JP6047160B2 - 天然ａｈｒリガンド依存性癌を治療および／または予防するための手段および方法 - Google Patents

Description

本発明は、癌治療学および癌治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、天然AHRリガンド依存性癌を治療および/または予防するための方法に関するが、その方法は、前記癌に罹患した被験体に、治療上有効な量のAHR阻害剤を投与することを含む。さらに、天然AHRリガンド依存性癌の治療および/または予防に用いるAHR阻害剤を検討する。

腫瘍微小環境は、腫瘍の悪性度に多様な影響をおよぼすので、有効な腫瘍治療において特別な課題となる（Tennant 2010, Nat Rev Cancer 10, 267）。

トリプトファン（Trp）代謝は、腫瘍微小環境の重要性の一例である。その機能的関連性は、免疫反応の制限に関するきわめて重要な内因性メカニズムとして、動物モデルですでに実証されている（Munn 2007, J Clin Invest 117, 1147）。

より詳細には、Trp代謝の活性化は、免疫系の疾患および異常、たとえば、腫瘍免疫、自己免疫、感染性疾患、ならびに免疫特権の維持と関連がある（Opitz 2007, Cell Mol Life Sci 64, 2452）。腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節におけるインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ1および2（IOG1/2）によるTrpの分解は、抗腫瘍免疫応答を阻害し、さまざまな悪性腫瘍の予後不良に関連する（Lob 2009, Nat Rev Cancer 9 (6): 445）。IDO1/2の阻害は動物モデルで腫瘍形成を抑制し、目下、癌患者において第I/II相臨床試験で検討されている（Muller 2005, Nat Med 11(3): 312, Uyttenhove 2003, Nat Med 9(10), 1269; DiPuccio 2010, Expert Opin Ther Pat 20, 229; Ball 2007, Gene 396(1), 203; Metz 2007, Cancer Res 67(15), 7082）。

ニューロンおよび肝細胞でTrp代謝に関与することが知られているもう1つの酵素が、同様にトリプトファン分解の第1段階を合成するトリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）である（Thackray 2008, Biochem Soc Trans 36, 1120）。TDOも、腫瘍薬の標的になり得るものとして報告されている（WO2010/008427）。しかしながら、ヒト腫瘍形成および進行に対するTrp異化の関連性は、依然として明らかではない。

キヌレニン（Kyn）は、免疫抑制機能を有するTrp代謝産物である。しかしながら、その分子標的、ならびにこの作用がどのようにして引き起こされるのかというメカニズムはいまだ解明されていない。外因性Kynは、とくに、樹状細胞およびT細胞において芳香族炭化水素受容体（AHR）転写因子を活性化することが報告されている（Mezrich 2010, J Immunol 185, 3190; Nguyen 2010, Proc Natl. Acad Sci, USA, 107, 19961）。

AHRは、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）Per-Arnt-Sim（PAS）ファミリーの転写因子であって、ベンゾピレンおよび2,3,7,8-テトラクロロジベンゾダイオキシン（TCDD）などの生体異物によって活性化される。核内で、AHRはAHR核トランスロケーター（ARNT）とともにヘテロ二量体を形成し、AHR標的遺伝子の調節領域にあるダイオキシン応答配列（DRE）のコア結合モチーフと相互作用する（Reyes 1992, Science 256, 5060; Abel 2010, Biol Chem 391, 1235）。

AHRは、たとえば、ハロゲン化芳香族炭化水素によって引き起こされる、化学発癌に関与することが知られている。さらに、緑茶抽出物はAHRのアンタゴニストとして機能しうるので、それによってこのようなハロゲン化芳香族炭化水素の有害な影響を防止できることが、報告されている（Palermo 2003, Chem Res Toxicol 16, 865）。その上、AHR遺伝子の構成的発現は、膠芽腫細胞において細胞生存に関与することが知られている（Gramatzki 2009, Oncogene 28, 2593）。

上記を考慮すると、腫瘍の悪性度がTrp異化などの代謝プロセスに依存するような腫瘍を、効果的に治療するための手段および方法の提供は、まだ手に入れられておらず、それにもかかわらず非常に望ましいものであるといえるだろう。

WO2010/008427

Tennant 2010, Nat Rev Cancer 10, 267 Munn 2007, J Clin Invest 117, 1147 Opitz 2007, Cell Mol Life Sci 64, 2452 Lob 2009, Nat Rev Cancer 9 (6): 445 Muller 2005, Nat Med 11(3): 312 Uyttenhove 2003, Nat Med 9(10), 1269 DiPuccio 2010, Expert Opin Ther Pat 20, 229 Ball 2007, Gene 396(1), 203 Metz 2007, Cancer Res 67(15), 7082 Thackray 2008, Biochem Soc Trans 36, 1120 Mezrich 2010, J Immunol 185, 3190 Nguyen 2010, Proc Natl. Acad Sci, USA, 107, 19961 Reyes 1992, Science 256, 5060; Abel 2010, Biol Chem 391, 1235 Palermo 2003, Chem Res Toxicol 16, 865 Gramatzki 2009, Oncogene 28, 2593

本発明は、天然AHRリガンド依存性癌を治療および/または予防するための方法に関するものであって、その方法は、前記癌に罹患した被験体に、治療上有効な量のAHR阻害剤を投与することを含む。

本発明の方法の好ましい実施形態において、前記癌は、脳腫瘍、好ましくは神経膠腫、黒色腫、結腸直腸腺癌、結腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、乳癌、肝細胞癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、膵臓腺癌、中皮腫、および小細胞肺癌（SCLC）からなる一群から選択される。

本発明の方法の好ましい実施形態において、前記AHR阻害剤は小分子化合物である。

本発明の方法のより好ましい実施形態において、前記小分子化合物は、植物性化合物もしくはその誘導体である。

本発明の方法のより好ましい実施形態において、前記植物性化合物またはその誘導体は、フラボンもしくはその誘導体である。最も好ましくは、前記フラボンもしくはその誘導体は、3,4-ジメトキシフラボン、3´-メトキシ-4´-ニトロフラボン、4´,5,7-トリヒドロキシフラボン（アピゲニン）、または1-メチル-N-[2-メチル-4-[2-(2-メチルフェニル)ジアゼニル]フェニル-1H-ピラゾール-5-カルボキサミド（CH223191; CAS番号301326-22-7）である。

本発明の方法の、別のより好ましい実施形態において、前記植物性化合物もしくはその誘導体は、レスベラトロールもしくはその誘導体、エピガロカテキン、または没食子酸エピガロカテキンである。

本発明の方法のもう1つの好ましい実施形態において、前記小分子化合物は、下記の一般式（I）で特徴付けられる化合物である：

式中、
(i) R¹ およびR² は互いに独立に、水素、またはC₁ - C₁₂ アルキルである、
(ii) R³ 〜R¹¹ は、互いに独立に、水素、C₁ - C₁₂ アルキル、ヒドロキシル、またはC₁ - C₁₂ アルコキシである、ならびに
(iii) 破線は二重結合もしくは2つの水素のいずれかを表す。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記AHR阻害剤は、AHRタンパク質に特異的に結合して阻害する抗体である。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記AHR阻害剤は、AHRリプレッサータンパク質、または不活性なAHR核トランスロケーター（ARNT）である。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記AHR阻害剤は核酸阻害剤である。

本発明の方法の、別のより好ましい実施形態において、前記核酸リプレッサーは、AHRをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するものであって、リボザイム、アンチセンス分子、阻害剤オリゴヌクレオチド、マイクロRNA、および低分子干渉RNA（siRNA）からなる一群から選択される。

