JP6110375B2 - 糸状菌を用いた西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents
糸状菌を用いた西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ組換えタンパク質の製造方法 Download PDFInfo
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Description
(1) 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも1個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、かつ少なくとも240個のコドンが修飾されている、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、GCCの使用頻度が80%、GCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、CGCの使用頻度が90%、CGTの使用頻度が10%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、AACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、GACの使用頻度が95%、GATの使用頻度が5%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、TGCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、CAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、GAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、GGCの使用頻度が75%、GGTの使用頻度が25%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、CACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ATCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、CTCの使用頻度が80%、CTGの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、AAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、TTCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、CCCの使用頻度が80%、CCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、AGCの使用頻度が15%、TCCの使用頻度が85%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ACCの使用頻度が85%、ACGの使用頻度が15%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、TACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、GTCの使用頻度が85%、GTGの使用頻度が5%、GTTの使用頻度が10%。
(2) 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも1個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、かつ少なくとも70%のコドンが修飾されている、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、GCCの使用頻度が80%、GCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、CGCの使用頻度が90%、CGTの使用頻度が10%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、AACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、GACの使用頻度が95%、GATの使用頻度が5%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、TGCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、CAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、GAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、GGCの使用頻度が75%、GGTの使用頻度が25%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、CACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ATCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、CTCの使用頻度が80%、CTGの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、AAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、TTCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、CCCの使用頻度が80%、CCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、AGCの使用頻度が15%、TCCの使用頻度が85%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ACCの使用頻度が85%、ACGの使用頻度が15%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、TACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、GTCの使用頻度が85%、GTGの使用頻度が5%、GTTの使用頻度が10%。
(3) 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼC1aポリペプチドをコードし、下記(i)〜(ii)からなる群から選択される少なくとも1の特徴を有する(1)又は(2)に記載のポリヌクレオチド
(i)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含む
(ii)配列番号:1に記載の91〜1017位からなる塩基配列と95%以上の相同性を有する。
(4) 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼC1aポリペプチドをコードし、下記(i)〜(ii)からなる群から選択される少なくとも1の特徴を有する(1))又は(2)に記載のポリヌクレオチド
(i)配列番号:26に記載の塩基配列のコード領域を含む
