JP6232375B2 - 化合物の感受性ポテンシャルを決定するための材料と方法 - Google Patents
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Description
従来の研究は、末梢血単球(PMBC-DC)由来またはCD34+幹細胞由来のDCの分析に基づくin vitro感作アッセイの開発に重点が置かれてきた(Tuschl & Kovac(2001)、De Smedtら(2002))。最初の研究は皮膚感作物質へ曝露した後の表面マーカーの測定に重点を置いた(Tuschlら(2000))。他の研究はDC成熟プロセスにおける遺伝子転写の変化の測定に重点を置いた。
生存ドナーまたはin vitro分化DCから単離した一次LCを用いることはできるものの、標準化スクリーニングアッセイにおける一次細胞の広範な使用はドナーの変動および十分な量の細胞を得ることが困難であることから限定される。従って、本発明では樹状様特性をもつヒト細胞株を予測の皮膚感作試験に対するin vitro分化モデルとして用いることが好ましい。現在、THP-1、UD937またはMutz-3細胞を含有するいくつかのリンパ様または骨髄細胞株が皮膚感作試験用の代理LC細胞株として利用される。
(a)前記試験化合物を細胞と接触させるステップ;
(b)前記細胞中の表1から選択される1以上のマーカータンパク質の発現の存在またはレベルの変化を決定するステップ;および
(c)前記発現の存在またはレベルの変化に基づいて前記試験化合物の感作ポテンシャルを決定する(ここで、前記1以上のマーカータンパク質の発現の存在もしくはレベルの変化は前記試験化合物が感作ポテンシャルを有することを示す)ステップ
を含むものである前記方法が提供される。
(A)グループ1:トップ15の皮膚感作物質マーカー;(B)グループ2:トップ10の呼吸器感作物質マーカー;(C)グループ3:さらなる感作効果の一般的マーカー。
(a)その細胞を前記マーカータンパク質または前記マーカータンパク質をコードする核酸配列と選択的に結合する少なくとも1つの特異的結合メンバーと接触させるステップ;および
(b)前記特異的結合メンバーとマーカータンパク質または前記マーカータンパク質をコードする核酸配列により形成される複合体を検出しおよび/または決定するステップ
を含みうる。
(a)分析物と結合することができる結合メンバーがその上に固定された固体支持体;
(b)標識を含む現像剤;および、任意に
(c)洗浄溶液、希釈剤およびバッファーから成る群より選択される1以上の化合物
を含むものである。
(a)1以上の結合メンバーがその上に固定された固体支持体であって、ここで各結合メンバーは表1、表1(A)グループ1;表1(B)グループ2;または表1(C)グループ3;表5に与えられたグループから選択されるタンパク質マーカーまたは前記タンパク質マーカーもしくはその断片をコードする核酸と選択的に結合する前記固体支持体;
(b)標識を含む現像剤;および
(c)洗浄溶液、希釈剤およびバッファーから選択される1以上の成分を含んでもよい。
用語「抗体」にはポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、抗体のフラグメント、例えば1本鎖およびFabフラグメント、ならびに遺伝子操作で作られた抗体が含まれる。抗体はキメラまたは単一種のものであってもよい。
化学物質安全性試験の必要性は、医薬品に対してならびに化粧品およびヒトの皮膚および粘膜と接触する広範囲の他製品の販売認可に対して長期にわたり規制プロセスを確立してきた。いくつもの試験体制が確立されていると共に、いくつかの事例ではこれらの試験のごく少数が国家規制機関による目的によって禁止されている。概してこれらの試験は全生存生物研究、典型的にはげっ歯類に基づくものである。
候補バイオマーカーの発見に用いたトレーニング化学物質
ヒトMutz-3細胞中のバイオマーカー発見するために一式のトレーニング化学物質を選択した。選択した化学物質は5種の異なる強度の皮膚感作剤、2種の呼吸器感作剤および3種の非感作性/刺激物質を含んだ(表2)。
DNCB:1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン(DNCB)はカラー写真処理に用いられる有機化合物である。DNCBは極端なアレルゲンと考えられる。
