JP6151640B2 - たん白質の精製方法 - Google Patents

Description

本発明はたん白質の精製に関する。より詳しくは、たん白質組成物から目的たん白質を直接回収し、目的の品質を有するたん白質を効率的に精製する方法を提供する。

遺伝子組換え技術の発展により、種々のたん白質医薬品が供給されるようになった。特に、近年は数多くの抗体医薬品およびたん白質医薬品が開発・上市されている。これらのたん白質医薬品を工業的、かつ経済的、高純度に製造することは、バイオ医薬品産業にとってますます重要な課題になっている。

このような抗体医薬品またはたん白質医薬品は、一般に、その目的たん白質遺伝子を含むベクターを挿入した遺伝子組換え細胞を培養することによって生産される。その培養液には、目的たん白質のほかに、多種多様の培地成分または細胞副生成物等の不純物が含まれているため、医薬品として要求される純度まで高度に分離・精製すること、さらには、工業的な規模で経済的に生産することを両立させることは、非常に困難かつ挑戦的である。

目的たん白質の製造方法のなかでも、精製工程はたん白質の生理活性機能を維持したまま純度を高める工程として極めて重要である。一般的に、精製工程は電荷、親水性または分子サイズの違いなどを利用した、異なるモードのクロマトグラフィー法、およびアルコール分画、塩析、ろ過、濃縮または希釈などの操作の組合せで行われる（非特許文献１）。

クロマトグラフィーとしては、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィー等が挙げられる。これらを組み合わせることで、所望の純度に目的たん白質を精製し得る。アフィニティークロマトグラフィーとしては、抗体またはヘパリンなどの目的たん白質と親和性を有する物質を固定化した担体が利用される。

また、目的たん白質が抗体である場合には、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ Ｇなどの抗体の特定部位に相互作用を有するリガンド（親和性物質）を固定化した担体が利用される。更に、これらのクロマトグラフィーに使用される担体または緩衝液と目的たん白質ならびに不純物との相互作用の強さに応じて、目的たん白質を担体に付着させた後に溶出させるキャプチャーモードと、不純物を担体に付着させ目的たん白質を担体に素通りさせるフロースルーモードの二つの方法を利用し得る。

特に、目的たん白質が抗体である場合には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーを行った後に、前述のクロマトグラフィーを１つ以上組み合わせることで、所望の純度の目的物を精製する技術がすでに確立されており、プラットフォーム精製法としての利用が進んでいる。

一方、目的たん白質が抗体以外の場合、当該たん白質を所望の純度で精製する際には、プラットフォーム精製法として利用し得る標準的な方法が存在せず、目的たん白質の性質を鑑みて、個々に試行錯誤の試験を重ねることで精製工程がデザインされ、個々の目的たん白質ごとに最適化されたうえで利用されているのが現状である。

目的たん白質に親和性を有する抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィーなども精製に利用されているが、目的たん白質ごとに固有のリガンド（親和性物質）を利用しなければならないこと、期待する結合特性または親和性を有するリガンドを必ずしも容易に入手し得ない場合があること、リガンドを結合した担体が非常に高価であること、安定な供給が懸念されることなど多くの課題が存在するため、工業的には必ずしも容易に利用することができない。

以上のような背景から、目的たん白質を簡便な方法で効率的かつ迅速に精製できる標準的な技術の確立が望まれている。

一方、アフィニティークロマトグラフィー以外の簡便なクロマトグラフィーを用いた場合、目的たん白質を精製するには細胞培養上清等の前処理が必須である。通常、細胞培養上清中には細胞の代謝物または培地成分および培養時の添加物に由来する成分が多く含まれており、電気伝導度または塩濃度が高い場合が多い。

この場合、培養上清をクロマトグラフィーに直接供することは効率的でないため、培養上清を数倍に希釈する、緩衝液を交換する、濃縮後に緩衝液を交換する、濃縮後に希釈するなどの前処理が一般的に行われている。

しかし、前記前処理は、数時間から１日以上の操作時間を要し、希釈用タンクの大きさなどの製造設備にも依存するため、工業的な製造法としては効率的かつ現実的でない。また、濃縮などの培養上清の前処理を実施している間に、目的たん白質の品質への悪影響が生じることが多い。

以上のように、たん白質を高純度に精製する工業的な製造方法として前処理操作が課題になっている。簡便な前処理操作でたん白質の品質を損ねることなく、目的のたん白質を効率的に回収できる精製法が求められている。

なお、目的たん白質を医薬品として供給し利用するためには、培養液などの組成物から目的たん白質を所望の生物活性が得られるように高度な純度で精製する必要がある。しかし、培養液のような、精製の開始点となる目的たん白質を含む組成物は、当該たん白質を分解する活性を有する微量な成分または不純物を含んでいることが多く、これらの成分を不活化するか除去しないと、目的物質の生物活性が損なわれる、収率が低下する、修飾を受ける、副生成物が生産されるなどの懸念がある。また、前述した培養上清の前処理によってこれらの不純物が濃縮または活性化され、目的たん白質に悪影響を及ぼす可能性もある。

前記成分または不純物としては、例えば、生産細胞自身が保有する糖除去酵素類、たん白質加水分解酵素類および酸化還元酵素類などが挙げられる。糖除去酵素としては、例えば、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガラクトシダーゼおよびグリカナーゼなどが挙げられる。

たん白質分解酵素としては、例えば、セリンプロテアーゼ、エステラーゼ、システインプロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼおよびカテプシンなどが挙げられる。

酸化還元酵素としては、例えば、チオレドキシンなどのカスケード反応が知られている。また、トランスグルタミナーゼなどのアミノ酸異性化酵素もたん白質の構造を修飾する酵素として知られている。

例えば、糖たん白質とノイラミニダーゼが混在する溶液において、速やかにノイラミニダーゼを分離するする方法としては、前述したアルコール分画、塩析分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの組合せで行うことができるが、これらの方法のみで目的たん白質を安定的に精製する方法は極めて限定的である。

また、ノイラミニダーゼの酵素活性を酵素阻害剤（銅などの２価陽イオン、シアル酸およびその誘導体、シアリルラクトース、オリゴシアル酸、ポリシアル酸、タミフル、ＢＣＸ−１８１２、シアリダーゼ中和抗体、など）で阻害し精製する方法が考えられる。しかし、これらの阻害剤を製造工程で大量に利用するのは容易でなく、また、精製工程で毒性の無い濃度まで十分に除去するには限界がある。

以上のように、目的たん白質を含有する培養液などの組成物は、たん白質の構造または安定性を損ねる複数の不純物を微量成分として含有していることが多く、所望の品質のたん白質を得るにはこれらの不純物を安全な方法で速やかに効率的に除去する精製方法が望まれている。

更には、前述の不純物成分により分解若しくは修飾を受けた目的たん白質または生物活性が失われた目的たん白質自身も不純物になり得る。例えば、糖鎖を含有する糖たん白質の場合、糖鎖は生理活性、安定性、体内動態または溶解性などに、大きく関与することが知られている。

遺伝子組換え技術を応用して作製した動物細胞を用いて糖たん白質を生産した場合、得られた培養液には、死細胞より漏洩したノイラミニダーゼが含まれているため、生産した目的とする糖たん白質の糖鎖からシアル酸が除去される。糖たん白質からシアル酸が脱離すると、非還元末端に露出したガラクトース残基が肝臓などに局在するアシアロ糖蛋白質受容体（ガラクトース受容体）に捕捉され、速やかに分解される（非特許文献２）。

このように、糖たん白質は、糖鎖末端のシアル酸の結合数が少ないと血液中の半減期が低下し生理活性を十分に発揮できない場合がある。また、エリスロポエチンなどは糖鎖のシアル酸結合数によって生物活性が変化することが知られている。

このように、糖たん白質からシアル酸が除去された、またはシアル酸結合数が低下したたん白質は不純物となり得るため、シアル酸の脱離を抑制するため前述のようにノイラミニダーゼを除去するか、または、シアル酸結合数の低下したたん白質を除去する必要がある。

たん白質の糖鎖の組成または含有量をクロマトグラフィーで制御することは非常に難易度が高く挑戦的である。このように、糖たん白質の糖鎖を目的の品質に保ったまま高純度に精製する方法の開発が望まれている。

他の事例としては、製造工程の途中で変性した目的たん白質自身も不純物となり得る。例えば、目的たん白質が製造工程において変性するなどして形成された重合体（または会合体、凝集体、ダイマー、オリゴマー、アグリゲーツ若しくはマルチマー）は、生物活性の低下、体内動態の変化または抗原性などが懸念される。

例えば、プロテインＳは、通常の精製方法では重合体の生成を抑制することができず、重合体を生成しない精製方法はこれまでに知られていない（非特許文献３）。また、切断体（ニック体）の含有量を低下できる効率的な精製方法は開発されていない。そのため、重合体または切断体などの目的たん白質由来の不純物を精製工程で十分低いレベルまで除去できる精製方法の確立が望まれている。

以上の背景に示すとおり、たん白質の品質に係る不純物を除去し、目的の品質のたん白質を簡便に精製する方法が求められている。

一方、たん白質組成物より目的たん白質を高純度に精製するための技術として、種々のモードのクロマトグラフィー担体が開発されてきた。このうち混合モード担体（または、マルチモード担体、または、ミックスモード担体）は、２種類以上の特性を有するモードのリガンドを一つの担体に結合したクロマトグラフィー担体であり、近年開発された。

混合モード担体は、単純に２つのモードを合わせた分離特性だけではないユニークな分離特性を有することが知られており、たん白質の精製に有用なツールとなりつつある（非特許文献４）。

しかし、混合モード担体を使った抗体以外のたん白質の標準的な精製方法は知られていない。陰イオン交換基と疎水性相互作用基を保有するＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）などの混合モード担体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーなどで粗精製した抗体組成物の次段階の精製法として知られているのみである（特許文献１〜３および非特許文献５）。

この場合、除去される不純物は、ホスト細胞由来のたん白質（ＨＣＰ）またはＤＮＡなどが主なものであり、目的のたん白質自身の品質を変化させたり、成分を調節したりするものではない（非特許文献６および７）。

また、陽イオン交換基と疎水性相互作用基を保有するＣａｐｔｏ ＭＭＣ（ＧＥヘルスケア社製）などの混合モード担体は、高塩濃度の組成物から所望のたん白質を回収する方法として知られており（非特許文献８〜９）、抗体の精製にも利用されているが（特許文献４）、たん白質の品質に係る不純物を除去し、成分を調節し、目的の品質のたん白質を得るための第一段階の精製に使用されている例は極めて限定的である。

特に、たん白質の糖鎖に結合するシアル酸、たん白質自身の重合体または分解物を第一クロマトグラフィーで直接回収しつつ制御する方法は報告が無い。また、陽イオン交換基を有する混合モード担体で酸性のたん白質を精製する方法、および、陰イオン交換基を有する混合モード担体で塩基性のたん白質を精製する方法は知られていない。

国際公開第２０１０／０７１２０８号 国際公開第２０１０／０３０２２２号 国際公開第２００６／０４３８９５号 国際公開第２００９／１２６６０３号

Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ． 代謝、１９８３，２０，１５３． Ｋｒｉｓｔｉｎ Ｍ．Ｓｅｒｅ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｊａｎ Ｒｏｓｉｎｇ，Ｔｉｌｍａｎ Ｍ．Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ａｆｆｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，２００６，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ４３（ｓｕｐｐｌ １）Ｓ１１１−Ｓ１２０． Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｌ．Ａ．，Ｋｏｐａｃｉｅｗｉｃｚ，Ｗ．，Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．，Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅｉｔｈｅｒ ｔｈｅ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｒ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅ，１９８６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．３５９，７３−８４． Ｃｈｅｎ Ｊ．，Ｔｅｔｒａｕｌｔ Ｊ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｗａｓｓｅｒｍａｎ Ａ．，Ｃｏｎｌｅｙ Ｇ．，ＤｉＬｅｏ Ｍ．，Ｈａｉｍｅｓ Ｅ．，Ｌｅｙ Ａ．，Ｔｈｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｆ ｍｉｘｅｄ−ｍｏｄｅ ｒｅｓｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，２０１０ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ １２１７（２），２１６−２２４． ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社 Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ Ｄａｔａ Ｆｉｌｅ ７１−２７７９−１１ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｄｆ／Ｃａｐｔｏ＿ａｄｈｅｒｅ．ｐｄｆ Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｋ．，Ｌｊｕｎｇｌｏｆ Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｇ．，Ｂｒｅｋｋａｎ Ｅ．，Ｍａｂ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｗｉｔｈ ａ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ： Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｓｔｅｐ ｔｏ ｆｏｌｌｏｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ，２００９，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ７（２），５２−５６． ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社 Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ Ｄａｔｅ Ｆｉｌｅ １１−００３５−４５ＡＡｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｄｆ／１１００３５４５ａａ．ｐｄｆ ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｙ，１１，２０１１