(ii)配列番号:26に記載の91〜1017位からなる塩基配列と95%以上の相同性を有する。
(5) (1)〜(4)のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチドに、さらに所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド。
(6) (1)〜(5)のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(7) (6)に記載の発現ベクターを糸状菌に導入してなる形質転換体。
(8) 前記糸状菌が、トリコデルマ属菌又はアスペルギルス属菌である(7)に記載の形質転換体。
(9) 前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ又はアスペルギルス・ニガーである(7)に記載の形質転換体。
(10) 前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデである(7)に記載の形質転換体。
(11) (7)〜(10)のうちのいずれか一に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程を含む、(1)〜(4)のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの製造方法。
(12) 標的分子を検出するための方法であって、
(7)〜(10)のうちのいずれか一に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程と、 該ポリペプチドを前記標的分子に結合させる工程とを含む、方法。
(13) 色素の脱色方法であって、
(7)〜(10)のうちのいずれか一に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程と、
該色素に前記ポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させる工程とを含む、方法。
(14) フェノール性化合物の除去方法であって、
(7)〜(10)のうちのいずれか一に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程と、
該フェノール性化合物に前記ポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させる工程とを含む、方法。
後述の実施例に示す通り、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチド(HRP)をコードする野生型の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いては、糸状菌において、ウェスタンブロット分析により、HRPポリペプチドの発現を検出できなかったが、前記野生型の塩基配列とコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドを用いたところ、かかる糸状菌において、HRPポリペプチドの発現を検出することができた。
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも1個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、GCCの使用頻度が80%、GCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、CGCの使用頻度が90%、CGTの使用頻度が10%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、AACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、GACの使用頻度が95%、GATの使用頻度が5%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、TGCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、CAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、GAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、GGCの使用頻度が75%、GGTの使用頻度が25%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、CACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ATCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、CTCの使用頻度が80%、CTGの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、AAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、TTCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、CCCの使用頻度が80%、CCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、AGCの使用頻度が15%、TCCの使用頻度が85%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ACCの使用頻度が85%、ACGの使用頻度が15%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、TACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、GTCの使用頻度が85%、GTGの使用頻度が5%、GTTの使用頻度が10%。
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、GCCの使用頻度が80%、GCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、CGCの使用頻度が90%、CGTの使用頻度が10%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、AACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、GACの使用頻度が95%、GATの使用頻度が5%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、TGCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、CAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、GAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、GGCの使用頻度が75%、GGTの使用頻度が25%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、CACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ATCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、CTCの使用頻度が80%、CTGの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、AAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、TTCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、CCCの使用頻度が80%、CCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、AGCの使用頻度が15%、TCCの使用頻度が85%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ACCの使用頻度が85%、ACGの使用頻度が15%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、TACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、GTCの使用頻度が85%、GTGの使用頻度が5%、GTTの使用頻度が10%。
(i)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含む
(ii)配列番号:1に記載の91〜1017位からなる塩基配列と95%以上の相同性を有する。
(i)配列番号:26に記載の塩基配列のコード領域を含む
(ii)配列番号:26に記載の91〜1017位からなる塩基配列と95%以上の相同性を有する。
本発明は、前記本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。本発明の発現ベクターとしては、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主である糸状菌に導入されたとき、その糸状菌のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
本発明においては、前記形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたHRPポリペプチド等を採取することによって、本発明のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを製造することができる。本発明による形質転換体の培養は、常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。
HRPポリペプチドを触媒として作用させることにより、ルミノールやTMB(テトラメチルベンヂジン)等の発光・発色基質が酸化され、化学発光や発色が生じることが知られている。そして、HRPポリペプチドと、標的分子とを結合させることにより、前記化学発光等を指標として該標的分子を検出することができる。従って、本発明は、標的分子を検出するための方法であって、本発明の製造方法によって製造されたポリペプチド(本発明のポリペプチド)を前記標的分子に結合させることを特徴とする方法を提供する。
野生型西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ(HRP)の糸状菌での発現検討
先ず、下記方法にて、野生型HRPポリペプチドをコードする野生型の塩基配列を用いて、糸状菌(トリコデルマ・ビリデ)を形質転換し、得られた形質転換体におけるHRPポリペプチドの発現を調べた。
野生型HRP C1a遺伝子の配列として、「Eur.J.Biochem.、1988年、173巻、3号,681〜687ページ」に記載の塩基配列(配列番号:3に記載の塩基配列)を用い、野生型HRP遺伝子を人工的に合成した。人工合成の際、開始コドンの上流の配列に制限酵素StuI認識サイトを、終始コドンの下流に制限酵素XhoI認識サイトを付加した。そして、合成して得られた野生型HRP遺伝子を、制限酵素SfiIにて処理したpMA−Tに挿入することにより、プラスミド「pHRP_Native」を得た。
プラスミド「pHRP_Native」をStuI及びXhoIで切断し、約1kbpの遺伝子断片「HRP_Native」を得た。一方、プラスミド「pCB1−Eg3X−hphless」(国際公開第2011/021616号 参照)をStuI及びXhoIで切断し、約6kbpの断片を回収した。これに「HRP_Native」をTaKaRa DNAライゲ―ションキットマイティミックス(宝酒造社製)を用いて連結し、プラスミド「pCB1−HRP_Native」を作製した。酵素等の反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミド「pCB1−HRP_Native」にクローニングされた挿入DNA断片のシークエンスは、ビッグダイターミネーターv3.1サイクルシークエンシングキット(アプライドバイオシステムズ社製)とABI PRISMジェネティックアナライザー(アプライドバイオシステムズ社製)とを用いて、添付のプロトコールに従って、決定した。プラスミド「pCB1−HRP_Native」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、自身の開始コドンを用いてHRPポリペプチドを発現するように構築した。
プラスミド「pCB1−HRP_Native」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、国際公開第2005/056787号に記載の方法に従い、実施した。ウラシル生合成遺伝子(pyr4)欠損株であるトリコデルマ・ビリデ株 2株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)のpyr4遺伝子を用いたコートランスフォーメーション法により形質転換を実施した。トリコデルマ・ビリデ株 2株を50mLの菌体形成培地(1% イーストエキス、1% モルトエキス、2% ポリペプトン、2.5% グルコース、0.1% リン酸水素2カリウム、0.05% 硫酸マグネシウム7水和物、0.0001% ウリジン(pH7.0))において、28℃で24時間培養し、3000rpmで10分間遠心分離し、集菌した。得られた菌体を0.5mol/L シュークロースで洗浄し、綿で濾過したプロトプラスト化酵素溶液(1mg/mL β−グルクロニダーゼ、0.3mg/mL キチナーゼ、0.3mg/mL ザイモリエース、0.5mol/L シュークロース)に懸濁した。30℃で60分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、2500rpmで10分間遠心分離してプロトプラストを回収し、SUTC緩衝液(0.5mol/L シュークロース、10mmol/L 塩化カルシウム、10mmol/L トリス塩酸(pH7.5))で洗浄した。