さらに、天然AHRリガンド依存性癌の治療および/または予防に用いるAHR阻害剤を本発明で検討する。

図1は、ヒト脳腫瘍においてTDOがTrpをKynに分解することを示す。a, 72時間培養し、HPLCで測定された、ヒト星状膠細胞（hAs）、神経膠腫細胞株、およびGIC（T323）の上清中のTrp（左）およびKyn（右）含量（n=4）。b, 定量的RT-PCRおよびHPLCにより測定されたヒト神経膠腫細胞のTDO mRNAとKyn放出との間の相関（n=4）。 c, TDO阻害剤680C91（黒棒グラフ）またはその溶媒（白棒グラフ）存在下で48時間培養したU87神経膠腫細胞の上清中のKyn濃度（n=4；1、5および10μM TDOIについてそれぞれP = 0.005、0.002、および0.0009）。d. siRNAによってTDO（黒棒グラフ、それぞれP = 0.000007、0.0007、および0.00006）、IDO1（ダークグレー棒グラフ）、またはIDO2（ライトグレー棒グラフ）をノックダウンした後の神経膠腫細胞のKyn放出（n=3）。 e, 健全な脳組織におけるニューロンの弱いTDO発現（上図）。膠芽細胞腫におけるTDO発現（WHOグレードIV、下図）；赤色：TDO染色；* 壊死；矢印：浸潤した脳組織との境界。挿入図：隣接する脳組織に浸潤する単一腫瘍細胞（矢印）。倍率：40x、挿入図400x（上図）、100x（下図）。 f, 脳腫瘍における悪性度の増加（WHOグレードII-IV；グレードII、n=18、グレードIII、n=15、グレードIV、n=35）とTDO発現[Hスコア]のプロット。g. さまざまなWHOグレードの神経膠腫におけるKi-67増殖指標、と、TDO Hスコアとの相関（n=42）。 h, HPLCで測定された、24人の膠芽細胞腫患者および24人の年齢性別の対応する健常対照群の、血清中のTrp（左）およびKyn（右）濃度。i, 健全なヒト脳組織（白棒グラフ、n=5）および膠芽細胞腫組織（黒棒グラフ、n=5）におけるキノリン酸染色の数値化。(f)および(g)のデータ分布は、中央値とともに25パーセンタイルおよび75パーセンタイルを示す箱髭図として表され、髭はそれぞれ10パーセンタイルおよび90パーセンタイルを表す。 図2は、神経膠腫細胞によるTDOを介したKyn放出の、免疫細胞に及ぼすパラクリン作用を示す。a, さまざまな神経膠腫細胞株とともに共培養したPBMCの同種異系増殖と、神経膠腫細胞のKyn放出との相関（n=3）。b, TDOを発現する対照U87神経膠腫細胞（sh-c）とともに共培養したPBMCの同種異系増殖を、100μM Kynあり、またはなしで、安定な低分子ヘアピン型RNAによるTDOのノックダウンを有するU87細胞（sh-TDO）とともに共培養したPBMCの同種異系増殖と比較し（黒棒グラフ）、100μM Kynあり、またはなしでのPBMC単独（白棒グラフ）と対比する（n=3）。 c, ヒト神経膠腫切片において染色されたLCA+細胞（左のグラフ）およびCD8+細胞（右のグラフ）の数量化であって、このヒト神経膠腫切片は、TDO低発現の前記切片（Hスコア＜150、白棒グラフ、LCAについてn=12、CD8についてn=10）、およびTDO高発現の前記切片（Hスコア≧150、黒棒グラフ、LCAについてn=17、CD8についてn=10）である。d, Tdo（黒丸）または空のベクター（白丸）を安定的に遺伝子導入したTdo欠損GL261マウス神経膠腫細胞を、C57BL/6N マウスの側腹部に皮下注射し、その神経膠腫細胞の増殖を、計量キャピラリを用いてモニターした（n=6）。腫瘍重量は次の式を用いて計算した：腫瘍重量(g) = (長さ(cm) × 幅(cm)²) × 0.5。 e, ELISpotで測定された、神経膠腫溶解物による再刺激後の、皮下にTdo発現腫瘍を担持するマウスのT細胞のIFN-γ放出（黒棒グラフ）と、Tdo欠損腫瘍を担持するマウスのT細胞のIFNγ放出（白棒グラフ）との比較（n=3）。f, クロム放出によって測定された、Tdo発現GL261腫瘍を有するマウスの脾細胞による、GL261マウス神経膠腫細胞の溶解を、Tdo欠損GL261腫瘍を皮下に有する場合と比較する（n=4）。 g, sh-c（白四角）およびsh-TDO（黒丸）細胞のコラーゲン基質中への移動距離の定量（n=3；24、48、および72時間について、それぞれP=0.004、0.0005、および0.01）。h, sh-c（白棒グラフ）およびsh-TDO（黒棒グラフ）U87細胞のコロニー形成性生存（n=3）。 i, 30μMもしくは60μM Kynあり、またはなしで、70μM Trp存在下または非存在下での、U87神経膠腫細胞のマトリゲル（Matrigel）ボイデン（Boyden）チャンバーアッセイ（n=3）。j, 30μMもしくは60μM Kynあり、またはなしで、70μM Trp存在下または非存在下での、LN-18神経膠腫細胞のコロニー形成性生存（n=3）。 k, sh-c（上図）またはsh-TDO（下図）U87神経膠腫細胞を移植したCD1 nu/nuマウスの代表的な頭部MRI、H&Eおよびネスチン染色。画像は2つの独立した実験の代表的なものである（n=6）。 l, NK細胞枯渇のために抗アシアロGM1抗体（ASIALO）で処理された、または対照IgG（IgG）で処理された、CD1 nu/nuマウスの側腹部に皮下注入されたsh-c（白棒グラフ）およびsh-TDO（黒棒グラフ）U87神経膠腫細胞の腫瘍重量（n=8）。 図3は、KynがAHRを活性化することを示す。a, U87細胞においてKyn処理によって8時間後に最も強く誘導される25個の遺伝子とAHRシグナル伝達との関係（赤：アップレギュレーション、緑：ダウンレギュレーション）。b, 50μM Kyn、50μM Trpもしくは1 nM TCDDで3時間処理した後の、Trpを分解しないマウス肝細胞癌細胞の核内へのGFP標識AHRのトランスロケーション（ネガティブコントロール：培地）。 c, 指示された処理（ネガティブコントロール：培地、ポジティブコントロール：1 nM TCDD、50μM Kyn）を3時間行った後の、GFP標識AHRを有する細胞内の、細胞質の蛍光強度に対する核の蛍光強度の比。データの分布は、中央値とともに25パーセンタイルおよび75パーセンタイルを示す箱髭図で表され、髭はそれぞれ10パーセンタイルおよび90パーセンタイルを表す（P＜0.001、順位に基づく一元配置分散分析法、Dunnの方法にしたがう）。d, 対照（1,2）、Kyn処理（3,4）、およびTCDD処理（5,6）ヒトLN-229神経膠腫細胞のそれぞれ2つの異なる核および細胞質画分のAHRウェスタンブロット。 e, 指定のKyn濃度で処理されたU87神経膠腫細胞におけるダイオキシン応答配列（DRE）化学活性化ルシフェラーゼ遺伝子発現（n=2）。f, Ahr機能を有するマウスおよびAhr欠損マウス由来のマウス肝サイトゾルを用いた、指示された濃度のL-3H-Kynによる放射性リガンド結合アッセイ。特異的な結合は、Ahr機能を有するサイトゾルで測定された放射能からAhr欠損サイトゾルの放射能を引き算して算出した（n=4）。 g, 100μM Kyn、1 nM TCDD、またはコントロールで処理された、対照（sh-c、白棒グラフ）と比較したsh-AHR LN-308神経膠腫細胞（黒棒グラフ）におけるCYP1A1 mRNA発現（n=4）。h, sh-c U87神経膠腫細胞（白棒グラフ）と比較したsh-TDO（黒棒グラフ）におけるAHR標的遺伝子のｍRNA発現（n=4）。 図4は、TDOにより生成されたKynのオートクリンおよびパラクリン作用がAHRを介してもたらされることを示す。a, TDO低発現および高発現のヒト神経膠腫切片におけるLCAおよびTIPARPの免疫蛍光染色。倍率：400x。b, AHR低発現のヒト神経膠腫切片（Histoscore＜150、白棒グラフ、LCAについてn=10、およびCD8についてn=8）およびAHR高発現のヒト神経膠腫切片（Histoscore≧150、黒棒グラフ、LCAについてn=12、およびCD8についてn=12）において染色されたLCA+細胞（左）およびCD8+細胞（右）の数量化。 c, Tdo発現あり、およびなしのマウスGL261神経膠腫細胞を、Ahr機能のあるマウス（白棒グラフ）またはAhr欠損マウス（黒棒グラフ）の側腹部に皮下注入した15日後に測定された腫瘍重量（n=6）。d, Ahr機能のあるマウスおよびAhr欠損マウスの皮下の、Tdo機能のあるGL261腫瘍およびTdo欠損GL261腫瘍において染色されたLCA+免疫細胞の数量化であって、25および75パーセンタイルおよび中央値を示す箱ひげ図として示す（n=4）。 e, sh-c LN-308神経膠腫細胞（白棒グラフ）および2つの異なるshRNAによってAHRをノックダウンしたLN-308神経膠腫細胞（sh-AHR1、グレー棒グラフ、およびsh-AHR2、黒棒グラフ）の、100μM Kynの存在下、または非存在下での移動（n=4）。f, 100μM Kynあり、またはなしでの、sh-c（白棒グラフ）およびsh-AHR（黒棒グラフ）LN-308神経膠腫細胞のコロニー形成能（n=3）。 g, CD1 nu/nuマウスの側腹部に皮下注入された、AHR機能のある（黒丸）ならびにAHR欠損の（白丸）ヒトLN-308神経膠腫細胞の増殖を計量キャピラリを用いてモニターした（n=7）。腫瘍重量は、次式を用いて計算した：腫瘍重量 = （長さ(cm) × 幅(cm)²）× 0.5。 図5は、TDOにより生成されたKynがさまざまなヒトの癌においてAHRを活性化すること、ならびにAHR活性化が神経膠腫患者の生存を予測することを示す。a, ヒト膠芽細胞腫組織の連続切片におけるTDO発現（赤色）およびAHR発現（茶色）の相関。矢印は位置づけのために血管を示す。倍率40x、挿入図200x。 b, スピアマン（Spearman）の順位相関を用いて計算されたTDOおよびAHRのHスコアに基づくヒト神経膠腫組織におけるTDO発現とAHR発現との間の相関（n=26）。c, スピアマン順位相関によって解析されたヒト膠芽細胞腫のマイクロアレイデータにおけるTDO発現とCYP1B1発現との間の相関（n=396）。 d, スピアマン順位相関によって解析されたヒト膀胱癌（左、n=58）、ヒト肺癌（中、n=122）、およびヒト卵巣癌（右、n=91）のマイクロアレイデータにおけるTDO発現とCYP1B1発現との間の相関。e, Rembrandtから得られた、TDOまたはAHRの高発現（赤色）を有する神経膠腫患者（WHOグレードII-IV）の生存確率を、これらの遺伝子の中程度の発現（青色）または低発現（緑色）を有する患者と比較する。統計分析のために、補足事項（Supplementary note）21を参照されたい。f, The Cancer Genome Atlas (TCGA)ネットワークの膠芽細胞腫データセットから得られた、AHR標的遺伝子CYP1B1の高発現（赤色）を有する膠芽細胞腫患者の生存確率を、CYP1B1の低発現（緑色）を有する患者と比較する（n=362）。 g, TDOにより生成されるKynの、AHRを介した、癌細胞および免疫細胞に及ぼすオートクリンおよびパラクリン作用に焦点を当てた概要図。

発明の詳細な説明
本発明は天然AHRリガンド依存性癌を治療および/または予防するための方法に関するものであって、その方法は、前記癌に罹患した被験体に、治療上有効な量のAHR阻害剤を投与することを含む。

