＴＣＣ２５２３８とＯ３５Ｅの両菌株に由来するＭ．カタラーリスＯＭＰと反応する抗体を含むことを確認した。図２は、ヒト唾液とＯＭＰの両方が、ヒトＩｇＡ（唾液、ＯＭＰ）、および／またはＩｇＧによって認識される複数の抗原を含むことを示す。

これは、Ｍ．カタラーリスの参照小児中耳単離物として世界中で使用され、利用可能なモノクローナル抗体の生成のために使用される、標準Ｏ３５Ｅ系統群１菌株（Ｂｏｏｔｓｍａ ＨＪら（２０００年）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８１：１３７６−８７頁）として、ＡＴＣＣ２５２３８菌株は、上皮細胞付着因子（ｍＡｂの１７Ｃ７と２５Ｂ４）の発現において同様に振る舞うことを、最初に解明することは重要であった。図１は、これがその事例であることを示す。さらに、図２に示すように、血漿由来のＩｇＡおよびＩｇＧは、同じＡＴＣＣ２５２３８の外膜エピトープを認識し、これは、本発明者らの一連の実験においてこの菌株の有用性をさらに実証する。ＵｓｐＡ１主要付着因子（ｍＡｂの１７Ｃ７と２４Ｂ５の両方と反応する）は、ヒトフィブロネクチンおよびＣＥＡＣＡＭ１（Ｂｒｏｏｋｓ ＭＪら（２００８年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６：５３２２−９頁）と反応するドメインを含み、したがって、の多種多様のヒト上皮細胞系に結合すべきであることは、ここで注目される。イムノブロットにおける明確なバンドの生成は、抗体が、それらの特異的抗原結合（Ｆａｂ）ドメインによって外膜小胞に結合するという概念を支持する。

〔実施例２〕
上皮細胞への細菌接着の阻害
本発明の免疫グロブリン製剤の抗菌作用をさらに実証するために、免疫グロブリン調製物が、咽頭上皮細胞系Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２へのＭ．カタラーリスの接着の阻害において有効であるかどうかを試験した。

インビトロにおけるヒト上皮細胞に付着するＭ．カタラーリスの能力は、先に記載されるように測定された（Ａｅｂｉ Ｃら（１９９８年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：３１１３−９頁）が、以下の変更を伴った。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞（１ウェルあたり約３×１０^５細胞）は、０．１％ＦＣＳが補足されているが、抗体を含まないＭＥＭ中で、２４ウェルの組織培養プレートにおいてコンフルエントな単層になるまで一晩増殖され、ＭＥＭ中で３回洗浄された。細菌を一晩増殖させ、感染の適切な多重度（ＭＯＩ）に調整した。生存している細菌は、適切な濃度の免疫グロブリン（上の段落１．２に記載したように調製した）または対照（例えば、ＩｇＧアッセイに関してプロリン）が補足されているが、抗体を含まない、ＦＣＳ不含ＭＥＭ中でウェルに添加され、５分間、１，５００ｒｐｍで遠心分離され、その後、３０分間、３７℃にてインキュベートされた。次に、ウェルをＭＥＭ中で５回洗浄し、トリプシン処理し、懸濁液は、付着細菌の数を決定するために定量的に培養された。Ｏ３５Ｅ．１菌株（すなわち、対立遺伝子置換によって生成された同質遺伝子ｕｓｐＡ１の付着因子ノックアウト変異体（Ａｅｂｉ Ｃら（１９９８年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：３１１３−９頁））を陽性（すなわち、付着阻害）対照として使用した。データは、上皮細胞に付着する元の接種材料の細菌の割合として表された。各々のアッセイを３連で実施し、少なくとも３つの実験を行い、調査した条件あたり少なくとも９個のデータ点を得た。細胞生存率は、トリパンブルー排除、および市販のＬＤＨアッセイ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって形態学的に確認された。

ＩｇＡ Ｆ４（図３）とＩｇＡ Ｆ５（図４）の両方は、５ｍｇ／ｍｌ濃度で付着を有意に阻害した。陽性対照Ｏ３５．１と５ｍｇ／ｍｌのＩｇＡが補充されたＯ３５．１の付着は有意に低かった。プールされたヒト血漿ＩｇＧによる付着阻害は全体的に有意であった。しかし、カラム間の差は統計学的な有意性に達成しなかったが、図５は、ＩｇＧ濃度依存的な阻害効果を示唆する。一方、図６に示すように、ＩｇＭ Ｆ５Ａ画分は、強力な付着阻害効果を示した。

