JP6219170B2 - リポタンパク質複合体ならびにその製造および使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2011年2月7日に出願された米国仮特許出願第61/440,371号、2011年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/452,630号および2011年5月17日に出願された米国仮特許出願第61/487,263号(これらの全ての内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる)の35 U.S.C.§119(e)の下での利益を主張する。
本開示は、リポタンパク質複合体、該複合体を含む医薬組成物、そのような複合体のためのアポリポタンパク質を製造および精製する方法、該複合体を作製する方法ならびに心血管疾患、障害および/またはそれらと関連する状態を治療または予防するための前記複合体の使用方法を提供する。
3.1.概説
循環コレステロールは、脂質と、血液中の脂質を輸送するタンパク質組成物との複合体粒子である血漿リポタンパク質により運搬される。4つの主要なクラスのリポタンパク質粒子が血漿中に循環し、脂肪輸送系に関与する:カイロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)および高密度リポタンパク質(HDL)。カイロミクロンは、腸脂肪吸収の短命の生成物である。VLDLおよび特に、LDLは、肝臓(コレステロールが合成されるか、または食事起源から得られる)から肝臓外組織、例えば、動脈壁へのコレステロールの送達を担う。対照的に、HDLは、逆コレステロール輸送(RCT)、特に、肝臓外組織から肝臓へのコレステロール脂質の除去を媒介し、そこで保存、異化、排除または再利用される。HDLはまた、炎症、酸化された脂質およびインターロイキンの輸送において有益な役割を果たし、次いで血管壁における炎症を減少させることができる。
逆コレステロール輸送(RCT)経路は、多くの肝臓外組織からコレステロールを排除するように機能し、体内の多くの細胞の構造および機能の維持にとって重要である。RCTは主に3つの段階:(a)コレステロール流出、すなわち、末梢細胞の様々なプールからのコレステロールの最初の除去;(b)細胞中への流出したコレステロールの再進入を防止する、レシチン:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)の作用によるコレステロールエステル化;および(c)加水分解のための肝臓細胞へのHDL−コレステロールおよびコレステリルエステルの取込み、次いで、再利用、貯蔵、胆汁中への排出または胆汁酸への異化、からなる。
HDLの防御機構の研究は、HDLの主成分であるアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)に焦点を当ててきた。ApoA−Iの高い血漿レベルは、冠動脈病変の非存在または減少と関連する(Maciejkoら、1983、N. Engl. J. Med. 309:385-89; Sedlisら、1986、Circulation 73:978-84)。
脂質異常障害は、血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルの上昇ならびに血清HDL:LDL比の低下と関連する疾患であり、高脂血症、特に、高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲の疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患が挙げられる。動脈不全により引き起こされる、一過性虚血発作または間欠性跛行などのアテローム性動脈硬化症と関連する症候群も含まれる。脂質異常障害と関連する上昇した血清コレステロールおよびトリグリセリドを低下させるためにいくつかの治療が現在利用可能である。しかしながら、有効性、副作用および患者集団の適格性の点で、それぞれはそれ自身の欠点および限界を有する。
本開示は、脂質異常症ならびに脂質異常症と関連する疾患、障害および/または状態を治療および/または予防するのに特に適した、タンパク質画分(例えば、アポリポタンパク質画分)と脂質画分とを含むリポタンパク質複合体、およびその集団を提供する。より高い純度および/もしくは均一性を有し、ならびに/または本明細書に記載のように特定の比率の脂質およびタンパク質を含む複合体の集団が、副作用のリスクの低下と共に、コレステロールを移動させる能力が増加していることが発見された。
・集団は、それぞれタンパク質画分と脂質画分とを含む、複数のリポタンパク質複合体を含有する;
・タンパク質画分は、上記の、および第6.1節または第6.5.3節に記載されるリポタンパク質またはリポタンパク質類似体を含有する;最も好ましくは、タンパク質画分は、第6.1.2節に記載の方法により得られたか、もしくは得られる、および/または第6.1.4節に記載の方法により精製されたリポタンパク質(例えば、ApoA−Iタンパク質)を含むか、または本質的にそれからなる;
・脂質画分は、上記の、および第6.2節または第6.5.2節に記載の脂質を含む;
・リポタンパク質複合体は、好ましくは第6.5.4節に記載の熱サイクリング法により製造される。
・多くは4nm〜15nm(例えば、5nm〜12nm、6nm〜15nm、または8nm〜10nm)の範囲である、集団中の複合体のサイズの均一性;
・複合体を作製するのに用いられるアポリポタンパク質の純度(例えば、酸化、脱アミド化、トランケートされた、および/もしくは未熟な形態のアポリポタンパク質の欠如ならびに/または内毒素の欠如ならびに/またはアポリポタンパク質以外のタンパク質(宿主細胞タンパク質など)の欠如、ならびに/または組換え産物中に存在することが多い宿主細胞DNA);
・集団中の複合体自体の純度(複合体を調製するのに用いられる溶媒もしくは洗剤などの汚染物質の欠如;酸化脂質の欠如;脱アミド化、酸化もしくはトランケートされたタンパク質の欠如;ならびに/または少量の非複合体化アポリポタンパク質および/もしくは脂質またはそれらの欠如を特徴とする)
を含む。
(a)前記集団中のリポタンパク質、典型的には、ApoA−Iの少なくとも75重量%、少なくとも80重量%、少なくとも85重量%、少なくとも90重量%、または少なくとも95重量%が、成熟形態にある;
(b)前記集団中のリポタンパク質、典型的には、ApoA−Iの25重量%以下、20重量%以下、15重量%以下、10重量%以下または5重量%以下が未熟形態にある;
(c)前記集団が、リポタンパク質、典型的には、ApoA−I 1ミリグラムあたり、100ピコグラム以下、50ピコグラム以下、25ピコグラム以下、10ピコグラム以下または5ピコグラム以下の宿主細胞DNAを含有する;
(d)前記集団が、リポタンパク質、典型的には、ApoA−I 1ミリグラムあたり、500ナノグラム以下、200ナノグラム以下、100ナノグラム以下、50ナノグラム以下、または20ナノグラム以下の宿主細胞タンパク質を含有する;
(e)前記集団中のリポタンパク質、典型的には、ApoA−Iの25重量%以下、20重量%以下、15重量%以下、10重量%以下または5重量%以下がトランケートされた形態にある;
(f)リポタンパク質成分が成熟ApoA−Iを含むか、またはそれからなり、前記集団中の前記ApoA−I中のメチオニン112およびメチオニン148の各々の20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、3%以下、2%以下または1%以下が酸化されている;
(g)リポタンパク質複合体の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%が、ゲル浸透クロマトグラフィー(「GPC」)または動的光散乱(「DLS」)により測定された場合、4nm〜15nmのサイズ、例えば、6nm〜15nmのサイズ、または8〜12nmのサイズ、さらにより好ましくは、5nm〜12nmのサイズの粒子の形態にある;
(i)前記集団が、リポタンパク質、典型的にはApoA−I 1ミリグラムあたり、1EU以下、0.5EU以下、0.3EU以下または0.1EU以下の内毒素を含有する;
(j)前記集団中のリポタンパク質、典型的にはApoA−I中のアミノ酸の15%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下または1%以下が脱アミド化されている;
(k)前記複合体中の脂質画分中の脂質の15重量%以下、10重量%以下、5重量%以下、2重量%以下または0重量%がコレステロールである;
(l)前記集団が200ppm、100ppm、50ppm以下の非水性溶媒を含有する;
(m)前記集団が洗剤(例えば、コール酸塩)を含有しない;
(n)前記集団が、ゲル浸透クロマトグラフィー中の単一のピークにおける集団の百分率により測定された場合、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%均一であってよい;
(o)前記集団が、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも97%のタンパク質が複合体化された形態にある組成物中にある;
(p)前記集団中の脂質の5%以下、4%以下、3%以下、2%以下または1%以下が酸化されている;ならびに
(q)前記集団中のメチオニンおよび/またはトリプトファン残基の15%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下または1%以下が酸化されている。
I群:上記の特徴(a)、(b)および(c);
II群:上記の特徴(c)、(d)および(i);
III群:上記の特徴(f)、(j)、(e)、(p)および(q);
IV群:上記の特徴(g)、(n)および(o);
V群:上記の特徴(l)および(m);ならびに
VI群:上記の特徴(k)。
本開示は、リポタンパク質複合体を作製する方法と共に、リポタンパク質複合体、その集団を提供する。この複合体、ならびにその集団および組成物(例えば、医薬組成物)は、特に、脂質異常症ならびに/または脂質異常症と関連する疾患、障害および/もしくは状態の治療および/または予防にとって有用である。発明の概要の節で考察された通り、リポタンパク質複合体は、好ましくは、規定の重量比またはモル比の2つの主要な画分、アポリポタンパク質画分およびリン脂質画分を含み、好ましくは、特定の量の中性リン脂質および場合により、1つまたは複数の負に荷電したリン脂質を含む。
本開示は、タンパク質画分を含むリポタンパク質複合体を提供する。本開示は、リポタンパク質複合体を作製する方法をさらに提供する。リポタンパク質複合体のタンパク質成分は、本発明の方法における成功にとって重要ではない。治療的および/または予防的利益を提供する、実質的に任意の脂質結合タンパク質、例えば、アポリポタンパク質および/またはその誘導体もしくは類似体を、複合体中に含有させることができる。さらに、アポリポタンパク質(例えば、ApoA−Iなど)がLCATを活性化するか、または脂質と結合した場合に円盤状粒子を形成することができるという点で、その活性を「模倣」する任意のα−へリックスペプチドもしくはペプチド類似体、または任意の他の型の分子を、リポタンパク質複合体中に含有させることができ、用語「脂質結合タンパク質」により包含される。
本開示は、例えば、リポタンパク質複合体を作製するのに用いるための、組換え産生されたタンパク質を精製する方法をさらに提供する。組換え産生されたタンパク質は、最も好適にはアポリポタンパク質である。好適なタンパク質としては、好ましくは成熟形態の、アポリポタンパク質ApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoA−VおよびApoEが挙げられる。脂質結合タンパク質もまた、活性な多型、アイソフォーム、変異体および突然変異体ならびにトランケートされた形態の前記アポリポタンパク質であり、最も一般的にはアポリポタンパク質A−IMilano(ApoA−IM)、アポリポタンパク質A−IParis(ApoA−IP)およびアポリポタンパク質A−IZaragoza(ApoA−IZ)である。システイン残基を含有するアポリポタンパク質突然変異体も公知であり、用いることもできる(例えば、米国特許出願公開第2003/0181372号を参照されたい)。アポリポタンパク質は、単量体または二量体の形態にあってよく、二量体はホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよい。例えば、ApoA−I(Duvergerら、1996、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12): 1424-29)、ApoA−IM(Franceschiniら、1985、J. Biol. Chem. 260: 1632-35)、ApoA−IP(Daumら、1999、J. Mol. Med. 77:614-22)、ApoA−II(Shelnessら、1985、J. Biol. Chem. 260(14):8637-46; Shelnessら、1984、J. Biol. Chem. 259(15):9929-35)、ApoA−IV(Duvergerら、1991、Euro. J. Biochem. 201(2):373-83)、ApoE(McLeanら、1983、J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000)、ApoJおよびApoHのホモおよびヘテロ二量体(実現可能である場合)を用いることができる。アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が複合体中に含まれた場合にいくらかの生物活性を保持する限り、Hisタグなどのその単離を容易にするエレメント、または他の目的のために設計された他のエレメントに対応する残基を含んでもよい。