たん白質の工業規模の製造において、たん白質組成物から目的たん白質を直接回収し、目的の品質を有する精製たん白質を効率的かつ迅速に得られる簡便な精製方法が求められている。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、混合モード担体を第一段目の精製工程に使用すること、分離条件を調整すること、アミノ酸を含有する緩衝液で洗浄および／または溶出すること、溶出画分を選択することを適宜組み合わせることにより、目的の品質を有する精製たん白質を効率的かつ迅速に精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は以下の（１）〜（２９）に関する。
（１）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
（２）混合モード担体がイオン交換基および疎水性相互作用基を含む、前記（１）に記載の精製方法。
（３）混合モード担体がＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍから選択される、前記（１）または（２）に記載の精製方法。
（４）以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
（ｂ）陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）陰イオン交換担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程。
（５）精製たん白質の回収率が５０％以上である前記（１）〜（４）のいずれか１に記載の精製方法。
（６）たん白質が糖たん白質である、前記（１）〜（５）のいずれか１に記載の精製方法。
（７）糖たん白質が、シアル酸が結合した糖鎖を含む糖たん白質である、前記（６）に記載の精製方法。
（８）シアル酸が結合した糖鎖を含む糖たん白質がアンチトロンビン、プロテインＳ若しくはエリスロポエチンまたはその誘導体である、前記（７）に記載の精製方法。
（９）精製糖たん白質のシアル酸結合数が最大付加可能数の７０％以上である、前記（７）または（８）に記載の精製方法。
（１０）第一クロマトグラフィー工程の後に、更に１以上の追加のクロマトグラフィー工程を含む前記（１）〜（９）のいずれか１に記載の精製方法。
（１１）追加のクロマトグラフィー工程が、混合モード担体、陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、陽イオン交換担体、陽イオン交換膜、疎水性相互作用担体、サイズ排除担体、ゲルろ過担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、または硫酸化アガロース担体のいずれか１つが使用されるクロマトグラフィーである前記（１）〜（１０）のいずれか１に記載の精製方法。
（１２）前記１〜１１のいずれか１に記載の方法で精製されたたん白質を含有する組成物。
（１３）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
（ａ）アンチトロンビン組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
（１４）精製アンチトロンビンの平均シアル酸結合数が最大付加可能数の７０％以上である、前記１３に記載の精製方法。
（１５）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
（ａ）アンチトロンビン組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
（ｂ）陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）陰イオン交換担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
（１６）精製アンチトロンビンの平均シアル酸結合数が最大付加可能数の７０％以上である、（１５）に記載の精製方法。
（１７）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、プロテインＳの精製方法。
（ａ）プロテインＳ組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有するプロテインＳの画分のみを得る工程。
（１８）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
（１９）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１以上含む第一クロマトグラフィー工程で、目的の品質を有する精製たん白質を得ることを特徴とするクロマトグラフィー工程を含む、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
（２０）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも２以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
（２１）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも３以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
（２２）少なくとも以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（２３）少なくとも以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（２４）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
（ｂ）陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）陰イオン交換担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
（２５）以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む第一クロマトグラフィー工程で、目的の品質を有する精製たん白質を得ることを特徴とするクロマトグラフィー工程を含む、たん白質の精製方法。
（ａ）たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
（ｂ）陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）陰イオン交換担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程。
（２６）目的の品質が、以下の少なくとも１つである前記（１９）または（２５）に記載の精製方法。
（ａ）たん白質あたりのシアル酸結合数が最大付加可能数の７０％以上
（ｂ）重合体または切断体の含有量が１０％以下
（２７）少なくとも以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
（ａ）アンチトロンビン組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
（２８）少なくとも以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
（ａ）アンチトロンビン組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
（ｂ）陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）陰イオン交換担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
（２９）少なくとも以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、プロテインＳの精製方法。
（ａ）プロテインＳ組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有するプロテインＳの画分のみを得る工程。

本発明により、たん白質組成物より目的たん白質を直接回収し、たん白質自身の品質に関与する不純物を効率的に除去することで、目的の品質を有するたん白質（以下、「精製たん白質」とも称する）を効率的に精製する技術が提供される。

具体的には、混合モード担体を用いたクロマトグラフィーに培養上清などのたん白質組成物を直接供し、品質の維持された精製たん白質を効率的に回収することができる。これにより、クロマトグラフィー前の処理または操作時間が削減される他、濃縮などの培養上清の前処理を実施している間に、目的たん白質の品質への悪影響が生じることを避けることが可能である。

また、たん白質組成物に含有される不純物を速やかに効率的に除去可能な精製方法が提供される。これにより、従来の精製法に比較して、たん白質の品質および収率が著しく改善される。

より具体的には、所望のシアル酸結合数または重合体含量または分解物含量を有する、アンチトロンビン、エリスロポエチン若しくはプロテインＳ、またはそれらの誘導体などの糖たん白質の精製物が、実製造に利用可能な収率で得られる製造法が提供される。

本発明により製造されたたん白質は医薬品として有用である。

図１は、アミノ酸添加によるノイラミニダーゼ活性の抑制レベルを示す。 図２は、担体１ｍＬあたりのアンチトロンビンの吸着量を示す。 図３は、実施例７の混合モード担体を用いたプロテインＳ培養上清の精製におけるクロマトグラムを示す。Ｂ〜ＥがプロテインＳの目的画分、Ｇは主に重合体を含有する画分を示す。縦軸はＵＶ２８０ｎｍの吸光度、横軸は溶出時間を示す。 図４は、溶出画分中の重合体の有無についてのＮａｔｉｖｅ−Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析を示す。Ａが添加した培養上清、Ｂ〜Ｇが混合モード担体を用いた精製における溶出画分で、図３のＢ〜Ｇに相当する。一番下の最も濃いバンドがプロテインＳ単量体を示す。 図５は、実施例８の混合モード担体を用いたプロテインＳ培養上清の精製におけるクロマトグラムを示す。Ｂ〜ＥがＣａｐｔｏ ＭＭＣ担体を用いて精製したときの溶出ピークである。縦軸はＵＶ２８０ｎｍの吸光度、横軸は溶出時間を示す。 図６は、実施例８の疎水モード担体を用いたプロテインＳ培養上清の精製におけるクロマトグラムを示す。Ｆ〜ＨのピークがＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）担体を用いたカラム精製における溶出ピークを示す。縦軸はＵＶ２８０ｎｍの吸光度、横軸は溶出時間を示す。 図７は、混合モード担体、疎水モード担体を用いた精製における分画液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ａがカラムに添加した培養上清、Ｂ〜Ｅが図５に示したクロマトグラムの分画液、Ｆ〜Ｈが図６に示したクロマトグラムの分画液を示す。 図８は、ノイラミニターゼおよびアミノ酸を添加したプロテインＳを含む水溶液の等電点電気泳動分析の結果を示す。ＡはプロテインＳを含む水溶液に精製水を添加した直後凍結保管した検体、ＢはプロテインＳを含む水溶液に精製水を添加し、３７℃で３時間静置した検体、ＣはプロテインＳを含む水溶液にグリシン（終濃度１．０ｍｏｌ／Ｌ）と精製水を添加し、３７℃で３時間静置した検体、ＤはプロテインＳを含む水溶液にグリシン（終濃度１．０ｍｏｌ／Ｌ）とノイラミニダーゼ（終濃度０．０００５Ｕ／ｍＬ）を添加し、３７℃で３時間静置した検体、ＥはプロテインＳを含む水溶液にノイラミニダーゼ（終濃度０．０００５Ｕ／ｍＬ）と精製水を添加し、３７℃で３時間静置した検体を示す。泳動像の上側が塩基性側、下側が酸性側を示す。 図９は、２５℃６日間静置した、アミノ酸を添加したプロテインＳを含む水溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ＡはプロテインＳを含む水溶液に精製水を添加し、４℃で６日間静置した検体、ＢはプロテインＳを含む水溶液に精製水を添加し、２５℃で６日間静置した検体、ＣはプロテインＳを含む水溶液にグリシン（終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ）を添加し、２５℃で６日間静置した検体、ＤはプロテインＳを含む水溶液にアルギニン（終濃度０．４ｍｏｌ／Ｌ）を添加し、２５℃で６時間静置した検体を示す。 図１０は、２５℃７日間静置した、アミノ酸を添加したエリスロポエチンを含む培養液から精製されたエリスロポエチンのキャピラリー電気泳動分析の結果を示す。縦軸はピーク面積、横軸はシアル酸結合数（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を示し、●印は測定開始時のサンプル、■印は精製水を添加し２５℃７日間静置したサンプル、▲印は１ｍｏｌ／Ｌアラニンを添加し２５℃７日間静置したサンプル、×印は１ｍｏｌ／Ｌグリシンを添加し２５℃７日間静置したサンプル、○印は１ｍｏｌ／Ｌアルギニンを添加し２５℃７日間静置したサンプルを示す。 図１１は、混合モード担体を用いて精製したプロテインＳと、混合モード担体を用いずに精製したプロテインＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。Ａは市販のプロテインＳ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、Ｂは比較例３（混合モード担体を用いずに精製）にて取得したプロテインＳ、Ｃは実施例１６（混合モード担体を用いて精製）にて取得したプロテインＳを示す。 図１２は、混合モード担体を用いて精製したプロテインＳと、混合モード担体を用いずに精製したプロテインＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。Ａは比較例３（混合モード担体を用いずに精製）にて取得したプロテインＳ、Ｂは比較例３（混合モード担体を用いずに精製）にて取得後、３７℃で３日間静置したプロテインＳ、Ｃは実施例１６（混合モード担体を用いて精製）にて取得したプロテインＳ、Ｄは実施例１６（混合モード担体を用いて精製）にて取得後、３７℃で３日間静置したプロテインＳを示す。

本発明は、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法に関する。
（ａ）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
（ｂ）混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）混合モード担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。

本発明は、培養上清などのたん白質組成物を直接混合モード担体に接触させること、たん白質組成物から目的たん白質由来不純物を生成させる成分、または、目的たん白質由来不純物自身を速やかに分離・低減すること、アミノ酸を含有する緩衝液を用いること、溶出画分を選択することを適宜組み合わせることで目的の品質を有する精製たん白質を得る精製方法に関する。

ここで、「直接混合モード担体に接触させる」とは、培養上清などのたん白質組成物を数倍に希釈すること、緩衝液を交換すること、濃縮後に緩衝液を交換すること、または濃縮後に希釈することは行わないことを意味する。

本発明において、たん白質組成物としては、目的のたん白質が含まれる水溶液であればいずれでもよい。本発明において、たん白質としては、例えば、糖鎖を有しない天然若しくは非天然のたん白質、天然若しくは非天然の糖たん白質、またはそれらの誘導体などが挙げられる。

具体的には、例えば、エリスロポエチン、ダルベポエチン、アンチトロンビン（α体若しくはβ体、またはそれらの混合物）、インターフェロン類、インターロイキン類、プロテインＳ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、トロンボモジュリン、グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球マクロファージ刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、トロンボポエチンまたは巨核球増殖促進因子ＭＧＤＦ（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ）、繊維芽細胞成長因子ＦＧＦ、上皮細胞成長因子ＥＧＦ、インスリン様成長因子、脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ、毛様態神経栄養因子ＣＴＮＦ若しくはグリア細胞由来神経栄養因子ＧＤＮＦ、または抗体およびそれらの誘導体などが挙げられる。