ＩｇＡ Ｆ４およびＩｇＡ Ｆ５は、５ｍｇ／ｍｌ濃度でＤｅｔｒｏｉｔ細胞への付着を有意に阻害することが見出された（図３および図４参照）。用量効果曲線が存在するようであった。主要な付着因子であるＵｓｐＡ１の発現が欠損している同質遺伝子変異体である陽性対照菌株Ｏ３５．１の付着もまた有意に低かった（有意性を示さなかった）。これらの所見は、血漿ＩｇＡが、−生理的な唾液濃度を約１ｌｏｇ_１０超える濃度で−インビトロで咽頭上皮細胞へのＭ．カタラーリスの結合を阻害することができることを示す。これらのデータは、細菌表面成分（例えば、ＯＭＰ、ＬＯＳ）の炎症促進作用を防ぐ中和「粘膜」抗体としてその可能性を支持する。同様の知見は、精製された血漿ＩｇＭ Ｆ５Ａについて記録された（図６）。統計的な有意性が得られなかったが、類似の傾向（図５）がまた血漿ＩｇＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ（登録商標））について観察された。これは、結合したＩｇＧ（およびＩｇＭ抗体）がヒト補体を強く活性化し、その後の死滅またはオプソニン化を伴う細菌結合が粘膜炎の予防に望ましくない場合があることを言及することは注目に値する。しかしながら、補体がヒト腔において活性であるのかどうか、およびどの程度活性であるのかは知られていない。

〔実施例３〕
免疫グロブリンによる上皮細胞の細菌侵入の阻害
以前に示されているように（Ｓｐａｎｉｏｌ Ｖら（２００８年）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ １０：３−１１頁）、Ｍ．カタラーリスは、小児および若年成人において、インビボで上皮細胞に浸潤し、さらに粘膜下咽頭の軟部組織に局在し得る（Ｈｅｉｎｉｇｅｒ Ｎら（２００７年）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９６：１０８０−７頁）。したがって、本発明者らは、インビトロで咽頭上皮細胞の浸潤を阻害するヒト免疫グロブリンの可能性を調査し、免疫グロブリン製剤の潜在的な利点をさらに実証した。

細菌侵入は、先に記載されるようにゲンタマイシン保護アッセイ（Ｓｐａｎｉｏｌ Ｖら（２００８年）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ １０：３−１１頁）を用いて評価され、以下の変更を伴った。細胞は、抗生物質を含まない培地中で調製された。洗浄後、細菌は、上の段落１．２に記載されるように調製された、所定濃度の各々の免疫グロブリンとともに３０のＭＯＩで添加され、５分間、１，５００ｒｐｍで遠心分離され、３時間３７℃にて５％ＣＯ_２下でインキュベートされた。細胞内細菌の数を決定するために、感染された単層をＰＢＳ中で３回洗浄し、硫酸ゲンタマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を用いて、２時間３７℃にて処理された。洗浄後、細胞は、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いた処理によってプラスチック表面から脱着され、１％サポニンの添加によって溶解され、定量的な細菌培養のためにＰＢＳ中で連続的に希釈された。侵入率は、接種されたｃｆｕ数によるゲンタマイシン曝露後に回収されたｃｆｕ数で割ることによって計算された。

図７は、１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＩｇＡ Ｆ４が、０．１ｍｇ／ｍｌと比較して、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２咽頭細胞の浸潤を有意に阻害したことを示している。１０ｍｇ／ｍｌと陰性対照（ＭＥＭ−ＰＢＳ）の比較は、有意性に到達しなかった。同様に、１０ｍｇ／ｍｌのヒトのプールされた血漿ＩｇＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ（登録商標））は、ＭＥＭ−ＰＢＳの陰性対照と比較して侵入を有意に阻害した。これはまた、血漿ＩｇＭ Ｆ５について当てはまり、５ｍｇ／ｍｌで、ＭＥＭ−ＰＢＳ対照および０．１ｍｇ／ｍｌの最低濃度のＩｇＧと比較して、侵入の有意な阻害を実相した。図７〜９中の分散度として、本発明らは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を用いた。また、本発明者らは、Ｄｅｔｒｏｉｔ細胞の浸潤を完全に行えない「陽性」対照の提示を控えることを余儀なくされ、これは、このような細菌が利用できなかったためである。

より多くの古典的な細胞外病原体が、最近、粘膜上皮細胞層全体に浸潤しまたはトランスサイトーシスすることが見出されている。例えば、分類不可能なヘモフィラス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）（Ｅｌｄｉｋａ、Ｎ ＆ Ｓｅｔｈｉ Ｓ（２００６年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ １２：１１８−２４頁）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（Ｑｕｅ ＹＡら（２００５年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１：１６２７−３５頁）などが挙げられる。細胞内持続性は、粘膜免疫を回避する手段であってもよく、ホストの上皮下腔および−最終的には−血管腔に接近するためであってもよい。これは、発熱性好中球減少症および粘膜炎を有する患者において特に関連性があり得る。本発明者らは、確立されたゲンタマイシン保護アッセイを用いて、上皮浸潤の免疫グロブリン媒介性阻害を測定し、３つ全てのアイソタイプがＤｅｔｒｏｉｔ細胞の浸潤を阻害し得ることを見出した。ＩｇＡ Ｆ４（図７）およびＩｇＭ Ｆ５Ａ（図９）の場合において、有意な阻害は、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌで観察された。再度、同様の傾向が、統計的に有意ではないが、血漿ＩｇＧについて見出された（図８）。