本開示は、ApoA−Iなどの脂質結合タンパク質を製造するための組換え発現方法、および関連する核酸、哺乳動物宿主細胞、細胞培養物を提供する。得られる組換え脂質結合タンパク質を精製し、および/または本明細書に記載のリポタンパク質複合体中に組み込むことができる。
本開示は、本明細書に記載のリポタンパク質複合体およびその組成物を作製するのに有用である、高度に精製されたアポリポタンパク質を取得する方法に関する。この方法は、限定されるものではないが、ApoA−I、−II、−IIIまたは−IV;ApoB48およびApoB100;ApoC−I、−II、−IIIまたは−IV;ApoD;ApoE、ApoH;ApoJなどの任意のアポリポタンパク質に適用することができる。より具体的には、本開示は、高度に精製されたApoA−Iを取得する方法に関する。いくつかの実施形態においては、ApoA−Iは、限定されるものではないが、Genbank受託番号NP_000030、AAB59514、P02647、CAA30377、AAA51746およびAAH05380.1に記載の配列から選択される配列を有するヒトタンパク質である。特定の実施形態においては、ApoA−Iは、第6.1.2節で上記されたヒトタンパク質である。他の実施形態においては、本開示の方法を用いて、非ヒト動物(例えば、米国特許出願公開第2004/0077541号)、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒヒ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ハリネズミ、アナグマ、マウス、ラット、ネコ、モルモット、ハムスター、アヒル、ニワトリ、サケおよびウナギ(Brouilletteら、2001、Biochim. Biophys. Acta. 1531 :4-46;Yuら、1991、Cell Struct. Funct. 16(4):347-55;ChenおよびAlbers、1983、Biochim Biophys Acta. 753(l):40-6;Luoら、1989、J Lipid Res. 30(11): 1735-46;Blatonら、1977、Biochemistry 16:2157-63;Sparrowら、1995、J Lipid Res. 36(3):485-95;Beaubatieら、1986、J. Lipid Res. 27: 140-49;Januzziら、1992、Genomics 14(4): 1081-8;GoulinetおよびChapman、1993、J. Lipid Res. 34(6):943-59; Colletら、1997、J Lipid Res. 38(4):634-44;ならびにFrankおよびMarcel、2000、J. Lipid Res. 41(6):853-72)から得られるApoA−Iを精製することができる。
本出願人は、成熟し、無傷であり、汚染物質を実質的に含まないリポタンパク質を生成する、以下に記載され、実施例に例示される改良された精製プロセスをさらに発見した。本明細書に記載の精製方法は、当業者にとって都合の良い任意の規模で実施することができる。
本開示はまた、実質的に純粋な成熟完全長アポリポタンパク質も提供する。本明細書で用いられる用語「実質的に純粋な」とは、少なくとも95%純粋であるタンパク質を指す。特定の実施形態においては、実質的に純粋なタンパク質は、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.99%または100%純粋である。特定の態様においては、本明細書に記載の精製方法により製造された実質的に純粋なアポリポタンパク質生成物は、白い背景に対して光源を用いて視覚的に調べた場合、可視粒子を含まない透明からわずかに乳白光を発する無色の溶液である。様々な実施形態においては、上記の第6.1.4節に記載の方法により得られたか、または得られる実質的に純粋なアポリポタンパク質は、以下にさらに詳述するように、少量または検出不可能な量の1つまたは複数の宿主細胞DNA、アポリポタンパク質以外のタンパク質(例えば、宿主細胞タンパク質)、内毒素、残留溶媒、ならびに低いバイオバーデン(bioburden)(すなわち、試料上または試料中の少数の微生物)を含む。アポリポタンパク質生成物の純度は、限定されるものではないが、N末端エドマン配列決定、MALDI−MS、ゲル電気泳動、HPLCおよび/または免疫アッセイなどの当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。
本開示のリポタンパク質複合体および組成物は、脂質画分を含む。脂質画分は、1つまたは複数の脂質を含む。様々な実施形態においては、1つまたは複数の脂質は、飽和および/または不飽和および天然または合成の脂質であってよい。脂質画分は、好ましくは少なくとも1つのリン脂質を含む。
本開示は、それぞれの組成が上記の第6.1節および第6.2節にそれぞれ記載された、タンパク質画分と脂質画分とを含むリポタンパク質複合体を提供する。
リポタンパク質複合体の組成、ならびにそのサイズおよびリポタンパク質複合体の調製において用いられる脂質粒子のものを、当技術分野で公知の様々な技術を用いて決定することができる。
本開示は、本明細書に記載のリポタンパク質複合体の集団をさらに提供する。集団は、例えば、上記の第6.3節に記載のようなタンパク質画分および脂質画分をそれぞれ含む、本明細書に記載の複数のリポタンパク質複合体を含む。本出願人は、リポタンパク質複合体の集団の効力および安全性プロフィールに個別に、または組み合わせて寄与すると考えられるいくつかの特徴を発見した。リポタンパク質複合体の集団は、本明細書に記載の任意の数の特徴を単独で、または組み合わせて含んでもよい。
6.5.1.熱サイクリングに基づくリポタンパク質複合体の作製方法
本明細書に記載のタンパク質および脂質成分の熱サイクリングを用いる方法を用いて、他の方法と比較して利点を有するリポタンパク質複合体を生成することができることが発見された。本明細書に提供される熱サイクリング法においては、タンパク質成分および脂質成分は、タンパク質成分の大部分(例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%)が脂質成分と複合体化されてリポタンパク質複合体を形成するまで熱サイクリングにかけられる。当業者には明らかなように、リポタンパク質複合体の製造のための他の方法と比較した本発明の方法の利点としては、含まれる副生成物(例えば、非複合体化タンパク質)が少ないか、全くない、または得られる生成物中に存在する製造不純物(例えば、洗剤もしくは界面活性剤、分解されたタンパク質、酸化された成分)を含まない、実質的に均一で純粋な最終生成物をもたらす高い複合体化効率、費用が高く、無駄の多い精製ステップの必要性の回避が挙げられる。かくして、前記方法は効率的であり、出発材料の無駄が皆無かそれに近い。さらに、プロセスはスケールアップが容易であり、装備費用が低い。工業用溶媒を用いずにこれらのプロセスを実行する能力は、それらを環境に優しくもする。
本開示の熱サイクリング法は、上記の第6.2節に記載のように、飽和、不飽和、天然および合成の脂質および/またはリン脂質などの様々な脂質を単独で、または組み合わせて用いることができる。
リポタンパク質複合体のタンパク質成分は、本発明の熱サイクリング法における成功にとっては重要ではない。実質的に任意の脂質結合タンパク質、例えば、治療的および/または予防的利益を提供するアポリポタンパク質および/またはその誘導体もしくは類似体を、複合体中に含有させることができる。さらに、任意のα−へリックスペプチドもしくはペプチド類似体、またはアポリポタンパク質(例えば、ApoA−Iなど)がLCATを活性化するか、もしくは脂質と結合した場合に円盤状粒子を形成することができるという点で、アポリポタンパク質の活性を「模倣」する任意の他の種類の分子を、リポタンパク質複合体中に含有させることができ、従って、「脂質結合タンパク質」の定義内に含まれる。熱サイクリング法において用いることができる脂質結合タンパク質としては、上記の第6.1節に記載のものが挙げられる。脂質結合タンパク質を、上記の第6.1.2節に記載のように組換え産生することができる。脂質結合タンパク質は、上記の第6.1.3節または第6.1.4節に記載のものなどの、本明細書に記載の方法のいずれかによって精製することができる。
前記方法は一般的に、脂質粒子と脂質結合タンパク質とを含む懸濁液を、リポタンパク質複合体が形成されるまで「高」温範囲と「低」温範囲との間で熱サイクリングすることを必要とする。
負に荷電したリポタンパク質複合体などの本明細書に記載のリポタンパク質複合体を、限定されるものではないが、ベシクル、リポソーム、プロテオリポソーム、ミセル、および円盤状粒子などの様々な形態で調製することができる。上記の熱サイクリング法に加えて、当業者には公知の様々な方法を用いて、リポタンパク質複合体を調製することができる。リポソームまたはプロテオリポソームを調製するための様々な技術を用いることができる。例えば、アポリポタンパク質を好適なリン脂質と共に(超音波浴または超音波プローブを用いて)同時超音波処理して、複合体を形成させることができる。あるいは、アポリポタンパク質、例えば、ApoA−Iを、予め形成された脂質ベシクルと合わせて、リポタンパク質複合体の同時形成をもたらすことができる。また、リポタンパク質複合体は、洗剤透析法により;例えば、アポリポタンパク質、荷電したリン脂質およびSMおよびコール酸塩などの洗剤の混合物を透析して、洗剤を除去し、再構成させて負に荷電したリポタンパク質複合体を形成させる(例えば、Jonasら、1986、Methods in Enzymol. 128:553-82を参照されたい)、または押出装置を用いることにより、または均一化により形成させることもできる。
本開示により想定される医薬組成物は、in vivoでの投与および送達にとって好適な薬学的に許容される担体中に活性成分として負に荷電したリポタンパク質複合体を含む。ペプチドは酸性および/または塩基性末端および/または側鎖を含んでもよいため、ペプチド模倣性アポリポタンパク質を、遊離酸もしくは塩基の形態で、または薬学的に許容される塩の形態で組成物中に含有させることができる。アミド化、アシル化、アセチル化またはペグ化されたタンパク質などの改変タンパク質を用いることもできる。場合により、医薬組成物は、上記の第6.2節および第6.3節に記載のように、1つまたは複数の疎水性、親油性、または非極性活性剤をロードしたリポタンパク質複合体を含んでもよい。
本明細書に記載のリポタンパク質複合体、例えば、負に荷電したリポタンパク質複合体、および組成物を、有用であることが示された実質的に全ての目的のリポタンパク質複合体のために用いることができる。負に荷電したリポタンパク質複合体などのリポタンパク質複合体は、現在利用可能な治療レジメンにより必要とされるアポリポタンパク質の量(2〜5日毎に投与1回あたり20mg/kg〜100mg/kg、平均的なサイズのヒト1人あたり1.4g〜8g)よりも有意に低い用量で投与された場合でも、コレステロールを移動させるのに有効である。
本明細書中に記載のリポタンパク質複合体、例えば、負に荷電したリポタンパク質複合体、および組成物は、例えば、診断目的で、血清HDLを測定するためにin vitroでのアッセイにおいて用いることができる。ApoA−I、ApoA−IIおよびApoペプチドは、血清のHDL成分と結合するので、負に荷電したリポタンパク質複合体を、HDL集団、ならびにプレ−β1およびプレ−β2 HDL集団の「マーカー」として用いることができる。さらに、負に荷電したリポタンパク質複合体を、RCTにおいて有効なHDLのサブ集団のマーカーとして用いることができる。この目的のために、負に荷電したリポタンパク質複合体を、患者血清試料に添加するか、または患者血清試料と混合することができる;適切なインキュベーション時間の後に、組み込まれた負に荷電したリポタンパク質複合体を検出することによって、HDL成分をアッセイすることができる。これは、標識された負に荷電したリポタンパク質複合体(例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、染料など)を使用して、または負に荷電したリポタンパク質複合体に対して特異的な抗体(もしくは抗体断片)を使用する免疫アッセイによって、達成することができる。
7.1.チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中でのヒトApoA−Iのクローニングおよび発現
7.1.1.ApoA−I発現ベクターの調製