これらのたん白質は、血漿若しくは尿など生体から得られた組成物、遺伝子組換え技術若しくは細胞融合技術を用いて得られた細胞または菌の培養液、あるいはトランスジェニック非ヒト動物若しくは植物などから得られた組成物を出発原料として得られる。

たん白質を生産する細胞としては、例えば、所望のたん白質をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換細胞が挙げられる。具体的には、例えば、動物細胞、植物細胞または酵母細胞などの細胞株が挙げられる。

さらに具体的には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、または受精卵細胞などにたん白質遺伝子を導入した細胞が挙げられる。

たん白質を生産する細胞を培養する培地としては、各々の細胞の培養に適した培地であればいずれも用いられるが、例えば、動物細胞を培養する培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地が用いられる。例えば、血清含有培地、血清アルブミン若しくは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地、または無たん白培地など、いずれの培地も用いられるが、好ましくは無血清培地または無たん白培地が用いられる。

例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ−ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ ３２５培地（以上、ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地（以上、インビトロジェン社製）若しくはＩＳ ＣＤ−ＣＨＯ培地（アーバインサイエンティフィック社製）、またはこれらの改変培地、混合培地あるいは濃縮培地などが挙げられる。これらの中でも、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地またはＩＳ ＣＤ−ＣＨＯ培地などが好ましい。

また、必要に応じてたん白質を生産する細胞の生育に必要な生理活性物質または栄養因子などを添加することができる。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させるか、培養中に添加培地または添加溶液として培養液へ適宜追加供給する。追加供給の方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態でもよく、また、添加方法は連続または断続のいずれでもよい。

たん白質を生産するトランスジェニック非ヒト動物または植物としては、たん白質をコードする遺伝子が細胞内に組み込まれた非ヒト動物または植物が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサルなどが挙げられる。植物としては、例えば、タバコ、ポテト、トマト、ニンジン、ソイビーン、アブラナ、アルファルファ、コメ、小麦、大麦またはコーンなどが挙げられる。

たん白質組成物の生産方法としては、例えば、アンチトロンビン組成物は国際公開第２００８／１２０８０１号など、エリスロポエチン組成物は日本国特開平３−１９８７９２号公報など、プロテインＳ組成物は国際公開第２０１０／０１８８４７号などに記載の方法が挙げられる。

以上のように生産された「たん白質組成物」は、細胞または粒子などの不溶物が存在する場合にはそれらを除去し、不溶物を除去した後に本発明の精製法に供される。細胞または粒子などの不溶物の除去方法としては、連続遠心分離、バッチ式遠心分離、デプスろ過、精密ろ過若しくは活性炭などのいずれかを選択するか、または、それらを組合せて行うことができる。また、必要に応じてたん白質組成物のｐＨを調整した後に精製法に供される。

本発明において、第一クロマトグラフィーである混合モード担体に接触させるたん白質組成物は、不溶物を除去すること、およびｐＨを調整すること以外に前処理を必要としない。例えば、限外ろ過膜を用いたクロスフローろ過（タンジェンシャルフローろ過法）または透析などによる緩衝液交換は不要である。また、水または緩衝液による希釈の前処理は不要である。

本発明において、混合モード担体を用いる場合のたん白質組成物から目的たん白質を精製する特徴的な手順としては、例えば、（１）たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させ目的たん白質を吸着させる工程、（２）目的たん白質の品質を制御する工程、の順に実施される。（２）の工程は更に、（２−１）不純物を分離し目的たん白質を溶出する工程、（２−２）溶出液の特定の分画範囲を回収する工程、に分類される。

本発明において、クロマトグラフィーに利用する混合モード担体としては、異なる選択性を有する２種類以上の官能基、好ましくはイオン交換基および疎水性相互作用基を固相マトリックスに結合した担体が好ましい。

イオン交換基としては、例えば、硫酸基、メチル硫酸基、スルフォフェニル基、スルフォプロピル基若しくはカルボキシメチル基などの陽イオン交換基、または、４級アンモニウム基、４級アミノエチル基、ジエチルアミノエチル基若しくはジエチルアミノプロピル基などの陰イオン交換基が挙げられる。

疎水性相互作用基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、オクチル基、エーテル基またはフェニル基などが挙げられる。

本発明において、固相マトリックスとしては、例えば、セルロース、セファロース、アガロース、キトサン、アクリル酸重合体若しくはスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などのポリマーおよびその誘導体（架橋ポリマーを含む）、シリカ粒子、ガラス粒子、セラミック粒子またはその表面処理粒子等が挙げられる。

上記の官能基は、これらの固相マトリックスに直接結合させることもできるし、官能基を複数有する構造のポリマー（グラフト鎖）として固相マトリックスに間接的に結合させることもできる。

このような混合モード担体としては、具体的には、例えば、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（以上、ポール社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍ（東ソー社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明における第一の工程である、「たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させ目的たん白質を吸着させる工程」は、キャプチャーモード（吸着モード）で行われる。混合モード担体を充てんしたカラムに、先述のたん白質組成物を接触させ、目的たん白質を担体に吸着させる。

たん白質を混合モード担体に吸着させる条件としては、好ましくはｐＨ４〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。担体１ｍＬ当たりのたん白質の吸着量としては、１〜５０ｍｇが好ましく、より好ましくは５ｍｇ以上である。

電気伝導度は０．０１ｍＳ／ｃｍ〜５０ｍＳ／ｃｍが好ましく、より好ましくは０．１〜２０ｍＳ／ｃｍである。たん白質組成物に含有される目的たん白質のうち、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が吸着し、工程収率として好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が回収されるように、混合モード担体の量が決定され利用される。

本発明の第二の工程の第一段階である「不純物を分離し目的たん白質を溶出する工程」では、目的たん白質を混合モード担体から溶出するまでに不純物が所望のレベルまで除去または分離される。除去または分離される第一の不純物としては、目的たん白質由来不純物を生成させる成分、すなわち、目的たん白質の性質を変化させる成分が挙げられる。

具体的には、例えば、糖除去酵素類、たん白質加水分解酵素類または酸化還元酵素類などが挙げられる。糖除去酵素としては、例えば、ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガラクトシダーゼまたはグリカナーゼなどが挙げられる。

たん白質分解酵素としては、例えば、セリンプロテアーゼ、エステラーゼ、システインプロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼまたはカテプシンなどが挙げられる。

酸化還元酵素としては、例えば、チオレドキシンレダクターゼなどのチオレドキシン関連酵素が挙げられる。アミノ酸異性化酵素としては、例えば、トランスグルタミナーゼなどが挙げられる。これらの不純物は主として、目的たん白質を生産する宿主に由来するものである。

除去または分離される第二の不純物としては、主に前述の第一の不純物により生じた目的たん白質由来不純物であり、例えば、分解、変性、糖鎖成分の除去、酸化若しくは脱アミド等を受けた修飾たん白質または重合したたん白質等が挙げられる。

本工程は、以下の手順で実施することができる。目的たん白質を混合モード担体に吸着させた後、緩衝液で洗浄することにより、不純物を洗浄し除去する。不純物を洗浄する緩衝液の条件は、目的たん白質が担体に吸着した状態で不純物が吸着しない、または、不純物と担体との親和性が低下する好適な条件をｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物などを変更することで選定する。前記条件を選定する上で、不純物と目的たん白質の物理化学的性質の違い、例えば、等電点、電荷、疎水性度、分子サイズまたは立体構造などの違いを利用することができる。

これらの違いは、目的たん白質よりシアル酸脱離、電荷の変化、酸化、重合若しくは切断による疎水性または分子サイズの変化、あるいは溶液条件に依存した変性などにより生じ得る。

洗浄で使用する緩衝液の具体的な条件は、不純物と目的たん白質の混合モード担体への親和性の違いが生じるような条件の中から選定されるが、好ましくはｐＨ４〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。電気伝導度は好ましくは０．０１〜３００ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは０．１〜２５０ｍＳ／ｃｍである。

親和性の違いが現れるような適当なｐＨは当業者であれば、混合モード担体の持つイオン交換基および疎水性相互作用基の組合せから適宜選択することが可能であるが、目的たん白質と不純物の等電点を参考に決定することができる。

例えば、後述の実施例１の場合、アンチトロンビンおよびノイラミニダーゼはいずれも等電点が酸性ｐＨにある酸性たん白質であるが、等電点がより中性に近いノイラミニダーゼは、陰イオン交換基を有する混合モード担体と結合しなくなるｐＨがアンチトロンビンに比較して高いことが推測される。

そこで、ノイラミニダーゼとアンチトロンビンの何れもが担体に吸着する酸性付近の条件（例えばｐＨ６．０）から、ノイラミニダーゼの等電点付近のｐＨへ少しずつ（例えば、０．２ずつ）緩衝液のｐＨを変えて目的たん白質と不純物の結合について確認することで、両たん白質の親和性の違いが現れる適当なｐＨを見つけ出すことが可能である。

また、ここで検討した個々のｐＨの条件において、ノイラミニダーゼと混合モード担体との疎水性相互作用を変化させるために塩を加えることで電気伝導度を調節し、両たん白質の親和性の違いが現れる適当な塩濃度を見つけ出すことが可能である。

例えば、ノイラミニダーゼとアンチトロンビンの何れもが担体に吸着する酸性条件（例えばｐＨ６．０）において、塩化ナトリウムを溶出緩衝液に１０ｍｍｏｌ／Ｌずつ加え、塩濃度を段階的に増加させることで、ノイラミニダーゼのみが担体との親和性が低下し溶出される条件を見出すことができる。

以上のような手順で検討を行い、ノイラミニダーゼがアンチトロンビンの品質に影響を及ぼさない最適なｐＨおよび塩濃度または電気伝導度の組合せを決定し、ノイラミニダーゼを中間洗浄により除去する条件を設定することができる。

本工程に使用する緩衝液としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどが挙げられる。

これらの濃度は０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせても利用できる。また、洗浄用の緩衝液は、第一の工程である目的たん白質を担体に吸着させる際の緩衝液の成分とは、上述の条件が一般的に異なる。

さらに、クロマトグラフィーに使用する緩衝液または洗浄に使用する緩衝液には、「アミノ酸を含有する緩衝液」を用いることができる。アミノ酸を含有する緩衝液には、アミノ酸の他に糖、酵素阻害物質などが含まれている緩衝液も含まれる。

アミノ酸、糖または酵素阻害物質としては、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジンなどのアミノ酸およびその誘導体、並びにグルコース、スクロース、ラクトースまたはシアル酸およびその誘導体などが挙げられる。

具体的には、例えば、３００ｍｍｏｌ／Ｌグリシンを含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）などが挙げられる。これらの緩衝液を用いて目的の品質を有する精製たん白質を得ることも可能であり、混合モードクロマトグラフィー他、各種クロマトグラフィーにおいて適用することができる。

混合モード担体に吸着した目的たん白質は、緩衝液の塩濃度または電気伝導度を上げるか、または、緩衝液のｐＨを変更することにより溶出される。この過程で目的たん白質は不純物と分離される。

本発明において、「不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液」としては、例えば、不純物と目的たん白質の担体への親和性の違いが現れるような緩衝液が挙げられる。具体的には、例えば、適当なｐＨおよび塩濃度（または電気伝導度）を有する緩衝液が挙げられる。該緩衝液のｐＨとしては、好ましくはｐＨ４〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。

前記緩衝液の電気伝導度は好ましくは０．０１〜３００ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは０．１〜２５０ｍＳ／ｃｍである。親和性の違いが現れるような適当なｐＨは当業者であれば、混合モード担体の持つイオン交換基および疎水性相互作用基の組合せから適宜選択することが可能であるが、目的たん白質と不純物の等電点を参考に決定することができる。