本明細書で使用される「治療」という用語は、無治療の被験体と比較して、治療を受けた被験体で生じるなんらかの改善を意味する。このような改善は、癌の悪化または進行の防止であることもある。さらに、このような改善は、癌、またはそれに伴う症状の、改善または治癒であってもよい。当然のことながら、治療は、必ずしも治療を受けた被験体の100％にとって成功ではないかもしれない。しかしながら、この用語は、治療が被験体のうち統計上有意な部分（たとえば、コホート研究におけるコホート）にとって成功であることを必要とする。当業者は、さまざまな周知の統計評価ツール、たとえば信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントt検定、マン・ホイットニー検定などを用いて、一部分が統計上有意であるかどうかを容易に判断することができる。詳細は、DowdyおよびWearden、Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見いだされる。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％である。p値は好ましくは、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。

本明細書で使用される「予防」という用語は、本明細書で使用されるような癌、またはそれに付随する症状が発症しないようにすることを指す。当然のことながら、予防は、未来の一定期間内に、癌が発症しないようにすることを指す。前記の期間は、好ましくは、本発明の意味において化合物の投与から始まり、少なくとも1ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも1年、少なくとも2年、少なくとも5年、少なくとも10年の間、または、さらに言えば、被験体の生理的な余命の間、持続するべきである。当然のことながら、予防は、必ずしも処置を受けた被験体の100％にとって成功ではないかもしれない。しかしながら、この用語は、予防が被験体のうち統計上有意な部分（たとえば、コホート研究におけるコホート）にとって成功であることを必要とする。当業者は、本明細書の他の部分でも詳述されるさまざまな周知の統計評価ツールを用いて、一部分が統計上有意であるかどうかを容易に判断することができる。

本明細書で使用される「天然AHRリガンド依存性癌」という用語は、天然のAHRリガンドによって引き起こされるAHRの構成的活性化に依存する任意の悪性新生物を指す。好ましくは、前記の天然AHRリガンドはキヌレニン（Kyn）である。キヌレニンは、好ましくは、トリプトファン分解酵素の発現増加の結果として、トリプトファン分解により生じる。より好ましくは、本発明に記載の癌は、トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）活性の増加に関連する癌である。本明細書に記載のTDO活性は、好ましくは、癌組織または癌細胞中に存在するキヌレニンおよび/またはトリプトファン濃度を測定することによって、評価することができる。さらに、TDO活性の増加は、癌組織または癌細胞中のTDO酵素または前記TDO酵素をコードする転写物の量を測定することによって評価することもできる。TDO酵素の量は、抗体に基づく技法、たとえばELISAなどによって測定することができるが、転写物の量は、ノーザンブロットなどの核酸ハイブリダイゼーション法、またはRT-PCRなどの核酸増幅法によって測定することができる。癌と関連してTDOの増加があるかどうかを判定するための特に好ましい技法は、下記の添付の実施例において説明されており、またはWO2010/008427に記載されているが、そのそれぞれの開示内容は、これにより参考として本明細書に組み入れられる。好ましくは、前記の癌は、脳腫瘍、好ましくは神経膠腫、黒色腫、結腸直腸腺癌、結腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、乳癌、肝細胞癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、膵臓腺癌、中皮腫、および小細胞肺癌（SCLC）からなる一群から選択される。あるいはまた、さらにより好ましくは、本発明の癌は、したがって、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ1または2（IDO1またはIDO2）の増加と関連する癌である。これに関連して想定される癌は、当技術分野でよく知られている；たとえば、Lob 2009, Nat Rev Cancer 9(6), 445を参照されたいが、そのそれぞれの開示内容はこれにより参考として本明細書に組み入れられる。

本発明の意味において「AHR阻害剤」は、芳香族炭化水素受容体（AHR）ポリペプチドの活性を、直接的または間接的に阻害する能力を有する化合物である。本発明にしたがって記載されるAHRポリペプチドは、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子ファミリーの一員である。このAHRポリペプチドは、通常は不活性であって、いくつかのシャペロンを有する複合体として存在する、細胞質ゾルの転写因子である。AHRを活性化または阻害することができるいくつかのリガンドがすでに報告されているが、それらの中には人工的なもの、または天然に存在するものがある。最初に発見されたリガンドは、合成物で、ハロゲン化芳香族炭化水素（ポリ塩化ジベンゾダイオキシン、たとえば2,3,7,8-テトラクロルジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)、ポリ塩化ジベンゾフラン、およびポリ塩化ビフェニル）および多環式芳香族炭化水素（3-メチルコラントレン、ベンゾ[a]ピレン、ベンズアントラセン、およびベンゾフラボン）に属するものであった。AHRのリガンドとして同定された天然に存在する化合物には、トリプトファンの誘導体、たとえばキヌレニン、インジゴ、およびインジルビンなど、テトラピロール類、たとえばビリルビンなど、アラキドン酸代謝産物、たとえばリポキシンA4およびプロスタグランジンGなど、変性低比重リポタンパク質、いくつかの食餌性カロテノイド、ならびに7-ケトコレステロールがある。リガンドが結合すると、シャペロンが解離し、結果としてAHRの核内へのトランスロケーションが起こり、ARNT（AHR核トランスロケーター）とともに二量体となる。AHRおよびARNTの複合体が、遺伝子の転写に影響を及ぼす。

AFRポリペプチドは、機能にとって決定的に重要ないくつかのドメインを含有しており、転写因子の塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス/Per-Arnt-Sim（bHLH/PAS）ファミリーの一員として分類される。そのbHLHモチーフはタンパク質のN-末端にある。bHLHスーパーファミリーのメンバーは、2つの機能的に異なる高度に保存されたドメインを有する。第1は、転写因子とDNAとの結合に関与する塩基性領域である。第2は、タンパク質-タンパク質相互作用を促進するヘリックス-ループ-ヘリックス（HLH）領域である。AHRはさらに、2つのPASドメイン、PAS-AおよびPAS-Bを含有するが、これらは、ショウジョウバエ遺伝子period（Per）およびsingle-minded（Sim）中に見られるタンパク質ドメインに対して高い配列相同性を示す200-350アミノ酸の一続きの配列である。さらに、同様のドメインがARNT中に存在する。PASドメインは、AHRおよびARNTの場合のように、他のPASドメイン含有タンパク質との特異的な二次相互作用をサポートし、ヘテロ接合およびホモ接合タンパク質複合体の形成が可能となる。AHRのリガンド結合部位は、PAS-Bドメインの中にあり、リガンド結合のために不可欠ないくつかの保存された残基を含有する。具体的には、アミノ酸Tyr310、Phe324、His326、および/またはArg352がリガンド結合に関与すると思われる。最後に、Qリッチドメインがタンパク質のC末端領域にあり、コアクチベーターの動員およびトランス活性化に関与する。

好ましくは、AHRポリペプチドはヒトAHRであり、より好ましくはGenbank受入番号NM_001621.4 (GI: 229577137)のもとに示されるポリヌクレオチドでコードされるヒトAHRであって、この受入番号のもとに示されるアミノ酸配列を有する。さらに、本発明にしたがって、前記AHRポリペプチドのバリアントも想定される。1つもしくは複数のヌクレオチド置換、欠失、および/または付加を含有する前記ポリヌクレオチドのバリアントは、好ましくは、結果として、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を有する、コードされたアミノ酸、すなわち本発明によるポリペプチドバリアントをもたらす。バリアントポリヌクレオチドは、好ましくは、上記の特定の核酸配列に対して少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一の核酸配列を含有すべきである。さらに、バリアントポリヌクレオチドは、好ましくは、上記アミノ酸配列に対して少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有することができる。本明細書で使用される「同一の」という用語は、最高の順序の一致が得られるように配列がアラインされた、2つの核酸配列もしくはアミノ酸配列の間で、同一のアミノ酸の数を決定することによって特徴付けられる配列同一性を意味する。これは、コンピュータープログラム、たとえばBLASTP、BLASTN、またはFASTA（Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403）などに体系化された既報の技術もしくは方法を用いて、計算することができる。パーセント同一性の値は、ある態様では、アミノ酸配列の全体にわたって計算され、またはより長い配列のヌクレオチドのうち少なくとも50％について計算される。異なる配列を比較するために、当業者は、さまざまなアルゴリズムに基づく一連のプログラムを利用できる。これに関連して、Needleman-WunschまたはSmith-Watermanのアルゴリズムは特に信頼できる結果を与える。配列アラインメントを実行するために、プログラムPileUp（Higgins 1989, CABIOS 5, 151）、またはプログラムGapおよびBestFit（Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482）を使用することができるが、これらはGCGソフトウェアパケット（Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）の一部である。上記のパーセント（％）単位の配列同一性の値は、本発明の別の態様において、プログラムGAPを用いて、配列領域全体にわたって以下の設定、 Gap Weight: 50、Length Weight: 3、Average Match: 10.000、およびAverage Mismatch: 0.000、を用いて求めることができるが、これらの設定は、他に特に規定のない限り、配列アラインメントのための標準設定として常に使用されるものとする。当然のことながら、前記バリアントは基本的に、上記AHRについて明記された同じ生物活性を依然として示すべきである。

AHR活性を直接的に阻害する化合物は、好ましくは、AHRポリペプチドと物理的に相互作用し、それによってAHR活性を阻害することができる化合物である。このような阻害は、化合物がAHRの相互作用ドメインまたはそのリガンド結合ドメインと結合し、それによって本明細書中に別記されるようなAHRの生物学的機能を阻害する場合に、生じる可能性がある。好ましいのは、阻害剤がキヌレニンに対するリガンド結合ドメインをブロックすること、すなわちPAS-Bドメインのリガンド結合ドメイン、またはTyr310、Phe324、His326、およびArg352（ヒトAHRに対応するアミノ酸位置）で形成されるリガンド結合ドメインと相互作用することである。あるいはまた、化合物は、AHRポリペプチドに対してアロステリック効果を引き起こし、その結果として生物学的機能の阻害ももたらすこともある。間接的な阻害は、AHRポリペプチドの転写および/または翻訳、したがって細胞内で利用可能なAHRポリペプチドの量を低下させ、または抑制する化合物によって引き起こされる可能性がある。AHR阻害剤は少なくとも、AHRの活性を統計的に有意な程度に低下させるはずである。当然、阻害剤は、AHR活性を検出可能限界より下に減少させることが好ましい。AHR活性の質的および/または量的な阻害は、当技術分野で周知のアッセイによって測定することができるが、好ましくは以下の実施例に記載のアッセイによって測定される。AHRの活性は、その内在性標的遺伝子CYP1A1の遺伝子発現の誘導を、エトキシレゾルフィンO-脱エチル化酵素（EROD）アッセイで測定することによって、検出することができる。あるいはまた、AHRの活性は、レポーター遺伝子アッセイを使用することによって検出することができるが、このレポーター遺伝子の発現はダイオキシン応答配列（DRE）依存性プロモーターによって制御されている。AHR活性を測定するために特に好ましいアッセイは、本明細書の実施例において詳細に記載される。