〔実施例４〕
免疫グロブリンによる上皮サイトカイン／ケモカイン放出の調節
免疫グロブリンの抗炎症作用の可能性を示すために、免疫グロブリン製剤が、上皮細胞によるサイトカイン／ケモカイン放出に影響を与えるかどうかについて調べた。

Ｄｅｔｒｏｉｔ細胞単層を調製し、濃度増加させたＩｇＡ Ｆ４の存在下で、様々な濃度のＭ．カタラーリスのＯＭＰ（ＯＭＰ調製について実施例１．３参照）を用いて刺激した。陰性対照は、ＯＭＰを含むまたは含まない培地で構成された。個別の上清を刺激後の０時および２４時間で回収し、次に、分析するまで−８０℃に維持した。本実験において、試料は、検出前に１６時間、一晩インキュベートされた。マトリックス溶液として、本発明者らは、０．１％ＦＣＳでＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地（Ｓｉｇｍａ、Ｒ８７５８）を使用した。試料を調製後、Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００アナライザー（ＢｉｏＲａｄ）を用いてデータを取得した。Ｄｅｔｒｏｉｔ細胞の調製、様々な濃度の免疫グロブリンおよびＯＭＰへの曝露は、ベルン大学感染症研究所で実施された。サイトカイン／ケモカインの測定は、ＣＳＬベーリング（Ｂｅｒｎ）で行われた。

０時で、Ｄｅｔｒｏｉｔ細胞は、ＯＭＰと様々な濃度のＩｇＡ Ｆ４が補足されたまたは補足されていない新鮮な培地を受け入れた。こうした理由から、図１０Ａ、Ｂ、Ｃに示されるように、この時点で上清中にサイトカインはほとんど検出することができなかった。２４時間で、いずれのＯＭＰを含まない場合、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞は、検出可能なレベルのＭＣＰ−１、ＩＬ−８およびＩＬ−６を分泌した（図１０Ａ、Ｂ、Ｃ）。ＭＣＰ−１は、単球／マクロファージの動員を制御する主要なケモカインである。それは、多くの疾患に関与している（Ｄｅｓｈｍａｎｅ ＳＬら（２００９年）Ｊ．Ｉｎｔ．＆ Ｃｙｔ．Ｒｅｓ．２９、６、３１３−３２６頁）。ＩＬ−８または好中球走化性因子は、好中球を組織に動員するケモカインである。また、それは口腔内の炎症に関連している（Ｅｒｔｕｇｒｕｌ ＡＳら（２０１３年）Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ Ｒｅｓ；４８：４４−５１頁）。最後に、また、ＩＬ−６は、炎症の重要なメディエータであり、照射された線維芽細胞において誘導されることが示されている（Ｂｒａｃｈ ＭＡら（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８４６６−８４７２頁；Ｒｉｎｃｏｎ Ｍ（２０１２年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（１１）５７１−５７７頁）。重要なことには、培地へのＯＭＰの添加は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８およびＩＬ−６産生をそれぞれ約１０倍、３倍および７倍増加させた。さらに、少量のＩｇＡ Ｆ４は、ＯＭＰにより誘導されたケモカイン／サイトカイン産生においてほとんど影響を及ぼさなかったが、１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＡは、ＭＣＰ−１分泌を顕著に減少させ、より少ない程度にＩＬ−８およびＩＬ−６分泌を減少させた。

これらの結果を支持するために、本発明者らは、追加の細胞系についてＩｇＡ Ｆ４活性を試験することを目的とした。口腔底の組織は、口腔粘膜炎の経過中に損傷した組織の１つを表している。本発明者らは、口腔底に由来する新たな細胞系であるＨ３７６（ヒト口腔扁平上皮癌；ＨＰＡＣＣ ０６０９２００５）を見出した。Ｈ３７６に加えて、本発明者らは、歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ−１細胞系；ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２０１４（商標））を研究するために選択した。これは、歯肉線維芽細胞が口腔内の上皮細胞下に位置され、口腔粘膜炎の経過で炎症を感知するためである。

以下の実験において、本発明者らは、Ｈ３７６およびＨＧＦ−１細胞のサイトカインプロファイルを分析した。

細胞単層は、２つの濃度のＩｇＡ Ｆ４（ＭＥＭ中で調製した５および１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下で調製された。陰性対照は、培地単独（純粋なＭＥＭ細胞培養培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５１２００−０４６）からなっていた。個別の上清を２４時間で回収した。ＨＧＦ−１細胞は、線維芽細胞を刺激することが知られている炎症促進性サイトカイン（例えば、組換えＩＬ−１βおよびＴＮＦα、ともに５０ｎｇ／ｍｌ、それぞれＭｉｌｔｅｎｉ（１３０−０９３−８９３）およびＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（３００−０１ Ａ）から入手）で刺激された。刺激後、次に、分析するまで、上清を−８０℃にて維持した。マトリックス溶液として、本発明者らはＭＥＭを使用した。試料を調製後、Ｂｉｏｐｌｅｘ ２００アナライザー（ＢｉｏＲａｄ）を用いてデータを取得した。