例えば、後述の実施例１の場合、アンチトロンビンおよびノイラミニダーゼの何れもが混合モード担体に吸着するｐＨ６．０から、塩基性側にｐＨを少しずつ上昇させ、ノイラミニダーゼおよびアンチトロンビンが順番に溶出されるようなｐＨを決定する。

次いで、溶出する緩衝液の塩濃度についても、例えば、個々のｐＨ条件において、１０ｍｍｏｌ／Ｌずつ段階的に上昇させることで、ノイラミニダーゼおよびアンチトロンビンが順番に溶出されるような塩濃度を決定する。

更に、検討したｐＨおよび塩濃度の組合せにおいて、ノイラミニダーゼおよびアンチトロンビンの分離が最も良好な条件を決定する。

溶出方法としては、目的たん白質と混合モード担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨの緩衝液を通液して溶出させる方法（一段階溶出法）、段階的に塩濃度またはｐＨを変化させてたん白質を溶出させる方法（ステップワイズ法）、連続的に塩濃度またはｐＨを変化させてたん白質を溶出させる方法（グラジエント法）のいずれでもよい。

溶出させるための緩衝液は、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどが挙げられる。

これらの濃度は０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせても利用できる。

さらに、緩衝液にはアミノ酸、糖、酵素阻害物質などが含まれてもよい。例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸およびその誘導体、グルコース、スクロース、ラクトースまたはシアル酸などが挙げられる。

具体的には、例えば、０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜８）、０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ４〜７）などが挙げられる。

第二の工程の第一段階では、担体に吸着した目的たん白質を洗浄する工程および溶出する工程の何れかを選定する、若しくは、両者を組み合わせることで、目的たん白質と不純物を分離する。

本発明において、ノイラミニダーゼの活性を抑制するために阻害剤を用いてもよい。阻害剤としては、例えば、シアル酸、アミノ酸または二価金属イオンなどが挙げられる。アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジンなどのアミノ酸並びにその誘導体が挙げられる。

これらのアミノ酸は、クロマトグラフィー工程、精製工程中間体またはプール液などの工程で利用される。これらの濃度は０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌである。

これらの濃度でアミノ酸を本発明の平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、または／および出発物質となるたん白質組成物に添加し、目的たん白質からのシアル酸脱離を抑制する。なお、アミノ酸添加によるノイラミニダーゼ阻害は本発明の混合モード担体を利用する精製工程に限定されず、何れの製造工程の一部に利用してもよい。

本発明の第二の工程の第二段階である「溶出液の特定の分画範囲を回収する工程」では、目的たん白質を混合モード担体から溶出後、特定の分画範囲を回収することで不純物を所望のレベルまで低減する。

前記分画範囲を決定するためには、予め２つ以上の画分に溶出液を分画し、個々の分画液について目的たん白質と不純物の含有量を測定することで、所望の品質の目的たん白質が含まれる分画液を１つ以上選定すればよい。この作業により、不純物が多く含まれている分画液を除外し、目的の品質となるような分画範囲を特定することができる。

本発明の技術を用いて、第一工程のクロマトグラフィーを終了した段階で、たん白質組成物より、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の目的たん白質を回収し、たん白質自身の品質に関連する不純物を除去し安定な品質のたん白質溶液が得られる。

本発明の技術を用いることで、「目的の品質」を有する精製たん白質を得ることができる。「目的の品質」とは、例えば、目的たん白質あたりのシアル酸結合数として最大付加可能数の好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であることが挙げられる。

さらに「目的の品質」としては、例えば、重合体または切断体の含有量が、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは１％以下に低減されていることも挙げられる。

目的の品質を有する精製たん白質として、具体的には、平均シアル酸結合数が１分子あたり６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上のアンチトロンビンα体、平均シアル酸結合数が１分子あたり４ｍｏｌ／ｍｏｌ以上のアンチトロンビンβ体、上記のアンチトロンビンα体とアンチトロンビンβ体の混合物、平均シアル酸結合数が１分子あたり８ｍｏｌ／ｍｏｌ以上のエリスロポエチン、平均シアル酸結合数が１分子あたり５ｍｏｌ／ｍｏｌ以上のプロテインＳ、重合体含有量が１％以下のアンチトロンビン、重合体含有量が１％以下のエリスロポエチン、重合体含有量が１０％以下のプロテインＳ、切断体が１０％以下のプロテインＳなどが挙げられる。

本発明は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法に関する。
（ａ）たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
（ｂ）陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程、
（ｃ）陰イオン交換担体をアミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および／または溶出することで不純物を除去する工程。
また、（ａ）〜（ｃ）の工程に更に、（ｄ）目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程、を加えてもよい。

また、本発明は、培養上清などのたん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させること、たん白質組成物から目的たん白質由来不純物を生成させる成分、または、目的たん白質由来不純物自身を速やかに分離・低減すること、アミノ酸を含有する緩衝液を用いること、溶出画分を選択することを適宜組み合わせることで目的の品質を有する精製たん白質を得る精製方法に関する。

本発明において、陰イオン交換担体を用いる場合のたん白質組成物から目的たん白質を精製する特徴的な手順としては、例えば、（１）たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させ目的たん白質を吸着させる工程、（２）目的たん白質の品質を制御する工程、の順に実施される。（２）の工程は更に、（２−１）不純物を分離し目的たん白質を溶出する工程、（２−２）溶出液の特定の分画範囲を回収する工程、に分類される。

本発明において、第一クロマトグラフィー工程に利用する陰イオン交換担体としては、陰イオン交換基を固相マトリックスに、直接または間接的に結合した担体または膜が挙げられる。陰イオン交換基、固相マトリックス、および陰イオン交換基と固相マトリックスとの結合は、前記と同様である。

具体的には、例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０（以上、東ソー社製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ（以上、Ｍｅｒｃｋ社製）またはセルファインＭＡＸ−Ｑ（ＪＮＣ社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明における第一の工程である、「たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させ目的たん白質を吸着させる工程」は、キャプチャーモード（吸着モード）で行われる。陰イオン交換担体を充てんしたカラムに、先述のたん白質組成物を接触させ、目的たん白質を担体に吸着させる。

たん白質を陰イオン交換担体に吸着させる条件としては、好ましくはｐＨ４〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。担体１ｍＬ当たりのたん白質の吸着量としては、１〜１００ｍｇが好ましく、より好ましくは５ｍｇ以上である。

電気伝導度は０．０１ｍＳ／ｃｍ〜５０ｍＳ／ｃｍが好ましく、より好ましくは０．１〜３０ｍＳ／ｃｍである。たん白質組成物に含有される目的たん白質のうち、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が吸着し、工程収率として好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が回収されるように、陰イオン交換担体の量が決定され利用される。

本発明の第二の工程の第一段階である「不純物を分離し目的たん白質を溶出する工程」では、目的たん白質を陰イオン交換担体から溶出するまでに不純物が所望のレベルまで除去または分離される。

除去または分離される第一の不純物としては、上記と同様の目的たん白質由来不純物を生成させる成分、すなわち、目的たん白質の性質を変化させる成分が挙げられる。除去または分離される第二の不純物としては、上記と同様の主に前述の第一の不純物により生じた目的たん白質由来不純物である。

本工程は、以下の手順で実施することができる。目的たん白質を陰イオン交換担体に吸着させた後、緩衝液で洗浄することにより、不純物を洗浄し除去する。不純物を洗浄する緩衝液の条件は、目的たん白質が担体に吸着した状態で不純物が吸着しない、または、不純物と担体との親和性が低下する好適な条件をｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度若しくは添加物などを変更することで選定する。

前記条件を選定する上で、不純物と目的たん白質の物理化学的性質の違い、例えば、等電点、電荷、疎水性度、分子サイズまたは立体構造などの違いを利用することができる。これらの違いは、目的たん白質よりシアル酸脱離、電荷の変化、酸化、重合若しくは切断による疎水性または分子サイズの変化、あるいは溶液条件に異存した変性などにより生じ得る。

洗浄で使用する緩衝液の具体的な条件は、不純物と目的たん白質の陰イオン交換担体への親和性の違いが生じるような条件の中から選定されるが、好ましくはｐＨ４〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。

電気伝導度は好ましくは０．０１〜３００ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは０．１〜２５０ｍＳ／ｃｍである。親和性の違いが現れるような適当なｐＨは当業者であれば、陰イオン交換担体の持つ陰イオン交換基から適宜選択することが可能であるが、上記と同様に目的たん白質と不純物の等電点を参考に決定することができる。

本工程に使用する緩衝液としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどが挙げられる。

これらの濃度は０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。また上記の塩は、例えば０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせても利用できる。また、洗浄用の緩衝液は、第一の工程である目的たん白質を担体に吸着させる際の緩衝液の成分とは、上述の条件が一般的に異なる。

さらに、クロマトグラフィーに使用する緩衝液、または洗浄に使用する緩衝液には、「アミノ酸を含有する緩衝液」を用いることができる。アミノ酸を含有する緩衝液には、アミノ酸の他に糖、酵素阻害物質などが含まれている緩衝液も含まれる。

アミノ酸としては、上記と同様の、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジンなどのアミノ酸およびその誘導体が挙げられ、糖としては、例えば、グルコース、スクロース、ラクトースまたはシアル酸およびその誘導体などが挙げられる。これらの緩衝液を用いて目的の品質を有する精製たん白質を得ることも可能であり、各種クロマトグラフィーにおいて適用することができる。

陰イオン交換担体に吸着した目的たん白質は、緩衝液の塩濃度または電気伝導度を上げるか、または、緩衝液のｐＨを変更することにより溶出される。この過程で目的たん白質は不純物と分離される。

本発明において、「不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液」としては、例えば、不純物と目的たん白質の担体への親和性の違いが現れるような緩衝液が挙げられる。具体的には、例えば、適当なｐＨおよび塩濃度（または電気伝導度）を有する緩衝液が挙げられる。

前記緩衝液のｐＨとしては、好ましくはｐＨ４〜９であり、より好ましくはｐＨ５〜８である。該緩衝液の電気伝導度は好ましくは０．０１〜３００ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは０．１〜２５０ｍＳ／ｃｍである。

親和性の違いが現れるような適当なｐＨは当業者であれば、陰イオン交換担体の持つ陰イオン交換基から適宜選択することが可能であるが、上記と同様に目的たん白質と不純物の等電点を参考に決定することができる。

溶出方法としては、目的たん白質と陰イオン交換担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨの緩衝液を通液して溶出させる方法（一段階溶出法）、段階的に塩濃度またはｐＨを変化させてたん白質を溶出させる方法（ステップワイズ法）、連続的に塩濃度またはｐＨを変化させてたん白質を溶出させる方法（グラジエント法）のいずれでもよい。

溶出させるための緩衝液としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどが挙げられる。

これらの濃度は０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。また前記の塩は、例えば、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせても利用できる。

さらに、緩衝液にはアミノ酸、糖、酵素阻害物質などが含まれてもよい。例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジンなどのアミノ酸およびその誘導体、グルコース、スクロース、ラクトース並びにシアル酸などが挙げられる。

具体的には、例えば、０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜８）、０〜１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ４〜７）などが挙げられる。

第二の工程の第一段階では、担体に吸着した目的たん白質を洗浄する工程および溶出する工程の何れかを選定する、若しくは、両者を組み合わせることで、目的たん白質と不純物を分離する。

本発明において、ノイラミニダーゼの活性を抑制するために阻害剤を用いてもよい。阻害剤としては、例えば、シアル酸、アミノ酸および二価金属イオンなどが挙げられる。アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはヒスチジンなどのアミノ酸並びにその誘導体が挙げられる。

これらのアミノ酸は、クロマトグラフィー工程、精製工程中間体またはプール液などの工程で利用される。これらの濃度は０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜４ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌである。

これらの濃度でアミノ酸を本発明の平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、または／および出発物質となるたん白質組成物に添加し、目的たん白質からのシアル酸脱離を抑制する。なお、アミノ酸添加によるノイラミニダーゼ阻害は本発明の陰イオン交換担体を利用する精製工程に限定されず、何れの製造工程の一部に利用してもよい。