TMA:無水トリメリット酸は非常に反応性の化学物質であって、これを用いて工業的にトリメリット酸エステルを合成する。これらのエステルは、とりわけ温度安定性が必要とされる場合に、例えば、電線およびケーブルのコーティングにおけるポリ塩化ビニル用可塑剤として使われる。これは呼吸器感作物質と考えられる。
SDS:ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)またはラウリル硫酸ナトリウム(SLS)は多くの洗浄および衛生製品に利用される界面活性剤である。SDSは皮膚および眼刺激を引き起こす。
ヒト骨髄白血病由来の細胞株MUTZ-3(DSMZ, Braunschweig, Germany, Hu et al. 1996)は増殖および生存用の培地へサイトカインと成長因子の添加が必要である。MUTZ-3の祖先細胞を、20%FCSおよび40ng/ml GM-CSFを補充したL-グルタミンおよびヌクレオチドを含有するα-MEMで培養した(Invitrogen、22571-020)。細胞を37℃および5%CO2で増殖し、培地を毎週3回変えた。その細胞を200,000細胞/mlの濃度で保った。細胞を分割する場合、それらを800rpmにて5分間遠心分離した。上清を除去し、そして細胞を注意深く1mlの培地に再懸濁し、そして計数して適当な濃度を設定した。
細胞を4体積の100mM TEAB(炭酸水素トリエチルアンモニウム)、pH 8.5+0.1、1mM TCEP(トリス[2-カルボキシエチル]ホスフィン*HCl)、0.1%SDSに溶解した。細胞ペレットを溶解バッファーに懸濁した後、懸濁液を95℃にて10分間、熱ミキサー中で加熱した。細胞溶解液を氷上で2分間、2回超音波処理し、その後、第2サイクルの加熱と超音波処理を行った。サンプルを次いで14,000gにて10分間遠心分離しそして上清をさらなる分析に用いるかまたは-80℃にて貯蔵した。
タンパク質濃度をBradford試薬を用いて決定した。その結果を、BSA/IgG(50%/50%)から成る標準の希釈液の測定値から作成した標準曲線を用いて計算した。
タンデム質量タグ(TMT)(Thermo Scientific)は一式のアミン反応性標識を含み、これらは重および軽同位体で合成されて同じ総質量を示すが衝突誘起解離(CID)による活性化とその後のタンデム質量分析(MS/MS)後に異なる質量のレポーターイオンを与える。
サンプルを3mL水/アセトニトリル95:5+0.1%TFAでそれぞれ希釈し、次いでHLB Oasisカートリッジ(1cc、30mg、Waters)を用いて脱塩した。溶出画分をそれぞれさらに、自己作製カートリッジ(CHROMABOND 空カラム 15ml、Macherey-Nagel、650μL SP Sephalose Fast Flowを充填、Sigma)を用いて強カチオン交換により精製した。ペプチドを充填しかつ4mL水/アセトニトリル75:25+0.1%TFAで洗浄後、ペプチドを2mLH2O:ACN75:25+400mMの酢酸アンモニウムを用いて溶出した。サンプルを真空濃縮器中で乾燥し、それぞれ50μL水/アセトニトリル95:5+0.1%TFAに溶解し、そして分析まで-20℃にて保存した。
TMTシクスプレックス標識サンプルを高性能液クロマトグラフィ-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)により測定した。例えば、5μL(5μg)の各サンプルを、Proxeon EASY-nLC (Thermo Scientific)と結合したエレクトロスプレーイオン化線形イオントラップ四重極Orbitrap質量分析計(Thermo Scientific)に注入して測定した。ReproSil C18(5μm粒子、Dr. Maisch)を充填した自己充填の0.1×20mmトラップカラムにサンプルを供給しかつ10分間、H2O:蟻酸(99.9%/0.1%)により洗浄した後、分離を90分間、H2O:蟻酸(99.9%/0.1%;溶媒A)およびアセトニトリル:蟻酸(99.9%/0.1%;溶媒B)の勾配を用いて300nL/minの流速で行った。0.075×150mmカラムをReproSil C18 (3 μm 粒子、Dr.Maisch)を用いて自己充填した。全ての質量スペクトルを、陽イオン化モードにて350〜1800m/zの走査範囲でフラグメンテーションに対するトップ10 HCD法を用いて取得した。