プレプロApoA−I遺伝子配列はNCBI(P02647)から取得し、クローニングを容易にし、発現を改善するためにフランキング配列を付加した。フランキング配列を含むプレプロApoA−IコードDNAを合成し、Bluescript KS+ベクター中にクローニングした。5’フランキング配列は、最適化されたKozak翻訳配列を含んでいた。HindIIIおよびBglII制限酵素を用いて、Bluescript KS+ベクターから、プレプロApoA−I挿入物を切り出した。この断片をゲル精製し、以下の遺伝子エレメント:Molony Murine Sarcomaウイルス5’LTRに融合されたヒトサイトメガロウイルスプロモーター、MoMuLV/SVパッケージング領域、極初期サルサイトメガロウイルスプロモーター、マルチクローニング部位、MoMuLV由来3’LTR、ならびに細菌の複製起点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を担持するレトロウイルス発現ベクター中にライゲーションした。得られた構築物のクローンを、遺伝子およびフランキング領域を通じて配列決定した。最終的なクローン(クローン#17)を、予測されるDNA配列との一致に基づいて選択した。次いで、Vesicular Stomatitis Virusエンベロープ糖タンパク質のための発現プラスミドで同時トランスフェクトした293GP細胞を用いる形質導入のために、レトロベクターを調製した。同時トランスフェクトされた細胞から回収され、濃縮された上清を、以下の第7.1.2節に記載のCHO−S形質導入ステップに用いた。
無血清培地中での増殖のために適合させたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO−S)を、上記の第7.1.1節に記載のレトロウイルスベクターを用いる3ラウンドの形質導入(1X、2Xおよび3X)にかけた。それぞれの形質導入後の低温保存のために、プールされた集団を拡張し、細胞の試料を遺伝子コピー分析に提出した。遺伝子コピー指数を以下の表2に示す。3X形質導入細胞系を、125mLフラスコ中で2回、16日のフェドバッチ試験における生産性について分析した。その結果を表3に示す。
ApoA−Iを産生するマスター細胞バンクであるCHO−S−ApoA−I−R(3X)クローン17に対して、その生存能力の安定性、増殖速度、遺伝子挿入物の保護、および長期培養中の一貫した生成物分泌を評価するために、非GMP特性評価試験を行った。
7.2.1.接種材料および200Lバイオリアクター製造へのスケールアップ
マスター細胞バンクからのヒトApoA−I遺伝子を安定にトランスフェクトされたCHO−S細胞のバイアルを37℃水浴中で解凍し、35mLのHyQ PF−CHO LS細胞培養培地を含有する単一の振とうフラスコ(250mL)(Thermo Fisher Scientific)に添加した。血球計を用いて決定された初期細胞計数は、2.48x105細胞/mLであり、93.8%の生存率であった。次いで、培養物を、加湿された5%CO2環境中、37℃で維持したインキュベータ内のOrbit振とう器(90rpm)上に置いた。継代培養ステップは、約1.6x105細胞/mLの接種密度を目標とした。フラスコ中の4日目の細胞計数および生存率は、15.01x105細胞/mLおよび93.9%の生存率であった。250mLのフラスコを1Lのフラスコに継代培養した。1Lフラスコからの3日目の平均生細胞計数は、13.56x105細胞/mLであり、95.3%の生存率であった。この1Lフラスコを、それぞれ、1000mLおよび1.75x105細胞/mLの初期培養容量および初期標的細胞密度で10Lの使い捨てWave Bag(GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp、Somerset、NJ)を含むWave Bioreactor System 20EHに継代培養した。Wave Bioreactor運転設定は、37℃のインキュベーション温度、15.0cpmの振とう速度、10.9°の振とう角度、および0.25L/分のガス流速を用いる通気ガス中、5.0%のCO2濃度であった。培養の3日後、Wave Bag中の生細胞密度は10.73x105細胞/mLであり、新鮮なHyQ PF−CHO LSを添加し、培養容量を5000mLにした。さらに3日後、生細胞密度は13.25x105細胞/mLであり、Wave Bag中の容量を30Lバイオリアクターに移した。温度、pH、溶解酸素、圧力、および撹拌速度に関する30Lバイオリアクターにおける運転設定点は、それぞれ、37℃、pH7.0、40%空気飽和、1psig圧力、および50rpm撹拌速度であった。
バイオリアクターの内容物を2つのCuno(Rutherford、NJ、USA)60M02 Maximizerフィルター、次いで、Millipore 0.22μm Opticap(Billercia、MA、USA)に通過させることにより、バイオリアクターからの培地を200Lの袋に収穫した。次いで、清澄化された培地を、分散操作まで2〜8℃で保存した。清澄化された培地を、Millipore 0.22μmフィルター(Billerica、MA、USA)を通して濾過し、2Lの滅菌PETGボトル(ThermoFisher、Marietta、OH、USA)中に分注した後、出荷されるまで−20℃で凍結した。
8.1.材料および方法
発現、一次分離および条件化。実施例1に記載のように得られたApoA−I清澄化細胞増殖培地(約1.8L)を、周囲温度での保存により解凍した。解凍された培地を、1M HClを用いてpH5.3±0.2に低下させることにより、陰イオン交換クロマトグラフィーのために条件化した。
ApoA−Iの特性評価。SDS−PAGEによりApoA−I生成物の純度をアッセイしたところ、99%以上純粋であり、低レベルのDNAおよび宿主細胞タンパク質を含み、トランケートされたApoA−Iの量は検出不可能であった。図4を参照されたい。
9.1.アポリポタンパク質およびリン脂質成分の調製
プロApoA−I:タンパク質プロApoA−Iは、約90mgのタンパク質を含有する凍結乾燥された個々の100mLフラスコ中で、Unite de Biotechnologie、Institut Meurice、Hte Ecole Lucia De Brouckere、1 Avenue Emile Gryzon、B−1070 Anderlecht、Belgiumにより供給されたものであった。バッチ番号は20060202であった。タンパク質を使用まで約4℃で保持した。凍結乾燥前に、プロApoA−Iの含量は3.225mg/mLであり、尿素含量は約0.011mg/mLであった。約630mgのプロApoA−Iを25.6mLの酢酸/水5%中に溶解することにより、プロApoA−Iの溶液を作製した。溶液の最終濃度は25mg/mLであった。
以下のリポタンパク質複合体を調製した:
(a)中性リポタンパク質複合体:
a.処方A:タンパク質:リン脂質の重量比が1:2.5であるプロApoA−IおよびSM;
b.処方B:タンパク質:リン脂質の重量比が1:2.7であるプロApoA−IおよびSM;
c.処方C:タンパク質:リン脂質の重量比が1:3.1であるプロApoA−IおよびSM;
d.処方D:50:50のSM:DPPC wt比を有する、リポタンパク質wt:総リン脂質wt比が1:2.7であるプロApoA−I、SMおよびDPPC;
e.処方E:タンパク質:リン脂質の重量比が1:2.7であるプロApoA−IおよびSM。
(b)負に荷電したリポタンパク質複合体:
a.処方F:48:48:4のSM:DPPC:DPPG wt:wt比を有する、リポタンパク質wt:総リン脂質wt比が1:2.7であるプロApoA−I、SM、DPPCおよびDPPG;
b.処方G:73:23:4のSM:DPPC:DPPG wt:wt比を有する、リポタンパク質wt:総リン脂質wt比が1:2.7であるプロApoA−I、SM、DPPCおよびDPPG;
c.処方H:97:3のSM:DPPG wt:wt比を有する、リポタンパク質wt:総リン脂質wt比が1:2.7であるApoA−I、SMおよびDPPG;
d.処方I:97:3のSM:DPPG wt:wt比を有する、リポタンパク質wt:総リン脂質wt比が1:3.0であるApoA−I、SMおよびDPPG;
e.処方J:97:3のSM:DPPG wt:wt比を有する、リポタンパク質wt:総リン脂質wt比が1:3.3であるApoA−I、SMおよびDPPG。
試料をHPLC系に注入し、リポタンパク質複合体のサイズおよび分布について検査することにより、処方AからJまでのリポタンパク質複合体の形成を試験した。同時均一化により複合体を製造し、指示された時間にサンプリングした。
10.1.ApoA−I/DPPG/スフィンゴミエリン複合体を作製するための手順の概説
1〜30mg/ml、典型的には5〜20mg/mlのタンパク質濃度のリン酸バッファー(pH7〜9)中の凍結ApoA−I溶液を、2〜8℃で約24〜96h解凍することにより調製し、秤量する。リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素ナトリウムをApoA−I溶液に添加して、pH7.4のバッファー中10mMの最終ペプチド濃度を得る。
上記の手順に従うが、ApoA−IをDPPGとプレ複合体化せずに、ApoA−I/SM複合体を作製した。タンパク質成分は8.9mg/mlの濃度の5mlのApoA−Iであり、脂質成分は10mMリン酸バッファーpH8.0中に懸濁し、均一化して60nmの脂質粒子を形成させた0.5mlの卵スフィンゴミエリン(220mg/ml)であった。タンパク質および脂質成分を50℃で1:2.5wt:wtの比で混合した。得られた懸濁液を、図5に記載の熱サイクリング装置を用いて18時間(108サイクルおよび10分のサイクリング時間)、熱サイクリングにかけた。ゲル浸透クロマトグラフィーは、形成されたタンパク質/脂質複合体が本質的に均一であることを示す(図14のGPCクロマトグラムを参照されたい)。
ApoA−I/DPPG/フィトスフィンゴミエリン複合体を、上記の手順に従って作製した。フィトスフィンゴミエリン粒子を約183nmのサイズ(DLSにより測定)まで均一化し、7.8g/Lのタンパク質:DPPG混合物に添加して、1:2.7の最終タンパク質:脂質(SMおよびDPPG)比を達成した。N−パルミトイル−4−ヒドロキシスフィンガニン−1−ホスホコリン(フィト−スフィンゴミエリン)およびタンパク質:DPPG成分を含有する懸濁液を、合計2時間にわたって、37℃で10分間および57℃で10分間の6サイクルにわたって熱サイクリングした。ゲル浸透クロマトグラフィーは、形成されたタンパク質/脂質複合体が本質的に均一であることを示す(図15のGPCクロマトグラムを参照されたい)。
ApoA−I/DPPG/合成パルミトイルスフィンゴミエリン複合体を、以下のように作製した。10mMリン酸バッファーpH7.4中の合成パルミトイルスフィンゴミエリン(220mg/ml)の8.8mLの溶液を、3300nmの粒径に達するまで混合した。ApoA−I(14mg/mlで945mg)を、0.03重量%のDPPG(60mg/ml)と合わせ、50℃で30分間加熱した。合成パルミトイルスフィンゴミエリンミセルを、1:2.7のアポリポタンパク質:リン脂質重量比でタンパク質/DPPG複合体と合わせた。タンパク質および脂質の懸濁液を、合計240分間、または好適な粒径分布に達するまで、10分毎に37℃と57℃を交互にする加熱−冷却サイクルを用いて熱サイクリングした。熱サイクリングの間の複合体のサイズおよび分布を、GPCによりモニターした。複合体化後、濃度を8.0mgのApoA−I/mlにした後、等張性のためにスクロース(40mg/ml)およびマンニトール(20mg/ml)を複合体に添加した。リポタンパク質複合体をGPCによりアッセイしたところ、本質的に均一であることがわかった(図16のGPCクロマトグラムを参照されたい)。
ApoA−I/DPPG/フィトスフィンゴミエリン複合体を、以下のように作製した。10mMリン酸バッファーpH7.4中のフィトスフィンゴミエリン(220mg/ml)の2.0mLの溶液を、990nmの粒径に達するまで50℃で40分間、ULTRA−TURRAX(登録商標)中で分散させた。ApoA−I(7.8mg/mlの濃度で15.6mg)を、0.03重量%のDPPG(60mg/ml)と合わせ、57℃で30分間加熱した。フィトスフィンゴミエリン溶液を、1:2.7のアポリポタンパク質:リン脂質重量比でタンパク質/DPPG混合物と合わせた。次いで、タンパク質および脂質の懸濁液を、合計240分間、または好適な粒径分布に達するまで、10分毎に37℃と57℃を交互にする加熱−冷却サイクルを用いて熱サイクリングした。リポタンパク質複合体の集団をGPCにより測定したところ、約92.6%均一であることがわかった(図17のGPCクロマトグラムを参照されたい)。
