JP6174861B2 - 皮膚色素沈着抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、皮膚色素沈着抑制物質のスクリーニング方法、及びこの方法により得られた、ＨＧＦによる表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進による色素沈着を抑制するための剤に関する。
皮膚の色素沈着は、様々な要因が関与する複雑なプロセスで構成される生理的現象である。
従来、皮膚への色素沈着を抑制して肌を白くする物質として、メラノサイトによるメラニン顆粒の生成段階を抑制する物質の探求が行われてきた。このような物質として、メラニン合成経路の重要な酵素であるチロシナーゼの活性を阻害するアルブチン、コウジ酸などが知られている（特許文献１〜３）。
従来、皮膚への色素沈着を抑制して肌を白くする物質として、メラノサイトによるメラニン顆粒の生成段階を抑制する物質の探求が行われてきた。このような物質として、メラニン合成経路の重要な酵素であるチロシナーゼの活性を阻害するアルブチン、コウジ酸などが知られている（特許文献１〜３）。
近年、メラノサイトが産生したメラニン顆粒の表皮角化細胞による取り込みが、皮膚への色素沈着を左右する重要なプロセスであり、老化や疾患によりこのプロセスに異常が生じると、過度の皮膚色素沈着を引き起こすことが明らかになった。また、表皮角化細胞によるメラニン顆粒の取り込みを抑制することが、皮膚への色素沈着を効果的に抑制すると考えられている（非特許文献１）。表皮角化細胞によるメラニン顆粒の取り込みを抑制する物質として、ニコチン酸アミド、トラネキサム酸などが知られている（特許文献４）。
しかし、メラニン生成プロセスやメラニン顆粒取り込みプロセスの抑制に着目したスクリーニング方法により得られた色素沈着抑制物質は、化学合成品が多く、また、効果を奏する濃度がｍＭオーダーと高い物質が多い。
従って、皮膚色素沈着に関与する新たなプロセスを抑制する物質をスクリーニングする方法が求められている。
従って、皮膚色素沈着に関与する新たなプロセスを抑制する物質をスクリーニングする方法が求められている。
Expert.Rev.Dermatol.,2011 Feb 1;6(1):97-108
本発明は、皮膚色素沈着に関与する新たなプロセスを抑制する物質をスクリーニングする方法、及びこれにより得られる色素沈着抑制剤を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) 内在性の細胞増殖因子の一つである肝細胞増殖因子（以下「ＨＧＦ」ということもある）が、表皮角化細胞によるメラノソームの取り込みを促進している。
(ii) ＨＧＦの存在下で表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性を低下させる物質は、ＨＧＦ刺激による表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進を抑制し、その結果、皮膚の色素沈着を抑制する。
(iii) ＨＧＦの存在下で表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性を低下させる物質として選択されたルテオリン配糖体、及びルテオリン配糖体を含有する植物の抽出物は、低濃度で、皮膚の色素沈着を効果的に抑制する。
(iv) ＨＧＦ及び表皮角化細胞増殖因子（以下「ＫＧＦ」ということもある）の刺激により表皮角化細胞のメラノソーム取り込みは格段に促進される。従って、ＨＧＦ及びＫＧＦの存在下で表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性を低下させる物質を選択すれば、色素沈着抑制物質の選択の感度が高くなる。
(i) 内在性の細胞増殖因子の一つである肝細胞増殖因子（以下「ＨＧＦ」ということもある）が、表皮角化細胞によるメラノソームの取り込みを促進している。
(ii) ＨＧＦの存在下で表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性を低下させる物質は、ＨＧＦ刺激による表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進を抑制し、その結果、皮膚の色素沈着を抑制する。
(iii) ＨＧＦの存在下で表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性を低下させる物質として選択されたルテオリン配糖体、及びルテオリン配糖体を含有する植物の抽出物は、低濃度で、皮膚の色素沈着を効果的に抑制する。
(iv) ＨＧＦ及び表皮角化細胞増殖因子（以下「ＫＧＦ」ということもある）の刺激により表皮角化細胞のメラノソーム取り込みは格段に促進される。従って、ＨＧＦ及びＫＧＦの存在下で表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性を低下させる物質を選択すれば、色素沈着抑制物質の選択の感度が高くなる。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のスクリーニング方法、及び色素沈着抑制剤を提供する。
項１． (a) 被験物質の存在下又は非存在下で表皮角化細胞を処理し、かつこの処理の前、同時、又は後に表皮角化細胞を肝細胞増殖因子と接触させる工程、
(b) 被験物質存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を、被験物質非存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性と比較する工程、及び
(c) 表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を低下させる被験物質を選択する工程
を含む、皮膚色素沈着抑制物質のスクリーニング方法。
項２． 微粒子がメラノソーム、又は表皮角化細胞が貪食できる微粒子である項１に記載の方法。
項３． 表皮角化細胞が貪食できる微粒子が、メラニン、又は発色物質を含有する高分子微粒子である項２に記載の方法。
項４． 濃度１〜１０００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦの存在下で表皮角化細胞を処理する項１〜３の何れかに記載の方法。
項５． 表皮角化細胞を肝細胞増殖因子と共に表皮角化細胞増殖因子と接触させる項１〜４の何れかに記載の方法。
項６． ルテオリン配糖体、又はルテオリン配糖体を含有する植物抽出物を含む、ＨＧＦによる表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進による皮膚色素沈着を抑制するための剤。
項７． ルテオリン配糖体がルテオリン−７−Ｏ−グルコシドである項６に記載の剤。
項８． ルテオリン配糖体を含有する植物が、ペパーミント、オレンジミント、アップルミント、又はペニーロイヤルミントである項６又は７に記載の剤。
項１． (a) 被験物質の存在下又は非存在下で表皮角化細胞を処理し、かつこの処理の前、同時、又は後に表皮角化細胞を肝細胞増殖因子と接触させる工程、
(b) 被験物質存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を、被験物質非存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性と比較する工程、及び
(c) 表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を低下させる被験物質を選択する工程
を含む、皮膚色素沈着抑制物質のスクリーニング方法。
項２． 微粒子がメラノソーム、又は表皮角化細胞が貪食できる微粒子である項１に記載の方法。
項３． 表皮角化細胞が貪食できる微粒子が、メラニン、又は発色物質を含有する高分子微粒子である項２に記載の方法。
項４． 濃度１〜１０００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦの存在下で表皮角化細胞を処理する項１〜３の何れかに記載の方法。
項５． 表皮角化細胞を肝細胞増殖因子と共に表皮角化細胞増殖因子と接触させる項１〜４の何れかに記載の方法。
項６． ルテオリン配糖体、又はルテオリン配糖体を含有する植物抽出物を含む、ＨＧＦによる表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進による皮膚色素沈着を抑制するための剤。
項７． ルテオリン配糖体がルテオリン−７−Ｏ−グルコシドである項６に記載の剤。
項８． ルテオリン配糖体を含有する植物が、ペパーミント、オレンジミント、アップルミント、又はペニーロイヤルミントである項６又は７に記載の剤。
本発明により、細胞間情報伝達物質の一つであるＨＧＦが、表皮角化細胞によるメラノソーム取り込みを促進していることが明らかとなった。表皮角化細胞によるメラノソーム取り込みを抑制する物質の従来のスクリーニングは、細胞間伝達物質の影響を考慮しない方法で行われていたため、現実の色素沈着を反映したものではなかった。この点、本発明のスクリーニング方法は、ＨＧＦの存在下で、表皮角化細胞によるメラノソーム取り込み活性を抑制する物質を選択するため、選択される物質は、現実の皮膚色素沈着を効果的に抑制できるものである。