ピークリストをOrbitrap生データから、mascot ジェネリックファイル(*.MGfデータファイル)としてProteome Discoverer (バージョン1.1;ThermoFisher, San Jose, USA)を用いて作製した。得られる*.mgfファイルをIPIヒトデータベース(バージョン3.68;2011年2月)に対してMASCOT(バージョン2.2;MatrixScience, London, UK(質量分析データを用いる、配列データベースの検索による確率に基づくタンパク質同定)、Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS. Electrophoresis. 1999 Dec;20(18):3551-67)により検索した。ペプチドとタンパク質同定を次のパラメーターを用いて実施した:システインにおけるカルバミドメチル、N-末端部位およびリシンにおけるTMT改変は固定した改変として設定した。トリプシンを用いて酵素制限を行い、3つのミス切断を許容しかつ前駆体質量については許容質量耐性+/-10 ppmおよびフラグメントイオンについては0.05を許容した。対応するMASCOT結果ファイル(*.datデータファイル)をダウンロードし、そしてレポーターイオン強度とタンパク質同定を社内ツールで抽出した。レポーターイオン強度およびタンパク質同一性をリレーショナルMySQLデータベース(version 5.157; Oracle, Redwood Shores, USA)に送ってレポーターイオンのlog2比を計算した。
1つのLC/MS/MS試験内の任意のレポーターイオンの一定積分(constant integral)の仮定に基づくサムスケーリング(sum scaling)の方法により、質量タグの6つのレポーターイオン強度を同位体分布およびシステム偏差と関係付けた。加えて、全6つのタグが80 AU(任意のユニット)より小さくかつ2未満のタグのレポーターイオン強度が10 AUより小さい場合、これらのMS/MSスキャンをフィルターにかけて外した。レポーターイオンの相対強度はサンプル中のペプチドの相対量を表す。あるペプチド相対量の全サンプルに対する相対量を比較するために、各サンプル-対-プールした参照サンプル間の比を計算した。比をlog2変換して各ペプチドに対する参照測定値を得た。タンパク質レベルの相対的変化についての情報を得るために、1つのタンパク質同一性に属する各同定したペプチドに対するlog2参照レポーターイオン強度の幾何平均値を求めた。
感作物質および刺激物質のグループに属する参照化学物質ならびに適当な対照(ビヒクル)物質のグループに属する参照化学物質を用いて候補タンパク質バイオマーカーを選択した。これらの化学物質を色々な組み合わせと濃度で4つの分析発見研究に適用した。
アッセイ用の候補タンパク質バイオマーカーの同定
感作物質と非感作物質の間の区別を可能にする候補タンパク質バイオマーカーを発見するために、表2に掲げた色々なセットの化学物質を含む4通りの発見研究を次の通り実施した。第1の研究(40-002_2)では、Muts-3細胞を2つの呼吸器感作物質(150μM MDI、500μM TMA)、4つの接触感作物質(10μM DNCB、200μM 桂皮酸アルデヒド、150μM PPD、500μM オイゲノール)、2つの刺激物質(500μM サリチル酸、500μM フェノール)および2つの対照(無処理、0.1% DMS0)と共にインキュベートした。第2の研究(40-002_3)では、Muts-3細胞を2つの異なる濃度の2つの接触感作物質 (50および100μMの桂皮酸アルデヒド、4および8μMのDNCB)、1つの刺激物質(300および600μM SDS)および2つの対照(無処理、0.1% DMSO)と共にインキュベートした。第3の研究(40-002_4)では、Muts-3細胞を4つの接触感作物質(120μM 桂皮酸アルデヒド、4μM DNCB、75μM PPD、250μM オキサゾロン)、3つの刺激物質(200μM SDS、500μM サリチル酸、500μM フェノール)および2つの対照(無処理、0.1% DMSO)と共にインキュベートした。
現在、呼吸器感作物質を同定するための確証された細胞株に基づくアッセイは無く、樹状細胞株のIL-8アッセイはTMAに応答しない(Mitjans et al, 2009)。呼吸器感作物質に対する適当なタンパク質バイオマーカーを同定するために、Mutz-3細胞を呼吸器感作物質(TMA)、プロトタイプ接触感作物質(DNCB)、1つの刺激物質(SDS)を含む参照化合物に曝した。TMA-対-対照サンプルを比較する2つのサンプルt-検定(p<=0.05)を実施し、呼吸器感作物質TMAに対する細胞の反応を示すバイオマーカーを同定した。タンパク質をp-値の増加の順に並べた。