本発明の第二の工程の第二段階である「溶出液の特定の分画範囲を回収する工程」では、目的たん白質を陰イオン交換担体から溶出後、特定の分画範囲を回収することで不純物を所望のレベルまで低減する。

前記分画範囲を決定するためには、予め２つ以上の画分に溶出液を分画し、個々の分画液について目的たん白質と不純物の含有量を測定することで、所望の品質の目的たん白質が含まれる分画液を１つ以上選定すればよい。この作業により、不純物が多く含まれている分画液を除外し、目的の品質となるような分画範囲を特定することができる。

本発明の技術を用いて、第一工程のクロマトグラフィーを終了した段階で、たん白質組成物より、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の目的たん白質を回収し、たん白質自身の品質に関連する不純物を除去し安定な品質のたん白質溶液が得られる。本発明の技術を用いることで、前記と同様の「目的の品質」を有する精製たん白質を得ることができる。

本発明において、たん白質の組成物を第一クロマトグラフィー工程である混合モード担体または陰イオン交換担体で精製した後、引き続き既存の精製方法を組み合わせることで、医薬品レベルの高純度のたん白質組成物が提供される。

既存の精製方法としては、例えば、混合モード担体、陰イオン交換担体、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体、サイズ排除担体、ゲルろ過担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体などの担体または膜のうちいずれか１つの担体または膜が使用される１以上のクロマトグラフィーを組み合わせる方法が挙げられる。また、緩衝液交換、濃縮、希釈、ろ過、ウイルス不活性化、ウイルス除去などの単位操作を適宜加えることもできる。

混合モード担体としては、例えば、前記と同様の混合モード担体が挙げられる。具体的には、例えば、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（以上、ポール社製）またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍ（東ソー社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

陰イオン交換担体としては、陰イオン交換基を固相マトリックスに、直接または間接的に結合した担体または膜が挙げられる。陰イオン交換基、固相マトリックス、および陰イオン交換基と固相マトリックスとの結合は、前記と同様である。

具体的には、例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ−６５０（以上、東ソー社製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ（以上、Ｍｅｒｃｋ社製）、セルファインＭＡＸ−Ｑ（ＪＮＣ社製）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（Ｐａｌｌ社製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＱまたはＳａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（以上、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。

陽イオン交換担体としては、例えば、陽イオン交換基を固相マトリックスに、直接若しくは間接的に結合した担体または膜が挙げられる。陽イオン交換基、固相マトリックス、および陽イオン交換基と固相マトリックスとの結合は、前記と同様である。

具体的には、例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ Ｓ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ５０ ＸＳ（以上、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ⁻、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＯ３⁻、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＥ Ｈｉｃａｐ（以上、Ｍｅｒｃｋ社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ ＣＭ−６５０（以上、東ソー社製）、セルファインＭＡＸ−Ｓ（ＪＮＣ社製）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｓ（Ｐａｌｌ社製）またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。

疎水性相互作用担体としては、例えば、疎水性相互作用基を固相マトリックスに、直接または間接的に結合した担体が挙げられる。疎水性相互作用基、固相マトリックス、および疎水性相互作用基と固相マトリックスとの結合は、前記と同様である。

具体的には、例えば、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＵＰＥＲ ＢＵＴＹＬ−５５０Ｃ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＢＵＴＹＬ−６５０Ｃ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＢＵＴＹＬ−６００Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＨＥＮＹＬ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＰＰＧ−６００Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ、ＴＳＫｇｅｌ Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（以上、東ソー社製）、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ ＨＩＣ担体シリーズ（バイオラッド社製）、セルファインフェニル、セルファインブチル（以上、ＪＮＣ社製）、ブチル化キトパールまたはフェニル化キトパール（以上、富士紡ホールディングズ社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

逆相クロマトグラフィー用担体としては、例えば、炭化水素基を固相マトリックスに、直接または間接的に結合した担体が挙げられる。炭化水素基としては、例えば、トリメチル基、ブチル基、フェニル基、オクチル基またはオクタデシル基、およびこれらの末端を改変した官能基等が挙げられる。

固相マトリックスおよび疎水性相互作用基と固相マトリックスとの結合は、前記と同様である。具体的には、例えば、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣシリーズまたはＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

サイズ排除担体またはゲルろ過担体としては、例えば、デキストラン、アリルデキストラン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、セルロース、アガロース、スチレン、ジビニルベンゼン、ポリビニルアルコール、シリカまたはキトサン等で構成されたポリマーからなる担体が挙げられる。

具体的には、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ、Ｓｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ（以上、ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷシリーズ、ＴＳＫｇｅｌ ＰＷシリーズ（以上、東ソー社製）、Ｂｉｏ ｇｅｌ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｂｉｏ ｇｅｌ Ｐ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（以上、バイオラッド社製）、セルファインＧＨ、セルファインＧＣＬ（以上、ＪＮＣ社製）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ０５、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＧＦ２０００、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ（以上、ポール社製）またはフラクトゲル ＢｉｏＳＥＣ（メルク社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。

ヒドロキシアパタイト担体としては、例えば、ＣＨＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ ＩまたはＴｙｐｅ ＩＩ（以上、バイオラッド社製）が挙げられるが、これに限定されない。また、フルオロアパタイト担体としては、例えば、ＣＦＴ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅ（バイオラッド社製）等が挙げられるがこれに限定されない。

硫酸化セルロース担体または硫酸化アガロース担体としては、例えば、セルファインサルフェイト、セルファインサルフェイトｍ、セルファインサルフェイトｃ、硫酸化セルロファインｍ、硫酸化セルロファインｃ、硫酸化セルファインｍまたは硫酸化セルファインｃ（以上、ＪＮＣ社製）またはＣａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳ（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。

既存の精製方法における、担体または膜を用いたクロマトグラフィーは、その目的に応じてキャプチャーモード（吸着モード）またはフロースルーモード（非吸着モード）で行われ、クロマトグラフィーに使用する緩衝液または洗浄に使用する緩衝液には、好適な条件をｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物などを変更することで選定する。

当該条件を選定する上で、不純物と目的たん白質の物理化学的性質の違い、例えば、等電点、電荷、疎水性度、分子サイズまたは立体構造などの違いを利用することができる。キャプチャーモードの溶出方法としては、目的たん白質と担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨの緩衝液を通液して溶出させる方法（一段階溶出法）、段階的に塩濃度またはｐＨを変化させてたん白質を溶出させる方法（ステップワイズ法）、連続的に塩濃度またはｐＨを変化させてたん白質を溶出させる方法（グラジエント法）のいずれでもよい。

以上の工程との組合せにより、医薬品として所望の品質の目的たん白質を得ることができる。

例えば、シアル酸結合率としては、７０％以上、好ましくは８０％以上に維持されたアンチトロンビン、エリスロポエチン、プロテインＳ、またはそれらの誘導体を医薬品レベルの純度で得ることができる。また、重合体または切断体の含有量としては、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下に低減されたアンチトロンビン、エリスロポエチン若しくはプロテインＳまたはその誘導体を得ることができる。

本発明において、シアル酸結合数は、該たん白質１分子に結合する平均のシアル酸分子数（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、具体的には、例えば、蛍光ＨＰＬＣ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４，１３８（１９８７）］またはレゾルシノール法などにより測定することができる。また、例えば、等電点電気泳動法またはキャピラリー等電点電気泳動法などによりシアル酸結合数を測定することもできる。

また、シアル酸結合率は、該たん白質において理論上最大となるシアル酸結合数（最大付加可能数）に対する、測定によって得られたシアル酸結合数の割合を示す。理論上最大となるシアル酸結合数は、例えば、アンチトロンビンα体で８ｍｏｌ／ｍｏｌ、アンチトロンビンβ体で６ｍｏｌ／ｍｏｌ、エリスロポエチンで１４ｍｏｌ／ｍｏｌ、プロテインＳで６ｍｏｌ／ｍｏｌである。

また、本発明において、アンチトロンビン、エリスロポエチン、プロテインＳ、またはその誘導体の重合体および切断体の含有量は、ゲルろ過ＨＰＬＣ法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、光散乱法または超遠心法等により測定することができる。

本発明の用途としては、医薬品、診断薬、食品または化学工業製品等の主成分として利用されるたん白質の精製が挙げられる。

本発明は、上述のたん白質の精製方法で精製されたたん白質を含有する組成物に関する。

本発明において、精製されたたん白質を含有する組成物としては、例えば、医薬製剤が挙げられる。

本発明の医薬製剤は、予防薬または治療薬として精製されたたん白質を単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の添加剤等と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した製剤として提供するのが好ましい。

製剤としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏またはテープ剤等が挙げられる。

経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤等が挙げられる。

乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖等の糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。

カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトール等の賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、またはグリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤および噴霧剤等が挙げられる。

注射剤は、塩溶液若しくはブドウ糖溶液、または両者の混合物からなる添加剤等を用いて調製される。または、精製されたたん白質を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。

座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の添加剤を用いて調製される。

また、噴霧剤は精製されたたん白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ精製されたたん白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。

添加剤としては、具体的には、例えば、乳糖またはグリセリン等が挙げられる。精製されたたん白質および用いる担体の性質により、エアロゾルまたはドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

本発明は、培養上清などのアンチトロンビン組成物を直接混合モード担体または陰イオン交換担体に接触させること、アンチトロンビン組成物から不純物を生成させる成分、または、不純物自身を速やかに分離・低減すること、アミノ酸を含有する緩衝液を用いること、溶出画分を選択することを適宜組み合わせることで目的の品質を有するアンチトロンビンを得る精製方法に関する。

培養上清などのアンチトロンビン組成物は、例えば、国際公開第２００８／１２０８０１号に記載の方法で得ることができる。

第一クロマトグラフィー工程である混合モード担体または陰イオン交換担体に用いられる担体および第一クロマトグラフィー工程の精製方法は、前記と同様である。

アンチトロンビン組成物を第一クロマトグラフィー工程である混合モード担体または陰イオン交換担体で精製した後、引き続き既存の精製方法を組み合わせることで、医薬品レベルの高純度のアンチトロンビンが提供される。

既存の精製方法は、前記と同様であるが、好ましくは陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、または疎水性相互作用担体の少なくとも１つを含む精製方法が挙げられる。

例えば、第二クロマトグラフィー工程として陰イオン交換担体または陰イオン交換膜、第三クロマトグラフィー工程として硫酸化セルロース担体または硫酸化アガロース担体、第四クロマトグラフィー工程として疎水性相互作用担体を含む精製アンチトロンビンを得る精製方法が挙げられる。

上記精製方法で得られた精製アンチトロンビンの平均シアル酸結合数は最大付加可能数の７０％以上である。

本発明は、培養上清などのプロテインＳ組成物を直接混合モード担体に接触させること、プロテインＳ組成物から不純物を生成させる成分、または、不純物自身を速やかに分離・低減すること、アミノ酸を含有する緩衝液を用いること、溶出画分を選択することを適宜組み合わせることで目的の品質を有するプロテインＳを得る精製方法に関する。

培養上清などのプロテインＳ組成物は、例えば、国際公開第２０１０／０１８８４７号に記載の方法で得ることができる。

第一クロマトグラフィー工程である混合モード担体に用いられる担体および第一クロマトグラフィー工程の精製方法は、前記と同様である。

プロテインＳ組成物を第一クロマトグラフィー工程である混合モード担体で精製した後、引き続き既存の精製方法を組み合わせることで、医薬品レベルの高純度のプロテインＳが提供される。既存の精製方法は、前記と同様であるが、好ましくは陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、またはヒドロキシアパタイト担体の少なくとも１つを含む精製方法が挙げられる。

例えば、第二クロマトグラフィー工程として陰イオン交換担体、第三クロマトグラフィー工程としてヒドロキシアパタイト担体を含む精製プロテインＳ体を得る精製方法が挙げられる。

以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］アンチトロンビン培養上清から混合モード担体を用いてシアリダーゼを除去し目的物を回収する方法の例
アンチトロンビン約３８０ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＡＡ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、カラム体積３８ｍＬ）に直接通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