Ｈ３７６細胞は、炎症と関連したＩＦＮ−γによって誘導されるタンパク質であるＩＰ−１０（Ｌｉｕ Ｍら（２０１１年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２２（３）、１２１−１３０頁）、および炎症部位で好中球を動員し得る炎症性メディエータを表すＧ−ＣＳＦ（Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ（２００２年）Ｂｌｏｏｄ ９９：１８６３−１８６５頁）を分泌した（図１１Ａ、Ｂ）。図１１ＡおよびＢにおいて、本発明者らは、ＩｇＡ（５ｍｇ／ｍｌ）によるＨ３７６細胞の処理が、ＩＰ−１０とＧ−ＣＳＦ産生の両方を約５０％に強力に減少させたことを示す。１０ｍｇ／ｍｌへのＩｇＡの濃度増加は、Ｇ−ＣＳＦ産生をさらに減少させなかったが、ＩｇＡ（５ｍｇ／ｍｌ）よりもわずかに良好にＩＰ−１０産生を減少させた（図１１Ａ、Ｂ）。Ｈ３７６細胞は腫瘍細胞であり、活性化された表現型を有する可能性があった。本発明者らは、ＩＰ−１０とＧ−ＣＳＦレベルの両方が、初代口腔上皮細胞における場合ほどには高くない可能性があることを除外することができない。

ＨＧＦ−１は歯肉線維芽細胞である。それらは、定常状態でいずれものＩＰ−１０を産生しなかった（図１１Ｃ）。しかしながら、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αなどの炎症性分子が培地（純粋なＭＥＭ）も適用されたときに、ＩＰ−１０産生の明確な誘導があった。ＴＮＦαは、同等の濃度で、ＩＬ−１βよりもＩＰ−１０誘導において強力であった。両方の条件において、刺激時でのＩｇＡ添加は、ＩＰ−１０産生を強く減少させた。最も高いＩｇＡ Ｆ４濃度は最も強い減少を示した。それにもかかわらず、ＩｇＡ Ｆ４（５ｍｇ／ｍｌ）は、非常に類似した免疫抑制作用を示した（図１１ｃ）。

要約すると、本発明者らのデータは、ＩｇＡ Ｆ４が、骨髄細胞（例えば、上皮細胞）ではない細胞において免疫抑制作用を及ぼすことを示した最初のものである。これは、口腔粘膜炎の経過中に、炎症促進性ケモカインおよびサイトカインが、電離放射線および／または上皮細胞および線維芽細胞による細菌定着に応答して上方制御されるため、非常に有益な情報である。これらの結果は、口腔粘膜炎の経過中に、ＩｇＡが、広範囲の細胞サブセット（例えば、好中球、マクロファージ、上皮細胞など）におけるその免疫抑制作用を潜在的に標的とすることを示す。

〔実施例５〕
免疫グロブリンによる、Ｍ．カタラーリス以外の細菌の付着、侵入および該細菌によって誘導される上皮サイトカイン／ケモカイン放出の調節の阻害
同様の実験において、実施例１〜４に記載されているように、Ｍ．カタラーリス以外の細菌、または真菌などの他の微生物を調べる。微生物には、限定されないが、病原性および日和見病原性種、例えば、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridans）群、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumonia）、エンテロコッカス・フェカリス／フェシウム（Enterococcus faecalis/faecium）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、および多くの種の嫌気性細菌が挙げられる。実施例１〜４に記載されているのと同様の結果が得られる：ＩｇＡ調製物は、上記の細菌または真菌に対する特異的な抗体を含む；上皮細胞の付着および侵入は阻害される；炎症性サイトカイン反応は阻害される。同様の結果が他の上皮細胞系を用いて得られ、胃腸管および結腸の粘膜内層に代表される。

〔実施例６〕
動物モデルにおける粘膜炎の予防
適切に製剤化された免疫グロブリン製剤は、口腔粘膜炎の動物モデルにおいて試験される。免疫グロブリンは予防的に適用され、その後、Ｒｙｕら（Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．、５１、５９５−６０１頁、２０１０年）から適合されるＣＤ８９トランスジェニックマウスモデルにおいて、同時化学および放射線療法（ＣＣＲＴ）によって粘膜炎を誘導する。本発明者らは、口腔粘膜炎の程度および重症度においてであるが、さらに創傷治癒およびＣＣＲＴに起因する組織損傷の消散に関連した要因において免疫グロブリン治療の効果を測定する。口腔粘膜炎の重症度の実際の指標は、体重減少、舌の萎縮および口腔粘膜（上皮の厚さ）である。さらに、治療効果は、上皮層の厚さ、粘膜の基底細胞の数、増殖マーカーＫＩ−６７の組織学的定量化、ｍＲＮＡ転写物（組織試料のインサイチュハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲ）およびＫＧＦ、上皮細胞増殖因子、線維細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子Ａのような増殖因子のタンパク質発現を測定するによって評価される。このような分析は、免疫排除の結果として、および潜在的にはＩｇＡとＣＤ８９発現細胞の直接的相互作用に起因して、細胞内炎症促進性カスケードの下方制御に関する情報を得る。ＩｇＡで処置したマウスは、体重減少が少なく、それらの舌と口腔粘膜は、未処置の動物と比較して、それほど重度に罹患していない。分泌様ＩｇＡで処置したマウスはさらに良好に保護される。