AHR阻害剤は小分子化合物であることが好ましい。

本発明の意味において「小分子化合物」は、10 kDa未満、5 kDa未満、2 kDa未満、1 kDa未満、または500 Da未満の分子量を有する有機分子である。好ましくは、小分子はポリマーでない。好ましくは、本発明にしたがって言及される小分子は細胞透過性であって、AHRポリペプチドと結合するために細胞質内に拡散することができる。本明細書に記載の小分子は人工的に合成することができるが、AHR阻害剤の可能性を求めてスクリーニングされる化学ライブラリーに含まれていてもよい。あるいはまた、小分子は、組織、細胞、または全生物体などの天然起源から抽出によって得ることもできる。適当な起源は、具体的には、植物、植物組織、または微生物である。しかしながら、AHRに対する小分子阻害剤について他の起源も想定することができる。たとえば、7-ケトコレステロールは、ヒトにおいてAHRの競合阻害剤であると思われる（Savouret 2001, J. Biol. Chem. 276 (5): 3054-9）。

本発明の方法の好ましい実施形態において、前記小分子化合物は、植物性化合物またはその誘導体である。

本明細書で使用される「植物性化合物またはその誘導体」は、植物、植物組織、または植物細胞から抽出によって得られる小分子である。通常、小分子植物性化合物は、植物の一次、特に好ましくは、二次代謝産物といった代謝産物である。本発明の方法のより好ましい実施形態において、前記植物性化合物またはその誘導体は、フラボンまたはその誘導体である。最も好ましくは、前記フラボンまたはその誘導体は、3,4-ジメトキシフラボン、3´-メトキシ-4´-ニトロフラボン、4´,5,7-トリヒドロキシフラボン（アピゲニン）、または1-メチル-N-[2-メチル-4-[2-(2-メチルフェニル)ジアゼニル]フェニル-1H-ピラゾール-5-カルボキサミドである。本発明の方法の、別のより好ましい実施形態において、前記植物性化合物またはその誘導体は、レスベラトロール（trans-3,5,4'-トリヒドロキシスチルベン）もしくはその誘導体、エピガロカテキン、または没食子酸エピガロカテキンである。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記小分子化合物は、下記の一般式（I)で特徴付けられる化合物であって：

式中
(i) R¹およびR²は互いに独立に、水素またはC₁-C₁₂アルキルである、
(ii) R³-R¹¹は互いに独立に、水素、C₁-C₁₂アルキル、ヒドロキシル、またはC₁-C₁₂アルコキシである、ならびに
(iii) 破線は二重結合または2つの水素を表す。

より詳細には、下記の式(II)〜(V)のいずれかを有する化合物がより好ましい：

さらにより好ましい化合物、ならびにそれらを製造するための方法が、WO2007/128723に記載されており、そのそれぞれの開示内容はここに参考として組み入れられる。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記AHR阻害剤は、AHRタンパク質に特異的に結合してこれを阻害する抗体である。

この文脈で使用される「抗体」は、本明細書に別記されるように、AHRポリペプチドに特異的に結合し、AHR活性を阻害する、あらゆる種類の抗体を指す。好ましくは、本発明のこのような阻害抗体は、リガンド結合ドメインにある、AHRポリペプチド内部のエピトープに特異的に結合すべきである。あるいはまた、抗体による結合がAHR活性を阻害することになるエピトープは、AHRのDNA結合ドメインにあってもよいが、ARNTポリペプチドとの相互作用に関与するドメインにあってもよい。適当なドメインは、本明細書の別項で詳細に検討される。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、またはこのような抗体の任意のフラグメントもしくは誘導体である。本明細書で使用される抗体という言葉によって包含されるこのようなフラグメントおよび誘導体は、二重特異性抗体、合成抗体、Fab、F(ab)₂、Fv、もしくはscFvフラグメント、またはこれらの抗体のいずれかの化学修飾誘導体を含む。本発明の抗体との関連で使用される特異的結合は、抗体が他のポリペプチドと交差反応しないことを意味する。特異的結合は、さまざまな周知の技法によって検証することができる。

抗体またはそのフラグメントは、一般に、たとえば、Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載の方法を使用することによって得られる。モノクローナル抗体は、マウス骨髄腫細胞と、免疫化哺乳類、好ましくは免疫化マウス由来の脾臓細胞との融合を含む技術によって調製することができる（Koehler 1975, Nature 256, 495, and Galfre 1981, Meth. Enzymol. 73, 3）。好ましくは、上記のエピトープを有する免疫原性ペプチドが哺乳動物に適用される。宿主の種に応じて、免疫反応を強めるために、さまざまなアジュバントを使用することができる。このようなアジュバントには、たとえば、フロイントアジュバント、ゲル状鉱物、たとえば水酸化アルミニウム、および界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが含まれる。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記AHR阻害剤は、AHRリプレッサータンパク質、または不活性AHR核トランスロケーター（ARNT）である。

本明細書で使用される「AHRリプレッサー（AHRR）」という用語は、AHRおよびAHR/ARNT複合体の活性をマイナスに制御する推定腫瘍抑制遺伝子を意味する。好ましくは、本明細書に記載のAHRRポリペプチドそれ自体のアミノ酸配列はもちろん、AHRRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、Genbank受入番号：BC151852 (GI: 156229770)に示されている。さらに、本発明のAHRRポリペプチドは、前記の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントであってもよい。1つもしくは複数のヌクレオチド置換、欠失、および/または付加を含有する、前記ポリヌクレオチドのバリアントは、好ましくは、本発明にしたがって、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を有する、コードされたアミノ酸、すなわち本発明のポリペプチドバリアントをもたらす。バリアントポリヌクレオチドは、好ましくは、前記の特定の核酸配列に対して、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一な核酸配列を含有すべきである。さらに、バリアントポリヌクレオチドは、好ましくは、前記アミノ酸配列に対して、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一なアミノ酸配列をコードする、核酸配列を有していてもよい。2つの所与の配列間の配列同一性を計算する方法は、本明細書の別項に詳細に記載されている。

上記のように、不活性型のARNTポリペプチドは、前記の特定のポリヌクレオチドもしくはアミノ酸配列またはそれらのバリアントに基づいて、容易に当業者がデザインすることができる。さらに、これらの不活性ARNTポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを癌細胞に導入し、当技術分野でよく知られている方法で治療することができる。具体的には、不活性ARNTをコードするポリヌクレオチドのデリバリーシステムとして、本発明にしたがって、ウイルス発現系による遺伝子導入が想定される。適当な技法は当技術分野でよく知られている（上記を参照されたい）。

本明細書で使用される「AHR核トランスロケーター（ARNT）」は、AHR転写因子のための結合タンパク質を指す。詳細は本明細書の別項にすでに記載している。AHR阻害剤として本明細書で言及されるARNTポリペプチドは、依然としてAHRと相互作用する能力を有するが核トランスロケーションを妨げるポリペプチドであるか、またはAHR/ARNT複合体を細胞のタンパク質分解機構に向かわせるポリペプチドである。このような改変された阻害性ARMTポリペプチドをデザインする方法は、当業者によく知られている。好ましくは、本明細書で言及される（未改変）ARNTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Genbank 受入番号：NM_001197325.1 (GI: 309747070)に示されている。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、Genbank受入番号：（タンパク質）NP_001184254.1 (GI: 309747071)に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。さらに、本発明のARNTポリペプチドは、前記の特定のARNTポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントとすることができる。1つもしくは複数のヌクレオチド置換、欠失、および/または付加を含有する前記ポリヌクレオチドのバリアントは、好ましくは、結果として、1つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または付加を有する、コードされたアミノ酸、すなわち本発明によるポリペプチドバリアントをもたらす。バリアントポリヌクレオチドは、好ましくは、上記の特定の核酸配列に対して、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一の核酸配列を含有すべきである。さらに、バリアントポリヌクレオチドは、好ましくは、上記アミノ酸配列に対して、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有することができる。2つの所与の配列間の配列同一性を計算する方法は、本明細書の別項に詳細に記載されている。

AHRRポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを癌細胞に導入し、当技術分野でよく知られている方法で治療することができる。具体的には、不活性ARNTをコードするポリヌクレオチドのデリバリーシステムとして、本発明にしたがって、ウイルス発現系による遺伝子導入が想定される。適当な技法は当技術分野でよく知られており、たとえばGardlik 2005, Med Sci Monit. 11 (4): RA110-21; Salmons 1993, Hum Gene Ther. 4 (2): 129-41に記載されている。