１９５ｍＬの緩衝液ＡＡ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した後、１５２ｍＬの緩衝液ＡＢ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。

溶出前洗浄液ならびに特定の溶出範囲の溶出液中のアンチトロンビンの濃度を逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，６６２，２０９（１９９４）］で、またノイラミニダーゼ活性を酵素法［Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３，４５５（１９９３）］で測定した。その結果を表１に示す。

表１に示すように、所定の溶出液に回収されたアンチトロンビンの回収率は８４％と良好であった。溶出前洗浄液中にノイラミニダーゼを、また、溶出液中にアンチトロンビンを溶出させることができた。

比較例１に示した条件ではアンチトロンビン溶出液中にノイラミニダーゼ活性も同時に検出されたが、溶出前洗浄で使用する緩衝液の条件をノイラミニダーゼと混合モード担体との親和性を弱めるｐＨに設定することで、混合モードクロマトグラフィーにて培養上清から直接アンチトロンビンとノイラミニダーゼを極めて効果的に分離できることを見出した。

すなわち、混合モード担体に培養上清を直接通液し、アンチトロンビンを担体に吸着させ、ノイラミニダーゼを洗浄除去し、アンチトロンビンを溶出させ、溶出液の範囲をＨＰＬＣで選択することにより、アンチトロンビンの品質（シアル酸結合数）に影響する因子であるノイラミニダーゼを効果的に除去した組成物を得ることができた。

［実施例２］混合モード担体を用いたアンチトロンビンのシアル酸結合数調整の例（グリシン緩衝液の利用によりシアル酸結合数をより高める方法の例）
アンチトロンビン約３８０ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＡＣ（３００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、カラム体積３８ｍＬ）に直接通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

グリシンを含む１９５ｍＬの緩衝液ＡＣ（３００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した後、１５２ｍＬの緩衝液ＡＢ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。溶出後の特定の分画範囲に回収されたアンチトロンビンのシアル酸結合数を実施例１と同様の方法で測定した。

その結果、実施例２（平衡化および溶出前洗浄に緩衝液ＡＣを使用）の条件で精製した場合、実施例１（平衡化および溶出前洗浄に緩衝液ＡＡを使用）の条件で精製した場合に比較して、シアル酸結合数（アンチトロンビンの品質）は１．３倍に上昇した。溶出前洗浄で使用する緩衝液にグリシンを添加することにより、溶出されたアンチトロンビンの品質（シアル酸結合数）をさらに向上できることが分かった。

［実施例３］混合モード担体を用いたアンチトロンビンのシアル酸結合数調整の例（実施例２におけるグリシン緩衝液を他のアミノ酸緩衝液に代替できることを示す例）
比較例１の溶出工程で得られたアンチトロンビンを含む水溶液に、終濃度０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩またはグリシンを添加した。各溶液のノイラミニダーゼ活性を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果を図１に示す。

図１に示すように、アミノ酸の添加量が０ｍｍｏｌ／Ｌにおけるノイラミニダーゼの活性を１．０としたとき、１００ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩またはグリシンを添加することにより、相対活性が０．２程度となった。さらに、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以上のアルギニン、または３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上のグリシンを添加することにより、相対活性が０（検出限界以下）となった。

以上の結果から、グリシンをアルギニンなどのアミノ酸に置き換えることで、実施例２と同様の精製が行えることが示された。

［実施例４］混合モード担体と他のクロマトグラフィーとの組合せによるアンチトロンビンα体のフル精製の例
アンチトロンビン約１．４３ｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、実施例２と同様の方法（但し、緩衝液ＡＣの代わりにＡＤ（４５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を用いた）で精製し、特定範囲を回収することで回収液２３６ｍＬを得た。本工程で回収されたアンチトロンビンの回収率は８０％と良好であった。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液にＴｒｉｔｏｎＸ−１００が１％、リン酸トリブチルが０．３％になるように各試薬を混合した後、静かに攪拌した。本溶液を精製水で数倍に希釈した後、緩衝液ＡＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化したカラム（メルクミリポア社製、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ、カラム体積１９．６ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

３カラム体積の緩衝液ＡＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いてカラムを洗浄した後、４カラム体積の緩衝液ＡＢ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液に、リン酸ナトリウム緩衝液または精製水を添加し、ｐＨを６．０、電気伝導度を２５．２ｍＳ／ｃｍに調整した。本溶液を緩衝液ＡＦ（１７０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化したカラム（ＪＮＣ社製、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ、カラム体積２３．７ｍＬ）を通過させ、カラムを素通りした溶液を回収し、中和した。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を、緩衝液ＡＧ（１．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で数倍に希釈した。本溶液を緩衝液ＡＨ（１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）にて平衡化したカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、カラム体積４．９ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

２カラム体積の緩衝液ＡＨ（１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）にてカラム洗浄した後、クエン酸ナトリウム直線濃度勾配にて、アンチトロンビンを溶出させた。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を、限外ろ過膜（メルクミリポア社製、分画分子量１０キロダルトン）で適当な濃度に濃縮した後、緩衝液ＡＩ（２０ｇ／Ｌグリシン、１２ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に交換した。本溶液のシアル酸結合数を実施例１と同様の方法で測定した。

その結果、シアル酸結合数は６．７ｍｏｌ／ｍｏｌ（結合率８４％）と算出され、マルチモード担体と他のクロマトグラフィー工程の組合せにより、シアル酸結合数が６以上（結合率７５％以上）のアンチトロンビンα体を精製できることが分かった。

［実施例５］培養上清からアンチトロンビンを直接回収する場合の混合モード担体と陰イオン交換担体の比較
ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、メルクミリポア社製、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ、東ソー社製、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ−６００Ｃ ＡＲを、１ｍＬずつチューブに分注した後、緩衝液ＡＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化し５０％スラリー（計２ｍＬ）とした。

本スラリーにアンチトロンビンを含むＣＨＯ細胞培養上清（１１ｍＬ）をそれぞれ直接添加し、室温にて一晩攪拌した。攪拌終了後、上清中のアンチトロンビン濃度を実施例１と同様の方法で測定した。培養上清に対するアンチトロンビンの減少量から、単位担体量（１Ｌ）あたりのアンチトロンビンの吸着量（ｇ）を、以下の計算式にて算出した。その結果を図２に示す。
（単位担体量（１Ｌ）あたりのアンチトロンビン吸着量）＝［（培養上清中のアンチトロンビン量）−（担体処理液上清のアンチトロンビン量）］／（担体体積）

図２に示すとおり、混合モード担体であるＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅは、他の陰イオン交換担体に比べて著しく高い吸着量を示した。

以上の結果から、培養液中のアンチトロンビンは、混合モード担体に比較し、陰イオン交換担体では半分以下しか吸着しないことが分かった。すなわち、陰イオン交換担体へのアンチトロンビン吸着量は著しく低く、工業的なスケールで培養液からの直接精製に利用するには適切でないことが確認された。

［実施例６］培養上清から混合モード担体を用いて直接プロテインＳを回収する方法、および、陰イオン交換クロマト担体との収率の違い
プロテインＳ２０．０ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清（ｐＨを５．０に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの）を、緩衝液ＰＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム体積３．９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

１９．６ｍＬの緩衝液ＰＡでカラムを洗浄した後、３９．３ｍＬの緩衝液ＰＢ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。

その後１９．６ｍＬの溶液ＰＣ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（１）と称す。］

プロテインＳ８４．９ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＡで平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム体積３．９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

２４．９ｍＬの緩衝液ＰＡでカラム洗浄した後、３９．３ｍＬの緩衝液ＰＢを送液し、プロテインＳを溶出させた。その後２０．１ｍＬの溶液ＰＣ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、５００ｍｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（２）と称す。］

プロテインＳ２０．０ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（メルクミリポア社製、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＥ Ｈｉｃａｐ、カラム体積３．９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

２４．１ｍＬの緩衝液ＰＡでカラムを洗浄した後、３９．３ｍＬの緩衝液ＰＢ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。

その後１９．６ｍＬの溶液ＰＣ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（３）と称す。］

プロテインＳを８〜１０ｍｇ含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＧ（２０ｍｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸塩、１５０ｍｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、カラム体積０．９８ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

７．９ｍＬの緩衝液ＰＧにてカラム洗浄した後、７．９ｍＬの緩衝液ＰＨ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を送液し、プロテインＳを溶出させた。その後７．９ｍＬの緩衝液ＰＩ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸塩、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（４）と称す。］

プロテインＳを８〜１０ｍｇ含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＧで平衡化した陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ Ｑ、カラム体積０．９８ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

７．９ｍＬの緩衝液ＰＧにてカラム洗浄した後、７．９ｍＬの緩衝液ＰＨを送液し、プロテインＳを溶出させた。その後７．９ｍＬの緩衝液ＰＩを通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（５）と称す。］

プロテインＳの培養上清、および、精製（１）〜（５）における溶出前洗浄液ならびに溶出液中のプロテインＳを逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，６６２，２０９（１９９４）］で測定し、回収率を計算した。その結果を表２に示す。

表２に示すように、混合モード担体におけるプロテインＳの工程収率は負荷量にかかわらず８０％以上と良好であった。一方、他の担体は１ｍＬあたりの吸着量が１０ｍｇ以下と低いにもかかわらず回収率は２５％以下と著しく低かった。

この結果が示すように、イオン交換担体へのプロテインＳ吸着量は非常に低く、工業的なスケールで培養液から直接精製するには適切でないことが確認された。

［実施例７］混合モード担体を用いた培養上清からのプロテインＳ精製における重合体の除去
プロテインＳ８４．４ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清のｐＨを５．０に調整し、遠心操作により沈殿物を除去した。この溶液を緩衝液ＰＪ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸、ｐＨ５．３）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム堆積３．９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

１９．６ｍＬの緩衝液ＰＪにてカラム洗浄した後、３６．９ｍＬの緩衝液ＰＫ（２００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。その後１９．６ｍＬの溶液ＰＬ（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。その結果を図３に示す。

溶出画分中のプロテインＳの重合体の有無についてＮａｔｉｖｅ−Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより分析した。４−１２％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ（インビトロジェン社製）に各分画液をプロテインＳたん白質量が１μｇになるように添加し、泳動した。その後ＰＶＤＦメンブレンにたん白質を転写し、一次抗体・二次抗体を用いてプロテインＳを標識し、ＨＲＰ発色によりプロテインＳのバンド像を得た。その結果を図４に示す。

図３および図４に示す結果から、目的の品質のプロテインＳを含む画分をＢ〜Ｅと決定した。この範囲の溶出液に含まれるプロテインＳの回収率は８４％であり、重合体の含量も少なかった。

以上のように、混合モード担体に培養上清を直接通液し、プロテインＳを担体に吸着させ、洗浄工程を経た後、適切なｐＨならびに塩濃度条件を選択し、プロテインＳを溶出させ、溶出範囲を選択することでプロテインＳの重合体を良好に除去した画分を得ることができた。

［実施例８］培養上清からのプロテインＳ精製における混合モード担体と疎水クロマトグラフィー担体における純度と重合体分画能の違い
プロテインＳ９．９ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清のｐＨをリン酸で５．０に調整し、遠心操作により沈殿物を除去した。この溶液を緩衝液ＰＭ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム体積０．９８ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

９．８ｍＬの緩衝液ＰＭにてカラムを洗浄した後、緩衝液ＰＮ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸塩、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。［これを精製（６）と称す］。精製（６）の溶出ピークの分画パターンを図５に示す。

プロテインＳ１０．７ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清に溶液ＰＯ（飽和クエン酸ナトリウム溶液に塩化ナトリウムを加えたもの）を総体積の３０％になるように添加し（前処理）、遠心操作により沈殿物を除去した。

この溶液を、溶液ＰＰ（溶液ＰＯを超純水で３倍希釈したもの）で平衡化した疎水クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ、０．９８ｍＬ）に直接通過させ、プロテインＳを吸着させた。１５．５ｍＬの溶液ＰＰでカラムを洗浄した後、精製水を送液しプロテインＳを溶出させた［これを精製（７）と称す］。精製（７）の溶出ピークの分画パターンを図６に示す。なお、プロテインＳの培養上清を直接疎水モード担体に流した場合には、プロテインＳは吸着しなかった。