あるいは、口腔粘膜炎のハムスターモデルは、Ｗａｔｋｉｎｓら（Ｏｒａｌ Ｄｉｓ ２０１０年、１６：６５５−６６０頁）に記載されているのと同様に使用される。適切に製剤化されたＩｇＡ製剤（または対照についてはビヒクル溶液）は、最大２８日目までの研究の全期間、シリアンゴールデンハムスターに、予防的に（例えば、−３日目に開始）毎日３回与えられる。急性放射線によって誘導された粘膜炎のモデルにおいて、０日目に、一方の反転させた口腔頬袋を放射線照射（４０Ｇｙ）し、他方の頬袋を対照のために未処置のままにする。あるいは、分割された放射線によって誘導した粘膜炎のモデルにおいて、６０Ｇｙの累積線量が適用され、（Ｗａｔｋｉｎｓ、Ｏｒａｌ Ｄｉｓ ２０１０年、１６：６５５−６６０頁）に記載されるように、７．５Ｇｙの８回の分割に分配される。併用シスプラチンおよび急性放射線によって誘導した粘膜炎のさらに別のモデルにおいて、疾患は、０日目にシスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）および３５Ｇｙの放射線の組み合わせによって誘導される。口腔粘膜炎の臨床評価および体重のモニタリングは、６日目に開始し、研究の終了まで、典型的には２８日目まで毎日行われる。採点システムは（Ｗａｔｋｉｎｓ Ｏｒａｌ Ｄｉｓ、２０１０年 １６：６５５−６６０頁）に記載されている。さらに、組織および血漿試料を回収し、組織学的分析、血漿中の炎症マーカーの決定、および様々な組織の遺伝子発現研究のために、研究全体で適切に処理される。未処置／ビヒクル処理された動物は、口腔粘膜炎を発症し、疾患ピークは１６〜１８日目辺りであり、自然治癒は、粘膜炎の回帰によって証明され、１８〜２０日目辺りで開始する。ＩｇＡで処置された動物は、対照動物と比較して有意に低い粘膜炎スコアを有し、体重減少が少なく、同時に軽度の組織学的所見があり、炎症マーカー（限定されないが、炎症サイトカインおよびケモカインを含む）のレベルが減少する。炎症の減少と創傷治癒の促進は、遺伝子発現分析技術によって、ｍＲＮＡ発現レベルで確認される。分泌様ＩｇＡによる処置はさらにより効果的である。

〔実施例７〕
口腔上皮細胞に対する日和見病原体の付着阻害
実施例２に示されている本発明者らの免疫グロブリン調製物の抗菌作用に対する本発明者らのデータを裏付け、さらに強化するために、本発明者らは、Ｈ３７６上皮細胞に対する細菌付着を妨害するＩｇＡの能力について試験した。

口腔微生物叢は、フィルミクテス（Firmicutes）門について優勢である多種多様の細菌株で構成されている（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０１２年）Ｎａｔｕｒｅ ４８６：２０７−２１４頁）（Ｄｅｗｈｉｒｓｔ ＦＥ（２０１０年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９２：５００２−５０１７頁）。重要なことは、非被包性ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）およびストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）（両方ともフィルミクテス門由来）は遺伝的に非常に近い。Ｓ．ミチスは、主要な口腔日和見病原体を示すことが知られ、上皮バリアが破壊したとき、典型的には、口腔粘膜炎の患者に起こり得るため、潜在的に感染に至る可能性がある。非被包性Ｓ．ニューモニエは上皮によく付着し、結膜炎などの粘膜感染を引き起こし得るが、侵襲性疾患を引き起こさない。このように、Ｓ．ニューモニエＲ６とＳ．ミチスの両方は、このプロジェクトに照らして細菌と経口粘膜上皮間の相互作用の研究に有用なモデル生物である。

