JP6177783B2 - 分子量が少なくとも200の少なくとも1つの化合物の直接的な検出および/または定量方法 - Google Patents
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Description
リン含有化学複合分子の分析定量は、主にその物理化学的性質のため非常に困難である。これらの分子は高帯電分子であり、リン酸塩またはホスホン酸塩等の複合官能基が存在するため、pHによって異なるイオン化度を示す。この問題点は複数のリン含有基を持つ分子に特に関係する。
本発明は、化学複合分子の定量のための直接液体クロマトグラフィー法に関し、本発明の範囲において、少なくとも2つのリン含有基を有し、少なくとも分子量が200である分子が該分子として理解される。これらの複合分子は、数種のイオン化可能基の存在のため高極性かつ高帯電である。さらに、多くの場合、これらの分子はUV可視スペクトル領域の吸収帯が欠如しているため、標準的な技術では不可視である。
i)上記検出および/または定量される化学複合分子の少なくとも1つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ii)極性溶媒または少なくとも1つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも1つの溶媒はpHが7〜14になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
iii)非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも1つのクロマトカラムに、上記系の圧力を5〜1500気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
iv)質量検出器または放射能検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および/または該信号の強度を定量するステップと、
v)上記検出および/または定量される化学複合分子を含む生体マトリックスから上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
vi)上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ(v)で調製した上記試料を用いて上記ステップ(ii)および(iii)を繰り返すステップと、
vii)上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および/または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および/または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む直接検出および/または定量の方法を提供する。
i)上記検出および/または定量される化学複合分子の少なくとも1つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ii)極性溶媒または少なくとも1つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも1つの溶媒はpHが7〜14になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
iii)非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも1つのクロマトカラムに、上記系の圧力を5〜1500気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
iv)上記化学複合分子の溶離(eluation)を検出可能な検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および/または該信号の強度を定量するステップと、
v)上記検出および/または定量される化学複合分子を含むAPI、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品から上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記API、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品を全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
vi)上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、上記ステップ(v)で調製した上記試料を用いて上記ステップ(ii)および(iii)を繰り返すステップと、
vii)上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および/または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および/または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む分析方法を提供する。
本発明の様々な実施形態を以下に記載する。
i)上記検出および/または定量される少なくとも2つのリン基を含むイノシトールポリリン酸の少なくとも1つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ii)アミン水溶液からなる溶媒系であり、上記溶媒はpHが8〜13になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
iii)粒子の大きさが1.5〜15ミクロン、細孔の大きさが60〜500オングストロームである逆相固定相である少なくとも1つのカラムに、上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
iv)質量検出器を用いて、上記イノシトールポリリン酸の溶出時の信号の保持時間を同定し、および/または該信号の強度を定量するステップと、
v)上記検出および/または定量されるイノシトールポリリン酸を含む生体マトリックスから上記イノシトールポリリン酸の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
vi)上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、ステップ(v)で調製した上記試料を用いてステップ(ii)および(iii)を繰り返すステップと、