また、ＨＧＦ及びＫＧＦの刺激により表皮角化細胞のメラノソーム取り込みは格段に促進される。従って、本発明のスクリーニング方法において、ＨＧＦに加えてＫＧＦの存在下で表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性を低下させる物質を選択すれば、色素沈着抑制物質の選択の感度が高くなる。また、現実の皮膚での表皮角化細胞へのメラノソーム取り込みによる色素沈着を一層正確に反映した状態で、色素沈着抑制物質を選択することができ、より効果的な色素沈着抑制物質の選択の精度が高くなる。
実際に、本発明のスクリーニング方法により得られた色素沈着抑制物質であるルテオリン配糖体は、μＭオーダーの低濃度で、ＨＧＦ存在下での表皮角化細胞によるメラノソーム取り込み活性を顕著に抑制する。従って、ルテオリン配糖体、及びこれを含有する植物の抽出物は、低濃度の使用で、シミ、ソバカス、クスミを効果的に軽減させたり、肌に透明感を与える等、美白剤として有用なものである。
また、ルテオリン配糖体及び植物物抽出物は天然由来の物質であるため、安全性を重視する近年の消費者の嗜好に合致しており、また、安価かつ大量に調製できる点で、従来の美白剤より優れている。
また、ルテオリン配糖体及び植物物抽出物は天然由来の物質であるため、安全性を重視する近年の消費者の嗜好に合致しており、また、安価かつ大量に調製できる点で、従来の美白剤より優れている。
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）スクリーニング方法
本発明の色素沈着抑制物質のスクリーニング方法は、下記の(a)〜(c)の工程を含む方法である。
(a) 被験物質の存在下又は非存在下で表皮角化細胞を処理し、かつこの処理の前、同時、又は後に表皮角化細胞をＨＧＦと接触させる工程、
(b) 被験物質の存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を、被験物質の非存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性と比較する工程、及び
(c) 表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を低下させる被験物質を選択する工程
（Ｉ）スクリーニング方法
本発明の色素沈着抑制物質のスクリーニング方法は、下記の(a)〜(c)の工程を含む方法である。
(a) 被験物質の存在下又は非存在下で表皮角化細胞を処理し、かつこの処理の前、同時、又は後に表皮角化細胞をＨＧＦと接触させる工程、
(b) 被験物質の存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を、被験物質の非存在下で処理した表皮角化細胞の微粒子取り込み活性と比較する工程、及び
(c) 表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を低下させる被験物質を選択する工程
ＨＧＦ
ＨＧＦは、生体内において、肝臓、胎盤、真皮、血小板などから分泌されている。
本発明では、ヒト由来、又は非ヒト動物由来の何れのＨＧＦを用いてもよいが、ヒトＨＧＦを用いることが好ましい。ヒトＨＧＦとしては、配列番号１（ＮＣＢＩ、アクセッション番号 ＮＰ＿０００５９２．３）のアミノ酸配列からなるＨＧＦ、及びこのＨＧＦから５アミノ酸が欠損した配列番号２（ＮＣＢＩ、アクセッション番号ＮＰ＿００１０１９３２．１）のアミノ酸配列からなる５残基欠損ＨＧＦなどの天然型ヒトＨＧＦが挙げられる。
また、本発明のＨＧＦには、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性、中でも９５％以上の同一性、中でも９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ肝細胞増殖活性を有するタンパク質（ヒトＨＧＦ類縁体）も含まれる。また、本発明のＨＧＦには、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において、１個〜数個（例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ肝細胞増殖活性を有するタンパク質（ヒトＨＧＦ類縁体）も含まれる。
ＨＧＦは、生体内において、肝臓、胎盤、真皮、血小板などから分泌されている。
本発明では、ヒト由来、又は非ヒト動物由来の何れのＨＧＦを用いてもよいが、ヒトＨＧＦを用いることが好ましい。ヒトＨＧＦとしては、配列番号１（ＮＣＢＩ、アクセッション番号 ＮＰ＿０００５９２．３）のアミノ酸配列からなるＨＧＦ、及びこのＨＧＦから５アミノ酸が欠損した配列番号２（ＮＣＢＩ、アクセッション番号ＮＰ＿００１０１９３２．１）のアミノ酸配列からなる５残基欠損ＨＧＦなどの天然型ヒトＨＧＦが挙げられる。
また、本発明のＨＧＦには、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性、中でも９５％以上の同一性、中でも９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ肝細胞増殖活性を有するタンパク質（ヒトＨＧＦ類縁体）も含まれる。また、本発明のＨＧＦには、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において、１個〜数個（例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ肝細胞増殖活性を有するタンパク質（ヒトＨＧＦ類縁体）も含まれる。
また、ＨＧＦは、例えば、マウス由来ＨＧＦ（アクセッション番号ＡＡＢ３１８５５、ＮＰ＿０３４５５７、ＢＡＡ０１０６５、ＢＡＡ０１０６４等）、ラット由来ＨＧＦ（アクセッション番号ＮＰ＿５８７１３等）、ウシ由来ＨＧＦ（アクセッション番号ＮＰ＿００１０２６９２１、ＸＰ８７４０８６、ＢＡＤ０２４７５等）、ネコ由来ＨＧＦ（アクセッション番号ＮＰ＿００１００９８３０、ＢＡＣ１０５４５、ＢＡＢ２１４９９等）、イヌ由来ＨＧＦ（アクセッション番号ＮＰ＿００１００２９６４、ＢＡＣ５７５６０等）、又はチンパンジー由来ＨＧＦ（アクセッション番号ＸＰ５１９１７４等）などの非ヒト動物のＨＧＦ、又はこれらの類縁体であってもよい。非ヒト動物のＨＧＦの類縁体の定義は、ヒトＨＧＦの類縁体の定義と同じである。
ＨＧＦは、これを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離し、必要に応じて精製することにより得られる。また、遺伝子工学的手法により、ＨＧＦをコードする遺伝子をベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入し、この形質転換体の培養上清液から分離することによっても得られる。また、PEPROTECH社などから市販されている。
被験物質
被験物質の種類は、特に限定されず、低分子化合物、植物、動物、微生物などの天然物の抽出物、タンパク質、ペプチド、核酸、合成高分子化合物などが挙げられる。
被験物質の種類は、特に限定されず、低分子化合物、植物、動物、微生物などの天然物の抽出物、タンパク質、ペプチド、核酸、合成高分子化合物などが挙げられる。
表皮角化細胞
表皮角化細胞は、ヒト又は非ヒト動物由来の何れの表皮角化細胞であってもよいが、ヒト表皮角化細胞が好ましい。
表皮角化細胞は、ヒト又は非ヒト動物由来の何れの表皮角化細胞であってもよいが、ヒト表皮角化細胞が好ましい。
処理方法
工程(a)では、ＨＧＦを接触させた表皮角化細胞を被験物質の存在下又は非存在下で処理する。処理は、例えば約２８〜４０℃、好ましくは約３５〜３７℃で、例えば約１〜９２時間、好ましくは約１〜２４時間静置することにより行える。即ち、表皮角化細胞を、被験物質を含む媒体、及び被験物質を含まない他はこれと同じ媒体と、それぞれ、接触することにより行える。
この処理は、表皮角化細胞を生存させておくことができる媒体中で行えばよく、例えば、細胞培養用の培地、又は繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、脳下垂体抽出物、ブドウ糖、アミノ酸等を添加した緩衝液中で行えばよい。好ましくは、細胞培養用の培地、例えば、ＨＫＧＳなどのサプリメントを含有したＥｐｉｌｉｆｅ(ＧＩＢＣＯ社)などの市販されている表皮角化細胞培養液等の中で行えばよい。 被験物質による処理濃度は、被験物質の種類によって異なるが、約０．００００１〜１０００μｇ／ｍＬが好ましく、約０．００１〜５００μｇ／ｍＬがより好ましい。上記範囲であれば、過剰量の被験物質を使用せずに、十分なスクリーニング感度が得られる。
工程(a)では、ＨＧＦを接触させた表皮角化細胞を被験物質の存在下又は非存在下で処理する。処理は、例えば約２８〜４０℃、好ましくは約３５〜３７℃で、例えば約１〜９２時間、好ましくは約１〜２４時間静置することにより行える。即ち、表皮角化細胞を、被験物質を含む媒体、及び被験物質を含まない他はこれと同じ媒体と、それぞれ、接触することにより行える。