図1は、感作物質と刺激物質を区別するために提案したバイオマーカーの効用の他の例を示す。第4の研究では、Mutz-3細胞を1つの接触感作物質(DNCB)、1つの呼吸器感作物質(TMA)、1つの刺激物質(SDS)に曝すかまたは無処理のまま放置した。83種のタンパク質を含む問題のリストからのタンパク質のサブセットを用いて無鑑査ヒエラルキクラスターを形成し、アレルゲン、刺激物質および対照グループに属するサンプルの分離が良いことを示した。存在量が増加または減少する2つの主なタンパク質のクラスターを見出した。
化学物質を分類する好ましい方法は部分最小二乗回帰分析(PLS)を使う方法である。PLS判別分析は問題のリストから最も重要な分類子(classifier)を同定する。モデルを赤で強調した応答変数(y)および予測因子(predictor)(x)としてANOVAでフィルターしたタンパク質を用いて構築した。第1のPLS成分(x軸)を第2のPLS成分(y成分)に対してプロットし、3つの実験グループ「対照」、「刺激物質」および「感作物質」を分類する役割を有するバイオマーカーを分離した。
感作ポテンシャルを予測するマーカーを見出す代わりのアプローチとして、3種の公知の炎症性マーカーのレベルを測定する市販のイムノアッセイを用いるさらに標的化したアプローチを採用することにより、本発明者らは化学安全性のマーカーの供給源として細胞培養上清の可能性を探求した。ELISAにより測定する3種のタンパク質は、化学感作物質に対して分泌される炎症性タンパク質応答に対する参考文献の総括に基づいて選択した。細胞を実施例1に記載の通り培養し、使用済みの培地を取り出してELISAにより直接分析した。全てのキットは製造業者取扱説明書に従って用いた。
Huら(1996)によると、MUTZ-3細胞株は単球の特徴を示し、MPOを発現する。MPOはリソソームに貯蔵され、炎症の間、放出されるペルオキシダーゼ酵素であり、ミエロペルオキシダーゼはELISA(Assay-Designs)により測定された(図4)。驚いたことにその結果は、MPMがMutz-3細胞の接触感作物質DNCBに対する曝露の指標であるが呼吸器感作物質TMAに対するものでないことを示した。実施例1で本発明者らがMutz-3細胞の上清で見出したMPOのレベルの増加との組み合せで起こったMPOの細胞内レベルの減小を同定したことに注意すべきであって、これは接触感作物質による曝露に反応したMPOの活性分泌を示唆する。
カルプロテクチンはS100A8/S100A9のヘテロ二量体であって、Mutz-3細胞の上清中で市販イムノアッセイ(Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany)により測定した(図5)。カルプロテクチンはストレスに応答して食細胞により活性化されて分泌され、Toll様受容体4(TLR4)と結合する。Toll様受容体は先天的免疫系において重要な役割を果たし、カルプロテクチンによるTLR4の活性化はさらに炎症を増幅する(Ehrchenら 2009)。TLR4とインターロイキン12の二重ノックアウトマウスは、2,4,6-トリニトロ-1-クロロベンゼン(TNCB)、オキサゾロン、およびフルオレセインイソチオシアナート(Martinら、2008)を含む広範囲の色々な感作物質によるDC感作の著しい減少を示す。カルロプロテクチン分泌に関係する一般的な炎症経路に基づいて、全てのクラスの化学アレルゲンに対するマーカーであることが期待されうる。思いがけなく、本発明者らのデータはS100A8/S100A9レベルがDMCB曝露によりモジュレートされるが、呼吸器感作物質TMAに応答しないことは、2つの異なる化学物質によって異なる細胞経路が活性化されることを示す。MPOのように、カルプロテクチンの細胞外レベルの増加は、実施例1で見られた相関のある細胞内レベルの対応する減少と一致した。