vii)上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および/または信号の強度を比較することによって、上記イノシトールポリリン酸の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む直接検出および/または定量の方法を提供する。
i)上記検出および/または定量される化学複合分子の少なくとも1つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ii)極性溶媒または少なくとも1つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも1つの溶媒はpHが7〜14になるよう緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
iii)非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも1つのカラムに、上記系の圧力を5〜1500気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
iv)質量検出器または放射能検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および/または該信号の強度を定量するステップと、
v)上記検出および/または定量される化学複合分子を含む生体マトリックスから上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記生体マトリックスを全体的または部分的に溶解し、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理することを少なくとも含むステップと、
vi)上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、ステップ(v)で調製した上記試料を用いてステップ(ii)および(iii)を繰り返すステップと、
vii)上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および/または信号の強度を比較し、または先行研究または先行文献から取得した信号の保持時間、および/または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む直接検出および/または定量の方法。
i)上記検出および/または定量される化学複合分子の少なくとも1つの標準試料を、好ましくは既知濃度で、または既知濃度から、調製するステップと、
ii)極性溶媒または少なくとも1つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、好ましくは上記溶媒系を生成する少なくとも1つの溶媒はpHが緩衝化されている溶媒系の流れに上記標準試料を導入するステップと、
iii)非極性の固定相であることが好ましい固定相の微粒子で実質的に充填された少なくとも1つのカラムに、上記系の圧力を5〜1500気圧に維持しながら上記試料および上記溶媒系を通過させるステップと、
iv)上記化学複合分子の溶離を検出可能な検出器を用いて、上記化学複合分子の溶出時の信号の保持時間を同定し、および/または該信号の強度を定量するステップと、
v)上記検出および/または定量される化学複合分子を含むAPI、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品から上記化学複合分子の試料を調製するステップであって、溶液またはスラリーを生成するために上記API、医薬組成物、または機能性食品を全体的または部分的に溶解するステップと、必要であれば懸濁液中の粒子を除去するために上記溶液または上記スラリーを処理するステップを少なくとも含むステップと、
vi)上記標準試料と同時にまたは上記標準試料に続いて、ステップ(v)で調製した上記試料を用いてステップ(ii)および(iii)を繰り返すステップと、
vii)上記標準試料または複数の上記標準試料の、信号の保持時間、および/または信号の強度を比較することによって、上記化学複合分子の存在の検出および定量を行うステップと、
を少なくとも含む分析方法。
図1、実施例1のグラジエント溶離逆相クロマトグラフィー後のラットの血漿中のIP6について得られたUPLC(登録商標)−MSクロマトグラム。
血漿試料にキレート剤(EDTA)存在下でTCAを用いたタンパク質沈殿による化合物の精製および抽出を行った。その後、酢酸トリエチルアミン(TEAA)で浮遊物を希釈し、UPLC(登録商標)−MSシステムに20μL注入した。
実施例1で実施した生体分析処理を、線形性、真度、および精度のすべてを評価したイヌの血漿試料で再実証した。既知量のIP6を加えたブランク血漿試料を20μl注入して検量線を作成した。中濃度で10%未満の真度、15%未満の精度が得られ、結果的に優れた生体分析方法となった。
実施例1で実施した生体分析処理を、トリクロロ酢酸(TCA)、マトリックス、およびキレート剤の量を倍にしてヒトの血漿試料に適用した。最適なクロマトグラフィー条件下の分析物の保持時間は4.05分であった。
生体分析処理は、キレート剤(EDTA)の存在下でラットの尿を希釈することで化合物を抽出することを含み、沈殿剤は必要としなかった。酢酸トリエチルアミン(TEAA)で浮遊物を希釈し、HPLC−MSシステムに50μL注入した。
活性医薬成分の配合組成物(溶液)中でIP6を同定および定量した。この実施例では、関連不純物を同時に定量しなかった。溶液媒体は、水、0.9%のNaClまたは媒介物として他の水溶液からなっていた。
実施例1に記載された方法を肝細胞培養細胞に適応させることに成功した。既知量のIP6を有するいくつかの培養細胞をHPLC−MSに注入するこの試験は、この種のマトリックスに対する信頼性のある方法を示した。
実施例1で実施した生体分析処理をブタの血漿試料に適用した。既知量のIP6を加えたブランク血漿試料を50μl注入して検量線を作成した。15%未満の真度および精度が得られ、結果的に優れた生体分析方法となった。
活性医薬成分の配合組成物(溶液)中でIP6を同定および定量した。この実施例では、関連不純物を同時に定量し、それによってAPIのクロマトグラフからの純度の計算が可能となった。