この処理は、表皮角化細胞を生存させておくことができる媒体中で行えばよく、例えば、細胞培養用の培地、又は繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、脳下垂体抽出物、ブドウ糖、アミノ酸等を添加した緩衝液中で行えばよい。好ましくは、細胞培養用の培地、例えば、ＨＫＧＳなどのサプリメントを含有したＥｐｉｌｉｆｅ(ＧＩＢＣＯ社)などの市販されている表皮角化細胞培養液等の中で行えばよい。 被験物質による処理濃度は、被験物質の種類によって異なるが、約０．００００１〜１０００μｇ／ｍＬが好ましく、約０．００１〜５００μｇ／ｍＬがより好ましい。上記範囲であれば、過剰量の被験物質を使用せずに、十分なスクリーニング感度が得られる。
ＨＧＦと表皮角化細胞との接触は、表皮角化細胞の被験物質の存在下又は非存在下での処理の前、同時、又は後の何れであってもよい。
スクリーニング感度が良くなる点で、ＨＧＦの存在下に、表皮角化細胞を被験物質の存在下又は非存在下で処理するのが好ましい。即ち、ＨＧＦと表皮角化細胞との接触は、表皮角化細胞の被験物質の存在下又は非存在下での処理と同時に行うのが好ましい。この場合、処理は、表皮角化細胞を、被験物質及びＨＧＦを含む媒体、又は被験物質を含まない他はこれと同じ媒体と接触することにより行える。また、表皮角化細胞を被験物質の存在下又は非存在下で処理した後、例えば約０．１〜２４時間後に、表皮角化細胞とＨＧＦとを接触させる場合も、スクリーニング感度が良くなる。
スクリーニング感度が良くなる点で、ＨＧＦの存在下に、表皮角化細胞を被験物質の存在下又は非存在下で処理するのが好ましい。即ち、ＨＧＦと表皮角化細胞との接触は、表皮角化細胞の被験物質の存在下又は非存在下での処理と同時に行うのが好ましい。この場合、処理は、表皮角化細胞を、被験物質及びＨＧＦを含む媒体、又は被験物質を含まない他はこれと同じ媒体と接触することにより行える。また、表皮角化細胞を被験物質の存在下又は非存在下で処理した後、例えば約０．１〜２４時間後に、表皮角化細胞とＨＧＦとを接触させる場合も、スクリーニング感度が良くなる。
ＨＧＦと表皮角化細胞との接触は、表皮角化細胞を生存させておくことができる媒体中で行えばよく、例えば、細胞培養用の培地、又は繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、脳下垂体抽出物、ブドウ糖、アミノ酸等を添加した緩衝液中で行えばよい。好ましくは、細胞培養用の培地、例えば、ＨＫＧＳなどのサプリメントを含有したＥｐｉｌｉｆｅ (ＧＩＢＣＯ社)などの市販されている表皮角化細胞培養液等の中で行えばよい。
この接触は、例えば約２８〜４０℃、好ましくは約３５〜３７℃で、例えば約１〜９６時間、好ましくは約１〜２４時間行えばよい。
この接触は、例えば約２８〜４０℃、好ましくは約３５〜３７℃で、例えば約１〜９６時間、好ましくは約１〜２４時間行えばよい。
表皮角化細胞と接触させるＨＧＦの濃度は、約１〜１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、約５〜５００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、約１０〜１００ｎｇ／ｍＬがさらにより好ましい。上記範囲であれば、過剰量のＨＧＦを使用せずに、十分なスクリーニング感度が得られる。
ＫＧＦ
本発明方法では、ＨＧＦと共にＫＧＦを表皮角化細胞と接触させるのが好ましい。これにより、ＨＧＦ単独の時に比べて、スクリーニング感度が格段に向上する。即ち、僅かなメラノソーム取り込み抑制活性しかない物質でも検出することができる。
本発明では、ヒト由来、又は非ヒト動物由来の何れのＫＧＦを用いてもよいが、ヒトＫＧＦを用いることが好ましい。ヒトＫＧＦとしては、配列番号３（ＮＣＢＩ，アクセッション番号ＮＰ＿００２０００．１）のアミノ酸配列からなる天然型のＫＧＦが挙げられる。また、配列番号３のアミノ酸配列からなるＫＧＦの類縁体も使用できる。類縁体の定義は、ヒトＨＧＦについて述べたのと同じである。
本発明方法では、ＨＧＦと共にＫＧＦを表皮角化細胞と接触させるのが好ましい。これにより、ＨＧＦ単独の時に比べて、スクリーニング感度が格段に向上する。即ち、僅かなメラノソーム取り込み抑制活性しかない物質でも検出することができる。
本発明では、ヒト由来、又は非ヒト動物由来の何れのＫＧＦを用いてもよいが、ヒトＫＧＦを用いることが好ましい。ヒトＫＧＦとしては、配列番号３（ＮＣＢＩ，アクセッション番号ＮＰ＿００２０００．１）のアミノ酸配列からなる天然型のＫＧＦが挙げられる。また、配列番号３のアミノ酸配列からなるＫＧＦの類縁体も使用できる。類縁体の定義は、ヒトＨＧＦについて述べたのと同じである。
ＫＧＦは、これを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離し、必要に応じて精製することにより得られる。また、遺伝子工学的手法により、ＫＧＦをコードする遺伝子をベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入し、この形質転換体の培養上清液から分離することによっても得られる。また、PEPROTECH社などから市販されている。
表皮角化細胞と接触させるＫＧＦの濃度は、約１〜１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、約５〜５００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、約１０〜１００ｎｇ／ｍＬがさらにより好ましい。上記範囲であれば、過剰量のＫＧＦを使用せずに、十分にスクリーニング感度を向上させることができる。
微粒子
微粒子は、メラノソーム、又は表皮角化細胞が貪食できる微粒子であればよく、特に限定されない。表皮角化細胞が貪食できる微粒子は、表皮角化細胞に貪食されるメラノソーム貪食を模倣したものである。
微粒子としてメラノソーム自体を用いる場合、メラノソームは、メラノサイト（色素細胞）、好ましくはヒト由来のメラノサイトのホモジネートから調製できる。
表皮角化細胞とメラノソームとを約１〜１２０時間接触させた後に、メラノソーム取り込み活性を検出又は定量すればよい。表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性は、例えば、取り込み後の細胞をリン酸緩衝液など適当な緩衝液で十分に洗浄した後、遠心等の操作で細胞を集め、該細胞を溶解させ（例えば、２Ｎ ＮａＯＨ溶液、あるいは1％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ溶液で溶解させ）、その溶液の４０５ｎｍの波長の光に対する吸収を指標として定量評価が出来る。あるいは、フォンタナ・マッソン染色で表皮角化細胞を染色し、黒〜茶褐色に染色された部分の面積を光学顕微鏡で観察することにより検出又は定量できる。フォンタナ・マッソン染色は、メラノソームが銀イオンを吸着して還元する性質を利用した染色法である。
微粒子は、メラノソーム、又は表皮角化細胞が貪食できる微粒子であればよく、特に限定されない。表皮角化細胞が貪食できる微粒子は、表皮角化細胞に貪食されるメラノソーム貪食を模倣したものである。
微粒子としてメラノソーム自体を用いる場合、メラノソームは、メラノサイト（色素細胞）、好ましくはヒト由来のメラノサイトのホモジネートから調製できる。
表皮角化細胞とメラノソームとを約１〜１２０時間接触させた後に、メラノソーム取り込み活性を検出又は定量すればよい。表皮角化細胞のメラノソーム取り込み活性は、例えば、取り込み後の細胞をリン酸緩衝液など適当な緩衝液で十分に洗浄した後、遠心等の操作で細胞を集め、該細胞を溶解させ（例えば、２Ｎ ＮａＯＨ溶液、あるいは1％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ溶液で溶解させ）、その溶液の４０５ｎｍの波長の光に対する吸収を指標として定量評価が出来る。あるいは、フォンタナ・マッソン染色で表皮角化細胞を染色し、黒〜茶褐色に染色された部分の面積を光学顕微鏡で観察することにより検出又は定量できる。フォンタナ・マッソン染色は、メラノソームが銀イオンを吸着して還元する性質を利用した染色法である。
また、表皮角化細胞が貪食できる微粒子として、メラニン（メラニン微粒子）を用いることもできる。メラニンを緩衝液等に懸濁させると、粒子状メラニンの懸濁液が得られる。メラニンは、天然メラニンであってもよく、合成メラニンであってもよい。天然メラニンは、例えば、Ｓｉｇｍａ社から、Ｓｅｐｉａ ｍｅｌａｎｉｎ（イカ由来）などの商品名で市販されている。