Zn/Cu-SOD(SOD1)は遊離スーパーオキシド・ラヂカルを分子状酸素と過酸化水素に変換する酵素である。SOD1は身体の全細胞で発現される細胞内酵素である。DC分化の間、SOD1発現は増加して成熟DCにおいて最高レベルに到達する(Rivollier ら、2006)。SOD1発現はLPS、TNF-αおよびIL-1bなどのプロ炎症性メディエーターによりアップレギュレーションされる(Visnerら、1990)。成熟したDC段階における細胞に関連したSOD1レベルの増加を報じたRivollier ら(2006)とは対照的に、本発明者らはSOD1レベルが細胞抽出物中のアレルゲン曝露に応答して減少しかつMutz-3の上清中で増加することを見出した(図6)。上清中でSOD1を、特異的ELISAアッセイを用いて定量した(IBL, Hamburg, Germany)。
実施例1〜4の結果は、化学感作物質を刺激物質または対照化学から識別するための130種のタンパク質のパネル(表1、グループ1〜3)を同定した。参照化学物質を用いて130種のバイオマーカーのパネルを決定するために記載した方法を今や、改定した形態で用いて新しくまたは今まで未試験の化学剤を試験し、それらのアレルゲン、感作物質または非感作性物質としてのポテンシャルを決定することができる。本発明によれば、その方法は、新しい化学物質またはポジティブおよびネガティブ対照としての参照化学物質と組み合わせて新しい化学物質に曝したサンプルの試験セットにおける表1から選んだバイオマーカーの濃度を測定する方法を使うことができる。典型的には、新しい試験化学物質を評価する際に、表1からのバイオマーカーの組み合わせを用いて、とりわけグループ1またはグループ2からのバイオマーカーを選択して実施すべきである。グループ1およびグループ2から選択されるバイオマーカーのパネルの使用は、感作物質、刺激物質および対照の間の最も堅牢な組み合わせを確実なものにするであろう。選択したバイオマーカーが新しい化合物について巧く行けば、そのバイオマーカーの組み合わせを保持しうる。あるいは、グループ1または2からのプロセスを繰り返して他のバイオマーカーの組み合わせを試験することができる。また、グループ1または2からのバイオマーカーを拒絶し、グループ3からのバイオマーカーを含むこともできる。この繰り返しプロセスを優れた分類モデルが得られるまで続けうる。表1に記載のバイオマーカーの濃度を測定することにより皮膚刺激を起こす化学物質を同定することも可能である。典型的には、可能性のある刺激物質および感作物質の間を識別する際に、この分析は炎症性および細胞のストレスプロセスと連結したバイオマーカーを用いて実施すべきである。特に、SDSへの曝露後に誘導されるグループ3から選択されるバイオマーカーが有用でありうる。これは、限定されるものでないが、SLC3A2(膜貫通糖タンパク質CD98の一成分)、またはHYOU1(低酸素誘発性の細胞摂動に重要な細胞保護的な役割を有するタンパク質)またはSH3BGRL3/TIP-B1(TNF抑制タンパク質)の濃度の測定に関わりうる。感作または刺激化学物質によりモジュレートされるタンパク質の包括および組み合わせは新しい化学物質の感作または刺激ポテンシャルを正しく予測することを可能にするであろう。
感作ポテンシャルの一般的マーカーのパネル内で、接触感作物質効果に関連する最強識別マーカーを選択することもできる。PLS-DAを用いて、全ての他のクラスから皮膚感作物質の最強分離を提供する15種のタンパク質のサブグループを同定した(表1、グループ1)。従ってちょっとこれらの15種のタンパク質を測定する標的化分析を実施して公知の皮膚感作物質を検出し、未知の試験化学物質または化学物質の組み合わせが皮膚感作ポテンシャルを有するかどうかを実証することができる。
感作ポテンシャルの一般的マーカーのパネル内で、呼吸器感作物質効果に関連する最強識別マーカーを選択することもできる。PLS-DAを用いて、全ての他のクラスから呼吸器感作物質の最強分離を提供する10種のタンパク質のサブグループを同定した(表1、グループ2)。従ってちょっとこれらの10種のタンパク質を測定する標的化分析を実施して公知の皮膚感作物質を検出し、未知の試験化学物質または化学物質の組み合わせが皮膚感作ポテンシャルを有するかどうかを実証することができる。
本発明者らは、Mutz-3培養樹状細胞モデルを用いて、試験時点でそのアレルギーまたは刺激物質状態が未知であった一連の化合物を試験した。Mutz-3細胞を実施例1に記載の通り培養し、5種の未知化学物質(A、B、C;E、F)に曝した。1化合物当たり平均して3つのサンプルを処理した。Mutz-3細胞の培養を公知のアレルゲンPPDおよび公知の刺激物質SDSと共にインキュベートするかまたは無処理で放置してそれぞれポジティブおよびネガティブ対照とした。細胞培養後、使った培地を除去し、将来の分析用に貯蔵した。細胞を洗浄し、収穫し、タンパク質を抽出し、そして実施例1に記載の通りTMTを用いて標識した。
