ES2714402T3

ES2714402T3 - Método para la detección y/o cuantificación directa de al menos un compuesto con un peso molecular de como mínimo 200

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Publication number: ES2714402T3
Application number: ES12769441T
Authority: ES
Inventors: Berstard Joan Perello; De Zuani Ciriaco Maraschiello; Iréne Lentheric; De Las Heras Paula Mendoza; Espinosa Fernando Tur; Tur Eva Tur; Alarcon Máximo Encabo; Becerra Eva Martin; Amengual María De Mar Benito; Amengual Bernat Isern
Original assignee: Laboratoris Sanifit SL
Current assignee: Laboratoris Sanifit SL
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2032-10-08
Also published as: EP3499232A1; US11162958B2; EP2764360B1; WO2013050603A1; US20170254823A1; EP2579036A1; DK3499232T3; US9612250B2; PT2764360T; US20220187326A1; DK2764360T3; EP3499232B1; EP2764360A1; JP2014533353A; US20150212101A1; ES2972156T3; PT3499232T; JP6177783B2

Abstract

Método para la detección y cuantificación directa de al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, en donde el compuesto es una molécula químicamente compleja, en donde dicha molécula químicamente compleja es un inositol polifosfato seleccionado del grupo que contiene de 2 a 6 grupos fosfato, incluidos iones o sales de los mismos, en donde el compuesto o compuestos están dentro de una matriz biológica, en donde dicha matriz biológica es un fluido seleccionado de la lista que consiste en sangre, plasma, suero, orina, saliva, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo y mezclas de los mismos, en donde el método comprende al menos las siguientes etapas: i) preparar al menos una muestra estándar de la molécula químicamente compleja para ser detectada y cuantificada; ii) introducción de la muestra estándar en la corriente de un sistema disolvente; en donde el sistema disolvente consiste en una solución acuosa de una amina; en donde el pH del disolvente ha sido ajustado, entre 8 y 13; iii) pasar la muestra y el sistema disolvente a través de al menos una columna en la que la columna es una fase estacionaria de fase inversa, siendo el tamaño de partícula entre 1,5-15 micrones y el tamaño de poro entre 60- 500 Angstroms, mientras mantiene la presión del sistema entre 5 y 1500 atm; iv) identificar el tiempo de retención y cuantificar la intensidad de la señal de cuándo la molécula químicamente compleja se eluye, mediante un detector de masas; v) preparar una muestra de la molécula químicamente compleja a partir de una matriz biológica que comprende la molécula químicamente compleja para ser detectar y cuantificar, en donde el proceso para preparar la muestra comprende al menos disolver total o parcialmente la matriz biológica para formar una solución o una suspensión y, si es necesario, tratar la solución o la suspensión para eliminar partículas en suspensión; vi) repetir los pasos (ii) y (iii) con la muestra preparada en el paso (v); juntos o secuencialmente con el estándar; y vii) detectar y cuantificar la presencia de la molécula químicamente compleja por comparación del tiempo de retención e intensidad de la señal de la muestra estándar o las muestras estándar, o por comparación del tiempo de retención e intensidad de la señal obtenida de estudios previos o de la literatura, donde el detector capaz de detectar la elución de la molécula químicamente compleja es un espectrómetro de masas; un espectrómetro de masas en tándem o un cuadrupolo único; trabajando bajo cualquiera de los siguientes modos de operación: supervisión de iones seleccionados (SIM); supervisión de reacción múltiple (MRM); supervisión de la reacción seleccionada (SRM) y SCAN (negativo / positivo); o una combinación de ellos.

Description

DESCRIPCION

Metodo para la deteccion y/o cuantificacion directa de al menos un compuesto con un peso molecular de como mfnimo 200

La presente invencion hace referencia a un metodo directo de cromatograffa de lfquidos para la cuantificacion de moleculas qufmicamente complejas, donde la molecula qufmicamente compleja es un inositol polifosfato, seleccionado del grupo que contiene entre 2 y 6 grupos fosfato, incluyendo iones o sales de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA TECNICA

La determinacion analftica de la presencia de moleculas qufmicamente complejas que contengan fosforo esta plagada de importantes dificultades, principalmente debido a sus propiedades fisicoqufmicas. Estas moleculas cuentan con una carga elevada y, a causa de la presencia de grupos funcionales complejos, como fosfatos o fosfonatos, muestran un grado de ionizacion distinto en funcion del pH. Esta cuestion es especialmente relevante para moleculas con mas de un grupo que contenga fosforo.

Asimismo, la ausencia de bandas de absorcion en la region del espectro UV-visible en la mayorfa de estas moleculas qufmicamente complejas dificulta su cuantificacion mediante metodos espectrofotometricos directos. Ademas, la determinacion de la presencia de moleculas qufmicamente complejas en una matriz biologica implica dificultades adicionales a causa del efecto matriz, de modo que se deben desarrollar y validar nuevos metodos bioanalfticos para su uso rutinario.

La baja concentracion del analito en comparacion con la de otros componentes de la matriz puede eliminar la respuesta del analito. Estos efectos pueden provocar diferencias en la respuesta entre la muestra de la matriz y los estandares, lo que se traduce en dificultades para el analisis cuantitativo y la identificacion de compuestos (Biol Pharm Bull 25, 547-557; 2002).

Por ejemplo, los bifosfonatos presentan dos grupos fosfonicos por molecula, lo que confiere un caracter fuertemente ionico y una mayor polaridad. Ademas, la mayorfa de los miembros de esta familia no cuenta con cromoforos, lo que impide una conveniente deteccion directa por UV(J Pharm Biomed Anal 48, 483-496; 2008). Se han desarrollado otros metodos bioanalfticos para la determinacion de la presencia de bifosfonatos, que incorporan un paso de derivacion para su determinacion o fragmentacion, por lo que no se trata de metodos directos, entendiendo por metodo directo como la determinacion de la presencia de la molecula per se o de un aducto de dicha molecula, hecho que proporciona un metodo mas sensible, especffico, exacto y robusto, pero sobre todo un metodo mas aplicable, rapido y fiable para la realizacion de analisis rutinario (J Chromatogr B 877, 3159-3168; 2009, Int J Mass Spectrom 295, 85-93; 2010, J Mass Spectrom 37, 197-208; 2002).

Otro ejemplo de molecula qufmicamente compleja que contiene fosforo son los pirofosfatos. Los pirofosfatos se diferencian de los bifosfonatos en el atomo de carbono que enlaza los dos atomos de fosforo (el atomo de carbono de los bifosfonatos (P-C-P) se sustituye por uno de oxfgeno (P-O-P).

Los nucleotidos son otro ejemplo de moleculas qufmicamente complejas, con una carga elevada y de naturaleza polar (a causa de la presencia de uno o varios grupos fosfato), por lo que la presente invencion es especialmente relevante para los que presentan mas de un grupo fosfato.

La determinacion selectiva de la presencia de inositoles polifosfato (entre 2 y 6 grupos fosfato), junto con otras impurezas relacionadas, y especialmente en matrices biologicas, es uno de los principales avances en materia analftica que se consigue con la presente invencion. En el caso mas extremo, el inositol hexafosfato, tambien denominado InsP6 o IP6, presenta 12 protones disociables, con unos valores de pKa que oscilan entre valores negativos y valores superiores a 10 (Carbohydr Res 46, 159-171; 1976).

En la bibliograffa existente se han descrito numerosos metodos analfticos para la cuantificacion de InsP6. Sin embargo, la mayorfa de ellos se han desarrollado para la determinacion de su presencia en matrices simples (por ejemplo, los procedentes de metodos para extractos alimentarios o preparados farmaceuticos), en los que las concentraciones de InsP6 son superiores a las esperadas en matrices biologicas.

En el caso de matrices complejas (por lo general, las de origen biologico), los metodos citados con anterioridad no cuentan con la sensibilidad y especificidad suficientes para la determinacion de la presencia de InsP6 cuando las concentraciones que se deben cuantificar son bajas, como sucede con el plasma, la orina, y otros fluidos, tejidos o celulas biologicos.

Asf pues, se necesita un metodo muy sensible y selectivo para la cuantificacion de inositol polifosfatos en este tipo de matrices, puesto que sus propiedades fisicoqufmicas especiales hacen que la mayorfa de los metodos actuales no sean utiles para este fin.

Ademas, aunque algunos de los metodos actuales permiten detectar inositol polifosfatos, no cuentan con la reproducibilidad y solidez suficiente para poderlos utilizar en estudios clfnicos, en los que se deben realizar analisis sistematicos de muestras.

En la patente WO/2009/109647 se presenta la determinacion de la cantidad de inositol fosfato (IP1 o InsPI, solo un grupo fosfato) en una muestra (orina, plasma) mediante una prueba LC-ESI/MS/MS. En la patente US20100136600 se presenta la determinacion de la presencia de mioinositol en una muestra (orina, plasma) mediante el uso de tecnicas LC-MS/HPLC-MS. Sin embargo, ninguno de estos metodos presenta un metodo de determinacion de la presencia de IP6, y la tecnica de determinacion descrita en estas patentes puede no tener la eficacia/idoneidad necesarias para la determinacion de la presencia de IP2-IP6, porque se trata de moleculas con una carga elevada en comparacion con el inositol (sin grupos fosfato ni carga) o IP1 (solo un grupo fosfato, carga limitada).