本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記AHR阻害剤は核酸阻害剤である。

本明細書に記載の「核酸阻害剤」は、上記で抗体について記載したのと同様にポリペプチドに結合することによってAHRポリペプチドの活性を阻害するアプタマーのような核酸分子であるか、またはAHRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的であるために、前記ポリヌクレオチドと結合してその転写もしくは翻訳を阻害する核酸分子である。たとえば、阻害性核酸は、AHR遺伝子の適切な転写を妨げることによってトリプルヘリックス形成性オリゴヌクレオチドとして働く可能性がある。さらに、阻害性核酸は、AHR転写物に特異的に結合してそれを分解するリボザイムであってもよい。あるいはまた、阻害性核酸は、転写物に結合してそれを分解することができるか、または少なくともその効率的な翻訳を阻害することができる、アンチセンス、siRNA、またはマイクロRNAであってもよい。後者のタイプの阻害性核酸は、通常、AHR転写物中の配列に相補的な核酸配列を含有することを特徴とする。このような相補的配列は、細胞内で転写物との特異的なハイブリッド形成を可能にするように、十分な長さを有するべきであるし、十分な数の適合するヌクレオチドを含有するべきである。本明細書の別項に記載のような遺伝子導入系でデリバリーすると、このような核酸阻害剤を癌細胞内で発現させることができる。阻害性核酸は、好ましくは、発現制御配列のもとで発現させることができる。したがって、標的遺伝子の発現を阻害するためのRNA干渉の関与は、外部刺激によって調節することができる発現制御配列、たとえば活性をテトラサイクリンによって制御することができるtetオペレーターもしくは熱誘導性プロモーターによって、または腫瘍特異的もしくは組織特異的プロモーターの制御下で、調節することができる。しかしながら、核酸阻害剤は、リポソームによるデリバリーシステムによって送達されることもある。

したがって、本発明の方法の別のより好ましい実施形態において、前記核酸阻害剤は、リボザイム、アンチセンス分子、阻害性オリゴヌクレオチド、アプタマー、マイクロRNA、およびsiRNAからなる一群から選択される。

本発明に記載の「リボザイム」は、AHR転写物に相補的な配列を含有するRNA分子である。さらに、リボザイムは、AHR転写物中のホスホジエステル結合の加水分解を引き起こすことができる核酸配列を含有する。本発明に記載のリボザイムは、いわゆるハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、またはVSリボザイムとすることができる。リボザイムテクノロジーは当技術分野でよく知られており、当業者は難なく、適当なリボザイムをデザインして応用することができる；たとえば、Khan 2006, Clin. Chim. Acta 367 (1-2): 20-27; Kalota 2004, Cancer Biology & Therapy 3:1 4-12を参照されたい。

本明細書で使用される「アンチセンス分子」は、AHR転写物に相補的な、またはAHR転写物と結合することができるモルホリノオリゴヌクレオチドに相補的な、治療用アンチセンスRNAを表す。モルホリノオリゴヌクレオチドの応用を含めたアンチセンステクノロジーは、当技術分野でよく知られている；たとえばKalota 2004, Cancer Biology & Therapy 3:1 4-12; Morcos 2007, Biochem Biophys Res Commun 358 (2): 521-7を参照されたい。

本明細書で使用される阻害性オリゴヌクレオチドは、好ましくは二本鎖DNA小分子を指すが、これは標的ゲノムDNAの特定の領域に結合し、それによって遺伝子サイレンシングを達成することができる小分子（いわゆるトリプルヘリックス形成性オリゴヌクレオチド）であるか、または、デコイとして機能するオリゴヌクレオチドに結合して、標的遺伝子の転写に特異的に必要とされる転写因子を捕捉することができる小分子である。このような技術は、in vivoでも有効に使用されており、またある程度まではすでに治療法をもたらしている（Kalota 2004, Cancer Biology & Therapy 3:1 4-12を参照されたい）。

本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、AHRポリペプチドに特異的に結合する核酸アプタマーを指す。アプタマーのプールは、たとえば、試験管内人工進化法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）（SELEX法）を用いることによって作製することができる。選択ステップは、AHRポリペプチドに特異的に結合するアプタマーを求めて行うことができる。特異的に結合するアプタマーの中で、リガンド結合をブロックするもの、または相互作用ドメインをブロックし、それ故に本発明の意味において適当な阻害剤となるものを、同定することができる。アプタマーを作製するための技法は当技術分野で十分に確立されている；たとえば、Tuerk 1990, Science. Aug 3;249(4968):505-510; or Ellington 1990, Nature. Aug 30;346(6287):818-822を参照されたい。

本発明の意味において「マイクロRNA」は、AHR転写物に含まれる核酸配列に対して少なくとも部分的に相補的である、一本鎖RNA分子を表す。マイクロRNAは通常、約19〜26ヌクレオチドの長さを有する。マイクロRNAは、ヘアピン構造、およびヘアピンの軸を形成する2つの相補的な自己相補的領域を含有する前駆体、いわゆるpri-microRNAとして合成される。自己相補的な核酸配列の1つがマイクロRNAである。pri-microRNAは約70ヌクレオチドの長さを有し、標的細胞内でプロセシングを受けて成熟したマイクロRNAとなる。成熟マイクロRNAは、それとハイブリッド形成することで、転写されたmRNAの翻訳または安定性に影響を及ぼすことによって、遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる。マイクロRNAおよびそのpri-microRNAをデザインする方法は当業者によく知られている。具体的には、内在性pri-microRNA分子の自己相補的領域を、AHR転写物に少なくとも部分的に相補的な1つの自己相補的領域を含有する自己相補的領域ペアで置き換えることができる。マイクロRNAの技術は、たとえばBartel 2009, Cell 136 (2): 215-33, Trang 2008, Oncogene 27 Suppl 2: S52-7 or Li 2009, The AAPS journal 11 (4): 747-57に記載されている。

本明細書に記載の「低分子ヘアピン型RNA（shRNA）」は、上記でpri-microRNAについて記載したのと同様の構造を有する。しかしながら、shRNAは通常、長さがより短い。さらに好ましくは、AHR阻害剤として本発明にしたがって言及されるshRNAは、配列番号1〜4のいずれか1つに示す核酸配列を含有する、または基本的にそうした核酸配列からなる、核酸分子である。shRNAのデザインおよび応用は当技術分野でよく知られており、たとえば、McIntyre 2006, BMC Biotechnol. 6: 1 or Cao 2005, J Appl Genet. 46 (2): 217-25に記載されている。

「低分子干渉RNA（siRNA）」は、AHR転写物の一部と相補的であって、それと塩基対を形成することができる二本鎖RNA物質である、核酸分子を指す。siRNAは、標的RNAを切断するように宿主細胞内で酵素を特異的に導くように作用する。siRNA配列の特異性およびそのRNA標的に対する相同性によって、siRNAは、標的RNA鎖の切断を引き起こし、それによって標的RNA分子を不活化することができる。好ましくは、RNA干渉をもたらすのに十分なsiRNAは、標的遺伝子の逆方向反復断片、および当該遺伝子のコード領域（またはその一部）を含む核酸配列を含有する。siRNAの相補的領域は、siRNAと標的RNAとの十分なハイブリッド形成を可能にし、それによってRNA干渉を仲介する。哺乳類細胞において、siRNAは約19-25ヌクレオチド長である。siRNA配列は、相補的な塩基対合の相互作用を通じてsiRNAおよび標的RNAを一つに結び付けるのに十分な長さを有する必要がある。siRNAの長さは、好ましくは10ヌクレオチド以上であり、標的RNAと安定に相互作用するのに十分な長さを有する；具体的には15-30ヌクレオチド；より具体的には15から30ヌクレオチドまでの間の任意の整数値であり；最も好ましくは15、16、17、18、9、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、および30である。十分な長さとは、予想される条件下で目的とする機能を与えるのに十分な長さである15ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドのことである。安定な相互作用とは、低分子干渉RNAと標的核酸との相互作用（たとえば、生理的条件下で、標的の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することによる）を意味する。概して、このような相補性の度合いは、siRNAとRNA標的との間で100％であるが、必要に応じてより低いこともあり、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％とすることができる。たとえば、21塩基のうち19塩基が、塩基対をなすことができる。場合によって、アレルバリアント間の選択が望ましい場合には、他のアレル配列から標的配列を効果的に識別するために、標的遺伝子に対する100％の相補性が必要とされる。C. elegans（センチュウの一種）、ショウジョウバエ属（Dr
osophila）、植物、および哺乳動物などの生物において遺伝子の発現を抑えるためにRNA干渉を使用することに関する方法は、当技術分野で知られている（たとえば、Fire 1998, Nature 391:806-811; Fire 1999, Trends Genet. 15, 358-363; WO2001/29058; WO2009/932619を参照されたい）。

最後に、概して、トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）活性の増加と関連する癌の治療および/または予防に用いるために、AHR阻害剤、好ましくは本明細書に記載のAHR阻害剤が、本発明で検討される。

トリプトファン分解による癌関連免疫抑制は、これまで、癌細胞および腫瘍流入領域リンパ節中のIDO酵素活性によるとされていた。したがって、IDO阻害は、ヒト癌細胞に及ぼすいくぶん的確でない効果にもかかわらず、臨床試験において、癌を治療するための治療方法として現在、評価されているところである。本発明の基礎となる研究では、TDOが、癌において強く発現されており、同時に、免疫抑制性のKynを産生できることが示された。IDO陰性神経膠腫細胞では、TDOが構成的なTrp分解の唯一の決定要因であると思われ、そのことはTDOが神経膠腫治療における新たな治療ターゲットとなることを示す。実際、経口で使用できるTDO阻害剤が最近開発された。腫瘍細胞それ自体に作用することによって癌の悪性表現型を維持することができる、構成的なTrp分解の重要性を本発明者らが詳述したとおり、TDOの阻害は、抗腫瘍性免疫応答を回復させることができるだけでなく、腫瘍細胞固有の悪性表現型に影響を及ぼすこともできる。新たに出現した証拠は、AHRの発癌促進の役割を暗示する。構成的に活性なAHRを有するトランスジェニックマウスは自然に腫瘍を形成し、AHRのリプレッサー（AHRR）は、複数のヒトの癌において腫瘍抑制遺伝子となる。Ahr欠損マウスの異常な表現型は、内在性のAHRリガンドの存在を示す。内因的に産生されるさまざまな代謝産物、たとえば、アラキドン酸代謝産物、ビリルビン、cAMP、トリプタミン、および6-ホルミルインドロ[3,2-b]カルバゾール（FICZ）がAHRのアゴニストであることは示されているが、それらの機能性については、癌または免疫活性化といった病態生理学の文脈において、説得力のある立証はなされていない。したがって、AHRの内在性リガンドの探求が続いている。