プラスミド「pCB1−HRP_Native」を導入し最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第98/11239号の記載の方法に準じ、P培地(1.0%グルコース、4.0%ラクトース、2.0%大豆粕、1.0%イーストエキス、0.5%リン酸カリウム、0.2%硫酸アンモニゥム、0.2%炭酸カルシウム、0.03%硫酸マグネシウム)にて、フラスコを用い、28℃にて培養した。そして、HRPが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を12%ゲルSDS−PAGEミニ(テフコ社製)を用いて電気泳動分離を行い、PVDF膜(ミリポア社製)上にブロットした。ブロットしたPVDF膜について、抗HRP抗体(JIRL社製、製品番号:123−055−021)を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図1に示す。
フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ3種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案して修飾したHRPポリヌクレオチドによる、フミコーラにおけるHRPポリペプチド発現の検討
前記結果を受け、糸状菌においてHRPポリペプチドを高発現させるべく、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ3種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、これら3種全てにおける翻訳効率を向上させるべく、野生型HRP遺伝子の塩基配列と異なる塩基配列を有する修飾されたポリヌクレオチドを作製した。そして、先ずは、このポリヌクレオチドを用いて、フミコーラ(フミコーラ・インソレンス)を形質転換し、得られた形質転換体におけるHRPポリペプチドの発現を調べた。以下にこれらの方法並び得られた結果について示す。
フミコーラ、アスペルギルス、トリコデルマで発現が確認できたポリペプチドのコドン使用頻度を考慮し、3種全てにおける翻訳効率を向上させるべく、表1に記載のコドン使用頻度表を作成した。具体的には、前記3種の菌において、1種類の菌でも使用頻度が極端に低い(使用頻度が5%未満である)コドンの使用頻度は「0%」と設定した。また、前記3種の菌全てにおいて、使用頻度が5%以上のコドンについては、3種又は2種の菌の使用頻度の平均値を算出し、さらに該平均値が5の倍数になるように変更することにより、表1に記載のコドン使用頻度表を作成した。
HRP遺伝子をフミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ3種において、活性あるポリペプチドとして高発現させるために、HRPポリヌクレオチドの修飾を行った。すなわち、表1に記載のコドン使用頻度に基づき、野生型HRP遺伝子の塩基配列(配列番号:3に記載の塩基配列)から28.5%の塩基の変更を伴う、配列番号:1に記載の塩基配列を設計した(図2及び3 参照)。なお、このようにして設計した修飾HRPポリヌクレオチドの塩基配列においては、全コドン数338のうち246のコドンを変更、すなわち全コドンのうち72.8%のコドンが修飾(縮重変異)されている。そして、この塩基配列情報に基づき、pHRP_Native同様に、修飾HRPポリヌクレオチドを人工的に合成し、pMA−Tに挿入することにより、コドン修飾HRPポリヌクレオチドが挿入されたプラスミド「pHRP」を得た。
コドン修飾HRPポリヌクレオチドの塩基配列を基に、さらに該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのC末端側にHisタグが付加されて発現されるように、以下のプライマーを設計し、作製した。
HRP−humicola−F:CCCGGATCCTGGGACAAGATGCACTTCTCCAGCTCCTCC(配列番号:5)
HRP−humicola−R:CCCGGATCCCTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGGTGGGAGTTGGAGTTGACGACG(配列番号:6)。
「pNCE2−HRP−humicola」によるフミコーラ・インソレンスの形質転換は、国際公開第01/090375号に記載の方法に従い、実施した。フミコーラ・インソレンス MN200−1株を宿主とし、ハイグロマイシンを選択マーカーに用いて形質転換を実施した。フミコーラ・インソレンスMN200−1株を(S)培地中37℃で培養し、24時間後、3000rpm、10分間遠心分離により集菌した。(S)培地の組成は、3.0% グルコース、2.0% 酵母エキス、0.1% ペプトン、0.03% 塩化カルシウム、0.03% 塩化マグネシウム、pH6.8である。得られた菌体を0.5Mシュークロースで洗浄し、0.45μmのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液(3mg/ml β−グルクロニダーゼ、1mg/ml キチナーゼ、1mg/ml ザイモリアーゼ、0.5Mシュークロース)10mlに懸濁した。30℃で60〜90分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、2500rpm、10分間遠心分離してプロトプラストを回収し、SUTC緩衝液(0.5Mシュークロース、10mM塩化カルシウム、10mMトリス塩酸(pH7.5))で洗浄した。
プラスミド「pNCE2−HRP−humicola」を導入しハイグロマイシン添加再生YMG培地で生育した株を選抜し、国際公開第01/090375号に記載の方法に準じて培養した。そして、HRPが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を12%ゲルSDS−PAGEミニを用いて電気泳動分離を行い、PVDF膜(ミリポア社製)上にブロットした。ブロットしたPVDF膜について、抗Hisタグ抗体(MBL社製、製品番号:D291−7)を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図4に示す。
次に、前記コドン修飾HRPポリヌクレオチドを用いて、アスペルギルス(アスペルギルス・ニガー)を形質転換し、得られた形質転換体におけるHRPポリペプチドの発現を調べた。
(1−1)選択マーカー用トリコデルマ・ビリデ由来pyr4発現プラスミド「pUC−Pyr4」の構築
先ず、下記方法にて、アスペルギルス・ニガーの形質転換において選択マーカーとして利用するトリコデルマ・ビリデ由来pyr4遺伝子のクローニングを行った。
トリコデルマ・ビリデの菌体より、堀内らの方法(H.Horiuchiら、J.Bacteriol.1988年、170巻、272〜278ページ 参照)に従ってゲノムDNAを単離・精製した。単離したゲノムDNAを制限酵素Sau3AIにより部分消化した。これをファージベクターλEMBL3クローニングキット(ストラタジーン社製)のBamHIアームに、ライゲーションキットVer.2(宝酒造社製)を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、TE緩衝液に溶解した。連結混合物の全量をマックスプラックスλパッケージングキット(エピセンターテクノロジー社製)を用い、ファージ粒子を形成させ、大腸菌XL1−blue MRA(P2)株に感染させた。この方法により1.1×104個のファージから成るゲノムDNAライブラリーが得られた。
公開されているトリコデルマ・リセイの翻訳領域の配列を基に以下のプライマーを作製した。
PYRMET:ATGGCACCACACCCGACG(配列番号:7)
PYRSTOP:CTATCGCAGTAGCCGCTC(配列番号:8)。