Previamente, se han desarrollado metodos indirectos para la determinacion de la presencia de InsP6 e InsP3 en plasma mediante analisis de deteccion de masa-cromatograffa de gases de fracciones cromatograficas de HPLC, que implica la hidrolisis del IP6 y, ademas, la determinacion de la presencia de inositol o fosfato, por lo que se trata de un metodo que consume mucho tiempo (tres dfas por muestra) y ofrece unos resultados con una exactitud reducida (Life Sci 71, 1535-1546; 2002).

Tambien se ha descrito la HPLC-MS directa para su cuantificacion en extractos vegetales y celulas cultivadas in vitro (Mass Spectrom 23, 705-712; 2009). Sin embargo, las condiciones de la HPLC descritas, basadas en el uso de una columna de intercambio ionica, hacen que este metodo no se pueda aplicar a todas las demas matrices biologicas con baja concentracion de analito.

La HPLC/MS con ionizacion por nebulizacion termica permite determinar la presencia de inositoles fosfato, pero en el propio documento se especifica la falta de sensibilidad como limitacion para su uso en aplicaciones biologicas (Biomed Environ Mass Spectrom 19, 597-600; 1990).

Se han descrito otros metodos indirectos para la determinacion de la presencia de IP6 en orina humana que se basan en la medicion del fosforo total de extractos purificados de acido fftico. En este caso, se requiere un pretratamiento especffico de la muestra para evitar interferencias de otros compuestos que contengan fosforo que se encuentren junto con el acido fftico en la muestra de orina, como fosfato o pirofosfato (Anal Chem 75, 6374-6378; 2003, Anal Chim Acta 510, 41-43; 2004). Uno de los inconvenientes de estos metodos es que, a causa de sus problemas de sensibilidad y selectividad, su aplicacion se limita a muestras de orina, y no se pueden aplicar a muestras de tejido o sangre ni a la cuantificacion de impurezas relacionadas. Ademas, la determinacion indirecta de la presencia de IP6 mediante el fosforo total es una extrapolacion que arroja valores elevados de forma sistematica, puesto que todo el fosforo cuantificado se identifica como IP6.

Se ha descrito otro metodo indirecto para la determinacion de la presencia de fitato en orina humana. Este metodo se basa en la hidrolisis del fitato y la determinacion de la presencia de mioinositol, uno de los productos de la hidrolisis (Chromatographia 60, 265 -268; 2004). Se trata de un metodo que consume mucho tiempo (dos dfas por muestra) porque se debe realizar una hidrolisis acida. Asimismo, la sensibilidad limitada y la falta de especificidad de la hidrolisis hacen que este metodo no sea aplicable a otras matrices biologicas ni a la cuantificacion conjunta de las impurezas relacionadas.

A continuacion, se citan otros documentos considerados antecedentes del estado de la tecnica para la determinacion de la presencia de IP6 en muestras biologicas (principalmente en orina):

En 2001, March y cols. describieron un metodo unico para cuantificar inositol fosfatos en sangre, pero este metodo tambien es aplicable a orina y tejidos (J Chromatogr B 757, 247-255; 2001). Se trata de un metodo indirecto que consume mucho tiempo (tres dfas por muestra) basado en la hidrolisis enzimatica del IP6 y la determinacion de la presencia de la molecula de inositol (hidrolizado) mediante cromatograffa de gases y espectrometrfa de masas. Es un metodo sensible, aunque indirecto, basado en diversos principios de la presente invencion, que en cualquier caso presenta una especificidad limitada, puesto que todos los inositol fosfatos se hidrolizan de forma inespecffica y todo el hidrolizado se cuantifica como IP6.

La fluorescencia ha sido un recurso ampliamente utilizado para la cuantificacion del IP6, aunque su reducida sensibilidad solo permite aplicar esta tecnica a alimentos y orina como muestras biologicas (Anal Chim Acta 605, 185-191; 2007).

Son metodos totalmente diferentes de la invencion que se describe en el presente documento que, en cualquier caso, no permiten determinar las impurezas relacionadas y no son aplicables a otras matrices biologicas que no sean orina.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion hace referencia a un metodo directo de cromatograffa de lfquidos para la cuantificacion de moleculas qufmicamente complejas, entendiendo, en el ambito de la presente invencion, que dichas moleculas tienen como mfnimo dos grupos que contienen fosforo y un peso molecular de al menos 200. Estas moleculas complejas son altamente polares y presentan una carga elevada a causa de la presencia de diversos grupos ionizables. Ademas, en muchos casos, la ausencia de bandas de absorcion en la region del espectro UV-visible hace que estas moleculas sean invisibles para las tecnicas clasicas.

La identificacion y cuantificacion del compuesto diana se realiza mediante deteccion directa. En el ambito de la presente invencion, por deteccion directa se entiende la identificacion/cuantificacion del analito mediante una propiedad del compuesto (o sus iones o sales) "tal cual" o bien una propiedad del compuesto que forma un aducto (por ejemplo, pero no limitado, asociados ionicos, entre otros), metabolitos, preferiblemente metabolitos en fase II, de compuestos parentales, incluidos los fragmentos del analito principal en la deteccion de masa. Esta propiedad medida a traves de deteccion directa puede ser, pero sin ser limitante, la deteccion de masa, conductividad, radiactividad (y, por tanto, el analito se puede radiomarcar), RMN, siendo preferiblemente la deteccion de masa . Los inventores de la presente invencion han descubierto que, cuando la masa de la molecula qufmicamente compleja es inferior a 200, la selectividad se ve comprometida a estos niveles a causa de la interferencia de diversos compuestos de las fases moviles y la atmosfera.

Ademas, la sensibilidad del metodo de la presente invencion puede estar en el intervalo de 1 pmol, un valor que se encuentra en el intervalo alto de los metodos actualmente disponibles. Ademas, la combinacion de la sensibilidad con la especificidad/selectividad del metodo de la presente invencion permite aplicarlo a cualquier tipo de matriz biologica, asf como cuantificar el analito principal junto con las impurezas relacionadas en el caso de aplicaciones de control de calidad de ingredientes activos farmaceuticos, alimentos medicinales, reactivos, aditivos alimentarios, compuestos farmaceuticos o nutraceuticos.

En la presente invencion, "matriz biologica" se refiere a un entorno que puede o no ser aislado de un animal de sangre caliente. Algunos ejemplos no limitantes de matrices biologicas son: fluidos, tejidos, contenido estomacal, contenido intestinal, muestras de heces, cultivos celulares, orina, heces, sangre, suero, plasma, saliva, sudoracion, fluidos hfsticos, citoplasma celular, hepatocitos, microsomas, fracciones S9, tejidos, como tejido muscular, tejido hepatico, tejido cardfaco, tejido renal y de otros entornos corporales, y/o matrices de un animal de sangre caliente, preferentemente un humano. Una matriz biologica se puede presentar en forma de solucion o de solido, o bien una forma que sea una mezcla de las mismas, y puede estar presente en un organismo vivo o ser parte de el, o se puede aislar de un organismo vivo de tal modo que constituya una muestra de dicho organismo. Los metodos que se describen en el presente documento proporcionan unos resultados excelentes, incluso cuando se trabaja con una matriz biologica que contiene niveles muy bajos de la molecula qufmicamente compleja, siendo preferiblemente aquellas concentraciones inferiores a 0,001 □mol/mg (para matrices solidas) o □ m oO (para matrices en otros estados ffsicos), mas preferiblemente aquellas inferiores a 0,000001 □mol/mg o □molO, y aun mas preferibles las comprendidas en el rango de 0,0000001 □mol/mg o □gO. La matriz biologica puede ser un fluido biologico que, sin ser limitante, puede ser sangre, plasma, suero, orina, saliva, lfquido linfatico, lfquido cefalorraqufdeo y combinaciones de las mismas, preferiblemente sangre o plasma. La matriz biologica tambien puede ser un tejido biologico que, puede ser sin limitarse, tejido pulmonar, hepatico, renal, cardiaco, de vasos sangufneos, cerebral, oseo, dermico, muscular, nervioso, vascular, y combinaciones de los mismos, preferiblemente tejido cardiaco.

El metodo descrito en el presente documento, tambien es un metodo fiable para matrices biologicas de diversas especies, como por ejemplo y sin limitarse a, ratas, ratones, perros, monos, humanos, cerdos, cerdos enanos, conejos y cobayas.