表皮角化細胞とメラニンとを約１〜１２０時間接触させた後に、メラニン取り込み活性を検出又は定量すればよい。表皮角化細胞のメラニンの取り込み活性は、例えば、取り込み後の細胞をリン酸緩衝液など適当な緩衝液で十分に洗浄した後、遠心等の操作で細胞を集め、該細胞を溶解させ（例えば、２Ｎ ＮａＯＨ溶液、あるいは1％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ溶液で溶解させ）、その溶液の４０５ｎｍの波長の光に対する吸収を指標として定量評価が出来る。あるいは、黒〜茶褐色に染色された部分の面積を光学顕微鏡で直接観察することにより検出又は定量できる。
表皮角化細胞とメラニンとを約１〜１２０時間接触させた後に、メラニン取り込み活性を検出又は定量すればよい。表皮角化細胞のメラニンの取り込み活性は、例えば、取り込み後の細胞をリン酸緩衝液など適当な緩衝液で十分に洗浄した後、遠心等の操作で細胞を集め、該細胞を溶解させ（例えば、２Ｎ ＮａＯＨ溶液、あるいは1％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ溶液で溶解させ）、その溶液の４０５ｎｍの波長の光に対する吸収を指標として定量評価が出来る。あるいは、黒〜茶褐色に染色された部分の面積を光学顕微鏡で直接観察することにより検出又は定量できる。
また、表皮角化細胞が貪食できる微粒子として、蛍光物質のような着色物質を含有する高分子微粒子を用いることもできる。着色物質を含有する高分子微粒子としては、着色物質と高分子とを混合して成型した微粒子や、着色物質を共重合した高分子微粒子などが挙げられる。高分子は例えばポリスチレンとすることができる。微粒子のレーザー回折散乱法により測定される平均粒子径は、約０．１〜１μｍとすればよい。例えば、蛍光物質を含有する高分子微粒子が、ベイバイオサイエンス社、モレキュラープローブ社などから市販されている。
表皮角化細胞と着色高分子微粒子とを約１〜１２０時間接触させた後に、着色高分子微粒子の取り込み活性を検出又は定量すればよい。蛍光物質を含有する高分子微粒子の取り込み活性は、表皮角化細胞を蛍光顕微鏡観察した後、一細胞当たりに取り込まれた微粒子の数を計数したり、フローサイトメーターを使用すること等により検出、又は定量できる。
表皮角化細胞と着色高分子微粒子とを約１〜１２０時間接触させた後に、着色高分子微粒子の取り込み活性を検出又は定量すればよい。蛍光物質を含有する高分子微粒子の取り込み活性は、表皮角化細胞を蛍光顕微鏡観察した後、一細胞当たりに取り込まれた微粒子の数を計数したり、フローサイトメーターを使用すること等により検出、又は定量できる。
微粒子取り込み活性の比較
表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を、被験物質の有無で比較する場合、両活性を測定した上で測定値を比較してもよく、顕微鏡観察像などを直接比較してもよい。何れにしても、微粒子取り込み活性を低下させる被験物質を選択すればよい。被験物質のうち、微粒子取り込み活性を約９０％以下にする物質を選択するのが好ましく、約７０％以下にする物質を選択するのがより好ましい。
表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を、被験物質の有無で比較する場合、両活性を測定した上で測定値を比較してもよく、顕微鏡観察像などを直接比較してもよい。何れにしても、微粒子取り込み活性を低下させる被験物質を選択すればよい。被験物質のうち、微粒子取り込み活性を約９０％以下にする物質を選択するのが好ましく、約７０％以下にする物質を選択するのがより好ましい。
選択した物質は、ＨＧＦ（又はＨＧＦ及びＫＧＦ）の影響下で表皮角化細胞によるメラノソーム取り込みを抑制するため、実際の皮膚で行われてるＨＧＦ（又はＨＧＦ及びＫＧＦ）刺激による表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進を抑制するものであり、皮膚への色素沈着を抑制し、美白剤として有用である。
（ＩＩ）皮膚色素沈着抑制剤
本発明の皮膚色素沈着抑制剤は、ルテオリン配糖体、又はルテオリン配糖体を含有する植物抽出物を含む剤であり、ＨＧＦ（又はＨＧＦ及びＫＧＦ）による表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進による皮膚での色素沈着を抑制するために使用される。従って、シミ、ソバカス、又はクスミの予防、改善、又は抑制や、透明感の付与等の美白（ホワイトニング）に有用である。
本発明の皮膚色素沈着抑制剤は、ルテオリン配糖体、又はルテオリン配糖体を含有する植物抽出物を含む剤であり、ＨＧＦ（又はＨＧＦ及びＫＧＦ）による表皮角化細胞のメラノソーム取り込み促進による皮膚での色素沈着を抑制するために使用される。従って、シミ、ソバカス、又はクスミの予防、改善、又は抑制や、透明感の付与等の美白（ホワイトニング）に有用である。
ルテオリン配糖体としては、ルテオリンと、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、又はジギトキソース等の糖との配糖体が挙げられる。中でも、ルテオリンとグルコースとの配糖体が好ましく、下記構造式で表されるルテオリン−７−Ｏ−グリコシドがより好ましい。
ルテオリン配糖体を含む植物としては、ペパーミント（セイヨウハッカ）、オレンジミント、アップルミント、ペニーロイヤルミント等のシソ科ハッカ属植物が挙げられる。中でも、メラノソーム取り込み抑制効果が優れる点で、ペパーミント、オレンジミントが好ましい。
ルテオリン配糖体を含む抽出物は、植物の好ましくは乾燥葉を熱水（例えば、約７０〜８５℃）で抽出することにより調製できる。この熱水抽出物から濾過等により固形物を除去し、液体分を回収するか、又はさらに乾燥して乾燥物を回収することによっても調製できる。
ルテオリン配糖体を含む抽出物は、植物の好ましくは乾燥葉を熱水（例えば、約７０〜８５℃）で抽出することにより調製できる。この熱水抽出物から濾過等により固形物を除去し、液体分を回収するか、又はさらに乾燥して乾燥物を回収することによっても調製できる。
本発明の皮膚色素沈着抑制剤は、皮膚外用組成物、特に化粧品組成物とすることができる。化粧品組成物などの皮膚外用組成物は、ルテオリン配糖体、又はこれを含む植物抽出物に、必要に応じて、生理学的若しくは薬学的に許容される化粧品用の担体若しくは基剤、化粧品用の添加剤、及び／又はルテオリン配糖体以外の化粧品用の生理活性成分などを添加して調製できる。
化粧品用の添加剤としては、酸化防止剤、防腐剤、安定化剤、キレート剤、界面活性剤、増粘剤、還元剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、無機塩類、噴射剤、清涼化剤、収斂剤、芳香剤、香料、色素等が挙げられる。
化粧品用の添加剤としては、酸化防止剤、防腐剤、安定化剤、キレート剤、界面活性剤、増粘剤、還元剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、無機塩類、噴射剤、清涼化剤、収斂剤、芳香剤、香料、色素等が挙げられる。
製剤の性状は特に限定されず、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤などが挙げられる。
具体的な商品用途としては、化粧水、乳液、美容液、日焼け止め化粧料、パック、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリーム、洗顔料、メイク落とし等が挙げられる。
具体的な商品用途としては、化粧水、乳液、美容液、日焼け止め化粧料、パック、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリーム、洗顔料、メイク落とし等が挙げられる。
皮膚色素沈着抑制剤中のルテオリン配糖体、又はこれを含む植物抽出物の含有量は、組成物の全量に対して、０．０００００１重量％以上が好ましく、０．００００１重量％以上がより好ましく、０．０００１重量％以上がさらにより好ましい。また、組成物の全量に対して、２０重量％以下が好ましく、１５重量％以下がより好ましく、１０重量％以下がさらにより好ましい。
また、例えば、０．０００００１〜２０重量％が好ましく、０．００００１〜１５重量％がより好ましく、０．０００１〜１０重量％がさらにより好ましい。
皮膚色素沈着抑制剤中の、ルテオリン配糖体を含む植物抽出物の含有量は、ルテオリン配糖体の含有量が上記範囲となるようにすればよい。
上記範囲であれば、皮膚外用組成物の通常の使用量で十分な美白作用が得られる。
使用方法
本発明の皮膚色素沈着抑制剤の使用量は、使用対象の皮膚の状態、年齢、性別などによって異なるが、例えば以下の方法とすればよい。即ち、１日数回（例えば、約１〜５回、好ましくは１〜３回）、１回当たり適量（例えば、約１〜５ｇ）を、顔、首、腕、手、足、指などの皮膚に塗布、又は噴霧等すればよい。また、ルテオリン配糖体の１日使用量が、例えば、約０．０２５〜２５０μｇ／皮膚のｃｍ２となるように組成物を使用すればよい。
本発明の皮膚色素沈着抑制剤は、シミ、ソバカス、クスミを有する人、肌の透明感が低下している人が好適な使用対象となる。また、これらの皮膚トラブルの予防のため、正常な肌を有する人も好適な使用対象となる。
また、例えば、０．０００００１〜２０重量％が好ましく、０．００００１〜１５重量％がより好ましく、０．０００１〜１０重量％がさらにより好ましい。