ApoA−Iペプチド(H−Lys−Leu−Lys−Gln−Lys5−Leu−Ala−Glu−Leu−Leu10−Glu−Asn−Leu−Leu−Glu15−Arg−Phe−Leu−Asp−Leu20−Val−Inp22−OH;配列番号4)溶液を用いて、上記のように(第10.1節を参照されたい)、ApoA−Iペプチド、DPPGおよびスフィンゴミエリンの複合体を生成させた。リン脂質成分は、48.5:48.5:3の重量比の卵スフィンゴミエリン(SM)、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(ジパルミトイルホスファチジルコリン、DPPC)および1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)](ジパルミトイルホスファチジル−グリセロール、DPPG)からなる。ペプチドと総リン脂質複合体との比率は、1:2.5(w/w)である。薬剤複合体は、リン酸緩衝生理食塩水(12mMリン酸ナトリウム、130mM塩化ナトリウム、pH8.2)中のCER−522複合体の溶液である。出発溶液を2時間、1ml/minの流速で50℃と37℃の間で熱サイクリングにかけることにより、複合体を形成させた。
粒径に対する脂質粒径および熱サイクル数の効果を試験した。4つの異なる出発脂質粒径(85nm、77nm、66nmおよび60nmのゼータ平均を有する)の調製物(それぞれ、図19A〜19D)を、1回の通過でNanoBEEにSM溶液を通すことにより生成させた。それぞれの通過物をそのゼータ平均について分析した。脂質粒径はそれぞれの通過と共に低下し、所望のサイズが達成されるまで脂質粒子を収集した。4つの異なる脂質粒径を、37℃で3分間および57℃で10分間の5または7サイクルにわたって、第10.1節の複合体形成法において試験した。
複合体形成に対する初期熱サイクリング温度の効果を試験した。脂質成分およびタンパク質成分を、57℃の代わりに37℃に加熱し、合わせた以外は第10.1節に記載のようにApoA−I/DPPG/SM複合体を生成させた。得られた複合体のGPCクロマトグラムを図22に示す。比較的大きいタンパク質ピーク(図22で9.455分に溶出する)により示されるように、熱サイクリングを57℃で開始した場合よりも実質的に少ないタンパク質成分がリポタンパク質複合体中に組み込まれた。
大規模商業製造のために、本開示の方法をスケールアップし、場合により製剤化ステップと組み合わせた。商業的実施形態を図23に示す。この実施形態では、熱サイクリングステップの後に、リポタンパク質複合体を希釈し、1つまたは複数の等張剤(例えば、スクロースおよび/またはマンニトール)と混合し、濾過し、バイアル中にアリコートする。バイアルの内容物を凍結乾燥して、得られる製剤の貯蔵期間を延長することができる。
本明細書に開示される熱サイクリング法により作製されたApoA−I/DPPG/SM複合体を、脂質およびタンパク質成分の同時均一化により作製された複合体と比較した。熱サイクリングにより作製された複合体の純度は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定した場合、同時均一化と比較して97%に改善された。SDS−PAGEを用いた場合、熱サイクリングにより作製された複合体は、同時均一化された複合体と比較して、98%の増加した主バンド純度を有し、あまりトランケートされていないタンパク質バンドが存在する。
ApoA−Iは、化学的に不安定になりやすい(例えば、酸化)繊細なタンパク質である。ApoA−I/SM/DPPC含有医薬組成物中のApoA−Iの安定性を増強するために、不活性ガスである窒素の雰囲気下で医薬組成物を調製した(熱サイクリング、充填および最終ステップを含む)。以下は、窒素下での同時均一化により作製されたApoA−I/SM/DPPC複合体と、熱サイクリングにより作製されたApoA−I/SM/DPPC複合体とを比較する試験の結果である。
ApoA−I−脂質複合体の生物活性を、Fu5AHラットヘパトーマ細胞において試験し、ABCA1媒介性コレステロール流出を測定した。
正常なウサギに、(a)5mg/kg用量の処方Bの調製物(1:2.7のアポリポタンパク質:リン脂質重量比でApoA−IおよびSMを含有する中性リポタンパク質複合体);(b)5mg/kg用量の処方Hの調製物(1:2.7のアポリポタンパク質:リン脂質重量比および97:3のSM:DPPG重量比でApoA−I、SMおよびDPPGを含有する負に荷電したリポタンパク質複合体);または(c)リポタンパク質複合体調製物のための希釈剤を含有する対照調製物を単回注射した。4匹のウサギを、処方B、処方Hおよび対照の各々について試験した。
ウサギに静脈内注射されたアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)/卵SMおよびApoA−I/合成パルミトイルSMリポタンパク質複合体の薬力学的効果を試験した。リポタンパク質複合体の注射後、血漿脂質およびリポタンパク質レベルの変化を測定した。
14.1.材料および方法
3.0を超えるLDL/HDL比を有する健康なボランティアにおいて、無作為化二重盲検プラセボ対照交差単回上昇用量試験として処方Hのリポタンパク質複合体を用いて、第I相臨床試験を行った。この第I相試験の目的は、単回用量として投与された場合の負に荷電したリポタンパク質複合体の安全性、許容性、薬物動態および薬力学を評価することであった。0.25、0.75、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0および45.0mg/kgの上昇用量を試験した。対象は、注入により、タンパク質および脂質成分の同時均一化により作製されたApoA−I(実施例1に記載のように調製されたもの)、SMおよびDPPG(1:2.7のタンパク質:脂質重量比および97%SM/3%DPPG(w/w)の脂質組成)のリポタンパク質複合体を含有する滅菌溶液を受けた。この滅菌溶液は、リポタンパク質複合体に加えて、マンニトールおよびスクロース(4%(w/w)スクロース、2%(w/w)マンニトール)を含有するpH8.0の10mMリン酸緩衝生理食塩水であった。
以下に、この第I相試験からの臨床知見をまとめる。
0.25、0.75、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0および45.0mg/kgの単回IV用量で処方Hの負に荷電したリポタンパク質複合体を含む滅菌溶液の調製物を投与したこの第I相試験から、以下の結論が得られた。
心血管疾患の治療における、低用量の処方H(1:2.7のアポリポタンパク質:リン脂質重量比で、97:3の卵SM:DPPG重量比のApoA−I、卵スフィンゴミエリン(卵SM)およびDPPG)の負に荷電したリポタンパク質複合体の治療的利益をさらに確認するために、臨床試験を行う。ApoA−Iを上記の実施例1に記載のようにCHO細胞中での発現により調製し、複合体を実施例4の熱サイクリング法により生成する。
本開示の様々な態様が、以下の番号付きの段落に記載の実施形態で説明される。
1.アポリポタンパク質画分と脂質画分とを含むリポタンパク質複合体であって、前記脂質画分が本質的に95〜99重量%の中性リン脂質と1〜5重量%の負に荷電したリン脂質とからなり、アポリポタンパク質画分とリン脂質画分との比が、重量比で約1:2.7〜約1:3の範囲にある、リポタンパク質複合体。
2.アポリポタンパク質が、プレプロアポリタンパク質(preproapoliprotein)、プレプロApoA−I、プロApoA−I、ApoA−I、プレプロApoA−II、プロApoA−II、ApoA−II、プレプロApoA−IV、プロApoA−IV、ApoA−IV、ApoA−V、プレプロApoE、プロApoE、ApoE、プレプロApoA−IMilano、プロApoA−IMilano、ApoA−IMilano、プレプロApoA−IParis、プロApoA−IParis、およびApoA−IParisならびにその混合物から選択される、実施形態1に記載のリポタンパク質複合体。
3.アポリポタンパク質が本質的に配列番号1のアミノ酸25〜267に対応するタンパク質に対して少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有するApoA−Iからなる、実施形態2に記載のリポタンパク質複合体。
4.アポリポタンパク質が単量体、二量体および/または四量体を含む、実施形態3に記載のリポタンパク質複合体。
5.アポリポタンパク質がApoA−Iペプチド模倣体を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体。
6.アポリポタンパク質画分とリン脂質画分との比が、重量比で1:2.7である、実施形態1から5のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体。
7.脂質:アポリポタンパク質モル比が約1:105〜約110の範囲であり、アポリポタンパク質の値がApoA−I当量で表される、実施形態1から6のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体。
8.脂質:アポリポタンパク質モル比が1:108である、実施形態7に記載のリポタンパク質複合体。
9.中性脂質が天然スフィンゴミエリンまたは合成スフィンゴミエリンである、実施形態1から8のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体。
10.スフィンゴミエリンが卵スフィンゴミエリンである、実施形態9に記載のリポタンパク質複合体。
11.少なくとも95%純粋であるスフィンゴミエリンから作製される実施形態9に記載のリポタンパク質複合体。
12.前記脂質画分が本質的に96〜98重量%の中性リン脂質と2〜4重量%の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態1から11のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体。
13.前記脂質画分が本質的に97重量%の中性リン脂質と3重量%の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態12に記載のリポタンパク質複合体。
14.負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含む、実施形態13に記載のリポタンパク質複合体。
15.負に荷電したリン脂質が1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)](DPPG)の塩を含むか、またはそれからなる、実施形態14に記載のリポタンパク質複合体。
16.塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、実施形態15に記載のリポタンパク質複合体。
17.中性および/または負に荷電したリン脂質のアシル鎖がそれぞれ互いに独立に、12〜26、14〜26、または16〜26個の炭素原子を含有する飽和またはモノ不飽和炭化水素から選択される、実施形態1から16のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体。
18.中性および/または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が同じである、実施形態17に記載のリポタンパク質複合体。
19.中性および/または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が異なる、実施形態17に記載のリポタンパク質複合体。
20.中性および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が同じ数の炭素原子を含有する、実施形態17に記載のリポタンパク質複合体。
21.中性および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が異なる飽和度を有する、実施形態17に記載のリポタンパク質複合体。
22.中性および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が16個の炭素原子を含有する、実施形態17に記載のリポタンパク質複合体。
23.実施形態1から22のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体の集団。
24.脂質画分と、本質的にアポリポタンパク質A−I(「ApoA−I」)からなるアポリポタンパク質画分とをそれぞれ含むリポタンパク質複合体の集団であって、下記特徴:
(a)前記集団中のApoA−Iに関して少なくとも80重量%、少なくとも85重量%、少なくとも90重量%、または少なくとも95重量%が成熟形態にある;
(b)前記集団中のApoA−Iの20重量%以下、15重量%以下、10重量%以下または5重量%以下が未熟形態にある;
(c)前記集団がApoA−I 1ミリグラムあたり、100ピコグラム以下、50ピコグラム以下、25ピコグラム以下、10ピコグラム以下または5ピコグラム以下の宿主細胞DNAを含有する;
(d)前記集団がApoA−I 1ミリグラムあたり、500ナノグラム以下、200ナノグラム以下、100ナノグラム以下、50ナノグラム以下、または20ナノグラム以下の宿主細胞タンパク質を含有する;
(e)前記集団中のApoA−Iの20重量%以下、15重量%以下、10重量%以下または5重量%以下がトランケートされた形態にある;
