JP6176800B2 - Ｌｉｘ１ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、及び腫瘍細胞増殖抑制ペプチド - Google Patents

Ｌｉｘ１ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、及び腫瘍細胞増殖抑制ペプチド Download PDF

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Description

本発明は、ＬＩＸ１Ｌを高発現している腫瘍細胞（ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞）の細胞増殖抑制作用を有するペプチド、及びこのペプチドを用いたＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法に関する。
本願は、２０１３年４月１０日に、日本に出願された特願２０１３−０８２２７２号、及び２０１３年８月２３日に、日本に出願された特願２０１３−１７３６９６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
現在、悪性腫瘍に用いる抗腫瘍剤は、代謝拮抗薬（Ａｒａ−Ｃ、メソトレキセート等）、植物アルカロイド（ビンクリスチン）、アルキル化剤（エンドキサン）、抗癌抗生物質（アドリアマイシン、イダルビシンマイトマイシン等）、白金製剤（シスプラチン）等、数多く知られている。中でも、ポリペプチド剤としては、ヒトインターフェロン−γポリペプチド（例えば、特許文献１参照。）や、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）又はその変換体の一部からなるポリペプチド（例えば、特許文献２参照。）等が挙げられる。特に近年は、腫瘍特異性の高い分子標的治療薬（イマチニブ等）、モノクローナル抗体（リツキシマブ等）等が目覚ましい進歩を認め、治療効果も高くなってきている。しかしながら、イマチニブ等の抗腫瘍剤は、抗腫瘍効果スペクトルが狭く、腫瘍ごとに薬剤を選択しなければならないことに加えて、薬剤耐性の問題もある。このため、医療の場では常に、より有効で抗腫瘍効果スペクトルが広い薬剤が求められている。
一方で、ヒトのＬＩＸ１Ｌ（Ｌｉｘ１ ｈｏｍｏｌｏｇ−ｌｉｋｅ、以下ｈLIX1Lということがある。）遺伝子は、３３７個のアミノ酸からなるＬＩＸ１Ｌ蛋白質をコードする構造遺伝子である。ＬＩＸ１Ｌの分子生物学的な役割については未だ不明であるが、その発現量が細胞種によって異なることが報告されている。例えば特許文献３では、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子は、ＡｈＲアゴニストであってＣＹＰ１Ａ１により活性化される化合物に対して感受性のある細胞と感受性のない細胞において、発現量に統計学的な有意差（Ｐ＜１．０×１０−５）が存在する２６６種の遺伝子のうちの１つであったことが報告されている。また、特許文献４では、アレルギーに応じて発現量が増大又は減少する多数の遺伝子群のうちの１つとしてＬＩＸ１Ｌ遺伝子が挙げられている。
特開平５−３２０２００号公報 特開平５−２７１２９０号公報 特開２０１０−２６８６９０号公報 特表２００９−５２８８２６号公報
本発明は、広い抗腫瘍効果スペクトルをもつ新規ポリペプチド、及びこのポリペプチドを用いて腫瘍細胞の細胞増殖を抑制する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞において、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することによって細胞増殖が抑制されること、ＬＩＸ１Ｌの特定のチロシン残基を含む部分ペプチドが、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞増殖抑制作用を有すること、及びＬＩＸ１Ｌ蛋白質の特定のチロシン残基のリン酸化を阻害することによってＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞増殖抑制作用を有すること、を見出し、本発明を完成させた。
（１） 本発明の第一の態様は、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子を高発現している腫瘍細胞（ただし、ヒトの生体内の細胞を除く。）に対して、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現又は機能を抑制させる、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法である。
（２） 前記（１）のＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法においては、ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することが好ましい。
（３） 前記（２）のＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法においては、ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することが、配列番号３又は４で表される塩基配列を含むｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ、又は前記ｓｈＲＮＡ若しくは前記ｓｉＲＮＡを細胞内で生産するベクターを細胞内に導入することであることが好ましい。
（４） 前記（１）のＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法においては、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のチロシンのリン酸化を、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって、１３６番目のチロシンを含む部分配列を含むペプチドを用いて阻害することを含むことが好ましい。
（５） 本発明の第二の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって、１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドを含み、前記１３６番目のチロシンを含む部分配列が、８個以上、３５個以下のアミノ酸からなる、腫瘍細胞増殖抑制ペプチドである。
（６）本発明の第三の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドと、細胞膜透過能を有する部位とが、直接又は間接的に結合している、腫瘍細胞増殖抑制ペプチドである。
（７）前記（６）の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドとしては、前記１３６番目のチロシンを含む部分配列が、８個以上のアミノ酸からなることが好ましい。
（８） 前記（６）又は（７）の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドとしては、前記細胞膜透過能を有する部位が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
（９） 本発明の第四の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドを含む腫瘍細胞増殖抑制ペプチド、又は、前記（５）〜（８）のいずれかの腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを有効成分とする医薬用組成物である。
（１０） 前記（９）の医薬用組成物は、抗腫瘍剤であることが好ましい。
（１１） 本発明の第五の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドを含む腫瘍細胞増殖抑制ペプチド、又は、前記（５）〜（８）のいずれかの腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞（ただし、ヒトの生体内の細胞を除く。）に導入すること、を含む、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法である。
本発明によれば、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現又は機能を抑制することによって、この腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制することができる。
特に、本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に対して増殖阻害活性を示すが、ＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞やＬＩＸ１Ｌ遺伝子発現がほとんどみられない正常細胞に対しては増殖阻害活性を示さない。つまり、本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、正常細胞に対して細胞毒性を示さないにもかかわらず広い抗腫瘍効果スペクトルをもつため、抗腫瘍剤として非常に有用であり、この腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを用いることにより、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制することができる。
参考例１において、胃癌臨床検体を免疫組織化学染色した結果から得られた、各種胃癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を示した図である。 参考例１において、各種胃癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を示した図である。 参考例１において、胃癌臨床検体を免疫組織化学染色した結果から得られた、各種胃癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を示した図である。 参考例１において、各種胃癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を示した図である。 参考例１における全胃癌臨床検体について、分化型腫瘍と未分化型腫瘍ごとに、ＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を示した図である。 参考例１において、分化型腫瘍と未分化型腫瘍におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を示した図である。 参考例２において、各種癌臨床検体を免疫組織化学染色した結果から得られた、各種癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を示した図である。 参考例２において、各癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を示した図である。 参考例３において、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した２種の胃癌細胞株のＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントをエチジウムブロマイド染色した結果を示した図である。 参考例３において、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した２種の胃癌細胞株におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を表した図である。 参考例３において、２種の胃癌細胞株におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を、ウェスタンブロット法により測定した結果を示した図である。 参考例４において、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した３種の造血器腫瘍細胞株のＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントをエチジウムブロマイド染色した結果を示した図である。 参考例４において、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した３種の造血器腫瘍細胞株におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を表した図である。 参考例４において、３種の造血器腫瘍細胞株におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を、ウエスタンブロット法により測定した結果を示した図である。 実施例１において用いたｓｈＲＮＡ＃１の塩基配列を示した図である。 実施例１において用いたｓｈＲＮＡ＃２の塩基配列を示した図である。 実施例１において、ＨＬ−６０株のｓｈＲＮＡ処理による生細胞数の経時変化を示した図である。 実施例１において、ＨＬ−６０株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示した図である。 実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定したＨＬ−６０株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を表した図である。 実施例１において、Ｋ５６２株のｓｈＲＮＡ処理による生細胞数の経時変化を示した図である。 実施例１において、Ｋ５６２株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示した図である。 実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定したＫ５６２株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を表した図である。 実施例１において、ＫＡＴＯ−III株のｓｈＲＮＡ処理による生細胞数の経時変化を示した図である。 実施例１において、ＫＡＴＯ−III株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示した図である。 実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定したＫＡＴＯ−III株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量の相対値を示した図である。 実施例１において、ＯＣＵＭ−１株のｓｈＲＮＡ処理による生細胞数の経時変化を示した図である。 実施例１において、ＯＣＵＭ−１株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した結果を示した図である。 実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定したＯＣＵＭ−１株のｓｈＲＮＡ処理による７２時間培養後のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量の相対値を示した図である。 実施例２において用いたペプチドのアミノ酸配列を示した図である。 実施例２において、各ペプチドを添加して培養した後のＨＬ−６０株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 実施例２において、各ペプチドを添加して培養した後のＨＬ−６０株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 実施例２において、各ペプチドを添加して培養した後のＲＰＭＩ８２２６株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 実施例２において、各ペプチドを添加して培養した後のＫＡＴＯ−III株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 実施例２において、各ペプチドを添加して培養した後のＯＣＵＭ−１株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 実施例３において、ＨＬ−６０株に対して、各ペプチドを添加して培養した場合の生細胞数の経時変化を示した図である。 