Segun un aspecto de la presente invencion, se describe un metodo para la deteccion o cuantificacion directa de al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, donde el compuesto detectado o cuantificado es una molecula qufmicamente compleja, donde dicha molecula qufmicamente compleja es un inositol polifosfato seleccionado del grupo que contiene de 2 a 6 grupos fosfato, incluyendo iones o sales de los mismos, en donde el compuesto o los compuestos estan dentro de una matriz biologica, en donde dicha matriz biologica es un fluido biologico seleccionado de la lista que consiste en sangre, plasma, suero, orina, saliva, lfquido linfatico, lfquido cefalorraqufdeo y mezclas de los mismos, en donde el metodo para la deteccion y cuantificacion directa comprende al menos las siguientes etapas:

i) preparacion de, al menos una muestra estandar de la molecula qufmicamente compleja para serdetectada y cuantificada, ii) introduccion de la muestra estandar en el flujo de un sistema disolvente, donde el sistema de disolvente consiste en una solucion acuosa de una amina donde el pH del disolvente ha sido regulado entre 8 y 13, iii) paso de la muestra y del sistema disolvente a traves de al menos una columna donde la columna es una fase estacionaria de fase reversa siendo el tamano de partfcula entre 1,5-15 micrones y el tamano del poro entre 60-500 Angstroms, al mismo tiempo que se mantiene la presion del sistema entre 5 y 1500 atm.

iv) identificacion del tiempo de retencion o cuantificacion de la intensidad de la senal del momento en el que la molecula qufmicamente compleja se eluye mediante un detector de masa,

v) preparacion de una muestra de la molecula qufmicamente compleja a partir de una matriz biologica que comprende la molecula qufmicamente compleja objeto de deteccion y cuantificacion, donde el proceso para preparar la muestra comprende al menos la disolucion total o parcial de la matriz biologica para formar una solucion o suspension y, si resulta necesario, el tratamiento de la solucion o suspension para eliminar las partfculas que haya en suspension,

vi) repeticion de los pasos (ii) y (iii) con la muestra preparada en el paso (v), junto con el estandar o bien secuencialmente, y

vii) deteccion y cuantificacion de la presencia de la molecula qufmicamente compleja mediante la comparacion del tiempo de retencion y intensidad de la senal de la muestra o muestras estandar, o bien mediante la comparacion del tiempo de retencion y intensidad de la senal obtenida de estudios anteriores o de la bibliograffa existente, donde el detector capaz de detectar la elucion de la molecula qufmicamente compleja es un espectrometro de masas; un espectrometro de masas en tandem o un cuadrupolo unico; trabajando bajo cualquiera de los siguientes modos de operacion: supervision de iones seleccionados (SIM); supervision de reaccion multiple (MRM); supervision de la reaccion seleccionada (SRM) y SCAN (negativo / positivo); o una combinacion de ellos.

Otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para el analisis de un ingrediente activo farmaceutico (API), alimento medicinal, reactivo, aditivo alimentario, compuesto farmaceutico o nutraceutico donde el API, alimento medicinal, reactivo, aditivo alimentario, compuesto farmaceutico o nutraceutico incluye al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, donde dicho compuesto es una molecula qufmicamente compleja, donde dicha molecula qufmicamente compleja se sustituye con al menos dos grupos -R, preferentemente un cicloalquilo C3-C7, donde dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, dondecada grupo R corresponde independientemente a -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que se seleccionen independientemente al menos dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluidos sus iones y sales, donde este compuesto tambien se puede cuantificar junto con sus impurezas relacionadas, donde el metodo para el analisis comprende como mfnimo las siguientes etapas:

i) preparacion de al menos una muestra estandar, preferiblemente con una concentracion conocida, o a partir de una concentracion conocida, de la molecula qufmicamente compleja objeto de deteccion o cuantificacion,

ii) introduccion de la muestra estandar en el flujo de un sistema disolvente, donde el sistema disolvente es un disolvente polar o una mezcla de disolventes que comprende al menos un disolvente polar, donde el pH de al menos uno de los disolventes que componen el sistema disolvente preferiblemente se ha regulado entre 7 y 14, iii) paso de la muestra y del sistema disolvente por al menos una columna cromatografica donde la columna basicamente esta llena de pequenas partfculas de una fase estacionaria, preferiblemente una fase estacionaria no polar, al mismo tiempo que se mantiene la presion del sistema entre 5 y 1500 atm,

iv) identificacion del tiempo de retencion y/o cuantificacion de la intensidad de la senal del momento en el que la molecula qufmicamente compleja se eluye mediante un detector capaz de detectar la elucion de la molecula qufmicamente compleja,

v) preparacion de un muestra de la molecula qufmicamente compleja a partir de un API, un alimento medicinal, un reactivo, un aditivo alimentario, un compuesto farmaceutico o un nutraceutico que comprende la molecula qufmicamente compleja objeto de deteccion y/o cuantificacion, donde el proceso de preparar la muestra comprende al menos la disolucion total o parcial del API, alimento medicinal, reactivo, aditivo alimentario, compuesto farmaceutico o nutraceutico para formar una solucion o suspension y, si resulta necesario, el tratamiento de la solucion o suspension para eliminar las partfculas que haya en suspension,

vi) repeticion de los pasos (ii) y (iii) con la muestra preparada en el paso (v), junto con el estandar o bien secuencialmente,

vii) deteccion y/o cuantificacion de la presencia de la molecula qufmicamente compleja mediante la comparacion del tiempo de retencion y/o intensidad de la senal de la muestra o muestras estandar, o bien mediante la comparacion del tiempo de retencion y/o intensidad de la senal obtenida de estudios anteriores o de la bibliograffa existente.

Otro aspecto de la presente invencion, se refiere a un metodo para la preparacion de un farmaco, un alimento medicinal, un compuesto farmaceutico o compuesto farmaceutico nutraceutico, que comprende al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, donde dicho compuesto es una molecula qufmicamente compleja, donde dicha molecula qufmicamente compleja se sustituye con al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, donde dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, en el que cada grupo R corresponde independientemente a -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que se seleccionen independientemente al menos dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluidos sus iones y sales del mismo, donde el farmaco, alimento medicinal, compuesto farmaceutico o compuesto farmaceutico nutraceutico debe tener un porcentaje predeterminado de la molecula qufmicamente compleja, donde el proceso comprende: la obtencion de un lote de un farmaco, un alimento medicinal, un compuesto farmaceutico o compuesto farmaceutico nutraceutico; la medicion del porcentaje de pureza de la molecula qufmicamente compleja del lote mediante un proceso que comprende el metodo deacuerdo con el segundo aspecto; e incluye al lote el farmaco, alimento medicinal, compuesto farmaceutico o compuesto farmaceutico nutraceutico unicamente si su porcentaje de la molecula qufmicamente compleja medido cumple los requisitos o especificaciones predefinidas, siendo el resultado de la prueba normal, aplicada a contenido seco, superior al 60%, preferiblemente superior al 70%, y aun mas preferible superior al 80%.

Otro aspecto de la presente invencion, proporciona un proceso para la produccion de un compuesto farmaceutico que comprende al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, donde dicho compuesto es una molecula qufmicamente compleja, donde dicha molecula qufmicamente compleja se sustituye por al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, donde dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, donde cada grupo R corresponde independientemente a -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que se seleccionen independientemente al menos dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluidos iones y sales de los mismos, donde el proceso comprende esencialmente las mismas etapas de un proceso para la produccion de un primer lote, siempre que despues del analisis, mediante cualquier metodo del primer aspecto, de una muestra biologica aislada, preferiblemente una muestra de sangre o suero recogida de sujetos a los que se administraron los compuestos farmaceuticos obtenidos del primer lote, los valores calculados de AUC y Cmax cumplen los requisitos que se desean o son bioequivalentes a un farmaco, alimento medicinal, compuesto farmaceutico o sustancia nutraceutica de referencia. "AUC" se refiere al area bajo la curva que representa la concentracion de un compuesto, o de uno de sus metabolitos, en un fluido biologico de un paciente, como por ejemplo plasma o sangre, en funcion del tiempo tras la administracion del compuesto al paciente. Por su parte, “Cmax” es la concentracion maxima de un farmaco en el plasma o la sangre de un paciente tras la administracion de una dosis del farmaco o forma de farmaco al paciente.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

A continuacion, se describen diversas realizaciones de la presente invencion.

La molecula qufmicamente compleja puede ser un bifosfonato, hexametafosfato o un cicloalquilo C3-C7, donde dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, con la condicion de que se seleccionen independientemente por lo menos dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2. El termino "cicloalquilo C3-C7" hace referencia a un grupo alquilo cfclico saturado que cuenta con entre tres y siete atomos de carbono e incluye ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. La molecula qufmicamente compleja preferiblemente es un cicloalquilo C6. Asimismo, la molecula qufmicamente compleja tambien puede ser un derivado de cicloalquilo. Se han logrado unos resultados excelentes cuando la molecula qufmicamente compleja es un inositol polifosfato. La molecula qufmicamente compleja puede estar radiomarcada.

La muestra estandar preparada en el paso (ii) puede ser un estandar de referencia, un estandar externo, un estandar interno o bien una adicion de estandar, siendo esta ultima un estandar preparado por el metodo de adicion de estandar, que tambien se describe mas adelante.

El termino "estandar de referencia", como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un compuesto que se puede utilizar para analisis tanto cuantitativos como cualitativos de un analito, que puede ser, sin limitar, un ingrediente activo farmaceutico. Por ejemplo, el tiempo de retencion del compuesto en la cromatograffa de lfquidos (LC), que puede ser HPLC o UPLC, permite la fijacion de un tiempo de retencion relativo, lo que posibilita la realizacion de analisis cualitativos. La concentracion del compuesto en la solucion antes de la inyeccion en una columna de LC permite la comparacion de las areas situadas bajo los picos de un cromatograma de LC, lo que posibilita la realizacion de analisis cuantitativos.