色々な化学感作物質アッセイに対する複雑かつ可変性の細胞応答にアプローチするためには、色々な細胞の応答経路を表すいくつかのバイオマーカーの同時分析を可能にするアッセイが必要である。SRMに基づくアプローチは、技法の感度と選択性、多重化能力および抗体の限られた利用可能性の故に、魅力的なELISAの代替法である。本技法では、目的のタンパク質に一意的なサインペプチドを測定し、サンプル中のタンパク質の定量的な情報を提供する。化学曝露実験に応答するペプチド存在量の変化は、典型的な同位体TMT-SRの作業手順を用いて決定することができる。本技法において、定量はTMTゼロで標識したサンプルペプチド-対-TMTシクスプレックス重同位体で標識した内部参照サンプルの相対MS強度に基づいて行われる。
SRM決定のための候補ペプチドの選択
現存するMS/MSデータを用いて、最も高頻度で観察される特異的ペプチドを選択して定量した。もし可能であれば、SRM開発のためにタンパク質1種当たり少なくとも3種のペプチドを選択した。11種のバイオマーカー候補に対する代表的ペプチドを表6(図12)に示した。選択のための判定基準には次が含まれる:トリプシンによる切断ミスのないことおよび可変性の修飾がないこと(in vivoまたは実験において)
サンプル
発見研究に記載の通り、MUTZ3細胞を感作物質(4μM DNCB、150μM TMA)および刺激物質(200μM SDS)に曝すかまたは無処理のままとした。
プールしたサンプルをトリプシンで消化しかつTMTシクスプレックスで標識して、定量の参照となるペプチドの重標識バージョンを作製した。試験サンプルを消化しかつTMTゼロで標識して、ペプチドの軽標識バージョンを作製した。各15μgのプールおよび試験サンプルをその後に混合し、固相抽出による引き続いての精製および揮発性バッファーを用いる強カチオン交換を実施した。
混合した重および軽標識サンプルを5%アセトニトリル(=ACN)、0.2%蟻酸(=FA)に再懸濁し、TSQ Vantageトリプル四重極質量分析計(Thermo Fisher)と結合したAccela 1250液体クロマトグラフィ(LC)系に注入し、そしてSRMデータを得た。対応するTMTシクスプレックス標識およびTMTゼロ標識をしたフラグメントイオン質量を計算し、そしてMS計器パラメーターを個々のQ1およびQ3遷移対について最適化した。プールした細胞溶解液サンプルを消化し、TMTシクスプレックスで標識し、そしてTMTゼロ標識した参照ペプチドと組み合わせた。各ペプチドに対する正確な保持時間を用いると、各SRM遷移に与えられた走査時間を最大化するために用いた保持時間ウインドウでSRMサイクル時間は1.5秒であった。洗浄およびカラムを平衡化する時間を含めて、本方法の総試験時間は23分であった。脱クラスター電圧を5ボルトに設定し、ピーク幅(FWHM)を0.5に設定し、そしてクロムフィルターピーク幅を6秒に設定した。SRMアッセイは153種のSRM遷移物を含み、19ペプチドと11タンパク質をカバーした。SRM遷移物を表6(図12)に掲げた。
SRMをSkylineバージョン1.2.0.3425 (https://skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view)を介して可視化しかつ全てのピーク整合を可視的に実証した。ピーク面積をMicrosoft Excelに出力した。遷移を合計して各ペプチドに対する全遷移の総強度を得た。内因性(軽)ペプチドの量を、内部の重標識した参照サンプルに対する相対的なピーク面積比に基づいて計算した。
SRMマルチマーカーアッセイを適用し、特異的タンパク質応答サインに基づいて、化学感作物質で処理したサンプルを対照および刺激物質サンプルから識別した。表6(図12)に掲げたマーカーのうちの8つに特異的なペプチドを含むマルチマーカーのパネルの性能を試験するために、サンプルを典型的な接触感作物質(DNCB)および呼吸器感作物質(TMA)および刺激物質(SDS)に曝した。各サンプル(1処理当たり8複製)について3つの分析複製を実施した。SRMペプチドデータを分散分析(ANOVA)(P<0.05)により分析した後、Tukeyの事後(post-hoc)検定(対照と比較したアレルゲン、アレルゲン-対-刺激物質、P<0.05)を行った。表7(図13)はタンパク質前駆体PGD、MPO、HSPA8、TMSL、S100A8、S100A9およびS100A4から選択した20のペプチドの性能を示す。3つのペプチドを除外した全てのペプチドは有意判定(p<0.05)を合格し、アレルゲンと個々のペプチドとしての対照との間を識別する優れた性能を示した。