実施例３において、Ｋ５６２株に対して、各ペプチドを添加して培養した場合の生細胞数の経時変化を示した図である。 実施例３において、ＲＰＭＩ８２２６株に対して、各ペプチドを添加して培養した場合の生細胞数の経時変化を示した図である。 ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のアミノ酸配列を示した図である。 実施例４において用いたペプチド１〜３及びコントロールペプチドのアミノ酸配列を示した図である。 実施例４において、各ペプチドを添加して培養した後のＵ９３７株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 実施例４において、各ペプチドを添加して培養した後のＫ５６２株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 実施例４において、各ペプチドを添加して培養した後のＲＰＭＩ８２２６株の細胞に対してＭＴＴアッセイを行った場合の、培養液に添加したペプチドの濃度と５７０ｎｍの吸光度の関係を示した図である。 参考例５において、ＨＥＫ２９３株にＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた恒常発現株のライセートに対して抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降を行い、得られた沈降物に対してウェスタンブロットを行った結果を示した図である。 参考例６において、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した各株のＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントをエチジウムブロマイド染色した結果を示した図である。 参考例６において、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した各株のＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントをエチジウムブロマイド染色した結果を示した図である。 参考例６において、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した各株のＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントをエチジウムブロマイド染色した結果を示した図である。 実施例５において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）を示した図である。 実施例５において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）を示した図である。 実施例５において、ＭＫＮ４５株の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）を示した図である。 実施例５において、ＮＵＧＣ−４株の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）を示した図である。 実施例５において、ＨＬ−６０株の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）を示した図である。 実施例５において、Ｋ５６２株の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）を示した図である。 実施例５において、Ｕ９３７株（Ｃ）の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）を示した図である。 実施例６において、ＨＥＫ２９３株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）と、ＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）と、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌにペプチド１を導入した細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ペプチド１）について、形成されたコロニーの数を測定した結果を示した図である。 実施例７において、各マウスにおける、ペプチド溶液を投与した時点と腫瘍部の体積を経時的に測定した結果を示した図である。 実施例８において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 実施例８において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 実施例８において、Ｋ５６２株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 実施例８において、ＭＫＮ４５株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 実施例８において、ＮＵＧＣ−４株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例１において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例１において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例１において、Ｋ５６２株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例１において、ＭＫＮ４５株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例１において、ＮＵＧＣ−４株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例２において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例２において、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例２において、Ｋ５６２株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例２において、ＭＫＮ４５株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 比較例２において、ＮＵＧＣ−４株のＭＴＴアッセイの結果を示した図である。 実施例９において、ＨＥＫ２９３株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）と、ＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）と、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌにペプチド１を導入した細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６）について、それぞれ細胞質と核分画に分離し、これらのライセートに対して抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降を行い、得られた沈降物に対してチロシンリン酸化抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果を示した図である。 実施例９において、ＨＥＫ２９３株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）と、ＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）と、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌにペプチド１を導入した細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６）についてコロニーフォーメーションアッセイを行った結果、及び光学顕微鏡にて撮影したコロニーの状態を示した図である。
ＬＩＸ１Ｌ遺伝子は、ヒトの染色体１ｑ２１．１領域に存在する構造遺伝子であり、正常細胞ではほとんど発現しておらず、多くの腫瘍細胞において発現が亢進している遺伝子である。
なお、本明細書で用いる「腫瘍」という用語は、遺伝子変異によって自律的で制御されない増殖を行うようになった細胞集団のなかで周囲の組織に浸潤し、また転移を起こす腫瘍である悪性腫瘍（癌ともいう。）を意味し、各種肉腫及び癌腫を含み、固形癌及び造血器癌を含む。
ここで、固形がんは、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞肺癌、 非小細胞肺癌、乳癌、肺癌、胃癌、胆のう・胆管癌、肝癌、肝細胞癌、滕癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、絨毛上皮癌、子宮体癌、子宮頸癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、睾丸癌、胎児性癌、ウィルス腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨 肉腫、ユーイング腫、軟部肉腫等が挙げられる。一方、造血器癌としては、例えば、急性白血病、慢性 リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ 腫、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。
ＬＩＸ１Ｌ（ｈＬＩＸ１Ｌ）遺伝子がコードするｈＬＩＸ１Ｌ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、それぞれ示す（ＥＭＢＬのアクセッション番号：ＮＭ＿１５３７１３．１）。
腫瘍細胞は、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子が高発現しているＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞と、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現が低い（発現量が検出限界値未満を含む。）ＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞とに分けられる。ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞は、臓器や分化の程度、原発性か転移性かによらず、多くの腫瘍においてみられる。特に、いずれの臓器においても、分化腫瘍細胞よりも未分化腫瘍細胞において、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の発現頻度が高い。実際に、発明者らが多くの固形腫瘍（胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肝細胞癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、及び腎細胞癌）の患者について調べたところ、約２０〜６０％がＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍であった（後記参考例１及び２参照。）。
本発明及び本願明細書において、「ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞」とは、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量が、正常細胞と比較しその遺伝子発現が８倍以上である腫瘍細胞を意味し、「ＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞」とは、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞以外の腫瘍細胞を意味する。つまり、ある腫瘍細胞がＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞かＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞かは、この腫瘍細胞におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を測定することによって判別できる。基準となる正常細胞としては、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞か否かを判別する対象である腫瘍細胞と同じ組織由来の正常細胞であってもよく、異なる組織由来の正常細胞であってもよい。例えば、健常人から採取・分離された末梢血単核球を正常細胞とすることができる。
ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量は、蛋白質レベルで比較してもよい。例えば、ウェスタンブロット法により、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を定量的に検出することができる。具体的には、ウェスタンブロット法にて検出できるバンドを、デンシトメトリ―によりバンドのシグナルを数値化することにより、腫瘍細胞から検出されたシグナルが、正常細胞から検出されたシグナルの８倍以上である場合、「強いシグナル」と判断し、腫瘍細胞から検出されたシグナルが、正常細胞から検出されたシグナルの８倍未満である場合「弱いシグナル」と判断することができる。
また、腫瘍細胞の細胞ライセートを電気泳動して分離した後に膜に転写し、この膜上のＬＩＸ１Ｌ蛋白質を抗ＬＩＸ１Ｌ抗体を用いて検出した場合には、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質と結合した抗ＬＩＸ１Ｌ抗体から得られたシグナルをデンシトメトリーによって測定したシグナル強度が、正常細胞から同様にして測定されたシグナル強度の８倍以上である腫瘍細胞がＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞であり、正常細胞から同様にして測定されたシグナル強度の８倍未満である腫瘍細胞がＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞であると判断することができる。
ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量は、ｍＲＮＡレベルで比較してもよい。例えば、後記参考例３等で示すように、ＲＴ−ＰＣＲ法等の核酸増幅反応を利用して、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を定量的に検出することができる。具体的には、例えば、腫瘍細胞から抽出されたＲＮＡから逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡの全長又は一部分を増幅するＰＣＲを行った場合には、得られた増幅産物量が、正常細胞から同様にして得られた増幅産物量の８倍以上である腫瘍細胞がＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞であり、それ以外の腫瘍細胞がＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞であると判断できる。
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に対して、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制させることにより、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞における細胞増殖を抑制することができる。このＬＩＸ１Ｌ遺伝子発現抑制による細胞増殖抑制効果は、発現抑制前の腫瘍細胞のＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量が多いほど大きい傾向にある。また、ＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞に対して、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制させた場合には、このような細胞増殖抑制効果は検出できない。