El termino estandar externo, como se utiliza en el presente documento, hace referencia a una molecula qufmicamente compleja cuya concentracion se conoce. Si se utiliza para determinar una concentracion, preferiblemente se pueden anadir a la muestra de prueba estandares externos a una concentracion conocida, tecnica que se conoce como adicion de estandar.

El termino "estandar interno", como se utiliza en el presente documento, hace referencia a la sustancia que se anade a la muestra y que, posteriormente, se detecta y cuantifica en la muestra. La adicion del estandar interno puede producirse antes, durante o despues de la recogida o procesado de la muestra. El estandar interno, tal y como se concibe para la presente invencion, es un compuesto que se anade a la muestra, y este compuesto similar se cuantifica con los metodos descritos en el presente documento.

El sistema disolvente comprende preferiblemente un disolvente organico polar. En la presente invencion son de especial interes los sistemas disolventes que comprenden un disolvente organico polar hidromiscible. Los sistemas disolventes preferibles incluyen acetonitrilo, metanol o mezclas de los mismos. Mas preferible, el sistema disolvente incluye acetonitrilo.

Ademas, el sistema disolvente puede incluir agua. Uno de los sistemas disolventes mas preferibles comprende, preferiblemente consiste esencialmente en, agua y acetonitrilo.

El sistema disolvente puede ser isocratico o gradiente. En una realizacion preferida, durante el paso (iii) la composicion del sistema disolvente, esto es, el gradiente, se incrementa gradualmente, es decir, la fuerza de la fase movil aumenta gradualmente. Preferiblemente, el sistema empieza con un elevado contenido de agua en el momento en el que la muestra y el sistema disolvente inician el paso por la columna y, entonces, el contenido de agua se reduce gradualmente durante la elucion de la molecula qufmicamente compleja.

Opcionalmente, durante el paso (iii) la composicion del sistema disolvente y, por consiguiente, la fuerza de la fase movil, se mantienen esencialmente sin cambios.

En una realizacion particular, durante el paso (iii) el sistema disolvente comprende al menos un disolvente, en el que el pH de dicho disolvente se ha ajustado de 7 a 14, preferiblemente el pH del citado disolvente se ha ajustado de 8 a 13 y, de aun mas preferiblemente, de 8,5 a 12.

Las personas expertas en la materia disponen de diversas tecnicas para ajustar el pH. El pH se puede modificar con una sustancia capaz de alterar el pH, por lo general, un acido, una base o una sal con propiedades acidas o basicas, entre otras sustancias. Existen multiples sustancias capaces de modificar el pH, como por ejemplo una amina, una base inorganica, una sal de un acido organico o cualquier mezcla de estas sustancias. Sin embargo, se prefiere el uso de una amina y, en particular, de trietilamina. La base inorganica puede ser un hidroxido, preferiblemente KOH. Se puede utilizar como sal de un acido organico, como, por ejemplo, acetato.

En una realizacion particular de la presente invencion, antes de inyectar la muestra ya preparada en el equipo correspondiente, se realiza un control de pH adicional. Preferiblemente, el pH se ajusta al mismo valor de pH que la fase movil. Se puede ajustar con un acido, una base o una sal, preferiblemente una base amina y, aun mas preferible dicha amina es trietilamina.

El termino "columna cromatografica", como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un tubo lleno de partfculas adsorbentes que se utiliza para realizar la cromatograffa. Para la presente invencion son especialmente interesantes las columnas en las que las pequenas partfculas de una fase estacionaria no polar presentan una base de sflice, preferiblemente una base de gel de sflice. Se obtienen buenos resultados cuando las pequenas partfculas constituyen una fase estacionaria no polar, preferentemente con un base de gel de sflice y enlazadas de forma covalente a un grupo alquilo de cadena. El grupo alquilo de cadena puede ser un alquilo C²-C²⁰, preferiblemente un alquilo C⁸-C¹⁸.

Las pequenas partfculas de una fase estacionaria no polar pueden presentar un tamano medio de partfcula de entre 0,5 y 20 micras, preferiblemente de entre 1,5 y 15 micras y, aun mas preferible, de entre 5 y 10 micras.

El tamano del poro puede oscilar entre 10 y 1000 Angstroms, preferiblemente entre 60 y 500 Angstroms y, aun mas preferible entre 100 y 300 Angstroms.

La reproducibilidad del sistema aumenta y se consiguen otras ventajas cuando la temperatura de la columna durante el paso (iii) se mantiene esencialmente sin cambios. Por lo general, la temperatura de la columna durante el paso (iii) se mantiene esencialmente sin cambios en un intervalo que oscila entre 10 y 70°C. Preferiblemente, se mantiene esencialmente sin cambios en un intervalo que oscila entre 45 y 55°C y, aun mas preferible, se mantiene esencialmente sin cambios a unos 50°C.

El termino "detector" hace referencia a cualquier dispositivo, equipo, maquina, componente o sistema que puede detectar la molecula qufmicamente compleja. Los detectores pueden incluir o no hardware y software. En un detector de masa (espectrometro de masas), el detector habitual incluye un analizador de masa y/o conectado a un analizador de este tipo. Algunos ejemplos de detectores capaces de detectar la elucion de la molecula qufmicamente compleja son un espectrometro de masas, un espectrometro de masas en tandem (o triple cuadrupolo) o un cuadrupolo unico.

Estos detectores de masa pueden operar en distintos modos de funcionamiento, entre otros, supervision de iones seleccionados (SIM), supervision de reacciones multiples (MRM), supervision de reacciones seleccionadas (SRM) y SCAN (negativo/positivo), o varios de ellos. Tambien se puede utilizar un detector de radiactividad. Para el segundo aspecto de la presente invencion, tambien se puede utilizar una conductimetrfa o un detector de RMN.

El uso de un detector de masa normalmente implica un paso adicional, a saber, un paso previo de cambio de fase e ionizacion de la molecula qufmicamente compleja entre la elucion y la deteccion. El cambio de fase e ionizacion puede ser, sin limitar, una ionizacion qufmica (APCI), una fotoionizacion a presion atmosferica (APPI) o una ionizacion por nebulizacion electrica (ESI) o nebulizacion termica. La ionizacion por nebulizacion electrica (ESI) se puede realizar en una atmosfera de N²a una temperatura de entre 250 y 1000°C, preferiblemente entre 300 y 800°C y, aun mas preferible, de entre 400 y 600°C.

Para el tratamiento previo de la muestra biologica, en el paso (v) puede ser necesario el uso de un agente precipitante de protefnas, preferiblemente acido tricloroacetico para el tratamiento previo de la muestra. Este tratamiento adicional permite simplificar la matriz biologica, de modo que aumenta la selectividad y la sensibilidad al reducir los efectos de matriz. El paso (v) tambien puede comprender el uso de un quelante para el tratamiento previo de la muestra, como por ejemplo EDTA. Estos quelantes reducen la concentracion de calcio libre en la muestra biologica, de modo que se evita la formacion de compuestos labiles junto con el analito, lo que reducirfa la recuperacion y pondrfa en peligro la exactitud del metodo.

La matriz biologica tambien puede estar preconcentrada, incrementando asf la sensibilidad del metodo.

Una realizacion de la presente invencion es un metodo para la deteccion o cuantificacion directa de al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, donde el compuesto es una molecula qufmicamente compleja, donde dicha molecula qufmicamente compleja es un inositol polifosfato seleccionado del grupo que contiene de 2 a 6 grupos fosfatos, incluidos iones y sales de los mismos, donde el compuesto o compuestos estan en una matriz biologica, donde dicha matriz biologica es un fluido biologico, seleccionado de la lista que consiste en: sangre, plasma, suero, orina, saliva, lfquido linfatico, lfquido cefalorraqufdeo y combinaciones de los mismos, en el que el metodo comprende al menos una de las siguientes etapas:

i) preparacion de al menos una muestra estandar de la molecula qufmicamente compleja para ser detectada y cuantificada;

ii) introduccion de la muestra estandar en el flujo de un sistema disolvente, donde el sistema disolvente consiste en una solucion acuosa de una amina, donde el pH del disolvente se ha ajustado a un valor de entre 8 y 13;

iii) paso de la muestra y el sistema disolvente a traves de al menos una columna donde la columna es una fase estacionaria de fase inversa, siendo el tamano de partfcula entre 1,5 y 15 micras, y un tamano de poro de entre 60 y 500 Angstroms, mientras se mantiene la presion del sistema entre 5 y 1500 atm;

iv) identificacion del tiempo de retencion y cuantificacion de la intensidad de la senal del momento en el que la molecula qufmicamente compleja se eluye mediante un detector de masa;

v) preparacion de un muestra de la molecula qufmicamente compleja a partir de una matriz biologica que comprende la molecula qufmicamente compleja objeto de deteccion o cuantificacion, donde el proceso de preparar la muestra comprende al menos la disolucion total o parcial de la matriz biologica para formar una solucion o suspension y, si resulta necesario, el tratamiento de la solucion o suspension para eliminar las partfculas que haya en suspension; vi) repeticion de los pasos (ii) y (iii) con la muestra preparada en el paso (v), junto con el estandar o bien secuencialmente; y

vii) deteccion y cuantificacion de la presencia de la molecula qufmicamente compleja mediante la comparacion del tiempo de retencion y la intensidad de la senal de estudios previos o de la literatura,

donde el detector capaz de detectar la elucion de la molecula qufmicamente compleja es un espectrometro de masas; un espectrometro de masas en tandem o un cuadrupolo unico; trabajando bajo cualquiera de los siguientes modos de operacion: supervision de iones seleccionados (SIM); supervision de reaccion multiple (MRM); supervision de la reaccion seleccionada (SRM) y SCAN (negativo / positivo); o una combinacion de ellos.