本発明を踏まえて、癌の進行をもたらすこれら2つの重要な経路は、Trp異化がAHR活性化につながることを示すことによって、十分な量の機能的に関係のある内在性AHRリガンドの生成と関連する、ヒトの病態生理学的状態の証拠を提供する。本発明の基礎となる研究の結果は、AHRを介したシグナルに対する、一次免疫細胞および形質転換癌細胞の反応の差異を明らかにするが、これは、古典的な外因性AHRリガンド、TCDDおよび3-MCを用いた、さまざまな毒性学的研究と合致する。これらの生体異物への暴露は、細胞性および液性免疫反応の著しい抑制をもたらすが、同時に、発癌を促進し、腫瘍増殖を引き起こすことにもつながる。これらの細胞特異的なAHR効果の相違は、AHRRのようなAHRシグナル伝達を個別に制御する因子の発現、ならびにAHR活性化に対する反応を形成する細胞特異的転写因子クロストークに左右される可能性がある。Kynを介したAHRの活性化は、癌の経過に関連するだけではないようである。たとえば、作動性リガンドによるマウスおよびヒトAHRの活性化は制御性T細胞を誘導する。興味深いことに、Ahr欠損マウスは、外因性リガンドが存在しないと中枢神経系（CNS）の自己免疫増悪に罹るが、Trp異化はCNS自己免疫を抑制し、そのことは、Trp異化の活性化が、AHRを介して炎症を限局する内因性フィードバックループに相当することを示唆する。実際、外因性KynはマウスにおいてAHRを介した免疫細胞の調節に関与する。AHRを活性化するのに十分なKyn濃度は、炎症性刺激に反応して、IDOによっても生成される。より広い意味において、かなりの数の悪性腫瘍が、ほぼ慢性の感染および炎症部分から発生するが、そこで、腫瘍微小環境中のTrp異化は活性化されており、局所免疫抑制を維持する。炎症刺激に応じて生じる、KynによるAHRの活性化は、したがって、炎症と発癌をつなぐこれまで認識されていない経路を構成している可能性がある。

本明細書に引用されるあらゆる参考文献は、開示内容の全体、ならびに本明細書に個別に言及される開示内容について、参考として本明細書に組み入れられる。

（実施例）
本発明は、ここから下記の実施例によって説明されることになるが、その実施例は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

材料および一般的な方法
細胞および試薬
細胞株の起源および培養条件は、補足的方法において詳述される。すべての神経膠腫始原細胞（GIC）は、切除したばかりの腫瘍から確立され、最初の継代に使用された。すべての細胞は細菌汚染について常に検証された。Trpを含まないRPMI 1640 (Promocell) および透析されたFBS (Invitrogen)を用いて、Trpを含まない条件下で細胞を培養した。L-TrpおよびL-KynはSigma-Aldrich製とした。インターフェロンγ（IFNγ）は、Immunotools (Friesoythe, Germany)製とした。TCDDおよび3-メチルコラントレン（3-MC）はSigma-Aldrich製、3,4-ジメトキシフラボン（3,4-DMF）はAlfa Aesar（Karlsruhe, Germany）製とした。TDO阻害剤((E)-6-フルオロ-3-[2-(3-ピリジル)ビニル]-1H-インドール) 680C91は、ピペリジン存在下での6-フルオロインドール-3-カルボキサルデヒドとピリジン-3-酢酸との縮合によって合成した。

マウス
C57BL/6NおよびCD-1 nu/nuマウスは、Charles River (Sulzfeld, Germany)から購入した。Ahr欠損マウス（B6.129-AHRtm1Bra/J）は、Charlotte Esser (Duesseldorf, Germany)に提供していただいた。Ahr欠損マウスと齢の適合したC57BL/6Nは、Harlan Laboratories (Rossdorf, Germany)から得た。

TDO発現解析
TDOの発現は、ヒト腫瘍において免疫組織化学によって解析した。Trp分解に対するその関連性は、遺伝子のノックダウンによって、またはTDOの過剰発現によって判定した。TrpおよびKynは、細胞培養上清、ヒト血清、および異種移植組織においてHPLCで測定した。混合白血球反応、クロム放出、ELISpot、および腫瘍組織中の免疫細胞の染色を用いて、TDO活性の免疫効果を評価した。細胞周期の分析、マトリゲルおよびスフェロイド浸潤アッセイ、スクラッチアッセイ、スフィアフォーメーションアッセイ、およびコロニー形成能アッセイを用いて、TDO活性のオートクリン作用を分析した。すべての動物手順は、施設の実験動物研究指針に従い、政府機関により承認された。TDOのノックダウンあり、およびなしのヒト神経膠腫細胞のCD1nu/nuマウスへの同所移植、前記細胞のNK枯渇または野生型CD1nu/nuマウスへの皮下注入、ならびマウスのTdo機能を有するGL261およびTdo欠損GL261細胞の同系C57BL/6Nマウスへの皮下注入を行って、in vivoでのTDO活性のオートクリンおよびパラクリン作用を分析した。Kynで処理したヒト神経膠腫細胞のマイクロアレイ分析を行って、Kynにより活性化されるシグナル伝達経路を確認した。AHRトランスロケーションの分析、DREルシフェラーゼ分析および放射性リガンド結合アッセイによって、KynによるAHRの活性化が確認された。AHRの薬理学的阻害および安定したノックダウン（in vitroおよびin vivo）は、Kynの影響がAHR依存性であることを立証した。Tdo機能を有する腫瘍細胞およびTdo欠損腫瘍細胞のAhr+/+およびAhr-/-マウスへの注入を用いて、TDOを介した癌促進に対する宿主の影響の寄与を検討した。最後に、ヒト腫瘍組織の染色、マイクロアレイデータ、および臨床データを用いて、TDOがヒトの癌においてAHRを活性化するかどうか、ならびにこれが生存にどのような影響を及ぼすかを分析した。

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるTrpおよびKyn濃度の分析
HPLC分析は、フォトダイオードアレイ（PDA）検出およびLichrosorb RP-18カラム（250 mm x 4 mm ID、5μm、Merck、Darmstadt、Germany)を有するBeckman HPLCを用いて実施した。KynおよびTrp濃度は、3 x 10⁵細胞の培地中で測定した。ヒト血清は、24人の膠芽細胞腫患者（女性10人、男性14人、年齢中央値53.5歳）ならびに24人の年齢および性別のマッチした健常対照（女性10人、男性14人、年齢中央値53.5歳）からインフォームドコンセント後に採取し、TrpおよびKyn濃度について分析した。U87異種移植片中のKyn濃度を測定するために、U87腫瘍を切除して秤量し、ただちに液体窒素中で凍結して加工処理した。

定量的（q）RT-PCR
全RNAはQiagen RNeasyキットを用いて分離し、cDNAはApplied Biosystems逆転写キット(Foster City, CA, USA)を用いて合成した。QRT-PCRは、SYBR Green PCR Mastermixを用いてABI 7000サーマルサイクラーで行った(いずれもApplied Biosystems)。すべてのプライマーは、ゲノムDNAの増幅を除外するために、ゲノムDNA上の少なくとも1つのイントロンで隔てられた。PCR反応は、鋳型の脱落、ならびに融解曲線およびゲル分析によって、no-RTコントロールを含めることにより確認された。標準曲線は、それぞれの遺伝子について作製された。遺伝子発現の相対的定量は、閾値の比較によって決定した。すべての結果は、GAPDHに対して標準化された。

siRNA実験
IDO1（INDO）、IDO2、およびTDO（TDO2）をノックダウンするために、Dharmacon RNA Technologies（Lafayette, CO, USA）によるSMARTプールsiRNAを使用した。標的配列は以下の通りとした：
ヒトINDO (Genbank受入番号NM_002164):
5’-UCACCAAAUCCACGAUCAUUU-3’ (配列番号5);
5’-UUUCAGUGUUCUUCGCAUAUU-3’ (配列番号6);
5’-GUAUGAAGGGUUCU GGGAAUU -3’ (配列番号7);
5’-GAACGGGACACUUUGCUAAUU-3’ (配列番号8)
ヒトIDO2 (Genbank受入番号NM_194294):
5’-CAAACUUCCUCAAUUGAUU-3’ (配列番号9);
5’-UUGGAAAGCUAUCACAUAU-3’ (配列番号10);
5’-GAGUAUGGCUUUCUUCUUC-3’ (配列番号11);
5’-GCACCCAGUUGAAGUUUAA-3’ (配列番号12)
ヒトTDO2 (Genbank受入番号NM_005651):
5’-UCAUAAGGAUUCAGGCUAA-3’ (配列番号13);
5’-AGUGAUAGGUACAAGGUAU-3’ (配列番号14);
5’-GGAUUUAACUUCUGGGGAA-3’ (配列番号15);
5’-GCGAAGAAGACAAAUCACA-3’ (配列番号16)
TDOA shRNAセンス:
5’-GGAAAGAACTCCAGGTTTATTCAAGAGATAAACCTGGAGTTCTTTCC-3’ (配列番号17)
TDOA shRNAアンチセンス:
5’-CCTTTCTTGAGGTCCAAATAAGTTCTCTATTTGGACCTCAAGAAAGG-3’ (配列番号18)
TDOB shRNAセンス:
5’-TCATAAGGATTCAGGCTAATTCAAGAGATTAGCCTGAATCCTTATGA-3’ (配列番号19)
TDOB shRNAアンチセンス:
5’-AGTATTCCTAAGTCCGATTAAGTTCTCTAATCGGACTTAGGAATACT-3’ (配列番号20)
ON-TARGETplus siCONTROL Non-targeting Pool (D-001810-10- 05, Dharmacon) およびsiRNAなしのトランスフェクションを、ネガティブコントロールとして使用した。細胞は、Invitrogen製のリポフェクタミン（Lipofectamine）RNAiMAXを用いてトランスフェクトした。ノックダウン効率はqRT-PCRによって分析した。