皮膚色素沈着抑制剤中の、ルテオリン配糖体を含む植物抽出物の含有量は、ルテオリン配糖体の含有量が上記範囲となるようにすればよい。
上記範囲であれば、皮膚外用組成物の通常の使用量で十分な美白作用が得られる。
使用方法
本発明の皮膚色素沈着抑制剤の使用量は、使用対象の皮膚の状態、年齢、性別などによって異なるが、例えば以下の方法とすればよい。即ち、１日数回（例えば、約１〜５回、好ましくは１〜３回）、１回当たり適量（例えば、約１〜５ｇ）を、顔、首、腕、手、足、指などの皮膚に塗布、又は噴霧等すればよい。また、ルテオリン配糖体の１日使用量が、例えば、約０．０２５〜２５０μｇ／皮膚のｃｍ２となるように組成物を使用すればよい。
本発明の皮膚色素沈着抑制剤は、シミ、ソバカス、クスミを有する人、肌の透明感が低下している人が好適な使用対象となる。また、これらの皮膚トラブルの予防のため、正常な肌を有する人も好適な使用対象となる。
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
試験例１：ヒト正常表皮角化細胞のメラノソーム貪食に与えるＨＧＦの影響及びメラノソーム貪食抑制物質のスクリーニング（染色による検出）
試験例１−１：ＨＧＦの影響
＜単離メラノソームの調製＞
ヒト由来の正常色素細胞（ＮＨＥＭ ｎｅｏｎａｔａｌ）（ＴＯＹＯＢＯ社製、クラボウ社より購入）を、直径が１５０ｍｍのディッシュ４枚に播種し、予めサプリメントとしてＨＭＧＳ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＭｅｄｉｕｍ２５４培地（ＧＩＢＣＯ社）、で９０％コンフルーエントに至るまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、培地をアスピレートし、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、 １．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．４）で細胞を洗浄した後、ＥＤＴＡを含有したトリプシンを各プレートに３ｍL加え、細胞を剥離した。
その後、等量のトリプシン中和溶液で中和し、細胞懸濁液を５０ｍＬのファルコンチューブへ移した後、４℃、１０００ｒｐｍで遠心した。上述の細胞懸濁溶液の遠心後、上清をアスピレートし、残った細胞ペレットに、ホモジネートバッファーを５ｍＬ加えペレットを懸濁した後、４℃、１０００×ｇの条件で１０分遠心した。細胞のホモジネートバッファーは、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ， ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ；Ｒｏｃｈｅ社）を加えたＣＨＭ−１溶液（０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）を調整し、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通して除菌することにより調製した。
再度上清をアスピレートした後、冷えたホモジネートバッファーを新たに２ｍＬ加え、細胞懸濁溶液とし、ガラス製のホモジナイザーへ移して、氷上で細胞を破砕した。得られた破砕溶液を冷えた１５ｍＬのファルコンチューブへ移し、新たに冷えたホモジネートバッファーを４ｍＬ加えた後、４℃、１０００×ｇで１０分遠心した。上清を新たに５０ｍＬの冷えた遠心管へ移し、更に冷えたホモジネートバッファーで１０ｍＬに合わせ、４℃、１９０００×ｇの条件で３０分遠心を行った。遠心後、上清をアスピレートし、あらかじめ０．２２μｍのフィルターで除菌したＰＢＳ溶液２ｍＬにてペレットを懸濁した。なお、最後に用いたＰＢＳ溶液はプロテアーゼインヒビターを加えてフィルター滅菌を行ったものを用いた。
このようにして得た懸濁液をメラノソームとして用いた。
試験例１−１：ＨＧＦの影響
＜単離メラノソームの調製＞
ヒト由来の正常色素細胞（ＮＨＥＭ ｎｅｏｎａｔａｌ）（ＴＯＹＯＢＯ社製、クラボウ社より購入）を、直径が１５０ｍｍのディッシュ４枚に播種し、予めサプリメントとしてＨＭＧＳ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＭｅｄｉｕｍ２５４培地（ＧＩＢＣＯ社）、で９０％コンフルーエントに至るまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、培地をアスピレートし、ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、 １．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．４）で細胞を洗浄した後、ＥＤＴＡを含有したトリプシンを各プレートに３ｍL加え、細胞を剥離した。
その後、等量のトリプシン中和溶液で中和し、細胞懸濁液を５０ｍＬのファルコンチューブへ移した後、４℃、１０００ｒｐｍで遠心した。上述の細胞懸濁溶液の遠心後、上清をアスピレートし、残った細胞ペレットに、ホモジネートバッファーを５ｍＬ加えペレットを懸濁した後、４℃、１０００×ｇの条件で１０分遠心した。細胞のホモジネートバッファーは、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ， ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ；Ｒｏｃｈｅ社）を加えたＣＨＭ−１溶液（０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）を調整し、０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通して除菌することにより調製した。
再度上清をアスピレートした後、冷えたホモジネートバッファーを新たに２ｍＬ加え、細胞懸濁溶液とし、ガラス製のホモジナイザーへ移して、氷上で細胞を破砕した。得られた破砕溶液を冷えた１５ｍＬのファルコンチューブへ移し、新たに冷えたホモジネートバッファーを４ｍＬ加えた後、４℃、１０００×ｇで１０分遠心した。上清を新たに５０ｍＬの冷えた遠心管へ移し、更に冷えたホモジネートバッファーで１０ｍＬに合わせ、４℃、１９０００×ｇの条件で３０分遠心を行った。遠心後、上清をアスピレートし、あらかじめ０．２２μｍのフィルターで除菌したＰＢＳ溶液２ｍＬにてペレットを懸濁した。なお、最後に用いたＰＢＳ溶液はプロテアーゼインヒビターを加えてフィルター滅菌を行ったものを用いた。
このようにして得た懸濁液をメラノソームとして用いた。
＜表皮角化細胞によるメラノソーム貪食能に与えるＨＧＦの影響＞
ＴＯＹＯＢＯ社より購入したヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）を用い、ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）の刺激が単離メラノソームの貪食能に及ぼす影響について、以下のようにして検討した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を２ウェルのスライドガラス型カルチャープレート（ＮＵＮＣ社）に１×１０４個播種し、ＨＫＧＳ（ＧＩＢＣＯ社）を予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で１００％コンフル―エントに達するまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、培地をアスピレートし、あらかじめＨＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍＬとなるように溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。対照としてＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるようにＥｐｉlｉｆｅ培地へ溶解したものを用意し、また、条件を合わせる目的で、上記ＨＧＦ含有Ｅｐｉlｉｆｅ培地にもＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるように加えた。これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
次いで、培地をアスピレートした。上述の方法で単離したメラノソームを１０容量％となるようにＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解した培地を用意し、該培地で細胞をさらに２４時間培養した。
その後、該培地をアスピレートし、フォンタナ・マッソン染色キット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｅｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、細胞内に取り込まれたメラノソームを染色した。倍率１０００倍率光学顕微鏡で細胞を観察し、メラノソームの取り込みを評価した。結果を図１に示す。