精製（６）、精製（７）のメインピーク部分の分画液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。４−２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ（インビトロジェン社製）に各分画液をプロテインＳたん白質量が２．５μｇになるように添加し、泳動後ＣＢＢ染色を行った。その結果を図７に示す。

図７に示すように、精製（６）で取得した溶出液の方が精製（７）で取得した溶出液よりもプロテインＳ純度が高いことが分かった。また、精製（６）ではプロテインＳのバンドより高分子量領域にバンドが見られないことから、混合モード担体精製は疎水クロマトグラフィー精製より重合体の除去に優れていることが分かった。

［実施例９］混合モード担体を用いたアンチトロンビンのシアル酸結合数調整の例（グリシン緩衝液の利用によりシアル酸結合数をより高める方法の例）
アンチトロンビン４２８ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＡＣ（３００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、カラム体積２８．５ｍＬ）に直接通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

グリシンを含む２２８ｍＬの緩衝液ＡＣ（３００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した後、１４３ｍＬの緩衝液ＡＢ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。溶出後の特定の分画範囲に回収されたアンチトロンビンのシアル酸結合数を実施例１と同様の方法で測定した。

その結果、実施例９（平衡化および溶出前洗浄に緩衝液ＡＣを使用）の条件で精製した場合、実施例１（平衡化および溶出前洗浄に緩衝液ＡＡを使用）の条件で精製した場合に比較して、シアル酸結合数（アンチトロンビンの品質）は１．３倍に上昇した。溶出前洗浄で使用する緩衝液にグリシンを添加することにより、溶出されたアンチトロンビンの品質（シアル酸結合数）をさらに向上できることが分かった。

［実施例１０］培養上清から混合モード担体を用いて直接プロテインＳを回収する方法、および、陰イオン交換担体との収率の違い
プロテインＳ１９．９ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清（ｐＨを５．０に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの）を、緩衝液ＰＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム体積３．９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

１９．６ｍＬの緩衝液ＰＡでカラムを洗浄した後、４１．９ｍＬの緩衝液ＰＢ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。その後１９．６ｍＬの緩衝液ＰＣ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（１）と称す。］

プロテインＳ８７．７ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＡで平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム体積３．９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。２４．９ｍＬの緩衝液ＰＤ（５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）でカラム洗浄した後、３９．３ ｍＬの緩衝液ＰＥ（５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。

その後２０．１ｍＬの緩衝液ＰＦ（５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（２）と称す。］

プロテインＳ２１．８ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（メルクミリポア社製、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳＥ Ｈｉｃａｐ、カラム体積３．９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

１８，３ｍＬの緩衝液ＰＡでカラムを洗浄した後、３９．３ｍＬの緩衝液ＰＢ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。その後１９．６ｍＬの緩衝液ＰＣ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（３）と称す。］

プロテインＳを８〜１０ｍｇ含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＧ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸塩、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、カラム体積０．９８ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

７．９ｍＬの緩衝液ＰＧにてカラム洗浄した後、７．９ｍＬの緩衝液ＰＨ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を送液し、プロテインＳを溶出させた。その後７．９ｍＬの緩衝液ＰＩ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸塩、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．４）を通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（４）と称す。］

プロテインＳを８〜１０ｍｇ含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＰＧで平衡化した陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ Ｑ、カラム体積０．９８ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。７．９ｍＬの緩衝液ＰＧにてカラム洗浄した後、７．９ｍＬの緩衝液ＰＨを送液し、プロテインＳを溶出させた。その後７．９ｍＬの緩衝液ＰＩを通液し、カラム内に残存するプロテインＳを溶出させた。［これを精製（５）と称す。］

プロテインＳの培養上清、および、精製（１）〜（５）における溶出前洗浄液ならびに溶出液中のプロテインＳを逆相ＨＰＬＣ法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，６６２，２０９（１９９４）］で測定し、回収率を計算した。その結果を表３に示す。

表３に示すように、混合モード担体におけるプロテインＳの工程収率は負荷量にかかわらず８０％以上と良好であった。一方、他の担体は１ｍＬあたりの吸着量が１０ｍｇ以下と低いにもかかわらず回収率は２５％以下と著しく低かった。

この結果が示すように、イオン交換担体へのプロテインＳ吸着量は非常に低く、工業的なスケールで培養液から直接精製するには適切でないことが確認された。

［実施例１１］培養上清から混合モード担体を用いて直接エリスロポエチンを回収する方法
エリスロポエチン１１８ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＥＡ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ６．４）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、カラム体積５．９ｍＬ）に直接通過させることにより、エリスロポエチンを吸着させた。

２９．５ｍＬの緩衝液ＥＡ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ６．４）でカラムを洗浄した後、２９．５ｍＬの緩衝液ＥＡ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ６．４）と緩衝液ＥＢ（５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ６．４）を用いた塩化ナトリウム濃度勾配で、エリスロポエチンを溶出させた。

溶出前洗浄液および特定の溶出範囲の溶出液中のエリスロポエチンの濃度を抗エリスロポエチン抗体を固定化したセンサーチップを用いた表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、ＧＥヘルスケア社製）を利用して測定した。

その結果、単位担体量（１Ｌ）あたりのエリスロポエチン吸着量は３ｇであった。よって、培養上清から混合モード担体を用いて直接エリスロポエチンを回収できることが分かった。

［実施例１２］アミノ酸添加によるノイラミニダーゼおよびプロテアーゼ活性の抑制（プロテインＳを含む水溶液）
２９９ｍｇのプロテインＳを含むＣＨＯ細胞培養上清（ｐＨを５．０に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの）を、緩衝液ＰＱ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液、ｐＨ５．０）で平衡化した混合モード担体カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム体積３２．８ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

１６４ｍＬの緩衝液ＰＱ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液、ｐＨ５．０）でカラムを洗浄した後、２６２．４ｍＬの緩衝液ＰＲ（１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させた。

このプロテインＳを含む水溶液に、ノイラミニダーゼ（ナカライテスク社製）を終濃度が０．０００５Ｕ／ｍＬになるように添加した。対照にはノイラミニダーゼの添加量と同様の精製水を添加した。さらに終濃度が１．０ｍｏｌ／Ｌになるようにグリシン、または精製水を添加し、３７℃で３時間静置した。

調製品の溶媒を精製水で置換した後、等電点電気泳動法（ｐＨ３−７ ＩＥＦ Ｇｅｌ、インビトロジェン社製、プロテインＳたん白質の添加量１０μｇ）による解析を行った。その結果を図８に示す。

図８に示すように、精製水を添加したプロテインＳを含む水溶液の泳動像は塩基性側に移動した。一方で、グリシンを添加したプロテインＳを含む水溶液の泳動像は、開始前の泳動像よりも塩基性側に移動しているものの、主なバンドは精製水を添加したものよりも全体的に酸性側にあることが確認された。

本結果より、アミノ酸添加によりノイラミニダーゼの活性が抑制され、プロテインＳの品質（シアル酸結合数）を維持できることが示された。

同様に、上記６に記載した混合モード担体を用いたクロマトグラフィー工程にて得られたプロテインＳを含む水溶液に、グリシン（終濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ）、アルギニン（終濃度０．４ｍｏｌ／Ｌ）または精製水をそれぞれ添加し、２５℃もしくは４℃で６日間静置した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（４−２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ、インビトロジェン社製、プロテインＳたん白質の添加量２．４μｇ）により解析した。その結果を図９に示す。

図９に示すように、精製水を添加した検体では、プロテインＳが完全に切断体に変換されているのに対し、グリシンおよびアルギニンを添加した検体では、プロテインＳの切断体への変換が抑制されていることが確認された。本結果より、アミノ酸添加によりプロテアーゼの活性が抑制され、プロテインＳの切断体の形成を抑制できることが示された。

［実施例１３］アミノ酸添加によるノイラミニダーゼ活性の抑制（エリスロポエチンを含む水溶液）
精製水、１ｍｏｌ／Ｌアラニン溶液、１ｍｏｌ／Ｌアルギニン溶液または１ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液を、それぞれエリスロポエチンを含む培養液と等量混合し、２５℃で７日間静置した。その後、抗エリスロポエチン抗体固定化アフィニティーカラムを用いてエリスロポエチンを精製した後、エリスロポエチンに結合しているシアル酸の数をキャピラリー電気泳動装置［Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３（９）１５９６-１５９９（２０１０）］にて測定した。その結果を図１０に示す。

図１０に示すように、精製水を添加した溶液ではシアル酸結合数の比較的高い成分が消失しているのに対し、アミノ酸を添加した溶液では精製水を添加した溶液と比較してシアル酸結合数が保持された。効果はアルギニン、グリシン、アラニンの順に強く、特にアルギニン添加条件ではインキュベート開始時と比較してシアル酸結合数が同等であった。本結果から、アミノ酸添加によりエリスロポエチン水溶液に含まれるノイラミニダーゼの活性が抑制されていることが示された。

［実施例１４］アミノ酸添加と他のクロマトグラフィーとの組合せによるアンチトロンビンα体精製の例
アンチトロンビン５．７９ｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を精製水で数倍に希釈した後、緩衝液ＡＲ（３００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化したカラム（メルク社製、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ、カラム体積４５６ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

６カラム体積の緩衝液ＡＲ（３００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いてカラムを洗浄した後、４カラム体積の緩衝液ＡＳ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させ、回収液９５４ｍＬを得た。この回収液を緩衝液ＡＴ（２５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液、ｐＨ１０．０）でｐＨ７．０に調整した。本工程で回収されたアンチトロンビンの回収率は９５％と良好であった。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液にＴｒｉｔｏｎＸ−１００が１％、リン酸トリブチルが０．３％になるように各試薬を混合した後、静かに攪拌した。本溶液を精製水で数倍に希釈した後、緩衝液ＡＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化したカラム（メルク社製、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ、カラム体積２０９ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

３カラム体積の緩衝液ＡＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いてカラムを洗浄した後、４カラム体積の緩衝液ＡＳ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。この回収液を緩衝液ＡＴ（２５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン緩衝液、ｐＨ１０．０）でｐＨ７．０に調整した。本工程で回収されたアンチトロンビンの回収率は１００％と良好であった。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液に、リン酸ナトリウム緩衝液または精製水を添加し、ｐＨを６．０、電気伝導度を２４．１ｍＳ／ｃｍに調整した。本溶液を緩衝液ＡＵ（１６０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化したカラム（ＪＮＣ社製、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ、カラム体積５３０ｍＬ）を通過させ、カラムを素通りした溶液を回収し、中和した。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を、緩衝液ＡＧ（１．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で数倍に希釈した。本溶液を緩衝液ＡＨ（１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）にて平衡化したカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、カラム体積１７７ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

２カラム体積の緩衝液ＡＨ（１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）にてカラム洗浄した後、クエン酸ナトリウム直線濃度勾配にて、アンチトロンビンを溶出させた。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を、限外ろ過膜（メルク社製、分画分子量１０キロダルトン）で適当な濃度に濃縮した後、緩衝液ＡＩ（２０ｇ／Ｌグリシン、１２ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に交換し、精製アンチトロンビンα体を含む水溶液を得た。

本溶液のシアル酸結合数を実施例１と同様の方法で測定した。その結果、シアル酸結合数は６．６ｍｏｌ／ｍｏｌ、シアル酸結合率は８３％と算出された。

［実施例１５］混合モード担体と他のクロマトグラフィーとの組合せによるアンチトロンビンα体精製の例
アンチトロンビン３．１４ｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、実施例２と同様の方法（但し、緩衝液ＡＣの代わりにＡＤ（４５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を用いた、カラム体積を１１４ｍＬにした）で精製し、特定範囲を回収することで回収液７０６ｍＬを得た。本工程で回収されたアンチトロンビンの回収率は８９％と良好であった。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液にＴｒｉｔｏｎＸ−１００が１％、リン酸トリブチルが０．３％になるように各試薬を混合した後、静かに攪拌した。本溶液を精製水で数倍に希釈した後、緩衝液ＡＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化したカラム（メルク社製、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ、カラム体積２８．５ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