安定なノックダウン細胞
U87ヒト神経膠腫細胞は、FUGENE HDトランスフェクション試薬（Roche, Mannheim, Germany）を用いて、sh-TDOまたはスクランブルコントロールを発現するpSUPER.puroプラスミド (OligoEngine, Seattle, WA, USA)でトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に、培地を5μg/mlピューロマイシン（AppliChem GmbH）含有DMEMに交換した。別に指示のない限り、sh-TDOAを使用した。LN308神経膠腫細胞においてAHRをノックダウンするために、pSingle-tTS-shRNAベクターをClontech (CA, USA)より購入した。XhoI/HindIIIオーバーハングを有する、望ましいshRNA配列をコードするアニーリングされた二本鎖オリゴヌクレオチドを、XhoI/HindIIIクローニング部位を用いてベクター中にクローニングした。XhoI/HindIIIオーバーハングを含む、コントロール/AHRまたはTDO shRNAサイレンシングのための低分子ヘアピン配列は以下の通りとした：
スクランブルshRNAアンチセンスオリゴ:
5’-AGCTTGGATCCAAAAAAGTACTTCCACCTCAGTTGGCTCTCTTGAAGCCAACTG AGGTGGAAGTACC-3’ (配列番号21)
スクランブルshRNAセンスオリゴ:
5'-TCGAGGTACTTCCACCTCAGTTGGCTTCAAGAGAGCCAACTGAGGTGGAAGTA CTTTTTTGGATCCA-3’ (配列番号22)
AHR shRNAアンチセンスオリゴ:
5’-AGCTTGGATCCAAAAAAGCGTTTACCTTCAAACTTTATCTCTTGAATAAAGTTT GAAGGTAAACGCC-3’ (配列番号1)
AHR shRNAセンスオリゴ:
5’-TCGAGGCGTTTACCTTCAAACTTTATTCAAGAGATAAAGTTTGAAGGTAAACG CTTTTTTGGATCCA-3’ (配列番号2)
AHR shRNAアンチセンスオリゴ(AHRAHR siRNAのSMARTプールのDharmacon siRNA #6):
5’-AGCTTGGATCCAAAAAAGGAACTCAAGCTGTATGGTATCTCTTGAATACCATA CAGCTTGAGTTCCC-3’ (配列番号3)

AHR shRNAセンスオリゴ (Dharmacon):
5’-TCGAGGGAACTCAAGCTGTATGGTATTCAAGAGATACCATACAGCTTGAGTTC CTTTTTTGGATCCA-3’ (配列番号4)
組換えベクターをLN-308およびLN-18神経膠腫細胞にトランスフェクトし、クローン形質転換体を1 mg/mlネオマイシン（Sigma-Aldrich）によって選択した。2μg/mlドキシサイクリン（Sigma-Aldrich）を用いてノックダウンを誘導し、誘導の72時間後に細胞を分析した。他に特に指示しない限りsh-AHR1を使用した。

安定な過剰発現
GL261細胞に、Tdo cDNA (NM_ 019911)を発現するpcDNA3.1 (-) (Invitrogen)、または空のベクターを、FUGENE HD試薬（Roche）を用いてトランスフェクトした。クローン形質転換体を1 mg/mlネオマイシン（Sigma-Aldrich）を用いて選択した。

組織標本および免疫組織化学
3μmに切断した切片を、Ventana BenchMark XT（登録商標）免疫染色装置(Ventana)を用いてそれぞれの抗体とともにインキュベートして処理した。TDO染色の定量分析のために、染色された腫瘍細胞のパーセンテージ、および染色強度を、光学顕微鏡（Olympus BX51）を用いて、組織切片上の代表的な倍率視野（200x）において評価した。

免疫蛍光染色
免疫蛍光のために、TDO低発現の神経膠腫およびTDO高発現の神経膠腫の切片は、Ventana Cell Conditioner 1の中で30分間の熱による抗原回復の後、ウサギ抗TIPARP（1:50）およびマウス抗LCA（1:50）抗体とともに4℃にて一晩インキュベートした。その後、ロバ抗ウサギAlexaFluor 568 (1:500, Invitrogen)およびロバ抗マウスDyLight 488 (1:100, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)二次抗体を5時間作用させた。顕微鏡写真は、Olympus BX-50顕微鏡 (Olympus GmbH, Hamburg, Germany)で、Zeiss Axiocam MRm (Zeiss, Jena, Germany)を用いて撮影された。

混合白血球反応（MLR）
96ウェルプレート内で、10％ FBS、100 U/ml ペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640中に神経膠腫細胞をシードした。シードの24時間後に、刺激細胞として2 x 10⁵ 放射線照射 (30 Gy) PBMC、ならびにレスポンダーとして非血縁ドナー由来の2 x 10⁵ PBMCを添加した。6日MLRを行って、最後の18時間、培養物に[3H]-メチルチミジン（PerkinElmer, Waltham, MA, USA）を適用し、放射性核種の取り込みをシンチレーション計数により測定した。6人の非血縁PBMCドナーについて実験を繰り返した。

レポーターアッセイ
補足的方法に詳述されるように、デュアルルシフェラーゼ/ウミシイタケアッセイを行った。さまざまなTrp代謝産物に反応してDREによって駆動されるレポーター遺伝子活性化を分析するために、ウミシイタケルシフェラーゼを発現する、pGL3プロモーター発現プラスミドおよび対照プラスミドpRL-SV40を使用した（Promega, Heidelberg, Germany）。

浸潤アッセイ
マトリゲルアッセイにおいて、細胞の浸潤は、膜を超えて移動した細胞数を5つの独立した顕微鏡高倍率視野で計数することによって評価し、微小格子を用いて対照に対する侵襲のパーセンテージとして表した。スフェロイドアッセイでは、埋め込み後0、24、48、および72時間の時点で、各スフェロイドがカバーする領域の顕微鏡写真を撮った。定量のために、ImageJを用いて、指示された時点で浸潤神経膠腫細胞によってカバーされる平均面積を24時間間隔で測定し、0時間の面積と比較した。

クロム放出アッセイ
免疫細胞の細胞傷害性の阻害は、標準化51クロム放出アッセイ（補足的方法）を用いて評価した。パーセント単位の特異的な溶解は次のように計算した：[51Cr放出実験値 - 最小放出] / [最大放出- 最小放出] x 100。この実験は、少なくとも4人の異なるPBMCドナーについて実施した。

酵素免疫スポットアッセイ（ELISpot）
樹状細胞（DC）を健常C57BL/6Nマウスの骨髄から分離し、20 ng/ml GM-CSF (Immunotools)を含有するRPMI 1640中で5日間培養した。担癌マウスから脾臓を摘出し、40μmセルストレイナーを通してすりつぶした。赤血球を溶解し、Pan T CellアイソレーションキットII（Miltenyi GmbH）を用いて、MACSによりT細胞を分離した。抗IFNγ抗体（Mabtech AB, Nacka Strand, Sweden）でコーティングしておいたELISpotプレート(Millipore)に2 x 10⁵ DCをシードし、10μg GL261溶解物（PBS中で凍結融解サイクルを繰り返すことによって作製）を4時間適用した後、1 x 10⁵ T細胞を添加した。36時間後、IFNγ産生T細胞を、ビオチン標識抗IFNγ抗体、ストレプトアビジン-ALPおよびBCIP/NBTPLUS (Mabtech)を用いて検出し、ImmunoSpot Analyzer (Cellular Technology Limited, Shaker Heights, OH, USA)を用いて定量した。

AHRトランスロケーションの検出
AHRトランスロケーションを検出するために、ウェル当たり7000個の、GFP標識AHRを有するTao BpRc1細胞を50μM Kynまたは50μM Trpに暴露し、PBS中3.7％ホルムアルデヒドの中で固定して、0.1％Triton X100中で透過性とし、1μg/ml Hoechst 33342 (Invitrogen)とともにインキュベートしてから、20x U-Apo 340対物レンズ(Olympus, NA 0.75)を用いてノンコンフォーカルモードで、BD Pathway（登録商標）Imager 855にてイメージングした。蛍光強度の分析はさらに、Attovisionソフトウェア(BD Biosciences)を用いて行った。それに加えて、LN-229神経膠腫細胞の核および細胞質画分中のAHRタンパク質含量をイムノブロッティングにより比較した。

3H標識Kynによる放射性リガンド結合アッセイ
11 Ci/mmolの比放射能を有するL-3H-Kynは、Quotient Bioresearch (Radiochemicals) Ltd. (Cardiff, UK)より入手した。Ahr高発現およびAhr欠損マウス由来のマウス肝サイトゾルを用いたL-3H-Kynによる結合アッセイを行った。特異的な結合は、Ahr高発現およびAhr欠損サイトゾル間の放射能の相違として定義された。

動物実験
すべての動物手順は、施設の実験動物研究指針に従い、政府機関により承認された。ヒト神経膠腫細胞は、6匹の6-12週齢胸腺欠損マウス（CD1nu/nu）の右線条体に皮下注入されるか、または定位的に移植され、観察された。NK細胞の枯渇は、腫瘍細胞注入の2日前に開始して、ウサギ抗アシアロGM1抗体（Wako Chemicals, Duesseldorf, Germany）の隔週腹腔内注入によって実施した。対照は、ウサギIgG（Calbiochem, Darmstadt, Germany）を注入した。in vivoでAHRノックダウンを誘導するために、ドキシサイクリンを、スクロース含有飲用水中2 mg/mlの濃度でマウスに投与した。マウス神経膠腫細胞は、6-12週齢野生型C57BL6/NマウスまたはAHR-/- C57/Bl6マウスの右側腹部に皮下注入した。

核磁気共鳴映像法（MRI）
図3のMRIスキャンは、通常の全身1.5 T MRIスキャナー（Symphony, Siemens, Erlangen, Germany）で特注の送信/受信小動物コイルを用いて行った。