前記にて作製したファージプラークは、ハイボンドN+ナイロントランスファーメンブラン(アマシャム社製)に転写し、0.4N水酸化ナトリウムでアルカリ処理し、メンブラン上の組換えファージDNAを1本鎖に変成後、5×SSC(1×SSC:15mMクエン酸3ナトリウム、150mM塩化ナトリウム)で洗浄し、風乾させDNAを固定した。その後、キットのマニュアルにしたがって、前記にて作製したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、検出反応をし、FUJIメディカルX線フィルム(富士写真フィルム社製)に感光させ、2個の陽性クローンを得た。陽性クローンからのDNA調製は、Maniatisらの方法(J.Sambrook,E.F.Fritsch及びT.Maniat1s、Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年)に従い、宿主大腸菌としてLE392を用いてファージDNAを回収した。以上のように調製したファージDNAをPstIで処理し、前記プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った結果、ファージクローン1では約0.8kbpのバンドを検出し、ファージクローン2では約2.2kbpのバンドを検出した。
ファージクローン1の約0.8kbpのPstI断片及びファージクローン2の約2.2kbpのPstI断片をpUC118にクローン化し、それぞれプラスミド「pUC−PYR−clone1」及び「pUC−PYR−clone2」を得た。得られたプラスミドの塩基配列を実施例1−2記載の方法により解析した。その結果、「pUC−PYR−clone1」はPyr4遺伝子のターミネーター側が、「pUC−PYR−clone2」はプロモーター側が含まれていることが明らかになった。「pUC−PYR−clone1」及び「pUC−PYR−clone2」をPstI処理し、連結した状態でpUC118にサブクローニングし、プラスミド「pUC−Pyr4」を得た。
プラスミド「pUC−Pyr4」にXbaIサイトを付加するために、Tricho−pyr−N−xba及びTricho−pyr−C−xbaをプライマーとして使用し、「pUC−Pyr4」を鋳型にPCRを行った。増幅された約2.5kbpのDNA断片をXbaIで切断し、約2.5kbpの遺伝子断片「Pyr4−xbaI」を得た。
Tricho−pyr−N−xba:GGTCTAGACTGCAGGCACTTCCAGGCA(配列番号:9)
Tricho−pyr−C−xba:GGTCTAGAGCATGACGAATACATATCAAAC(配列番号:10)。
amyB−P−R5R:GATATCTGTGGGGTTTATTGTTCAGAGAA(配列番号:11)
amyB−T−R5R:GATATCAGGGTGGAGAGTATATGATGGTA(配列番号:12)。
次に、前記にて構築したプラスミド「pAmyB−pyr」に、前記コドン改変HRP遺伝子を挿入した。すなわち、先ず、コドン改変HRP遺伝子の塩基配列を基に、さらに該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのC末端側にHisタグが付加されて発現されるように、以下のプライマーを設計し、作製した。
HRP−Aspergillus−F:GGCATTTATGCACTTCTCCAGCTCCTCCA(配列番号:13)
HRP−Aspergillus−R:CTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGGTGGGAGTTGGAGTTGACGACG(配列番号:14)。
次に、ウラシル生合成遺伝子(pyr4)欠損株であるアスペルギルス・ニガー pyr1株を以下に示す方法にて作出した。
pyr4欠損株であるアスペルギルス・ニガー pyr1株を宿主とし、選択マーカーとしてpyr4遺伝子を用いた形質転換を実施した。
プラスミド「pAmyB−pyr−HRP−Aspergillus」を導入し最少再生培地で生育した株を選抜し、生産培地に植菌し30℃、4日間培養した。得られた培養上清液を12%ゲルSDS−PAGEミニを用いて電気泳動分離を行い、PVDF膜(ミリポア社製)上にブロットした。ブロットしたPVDF膜について、抗Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図5に示す。
pAmyB−pyr−HRP−Aspergillusによる形質転換体の培養上清を適宜希釈し、該形質転換体の濃度が9×108CFU/mLとなるよう希釈した培養上清にテトラメチルベンヂジン試薬(コスモバイオ社製)を添加して、室温で10分間静置した。1N硫酸を添加し、反応を停止した後、波長450nmにおける吸光度を測定し、HRP量を算出した。なお、検量線には、和光純薬社製HRP試薬(和光:169−10791)を使用し、ミリQ水で0.625〜10ng/mL程度に希釈したものを用いた。結果、pAmyB−pyr−HRP−Aspergillusによる形質転換体培養上清中のHRP濃度は0.004mg/Lであった。
次に、前記コドン修飾HRPポリヌクレオチドを用いて、トリコデルマ(トリコデルマ・ビリデ)を形質転換し、得られた形質転換体におけるHRPポリペプチドの発現を調べた。
コドン修飾HRPポリヌクレオチドの塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
HRP−tricho−F:GGGAGGCCTGCGCATCATGCACTTCTCCAG(配列番号:15)
HRP−tricho−R:CCCCTCGAGCTAGGAGTTGGAGTTGACGAC(配列番号:16)
HRP−tricho−R(Hisless):CCCCTCGAGCTAGGAGTTGGAGTTGACGAC(配列番号:17)。
プラスミド「pCB1−HRP−tricho」又は「pCB1−HRP(Hisless)−tricho」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、比較例1(3)記載の方法により実施した。
プラスミド「pCB1−HRP−tricho」及び「pCB1−HRP(Hisless)−tricho」を各々導入し、最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第98/11239号に記載の方法に準じ、P培地にて、フラスコ又はジャーファーメンターを用い、28℃にて培養した。HRPが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を12%ゲルSDS−PAGEミニを用いて電気泳動分離を行い、PVDF膜(ミリポア社製)上にブロットした。ブロットしたPVDF膜について、pCB1−HRP−trichoに関しては、抗Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロットを行い、pCB1−HRP(Hisless)−trichoに関しては、抗HRP抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図6及び7に示す。