ＬＩＸ１Ｌ遺伝子発現抑制により細胞増殖抑制効果が得られることから、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子は細胞増殖に関与する遺伝子であり、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子が高発現している細胞では、この細胞の増殖にＬＩＸ１Ｌ蛋白質が大きな役割を果たしており、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子が癌遺伝子としての機能があることが示唆される。ＬＩＸ１Ｌ低発現腫瘍細胞では、細胞増殖に対するＬＩＸ１Ｌ蛋白質の役割が小さく、他の成分によって増殖が亢進されているため、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制させても細胞増殖抑制効果が観察されないのではないかと推察される。
なお、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の機能は従来知られておらず、細胞の腫瘍化の一因となる癌遺伝子なのか、それとも腫瘍化によって発現が亢進する遺伝子なのかについては何ら明らかにされてはいない。ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現抑制によりＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞増殖が抑制されること、つまり、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞増殖にＬＩＸ１Ｌ遺伝子が寄与していることは、本発明者らが初めて見出した知見である。
ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制する方法としては特に限定されるものではなく、従来公知のいずれの手法を用いてもよい。本発明においては、臨床への適用が可能であることから、ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することが好ましい。ＲＮＡ干渉は、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）を、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞内へ導入することにより行うことができる。
なお、細胞へ直接ｓｉＲＮＡ等を導入させてもよく、細胞内においてｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターを細胞内へ導入させてもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導ベクターの作製、及び細胞への導入等は、常法により行うことができる。例えば、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは化学合成により合成することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、例えば、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターに化学合成したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを組み込むことにより行うことができる。
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はＲＮＡｉ誘導ベクターの細胞への導入は、例えば、トランスフェクション試薬（例えば、リポフェクタミン（登録商標））；金コロイド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター等の各種ウイルスベクター；及び様々な元素を組み合わせて作成したナノ粒子：等による導入が挙げられる。
また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。
例えば、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡ中のＲＮＡｉ標的領域を、配列番号３又は４で表される塩基配列からなる領域とすることにより、ＲＮＡ干渉によって効率よくＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することができる。具体的には、配列番号３又は４で表される塩基配列を含むｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡ、又はこれらを細胞内で生産するベクターをＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞内へ導入する。配列番号３で表される塩基配列を含むｓｈＲＮＡとしては、例えば、塩基配列５で表される塩基配列からなる二本鎖核酸が挙げられ、配列番号４で表される塩基配列を含むｓｈＲＮＡとしては、例えば、塩基配列６で表される塩基配列からなる二本鎖核酸が挙げられる。
即ち、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法としては、ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することを含むＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であり、前記ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することが、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ、又は前記ｓｈＲＮＡ若しくは前記ｓｉＲＮＡを細胞内で生産するベクターを細胞内に導入すること、を含むＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法が挙げられる。
また、配列番号３又は４で表される塩基配列を含むｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡ、又はこれらを細胞内で生産するベクターは、適宜化学修飾等を行って、本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドと同様に製剤化することもできる。
ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現抑制のみならず、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の機能を抑制することによっても、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖抑制効果が得られる。ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の機能を抑制する方法としては、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質の不活性変異体や、機能や活性に必要な部分領域を欠損している部分蛋白質やペプチドを細胞内に過剰に導入する方法が挙げられる。
中でも、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質中のシグナル伝達に関与する部分領域と相同的なペプチド又は部分蛋白質であって、伝達されたシグナルに応答するための機能ドメインを欠損しているペプチド（以下、「本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチド」という。）を細胞内へ導入する方法が好ましい。腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞内において内在性のＬＩＸ１Ｌ蛋白質と競合するため、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質の発現を抑制した場合と同様に、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞増殖を抑制し得る。
本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドとしては、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質中、特定のシグナルの伝達によってリン酸化されるチロシン残基、セリン残基、又はスレオニン残基を含む部分領域と相同的なアミノ酸配列（以下、単に「リン酸化領域部分配列」ということがある。）を含むペプチドが挙げられる。多くの細胞において、細胞増殖等のシグナル伝達には、蛋白質のリン酸化が中心的な役割を果たしており、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質も、チロシン残基等のリン酸化により、細胞増殖シグナルに関与していると考えられるためである。
なお、本明細書及び請求の範囲における「腫瘍細胞増殖抑制ペプチド」は、Ｃ末端がアミド化されたペプチドを意味する。即ち、前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されて、−ＣＯＯＮＨ2となっている。
本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドとしては、例えば、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のＮ末端から１３６番目のチロシン（Ｙ１３６）を含むポリペプチド（以下、「Ｙ１３６含有ペプチド」という。）が挙げられる。Ｙ１３６含有ペプチドを細胞内へ導入することによって、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞増殖を抑制することができる。Ｙ１３６含有ペプチドとしては、具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって、Ｙ１３６を含む部分配列（Ｙ１３６含有部分配列）をリン酸化領域部分配列として含むポリペプチドである。
本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、例えば、化学合成により合成することができる。
Ｙ１３６含有部分配列におけるＹ１３６の位置は、特に限定されるものではなく、Ｙ１３６含有部分配列のＮ末端付近やＣ末端付近であってもよいが、Ｙ１３６含有部分配列の中央付近であることが好ましい。また、Ｙ１３６含有部分配列の長さ（アミノ酸数）は、このＹ１３６含有部分配列からなるポリぺプチドが、他のポリペプチドと識別可能な程度の長さがあればよく、８アミノ酸以上が好ましく、１０アミノ酸以上がより好ましく、１１アミノ酸以上がさらに好ましい。一方で、長すぎるポリペプチドは、一般的に細胞膜透過性が低くなる傾向にあり、また、生体内に投与された場合に抗原性を示すおそれもある。このため、Ｙ１３６含有部分配列の長さは、３５アミノ酸以下であることが好ましく、３０アミノ酸以下であることがより好ましい。
即ち、Ｙ１３６含有部分配列の長さは、８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下であることが好ましく、１０アミノ酸以上、３５アミノ酸以下であることがより好ましく、１１アミノ酸以上、３０アミノ酸以下であることがさらに好ましい。
なお、ここでいう「Ｎ末端付近」とは、Ｎ末端から５アミノ酸以内の位置を意味し、「Ｃ末端付近」とは、Ｃ末端から５アミノ酸以内の位置を意味する。「中央付近」とは、Ｙ１３６含有部分配列の中央の位置から１０アミノ酸以内の位置を意味する。
Ｙ１３６含有部分配列としては、具体的には、Ｎ末端から１３０番目のプロリンから開始して１３６番目のチロシンを有する８アミノ酸を含む部分アミノ酸配列が好ましく、Ｎ末端から１３０番目のプロリンから開始して１３６番目のチロシンを有する１１アミノ酸を含む部分アミノ酸配列がより好ましい。
本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、Ｙ１３６含有部分配列等のリン酸化領域部分配列のみからなるポリペプチドであってもよいが、さらに、細胞膜透過能を有する部位を有することが好ましい。本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドが細胞膜透過能を有する部位を有することにより、前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドをＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の細胞内へより効率よく導入させることができる。細胞膜透過能を有する部位としては、ポリペプチドからなる部位であってもよく、ポリペプチド以外の成分、例えば、糖や核酸、低分子化合物を含む部位であってもよい。また、この部位は、天然型のアミノ酸のみからなるポリペプチドであってもよく、修飾アミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。ポリペプチドからなる細胞膜透過能を有する部位としては、例えば、ＨＩＶ−１の ＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白質由来のＴａｔペプチド、オリゴアルギニン、ショウジョウバエのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ蛋白質由来のＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ、神経ペプチドｇａｌａｎｉｎとハチ毒ｍａｓｔｏｐａｒａｎのキメラペプチドであるｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ等の膜透過性ペプチドが好ましく用いられる。
本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドが膜透過性ペプチド等の細胞膜透過能を有する部位を有する場合には、リン酸化領域部分配列からなるポリペプチドと細胞膜透過能を有する部位とは、直接結合していてもよく、各種リンカーを介して間接的に結合されていてもよい。
また、前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、Ｙ１３６含有部分配列等のリン酸化領域部分配列からなるポリペプチドがＮ末端側にあってもよく、細胞膜透過能を有する部位がＮ末端側にあってもよい。
リンカーとしては、ポリペプチド同士又はポリペプチドと他の化合物とを連結することが可能なリンカーであれば特に限定されるものではないが、細胞膜透過性や抗原性のリスク等の点から、比較的小さい分子が好ましい。例えば、細胞膜透過能を有する部位が膜透過性ペプチドの場合、リンカーとしては、１〜５個のアミノ酸（ε−アミノカプロン酸等の修飾アミノ酸を含むものであってもよい。）からなるリンカーが好ましい。リンカーとしては、ε−アミノカプロン酸の１アミノ酸がより好ましい。
本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、細胞膜透過能を有する部位に加えて、又は細胞膜透過能を有する部位以外に、その他の機能性部位を有していてもよい。その他の機能性部位としては、リン酸化領域部分配列からなるポリペプチドによる増殖抑制機能を損なわない部位であれば特に限定されるものではない。その他の機能性部位としては、例えば、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等の蛋白質の精製に汎用されているタグペプチド等が挙げられる。