インビトロでのヒト上皮細胞に付着する細菌分離株の能力は、実施例２および文献（Ａｅｂｉ Ｃら（１９９８年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：３１１３−９頁）において先に記載されるように測定されたが、以下の変更を伴った。Ｈ３７６細胞（１ウェルあたり約３×１０^５細胞）は、０．１％ＦＣＳが補足されているが、抗体を含まないＭＥＭ中で、２４ウェルの組織培養プレートにおいてコンフルエントな単層になるまで一晩増殖され、ＭＥＭ中で３回洗浄された。細菌を一晩増殖させ、感染の適切な多重度（ＭＯＩ）に調整した。生存している細菌は、適切な濃度の免疫グロブリン（上の段落１．２に記載したように調製した）または対照（例えば、ＩｇＧアッセイに関してプロリン）が補足されているが、抗体を含まない、ＦＣＳ不含ＭＥＭ中でウェルに添加され、５分間、１，５００ｒｐｍで遠心分離され、その後、３０分間、３７℃にてインキュベートされた。次に、ウェルをＭＥＭ中で５回洗浄し、トリプシン処理し、懸濁液は、付着細菌の数を決定するために定量的に培養された。データは、上皮細胞に付着する元の接種材料の細菌の割合として表された。各々のアッセイを３連で実施し、少なくとも３つの実験を行い、調査した条件あたり少なくとも９個のデータ点を得た。細胞生存率は、トリパンブルー排除、および市販のＬＤＨアッセイ（ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって形態学的に確認された。

図１２Ａに示すように、Ｓ．ニューモニエＲ６は、口腔底を起源とするＨ３７６細胞に非常によく付着した。洗浄後、６０％超の細菌がまだ細胞に付着していた。重要なことには、ＩｇＡ Ｆ４（２ｍｇ／ｍｌ）の添加は、上皮細胞へのＳ．ニューモニエＲ６付着を顕著にブロックするのに十分であった。約７５％の細菌が細胞への付着を妨げられ得た。ＩｇＡの用量増加は、細菌付着のわずかに多くの阻害を示した。図１２Ｂにおいて、Ｈ３７６へのＳ．ミチス付着について試験した。本発明者らは、Ｓ．ミチスが、Ｓ．ニューモニエＲ６より少ない程度に上皮細胞に結合することを見出した。しかしながら、ＩｇＡ Ｆ４は、Ｓ．ミチス付着を明確に阻害し、最大効果は５ｍｇ／ｍｌであった。このようにして、口腔粘膜炎の症状を示す患者の口腔内へのＩｇＡ Ｆ４の投与は、日和見病原体のコロニー形成から口腔上皮を保護することができる。

〔実施例８〕
ＩｇＡはγ電離放射線によって誘導される細胞毒性から上皮細胞を保護する
放射線療法は、腫瘍を有する患者の標的である増殖細胞（例えば腫瘍細胞）を治療するために使用される。ＤＮＡ切断および活性酸素種を生成させることによって、γ電離放射線は、一般的に腫瘍細胞死を誘導する。それは口腔上皮の細胞は、それらの低い代謝回転のため、照射に対してより抵抗性であると考えられるが、繰り返される照射は、これらの細胞に対して細胞毒性をなおも誘導することができる。ＩｇＡが、電離放射線後に細胞の生存に影響を与えるかどうかを調べるために、本発明者らは、Ｈ３７６を照射し、２４時間後の細胞毒性を測定した。

図１３Ａに示すように、Ｈ３７６は、ＭＥＭ（８０μｌ）中に３×１０^４細胞／ウェル（９６ウェルプレート）で播種し、２時間と３７℃で維持された。次に、ＩｇＡ Ｆ４（５または１０ｍｇ／ｍｌ）および／またはＭＥＭは、最終濃度が１００μｌ（３連）に達するようにウェルに添加された。翌日、細胞を４Ｇｙで照射し、３７℃に戻した。照射から２４時間後、細胞毒性は、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ９２９１）を使用して評価された。このキットは、細胞死の過程中に放出される細胞内プロテアーゼの量を測定する。

図１３Ｂに示されるように、３０％超のＨ３７６は、電離放射線を受けた後に死滅した。ＩｇＡ Ｆ４を用いたＨ３７６細胞の予防的治療は、用量依存的にこの細胞毒性を減少させた。ＩｇＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）は、２４時間で細胞死をほぼ５０％阻害し、ＩｇＡ（５ｍｇ／ｍｌ）はほぼ３０％阻害した。したがって、上皮細胞へのＩｇＡの添加は、生存優位性を提供した。また、患者の上皮への繰り返しの照射の効果を減少し得る。

〔実施例９〕
創傷再上皮形成における有益な効果
口腔粘膜炎の過程での細菌のコロニー形成および炎症シグナルを調節することは関連性があるが、口腔粘膜炎症状の軽減は、口腔上皮の潰瘍後に迅速な創傷閉鎖を必要とすることが明らかになってきている。ＫＧＦは、創傷再上皮形成において重要な役割を果たしている。これは、ＫＧＦが、現在、口腔粘膜炎の治療において使用するためのいくつかの承認された薬剤の１つである理由の１つである。さらに、口腔粘膜炎の過程におけるＩｇＡの潜在的な役割を詳述するために、本発明者らは、創傷した上皮についてＩｇＡを試験した。インビトロにおける細胞上皮への照射の潜在的な損傷効果を再現するために、本発明者らは、スクラッチアッセイで使用する前に細胞単層を照射した。