Claims (31)
- 試験化合物の感作ポテンシャルを決定するin vitroの方法であって、
(a)前記試験化合物を細胞と接触させるステップ;
(b)前記細胞における、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGD)及び表1、表1(A)グループ1、表1(B)グループ2、表1(C)グループ3またはそれらの組み合わせから選択される1以上のマーカータンパク質の存在または発現レベルの変化を決定するステップ;および
(c)PGD及び前記1以上のマーカータンパク質の存在または発現のレベルの変化に基づいて前記試験化合物の感作ポテンシャルを決定するステップを含み、ここで、前記PGD及び前記1以上のマーカータンパク質の存在もしくは発現のレベルの変化は前記試験化合物が感作ポテンシャルを有することを示す、前記方法。 - 前記細胞が皮膚細胞、肺細胞または免疫系の細胞から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記免疫系の細胞が樹状細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞が樹状様特性を持つヒトまたは動物細胞株由来である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記細胞がリンパ様または骨髄細胞株由来である、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞株がTHP-1、U937およびMutz-3細胞から成る群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記1以上のマーカータンパク質が表1(A)グループ1から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上のマーカータンパク質が表1(B)グループ2から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上のマーカータンパク質が表5から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)がPGD及び前記1以上のタンパク質マーカーの存在または発現レベルを参照レベルと比較するステップを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)が細胞を前記PGDマーカータンパク質と選択的に結合する少なくとも1つの特異的結合メンバーと接触させるステップ;および前記特異的結合メンバーと前記PGDマーカータンパク質とにより形成される複合体を検出および/または定量するステップを含むものである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記決定するステップがPGD及び前記1以上のマーカータンパク質の既知の発現レベルの標準を用いる標準曲線を準備するステップおよび試験化合物と接触させた細胞を用いて得た読取値を比較してPGD及び前記1以上のマーカータンパク質の発現レベルの変化の測定値を得るステップを含むものである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記特異的結合メンバーが前記PGDマーカータンパク質と特異的かつ選択的に結合する抗体またはそのフラグメントである、請求項11または請求項12に記載の方法。
- 特異的結合メンバーがアプタマーである、請求項11または請求項12に記載の方法。
- ステップ(b)を質量分析により実施する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)をPGDタンパク質マーカー由来のペプチド及び前記1以上のマーカータンパク質由来のペプチドに対する1以上の遷移を用いる選択反応モニタリング;
(i)試験下の細胞中のペプチドレベルを、細胞の感受性を表すことが先に決定されたペプチドレベルと比較するステップ、および
(ii)前記PGD及び1以上のマーカータンパク質の発現の変化に基づいて試験化合物の感受性ポテンシャルを決定するステップ