本発明の一実施態様である腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを細胞内へ導入するためには、前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチド自体を細胞内へ導入させてもよく、細胞内において前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを生産させることができるベクターをＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に導入させてもよい。本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドやこれを生産するためのベクターは、常法により、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に導入させることができる。例えば、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に導入させる方法としては、市販のトランスフェクション試薬（例えば、リポフェクタミン（登録商標））；金コロイド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター等の各種ウイルスベクター；及び様々な元素を組み合わせて作成したナノ粒子；等が挙げられる。特に、本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドが細胞膜透過能を有する部位を有する場合には、このポリペプチドを単にＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に接触させるだけで、効率よく細胞内へ導入させることができる。
即ち、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法としては、腫瘍細胞増殖抑制ペプチド腫瘍細胞増殖抑制ペプチドをＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に導入することを含み、前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位と、を含み、前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とは直接又は間接的に結合しているＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法が挙げられる。
Ｙ１３６含有ペプチドを細胞内へ導入することによってＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖が抑制される理由は明らかではないが、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質中のＹ１３６はリン酸化される確率が高いチロシン残基であることから、このペプチド中のＬＩＸ１Ｌ蛋白質のＹ１３６に相当するチロシンが、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のＹ１３６と競合してリン酸化されることにより、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質中のＹ１３６のリン酸化に基づく増殖シグナルが切断される結果、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の細胞増殖機能が抑制され、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子を発現抑制した場合と同様の効果が得られると推察される。
本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を有することから、抗腫瘍剤をはじめとする医薬用組成物として有用である。本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、巨大分子である糖蛋白質に比して小さい分子であるため、人体に投与した場合に抗体が産生し難いこと、構造が単純なため化学的に大量生産が可能であること、また製造工程における品質管理も容易であること等の利点も有している。
特に、本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、広い抗腫瘍効果スペクトルをもち、正常細胞への細胞毒性が非常に低い、優れた抗腫瘍剤となり得る。これは、本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドが、多くの腫瘍細胞（例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞肺癌、 非小細胞肺癌、乳癌、肺癌、胃癌、胆のう・胆管癌、肝癌、肝細胞癌、滕癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、絨毛上皮癌、子宮体癌、子宮頸癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、睾丸癌、胎児性癌、ウィルス腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨 肉腫、ユーイング腫、軟部肉腫、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫；好ましくは、胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肝細胞癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、及び腎細胞癌；より好ましくは胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、及び腎細胞癌）において腫瘍細胞特異的に発現しているＬＩＸ１Ｌ蛋白質を直接標的とした新規ペプチド化合物であり、かつＬＩＸ１Ｌ蛋白質が発現していない又は発現量が少ない細胞には特段の影響を及ぼさないことが期待できるためである。
なお、本発明に係る医薬組成物又は抗腫瘍剤は、薬学的に許容できる担体又は希釈剤を含んでいてもよい。
ここで、「薬学的に許容できる担体又は希釈剤」は、賦形剤（例えば、脂肪、蜜蝋、半固体及び液体のポリオ一ル、天然若しくは硬化オイル等）；水（例えば、蒸留水、特に、注射用蒸留 水等）、生理学的食塩水、アルコール（例えば、エタノール）、グリセロール、ポリオ一ル、ブドウ糖水溶液、マンニトール、植物オイル等；添加剤（例えば、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味料、着色剤、調味料若しくは芳香剤、濃化剤、希釈剤、緩衝物質、溶媒若しくは可溶化剤、貯蔵効果を達成するための薬剤、浸透圧を変えるための塩、コーティング剤、又は抗酸化剤）等を意味する。
本発明の医薬組成物又は抗腫瘍剤に係る製剤は、各種の形態を選択することができ、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤若しくは液剤等の経口製剤、或いは、例えば溶液若しくは懸濁液等の殺菌した液状の非経口製剤、坐剤、軟膏剤等が挙げられる。
非経口的に筋肉内注射、静脈内注射又は皮下注射の形で投与する場合の適当な溶剤又は希釈剤としては、例えば注射用蒸留水、塩酸リドカイン水溶液（筋肉内注射用）、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、静脈内注射用液体（例えばクエン酸及びクエン酸ナトリウム等の水溶液）若しくは電解質溶液（点滴静注及び静脈内注射用）等、又はこれらの混合溶液が挙げられる。
これらの注射剤は予め溶解したものの他、粉末のまま或いは適当な担体（添加物）を加えたものを用時溶解する形態もとり得る。これらの注射液は、製剤全体の重量を基準として、例えば、１０〜９０重量％の有効成分を含むことができる。
これら製剤は常法又は慣用技術に従って当業者が容易に製造することができる。例えば、本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを含む製剤が注射剤の場合は、本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチド適量を ０．９ ％生理食塩水適量と混合し、この混合物を注射用バイアルに詰めることにより製造することができる。
本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは各種がん治療に有用な他剤と組み合わせて、又は放射線療法と組み合わせて使用することができる。
本発明は治療的に有効量の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを、投与が必要な対象に投与することを含む腫瘍（即ち、癌）の治療法をも包含する。
なお、本発明における「投与が必要な対象」とは、ＬＩＸ１Ｌを高発現している腫瘍細胞を有する患者を意味する。
本発明における「腫瘍（癌）の治療」という用語は、前記投与が必要な患者に対して、本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを含む製剤を投与することにより、腫瘍細胞の増殖を阻害することを意味する。好ましくは、かかる治療は、腫瘍細胞を後退、即ち、測定可能な腫瘍の大きさを減縮させることができる。さらに好ましくは、係る治療は、腫瘍細胞を完全に消失させる。
また、本発明における「治療」は、予防的投与も含む。
本発明に係る方法において、好ましい治療単位は、本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの投与形態、使用される本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの種類、使用される本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの剤型；併用される他の抗癌剤の種類、投与形態、剤型等；及び治療される腫瘍細胞（癌細胞）、患者の状態等によって変化してもよい。所定の条件において 最適な治療は、慣用の治療決定単位を基にして、及び／又は、本明細書を考慮して、当業者が決定することができる。
本発明に係る方法において、本発明の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの治療単位は、具体的に言うと、使用される腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの種類、配合された組成物の種類、適用頻度及び治療すべき特定部位、病気の軽重、患者の年令、医師の診断、腫瘍（癌）の種類等によって変えることができる。例えば、一応の目安として、1日当たりの成人１人当りの投与量は、非経口投与の場合、好ましくは静脈内投与、更に好ましくは点滴静注の塲合、例えば、 1 日当たり １０ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。ここで、点滴静注 の場合、例えば、１時間〜４８時間連続して投与してもよい。なお、投与回数は、投与方法及び症状に より異なるが、例えば、１日１回〜５回である。また、隔日投与、隔々日投与などの間けつ投与等の投与方法でも用いることができる。非経口投与の場合の治療の休薬期間は、例えば、０週間〜４週間である。
その他にも、本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質の細胞内における機能を特異的に阻害することができるため、細胞内シグナル伝達、特に細胞増殖シグナルにおけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の機能の解明のためのツールとしても有用である。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、
前記ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞は、胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肝細胞癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される少なくとも１つの癌細胞におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量が、正常細胞と比較して８倍以上である細胞であり、
前記増殖阻害方法は、ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することを含み、
前記ＲＮＡ干渉によるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現の抑制が、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ、又は前記ｓｈＲＮＡ若しくは前記ｓｉＲＮＡを細胞内で生産するベクターを細胞内に導入すること、を含むＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
腫瘍細胞増殖抑制ペプチドであって、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３０番目のプロリンから開始して、１３６番目のチロシンを有する８アミノ酸を含む部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチド、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
腫瘍細胞増殖抑制ペプチドと、薬学的に許容できる担体又は希釈剤と、を含む医薬組成物、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
腫瘍細胞増殖抑制ペプチドと、薬学的に許容できる担体又は希釈剤と、を含む医薬組成物であり、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドが
配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチドである医薬組成物、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害のための腫瘍細胞増殖抑制ペプチド、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害のための腫瘍細胞増殖抑制ペプチドであり、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドが、
配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチドである、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害のための腫瘍細胞増殖抑制ペプチド、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬の製造のための、腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの使用、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬の製造のための腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの使用であって、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、
配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチドである、
前記ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬品の製造のための、前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドの使用、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、
前記増殖阻害方法は腫瘍細胞増殖抑制ペプチドをＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に導入することを含み、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチドである、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、
前記増殖阻害方法は腫瘍細胞増殖抑制ペプチドをＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に導入することを含み、