En una realizacion particular de la presente invencion, el metodo comprende ademas un paso previo de fase cambio e ionizacion de la molecula qufmicamente compleja entre la elucion y la deteccion y en donde la fase de cambio y la ionizacion son la ionizacion qufmica (APCI), la fotoionizacion de la presion atmosferica (APPI), la ionizacion por electrospray (ESI) o termospray.

En una realizacion particular de la presente invencion, la matriz biologicamente a analizar es una muestra aislada de un ser humano que esta bajo un estudio de bioequivalencia.

En una realizacion particular de la presente invencion, el metodo se usa para detectar y cuantificar cualquiera de los metabolitos de un compuesto en un perfil metabolico.

Durante el tratamiento previo de la muestra, se puede incluir un paso para la separacion de solidos y lfquidos, normalmente mediante centrifugado o filtrado, para eliminar cualquier partfcula solida que pueda haber aparecido durante el proceso. En este paso, es preferible controlar la temperatura en un valor entre 2 y 8°C durante el tratamiento previo de la muestra y, mas preferiblemente a unos 4°C.

El metodo que se describe en el presente documento resulta de utilidad para el analisis de moleculas qufmicamente complejas. Un uso particular de los metodos que se describen en el presente documento es el analisis de matrices biologicas de seres humanos cuando el ser humano es objeto de un estudio de bioequivalencia. Otro uso particular de los metodos descritos en el presente documento es la determinacion simultanea de las impurezas relacionadas de la molecula qufmicamente compleja, especialmente de IP6.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "perfil metabolico" comprende la identificacion, semicuantificacion y / o cuantificacion de uno o mas metabolitos derivados de un compuesto parental, en una matriz biologica, que consisten principalmente en fosforilacion-desfosforilaciones metabolicas.

El termino "perfil de impurezas" comprende la identificacion, semicuantificacion y / o cuantificacion de una o mas impurezas derivadas de un compuesto parental, principalmente impurezas relacionadas con la desfosforilacion, en una formulacion de un API, un alimento medico, un reactivo, un aditivo alimentario, una composicion farmaceutica o nutraceutica.

En las siguientes clausulas se describen otros aspectos y otras formas de realizacion de la presente invencion: Clausula 1.- Metodo para la deteccion y/o cuantificacion directa de al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, en el que el compuesto objeto de deteccion o cuantificacion es una molecula qufmicamente compleja, donde dicha molecula qufmicamente compleja se sustituye por al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, donde dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, en el que cada grupo R corresponde independientemente a -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que al menos se seleccionen independientemente dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluidos sus iones y sales, donde el compuesto o compuestos objeto de deteccion y/o cuantificacion forman parte de una matriz biologica, donde dicha matriz biologica es un fluido biologico, un tejido biologico, contenido estomacal, contenido intestinal, una muestra de heces o un cultivo celular, y en el que el metodo para la deteccion y/o cuantificacion directa conlleva como mfnimo los pasos siguientes:

i) preparacion de al menos una muestra estandar, preferiblemente con una concentracion conocida, o a partir de una concentracion conocida, de la molecula qufmicamente compleja objeto de deteccion y/o cuantificacion;

ii) introduccion de la muestra estandar en el flujo de un sistema disolvente, donde el sistema disolvente es un disolvente polar o una mezcla de disolventes que comprende al menos un disolvente polar, en el que, preferiblemente, el pH de al menos uno de los disolventes que componen el sistema disolvente se ha ajustado a un valor de entre 7 y l4;

iii) paso de la muestra y del sistema disolvente al menos por una columna, donde la columna basicamente esta llena de pequenas partfculas de una fase estacionaria, preferiblemente una fase estacionaria no polar, al mismo tiempo que se mantiene la presion del sistema entre 5 y 1500 atm;

iv) identificacion del tiempo de retencion y/o cuantificacion de la intensidad de la senal del momento en el que la molecula qufmicamente compleja se eluye mediante un detector de masa o radiactividad;

v) preparacion de una muestra de la molecula qufmicamente compleja a partir de una matriz biologica que comprende la molecula qufmicamente compleja objeto de deteccion y/o cuantificacion, donde el proceso de preparar la muestra comprende al menos la disolucion total o parcial de la matriz biologica para formar una solucion o suspension y, si resulta necesario, el tratamiento de la solucion o suspension para eliminar las partfculas que haya en suspension;

vi) repeticion de los pasos (ii) y (iii) con la muestra preparada en el paso (v), junto con el estandar o bien secuencialmente;

vii) deteccion y/o cuantificacion de la presencia de la molecula qufmicamente compleja mediante la comparacion del tiempo de retencion y/o intensidad de la senal de la muestra o muestras estandar, o bien mediante la comparacion del tiempo de retencion y/o intensidad de la senal obtenida de estudios anteriores o de la bibliograffa existente. Clausula 2.- El metodo acuerdo con la clausula anterior, donde la molecula qufmicamente compleja es un bifosfonato, hexametafosfato, nucleotido o cicloalquilo C3-C7, en el que dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R.

Clausula 3.- El metodo acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que la molecula qufmicamente compleja es un inositol polifosfato, seleccionado del grupo que contiene entre 2 y 6 grupos de fosfato.

Clausula 4.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que la muestra estandar preparada en el paso (ii) es un estandar de referencia, estandar externo, estandar interno o adicion de estandar. Clausula 5.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el sistema disolvente comprende un disolvente organico polar hidromiscible.

Clausula 6.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que durante el paso (iii) la composicion del sistema disolvente se incrementa gradualmente, es decir, la fuerza de la fase movil aumenta gradualmente.

Clausula 7.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas de la 1 a la 5, en el que durante el paso (iii) la composicion del sistema disolvente, es decir, la fuerza de la fase movil, se mantiene esencialmente sin cambios. Clausula 8.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el sistema disolvente incluye agua, y el pH del agua se ha ajustado a un valor de entre 7 y 14, preferiblemente de 8 a 13 y, mas preferiblemente de 8,5 a 12, con una sustancia capaz de modificar el pH, donde la sustancia capaz de modificar el pH es preferentemente una amina, una base inorganica, una sal de un acido organico, o cualquier combinacion de estas sustancias, mas preferiblemente una amina y/o NH³, una sal de un acido organico o un hidroxido y, aun mas preferible, trietilamina y/o NH³.

Clausula 9.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, que ademas comprende al menos un paso adicional de control del pH, preferiblemente durante el tratamiento previo de la muestra antes de la inyeccion en el equipo.

Clausula 10.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que las partfculas pequenas de una fase estacionaria no polar presentan una base de gel de sflice y estan enlazadas de forma covalente a un grupo alquilo de cadena, donde el grupo alquilo de cadena es preferiblemente un alquilo C²-C²⁰y, de forma todavfa mas preferible, un alquilo C⁸-C¹⁸.

Clausula 11.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el detector capaz de detectar la elucion de la molecula qufmicamente compleja es un espectrometro de masas, un espectrometro de masas en tandem (o triple cuadrupolo) o un cuadrupolo unico, que opera en cualquiera de los modos de funcionamiento siguientes: supervision de iones seleccionados (SIM), supervision de reacciones multiples (MRM), supervision de reacciones seleccionadas (SRM) y SCAN (negativo/positivo), o una combinacion de ellos.

Clausula 12.- El metodo de acuerdo con la clausula anterior, que ademas comprende un paso previo de cambio de fase e ionizacion de la molecula qufmicamente compleja entre la elucion y la deteccion.

Clausula 13.- El metodo de acuerdo con la clausula anterior, en el que el cambio de fase y la ionizacion corresponden a ionizacion qufmica (APCI), fotoionizacion a presion atmosferica (APPI), ionizacion por nebulizacion electrica (ESI) o nebulizacion termica.

Clausula 14.- El metodo de acuerdo con la clausula anterior, en el que la ionizacion por nebulizacion electrica (ESI) se realiza en una atmosfera de N²a una temperatura de entre 250 y 1000°C, preferiblemente de entre 300 y 800°C y, aun mas preferible entre 400 y 600°C.

Clausula 15.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el paso (v) tambien comprende el uso de un agente precipitante de protefnas, preferiblemente acido tricloroacetico para el tratamiento previo de la muestra.