創傷治癒を試験するために使用される主なアッセイは、一般的なスクラッチアッセイである。これは、人工的な創傷の閉鎖を測定するために、細胞単層を傷つけ、経時的に画像を取り込むことからなる。図１４Ａに示すように、本発明者らは、ＭＥＭ（最終体積５００μｌ）中に１ウェルあたり約３×１０^５個（２４ウェルプレート）のＨ３７６細胞を播種し、プレートを３７℃にて２時間維持した。次に、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡもしくはＩｇＧまたは培地対照）をウェルに添加し、プレートをさらに２２時間３７℃に置いた。この工程で、プレートを２Ｇｙ、４Ｇｙで照射し、または未処理のままとし、３７℃に戻した。２４時間後、各々のウェルの細胞単層全体でＰ１０００チップを用いてスクラッチを作製した。人工的なギャップにスクラッチされた細胞が落下するのを防止するために、培地を除去し、細胞単層をＭＥＭで１回洗浄した。次に、免疫グロブリンが補足されたＭＥＭまたは補足されていないＭＥＭをウェルに添加した。顕微鏡を用いて様々な時間点で撮像し、ギャップの大きさを測定した。１００％の創傷再上皮形成は、人工的な創傷の完全な回復に対応する。

ＩｇＡ Ｆ４は２つの用量（１０ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌ）で試験し、一方、ＩｇＧは１０ｍｇ／ｍｌで使用した。興味深いことに、定常状態で、ＩｇＡは、人工的なギャップ閉鎖においてわずかな陽性効果を示した（図１４Ｂ）。対照的に、ＩｇＧは、創傷閉鎖を遅らせるようである。照射された細胞単層を傷つけた場合、ＩｇＡの役割はより明確になった（図１４ＣおよびＤ）。ＩｇＡ Ｆ４は、照射されたＨ３７６細胞の移動および分裂を維持し、一方、未照射の細胞は、人工的なギャップを同じ速度で覆わなかった。さらに、細胞を４Ｇｙで照射した場合、ＩｇＡの効果がより強かった。細胞を２Ｇｙおよび４Ｇｙで照射した場合、上皮細胞におけるＩｇＧの陰性効果が観察された（図１４Ｃ、Ｄ）。

〔実施例１０〕
上皮細胞へのＩｇＡの特異的結合
ＩｇＡが細菌刺激および創傷再上皮形成の過程全体で上皮細胞機能を制御する潜在的なメカニズムに関する情報を得るために、本発明者らは、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２とＨ３７６の両上皮細胞の療法におけるＩｇＡ受容体の細胞表面発現を分析した。

いくつかの受容体は、ＩｇＡに結合することが報告されている。それらは、ＣＤ８９、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、ＡＳＧＰ−Ｒ、ＦＣＡＭＲ（Ｆｃａ／ｍＲ、ＣＤ３５１）、およびｐｌｇＲ（ＣＤ３００ｅ）（Ｍｏｎｔｅｉｒｏら（２００３年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１７７−２０４頁）である。ＣＤ８９は、骨髄系細胞に発現し、一方、ＡＳＧＰ−Ｒ、ＦＣＡＭＲおよびｐｌｇＲは、それぞれ肝細胞上、Ｂリンパ球とマクロファージ、および腸管上皮細胞上に存在する。ＣＤ８９だけは、高特異性でＩｇＡと結合する。

多くの細胞型が、トランスフェリンのその受容体（例えば、ＣＤ７１）への結合によって駆動されるトランスフェリンからの鉄の取込みを必要とするため、したがって、ＣＤ７１は、非常に分化した細胞を除いて、多くの細胞型に潜在的に発現している（Ｐｏｍｋａ Ｐら（１９９９年）ＩＪＢＣＢ ３１、１１１１−１１３７頁）。しかしながら、そのレベルは、細胞から細胞へとかなり変化する。これまで、ＣＤ７１は、単量体ＩｇＡと分泌型ＩｇＡの両方に結合することが示されている（Ｍｏｕｒａら（２００１年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４、４、４１７−４２５頁）。したがって、口腔上皮細胞におけるＩｇＡのための潜在的な標的である。

この受容体の発現を調節するために、本発明者らは、ＰＢＳ（１×）で洗浄したＨ３７６およびＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を１０分間３７℃にて、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて穏やかに脱着させ、それらをＰＢＳ（１×）で洗浄し、抗ヒトＣＤ７１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＡ５９）抗体を用いてＰＢＳ（１×）中、氷上で３０分間染色した。アイソタイプ対照抗体を用いて、バックグラウンドの蛍光レベルを評価した。ＣＤ８９は、骨髄細胞上でのみ発現し、陰性対照として使用した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＭ−Ａ７１２）。２回の洗浄工程後、試料をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にかけた。