前記ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞は、胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肝細胞癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される少なくとも１つの癌細胞におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量が、正常細胞と比較して８倍以上である細胞であり、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチドである、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、
前記増殖阻害方法は腫瘍細胞増殖抑制ペプチドをＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞に導入することを含み、
前記ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞は、胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肝細胞癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される少なくとも１つの癌細胞におけるＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量が、正常細胞と比較して８倍以上である細胞であり、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３０番目のプロリンから開始して、１３６番目のチロシンを有する８アミノ酸を含む部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチドである、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、
前記増殖阻害方法は
治療的に有効量の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを、投与が必要な対象に投与することを含み、
前記腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、
前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合しているペプチドである、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、
前記方法は、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のチロシンのリン酸化を阻害する方法であり、
前記リン酸化を阻害する方法は、治療的に有効量のチロシンキナーゼインヒビターを、投与が必要な対象に投与すること、を含むＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、が挙げられる。
本発明のその他の態様としては、
ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法であって、
前記方法は、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のチロシンのリン酸化を阻害する方法であり、
前記リン酸化を阻害する方法は、治療的に有効量のチロシンキナーゼインヒビターを、投与が必要な対象に投与すること、を含み、
前記チロシンが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＬＩＸ１Ｌ蛋白質の１３６番目のチロシンであり、
前記チロシンキナーゼインヒビターが、配列番号１で表されるアミノ酸配列の、１３６番目のチロシンを含む８アミノ酸以上、３５アミノ酸以下の部分配列からなるポリペプチドと、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる細胞膜透過能を有する部位とを含み、前記ポリペプチドと前記細胞膜透過能を有する部位とが直接又は間接的に結合している腫瘍細胞増殖抑制ペプチドである、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、が挙げられる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
胃癌患者から採取された胃癌臨床検体について、免疫組織化学染色により、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を定量的に検出し、比較した。これらの胃癌臨床検体は、予めその病理学的検査の結果から、乳頭腺癌（Ｐａｐ）、管状腺癌（Ｔｕｂ）、低分化腺癌（Ｐｏｒ）、印環細胞癌（Ｓｉｇ）、粘液癌（Ｍｕｃ）、及びその他に分類された。管状腺癌はさらに高分化型（Ｔｕｂ１）と中分化型（Ｔｕｂ２）に分類され、低分化腺癌は充実型（Ｐｏｒ１）と非充実型（Ｐｏｒ２）に分類された。このうち、乳頭腺癌及び管状腺癌が分化型腫瘍細胞であり、その他が未分化型腫瘍細胞である。
通常は、１つの腫瘍組織中には、正常細胞と腫瘍細胞が混在している。そこで、各胃癌臨床検体について、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞が含まれている割合が高い検体がＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍であり、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞が含まれている割合が低い検体がＬＩＸ１Ｌ陰性腫瘍であると判定した。
具体的には、各胃癌臨床検体中の細胞を、一次抗体として抗ＬＩＸ１Ｌウサギポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ社製）、二次抗体としてぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（製品名：Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ ＭＡＸ−ＰＯ（ＭＵＬＴＩ）、ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて免疫組織化学染色した。
各胃癌臨床検体において無作為に選択した３か所の同一拡大視野を検鏡し、腫瘍部から検出されたシグナルと隣接した正常組織における細胞から検出されたシグナルとを比較し、隣接した正常組織における細胞から検出されたシグナルよりも強いシグナルが検出された腫瘍部の細胞をＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍細胞、シグナルが検出されなかった細胞をＬＩＸ１Ｌ陰性細胞として、ＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍細胞とＬＩＸ１Ｌ陰性細胞数を計測した。
計測された全細胞のうち、腫瘍細胞におけるＬＩＸ１Ｌ陽性細胞の割合が３０％以上、１００％以下のものをＬＩＸ１Ｌ陽性検体（＋）、１０〜３０％をＬＩＸ１Ｌ弱陽性（＋／−）、０％以上、１０％以下をＬＩＸ１Ｌ陰性（−）として、各胃癌臨床検体を判定した。
免疫組織化学染色の結果から得られた、各種胃癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数及びその割合を図１Ａ〜図１Ｆに示す。図１Ａは、乳頭腺癌、管状腺癌、低分化腺癌、印環細胞癌、粘液癌、及びその他の癌（図中、「ｏｔｈｅｒ」）ごとに、ＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を示し、図１Ｂは、図１Ａの結果から各種胃癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を示している。図１Ｃは、乳頭腺癌、高分化型管状腺癌、中分化型管状腺癌、充実型低分化腺癌、非充実型低分化腺癌、及び印環細胞癌ごとに、ＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を示し、図１Ｄは、図１Ｃの結果から各種胃癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を示している。さらに、図１Ｅは、全胃癌臨床検体について、分化型腫瘍（図中、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎ」）と未分化型腫瘍（図中、「Ｕｎｄｉｆｆｅｒ」）ごとに、ＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を示し、図１Ｆは、図１Ｅの結果から分化型腫瘍と未分化型腫瘍におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を示している。この結果、全ての種類の胃癌において、少なくとも４０％以上の頻度でＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍が検出された。
［参考例２］
胃癌以外の固形腫瘍（肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肝細胞癌、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、乳癌、及び腎細胞癌）の患者から採取された臨床検体についても、参考例１と同様にして、免疫組織化学染色を行い、各種癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数及びその割合を求めた。
免疫組織化学染色の結果から得られた、各種癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性検体と陰性検体の数を図２Ａに、その結果から各種癌におけるＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍の頻度を算出した結果を図２Ｂに、それぞれ示す。いずれの癌においても、約２０〜６０％がＬＩＸ１Ｌ陽性腫瘍であった。
［参考例３］
胃癌の細胞株について、ウェスタンブロット法及びＲＴ−ＰＣＲ法により、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を蛋白質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方から定量的に測定し比較した。
胃癌の細胞株としては、ＫＡＴＯ−III株とＯＣＵＭ−１株の２種類を用いた。両細胞株はいずれも未分化型腫瘍である。ＫＡＴＯ−III株は、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＲＰＭＩ１６４０培地に対して１０容量％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加した培養液中で１０〜１４日間培養した後、各解析を行った。ＯＣＵＭ−１株は、Ｄ’ＭＥＭ培地に、Ｄ’ＭＥＭ培地に対して１０容量％のＦＣＳを添加した培養液中で１０〜１４日間培養した後、各解析を行った各解析については、具体的には、まず、培養された細胞を回収し、一部をウェスタンブロッティングに用い、残りをＲＴ−ＰＣＲに用いた。
また、対照として、健常人から採取された血液から単離した末梢血単核球（正常末梢血単核球）についても、同様にしてＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を調べた。正常末梢血単核球は、以下のようにして単離した。まず、５ｍＬの全血サンプルに５ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を添加して希釈した後、全量を、予め遠沈管に分取しておいた２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ（登録商標）（ＧＥヘルスケア社製）の上に慎重に積層し、２２℃、２２００ｒｐｍで２０分間遠心分離処理〔最大加速・自然減速（ブレーキなし）条件〕を行った。
遠心分離処理終了後、分離した層を乱さないように、遠沈管から末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣということがある。）層を注意深く取り出し、新しい１５ｍＬ容チューブに回収した。回収したＰＢＭＣ層に対して、ＰＢＳを加え、４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理（最大加速・最大減速条件）し、上清を捨てるという洗浄操作を２回行った。洗浄後のＰＢＭＣ層に適当な量のＰＢＳを加えて懸濁したものを、正常末梢血単核球検体とした。この正常末梢血単核球検体は、ヘマトサイトメーター等で細胞数をカウントし、トリパンブルー染色により生存細胞数を検定した上で、実験に用いた。
ＲＴ−ＰＣＲは、まず、回収された細胞から、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出・精製した。ＲＮＡは分光光度計を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡ濃度を測定した。ｃＤＮＡの合成には、ＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）用ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用し、１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡとランダムプライマーを含む２０μＬの反応液で、２５℃で１０分間、次いで４２℃で４５分間の逆転写反応を行い、その後９５℃で２分間処理して逆転写酵素を失活した。すべてのＰＣＲには、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、合成されたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号８で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９で表される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて２０μＬの反応液で、ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ｍｏｄｅｌ ＰＴＣ ２００、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲを行った。なお、このプライマーセットは、２１８ｂｐのＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントを増幅するように設計されたプライマーセットである。さらに、コントロールとして、このプライマーセットに代えて、２５３ｂｐのＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントを増幅するように設計された、配列番号１０で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１で表される塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーセットを用いた以外は全て同様にしてＰＣＲを行った。反応条件は、１サイクルを９６℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間とし、これを２８サイクル行った。ＬＩＸ１ＬとＧＡＰＤＨの両方を増幅させて得られた増幅産物を１．５％のアガロースゲルにアプライして電気泳動を行い、分離された核酸をエチジウムブロマイド染色した。エチジウムブロマイド染色像中のＬＩＸ１Ｌのバンドについては、そのシグナル強度をデンシトメトリーを用いて測定し、シグナル強度の相対値を算出した。また、すべての定量的ＰＣＲ反応には、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを用い、合成されたｃＤＮＡ、ＬＩＸ１Ｌプライマーを含む２５μＬの反応液でＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、定量を行った。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現も確認した。反応条件は、１サイクルを９５℃で５秒間、６０℃で２０秒とし、これを４５サイクルで行った。この結果、シグナル強度の相対値は、正常末梢血単核球検体が０．１、ＫＡＴＯ−III株が０．９±０．１８、ＯＣＵＭ−１株が１．５±０．２７であった。