Clausula 16.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el paso (v) tambien comprende el uso de un quelante para el tratamiento previo de la muestra, preferiblemente EDTA o sus sales, o cualquier mezcla de las mismas.

Clausula 17.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que la matriz biologica esta preconcentrada.

Clausula 18.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores que, ademas, incluye una etapa para la separacion de solidos y lfquidos durante el tratamiento previo de la muestra.

Clausula 19.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que la matriz biologica es un fluido biologico, preferiblemente seleccionado de la lista que consiste en: sangre, plasma, suero, orina, saliva, lfquido linfatico, lfquido cefalorraqufdeo y mezclas de las mismas, preferiblemente sangre o plasma.

Clausula 20.- El metodo de acuerdo con las clausulas de la 1 a la 18, en el que la matriz biologica es un tejido biologico, preferiblemente se selecciona de la lista que consiste en: tejido pulmonar, renal, cardiaco, cerebral, hepatico, de vasos sangufneos, oseo, dermico, muscular, nervioso, vascular, y mezclas de dichos tejidos, preferiblemente tejido cardiaco.

Clausula 21.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que la matriz biologica que se va a analizar es una muestra aislada de un ser humano objeto de un estudio de bioequivalencia.

Clausula 23.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, donde se usa una matriz sustituta para preparar la curva de calibracion, preferiblemente la matriz utilizada, esta formada por albumina de suero bovino.

Clausula 24.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, cuando se utiliza para detectar y cuantificar cualquiera de los metabolitos de un compuesto en un perfil metabolico.

Clausula 25.- El metodo de acuerdo con cualquiera de las clausulas anteriores, en el que el compuesto esta radiomarcado.

Clausula 26.- Metodo para el analisis de un ingrediente activo farmaceutico, alimento medicinal, reactivo, aditivo alimentario, compuesto farmaceutico o nutraceutica, donde el ingrediente activo farmaceutico, alimento medicinal, compuesto farmaceutico o nutraceutico comprende al menos un compuesto con un peso molecular de como mfnimo 200, donde dicho compuesto es una molecula qufmicamente compleja, donde dicha molecula qufmicamente compleja se sustituye por al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, en el que dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, en el que cada grupo R corresponde independientemente a -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que se seleccionen independientemente al menos dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluidos sus iones y sales de las mismas, este compuesto tambien se puede cuantificar junto a sus impurezas relacionadas y donde el metodo para el analisis comprende al menos una de las siguientes etapas:

ii) introduccion de la muestra estandar en el flujo de un sistema disolvente, donde el sistema disolvente es un disolvente polar o una mezcla de disolventes que comprende al menos un disolvente polar, en el que preferiblemente el pH de al menos un disolvente que componen el sistema disolvente se ha ajustado;

iii) paso de la muestra y del sistema disolvente por al menos una columna, donde la columna basicamente esta llena de pequenas partfculas de una fase estacionaria, preferiblemente una fase estacionaria no polar, al mismo tiempo que se mantiene la presion del sistema entre 5 y 1500 atm;

iv) identificacion del tiempo de retencion y/o cuantificacion de la intensidad de la senal del momento en el que la molecula qufmicamente compleja se eluye mediante un detector capaz de detectar la elucion de la molecula qufmicamente compleja;

v) preparacion de un muestra de la molecula qufmicamente compleja a partir de un ingrediente activo farmaceutico, alimento medicinal, reactivo, aditivo alimentario, compuesto farmaceutico o nutraceutico que comprende la molecula qufmicamente compleja objeto de deteccion y/o cuantificacion, cuyo proceso de preparar la muestra comprende al menos la disolucion total o parcial del ingrediente activo farmaceutico, compuesto farmaceutico o nutraceutico para formar una solucion o suspension y, si resulta necesario, el tratamiento de la solucion o suspension para eliminar las partfculas que haya en suspension;

vii) deteccion y/o cuantificacion de la presencia de la molecula qufmicamente compleja mediante la comparacion del tiempo de retencion y/o la intensidad de la senal de la muestra o muestras estandar.

Clausula 27.- El metodo de acuerdo a la clausula anterior, cuando se utiliza para detectar y cuantificar cualquiera de las impurezas de un compuesto en un perfil de impurezas.

Clausula 28.- Un proceso para la preparacion de un farmaco, alimento medicinal, reactivo, aditivo alimentario, compuesto farmaceutico o compuesto farmaceutico nutraceutico que comprende al menos un compuesto con un peso molecular de como mfnimo 200, en el que dicho compuesto es una molecula qufmicamente compleja, en el que la citada molecula qufmicamente compleja se sustituye por al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, en el que dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, en el que cada grupo R corresponde independientemente a -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que se seleccionen independientemente al menos dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluidos los iones y sales de los mismos, en el que el farmaco, alimento medicinal, compuesto farmaceutico o nutraceutico debe tener un porcentaje predeterminado de la molecula qufmicamente compleja, en el que el proceso comprende: la obtencion de un lote de un farmaco, alimento medicinal, compuesto farmaceutico o compuesto farmaceutico nutraceutico; la medicion del porcentaje de pureza de la molecula qufmicamente compleja del lote mediante un proceso que comprende el metodo de conformidad con la clausula anterior; y la inclusion del lote del farmaco, alimento medicinal, compuesto farmaceutico o nutraceutico unicamente si su porcentaje de la molecula qufmicamente compleja medido de este modo cumple los requisitos o especificaciones, preferiblemente un porcentaje superior al 70% por peso y, de forma todavfa mas preferible, superior al 80% por peso (correspondiente a contenido seco).

Clausula 29.- Un proceso para la produccion de un compuesto farmaceutico que comprende al menos un compuesto con un peso molecular de como mmimo 200, en el que dicho compuesto es una molecula químicamente compleja, en el que la citada molecula químicamente compleja se sustituye por al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, en el que dicho cicloalquilo C3-C7 se sustituye por al menos dos grupos -R, en el que cada grupo R corresponde independientemente a -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que se seleccionen independientemente almenos dos R de entre -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluidos los iones y sales de los mismos, en el que el proceso comprende esencialmente los mismos pasos de proceso de un proceso para la produccion de un primer lote, siempre que despues del analisis, mediante cualquier metodo de las clausulas de la 1 a la 22, de una muestra biologica aislada, preferiblemente una muestra de sangre o suero recogida de sujetos a los que se administraron los compuestos farmaceuticos obtenidos del primer lote, los valores calculados de AUC y Cmax cumplen los requisitos que se desean o son bioequivalentes a un farmaco de referencia.

Clausula 30.- Perfil metabolico de un compuesto con un peso molecular de al menos 200, en donde el compuesto a ser detectada y/o cuantificada es una molecula químicamente compleja, en donde dicha molecula químicamente compleja esta sustituida con al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, en donde dicho cicloalquilo C3-C7 esta sustituido con al menos dos grupos -R, en donde cada grupo R corresponde independientemente -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que al menos dos R se seleccionen independientemente de -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluyendo iones o sales del mismo, en donde el compuesto o compuestos estan dentro de una matriz biologica, en donde dicha matriz biologica es un fluido biologico, tejido biologico, contenido del estomago, contenido del intestino, muestra de heces o celulas de cultivo.

Clausula 31.- Perfil de impurezas de un compuesto con un peso molecular de al menos 200, en donde el compuesto a ser detectada y/o cuantificada es una molecula químicamente compleja, en donde dicha molecula químicamente compleja esta sustituida con al menos dos grupos -R, preferiblemente un cicloalquilo C3-C7, en donde dicho cicloalquilo C3-C7 esta sustituido con al menos dos grupos -R, en donde cada grupo R corresponde independientemente -OH, -OP(O)(OH)2 o -P(O)(OH)2, con la condicion de que al menos dos R se seleccionen independientemente de -P(O)(OH)2 y -OP(O)(OH)2, incluyendo iones o sales del mismo, en donde el compuesto o compuestos estan presentes en una formulacion de un APl, un alimento medico, un reactivo, un aditivo alimentario, una composicion farmaceutica o nutraceutica.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Cromatograma UPLC®-MS obtenido para IP6 en plasma de rata tras la cromatograffa de fase inversa de elucion en gradiente del ejemplo 1.

Figura 2. Cromatograma HPLC-MS obtenido para IP6 en orina de rata tras la cromatograffa de fase inversa de elucion en gradiente del ejemplo 4.

Figura 3. Cromatograma ffpico de una muestra de un ingrediente activo farmaceutico (detalle en el caso de la muestra) del ejemplo 8 (perfil de impurezas). Figura 3a: En blanco. Figura 3b: Muestra (P: Fosfato; IP6: Inositol hexafosfato; 1, 2, 3 y 4: Impurezas relacionadas).

Figura 4. Cromatograma ffpico de ATP para una muestra de plasma de rata (ejemplo 9).

Figura 5. Cromatograma ffpico de IP3 para una muestra de plasma de rata (ejemplo 10).

Figura 6. Cromatograma ffpico de IP6 en orina humana (Ejemplo 11).

Figura 7. Cromatograma ffpico de IP6 usando una solucion de 30 mg de BSA (albumina de suero bovino) / mL en PBS como una matriz sustituta para plasma o suero (Ejemplo 12).