３カラム体積の緩衝液ＡＥ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を用いてカラムを洗浄した後、４カラム体積の緩衝液ＡＢ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液に、リン酸ナトリウム緩衝液または精製水を添加し、ｐＨを６．０、電気伝導度を３４．８ｍＳ／ｃｍに調整した。本溶液を緩衝液ＡＦ（１７０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化したカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳ、カラム体積２３．７ｍＬ）を通過させ、カラムを素通りした溶液を回収し、中和した。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を、緩衝液ＡＧ（１．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で数倍に希釈した。本溶液を緩衝液ＡＨ（１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）にて平衡化したカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、カラム体積２３．７ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

２カラム体積の緩衝液ＡＨ（１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）にてカラム洗浄した後、クエン酸ナトリウム直線濃度勾配にて、アンチトロンビンを溶出させた。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を、限外ろ過膜（メルク社製、分画分子量１０キロダルトン）で適当な濃度に濃縮した後、緩衝液ＡＩ（２０ｇ／Ｌグリシン、１２ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に交換し、精製アンチトロンビンα体を含む水溶液を得た。本溶液のシアル酸結合数を実施例１と同様の方法で測定した。その結果、シアル酸結合数は６．９ｍｏｌ／ｍｏｌ、シアル酸結合率８６％と算出された。

［実施例１６］混合モード担体と他のクロマトグラフィーとの組合せによるプロテインＳ精製の例
プロテインＳ１０２．１ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清（ｐＨ５．０に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの）を、緩衝液ＰＱ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液、ｐＨ５．０）で平衡化した混合モード担体カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、カラム体積１５．７ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

７８．５ｍＬの緩衝液ＰＱ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液、ｐＨ５．０）でカラムを洗浄した後、１５７ｍＬの緩衝液ＰＲ（１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させ、プロテインＳを含む水溶液２４２．２ｍＬを回収した。本工程で回収されたプロテインＳの回収率は８９．５％と良好であった。

上記工程にて回収したプロテインＳを含む水溶液にグリシン溶液を終濃度が１．０ｍｏｌ／Ｌをになるように添加した後、静かに攪拌した。本溶液を緩衝液ＰＳ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化したカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、カラム体積１７．７ｍＬ）を通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

８８．５ｍＬの緩衝液ＰＳ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．０）を用いてカラムを洗浄した後、３５４ｍＬの緩衝液ＰＴ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液、ｐＨ７．０）を送液し、プロテインＳを溶出させ、プロテインＳを含む水溶液２６．１７ｍＬを回収した。

上記工程にて回収したプロテインＳを含む水溶液に、グリシン溶液を終濃度が１．０ｍｏｌ／Ｌになるように添加した後、静かに攪拌した。本溶液を緩衝液ＰＵ（１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化したカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ＣＨＴ ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ、カラム体積１７．７ｍＬ）を通過させ、プロテインＳを吸着させた。

８８．５ｍＬの緩衝液ＰＵ（１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）を用いてカラムを洗浄した後、３５４ｍＬの緩衝液ＰＶ（４００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）を送液し、プロテインＳを溶出させ、プロテインＳを含む水溶液４４．２９ｍＬを回収した。

上記工程にて回収したプロテインＳを含む水溶液を、限外ろ過膜（メルク社製、分画分子量３０キロダルトン）で適当な濃度に濃縮した後、緩衝液ＰＷ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム溶液、ｐＨ７．４）に交換した。本精製工程における精製収率は３０．８％であった。

実施例１６に記載された方法で取得したプロテインＳ（以下、プロテインＳ−実施例１６と称す）と、比較例３に記載された方法で取得したプロテインＳ（以下、プロテインＳ−比較例３と称す）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（４−２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ、インビトロジェン社製、プロテインＳたん白質添加量２．４μｇ）により解析した結果を図１１に示す。

図１１に示すように、プロテインＳ−実施例１６のほうが不純物の含量が少なかった。

プロテインＳ−実施例１６とプロテインＳ−比較例３をそれぞれ３７℃下で３日間静置した検体と、−２０℃に凍結した検体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（４−２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ、インビトロジェン社製、プロテインＳたん白質添加量２．４μｇ）により解析した結果を図１２に示す。

図１２に示すように、プロテインＳ−実施例１６では変化が見られなかったのに対し、プロテインＳ−比較例３では切断体が増加した。よって、混合モード担体を用い、かつアミノ酸を用いた精製系を用いることで、プロテインＳの純度が向上し、かつ切断体の増加の原因となるプロテアーゼの除去に効果的であることがわかった。

［比較例１］アンチトロンビン培養上清の精製において混合モード担体を用いた通常の方法ではノイラミニダーゼを分離できないことを示す例
アンチトロンビン約３８０ｍｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、緩衝液ＡＪ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で平衡化した混合モードカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ、カラム体積３８ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

１９５ｍＬの緩衝液ＡＪ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、１５２ｍＬの緩衝液ＡＢ（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。

溶出前洗浄液ならびに溶出液中のアンチトロンビンの濃度、ノイラミニダーゼ活性を実施例１と同様に測定した。その結果を表４に示す。

表４に示すように、溶出液中にアンチトロンビンとノイラミニダーゼが同時に検出され、溶出前洗浄を実施したとしても、本精製法ではアンチトロンビンとノイラミニダーゼを分離することができなかった。

［比較例２］濃縮・希釈処理した培養液をアミノ酸非添加のクロマトグラフィー精製した場合にアンチトロンビンα体の品質へ影響することを示す例
アンチトロンビン約３５．３ｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、限外ろ過膜（メルクミリポア社製、分画分子量３０キロダルトン）にて約１０倍濃縮した。上記工程で得た濃縮液にＴｒｉｔｏｎＸ−１００が１％、リン酸トリブチルが０．３％になるように混合した後、静かに攪拌した。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を精製水で数倍に希釈した後、緩衝液ＡＫ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化したカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、カラム体積４０４ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

５カラム体積の緩衝液ＡＫ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した後、６カラム体積の緩衝液ＡＬ（１６０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を送液し、アンチトロンビンを溶出させた。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液に、リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、ｐＨを６．０、電気伝導度を７ｍＳ／ｃｍに調整した。本溶液を緩衝液ＡＭ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で平衡化したカラム（ＪＮＣ社製、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ、カラム体積６０８ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

５カラム体積の緩衝液ＡＭ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）にてカラム洗浄した後、緩衝液ＡＭ（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）と緩衝液ＡＮ（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）による塩化ナトリウム直線濃度勾配にて、アンチトロンビンを溶出し，回収液を中和した。

上記工程にて回収したアンチトロンビンを含む水溶液を限外ろ過膜（メルクミリポア社製、分画分子量３０キロダルトン）で約１０倍以上濃縮した後、沈殿をろ過した。

上記工程で回収したアンチトロンビンを含む水溶液に、緩衝液ＡＯ（３ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）を加えて数倍に希釈した。本溶液を緩衝液ＡＰ（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化したカラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、カラム体積３０４ｍＬ）を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。

３カラム体積の緩衝液ＡＰ（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）でカラムを洗浄した後、硫酸ナトリウム直線濃度勾配にて、アンチトロンビンを溶出させた。

上記工程にて回収したアンチトロンビンα体を含む水溶液を、限外ろ過膜（分画分子量１０キロダルトン）で適当な濃度に濃縮した後、緩衝液ＡＱ（２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で交換した。本溶液を最終精製品とした。

最終精製品に含まれるアンチトロンビンα体のシアル酸結合数を実施例１と同様の方法で測定した。実施例４に比べシアル酸結合数は少なく、４．５ｍｏｌ／ｍｏｌ（結合率５６％）まで低下した。

以上のように、陰イオン交換担体を初段精製に用いた場合には、培養上清の濃縮、および希釈が必要である。培養上清を濃縮した場合には、培養上清に含まれるノイラミニダーゼが濃縮され、その活性によりアンチトロンビンのシアル酸が切断されることで、精製サンプルのシアル酸結合数が低下したと考えられた。

以上のように、陰イオン交換担体を初段クロマトグラフィーとして使用し、たん白質組成物を直接精製しても、品質を維持したアンチトロンビンを精製するのは困難であることがわかった。

［比較例３］プロテインＳの培養上清の精製において混合モード担体を用いずに精製する方法では収率が低く、切断体の増加の原因となるプロテアーゼが除去できないことを示す例
プロテインＳ１６．１ｇを含むＣＨＯ細胞培養上清を、限外濾過膜（メルク社製、分画分子量１０キロダルトン）を用いて濃縮後、緩衝液ＰＸ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に緩衝液置換を行うとともに、濃縮液を約２倍希釈した。調製した溶液を緩衝液ＰＹ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、カラム体積５８９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。

５．９Ｌの緩衝液ＰＹ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した後、１．８Ｌの緩衝液ＰＺ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ７．４）を送液して再度カラムの洗浄を行った。

その後、５．９Ｌの緩衝液Ｐａ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）を用いてプロテインＳを溶出させ、プロテインＳを含む水溶液を回収した。

上記工程にて回収したプロテインＳを含む水溶液を、限外濾過膜（メルク社製、分画分子量１０キロダルトン）を用いて約６倍濃縮後、緩衝液ＰＹに緩衝液置換を行った。調製した溶液を、緩衝液ＰＹで平衡化した陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社製、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、カラム体積３９３ｍＬ）に直接通過させ、２．０Ｌの緩衝液Ｐｂ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、２００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でカラムを洗浄後、３．９Ｌの緩衝液Ｐｃ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出させ、プロテインＳを含む水溶液を回収した。

上記工程にて回収したプロテインＳを含む水溶液を、緩衝液ＰＵ（１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）で平衡化したカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、カラム体積５８９ｍＬ）に直接通過させることにより、プロテインＳを吸着させた。２．９Ｌの緩衝液ＰＵ（１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）でカラムを洗浄後、緩衝液Ｐｄ（５００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８）でプロテインＳを溶出させ、プロテインＳを含む水溶液を回収した。

上記工程にて回収したプロテインＳを含む水溶液を、カラム体積１９６ｍＬのカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）を用いて、上記工程と同様の方法で再度精製操作を行った。

上記工程にて得られたプロテインＳを含む溶液を、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（旭化成メディカル社製）でフィルトレーション後、限外濾過膜（メルク社製、分画分子量１０キロダルトン）を用いて濃縮後、緩衝液緩衝液ＰＷ（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム溶液、ｐＨ７．４）に交換した。本精製工程における精製収率は３．７％と、実施例１４の１／１０程度であった。

本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１１年６月２９日付で出願された米国仮出願（６１／５０２４２６）に基づいており、その全体が引用により援用される。

本発明により、たん白質組成物から不純物を速やかに分離し所望のたん白質を効率的に回収することができる。

Claims (5)

1. 少なくとも以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
   （ａ）アンチトロンビン組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
   （ｂ）陰イオン交換担体を０．１ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌのグリシンを含有する緩衝液で、洗浄することで、ノイラミニダーゼの活性を阻害し、且つ不純物を除去する工程、
   （ｃ）陰イオン交換担体を、アンチトロンビンと陰イオン交換担体との親和性を弱める緩衝液で溶出することで、シアル酸結合数が最大付加可能数の７０％以上である精製アンチトロンビンの画分のみを得る工程。
2. 精製アンチトロンビンの回収率が５０％以上である請求項１に記載の精製方法。
3. 第一クロマトグラフィー工程の後に、更に１以上の追加のクロマトグラフィー工程を含む請求項１または２に記載の精製方法。
4. 追加のクロマトグラフィー工程が、混合モード担体、陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、陽イオン交換担体、陽イオン交換膜、疎水性相互作用担体、サイズ排除担体、ゲルろ過担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、または硫酸化アガロース担体のいずれか１つが使用されるクロマトグラフィーである請求項１〜３のいずれか一項に記載の精製方法。
5. 工程（ｂ）において、緩衝液中のグリシン濃度が３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の精製方法。