ＴＯＹＯＢＯ社より購入したヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）を用い、ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）の刺激が単離メラノソームの貪食能に及ぼす影響について、以下のようにして検討した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を２ウェルのスライドガラス型カルチャープレート（ＮＵＮＣ社）に１×１０４個播種し、ＨＫＧＳ（ＧＩＢＣＯ社）を予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で１００％コンフル―エントに達するまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、培地をアスピレートし、あらかじめＨＧＦを最終濃度２０ｎｇ／ｍＬとなるように溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。対照としてＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるようにＥｐｉlｉｆｅ培地へ溶解したものを用意し、また、条件を合わせる目的で、上記ＨＧＦ含有Ｅｐｉlｉｆｅ培地にもＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるように加えた。これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
次いで、培地をアスピレートした。上述の方法で単離したメラノソームを１０容量％となるようにＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解した培地を用意し、該培地で細胞をさらに２４時間培養した。
その後、該培地をアスピレートし、フォンタナ・マッソン染色キット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｅｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、細胞内に取り込まれたメラノソームを染色した。倍率１０００倍率光学顕微鏡で細胞を観察し、メラノソームの取り込みを評価した。結果を図１に示す。
試験例１−２：ＨＧＦ存在下での表皮角化細胞によるメラノソーム貪食抑制物質のスクリーニング
被験物質として、シソ科ハッカ属のセイヨウハッカの成分として知られるルテオリン−７−Ｏ-グルコシドを２０ｍＭとなるようにＤＭＳＯ溶液に調整しストック溶液を用意した。その後、該化合物を最終濃度２０μＭとなるように、ＨＧＦ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）と共にＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解し、該培地により細胞を３７℃で２４時間処理した。
次いで、培地をアスピレートした。上述の方法で単離したメラノソームを１０容量％となるようにＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解した培地を用意し、該培地で細胞をさらに２４時間培養した。
その後、該培地をアスピレートし、フォンタナ・マッソン染色キット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｅｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、細胞内に取り込まれたメラノソームを染色した。倍率１０００倍率光学顕微鏡で細胞を観察し、メラノソームの取り込みを評価した。結果を図１に示す。
被験物質として、シソ科ハッカ属のセイヨウハッカの成分として知られるルテオリン−７−Ｏ-グルコシドを２０ｍＭとなるようにＤＭＳＯ溶液に調整しストック溶液を用意した。その後、該化合物を最終濃度２０μＭとなるように、ＨＧＦ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）と共にＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解し、該培地により細胞を３７℃で２４時間処理した。
次いで、培地をアスピレートした。上述の方法で単離したメラノソームを１０容量％となるようにＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解した培地を用意し、該培地で細胞をさらに２４時間培養した。
その後、該培地をアスピレートし、フォンタナ・マッソン染色キット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｅｉｃ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、細胞内に取り込まれたメラノソームを染色した。倍率１０００倍率光学顕微鏡で細胞を観察し、メラノソームの取り込みを評価した。結果を図１に示す。
＜結果＞
図１から明らかなように、ＨＧＦの添加により、表皮角化細胞によるメラノソーム取り込みは顕著に促進された。
また、被験物質であるルテオリン−７−Ｏ−グルコシドは、ＨＧＦ存在下でのメラノソームの取り込みを顕著に抑制した。このことは、ルテオリン−７−Ｏ-グルコシドが、実際の皮膚中でヒト表皮角化細胞によるメラノソームの貪食を顕著に抑制する物質であることを示している。
図１から明らかなように、ＨＧＦの添加により、表皮角化細胞によるメラノソーム取り込みは顕著に促進された。
また、被験物質であるルテオリン−７−Ｏ−グルコシドは、ＨＧＦ存在下でのメラノソームの取り込みを顕著に抑制した。このことは、ルテオリン−７−Ｏ-グルコシドが、実際の皮膚中でヒト表皮角化細胞によるメラノソームの貪食を顕著に抑制する物質であることを示している。
試験例２：ヒト正常表皮角化細胞のメラノソーム貪食に与えるＨＧＦの影響（蛍光ビーズによる検出）
＜ＨＧＦの影響＞
本試験例では、ヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）による単離メラノソームの貪食能に与えるＨＧＦの影響を、蛍光ビーズの貪食を蛍光顕微鏡観察することで評価した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を２ウェルのスライドガラス型カルチャープレート（ＮＵＮＣ社）に１×１０４個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、該培地をアスピレートして除去し、あらかじめＨＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。対照としてＨＧＦを含まないＥｐｉlｉｆｅ培地を用意した。
これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
処理後、培地をアスピレートし、蛍光ビーズ含有培地で置換して更に６時間培養した。蛍光ビーズ含有培地は、径が０．５μｍである蛍光ビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）の原液をＥｐｉｌｉｆｅ培地中に１／２５００倍の希釈率で溶解して調製した。
培養後、蛍光ビーズ含有培地をアスピレートし、ＰＢＳを各ウェルに１ｍＬ加えて細胞の洗浄を行った。本洗浄操作を更に４回行った。ＰＢＳをアスピレートした後、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００を最終濃度０．１容量％となるようにＰＢＳへ溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本界面活性剤処理は室温で、５分間行った。
界面活性剤含有ＰＢＳをアスピレートした後、核染色試薬としてＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるよう溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本処理は室温、１０分行った。核染色試薬含有ＰＢＳをアスピレートした後、ＰＢＳにより洗浄し、１０容量％中性ホルマリン溶液を１ｍＬ各ウェルに加え、細胞を固定した。その後、ホルマリン溶液を除き、風乾し、カバーガラスをマウントすることで蛍光顕微鏡用試料とした。
ＨＧＦ処理細胞、及び対照細胞を、蛍光顕微鏡により、３５０倍の倍率で細胞内に取り込まれた蛍光ビーズを観察した。結果を図２に示す。
＜ＨＧＦの影響＞