Figura 8. Cromatograma ffpico de las impurezas presentes en una solucion de acido fftico: IP5, IP4, IP3 y m / z 779(Ejemplo 13).

Figura 9. Cromatograma ffpico de metabolitos del acido fftico m/z 779, m/z 740 y m/z 579 despues de la incubacion de acido fftico en hepatocitos de rata (Ejemplo 14).

Figura 10. Cromatograma ffpico de metabolitos del acido fftico m/z 499, m/z 419, m/z 339 y m/z 259 despues de la incubacion de acido fftico en hepatocitos de rata (Ejemplo 14).

Figura 11. Cromatograma ffpico de acido fftico despues de la incubacion de acido fftico en hepatocitos de rata (Ejemplo 14).

Figura 12. Cromatograma ffpico de IP5 en plasma de rata (Ejemplo 15).

Figura 13. Cromatograma tfpico de metabolites del acido fftico (perfil metabolico) en plasma de rata (Ejemplo 16). Figura 14. Cromatograma tfpico de metabolitos del acido fftico (perfil metabolico) en plasma de perro (Ejemplo 17). Figura 15. Cromatograma tfpico de una muestra de API, que muestra los picos correspondientes para el acido fftico y sus correspondientes impurezas (perfil de impurezas) (Ejemplo 18).

Los ejemplos siguientes muestran la invencion como se describe en el presente documento y no limitan en ningun caso el alcance de la invencion que se recoge en las reivindicaciones adjuntas al presente documento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Determinacion de la presencia de IP6 en muestras de plasma de rata

La muestra de plasma se sometio a purificacion y extraccion del compuesto mediante precipitacion protefnica con TCA en presencia de un quelante (EDTA). El sobrenadante se diluyo con trietilamina acetato (TEAA) y se inyectaron 20 pL en el sistema UPLC®-MS.

La ionizacion de acido fftico se evaluo con espectrometrfa de masas con ionizacion por nebulizacion electrica negativa (ESI-MS).

Se realizo un analisis cuantitativo mediante espectrometrfa de masas en el modo de supervision de iones seleccionados (SIM).

El compuesto se analizo mediante cromatograffa de fase inversa de elucion en gradiente con TEAA en solucion acuosa y acetonitrilo como fase movil. El tiempo de retencion del analito en condiciones cromatograficas optimizadas fue de 3,42 minutos (vease la Figura 1 del cromatograma).

Ejemplo 2. Determinacion de la presencia de IP6 en muestras de plasma canino

El procedimiento bioanalftico desarrollado en el ejemplo 1 se valido nuevamente en muestras de plasma canino con una evaluacion completa de la linealidad, exactitud y precision. La curva de calibracion se desarrollo mediante la inyeccion de 20 pl de muestras de plasma en blanco a las que se anadio una cantidad conocida de IP6. Se consiguio una exactitud inferior al 10% y una precision inferior al 15% con concentraciones intermedias, por lo que se trata de un metodo bioanalftico excelente.

Ejemplo 3. Determinacion de la presencia de IP6 en muestras de plasma humano

El procedimiento bioanalftico desarrollado en el ejemplo 1 se aplico a muestras de plasma humano, pero se doblaron las cantidades de acido tricloroacetico (TCA), matriz y quelante. El tiempo de retencion del analito en condiciones cromatograficas optimizadas fue de 4,05 minutos.

Ejemplo 4. Determinacion de la presencia de IP6 en muestras de orina de rata

El procedimiento bioanalftico implico una extraccion del compuesto mediante la dilucion de la orina de rata en presencia de un quelante (EDTA), y no se requirio el uso de ningun agente precipitante. El sobrenadante se diluyo con trietilamina acetato (TEAA) y se inyectaron 50 pL en el sistema HPLC-MS.

La ionizacion de acido fftico se evaluo con espectrometrfa de masas con ionizacion por nebulizacion electrica negativa (ESI-MS). Se realizo un analisis cuantitativo mediante espectrometrfa de masas en el modo de supervision de iones seleccionados (SIM).

El compuesto se analizo mediante cromatograffa de fase inversa de elucion en gradiente con TEAA en solucion acuosa y acetonitrilo como fase movil. El tiempo de retencion del analito en condiciones cromatograficas optimizadas fue de ~3,99 minutos (vease la Figura 3 del cromatograma).

Ejemplo 5. Determinacion de la presencia de IP6 en formulaciones

Se ha identificado y cuantificado IP6 en formulaciones (soluciones) del ingrediente activo farmaceutico. En este ejemplo, sin cuantificacion simultanea de impurezas relacionadas. El medio de la solucion estuvo formado por agua, un 0,9% de NaCl u otras soluciones acuosas como vehfculo.

La determinacion y cuantificacion de IP6 se realizo mediante el mismo procedimiento del ejemplo 1, sin ningun tratamiento previo de la muestra aparte de la dilucion de la formulacion para que se ajustara al rango de la curva de calibracion.

El metodo analftico validado tambien se utilizo para evaluar la estabilidad, asf como la homogeneidad del IP6 en formulaciones no filtradas. Se demostro la linealidad y especificidad del metodo.

Ejemplo 6. Determinacion de la presencia de IP6 en cultivos celulares de hepatocitos

El metodo descrito en el ejemplo 1 se aplico correctamente a cultivos celulares de hepatocitos. El estudio de la inyeccion de diversos cultivos celulares con una cantidad conocida de IP6 en el HPLC-MS mostro que el metodo era fiable para este tipo de matriz.

Ejemplo 7. Determinacion de la presencia de IP6 en muestras de plasma porcino

El procedimiento bioanalftico desarrollado en el ejemplo 1 se aplico a muestras de plasma porcino. La curva de calibracion se desarrollo mediante la inyeccion de 50 pl de muestras de plasma en blanco a las que se anadio una cantidad conocida de IP6. Se consiguio una exactitud y una precision inferiores al 15%, por lo que se trata de un metodo bioanalftico excelente.

Ejemplo 8. Determinacion de la presencia de IP6 e impurezas relacionadas en formulaciones

Se ha identificado y cuantificado IP6 en formulaciones (soluciones) del ingrediente activo farmaceutico. En este ejemplo, se realizo una determinacion simultanea de la presencia de impurezas relacionadas, lo que permitio el calculo de la pureza cromatografica del ingrediente activo farmaceutico.

Para la determinacion y cuantificacion de IP6 se utilizo hidroxido de potasio como fase movil. Como alternativa tambien se puede utilizar hidroxido de sodio y se recomienda encarecidamente la adicion de pequenas proporciones de isopropanol.

La columna empleada fue un polfmero divinilbenceno de intercambio anionico. El caudal se mantuvo a 1 mL/min con una temperatura de 35°C.

Se obtuvo una mejor sensibilidad, en especial para impurezas, al utilizar la supresion ionica qufmica o electroqufmica.

El tiempo de retencion del acido fftico fue de 24,6 minutos (vease la Figura 4). La identidad del IP6 se confirmaba si el tiempo de retencion del pico principal de la muestra de la prueba estaba en un intervalo de ±0,5 minutos del tiempo de retencion medio del pico correspondiente a fitato para todas las inyecciones del estandar de trabajo de la prueba. Esta tecnica permite la determinacion simultanea del ingrediente activo farmaceutico junto con sus impurezas relacionadas en una unica serie cromatografica.

Ejemplo 9. Determinacion de la presencia de ATP (adenosfn trifosfato) en muestras de plasma de rata El procedimiento bioanalftico desarrollado en el ejemplo 1 se aplico a muestras de plasma de rata, pero se cambio la masa supervisada en el modo SIM por el peso molecular (M-1) del ATP. La curva de calibracion se desarrollo mediante la inyeccion de 50 pl de muestras de plasma en blanco a las que se anadio una cantidad conocida de ATP. El tiempo de retencion del a Tp fue de 3,96 minutos. En la Figura 4 se muestra un cromatograma tfpico obtenido con estas muestras.

Ejemplo 10. Determinacion de la presencia de IP3 (inositol trifosfato) en muestras de plasma de rata El procedimiento bioanalftico desarrollado en el ejemplo 1 se aplico a muestras de plasma de rata, pero se cambio la masa supervisada en el modo SIM por el peso molecular (M-1) del IP3. La curva de calibracion se desarrollo mediante la inyeccion de 50 pl de muestras de plasma en blanco a las que se anadio una cantidad conocida de IP3. El tiempo de retencion del IP3 fue de 2,62 minutos. En la Figura 5 se muestra un cromatograma tfpico obtenido con estas muestras.

Ejemplo 11. Determinacion de IP6 (hexafosfato de inositol) en plasma humano, de rata y de perro y en humano y de rata orina (modo MRM)

El metodo bionalftico desarrollado en el Ejemplo 1 y utilizado en el Ejemplo 1-10 se transfirio al modo MRM en un sistema UPLC®-MS/MS. El uso de este modo MRM dio lugar a un aumento de la sensibilidad analftica, asf como a mejora de la selectividad.