により実施する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(i)が、既知量の対応する合成ペプチドを用いて試験下の細胞からのマーカータンパク質由来のペプチドの量を決定するステップを含み、ここで合成ペプチドは標識を除いて細胞から得られるペプチドと配列が同一である、請求項16に記載の方法。
- 標識は異なる質量または重同位体のタグである、請求項17に記載の方法。
- 結合メンバーが固体支持体上に固定された、請求項11〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 試験化合物の感作ポテンシャルをin vitroで決定するために使用するキットであって、利用者が、PGD及び表1に与えられた1以上のマーカータンパク質またはその断片、又はPGD及び前記1以上のマーカータンパク質に対する1以上の抗体を含む分析物の試験下の細胞中の存在または発現レベルを決定することを可能にするキットであり、かつ
(a)分析物と結合することができる結合メンバーがその上に固定された固体支持体;
(b)標識を含む現像剤;および、
(c)洗浄液、希釈剤およびバッファーから成る群より選択される1以上の成分を含むものである前記キット。 - 結合メンバーが、PGDと選択的に結合できる抗体、及び表1、表1(A)グループ1;表1(B)グループ2;または表1(C)グループ3あるいはそれらの組み合わせから選択されるマーカータンパク質と選択的に結合できる抗体を含む、請求項20に記載のキット。
- 前記結合メンバーが表5から選択されるマーカータンパク質と選択的に結合できる抗体を含む、請求項21に記載のキット。
- 試験下の細胞における、試験化合物の感作ポテンシャルをin vitroで決定するために使用するキットであって;
(a)アッセイに適合しうるフォーマットの参照ペプチドのセット、ここでセット中の各ペプチドは、PGD及び表1、表1(A)グループ1;表1(B)グループ2;または表1(c)グループ3あるいはそれらの組み合わせに与えられた記載の1以上のマーカータンパク質のそれぞれを一意的に表すものであり;および
(c)洗浄液、希釈剤およびバッファーから成る群より選択される1以上の成分を含む前記キット。 - アレルゲンまたは刺激物質に曝された個体における、前記アレルゲンまたは刺激物質による接触または呼吸感作を診断または予後モニタリングするためのデータを取得するための方法であって、
(a)前記個体から得た生体サンプル中の、PGD及び表1、表1(A)グループ1;表1(B)グループ2;または表1(c)グループ3から選択される1以上のタンパク質マーカーの存在または発現レベルを決定するステップを含む、前記方法。
- 生体サンプルが皮膚細胞、肺細胞、または免疫系細胞から選択される細胞を含むものである、請求項24に記載の方法。
- 前記1以上のマーカータンパク質が表5から選択される、請求項24または請求項25に記載の方法。
- アレルゲンまたは刺激物質に曝された個体における、前記アレルゲンまたは刺激物質による接触または呼吸感作を診断または予後モニタリングするキットであって、
(a)複数の結合メンバーがその上に固定された固体支持体、ここで、各結合メンバーはPGD又は表1、表1(A)グループ1;表1(B)グループ2;または表1(c)グループ3に提供された群より選択される1以上のタンパク質マーカーと選択的に結合するものであり;
(b)標識を含む現像剤;および
(c)洗浄液、希釈剤およびバッファーから選択される1以上の成分
を含むものである前記キット。 - 前記1以上のタンパク質マーカーが表5から選択される、請求項27に記載のキット。
- 化学感作物質に対する個体のin vitro診断および予後モニタリングのための、PGD及び表1、表1(A)グループ1;表1(B)グループ2;表1(c)グループ3、または表5から選択される1以上のタンパク質マーカーの使用。
- 化学感作物質に対する個体のin vitro診断または予後モニタリングのための、PGDまたはその断片と結合することができる結合メンバー、及び表1または表5に提供された1以上のマーカータンパク質またはその断片、前記PGD及び前記1以上のマーカータンパク質に対する1以上の抗体から選択される分析物と結合することができる1以上の結合メンバーの使用。
- 前記結合メンバーが固体支持体に固定されている、請求項30に記載の使用。
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