本試験例では、ヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）による単離メラノソームの貪食能に与えるＨＧＦの影響を、蛍光ビーズの貪食を蛍光顕微鏡観察することで評価した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を２ウェルのスライドガラス型カルチャープレート（ＮＵＮＣ社）に１×１０４個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、該培地をアスピレートして除去し、あらかじめＨＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。対照としてＨＧＦを含まないＥｐｉlｉｆｅ培地を用意した。
これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
処理後、培地をアスピレートし、蛍光ビーズ含有培地で置換して更に６時間培養した。蛍光ビーズ含有培地は、径が０．５μｍである蛍光ビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）の原液をＥｐｉｌｉｆｅ培地中に１／２５００倍の希釈率で溶解して調製した。
培養後、蛍光ビーズ含有培地をアスピレートし、ＰＢＳを各ウェルに１ｍＬ加えて細胞の洗浄を行った。本洗浄操作を更に４回行った。ＰＢＳをアスピレートした後、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００を最終濃度０．１容量％となるようにＰＢＳへ溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本界面活性剤処理は室温で、５分間行った。
界面活性剤含有ＰＢＳをアスピレートした後、核染色試薬としてＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるよう溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本処理は室温、１０分行った。核染色試薬含有ＰＢＳをアスピレートした後、ＰＢＳにより洗浄し、１０容量％中性ホルマリン溶液を１ｍＬ各ウェルに加え、細胞を固定した。その後、ホルマリン溶液を除き、風乾し、カバーガラスをマウントすることで蛍光顕微鏡用試料とした。
ＨＧＦ処理細胞、及び対照細胞を、蛍光顕微鏡により、３５０倍の倍率で細胞内に取り込まれた蛍光ビーズを観察した。結果を図２に示す。
＜結果＞
図２から明らかなように、ＨＧＦで２４時間処理した細胞では、処理していない対照に比べ、細胞内に取り込まれた蛍光ビーズの数が多かった。
図２から明らかなように、ＨＧＦで２４時間処理した細胞では、処理していない対照に比べ、細胞内に取り込まれた蛍光ビーズの数が多かった。
試験例３：ヒト正常表皮角化細胞のメラノソーム貪食に与えるＨＧＦの影響及びメラノソーム貪食抑制物質のスクリーニング（フローサイトメーターによる定量）
試験例３−１：ＨＧＦの影響
本試験例では、ヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）による単離メラノソームの貪食能に与えるＨＧＦの影響を、フローサイトメーターを用いて定量した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を６ウェルのカルチャープレート（ＩＷＡＫＩ社）に１×１０５個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。その後、該培地をアスピレートして除去し、あらかじめＨＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。対照としてＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるようにＥｐｉlｉｆｅ培地へ溶解したものを用意し、また、条件を合わせる目的で、上記ＨＧＦ含有Ｅｐｉlｉｆｅ培地にもＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるように加えた。これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
その後、蛍光ビーズの処理を６時間では無く１２時間とした他は、試験例２と同様の手順で操作を行い、蛍光ビーズを細胞に与えた。
その後、培地をアスピレートして除去し、続いて２ｍＬのＰＢＳにより各ウェルの細胞を洗浄した。本洗浄操作をさらに４回繰り返した後、ＥＤＴＡを含有するトリプシン溶液３００μＬを各ウェルに加えて、３７℃のインキュベーター内で５分静置した。細胞の剥離が確認できた後、等量のトリプシン中和液を加え、細胞をピペッティングにより懸濁し、１．５ｍＬのエッペンチューブへ移した。その後、４℃、１５０００ｒｐｍで遠心を行い、上清をアスピレートした。得られた細胞ペレットに６００μＬの１０容量％中性ホルマリン溶液を加え、細胞を懸濁し、フローサイトメーターに供するサンプルとした。
この様な手順で調整したサンプルをフローサイトメーターに供し、各細胞における蛍光強度を定量した。結果を図３に示す。
試験例３−１：ＨＧＦの影響
本試験例では、ヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）による単離メラノソームの貪食能に与えるＨＧＦの影響を、フローサイトメーターを用いて定量した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を６ウェルのカルチャープレート（ＩＷＡＫＩ社）に１×１０５個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。その後、該培地をアスピレートして除去し、あらかじめＨＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。対照としてＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるようにＥｐｉlｉｆｅ培地へ溶解したものを用意し、また、条件を合わせる目的で、上記ＨＧＦ含有Ｅｐｉlｉｆｅ培地にもＤＭＳＯを最終濃度０．１容量％となるように加えた。これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
その後、蛍光ビーズの処理を６時間では無く１２時間とした他は、試験例２と同様の手順で操作を行い、蛍光ビーズを細胞に与えた。
その後、培地をアスピレートして除去し、続いて２ｍＬのＰＢＳにより各ウェルの細胞を洗浄した。本洗浄操作をさらに４回繰り返した後、ＥＤＴＡを含有するトリプシン溶液３００μＬを各ウェルに加えて、３７℃のインキュベーター内で５分静置した。細胞の剥離が確認できた後、等量のトリプシン中和液を加え、細胞をピペッティングにより懸濁し、１．５ｍＬのエッペンチューブへ移した。その後、４℃、１５０００ｒｐｍで遠心を行い、上清をアスピレートした。得られた細胞ペレットに６００μＬの１０容量％中性ホルマリン溶液を加え、細胞を懸濁し、フローサイトメーターに供するサンプルとした。
この様な手順で調整したサンプルをフローサイトメーターに供し、各細胞における蛍光強度を定量した。結果を図３に示す。
＜結果＞
図３から明らかなように、ＨＧＦは、蛍光ビーズの取り込みを１．１５倍に増大させた。この結果は、ヒト正常表皮角化細胞の貪食によるメラノソーム取り込みも、ＨＧＦ刺激により、同様に増大することを示している。
図３から明らかなように、ＨＧＦは、蛍光ビーズの取り込みを１．１５倍に増大させた。この結果は、ヒト正常表皮角化細胞の貪食によるメラノソーム取り込みも、ＨＧＦ刺激により、同様に増大することを示している。
試験例３−２：ＨＧＦ存在下での表皮角化細胞によるメラノソーム貪食抑制物質のスクリーニング
ヒト由来正常表皮角化細胞を６ウェルのカルチャープレート（ＩＷＡＫＩ社）に１×１０５個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。その後、該培地を除去し、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシドを最終濃度２０μＭとなるように、ＨＧＦ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）と共にＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解し、該培地により細胞を３７℃で２４時間処理した。
その後、蛍光ビーズの処理を６時間では無く１２時間とした他は、試験例２と同様の手順で操作を行い、蛍光ビーズを細胞に与えた。
その後の細胞の処理、及びフローサイトメーターによる測定は、試験例３−１と同様にした。結果を図３に示す。
ヒト由来正常表皮角化細胞を６ウェルのカルチャープレート（ＩＷＡＫＩ社）に１×１０５個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。その後、該培地を除去し、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシドを最終濃度２０μＭとなるように、ＨＧＦ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）と共にＥｐｉｌｉｆｅ培地に溶解し、該培地により細胞を３７℃で２４時間処理した。