ウェスタンブロッティングは、回収された細胞にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加えて超音波破砕処理を行った。得られたスラリーを１２％のアクリルアミドゲルにアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、蛋白質を分離した。電気泳動後のアクリルアミドゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜へ転写し、この転写膜に対して、非特異的反応を抑えるために、５％スキムミルク、１％ＢＳＡ溶液を用いて１時間室温でブロッキングを行った。その後転写膜を、一次抗体として抗ＬＩＸ１Ｌウサギポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ社製）で室温で２時間処理し、二次抗体としてぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（製品名：Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で室温にて１時間処理を行い、ウェスタンブロッティングを行った。コントロールとして、この転写膜に対してさらに、一次抗体として抗Ａｃｔｉｎマウスモノクローナル抗体（製品名：Ｃ−４、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、二次抗体としてぺルキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（製品名：ＮＸＡ９３１、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてウェスタンブロッティングを行った。バンドはＥＣＬ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）にて可視化を行った。
図３Ａは、各細胞株におけるＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物について電気泳動を行い、分離した核酸をエチジウムブロマイドで染色した染色像を示す。図３Ｂは、各細胞株の図３Ａの染色像中のＬＩＸ１Ｌのバンドのシグナル強度から求めたＬＩＸ１ＬのｍＲＮＡ量の相対値（ＫＡＴＯ−III株のＬＩＸ１ＬのｍＲＮＡ量を１とした。）を示す。図３Ｃは、各細胞株について、ウェスタンブロッティングで検出されたＬＩＸ１ＬとＡｃｔｉｎのバンドを示す。この結果、ＫＡＴＯ−III株とＯＣＵＭ−１株では、蛋白質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方において、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現亢進が認められた。ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現は、ＯＣＵＭ−１株のほうがＫＡＴＯ−III株よりも高かった。
［参考例４］
造血器腫瘍の細胞株について、ウェスタンブロット法及びＲＴ−ＰＣＲ法により、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量を蛋白質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方から定量的に測定し、比較した。ウェスタンブロット法及びＲＴ−ＰＣＲ法は、胃癌の細胞株に代えて造血器腫瘍の細胞株を用いた以外は、参考例３と同様にして行った。
造血器腫瘍の細胞株としては、急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０株、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２株、及び多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６株を用いた。ＨＬ−６０株とＫ５６２株は未分化型腫瘍であり、ＲＰＭＩ８２２６株は分化型腫瘍である。全ての細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＲＰＭＩ１６４０培地に対して１０容量％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加した培養液中で１０日間培養した後、各解析を行った。
図４Ａは、各細胞株におけるＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物について電気泳動を行い、分離した核酸をエチジウムブロマイド染色した染色像を示す。図４Ｂは、各細胞株の図４Ａの染色像中のＬＩＸ１Ｌのバンドのシグナル強度から求めたＬＩＸ１ＬのｍＲＮＡ量の相対値を示す（ＧＡＰＤＨのバンドのシグナル強度を１とした。）。図４Ｃは、各細胞株におけるウェスタンブロッティングで検出されたＬＩＸ１ＬとＡｃｔｉｎのバンドを示す。
各造血器腫瘍細胞株のエチジウムブロマイド染色の染色像中のＬＩＸ１Ｌのバンドのシグナル強度の相対値は、ＧＡＰＤＨのバンドのシグナル強度を１としたとき、骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞が０．１、ＨＬ−６０株が１．７±０．２１、Ｋ５６２株が１．８±０．３５、ＲＰＭＩ８２２６株が０．２±０．０３であった。
つまり、蛋白質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方において、未分化型腫瘍であるＨＬ−６０株とＫ５６２株は、分化型腫瘍であるＲＰＭＩ８２２６株と比較して、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量は顕著に多く、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現亢進が認められた。
［実施例１］
ＬＩＸ１Ｌ蛋白質の癌細胞での分子生物学的な役割について検討するため、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子に対する２種類のｓｈＲＮＡ（＃１及び＃２）を作製し、これらをＨＬ−６０株、Ｋ５６２株、ＫＡＴＯ−III株及びＯＣＵＭ−１株に導入し、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現抑制が細胞増殖に与える効果を検討した。ＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃１及び＃２の塩基配列を図５Ａ及びＢに示す。図５Ａ及びＢ中、「Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」はＬＩＸ１ＬのｍＲＮＡと相同的な領域を示し、「Ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と相補的な領域を示す。また、比較対象として、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現抑制能をもたないスクランブルｓｈＲＮＡも用いた。
なお、ＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃１及び＃２は、化学合成により作製することができる。
具体的には、各細胞株あたり１プレート（６ウェル／プレート）ずつ、細胞密度が１×１０４細胞／３．５ｃｍウェルとなるように播いた細胞を１晩前記参考例に記載の培養液と同じ組成の培養液で培養した。６ウェルのうち１ウェルについては培養を終了し、トリパンブルー染色し、生細胞の細胞数を数えた。残る５ウェルについては、培養液を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ（１２．５μＬ／ウェル）とｓｈＲＮＡ濃度が２．５μｇ／ウェルとなる培養液（２ｍＬ／ウェル）の混合液に交換して培養し、１ウェルは培地交換から２４時間後に、１ウェルは４８時間後に、残る１ウェルは７２時間後に、それぞれトリパンブルー染色し、生細胞の細胞数を数えた。コントロールとして、ｓｈＲＮＡを添加しない培養液に培地交換した以外は同様にして培養し、生細胞数を測定した（未処理）。
また、これとは別に、ＲＴ−ＰＣＲを行うために、各細胞株あたり１プレート（６ウェル／プレート）ずつ、細胞密度が１×１０４細胞／３．５ｃｍウェルとなるように播いた細胞を前記参考例に記載の培養液と同じ組成の培養液で１晩培養した。その後、培養液を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ（１２．５μＬ／ウェル）とｓｈＲＮＡ濃度が２．５μｇ／ウェルとなる培養液（２ｍＬ／ウェル）の混合液に交換して７２時間培養して細胞を回収した。回収された細胞に対して、参考例３と同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントとＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントを増幅させ、得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、分離された核酸のエチジウムブロマイド染色像を得た。コントロールとしては、ｓｈＲＮＡを添加しない培養液に培地交換した以外は同様にして培養し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、エチジウムブロマイド染色像を得た（未処理）。
図６Ａ〜図９Ｃに、各細胞株の測定結果を示す。図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ及び図９Ａは生細胞の細胞数の測定結果を示す。図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ及び図９Ｂは７２時間培養後のＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＬＩＸ１ＬのフラグメントとＧＡＰＤＨのフラグメントのエチジウムブロマイド染色の染色像を示す。図６Ｃ、図７Ｃ、図８Ｃ及び図９Ｃは各細胞株における図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ及び図９Ｂの染色像中のＬＩＸ１Ｌのバンドのシグナル強度から求めたＬＩＸ１ＬのｍＲＮＡ量の相対値（未処理のＬＩＸ１ＬのｍＲＮＡ量を１とした。）を示す。この結果、いずれの細胞株においても、スクランブルｓｈＲＮＡを導入させた細胞の生細胞数とＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量は、ｓｈＲＮＡを導入させなかった未処理の細胞と同程度であったが、ＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃１とＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃２を導入した細胞では、２４時間経過時点までは未処理細胞と比べて生細胞数にあまり差はなかったが、４８時間経過後及び７２時間経過後では、未処理細胞よりも明らかに生細胞数が減少していた。また、７２時間後のＲＴ−ＰＣＲの結果では、ＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃１とＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃２を導入した細胞では、ほとんどＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現はみられず、ＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃１とＬＩＸ１Ｌ ｓｈＲＮＡ＃２によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現が抑制されたことが確認された。これらの結果から、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞であるこれら４種の細胞株においては、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子発現抑制により、細胞増殖の抑制が認められ、ＬＩＸ１Ｌ発現は細胞増殖に関与していることが推測された。また、これらの４種のうち最もＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量が低かったＫＡＴＯ−III株では、他の細胞株よりも細胞増殖抑制効果が小さかった。
［実施例２］
ＬＩＸ１Ｌ蛋白質には、５つのチロシン残基（Ｙ９５、Ｙ１２６、Ｙ１３６、Ｙ１３９、及びＹ２６３）がある。これらのチロシン残基のリン酸化の確率を予測し、Ｙ１３６が最もリン酸化される確率が高いと予想された。そこで、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のアミノ酸配列中、Ｙ１３６とＹ１３９を含むアミノ酸配列と、Ｙ１３６は含まないがＹ１３９を含むアミノ酸配列に対して、それぞれ同一のアミノ酸配列を有するペプチドを化学合成した。これらのペプチドは、配列番号７で表されるＴａｔ配列からなるペプチドのＣ末端と、チロシン残基を含むＬＩＸ１Ｌ蛋白質の部分アミノ酸配列のＮ末端をε−アミノカプロン酸で連結させたペプチドである（ペプチド１：配列番号１２、ペプチド２：配列番号１３）。また、比較対象として、Ｔａｔ配列からなるペプチドのＣ末端にε−アミノカプロン酸を結合させたペプチドも化学合成した（コントロールペプチド：配列番号１４）。これらのペプチドのアミノ酸配列を、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質の部分アミノ酸配列と共に図１０に示す。
ＨＬ−６０株、Ｋ５６２株、ＲＰＭＩ８２２６株、ＫＡＴＯ−III株及びＯＣＵＭ−１株に対して、コントロールペプチド、ペプチド１、又はペプチド２を導入し、細胞増殖に対する影響を調べた。細胞増殖の評価は、ミトコンドリアでの還元反応を利用したＭＴＴ法により行った。
具体的には、まず、９６ウェルマイクロプレートに、細胞密度が５×１０３細胞／ウェルとなるように播いた細胞を１晩前記参考例と同じ組成の培養液で培養た。その後、培養液をペプチド濃度が０〜１００μＭの培養液１００μＬに交換して７２時間培養した。培養後、培養液にＭＴＴ含有ＰＢＳ溶液を添加し、４時間インキュベートした後、各ウェルにイソプロパノール（３４（ｖ／ｖ）％塩酸を含む）１００μＬを入れ、生成されたホルマザンを溶解させた。このマイクロプレートの各ウェルの５７０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーにて測定した。コントロールとしては、ペプチドを添加しない以外は同様にして培養し、ＭＴＴアッセイを行い、５７０ｎｍの吸光度を測定した（未処理）。
各細胞株の５７０ｎｍの吸光度の測定結果を図１１Ａ〜図１１Ｅに示す。この結果、コントロールペプチドを導入させた場合の５７０ｎｍの吸光度は、いずれの細胞株においても、ペプチドを導入させなかった未処理の場合と同様に、濃度を１００μＭまで増大させても特に変化はなく、コントロールペプチドを導入しても細胞増殖に影響がないことが確認された。ペプチド２を導入した場合にも、いずれの細胞株においても、コントロールペプチドと同様に濃度を１００μＭまで増大させても５７０ｎｍの吸光度は特に変化はなかった。これに対して、ペプチド１を導入した場合には、ＨＬ−６０株、Ｋ５６２株、及びＯＣＵＭ−１株では、６．２５μＭ以上の濃度で優位な細胞増殖抑制効果が認められ、ＫＡＴＯ−III株では２５μＭ以上の濃度で優位な細胞増殖抑制効果が認められた。しかしながら、ＲＰＭＩ８２２６株では、ペプチド１についてコントロールペプチドと同様に濃度を１００μＭまで増大させても５７０ｎｍの吸光度は特に変化はなく、ペプチド１による細胞増殖抑制効果は認められなかった。これらの結果から、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のＹ１３６を含む部分領域と同一のアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、Ｙ１３６含有ペプチド）が、ＬＩＸ１Ｌ高発現細胞に対して細胞増殖抑制効果を示すこと、及びこの効果はＬＩＸ１Ｌ低発現細胞では見られないことが示された。さらに、ＬＩＸ１Ｌ高発現細胞の中でも、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現量が比較的高いＨＬ−６０株、Ｋ５６２株、及びＯＣＵＭ−１株では、ＫＡＴＯ−III株よりもペプチド１による細胞増殖抑制効果が高かったことから、Ｙ１３６含有ペプチド等の本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドは、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現レベルによってその増殖抑制効果が異なることが分かり、ＬＩＸ１Ｌ高発現細胞でその増殖抑制効果がより有効であることが推測された。