図１５に示すように、本発明者らは、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２とＨ３７６の両上皮細胞がトランスフェリン受容体を明確に発現することを見出した。対照的に、予期されたように、ＣＤ８９は、上皮細胞では検出されなかった。

〔実施例１１〕
ＩｇＡ Ｆ４製剤はＴＮＦαと反応しない
過去数年にわたって、炎症および腫瘍発症の促進に関与する主要なタンパク質を標的化しおよび／または阻害するための免疫グロブリン（例えば、モノクローナル抗体）の生成が強力に増加した。慢性疾患ならびに自己免疫疾患において、抗ＴＮＦα特異的抗体は、治療された患者における炎症を抑えることが示されている。

実施例４（図１０および１１）に示されるように、ＩｇＡは、上皮細胞による炎症促進性分子の産生を下方制御した。ＩｇＡの観察された抗炎症作用における抗ＴＮＦ活性の関与を排除するために、本発明者らは、本発明者らのポリクローナルＩｇＡおよびＩｇＧ製剤中のＴＮＦα特異的抗体レベルを決定した。

ＴＮＦ−αは、９６ウェルプレート（試料プレート）（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ）において、ＰＢＳ ｐＨ７．４（５０μＬ／ウェル）中で１μｇ／ｍｌにて２時間３７℃で被覆された。次に、ウェルを３００μｌの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で２時間３７℃にてブロックした。並行して、被覆されたＴＮＦ−αなしの結合対照プレート（ブランクプレート）を調製した。洗浄工程後、Ｉｇ試料（ＩｇＡ Ｆ４／ＩｇＧ Ｐｒｉｖｉｇｅｎ／Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）をＬｏｗＣｒｏｓｓＢｕｆｆｅｒ（ＬＣＢ）（Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で希釈した。いくつかのウェルにおいて、遊離ＴＮＦ−αを添加し、抗体結合を阻害した。試料（１００μｌ）をプレートにピペッティングし、２時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを３回洗浄し、プレートを３０分間、３７℃にて、関連する二次抗体：抗体緩衝液（ＬＣＢ）中のポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ；０．５μｇ／ｍｌ）またはポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＡ ＨＲＰ（Ｄａｋｏ；０．５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。ウェルを以前のように４回洗浄し、続いて、超高感度ＴＭＢ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）で発色させた。反応物を１Ｍ塩酸（Ｍｅｒｃｋ）を用いて停止させ、吸光度をＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により４５０ｎｍで測定した。

図１６は、発明者らのＩｇＧとＩｇＡ Ｆ４製剤の両方がごく少量の抗ＴＮＦα抗体を含んでいたことを実証する。同等の濃度で、ＩｇＡおよびＩｇＧは、抗ＴＮＦα特異的抗体であるＩｎｆｌｉｘｉｍａｂと比較して、ＴＮＦαに対して、それぞれ１．２×１０^６および１．１×１０^５倍反応性が小さい。したがって、ＩｇＡ免疫抑制活性は、抗ＴＮＦα活性とは無関係なＴＮＦαである。

Claims (17)

1. 有効成分としてＪ鎖含有ＩｇＡと組換え分泌成分を含む、対象における局所投与による消化管の粘膜炎の予防または治療において使用するための医薬組成物であって、Ｊ鎖含有ＩｇＡ中のＩｇＡが血液またはその成分由来のＩｇＡである前記医薬組成物。
2. 消化管の粘膜炎が口腔粘膜炎である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ＩｇＭをさらに含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 別の免疫グロブリンをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 粘膜炎に罹患したまたは罹患するリスクがある粘膜領域との長期の接触時間を与えるように製剤化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 製剤が、クリーム、ゲル、シロップ、ゼリー、罹患した粘膜近傍で溶解する固体形態またはそれらの組み合わせから選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 粘膜への局所投与が、１種またはそれ以上の微生物の付着および／または侵入を減少させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 微生物が、細菌および／または真菌である、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 粘膜への局所投与が、粘膜創傷治癒を促進する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 粘膜への局所投与が、抗炎症作用を及ぼす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 抗炎症作用が
    （ａ）炎症促進性サイトカイン発現の阻害；および／または
    （ｂ）抗炎症性サイトカインの発現の刺激
    である、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 対象が、化学療法および／または放射線療法を受けているまたは受けようとしている癌患者のような消化管の粘膜炎を発症するリスクがある対象である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. リスクがある対象が、以前の化学療法および／または放射線療法の処置の結果として粘膜炎を発症した癌患者である、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 患者の好中球数が減少し始めたときに組成物の投与が開始される、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
15. 患者の好中球数が正常を下回っている期間中に治療が維持される、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 医薬組成物が１日最大６回まで対象に投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
17. 医薬組成物が粘膜炎の治療のための追加の有効な薬剤を含むか、または患者が殺菌性口内洗浄液のような別の薬剤も用いている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。