その後、蛍光ビーズの処理を６時間では無く１２時間とした他は、試験例２と同様の手順で操作を行い、蛍光ビーズを細胞に与えた。
その後の細胞の処理、及びフローサイトメーターによる測定は、試験例３−１と同様にした。結果を図３に示す。
＜結果＞
図３から明らかなように、ルテオリン−７−Ｏ-グルコシドは、ＨＧＦ存在下での蛍光ビーズの取り込みを、対照の約５０％に抑制した。このことは、ルテオリン−７−Ｏ-グルコシドが、実際の皮膚中でヒト表皮角化細胞によるメラノソームの貪食を顕著に抑制する物質であることを示している。
図３から明らかなように、ルテオリン−７−Ｏ-グルコシドは、ＨＧＦ存在下での蛍光ビーズの取り込みを、対照の約５０％に抑制した。このことは、ルテオリン−７−Ｏ-グルコシドが、実際の皮膚中でヒト表皮角化細胞によるメラノソームの貪食を顕著に抑制する物質であることを示している。
試験例４：ヒト正常表皮角化細胞のメラノソーム貪食に与えるＨＧＦおよびＫＧＦ併用処理の影響（蛍光ビーズによる検出）
＜ＨＧＦ及びＫＧＦ併用処理の影響＞
本試験例では、ヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）による単離メラノソームの貪食能に与えるＨＧＦおよびＫＧＦとの併用処理の影響を、蛍光ビーズの貪食を蛍光顕微鏡観察することで評価した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を１２ウェルのカルチャープレート（ＩＷＡＫＩ社）一ウェル当たり１×１０４個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、該培地をアスピレートして除去し、あらかじめＨＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。さらに、ＫＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉlｉｆｅ培地と、ＨＧＦとＫＧＦをそれぞれ混合したＥｐｉｌｉｆｅ培地も用意した。これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
処理後、培地をアスピレートし、蛍光ビーズ含有培地で置換して更に２４時間培養した。蛍光ビーズ含有培地は、径が０．５μｍである蛍光ビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）の原液をＥｐｉｌｉｆｅ培地中に１／１２５０００倍の希釈率で溶解して調製した。
培養後、蛍光ビーズ含有培地をアスピレートし、ＰＢＳを各ウェルに１ｍＬ加えて細胞の洗浄を行った。本洗浄操作を更に４回行った。ＰＢＳをアスピレートした後、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００を最終濃度０．１容量％となるようにＰＢＳへ溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本界面活性剤処理は室温で、５分間行った。
界面活性剤含有ＰＢＳをアスピレートした後、核染色試薬としてＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるよう溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本処理は室温、１０分行った。核染色試薬含有ＰＢＳをアスピレートした後、ＰＢＳにより洗浄し、１０容量％中性ホルマリン溶液を１ｍＬ各ウェルに加え、細胞を固定した。その後、蛍光顕微鏡用試料とした。
ＨＧＦ処理細胞、ＫＧＦ処理細胞、ＨＧＦとＫＧＦの同時処理細胞、及び対照細胞を、蛍光顕微鏡により、３５０倍の倍率で細胞内に取り込まれた蛍光ビーズを観察し、一視野あたり、蛍光ビーズが１０個以上取り込まれている細胞の数をカウントした。一視野あたりの総細胞数をカウントし、上記１０個以上のビーズを含む細胞が占める割合（相対占有率）について、対照群を１００％とした時どれだけ変化するか各群で比較した。結果を図４に示す。
＜ＨＧＦ及びＫＧＦ併用処理の影響＞
本試験例では、ヒト由来の正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ ｎｅｏｎａｔａｌ）による単離メラノソームの貪食能に与えるＨＧＦおよびＫＧＦとの併用処理の影響を、蛍光ビーズの貪食を蛍光顕微鏡観察することで評価した。
ヒト由来正常表皮角化細胞を１２ウェルのカルチャープレート（ＩＷＡＫＩ社）一ウェル当たり１×１０４個播種し、ＨＫＧＳを予めサプリメントとして添加したＥｐｉlｉｆｅ培地で１００％コンフルーエントに達するまで培養した。培養はＣＯ２インキュベーター（９５容量％ 空気／５容量％ 二酸化炭素）内、３７℃の条件下で行った。
その後、該培地をアスピレートして除去し、あらかじめＨＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用意した。さらに、ＫＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解したＥｐｉlｉｆｅ培地と、ＨＧＦとＫＧＦをそれぞれ混合したＥｐｉｌｉｆｅ培地も用意した。これら培地で細胞を３７℃で２４時間処理した。
処理後、培地をアスピレートし、蛍光ビーズ含有培地で置換して更に２４時間培養した。蛍光ビーズ含有培地は、径が０．５μｍである蛍光ビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）の原液をＥｐｉｌｉｆｅ培地中に１／１２５０００倍の希釈率で溶解して調製した。
培養後、蛍光ビーズ含有培地をアスピレートし、ＰＢＳを各ウェルに１ｍＬ加えて細胞の洗浄を行った。本洗浄操作を更に４回行った。ＰＢＳをアスピレートした後、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００を最終濃度０．１容量％となるようにＰＢＳへ溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本界面活性剤処理は室温で、５分間行った。
界面活性剤含有ＰＢＳをアスピレートした後、核染色試薬としてＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を最終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるよう溶解し、該溶液で細胞を処理した。なお、本処理は室温、１０分行った。核染色試薬含有ＰＢＳをアスピレートした後、ＰＢＳにより洗浄し、１０容量％中性ホルマリン溶液を１ｍＬ各ウェルに加え、細胞を固定した。その後、蛍光顕微鏡用試料とした。
ＨＧＦ処理細胞、ＫＧＦ処理細胞、ＨＧＦとＫＧＦの同時処理細胞、及び対照細胞を、蛍光顕微鏡により、３５０倍の倍率で細胞内に取り込まれた蛍光ビーズを観察し、一視野あたり、蛍光ビーズが１０個以上取り込まれている細胞の数をカウントした。一視野あたりの総細胞数をカウントし、上記１０個以上のビーズを含む細胞が占める割合（相対占有率）について、対照群を１００％とした時どれだけ変化するか各群で比較した。結果を図４に示す。
＜結果＞
図４から明らかなように、ＨＧＦおよびＫＧＦで２４時間処理した細胞では、処理していない対照に比べ、１０個以上蛍光ビーズを細胞内に取り込んだ細胞の割合が多かった。また、ＨＧＦとＫＧＦの併用処理は該細胞の割合を更に高めた。
図４から明らかなように、ＨＧＦおよびＫＧＦで２４時間処理した細胞では、処理していない対照に比べ、１０個以上蛍光ビーズを細胞内に取り込んだ細胞の割合が多かった。また、ＨＧＦとＫＧＦの併用処理は該細胞の割合を更に高めた。
本発明のスクリーニング方法は、従来のスクリーニング方法で得られる美白剤に見られない新たな機序で色素沈着を抑制する物質を選択することができ、産業上有用な方法である。
Claims (3)
- (a) 被験物質の存在下又は非存在下で表皮角化細胞を処理し、かつこの処理の前、同時、又は後に表皮角化細胞をＨＧＦと共にＫＧＦと接触させる工程、
(b) 被験物質存在下で処理した表皮角化細胞と微粒子とを接触させた後の微粒子取り込み活性を、被験物質非存在下で処理した表皮角化細胞と微粒子とを接触させた後の微粒子取り込み活性と比較する工程、及び
(c) 表皮角化細胞の微粒子取り込み活性を低下させる被験物質を選択する工程
を含む、皮膚色素沈着抑制物質のスクリーニング方法であって、前記微粒子がメラノソーム、又は表皮角化細胞が貪食できる微粒子であることを特徴とする方法。 - 表皮角化細胞が貪食できる微粒子が、メラニン、又は発色物質を含有する高分子微粒子である請求項１に記載の方法。
- 濃度１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ及び濃度１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの存在下で表皮角化細胞を処理する請求項１又は２に記載の方法。
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