［実施例３］
ＨＬ−６０株、Ｋ５６２株、及びＲＰＭＩ８２２６株に対して、コントロールペプチド、ペプチド１、又はペプチド２を導入し、細胞増殖に対する影響を調べた。細胞増殖の評価は、実施例１と同様に生細胞数を計測することにより行った。
具体的には、ｓｈＲＮＡ濃度が２．５μｇ／ウェルの培養液（２ｍＬ／ウェル）に代えて、５μＭのコントロールペプチド、ペプチド１、又はペプチド２を含む培養液を用いた以外は、実施例１と同様にして細胞を培養し、生細胞数を測定した。コントロールとして、ペプチド２を含まない培養液を用いて同様に培養し、生細胞数を測定した（未処理）。
図１２Ａ〜図１２Ｃに、各細胞株の生細胞数の測定結果を示す。この結果、いずれの細胞株においても、コントロールペプチドを導入した場合とペプチド２を導入した場合には、７２時間経過時点においても、ペプチドを導入させなかった未処理の場合と同程度の細胞が生存していた。一方で、ペプチド１を導入した場合には、ＨＬ−６０株とＫ５６２株では２４時間培養後の時点で既に未処理の場合よりも生細胞数が減少しており、７２時間培養後には生細胞は極わずかであった。これに対して、ＲＰＭＩ８２２６株では、ペプチド１を導入した場合にも、未処理の場合と同程度の細胞が生存していた。これらの結果からも、ＬＩＸ１Ｌ高発現細胞にペプチド１をはじめとする本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを導入することによって、細胞増殖が抑制されることが示された。
［実施例４］
実施例２及び３で用いたペプチド１は、Ｙ１３６含有部分配列が１１アミノ酸からなる。そこで、Ｙ１３６含有部分配列が２０アミノ酸からなるペプチド３（配列番号１５）と、Ｙ１３６含有部分配列が３０アミノ酸からなるペプチド４（配列番号１６）とを化学合成により作製し、細胞増殖抑制効果をペプチド１と比較した。図１３Ａに、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のアミノ酸配列と、図１３Ｂにペプチド１、３、４及びコントロールペプチドのアミノ酸配列を示す。図１３Ａには、ペプチド１、３、４のＹ１３６含有部分配列を示す。
ペプチドを導入する細胞株としては、Ｕ９３７株、Ｋ５６２株、及びＲＰＭＩ８２２６株を用いた。Ｕ９３７株は、Ｋ５６２株と同程度のＬＩＸ１Ｌ発現が確認されたＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞である。
具体的には、添加するペプチドをペプチド１、３、４又はコントロールペプチドとした以外は、実施例２と同様にして、細胞を７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを行い、５７０ｎｍの吸光度を測定した。
各細胞株の５７０ｎｍの吸光度の測定結果を図１４Ａ〜図１４Ｃに示す。この結果、Ｕ９３７株及びＫ５６２株では、ペプチド１、３、又は４を導入したことにより細胞増殖が抑制された。Ｕ９３７株及びＫ５６２株におけるペプチド１、３、４の細胞増殖抑制効果は、いずれも同程度であった。また、ＲＰＭＩ８２２６株では、ペプチド１、３、又は４を導入しても、コントロールペプチドと同様に細胞増殖は抑制されなかった。
［参考例５］
ＨＥＫ２９３株にＦＬＡＧタグをつけたＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させ、ＬＩＸ１Ｌ蛋白質の細胞内局在、並びにセリン、スレオニン、及びチロシンのリン酸化の有無について調べた。
まず、ＦＬＡＧタグがＮ末端に付加されたＬＩＸ１Ｌ蛋白質（ＦＬＡＧ／ＬＩＸ１Ｌ蛋白質、配列番号１７）を強制的に発現させた恒常発現株（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）と、ＦＬＡＧ蛋白質のみを強制的に発現させた恒常発現株（２９３ＦＬＧ）を作製した。恒常発現株は、Ｆｌｐ−ｉｎ（登録）商標システム （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。
具体的には、まず、発現ベクターとしてプラスミドｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｖ６０１０−２０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、プラスミドｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩサイトにＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ融合遺伝子を挿入して、ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ５／ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＦＲＴ）を作製した。ｐｃＤＮＡ５／ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＦＲＴとＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターであるｐＯＧ４４（Ｖ６００５−２０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株（ゲノム中にＦＲＴ部位が１ヶ所含まれているＦｌｐ−Ｉｎホストセル）（Ｒ７５０−０７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｋｉｔ（Ｖ６００５−２０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて遺伝子導入し、終濃度１００ｍｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加した１０％ＦＣＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地により４週間培養し、目的遺伝子が染色体内に挿入された細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ細胞）を選択的に増殖させた。対照として、コントロールベクター（ｐｃＤＮＡ５／ＦＬＧ／ＦＲＴ）のみを遺伝子導入した細胞（２９３ＦＬＧ細胞）を同時に培養増殖させた。
次いで、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ細胞及び２９３ＦＬＧ細胞を、それぞれ、１００ｍｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂを添加した１０％ＦＣＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地で１０〜１４日間培養した後、Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用いて、核分画と細胞質分画に分離した。得られた両分画に対して、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製）とアガロース結合プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製）を用いて免疫沈降し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質分離を行い、膜に転写した。転写した膜に対して、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＬＩＸ１Ｌ抗体（Ａｂｎｏｖａ社製）、抗リン酸化スレオニン抗体（Ａｂｃａｍ社製）、抗リン酸化セリン抗体（Ａｂｃａｍ社製）、及び抗リン酸化チロシン抗体（Ａｂｃａｍ社製）を用いてウエスタンブロットを行った。
図１５に、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降物のウェスタンブロットの結果を示す。この結果、ＦＬＡＧ／ＬＩＸ１Ｌ蛋白質は細胞質画分と核画分の両方に存在していることがわかった。また。両画分に存在するＦＬＡＧ／ＬＩＸ１Ｌ蛋白質はいずれもチロシンがリン酸化されていたが、セリンやスレオニンのリン酸化は確認されなかった。
［参考例６］
参考例５で作製した２９３ＦＬＧと２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ、ＮＵＧＣ−４株（胃癌細胞株）、ＭＫＮ４５株（胃癌細胞株）、Ｋ５６２株（慢性骨髄性白血病細胞株）、ＨＬ−６０株（急性骨髄性白血病細胞株）、及びＵ９３７株（急性骨髄性白血病細胞株）について、ＰＣＲを用いてＬＩＸ１Ｌの発現量を調べた。
２９３ＦＬＧは、参考例５と同様にして、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にプラスミドｐｃＤＮＡ５／ＦＬＧ／ＦＲＴを導入してＦＬＡＧ蛋白質を強制発現させた細胞を回収した。２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌも参考例５と同様にして、Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３株にＦＬＡＧ／ＬＩＸ１Ｌ蛋白質発現用ベクター（ｐｃＤＮＡ５／ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＦＲＴ）を導入してＦＬＡＧ／ＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞を回収した。Ｋ５６２株、ＨＬ−６０株、ＮＵＧＣ−４株、ＭＫＮ４５株、及びＵ９３７株については、ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＲＰＭＩ１６４０培地に対して１０容量％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を添加した培養液中で１０〜１４日間培養した細胞を回収した。
ＰＣＲのサイクル数を２４、２５、又は２７サイクルとした以外は参考例３と同様にして、回収した細胞から、総ＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲによって２１８ｂｐのＬＩＸ１Ｌ遺伝子のｃＤＮＡのフラグメントとＧＡＰＤＨのｃＤＮＡのフラグメントとを増幅し、得られた増幅産物を電気泳動し、分離された核酸をエチジウムブロマイド染色した。
図１６Ａ、Ｂ及びＣに、エチジウムブロマイド染色の染色像を示す。この結果、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌが最もＬＩＸ１Ｌの発現量が多く、２９３ＦＬＧ、Ｋ５６２株、ＨＬ−６０株、及びＵ９３７株が同程度の発現量であり、ＮＵＧＣ−４株では２５サイクルの時点でほとんどＬＩＸ１Ｌの発現は確認できなかった。ＭＫＮ４５株のＬＩＸ１Ｌ発現量は、Ｋ５６２株等よりは少ないものの、ＮＵＧＣ−４株よりも明らかに多かった。
［実施例５］
参考例６においてＬＩＸ１Ｌの発現量を調べた７株について、実施例３と同様にして、コントロールペプチド又はペプチド１を導入し、細胞増殖に対する影響を調べた。細胞増殖の評価は、実施例１と同様に生細胞数を計測する方法と、実施例２と同様にＭＴＴアッセイを行う方法とにより行った。
生細胞数を計測する方法は、２５μＭ（ＨＬ−６０株、Ｋ５６２株、及びＵ９３７株は１０μＭ）のコントロールペプチド又はペプチド１を含む培養液を用いた以外は、実施例１と同様にして細胞を３日間培養し、生細胞数を測定した。対照として、ペプチドを含まない培養液を用いて同様に培養し、生細胞数を測定した（未処理）。
また、ＭＴＴアッセイを行う方法は、添加するペプチドを２５μＭ（ＨＬ−６０株、Ｋ５６２株、及びＵ９３７株は１０μＭ）のコントロールペプチド又はペプチド１とした以外は、実施例２と同様にして、細胞を７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを行い、５７０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、ペプチドを含まない培養液を用いて同様に培養し、ＭＴＴアッセイを行った（未処理）。
図１７Ａ〜図１９Ｃに、各細胞株の生細胞数の測定結果（左）及びＭＴＴアッセイの結果（右）（５７０ｎｍの吸光度）を示す。この結果、ＦＬＡＧ／ＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌでは、ペプチド１の導入により細胞増殖が抑制されていたが（図１７Ｂ）、ＦＬＡＧ蛋白質のみを強制発現させた２９３ＦＬＧでは、ペプチド１を導入しても細胞増殖は抑制されていなかった（図１７Ａ）。また、参考例６においてＬＩＸ１Ｌの発現量が多いことが確認されたＭＫＮ４５株（図１８Ａ）、ＨＬ−６０株（図１９Ａ）、Ｋ５６２株（図１９Ｂ）、及びＵ９３７株（図１９Ｃ）はペプチド１の導入により細胞増殖が抑制されていたが、ＬＩＸ１Ｌの発現がほとんど観察されなかったＮＵＧＣ−４株では、ペプチド１を導入しても細胞増殖は抑制されなかった（図１８Ｂ）。
［実施例６］
参考例５で作製した２９３ＦＬＧ及び２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ、並びに２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌにペプチド１を導入した細胞について、それぞれコロニーの形成数を比較した。
具体的には、２９３ＦＬＧは１プレート（６ウェル／プレート）、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌは２プレートに、細胞密度が１×１０４細胞／３．５ｃｍウェルとなるように播いた。このうち、２９３ＦＬＧを播いたプレートと、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌを播いたプレートのうちの１枚については、１０容量％ＦＣＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地中で１４日間培養した。２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌを播いたプレートのうちの残る１枚については、２５μＭとなるようにペプチド１を含有させた１０容量％ＦＣＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地中で１４日間培養した。培養後の各ウェルを顕微鏡下で観察し、形成されたコロニーの数を測定した。
測定結果を図２０に示す。２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌではコロニー形成数の増加が優位に認められ、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌにペプチド１を導入した細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ペプチド１）ではコロニー数は抑制されることがわかった。
［実施例７］
癌細胞株を移植した癌モデルマウスに、ペプチド１を投与し、影響を観察した。