「pCB1−HRP−tricho」又は「pCB1−HRP(Hisless)−tricho」による形質転換体のフラスコ培養における培養上清を、該形質転換体の濃度が9×108CFU/mLとなるよう適宜希釈し、HRP濃度の測定を実施例2(6)に従い、実施した。結果、pCB1−HRP−trichoによる形質転換体の培養上清中のHRP濃度は123mg/Lであり、pCB1−HRP(Hisless)−trichoによる形質転換体の培養上清中のHRP濃度は165mg/Lであった。同様に「pCB1−HRP−tricho」又は「pCB1−HRP(Hisless)−tricho」による形質転換体のジャーファーメンター培養における培養上清を、該形質転換体の濃度が9×108CFU/mLとなるよう適宜希釈し、HRP濃度の測定を実施例2(6)に従い、実施した。結果、pCB1−HRP−trichoによる形質転換体の培養上清中のHRP濃度は317mg/Lであり、pCB1−HRP(Hisless)−trichoによる形質転換体の培養上清中のHRP濃度は525mg/Lであった。
前記コドン修飾HRPポリヌクレチドを用いることにより、HRPと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドも、糸状菌にて高発現させることができるかどうかを、以下に示す方法にて調べた。
プラスミド「pCB1−Eg3X−hphless」のCBH1セルラーゼ結合部位欠失、並びにHpaIサイト及びPstIサイトを挿入するために、TrichoCBH1HpaR及びaTrichoPstFをプライマーとして使用し、pCB1−Eg3X−hphlessを鋳型にPCRを行い、CBH1共発現用ベクター「pCB1−KR」を得た。
TrichoCBH1HpaR:GGTTAACCTGAGTAGGGCCGGGAGAGGA(配列番号:18)
aTrichoPstF:GGCTGCAGTAAGGTACTCGAGCAAAAGCTT(配列番号:19)。
コドン修飾HRPポリヌクレオチドの塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
HRPHpaKR:GCTATTGAGAAGCGCCAGCTCACCCCTACCTTCTACGAC(配列番号:20)
PERAspglaC:CTAGGAGTTGGAGTTGACGAC(配列番号:21)。
プラスミド「pCB1−KR−HRP−tricho」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、比較例1(3)記載の方法により実施した。
プラスミド「pCB1−KR−HRP−tricho」を導入し最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第98/11239号に記載の方法に準じ、P培地にて、フラスコを用い、28℃にて培養した。HRPが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を12%ゲルSDS−PAGEミニを用いて電気泳動分離を行い、PVDF膜(ミリポア社製)上にブロットした。ブロットしたPVDF膜について、抗HRP抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図8に示す。
pCB1−KR−HRP−trichoによる形質転換体を、国際公開第98/11239号の記載の方法に準じ、P培地にて、フラスコを用い、28℃にて培養した。そして、得られた培養上清を、該形質転換体の濃度が9×108CFU/mLとなるよう適宜希釈し、HRP濃度の測定を実施例2(6)に従い、実施した。pCB1−KR−HRP−trichoによる形質転換体の培養上清中のHRP濃度は123mg/Lであった。
(1) HisTrap HPカラムによる精製
実施例3(3)で培養した、pCB1−HRP−trichoによる形質転換体の培養上清2mlを、0.02M Na2HPO4、0.5M NaCl(pH7.5)バッファーで平衡化したHisTrap HPカラム(GE製)に供した。平衡化に使用したバッファーを用いてカラムを洗浄後、0.02M Na2HPO4、0.5M NaCl、0.5M イミダゾール(pH7.5)バッファーにて溶出した。
(1) アビセルへの結合活性を用いた精製
実施例4の(4)にて培養した、pCB1−KR−HRP−trichoによる形質転換体培養上清10μlと2%濃度のアビセル溶液90μl(20mM酢酸バッファー(pH5.0)、1M硫安)とを良く混和し、25℃で10分間静置した。遠心後、上清を除去し、20mM酢酸バッファー(pH5.0)及び1M硫安を加え、アビセル溶液を洗浄した(2回実施)。最終の遠心後、上清を除去し、ミリQ水を混ぜ、37℃で10分間放置し、アビセルから剥離させた。剥離後の上清を回収し、上清中に含まれるHRP濃度の測定を実施例2(6)に従い、実施した。その結果、12.7ng/ml濃度のHRPを回収することが出来た。
実施例3(3)で培養した、pCB1−HRP−trichoによる形質転換体の培養上清を用いてアナトー色素分解を測定した。1μmolのアナトー色素(和光純薬社製)、0.14μmolの過酸化水素を含む0.1M リン酸塩緩衝液(pH6.0)190μLに培養上清液10μLを添加し、37℃において適当な時間静置した後、454nmの吸光度変化を測定した。その結果、反応30分後から吸光度の減少が検出され前記コドン改変HRP遺伝子から発現されたHRPは、アナトー色素分解活性を示すことが明らかになった。
上記結果を受け、3種類の糸状菌の中で最も高いHRP産生能を示したトリコデルマにおいて、HRPポリペプチドをさらに高発現させるべく、トリコデルマの使用頻度に適合させた塩基配列を有する修飾されたHRPポリヌクレオチドを作製した。そして、このポリヌクレオチドを用いてトリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体におけるHRPポリペプチドの発現を調べた。以下にその方法及び得られた結果について示す。
トリコデルマ(トリコデルマ・ビリデ)で発現が確認できたポリペプチドのコドン使用頻度を考慮し、表2に記載のコドン使用頻度表を作成した。
HRP遺伝子をトリコデルマ(トリコデルマ・ビリデ)において、活性あるタンパク質として高発現させるために、HRPポリヌクレオチドの修飾を行った。すなわち、表2に記載のコドン使用頻度に基づき、野生型HRP遺伝子の塩基配列(配列番号:3に記載の塩基配列)から29.9%の塩基の変更を伴う、配列番号:22に記載の塩基配列を設計した。なお、このようにして設計した修飾HRPポリヌクレオチドの塩基配列においては、全コドン数338のうち242のコドンを変更、すなわち全コドンのうち71.6%のコドンが修飾(縮重変異)されている。そして、この塩基配列情報に基づき、pHRP_Native同様に、修飾HRPポリヌクレオチドを人工的に合成し、pMA−Tに挿入することにより、コドン修飾HRPポリヌクレオチドが挿入されたプラスミド「pHRP−2」を得た。
コドン修飾HRPポリヌクレオチドの塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
HRP−tricho−2−F:GGGAGGCCTGCGCATCATGCACTTCA(配列番号:24)
HRP−tricho−2−R(Hisless):CCCGTCGACGCTGTTGCTGTTGACGACGCGGCAGTT(配列番号:25)。
プラスミド「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−2」によるトリコデルマ(トリコデルマ・ビリデ)の形質転換は、比較例1 (3)記載の方法により実施した。