(f)前記集団中の前記ApoA−I中のメチオニン112およびメチオニン148のそれぞれの20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、3%以下、2%以下または1%以下が酸化されている;
(g)リポタンパク質複合体の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも90%が、ゲル浸透クロマトグラフィー(「GPC」)または動的光散乱(「DLS」)により測定された場合、4nm〜15nmまたは6nm〜15nmのサイズの粒子の形態にある;
(h)前記集団がApoA−I 1ミリグラムあたり、1EU以下、0.5EU以下、0.3EU以下または0.1EU以下の内毒素を含有する;ならびに
(i)前記集団中のApoA−I中のアミノ酸の10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下または1%以下が脱アミド化されている
のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個全部を特徴とする、集団。
25.前記複合体中の脂質画分中の脂質の15重量%以下、または10重量%以下、5重量%以下または2重量%以下がコレステロールである、実施形態24に記載の集団。
26.コレステロールを含有しない、実施形態25に記載の集団。
27.タンパク質の少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%が成熟ApoA−Iタンパク質である、実施形態24から26のいずれか1つに記載の集団。
28.タンパク質の15%未満、10%未満、または10%未満が酸化、脱アミド化、および/またはトランケートされた種である、実施形態27に記載の集団。
29.リポタンパク質複合体が少なくとも90%、少なくとも92.5%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%または少なくとも98%純粋である、実施形態24から28のいずれか1つに記載の集団。
30.リポタンパク質複合体が、ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピークにより反映されるように、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%均一である、実施形態24から29のいずれか1つに記載の集団。
31.リポタンパク質複合体の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%が、GPCまたはDLSにより測定された場合、4nm〜12nmの範囲のサイズ、6nm〜12nmの範囲のサイズ、または8nm〜12nmの範囲のサイズである、実施形態30に記載の集団。
32.タンパク質の少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%が複合体中にある、実施形態24から31のいずれか1つに記載の集団。
33.コール酸塩を含有しない、実施形態24から32のいずれか1つに記載の集団。
34.洗剤を含有しない、実施形態24から33のいずれか1つに記載の集団。
35.200ppm未満、100ppm未満または50ppm未満の非水性溶媒を含有する、実施形態24から34のいずれか1つに記載の集団。
36.前記ApoA−IがヒトApoA−Iタンパク質である、実施形態24から35のいずれか1つに記載の集団。
37.前記ApoA−Iが組換えApoA−Iである、実施形態24から36のいずれか1つに記載の集団。
38.ApoA−Iが配列番号1のアミノ酸25〜267に対応するタンパク質に対して少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態24から37のいずれか1つに記載の集団。
39.前記脂質画分が本質的に95〜99重量%の中性リン脂質と1〜5重量%の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態24から38のいずれか1つに記載の集団。
40.前記脂質画分が本質的に96〜98重量%の中性リン脂質と2〜4重量%の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態39に記載の集団。
41.前記脂質画分が本質的に97重量%の中性リン脂質と3重量%の負に荷電したリン脂質とからなる、実施形態24から40のいずれか1つに記載の集団。
42.中性脂質が天然スフィンゴミエリンまたは合成スフィンゴミエリンであり、場合により、脂質が5meq O/kg未満、4meq O/kg未満、3meq O/kg未満、または2meq O/kg未満の過酸化物価を有する、実施形態41に記載の集団。
43.スフィンゴミエリンが卵スフィンゴミエリンである、実施形態42に記載の集団。
44.少なくとも95%純粋であるスフィンゴミエリンから作られる実施形態42に記載の集団。
45.負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含む、実施形態41から44のいずれか1つに記載の集団。
46.負に荷電したリン脂質が1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)](DPPG)の塩を含むか、またはそれからなる、実施形態45に記載の集団。
47.塩がナトリウム塩またはカリウム塩である、実施形態46に記載の集団。
48.中性リン脂質および/または負に荷電したリン脂質のアシル鎖がそれぞれ互いに独立に、12〜26、14〜26、または16〜26個の炭素原子を含有する飽和またはモノ不飽和炭化水素から選択される、実施形態24から47のいずれか1つに記載の集団。
49.中性リン脂質および/または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が同じである、実施形態48に記載の集団。
50.中性リン脂質および/または負に荷電したリン脂質のそれぞれのアシル鎖が異なる、実施形態48に記載の集団。
51.中性リン脂質および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が同じ数の炭素原子を含有する、実施形態48に記載の集団。
52.中性リン脂質および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が異なる飽和度を有する、実施形態48に記載の集団。
53.中性リン脂質および負に荷電したリン脂質のアシル鎖が16個の炭素原子を含有する、実施形態48に記載の集団。
54.1:80〜120、1:85〜1:110、または1:100〜1:115の範囲のアポリポタンパク質画分:脂質画分モル比を有し、アポリポタンパク質の値がApoA−I当量で表される、実施形態24から41のいずれか1つに記載の集団。
55.1:80〜1:90、1:90〜1:100、1:100〜1:110または1:105〜1:110の範囲のアポリポタンパク質画分:脂質画分モル比を有し、アポリポタンパク質の値がApoA−I当量で表される、実施形態54に記載の集団。
56.1:2〜約1:3の範囲のアポリポタンパク質画分:リン脂質画分重量比を有する、実施形態24から55のいずれか1つに記載の集団。
57.アポリポタンパク質画分:リン脂質画分の重量比が1:2.1〜1:2.7である、実施形態24から40のいずれか1つに記載の集団。
58.アポリポタンパク質画分:リン脂質画分の重量比が1:2.7である、実施形態57に記載の集団。
59.実施形態1から22のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体または実施形態23から58のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体の集団、ならびに1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤を含むか、または本質的にそれからなる医薬組成物。
60.配列番号1の25〜267位に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含むApoA−Iタンパク質を発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞。
61.宿主細胞が培養される培地中に前記タンパク質が分泌される、実施形態60に記載の哺乳動物宿主細胞。
62.前記タンパク質がシグナル配列MKAAVLTLAVLFLTGSQAをさらに含む、実施形態60または61に記載の哺乳動物宿主細胞。
63.前記タンパク質がプロペプチド配列RHFWQQをさらに含む、実施形態60から62のいずれか1つに記載の哺乳動物宿主細胞。
64.チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、CHO−S、CHO−K1、VERO、BHK、BHK570、HeLa、COS−1、COS−7、MDCK細胞、293、3T3、ミエローマ、PC12およびW138である、実施形態60から63のいずれか1つに記載の哺乳動物宿主細胞。
65.CHO細胞である、実施形態64に記載の哺乳動物宿主細胞。
66.CHO−S細胞またはCHO−K1細胞である、実施形態65に記載の哺乳動物宿主細胞。
67.培養物中で少なくとも0.5、1、2、3または4g/Lの前記ApoA−Iタンパク質を産生することができる、実施形態60から66のいずれか1つに記載の哺乳動物宿主細胞。
68.培養物中で最大で4、5、6、7、8、9、10、12、15または20g/Lの前記ApoA−Iタンパク質を産生することができる、実施形態67に記載の哺乳動物宿主細胞。
69.培養物が大規模培養物である、実施形態67または68に記載の哺乳動物宿主細胞。
70.前記大規模培養物が少なくとも15リットル、少なくとも20リットル、少なくとも25リットル、または少なくとも30リットルである、実施形態69に記載の哺乳動物宿主細胞。
71.前記大規模培養物が約50リットル、約100リットル、約200リットルまたは約300リットルである、実施形態70に記載の哺乳動物宿主細胞。
72.少なくとも約5コピーの、前記ApoA−Iタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態60から71のいずれか1つに記載の哺乳動物宿主細胞。
73.それぞれのヌクレオチド配列がプロモーターに機能し得る形で連結される、実施形態72に記載の哺乳動物宿主細胞。
74.プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーターである、実施形態73に記載の哺乳動物宿主細胞。
75.プロモーターが極初期サルサイトメガロウイルスプロモーターである、実施形態74に記載の哺乳動物宿主細胞。
76.配列番号1のアミノ酸25〜267に対応するアミノアミノ配列を含むか、またはそれからなる成熟ApoA−Iタンパク質を分泌する、実施形態60から75のいずれか1つに記載の哺乳動物宿主細胞。
77.実施形態60から76のいずれか1つに記載の複数の哺乳動物宿主細胞を含む哺乳動物細胞培養物。
78.配列番号1のアミノ酸25〜267に対応するアミノアミノ配列を含むか、またはそれからなる少なくとも約0.5g/Lの成熟ApoA−Iタンパク質を含む、実施形態77に記載の哺乳動物細胞培養物。
79.前記成熟ApoA−Iタンパク質の少なくとも80%、少なくとも85%、または少なくとも90%がシグナル配列を欠く、実施形態78に記載の哺乳動物細胞培養物。
80.前記成熟ApoA−Iタンパク質の少なくとも80%、少なくとも85%、または少なくとも90%がシグナル配列およびプロペプチド配列を欠く、実施形態78に記載の哺乳動物細胞培養物。
81.前記成熟ApoA−Iタンパク質の少なくとも80%、少なくとも85%、または少なくとも90%がトランケート、酸化または脱アミド化されていない、実施形態78から80のいずれか1つに記載の哺乳動物細胞培養物。
82.ApoA−Iタンパク質が発現および分泌される条件下で実施形態60から76のいずれか1つに記載の哺乳動物宿主細胞を培養することを含む、成熟した生物学的に活性なApoA−Iタンパク質を製造する方法。
83.前記培養哺乳動物宿主細胞の上清から、前記成熟した生物学的に活性なApoA−Iタンパク質を回収することをさらに含む、実施形態82に記載の方法。
84.ApoA−Iタンパク質を精製することをさらに含む、実施形態82または83に記載の方法。
85.実施形態84に記載の方法により得られたか、または得られる治療上有効量のApoA−Iタンパク質を含む医薬組成物。
86.ApoA−Iタンパク質が脂質と複合体化される、実施形態85に記載の医薬組成物。
87.不活性ガス下で前記医薬組成物を製造することを含む、ApoA−Iを含む医薬組成物中の酸化生成物を最小化する方法。
88.不活性ガスが窒素、ヘリウムまたはアルゴンである、実施形態87に記載の方法。
89.医薬組成物がApoA−Iを含むリポタンパク質複合体の医薬組成物である、実施形態87または88に記載の方法。
90.リポタンパク質複合体を調製する方法であって、
(a)脂質成分とタンパク質成分とを含む出発懸濁液を、第1の温度範囲の温度から第2の温度範囲の温度まで冷却するステップであって、前記脂質成分が本質的に脂質の粒子からなり、前記タンパク質成分が本質的に脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質からなる、ステップ;