１０匹の雄の７週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ、日本クレア株式会社から購入）の飼育を開始し、３１日目に、別途培養していたＭＫＮ４５細胞株を皮下に注入することによって移植した。移植当日を０日目として移植１４日目に、５匹ずつ２群（ペプチド１投与群及びコントロールペプチド投与群）に分け、それぞれの群で５匹のうち４匹を選抜し、ペプチド１又はコントロールペプチドを投与した。残る１匹は予備とした。ペプチド１投与群には、３０μＭのペプチド１溶液（ペプチド１をＰＢＳ（−）に溶解させた後、メチルセルロース溶液を加えて調製した溶液）を１００μＬずつ３日おきに４回、腫瘍部（ＭＫＮ４５細胞株を注入した部位）に皮下注射した。コントロールペプチド投与群は、３０μＭのコントロールペプチド溶液（コントロールペプチドをＰＢＳ（−）に溶解させた後、メチルセルロース溶液を加えて調製した溶液）を１００μＬずつ、ペプチド１投与群と同日に４回、腫瘍部に皮下注射した。
各マウスについて、ペプチド溶液を投与した時点（日）と腫瘍部の体積（ｍｍ３）を経時的に測定した結果を図２１に示す。腫瘍部の体積は、マウスの外観から判別される腫瘍部の幅と長さを測定し、下記式で算出した。
［腫瘍部の体積（ｍｍ３）］＝（［腫瘍部の幅（ｍｍ）］２×［腫瘍部の長さ（ｍｍ）］）／２
なお、ここで言う「腫瘍部の幅」とは、腫瘍により皮膚が盛り上がった部分の最大幅を意味し、「腫瘍部の長さ」とは、腫瘍により皮膚が盛り上がった部分の最大の長さを意味する。
この結果、コントロールペプチド投与群では経時的に腫瘍部の体積は大きくなっていたのに対して、ペプチド１投与群では、腫瘍部の大きさはほとんど変化せず、生物個体内においてもペプチド１が抗腫瘍効果を有することが観察された。また、体重については、コントロールペプチド投与群とペプチド１投与群はいずれも、何も投与しなかった予備のマウスと特に有意差はなかった。
［参考例７］
ペプチド１が実際に細胞内に取り込まれているかどうかを確認するため、ペプチド１のＣ末端に蛍光物質ＦＡＭを結合させたＦＡＭ標識ペプチド１を腫瘍細胞株へ導入し、ＦＡＭの蛍光を指標として細胞内への取り込みの有無を観察した。
具体的には、参考例５で作製した２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ、ＭＫＮ４５株、及びＮＵＧＣ−４株の培養液にそれぞれ、２０μＭとなるようにＦＡＭ標識ペプチド１を添加して培養した。ＦＡＭ標識ペプチド１添加から２時間経過後に、培養液にさらに核染色剤Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所製）を添加して６０分間培養した。その後、各細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
この結果、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１ＬとＭＫＮ４５株とＮＵＧＣ−４株のいずれにおいても、ＦＡＭ標識ペプチド１が細胞内に取り込まれていることが確認できた。特に、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１ＬとＭＫＮ４５株では、添加から２時間経過後には９０％以上の細胞にＦＡＭ標識ペプチド１が取り込まれていた。また、３株の全てにおいて、細胞内に取り込まれたＦＡＭ標識ペプチド１のほとんどは細胞質に認められた。
［実施例８］
ＬＩＸ１Ｌ蛋白質中の５つのチロシン残基のうち、Ｙ９５、Ｙ１３６、及びＹ１３９がリン酸化されることが予想された。そこで、表１に示す４種のペプチドについて、実施例２と同様にＭＴＴアッセイを行い、細胞増殖に対する影響を調べた。表１中、「Ｘ」はε−アミノカプロン酸を示す。また、ペプチドを導入する細胞としては、参考例５で作製した２９３ＦＬＧと２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ、Ｋ５６２株、ＭＫＮ４５株、及びＮＵＧＣ−４株を用いた。
具体的には、添加するペプチドをペプチド１、２、５又は６とした以外は、実施例２と同様にして、細胞を７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを行い、５７０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、ペプチドを含まない培養液を用いて同様に培養し、ＭＴＴアッセイを行った（未処理）。
図２２Ａ〜図２２Ｅに、各細胞株のＭＴＴアッセイの結果を示す。この結果、ペプチド１とペプチド５を添加した場合には、添加するペプチドの濃度を高くすることによりいずれの細胞株においても細胞増殖が抑制される傾向が観察されたが、ペプチド２とペプチド６では、２５０μＭ添加した場合でも細胞増殖は抑制されなかった。
［比較例１］
ＬＩＸ１Ｌ蛋白質には、２６個のセリン残基がある。これらのセリン残基のリン酸化の確率を予測し、リン酸化が高いと予想された１１個（Ｓ１６、Ｓ１６３、Ｓ１７９、Ｓ１９０、Ｓ１９２、Ｓ２２６、Ｓ２５５、Ｓ２８２、Ｓ２８６、Ｓ２９２、及びＳ２９７）について、表２に示すペプチドを合成し、実施例２と同様にＭＴＴアッセイを行い、細胞増殖に対する影響を調べた。表２中、「Ｘ」は表１と同じである。また、ペプチドを導入する細胞としては、参考例５で作製した２９３ＦＬＧと２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ、Ｋ５６２株、ＭＫＮ４５株、及びＮＵＧＣ−４株を用いた。
具体的には、添加するペプチドをペプチド７〜１４とした以外は、実施例２と同様にして、細胞を７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを行い、５７０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、ペプチドを含まない培養液を用いて同様に培養し、ＭＴＴアッセイを行った（未処理）。
図２３Ａ〜図２３Ｅに、各細胞株のＭＴＴアッセイの結果を示す。この結果、いずれのペプチドにおいても、全細胞株において、２５０μＭ添加した場合でも細胞増殖は抑制されなかった。
［比較例２］
ＬＩＸ１Ｌ蛋白質には、１３個のスレオニン残基がある。これらのセリン残基のリン酸化の確率を予測し、リン酸化が高いと予想された３個（Ｔ１５、Ｔ２０、及びＴ２９８）について、表３に示すペプチドを合成し、実施例２と同様にＭＴＴアッセイを行い、細胞増殖に対する影響を調べた。表３中、「Ｘ」は表１と同じである。また、ペプチドを導入する細胞としては、参考例５で作製した２９３ＦＬＧと２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ、Ｋ５６２株、ＭＫＮ４５株、及びＮＵＧＣ−４株を用いた。
具体的には、添加するペプチドをペプチド１５又は１６とした以外は、実施例２と同様にして、細胞を７２時間培養し、ＭＴＴアッセイを行い、５７０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、ペプチドを含まない培養液を用いて同様に培養し、ＭＴＴアッセイを行った（未処理）。
図２４Ａ〜図２４Ｂに、各細胞株のＭＴＴアッセイの結果を示す。この結果、いずれのペプチドにおいても、全細胞株において、２５０μＭ添加した場合でも細胞増殖は抑制されなかった。
［実施例９］
ＨＥＫ２９３株にＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ）と、ＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）と、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌにペプチド１（ＰＹ１３６）を導入した細胞（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６）について、それぞれ細胞質と核分画に分離し、免疫沈降とウエスタンブロッティングを用いてペプチド１（配列番号１２）によるＬＩＸ１Ｌのチロシンリン酸化の抑制効果について調べた。また、コロニーフォーメーションアッセイによりコロニー形成抑制効果について調べた。
まず、参考例５と同じ方法にてＦＬＡＧのみを強制発現させた細胞株（２９３ＦＬＧ）と、ＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞株（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ）、ペプチド添加用のＦＬＡＧタグ付きのＬＩＸ１Ｌ蛋白質を強制発現させた細胞株（２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６）を作製し、培養増殖させた。
次いで、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６細胞においては、実施例３と同じ方法により、ペプチド１を含む培養液で１４日間培養した。２９３ＦＬＧ細胞と、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ細胞においては、ペプチド１を含まない培養液を用いて同様に１４日間培養した。
次いで、２９３ＦＬＧ細胞、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ細胞、及び２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６細胞を、それぞれ、１００ｍｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂを添加した１０％ＦＣＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地で１４日間培養した後、Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｃｙｔｏｓｏｌ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用いて、核分画と細胞質分画に分離した。得られた両分画に対して、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製）とアガロース結合プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製）を用いて免疫沈降し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質分離を行い、膜に転写した。転写した膜に対して、抗ＬＩＸ１Ｌ抗体（Ａｂｎｏｖａ社製）及び抗リン酸化チロシン抗体（Ａｂｃａｍ社製）を用いてウエスタンブロットを行った。
図２５Ａに、抗ＬＩＸ１Ｌ抗体及び抗リン酸化チロシン抗体による免疫沈降物のウェスタンブロットの結果を示す。この結果、ペプチド１で処理した２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６細胞の細胞質分画では、ＬＩＸ１Ｌの１３６番目のチロシンのリン酸化が有意に抑制されていることがわかった。また、核分画においてもＬＩＸ１Ｌの１３６番目のチロシンのリン酸化が軽度に抑制されていることがわかった。
コロニーフォーメーションアッセイは０．６％アガロース及び１０％ＦＣＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地の上に、２９３ＦＬＧ細胞、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ細胞、及び２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６細胞をそれぞれ、０．４％アガロースを添加した１０％ＦＣＳ含有Ｄ’ＭＥＭ培地に混ぜて静かに乗せ、１４日間培養した。その後それぞれのウェルにおけるコロニー数を光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製）にて数えることによりＬＩＸ１ＬおよびＰＹ１３６の細胞増殖に与える影響を評価した。
図２５Ｂに、２９３ＦＬＧ細胞、２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ細胞、及び２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６細胞においてコロニーフォーメーションアッセイを行った結果を示す。この結果、ペプチド１で処理した２９３ＦＬＧ／ＬＩＸ１Ｌ／ＰＹ１３６細胞ではコロニー形成が有意に抑制されることがわかった。
本発明に係る腫瘍細胞増殖抑制ペプチド及びＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法を用いることにより、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖を阻害し得ることから、この腫瘍細胞増殖抑制ペプチド等は、抗腫瘍剤の開発や製造、及び腫瘍治療の分野で利用が可能であるため、産業上極めて有効である。

Claims (11)

  1. ＬＩＸ１Ｌ遺伝子を高発現している腫瘍細胞（ただし、ヒトの生体内の細胞を除く。）に対して、ＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現又は機能を抑制させる、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法。
  2. ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制する、請求項１に記載のＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法。
  3. ＲＮＡ干渉によりＬＩＸ１Ｌ遺伝子の発現を抑制することが、配列番号３又は４で表される塩基配列を含むｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ、又は前記ｓｈＲＮＡ若しくは前記ｓｉＲＮＡを細胞内で生産するベクターを細胞内に導入すること、を含む、請求項２に記載のＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法。
  4. ＬＩＸ１Ｌ蛋白質のチロシンのリン酸化を、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって、１３６番目のチロシンを含む部分配列を含むペプチドを用いて阻害することを含む、請求項１に記載のＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法。
  5. 配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって、１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドを含み、前記１３６番目のチロシンを含む部分配列が、８個以上、３５個以下のアミノ酸からなる、腫瘍細胞増殖抑制ペプチド。
  6. 配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドと、細胞膜透過能を有する部位とが、直接又は間接的に結合している、腫瘍細胞増殖抑制ペプチド。
  7. 前記１３６番目のチロシンを含む部分配列が、８個以上、３５個以下のアミノ酸からなる、請求項６に記載の腫瘍細胞増殖抑制ペプチド。
  8. 前記細胞膜透過能を有する部位が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項６又は７に記載の腫瘍細胞増殖抑制ペプチド。
  9. 配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドを含む腫瘍細胞増殖抑制ペプチド、又は、請求項５〜８のいずれか一項に記載の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを有効成分とする医薬用組成物。
  10. 抗腫瘍剤である、請求項９に記載の医薬用組成物。
  11. 配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列であって１３６番目のチロシンを含む部分配列からなるポリペプチドを含む腫瘍細胞増殖抑制ペプチド、又は、請求項５〜８のいずれか一項に記載の腫瘍細胞増殖抑制ペプチドを、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞（ただし、ヒトの生体内の細胞を除く。）に導入すること、を含む、ＬＩＸ１Ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法。
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