プラスミド「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−2」を導入し、最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第98/11239号に記載の方法に準じ、P培地にて、フラスコを用い、28℃にて培養した。HRPが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を12%ゲルSDS−PAGE ミニを用いて電気泳動分離を行い、PVDF膜(ミリポア社製)上にブロットした。ブロットしたPVDF膜について、抗HRP抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図9に示す。
「pCB1−HRP(Hisless)−tricho」による形質転換体のフラスコ培養における培養上清を、該形質転換体の濃度が9×108CFU/mLとなるよう適宜希釈し、HRP濃度の測定を実施例2 (6)に従い、実施した。
上記結果を受け、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ3種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案した塩基配列の有効性を確認するべく、実施例1〜3に記載のコドン修飾HRPポリヌクレオチドとは異なる配列を有する、当該3種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチドを作製した。そして、該ポリヌクレオチドを用いてトリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体におけるHRPポリペプチドの発現を調べた。以下にその方法及び得られた結果について示す。
HRP遺伝子をトリコデルマにおいて活性あるタンパク質として高発現させるために、HRPポリヌクレオチドの修飾を行った。すなわち、表1に記載のコドン使用頻度に基づき、野生型HRP遺伝子の塩基配列(配列番号:3に記載の塩基配列)から28.0%の塩基の変更を伴う、配列番号:26に記載の塩基配列を設計した。
プラスミド「pHRP−3」及び「pCB1−Eg3X−hphless」をStuI及びXhoIで切断し、約1kbp及び約6kbpの断片を回収した。両者をTaKaRa DNAライゲーションキットマイティミックスを用いて連結し、プラスミド「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−3」を作製した。プラスミド「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−3」にクローニングされた挿入DNA断片のシークエンスを、比較例1 (2)記載の方法により解析した。プラスミド「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−3」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、自身の開始コドンを用いてHRPを発現するように構築した。
プラスミド「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−3」によるトリコデルマ(トリコデルマ・ビリデ)の形質転換は、比較例1 (3)記載の方法により実施した。
プラスミド「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−3」を導入し、最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第98/11239号に記載の方法に準じ、P培地にて、フラスコを用い、28℃にて培養した。HRPが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を12%ゲルSDS−PAGE ミニを用いて電気泳動分離を行い、PVDF膜(ミリポア社製)上にブロットした。ブロットしたPVDF膜について、抗HRP抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図14に示す。
「pCB1−HRP(Hisless)−tricho−3」による形質転換体を、国際公開第98/11239号に記載の方法に準じ、P培地にて、フラスコを用い、28℃にて培養した。そして、その培養上清を、該形質転換体の濃度が9×108CFU/mLとなるよう適宜希釈し、HRP濃度の測定を実施例2 (6)に従い、実施した。結果、pCB1−HRP(Hisless)−tricho−3による形質転換体の培養上清中のHRP濃度は200mg/Lであった。
<223> コドン使用頻度がトリコデルマ、フミコ―ラ及びアスペルギルスに適合されており、人工的に合成されたポリヌクレオチドの配列
配列番号:2
<223> 配列番号:1に記載の塩基配列からなる人工的に合成されたポリヌクレオチドがコードするポリペプチド
配列番号:5〜21、24及び25
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号:22
<223> コドン使用頻度がトリコデルマに適合されており、人工的に合成されたポリヌクレオチドの配列
配列番号:23
<223> 配列番号:22に記載の塩基配列からなる人工的に合成されたポリヌクレオチドがコードするポリペプチド
配列番号:27
<223> 配列番号:26に記載の塩基配列からなる人工的に合成されたポリヌクレオチドがコードするポリペプチド
Claims (14)
- 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも1個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、かつ少なくとも240個のコドンが修飾されている、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、GCCの使用頻度が80%、GCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、CGCの使用頻度が90%、CGTの使用頻度が10%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、AACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、GACの使用頻度が95%、GATの使用頻度が5%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、TGCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、CAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、GAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、GGCの使用頻度が75%、GGTの使用頻度が25%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、CACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ATCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、CTCの使用頻度が80%、CTGの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、AAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、TTCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、CCCの使用頻度が80%、CCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、AGCの使用頻度が15%、TCCの使用頻度が85%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ACCの使用頻度が85%、ACGの使用頻度が15%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、TACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、GTCの使用頻度が85%、GTGの使用頻度が5%、GTTの使用頻度が10%。 - 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも1個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、かつ少なくとも70%のコドンが修飾されている、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、GCCの使用頻度が80%、GCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、CGCの使用頻度が90%、CGTの使用頻度が10%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、AACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、GACの使用頻度が95%、GATの使用頻度が5%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、TGCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、CAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、GAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、GGCの使用頻度が75%、GGTの使用頻度が25%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、CACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ATCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、CTCの使用頻度が80%、CTGの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、AAGの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、TTCの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、CCCの使用頻度が80%、CCTの使用頻度が20%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、AGCの使用頻度が15%、TCCの使用頻度が85%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ACCの使用頻度が85%、ACGの使用頻度が15%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、TACの使用頻度が100%;
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、GTCの使用頻度が85%、GTGの使用頻度が5%、GTTの使用頻度が10%。 - 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼC1aポリペプチドをコードし、下記(i)〜(ii)からなる群から選択される少なくとも1の特徴を有する請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド
(i)配列番号:1に記載の塩基配列のコード領域を含む
(ii)配列番号:1に記載の91〜1017位からなる塩基配列と95%以上の相同性を有する。 - 西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼC1aポリペプチドをコードし、下記(i)〜(ii)からなる群から選択される少なくとも1の特徴を有する請求項1又は2に記載のポリヌクレオチド
(i)配列番号:26に記載の塩基配列のコード領域を含む
(ii)配列番号:26に記載の91〜1017位からなる塩基配列と95%以上の相同性を有する。 - 請求項1〜4のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに、さらに所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターを糸状菌に導入してなる形質転換体。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ属菌又はアスペルギルス属菌である請求項7に記載の形質転換体。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ又はアスペルギルス・ニガーである請求項7に記載の形質転換体。
- 前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデである請求項7に記載の形質転換体。
- 請求項7〜10のうちのいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程を含む、請求項1〜4のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの製造方法。
- 標的分子を検出するための方法であって、
請求項7〜10のうちのいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程と、
該ポリペプチドを前記標的分子に結合させる工程とを含む、方法。 - 色素の脱色方法であって、
請求項7〜10のうちのいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程と、
該色素に前記ポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させる工程とを含む、方法。 - フェノール性化合物の除去方法であって、
請求項7〜10のうちのいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程と、
該フェノール性化合物に前記ポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させる工程とを含む、方法。
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