(b)冷却された(a)の懸濁液を、前記第2の温度範囲の温度から前記第1の温度範囲の温度まで加熱するステップ;
(c)前記の加熱された(b)の懸濁液を、前記第1の温度範囲の温度から前記第2の温度範囲の温度まで冷却するステップ;ならびに
(d)ステップ(b)と(c)を少なくとも1回繰り返すステップ
を含み、それによってリポタンパク質複合体を形成する方法。
91.ステップ(c)が、前記脂質成分および/または前記タンパク質成分の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%が複合体化形態になるまで、ステップ(a)および(b)を繰り返すことを含む、実施形態90に記載の方法。
92.ステップ(c)が、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の均一性のリポタンパク質複合体が得られるまで、ステップ(a)および(b)を繰り返すことを含む、実施形態90または91に記載の方法。
93.ステップ(d)が、少なくとも3回、少なくとも4回、または少なくとも5回、ステップ(b)および(c)を繰り返すことを含む、実施形態90から92のいずれか1つに記載の方法。
94.ステップ(c)が、最大6回、最大8回または最大10回、ステップ(b)および(c)を繰り返すことを含む、実施形態90から93のいずれか1つに記載の方法。
95.ステップ(a)の後、懸濁液が、前記加熱ステップ(b)の前に少なくとも1分、少なくとも2分、少なくとも3分、少なくとも4分または少なくとも5分、第2の温度範囲で維持される、実施形態90から94のいずれか1つに記載の方法。
96.ステップ(a)の後、懸濁液が、前記加熱ステップ(b)の前に、最大で6分、最大で8分、最大で10分、最大で20分、最大で30分または最大で1時間、第2の温度範囲内で維持される、実施形態90から95のいずれか1つに記載の方法。
97.ステップ(b)の後、懸濁液が、前記冷却ステップ(c)の前に少なくとも1分、少なくとも2分、少なくとも3分、少なくとも4分または少なくとも5分、第1の温度範囲内で維持される、実施形態90から96のいずれか1つに記載の方法。
98.ステップ(b)の後、懸濁液が、前記冷却ステップ(c)の前に最大で6分、最大で8分、最大で10分、最大で20分、最大で30分または最大で1時間、第1の温度範囲内で維持される、実施形態90から97のいずれか1つに記載の方法。
99.得られるリポタンパク質複合体が遠心分離にかけられない、実施形態90から98のいずれか1つに記載の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
100.脂質成分およびタンパク質成分が、ステップ(a)の前記出発懸濁液中で、それぞれ、脂質およびタンパク質およびペプチドの大部分に相当する、実施形態90から99のいずれか1つに記載の方法。
101.脂質成分が、ステップ(a)の前記出発懸濁液中の脂質の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%に相当する、実施形態90から100のいずれか1つに記載の方法。
102.タンパク質成分が、ステップ(a)の前記出発懸濁液中のタンパク質およびペプチドの少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%に相当する、実施形態90から101のいずれか1つに記載の方法。
103.前記懸濁液中の脂質の最大で5%、最大で10%、最大で15%または最大で20%が、ステップ(a)の出発懸濁液中でタンパク質成分と予め複合体化される、実施形態90から102のいずれか1つに記載の方法。
104.前記第1の温度範囲が、前記タンパク質成分の転移温度の、下は10℃以上および上は15℃以下、10℃以下または5℃以下の温度を含む、実施形態90から103のいずれか1つに記載の方法。
105.前記第2の温度範囲が、前記脂質成分の転移温度の、下は5℃以上または10℃以上および上は5℃以下の温度を含む、実施形態90から104のいずれか1つに記載の方法。
106.前記第1の温度範囲が、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、7℃または10℃以下である、実施形態90から105のいずれか1つに記載の方法。
107.前記第2の温度範囲が、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、7℃または10℃以下である、実施形態90から106のいずれか1つに記載の方法。
108.前記出発懸濁液を形成させるステップをさらに含む、実施形態90から107のいずれか1つに記載の方法。
109.前記懸濁液の形成が、それぞれ前記第1の範囲の温度に予め加熱された、脂質粒子の懸濁液と、前記脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質の溶液とを合わせるステップを含む、実施形態108に記載の方法。
110.前記懸濁液の形成が、それぞれ前記第1の範囲の温度に予め加熱された、脂質粒子の集団と、脂質と予め複合体化された前記脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質とを混合するステップを含む、実施形態108に記載の方法。
111.脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質と予め複合体化された脂質が、前記出発懸濁液中の総脂質の5%以下、10%以下、15%以下または20%以下である、実施形態110に記載の方法。
112.脂質の溶液が均一化された脂質の溶液である、実施形態109から111のいずれか1つに記載の方法。
113.前記合わせるステップの前に、高圧均一化を用いて均一化された脂質の溶液を形成させるステップをさらに含む、実施形態112に記載の方法。
114.前記高圧均一化が、1500barを超える、1800barを超える、または2000barを超える圧力である、実施形態113に記載の方法。
115.前記高圧均一化が、1900〜2500barの圧力で実施される、実施形態114に記載の方法。
116.脂質成分が本質的に脂質粒子からなり、前記脂質粒子が、
(i)DLSにより測定された場合、少なくとも45nm、少なくとも50nm、少なくとも55nmまたは少なくとも60nmのサイズである;および
(ii)DLSにより測定された場合、最大で65nm、最大で70nm、最大で75nm、最大で80nmのサイズ、最大で100nm、最大で120nm、最大で150nm、最大で200nm、最大で250nm、最大で300nm、最大で500nmのサイズである、実施形態90から115のいずれか1つに記載の方法。
117.前記脂質粒子が、DLSにより測定された場合、最大で65nm、最大で70nm、最大で75nm、または最大で80nmのサイズである、実施形態116に記載の方法。
118.前記脂質粒子が、DLSにより測定された場合、最大で100nm、最大で120nm、最大で150nm、最大で200nm、最大で250nm、最大で300nm、最大で500nmのサイズである、実施形態116に記載の方法。
119.ステップ(b)および(c)が、4nm〜15nm、5nm〜15nm、6nm〜15nm、または8nm〜15nmのリポタンパク質複合体が得られるまで繰り返される、実施形態90から116のいずれか1つに記載の方法。
120.ステップ(b)および(c)が、5nm〜12nm、6nm〜12nm、または8nm〜12nmのサイズのリポタンパク質複合体が得られるまで繰り返される、実施形態90から116のいずれか1つに記載の方法。
121.1、1を超える、または全てのステップが不活性ガス下で実行される、実施形態90から120のいずれか1つに記載の方法。
122.不活性ガスが窒素である、実施形態121に記載の方法。
123.前記タンパク質成分が脂質結合タンパク質を含むか、またはそれからなる、実施形態90から122のいずれか1つに記載の方法。
124.前記脂質結合タンパク質がApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoC−I、ApoC−II、ApoC−III、ApoEまたはその混合物である、実施形態123に記載の方法。
125.前記タンパク質成分が脂質結合ペプチドを含むか、またはそれからなる、実施形態90から122のいずれか1つに記載の方法。
126.前記脂質結合ペプチドがApoA−I、ApoA−II、ApoA−IV、ApoC−I、ApoC−II、ApoC−III、ApoEの類似体またはその混合物である、実施形態125に記載の方法。
127.前記脂質成分が天然脂質、合成脂質、またはその混合物を含むか、またはそれからなる、実施形態90から126のいずれか1つに記載の方法。
128.前記脂質成分が、エーテルリン脂質、短鎖リン脂質、コレステロール、コレステロール誘導体、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、ホスファチジルグリセロール、ガングリオシド、および/またはセレブロシドを含むか、またはそれからなる、実施形態127に記載の方法。
129.前記脂質成分が、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、1−ミリストイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−ミリストイルホスファチジルコリン、1−パルミトイル−2−ステアロイルホスファチジルコリン、1−ステアロイル−2−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール塩、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、(1,3)−D−マンノシル(1,3)ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、および/または3−コレステリル−6’−(グリコシルチオ)ヘキシルエーテル糖脂質を含むか、またはそれからなる、実施形態128に記載の方法。
130.前記脂質成分が中性脂質を含む、実施形態90から126のいずれか1つに記載の方法。
131.前記脂質成分が主に中性脂質である、実施形態130に記載の方法。
132.前記中性脂質がスフィンゴミエリンを含む、実施形態130または131に記載の方法。
133.前記中性脂質が主にスフィンゴミエリンである、実施形態132に記載の方法。
134.スフィンゴミエリンがD−エリスロース−スフィンゴミエリンおよび/またはD−エリスロースジヒドロスフィンゴミエリンを含むか、またはそれからなる、実施形態132または133に記載の方法。
135.前記出発懸濁液が負に荷電したリン脂質をさらに含む、実施形態130から135のいずれか1つに記載の方法。
136.前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含むか、またはそれからなる、実施形態135に記載の方法。
137.前記ホスファチジルグリセロールがC16:0アシル鎖を有する、実施形態136に記載の方法。
138.前記ホスファチジルグリセロールが、1,2−ジヘキサデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール)の塩を含むか、またはそれからなる、実施形態136または137に記載の方法。
139.前記塩がナトリウム塩である、実施形態138に記載の方法。
140.前記出発懸濁液中の脂質:タンパク質モル比が約2:1〜約200:1である、実施形態90から139のいずれか1つに記載の方法。
141.前記出発懸濁液中の脂質:タンパク質モル比が約10:1〜約125:1である、実施形態140に記載の方法。
142.前記出発懸濁液中の脂質:タンパク質モル比が約10:1〜約150:1である、実施形態140に記載の方法。
143.前記出発懸濁液中の脂質:タンパク質モル比が約75:1〜125:1である、実施形態140に記載の方法。
144.出発懸濁液が、2〜6(負に荷電した脂質):90〜120(中性脂質):1(脂質結合ペプチド、脂質結合タンパク質またはその混合物)の範囲のモル比で負に荷電した脂質、中性脂質および脂質結合ペプチドを含有する、実施形態90から143のいずれか1つに記載の方法。
145.前記第1の温度範囲が55℃〜60℃である、実施形態90から144のいずれか1つに記載の方法。
146.前記第2の温度範囲が35℃と40℃の間である、実施形態90から145のいずれか1つに記載の方法。
147.得られたリポタンパク質複合体を凍結乾燥するステップをさらに含む、実施形態90から146のいずれか1つに記載の方法。
148.凍結乾燥の前に等張剤を添加するステップをさらに含む、実施形態147に記載の方法。
149.リポタンパク質複合体の集団を含む医薬組成物であって、前記リポタンパク質複合体が、
(a)GPCまたはDLSにより測定された場合、4nm〜15nmのサイズまたは6nm〜15nmのサイズ、または5nmと12nmとの間のサイズ、または8nmと10nmとの間のサイズである;および