実施例1で実施した生体分析処理を、SIMモードで検出した質量をATPの分子量(M−1)に代えてラットの血漿試料に適用した。既知量のATPを加えたブランク血漿試料を50μl注入して検量線を作成した。ATPの保持時間は3.96分であった。図4はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
実施例1で実施した生体分析処理を、SIMモードで検出した質量をIP3の分子量(M−1)に代えてラットの血漿試料に適用した。既知量のIP3を加えたブランク血漿試料を50μl注入して検量線を作成した。IP3の保持時間は2.62分であった。図5はこれらの試料から得られた典型的なクロマトグラムを示している。
実施例1で実施し、実施例1〜10で用いた生体分析処理をUPLC(登録商標)−MS/MSシステムのMRMモードに転用した。MRMモードを用いることによって、結果的に分析感度の上昇に加えて選択性も向上した。
実施例11で実施した生体分析処理を、代替マトリックスに適用した。特定の状況(例えば、分析物の構造的なレベルがブランクマトリックスにおいて求められる場合)で、検量線を作成し、生体試料のIP6を定量するために代替マトリックスが利用可能であった。
フィチン酸の定量のために実施したクロマトグラフ法によって、フィチン酸溶液中に存在するいくつかの不純物を定量することが可能となった。検出された全ての不純物(IP3、IP4、IP5、およびm/z 779)がフィチン酸のピークで溶離したが、これらの不純物はその分子量の違いによって検出された。最も多い不純物はIP5であった。
ラットの肝細胞中のフィチン酸の培養後に、フィチン酸およびその代謝産物が検出された。純化ステップでは、EDTAを用いた沈殿後にKHB溶媒を用いた沈殿物の希釈と、最終的にはTEAAを用いた希釈とを行った。IP1およびIP2のみがフィチン酸と比較して保持時間に大きな違いを生じて溶離した。
実施例1で実施した生体分析処理を、イヌおよびラットの血漿中のIP5の定量に適用した。
フィチン酸の定量のために実施した生体分析処理を、代謝産物の最大量を検出するためにラットの血漿試料に適用した。
フィチン酸の分析のために実施した生体分析処理を、代謝産物の最大量を検出するためにイヌの血漿試料に適用した。上記代謝産物は、最初にSCANモードで検出され、その後SIMモードで確認および半定量された。基準を作るために対応する代謝産物を得る(つまり合成する)ことで定量測定を行うことができる。
フィチン酸および関連不純物を水溶液中の配合組成物中で同定および定量した。この方法によってフィチン酸の分析計算およびクロマトグラフィー純度の計算が可能になる。
Claims (14)
- 生体試料中の、分子量が少なくとも200ダルトンの少なくとも1つの化合物の直接検出および/または定量の方法であって、上記直接検出および/または定量される少なくとも1つの化合物は
(a)ビスホスホネートまたはポリリン酸;
(b)ヘキサメタリン酸塩;
(c)少なくとも2つのR基で置換されているC3−C7シクロアルキルの化合物、ここで、それぞれのR基は、−OH、−OP(O)(OH) 2 または−P(O)(OH) 2 であり、少なくとも2つのR基は、独立して−P(O)(OH) 2 および−OP(O)(OH) 2 からなる群から選択され、当該C3−C7シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、またはシクロヘプチルである;
(d)(a)〜(c)のイオンまたは塩;ならびに
(e)(a)〜(d)の組み合わせ、
から選択されるリン含有化合物であり、上記直接検出および/または定量される少なくとも1つの化合物は生体マトリックスから得られる生体試料中にあり、上記生体マトリックスは、生体液、生体組織、胃の内容物、腸の内容物、便試料、培養細胞、または、それらの組み合わせであり、上記直接検出および/または定量のための上記方法は、
i)上記直接検出および/または定量される化合物の少なくとも1つの標準試料を調製するステップと、
ii)上記直接検出および/または定量される少なくとも1つの化合物を含む生体試料を調整するステップと、
iii)極性溶媒または少なくとも1つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系であり、溶媒系の流れに上記生体試料と同時にまたは上記生体試料に続いて、少なくとも1つの上記標準試料を導入し、固定相中の微粒子で実質的に充填された、樹脂の微粒子を含む、少なくとも1つのクロマトグラフィーカラムに、上記系の圧力を該クロマトグラフィーカラム中で5〜1500気圧に維持しながら複数の上記試料を通過させるステップと、
iv)上記クロマトグラフィーカラムからの試料の溶出時に、少なくとも1つの上記化合物が、質量分析検出器、電気伝導検出器、光度検出器、放射能検出器、または、NMR検出器を用いて直接検出および/または定量される少なくとも1つの化合物の信号の保持時間を同定し、および/または該信号の強度を定量するステップと、
を含むことを特徴とする直接検出および/または定量の方法。 - 置換されている上記C3−C7シクロアルキルの分子は、2〜6のリン酸基を含む群から選択されるイノシトールポリリン酸であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記生体液は、血液、血漿、血清、尿、唾液、リンパ液、脳脊髄液およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 上記生体組織は、肺、腎臓、心臓、脳、肝臓、血管、骨、皮膚、筋肉、神経組織、脈管組織、およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 分析される上記生体マトリックスは、生物学的等価性試験下に置かれたヒトの単離した試料であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 上記方法は、代謝プロファイル中の化合物の任意の代謝産物を直接検出および/または定量するために用いられる方法であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 活性医薬成分(API)、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品の分析の方法であって、上記活性医薬成分(API)、上記メディカルフード、上記医薬組成物、または上記機能性食品は分子量が少なくとも200ダルトンの少なくとも1つの化合物を含み、上記少なくとも1つの化合物は
(a)ビスホスホネートまたはポリリン酸;
(b)ヘキサメタリン酸塩;