Se utilizo el mismo procedimiento de extraccion. Las condiciones cromatograficas tambien se basaron en la misma teorfa. La transicion de masa obtenida despues de la disociacion inducida por colision y utilizada con fines cuantitativos de IP6 fue m/z 659,0 > m/z 560,9. La figura 6 muestra un cromatograma tfpico obtenido con estas muestras.

Ejemplo 12. Determinacion de IP6 en una matriz sustituta (matriz sustituta de suero o plasma)

El procedimiento bioanalftico desarrollado en el Ejemplo 11, se aplico en una matriz sustituta. En una situacion particular (por ejemplo, se esperan niveles constitutivos del analito en la matriz en blanco) se podrfa utilizar una matriz sustituta para preparar la curva de calibracion y cuantificacion de IP6 en muestras biologicas.

Un efecto de matriz similar, asf como la misma recuperacion de extraccion entre matriz sustituta y matriz biologica se observo que resulto en un comportamiento identico en el sistema UPLC®-MS/MS. Como matriz sustituta para plasma o suero, se utilizo una solucion de 30 mg de BSA (albumina de suero bovino) / ml en PBS. Esta modificacion da una mayor sensibilidad y evita el uso de matrices biologicas naturales para construir la curva de calibracion. La figura 7 muestra un cromatograma tfpico obtenido con estas muestras.

Ejemplo 13. Determinacion de IP6 y las impurezas relacionadas en las formulaciones (modo SCAN)

El metodo cromatografico desarrollado para la determinacion de acido fftico permitio determinar algunas impurezas presentes en una solucion de acido fftico, todas las impurezas detectadas (IP3, IP4, IP5 y m/z 779) se coeluyen con el pico de acido fftico; sin embargo, fueron detectados debido a su diferente peso molecular. IP5 fue la impureza mas abundante.

La figura 8 muestra un cromatograma obtenido para este ejemplo

Ejemplo 14. Determinacion de IP6 y metabolitos relacionados en hepatocitos de rata (modo SCAN)

El acido fftico y sus metabolitos se detectaron despues de la incubacion del acido fftico en hepatocitos de rata. El paso de purificacion implico una dilucion de los pellets con medio KHB despues de la precipitacion con EDTA y, finalmente, una dilucion con TEAA.

Solo IP1 e IP2 se eluyeron con diferencias significativas en el tiempo de retencion en relacion con el acido fftico. Las Figuras 9, 10 y 11 muestran cromatogramas tfpicos de acido fftico y sus metabolitos despues de la incubacion de acido fftico en hepatocitos de rata.

Ejemplo 15. Determinacion de IP5 en muestras de plasma de perros y ratas (modo SIM)

El procedimiento bioanalftico desarrollado en el Ejemplo 1, se aplico en la determinacion de IP5 en plasma de perros y ratas.

Se detecto IP5 en el modo SIM utilizando el peso molecular (M-1) de IP5. El tiempo de retencion para IP5 fue de 4,10 min.

La figura 12 muestra un cromatograma tfpico obtenido para IP5 en plasma de rata.

Ejemplo 16. Determinacion de metabolitos de acido fftico en muestras de plasma de rata (modo SIM) El procedimiento bioanalftico desarrollado para la determinacion de acido fftico se aplico a muestras de plasma de rata para detectar el maximo numero de metabolitos.

Los metabolitos se detectaron primero en el modo SCAN y luego se confirmaron y se semicuantificaron mediante el modo SIM. Se pueden realizar mediciones cuantitativas obteniendo (es decir, sintetizando) los metabolitos correspondientes para preparar estandares. La figura 13 muestra un cromatograma tfpico obtenido con estas muestras.

Ejemplo 17. Determinacion de metabolitos del acido fftico en muestras de plasma de perro (modo SIM) El procedimiento bioanalftico desarrollado para la determinacion de acido fftico se aplico a muestras de plasma de perro para detectar el maximo numero de metabolitos. Los metabolitos se detectaron por primera vez en el modo SCAN y luego confirmado y semi-cuantificado por el modo SIM. Se pueden realizar mediciones cuantitativas obteniendo (es decir, sintetizando) los metabolitos correspondientes para preparar los estandares.

La figura 14 muestra un cromatograma tfpico obtenido con estas muestras.

Ejemplo 18. Determinacion de acido fftico (identidad, ensayo) e impurezas relacionadas en formulaciones para control de calidad de un API, un alimento medico, un reactivo, un aditivo alimentario, una composicion farmaceutica o nutraceutico

El acido fftico y las impurezas relacionadas se han identificado y cuantificado en formulaciones en solucion acuosa. Este metodo permite el calculo del ensayo y la pureza cromatografica del acido fftico.

La determinacion y cuantificacion del acido fftico se llevo a cabo mediante cromatograffa de iones con derivatizacion post-columna por deteccion UV.

La columna de cromatograffa ionica utilizada fue un poliestireno al 2% reticulado con polfmero de divinilbenceno. El caudal se mantuvo a 1 ml / min, estableciendo una temperatura de columna de 35°C.

La sensibilidad adecuada para los compuestos relacionados con el acido fftico se obtuvo mediante el uso de derivatizacion post-columna y deteccion UV.

El tiempo de retencion para el acido fftico fue de 48,06 minutos (ver Figura 15). La identidad del fftico se confirma cuando el tiempo de retencion del pico principal en la muestra de ensayo esta dentro de ±0,5 minutos del tiempo de retencion promedio del pico correspondiente al acido fftico para todas las inyecciones del estandar de trabajo del ensayo.

Esta tecnica analftica permite la determinacion simultanea de acido fftico junto con sus impurezas relacionadas (hasta treinta y cinco) en un solo analisis cromatografico para el control de calidad de un API, un alimento medico, un reactivo, un aditivo alimentario, una composicion farmaceutica o nutraceutica.

Basado en asignaciones tentativas de comparacion de los tiempos de retencion relativos de las impurezas formadas con el metodo de la literatura, las principales impurezas formadas se identifican como se indica en la Tabla 1.

T l 1. A i n i n i im r z n iv r m r r

Claims

REIVINDICACIONES

1. Metodo para la deteccion y cuantificacion directa de al menos un compuesto con un peso molecular de al menos 200, en donde el compuesto es una molecula químicamente compleja, en donde dicha molecula químicamente compleja es un inositol polifosfato seleccionado del grupo que contiene de 2 a 6 grupos fosfato, incluidos iones o sales de los mismos, en donde el compuesto o compuestos estan dentro de una matriz biologica, en donde dicha matriz biologica es un fluido seleccionado de la lista que consiste en sangre, plasma, suero, orina, saliva, lfquido linfatico, lfquido cefalorraqmdeo y mezclas de los mismos, en donde el metodo comprende al menos las siguientes etapas:

i) preparar al menos una muestra estandar de la molecula químicamente compleja para ser detectada y cuantificada;

ii) introduccion de la muestra estandar en la corriente de un sistema disolvente; en donde el sistema disolvente consiste en una solucion acuosa de una amina; en donde el pH del disolvente ha sido ajustado, entre 8 y 13;

iii) pasar la muestra y el sistema disolvente a traves de al menos una columna en la que la columna es una fase estacionaria de fase inversa, siendo el tamano de partfcula entre 1,5-15 micrones y el tamano de poro entre 60 500 Angstroms, mientras mantiene la presion del sistema entre 5 y 1500 atm;

iv) identificar el tiempo de retencion y cuantificar la intensidad de la senal de cuando la molecula químicamente compleja se eluye, mediante un detector de masas;

v) preparar una muestra de la molecula químicamente compleja a partir de una matriz biologica que comprende la molecula químicamente compleja para ser detectar y cuantificar, en donde el proceso para preparar la muestra comprende al menos disolver total o parcialmente la matriz biologica para formar una solucion o una suspension y, si es necesario, tratar la solucion o la suspension para eliminar partfculas en suspension;

vi) repetir los pasos (ii) y (iii) con la muestra preparada en el paso (v); juntos o secuencialmente con el estandar; y

vii) detectar y cuantificar la presencia de la molecula químicamente compleja por comparacion del tiempo de retencion e intensidad de la senal de la muestra estandar o las muestras estandar, o por comparacion del tiempo de retencion e intensidad de la senal obtenida de estudios previos o de la literatura,

donde el detector capaz de detectar la elucion de la molecula químicamente compleja es un espectrometro de masas; un espectrometro de masas en tandem o un cuadrupolo unico; trabajando bajo cualquiera de los siguientes modos de operacion: supervision de iones seleccionados (SIM); supervision de reaccion multiple (MRM); supervision de la reaccion seleccionada (SRM) y SCAN (negativo / positivo); o una combinacion de ellos.

2. El metodo segun la reivindicacion 1, que ademas comprende una etapa previa de cambio de fase e ionizacion de la molecula químicamente compleja entre la elucion y la deteccion y en donde el cambio de fase y la ionizacion es ionizacion química (APCI), fotoionizacion de la presion atmosferica (APPI), ionizacion por electrospray (ESI) o termospray.

3. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la matriz biologicamente a analizar es una muestra aislada de un ser humano que esta bajo un estudio de bioequivalencia.

4. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuando se usa para detectar y cuantificar cualquiera de los metabolitos de un compuesto en un perfil metabolico.