(b)ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピークにより反映されるように、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%均一である、
医薬組成物。
150.医薬組成物を作製する方法であって、
(a)実施形態90から146のいずれか1つに記載の方法に従ってリポタンパク質複合体の集団を調製するステップ;および
(b)リポタンパク質複合体の前記集団と、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを合わせるステップ
を含む、方法。
151.医薬組成物が不活性ガス下で調製される、実施形態150に記載の方法。
152.不活性ガスが窒素、ヘリウムまたはアルゴンである、実施形態151に記載の方法。
153.医薬組成物を凍結乾燥するステップをさらに含む、実施形態150から152のいずれか1つに記載の方法。
154.個々の単位用量中に医薬組成物をアリコートするステップをさらに含む、実施形態150から152のいずれか1つに記載の方法。
155.個々の単位用量を凍結乾燥するステップをさらに含む、実施形態154に記載の方法。
156.実施形態147に記載の方法に従う、または実施形態153もしくは155に記載の方法により作製されたリポタンパク質複合体の凍結乾燥調製物を再構成させるステップを含む、医薬組成物を作製する方法。
157.再構成されたリポタンパク質複合体と、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを合わせるステップをさらに含む、実施形態156に記載の方法。
158.個々の単位用量中に医薬組成物をアリコートするステップをさらに含む、実施形態156または157に記載の方法。
159.実施形態150または156に記載の方法により作製された液体医薬組成物。
160.実施形態153に記載の方法により作製された凍結乾燥された医薬組成物。
161.実施形態158に記載の方法により作製された液体単位剤形。
162.治療上有効量の実施形態149に記載の医薬組成物を含む液体単位剤形。
163.実施形態155に記載の方法により作製された乾燥単位剤形。
164.脂質異常障害を治療するための方法であって、治療上有効量の:
(a)実施形態1から22のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体;
(b)実施形態23から58のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体の集団;
(c)実施形態59、149、および159のいずれか1つに記載の医薬組成物;
(d)実施形態90から148のいずれか1つに記載の方法により作製された治療上有効量のリポタンパク質複合体;
(e)実施形態161または162に記載の単位剤形;
(f)健康なボランティアへの最大45mg/kgの単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(g)ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(h)1mg/kg〜20mg/kgの用量でのヒト対象への単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(i)それぞれ1mg/kg〜20mg/kgの用量での、ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(j)健康なボランティアへの最大20mg/kgの単回投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体;
(k)ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体;
(l)1mg/kg〜20mg/kgの用量でのヒト対象への単回投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体;または
(m)それぞれ1mg/kg〜20mg/kgの用量での、ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体
を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
165.前記投与を繰り返すステップをさらに含む、実施形態164に記載の方法。
166.投与が6日〜12日の間隔で繰り返される、実施形態165に記載の方法。
167.投与が毎週である、実施形態166に記載の方法。
168.投与が1カ月、5週間、6週間、2カ月、3カ月、6カ月、1年、2年、3年、またはそれ以上の期間にわたって行われる、実施形態165から167のいずれか1つに記載の方法。
169.投与が1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、または12回行われる、実施形態165から167のいずれか1つに記載の方法。
170.投与が静脈内である、実施形態164から169のいずれか1つに記載の方法。
171.投与が注入による、実施形態170に記載の方法。
172.注入が1〜4時間にわたって行われる、実施形態171に記載の方法。
173.注入が最大で24時間にわたって行われる、実施形態171に記載の方法。
174.リポタンパク質複合体の量が、1回の投与あたり約0.25mg/kgのApoA−I当量から約30mg/kgのApoA−I当量までの範囲である、実施形態170から173のいずれか1つに記載の方法。
175.リポタンパク質複合体の量が、1回の投与あたり約1mg/kgのApoA−I当量から約15mg/kgのApoA−I当量までの範囲である、実施形態174に記載の方法。
176.リポタンパク質複合体の量が、1回の投与あたり約2mg/kgのApoA−I当量から約12mg/kgのApoA−I当量までの範囲である、実施形態175に記載の方法。
177.リポタンパク質複合体の量が、1回の投与あたり約3mg/kgのApoA−I当量である、実施形態176に記載の方法。
178.リポタンパク質複合体の量が、1回の投与あたり約6mg/kgのApoA−I当量である、実施形態176に記載の方法。
179.リポタンパク質複合体の量が、1回の投与あたり約12mg/kgのApoA−I当量である、実施形態176に記載の方法。
180.脂質異常障害を治療するための方法であって、
(a)1mg/kg〜12mg/kgの初期用量で、
(i)実施形態1から22のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体;
(ii)実施形態23から58のいずれか1つに記載のリポタンパク質複合体の集団;
(iii)実施形態59、149、および159のいずれか1つに記載の医薬組成物;
(iv)実施形態90から148のいずれか1つに記載の方法により作製された治療上有効量のリポタンパク質複合体;
(v)実施形態161または162に記載の単位剤形;
(vi)健康なボランティアへの最大45mg/kgの単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(vii)ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(viii)1mg/kg〜20mg/kgの用量でのヒト対象への単回投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(ix)それぞれ1mg/kg〜20mg/kgの用量での、ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に肝臓酵素の上昇をもたらさないリポタンパク質複合体;
(x)健康なボランティアへの最大20mg/kgの単回投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体;
(xi)ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体;
(xii)1mg/kg〜20mg/kgの用量でのヒト対象への単回投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体;または
(xiii)それぞれ1mg/kg〜20mg/kgの用量での、ヒト対象への2、3、4、5または6回の投与後に2倍を超えるトリグリセリドの増加をもたらさないリポタンパク質複合体
を対象に投与するステップ;
(b)対象のトリグリセリド、VLDL−コレステロールおよび/またはVLDL−トリグリセリドが、前記投与の4、8、12、24、48、72、168、336または504時間後に2倍を超えて上昇するかどうかを決定するステップ;ならびに
(c)対象のトリグリセリド、VLDL−コレステロールおよび/またはVLDL−トリグリセリドが投与前のレベルの2倍を超えて上昇する場合、前記投与を繰り返すが、より低い用量で行い、対象のトリグリセリド、VLDL−コレステロールおよび/またはVLDL−トリグリセリドが投与前のレベルの2倍を超えて上昇しない場合、同等か、もしくはそれより高い用量で前記投与を繰り返すステップ
を含む、方法。
181.前記対象が高脂血症または心血管を有するか、またはそれに罹りやすい、実施形態165から180のいずれか1つに記載の方法。
182.患者が高脂血症を有するか、またはそれに罹りやすく、前記高脂血症が高コレステロール血症である、実施形態181に記載の方法。
183.患者が心血管疾患を有するか、またはそれに罹りやすく、心血管疾患がアテローム性動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、狭心症、間欠性跛行、重症虚血肢、心房弁硬化症または再狭窄である、実施形態181に記載の方法。
184.胆汁酸樹脂、ナイアシン、抗炎症剤、スタチン、フィブラート、CETP阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、PCSK9のアゴニストおよび/またはコレステロール吸収の阻害剤を補助的に投与するステップをさらに含む、実施形態165から183のいずれか1つに記載の方法。
185.アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチンまたはロバスタチンから選択されるスタチンを投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
186.フィブラートであるフェノフィブラートを投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
187.コレステロール吸収阻害剤であるゼチアを投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
188.アナセトラピブおよびダルセトラピブから選択されるCETP阻害剤を投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
189.PCSK9の抗体アゴニストまたはPCSK9のリガンドアゴニストを投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
190.コレステロール吸収阻害剤であるクロピドグレル二硫酸塩を投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
191.抗凝固剤であるワーファリンを投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
192.抗炎症剤であるアスピリンを投与するステップをさらに含む、実施形態181に記載の方法。
193.リポタンパク質複合体の1、2または3つの均一な集団を含む組成物。
194.少なくとも1つの均一な集団中のリポタンパク質複合体が、実施形態1から22のいずれか1つに記載の複合体の特徴を有する、実施形態193に記載の組成物。
195.前記集団の少なくとも1、2または3つが、実施形態23から58のいずれか1つに記載の集団の特徴を有する、実施形態193または194に記載の組成物。
Claims (64)
- それぞれ、脂質画分と、アポリポタンパク質A−I(「ApoA−I」)を含むアポリポタンパク質画分とを含むリポタンパク質複合体の集団であって、前記リポタンパク質複合体が、ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピークにより示されるように、少なくとも95%の均一性である、集団。
- 前記アポリポタンパク質画分がApoA−Iからなる、請求項1に記載の集団。
- 前記リポタンパク質複合体が、ゲル浸透クロマトグラフィーにおける単一のピークにより示されるように、少なくとも97%の均一性である、請求項1または2に記載の集団。
- 前記集団における前記ApoA−Iの少なくとも98重量%がトランケートされていないApoA−Iである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の集団。