(c)少なくとも2つのR基で置換されているC3−C7シクロアルキルの化合物、ここで、それぞれのR基は、−OH、−OP(O)(OH) 2 または−P(O)(OH) 2 であり、少なくとも2つのR基は、独立して−P(O)(OH) 2 および−OP(O)(OH) 2 からなる群から選択され、当該C3−C7シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、またはシクロヘプチルである;
(d)(a)〜(c)のイオンまたは塩;ならびに
(e)(a)〜(d)の組み合わせ、
から選択されるリン含有化合物であり、上記少なくとも1つの化合物はその関連不純物とともに定量することも可能であり、上記分析の方法は、
i)上記化合物の少なくとも1つの標準試料を、調製するステップと、
ii)少なくとも1つの上記化合物を含む、上記活性医薬成分(API)、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品を含む試料を調製するステップと、
iii)極性溶媒または少なくとも1つの極性溶媒を含む溶媒混合物である溶媒系である溶媒系の流れに上記活性医薬成分(API)、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品を含む上記試料と同時にまたは上記試料に続いて、少なくとも1つの上記標準試料を導入し、固定相中の微粒子で実質的に充填された、樹脂の微粒子を含む少なくとも1つのクロマトグラフィーカラムに、上記系の圧力を該クロマトグラフィーカラム中で5〜1500気圧に維持しながら複数の上記試料を通過させるステップと、
iv)上記クロマトグラフィーカラムから溶出される上記試料の溶出時に、少なくとも1つの上記化合物が、質量分析検出器、電気伝導検出器、光度検出器、放射能検出器、または、NMR検出器を用いて直接検出および/または定量される少なくとも1つの化合物の信号の保持時間を同定し、および/または該信号の強度を定量するステップと、
を含む少なくとも1つの上記化合物の直接検出および/または定量を含む方法であることを特徴とする分析の方法。 - 上記方法は、不純物プロファイル中の上記少なくとも1つの化合物の任意の不純物を直接検出/または定量するために用いられる方法であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 分子量が少なくとも200ダルトンの少なくとも1つの化合物を含む薬、メディカルフード、試薬、食品添加物、医薬組成物、または機能性食品用組成物の製造方法であって、上記少なくとも1つの化合物は
(a)ビスホスホネートまたはポリリン酸;
(b)ヘキサメタリン酸塩;
(c)少なくとも2つのR基で置換されているC3−C7シクロアルキルの化合物、ここで、それぞれのR基は、−OH、−OP(O)(OH) 2 または−P(O)(OH) 2 であり、少なくとも2つのR基は、独立して−P(O)(OH) 2 および−OP(O)(OH) 2 からなる群から選択され、当該C3−C7シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、またはシクロヘプチルである;
(d)(a)〜(c)のイオンまたは塩;ならびに
(e)(a)〜(d)の組み合わせ、
から選択されるリン含有化合物であり、上記薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品は予め決められた割合の少なくとも1つの化合物を有している必要があり、プロセスは、
(i)1回分の上記薬、メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品を取得すること、
(ii)請求項8に記載の方法を含むプロセスによって少なくとも1つの上記1回分の上記化合物の純度の割合を測定すること、
(iii)上述のように測定した少なくとも1つの化合物の割合が、条件または規定内の場合のみ1回分の上記薬、上記メディカルフード、医薬組成物、または機能性食品を含有すること、を含むことを特徴とする製造方法。 - 分子量が少なくとも200ダルトンの少なくとも1つの化合物を含む1回分の医薬組成物の製造方法であって、少なくとも1つの上記化合物は
(a)ビスホスホネートまたはポリリン酸;
(b)ヘキサメタリン酸塩;
(c)少なくとも2つのR基で置換されているC3−C7シクロアルキルの化合物、ここで、それぞれのR基は、−OH、−OP(O)(OH) 2 または−P(O)(OH) 2 であり、少なくとも2つのR基は、独立して−P(O)(OH) 2 および−OP(O)(OH) 2 からなる群から選択され、当該C3−C7シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、またはシクロヘプチルである;
(d)(a)〜(c)のイオンまたは塩;ならびに
(e)(a)〜(d)の組み合わせ、
から選択されるリン含有化合物であり、上記製造方法は、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法によって、生体試料を分析することを含み、該試料は、最初の1回分の医薬組成物を投与された被験者から採取され、算出したAUCおよびCmaxが望ましい条件内にある、および/または参照薬と生物学的等価性があることを特徴とする製造方法。 - 上記置換されているC3−C7シクロアルキルの化合物は、フィチン酸塩であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法または請求項9または10に記載の製造方法。
- 上記質量分析検出器は、タンデム質量分析計、三連四重極型分析計、または、シングル四重極型分析計であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法、または、請求項9または10に記載の製造方法。
- 上記質量分析検出器は、選択イオンモニタリング(SIM)モード、多重反応モニタリング(MRM)モード、選択反応モニタリング(SRM)モード、SCAN(ポジティブ/ネガティブ)モード、または、それらの組み合わせであることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法、または、請求項9または10に記載の製造方法。
- 上記標準試料は、参照標準、外部標準、内部標準、または標準添加であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法、または、請求項9または10に記載の製造方法。
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