- 前記リポタンパク質複合体の少なくとも95%が、ゲル浸透クロマトグラフィー(「GPC」)または動的光散乱(「DLS」)による測定で、4nm〜15nmのサイズ、6nm〜15nmのサイズ、4nm〜12nmのサイズ、6nm〜12nmのサイズまたは8nm〜12nmのサイズの粒子の形態にある、請求項1〜4のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団中のApoA−Iの少なくとも75重量%、少なくとも80重量%、少なくとも85重量%、少なくとも90重量%または少なくとも95重量%が成熟形態にある、請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団中のApoA−Iの25重量%以下、20重量%以下、15重量%以下、10重量%以下または5重量%以下が未熟形態にある、請求項1〜5のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団中の前記ApoA−I中のメチオニン112およびメチオニン148のそれぞれの10%以下、5%以下、3%以下、2%以下または1%以下が酸化されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団中のApoA−Iのアミノ酸の15%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下または1%以下が脱アミド化されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団が、ApoA−I 1ミリグラムあたり、1EU以下、0.5EU以下、0.3EU以下または0.1EU以下の内毒素を含有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団が、ApoA−I 1ミリグラムあたり、100ピコグラム以下、50ピコグラム以下、25ピコグラム以下、10ピコグラム以下または5ピコグラム以下の宿主細胞DNAを含有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団が、ApoA−I 1ミリグラムあたり、500ナノグラム以下、200ナノグラム以下、100ナノグラム以下、50ナノグラム以下、または20ナノグラム以下の宿主細胞タンパク質を含有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の集団。
- 前記集団が、200ppm以下、100ppm以下、50ppm以下の非水性溶媒を含有する、および/またはいかなる洗剤も含有しない、請求項1から12のいずれか一項に記載の集団。
- 前記複合体中の脂質画分中の脂質の15重量%以下または10重量%以下、5重量%以下または2重量%以下がコレステロールである、請求項1から13のいずれか一項に記載の集団。
- 前記ApoA−IがヒトApoA−Iタンパク質である、請求項1から14のいずれか一項に記載の集団。
- 前記ApoA−Iが組換えApoA−Iである、請求項1から15のいずれか一項に記載の集団。
- 前記ApoA−Iは、配列番号1のアミノ酸25〜267に対応するタンパク質に対して少なくとも95%の配列同一性を有している、請求項1〜16のいずれか一項に記載の集団。
- 前記脂質画分が中性の脂質を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の集団。
- 前記中性の脂質がスフィンゴミエリンからなる、請求項18に記載の集団。
- 前記脂質画分が負に荷電した脂質をさらに含む、請求項18または19に記載の集団。
- 前記負に荷電した脂質が1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)](DPPG)からなる、請求項20に記載の集団。
- 負に荷電した脂質を含み、前記負に荷電した脂質:中性の脂質:ApoA−Iのモル比が2〜6:90〜120:1である、前記請求項20または21に記載の集団。
- 前記脂質画分が、95〜99重量%の中性リン脂質と1〜5重量%の負に荷電したリン脂質を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の集団。
- 前記脂質画分が、96〜98重量%の中性リン脂質と2〜4重量%の負に荷電したリン脂質を含む、請求項23に記載の集団。
- 前記脂質画分が、97重量%の中性リン脂質と3重量%の負に荷電したリン脂質を含む、請求項24に記載の集団。
- 前記中性脂質が天然スフィンゴミエリンまたは合成スフィンゴミエリンである、請求項25に記載の集団。
- 前記脂質が、5meq O/kg未満、4meq O/kg未満、3meq O/kg未満、または2meq O/kg未満の過酸化物価を有する、請求項26に記載の集団。
- 前記スフィンゴミエリンが卵スフィンゴミエリンである、請求項26または27に記載の集団。
- 前記負に荷電したリン脂質がホスファチジルグリセロールを含む、請求項25から28のいずれか一項に記載の集団。
- 前記負に荷電したリン脂質が1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)](DPPG)の塩を含むか、またはそれからなる、請求項29に記載の集団。
- 1:2から1:3の範囲のアポリポタンパク質画分:リン脂質画分重量比を有する、請求項1から30のいずれか一項に記載の集団。
- 請求項1から31のいずれか一項に記載の集団を含む組成物。
- 前記組成物中の前記リポタンパク質の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも97%が複合体化形態にある、請求項32に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記リポ蛋白質の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%が複合体化形態にある、請求項31または32に記載の組成物。
- 請求項1から32のいずれか一項に記載のリポタンパク質複合体の集団、または、請求項32〜34のいずれか一項に記載の組成物と、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および/または賦形剤とを含むか、またはそれからなる医薬組成物。
- 治療上有効量の請求項35に記載の医薬組成物を含む単位剤形。
- リポタンパク質複合体を調製する方法であって、
(a)脂質成分とタンパク質成分とを含む出発懸濁液を、第1の温度範囲の温度から第2の温度範囲の温度まで冷却するステップであって、
(i)前記脂質成分が均一化された脂質の粒子を含み、
(ii)前記タンパク質成分が脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質を含み、
(iii)前記出発懸濁液が、前記脂質成分と前記タンパク質成分を合わせるステップを含む方法の生成物であり、および
(iv)前記第1の温度範囲は前記第1の温度範囲が、前記タンパク質成分の転移温度の、下は10℃以上および上は15℃以下の温度を含み、前記第2の温度範囲が、前記脂質成分の転移温度の、下は5℃以上または10℃以上および上は5℃以下の温度を含む、ステップ;
(b)前記冷却された(a)の懸濁液を、前記第2の温度範囲の温度から前記第1の温度範囲の温度まで加熱するステップ;
(c)前記加熱された(b)の懸濁液を、前記第1の温度範囲の温度から前記第2の温度範囲の温度まで冷却するステップ;ならびに
(d)ステップ(b)と(c)を前記タンパク質成分の少なくとも80%がリポタンパク質に組み込まれるまで繰り返しリポタンパク質を形成するステップ
を含む、方法。 - 前記タンパク質成分が、前記出発懸濁液の脂質の総重量に対し10%以下の脂質をさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 前記ステップ(b)および(c)において、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記タンパク質成分がリポタンパク質に組み込まれるまで繰り返される、請求項37または38に記載の方法。
- 前記ステップ(b)および(c)において、少なくとも3回繰り返される、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b)および(c)において、ゲル濾過クロマトグラフィーによる測定で、直径が4nm〜15nmのリポタンパク質が得られるまで繰り返される、請求項37〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b)および(c)において、ゲル浸透クロマトグラフィーの単一ピークにより示される、前記リポタンパク質の少なくとも85%、90%、または95%が均質になるまで繰り返される、請求項37〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(b)および(c)において、ゲル浸透クロマトグラフィーの単一ピークにより示される、前記リポタンパク質の少なくとも97%が均質になるまで繰り返される、請求項42に記載の方法。
- 前記タンパク質成分は、均一化されていない脂質結合タンパク質及び/又は脂質結合ペプチドを含む、請求項37〜43のいずれか1つに記載の方法。
- 前記タンパク質成分が脂質結合タンパク質を含む、請求項37〜44のいずれか1つに記載の方法。
- 前記タンパク質成分がアポリポタンパク質A−I(ApoA−I)を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記脂質成分が中性の脂質を含む、請求項37〜46のいずれか1つに記載の方法。
- 前記中性の脂質がスフィンゴミエリンからなる、請求項47に記載の方法。
- 前記出発懸濁液がさらに負に荷電した脂質を含む、請求項47または29に記載の方法。
- 前記負に荷電したリン脂質が1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−(1−グリセロール)]からなる、請求項49に記載の方法。
- 前記負に荷電した脂質:中性の脂質:前記出発懸濁液中の脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質のモル比が2〜6:90〜120:1であり、脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質の前記モル比は、ApoA−I当量である、請求項49または50に記載の方法。
- 前記負に荷電した脂質が脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質と予め複合体化されている、請求項49〜51のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記脂質結合ペプチドおよび/または脂質結合タンパク質と前記負に荷電した脂質とを合わせる工程を含む方法により前記タンパク質成分を形成するステップを含む、請求項52に記載の方法。
- 前記出発懸濁液中の前記脂質:タンパク質のモル比が2:1から200:1であるか、前記リポタンパク質:リン脂質の総量の重量比が1:2.7である、請求項37〜53のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)の前に、前記出発懸濁液を前記脂質成分と前記タンパク質成分を合わせる工程を含む方法により形成するステップをさらに含む、請求項37〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂質成分と前記タンパク質成分の溶液がそれぞれ前記第1の範囲の温度であらかじめ加熱される、請求項55に記載の方法。
- 前記出発懸濁液を形成するステップの前に高圧均一化を用いて前記脂質粒子を形成するステップを更に含む、請求項55または56に記載の方法。
- 前記得られたリポタンパク質複合体を凍結乾燥するステップを更に含む、請求項37〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記出発懸濁液が洗剤を含まない、請求項37〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脂質成分が、高圧均一化を含む方法によって形成された脂質粒子からなる、請求項37〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高圧均質化がマイクロフルイダイゼーションを含む、請求項60に記載の方法。
- 医薬組成物を作製する方法であって、
(a)請求項37〜61のいずれか一項に記載の方法に従ってリポタンパク質複合体の集団を調製するステップ;および
(b)リポタンパク質複合体の前記集団と、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを合わせるステップ
を含む方法。 - 脂質異常障害治療剤の製造のための請求項1から31のいずれか一項に記載のリポタンパク質複合体の集団の使用。
- 脂質異常障害治療剤の製造のための請求項32から34のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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