マイクロアレイ
U87神経膠腫細胞を100μM Kynで8時間または24時間処理した後、その細胞を集め、RNAeasy-Kit (Qiagen)を用いてRNAを分離した。RNAを補足的方法に詳述したようにマイクロアレイ分析に供した。4つの処理（8時間、24時間、Kyn処理、未処理）のそれぞれについて、2つのアレイをハイブリダイズして、Kyn処理サンプル対未処理サンプルの平均log2比を計算した。データのその他の解析は補足的方法に詳述している。臨床サンプルのために、マイクロアレイおよび臨床データは、Molecular BRAin Neoplasia DaTa (REMBRANDT)のリポジトリ（REpository）から入手した（補足的方法）。The Cancer Genome Atlas (TCGA)ネットワークの未処理の原発性膠芽細胞腫（n=362）のデータセットの中で生存分析を、R2マイクロアレイ分析のKaplan-Meier分析モジュールおよび可視化プラットフォーム (http://r2.amc.nl)を用いて行った。

統計分析
データは、平均±平均誤差として表した。有意性の分析は、スチューデントのt検定で実施した。P値＜0.05を有意と見なした。Ki67およびTDOの相関は、スピアマン（Spearman）の順位相関（SPSS, IBM, Somers, NY, USA）によって分析した。TDOとAHRとの相関 (図6c)、ならびにTDOとCYP1B1との相関 (図6d)は、スピアマンの順位相関（Sigmaplot）によって分析した。核の蛍光強度は、順位による一元配置ANOVA（p=<0.001）に続いてDunn法（p<0.05）によって分析した。

TDOによって生成するKynのオートクリンおよびパラクリン作用
本発明の基礎となる研究によると、ヒト癌細胞株の選別は、脳腫瘍細胞、すなわち神経膠腫細胞株およびグリオーマ幹細胞（GIC）におけるTrpの構成的な分解および高マイクロモルレベルのKynの放出を明らかにしたが、ヒト星状膠細胞ではそうではなかった（図1a）。驚くべきことに、IDO1およびIDO2は、脳腫瘍において構成的Trp異化の原因とはならなかった。その代わりに、トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）が、これは主に肝臓で発現され、全身のTrp濃度を制御すると考えられているが、ヒト神経膠腫細胞で強く発現され、Kyn放出と相関していた（図1b）。TDOの薬理学的阻害またはノックダウンは、神経膠腫細胞によるKyn放出をブロックしたが、IDO1およびIDO2のノックダウンは影響を及ぼさず（図1c、d）、したがって、TDOがヒト神経膠腫細胞において主要なTrp分解酵素であることが確認された。ヒト脳腫瘍標本において、TDOタンパク質レベルは悪性度とともに増加し、増殖指数と相関した（図1e-g）。前記のように（(Miller 2004, Neurobiol Dis 15(3), 618）、健常なヒトの脳はニューロンに弱いTDO染色しか示さなかった（図1e）。TDO発現は神経膠腫に限定されず、本明細書の別項で言及される他のタイプの癌、肝細胞癌、結腸癌、乳癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巣癌、悪性黒色腫（脳転移）、および腎細胞癌などでも検出された。

神経膠腫患者の血清中のTrp濃度の低下を測定した（図1h）。これらは、Kynレベルの増加に置き換えることはできなかったが（図1h）、それは、Kynが他の細胞によって取り込まれ、キノリン酸に代謝されるからである。実際、TDO発現膠芽細胞腫組織においてキノリン酸の蓄積が検出された（図1i）。Kynは同種異系T細胞の増殖を抑制する。同種異系T細胞の増殖は、神経膠腫由来TDOによるKyn形成と逆相関した（図2a）。神経膠腫細胞におけるTDOのノックダウン（添付の図4c、d；付記9）は、同種異系T細胞の増殖を回復させたが、TDOノックダウン細胞へのKynの添加は、T細胞増殖の回復を妨げた（図2b）。Kynは、T細胞受容体刺激を受けたCD4+およびCD8+ T細胞の増殖を、濃度依存的に阻害した（添付の図4e）。それに加えて、TDOのノックダウンは、結果として、アロ反応性PBMCによる神経膠腫細胞の溶解を増強した（添付の図4f）。最後に、TDO高発現のヒト神経膠腫の切片では、TDO低発現の同切片と比べて、白血球共通抗原（LCA）陽性およびCD8+免疫細胞による浸潤の減少が観察された（図2c）が、これは、TDOによるKyn形成が、抗腫瘍免疫応答を抑制する可能性があることを示す。免疫的に正常なマウスにおけるin vivo実験は、TDO発現腫瘍が、TDO欠損の対照腫瘍より速く増殖し、高い増殖指数を示すことを明らかにした（図2d）。TDO発現腫瘍を担持するマウスについてTDO欠損腫瘍を担持するマウスと比較して、腫瘍特異的T細胞によるインターフェロンγ（IFNγ）放出、ならびに脾臓細胞による腫瘍細胞溶解が減少することから明らかなように、腫瘍のTDO活性は、in vivoで抗腫瘍免疫応答を抑制した（図2e、f）。

次に、神経膠腫細胞に及ぼすKynのオートクリン作用を評価した。対照とTDOノックダウンした神経膠腫細胞との間で、細胞周期進行の相違は検出されなかったが、TDOのノックダウンは運動性およびコロニー形成性生存を低下させた（図2g、h）。これは、Trp非存在下でKynの外からの添加が運動性およびコロニー形成性生存を回復させたので、Kynによってもたらされたものであるが（図2i、j）、そのことは、Kynが悪性神経膠腫細胞の運動性を高めることを示唆した。GICにおいて、スフェア形成は、Kynに反応して増強された。最後に、腫瘍形成は、TDOノックダウン腫瘍が機能性T細胞を欠いたヌードマウスの脳に同所移植されると減少した（図2k）。

TDOを介したNK細胞の阻害
抗腫瘍NK細胞応答の、TDOを介した阻害は、ヌードマウスでは機能的であるが、それがTDOノックダウン腫瘍の形成障害の原因となるかどうかを分析するために、皮下の腫瘍増殖をNK細胞の有無で比較した。NK細胞の枯渇は、対照およびTDOノックアウト腫瘍のいずれの増殖も強めたが、TDOノックアウトの増殖を対照の増殖にまでは回復させなかった（図2l）ので、機能性抗腫瘍T細胞およびNK細胞応答のない状態で、構成的TDO活性によって生成されるKynが、オートクリンの様式でヒト神経膠腫の悪性表現型を強めることが示唆される。

AHRによるKyn活性の分子的メカニズム
神経膠腫細胞に及ぼすKynのオートクリン作用の根底にある分子機序をよりよく理解するために、Kyn処理した神経膠腫細胞のマイクロアレイ分析を行って、KynによるAHR応答遺伝子の広範な誘導を明らかにした（図3a）。経路分析から、U87細胞のKyn処理によって8時間および24時間時点で最も強く誘導された、25個の遺伝子がすべて、直接または間接的にAHRによって制御されることが示された（図3a）。

悪性神経膠腫細胞株ならびにGICはAHRを構成的に発現するが、KynによるAHR標的遺伝子のアップレギュレーションは、2つの異なる神経膠腫細胞株で確認された。Kynは、1時間後にAHRの核内へのトランスロケーションをもたらしたが、これは、したがって、AHRに及ぼすKynの即時的作用を示す（図3b、c）。これに合致して、Kynで活性化された腫瘍細胞のウェスタンブロット分析は、TCDDにより誘導されたのと同等に、AHRの核内蓄積の増加と並行して細胞質内局在の減少を示した（図3d）。

Kynは、神経膠腫細胞において濃度依存的にREルシフェラーゼ活性を誘導し、EC50は36.6μMであった（図3e）。AHR活性化は、一連のTrpの異化代謝産物の中で、Kynに特有であった。エトキシレゾルフィン-O-脱エチル酵素（EROD）アッセイで、機能性AHR標的遺伝子シトクロームP450、ファミリー1、サブファミリーA、ポリペプチド1（CYP1A1）の誘導を確認し、KynのEC50は12.3μMであった。Ahr機能を有するマウスおよびAhr欠損マウス由来のマウス肝臓サイトゾルを用いた放射性リガンド結合アッセイは、Kynが4μMのKd(app)でAHRと結合することを示した（図3f）。Kynに対応した、AHRの活性化、ならびにAHRにより制御される遺伝子発現のアップレギュレーションは、AHRアンタゴニスト3,4-DMFによって、またはAHRのノックダウンによって阻害されたが（図3g）、これは、KynがAHRの特異的アゴニストであることを示す。Kyn、TCDD、および3-メチルコラントレン（3-MC）との結合に同一もしくは同様のAHR残基が関与することは、3,4-DMFが3つすべてのリガンドによるAHRの活性化を阻害するという事実によって確認された。重要なことは、TDOのノックダウンがAHRにより制御される遺伝子の発現を低下させたように、神経膠腫細胞の内因性Kyn生成が、AHRを活性化するのに十分であったということである（図3h）。U87異種移植片で平均Kyn濃度37.01 +/- 13.4μMが測定された（n=6）ように、in vivoでもAHRを活性化するのに十分なKyn濃度に達していた。TDOにより生成されたKynによるAHR活性化にしたがって、LCA+免疫細胞におけるAHR標的遺伝子TIPARPの発現が、TDOを発現するヒト神経膠腫切片においてのみ観察された（図4a）。

TDOがAHRを介して抗腫瘍免疫応答に影響を及ぼすかどうかを判定するために、ヒト神経膠腫切片における免疫細胞の浸潤を、AHRの発現との関連で分析した。確かに、LCA+およびCD8+免疫細胞による浸潤は、AHR高発現の神経膠腫切片において、AHR低発現の切片より減少した（図4b）。宿主AHR発現の腫瘍増殖への寄与を分析するために、Ahr欠損マウスおよびAhr機能を有するマウスにおけるTdo発現あり、およびなしのマウス腫瘍の増殖を比較した。Tdo発現腫瘍の増殖は、Ahr機能を有するマウスと比較すると、Ahr欠損マウスでは弱まっていた（図4c）が、それは、AHRによって仲介される宿主の作用が、腫瘍増殖を強めることを示す。腫瘍のLCA+免疫細胞の染色は、TDOの発現がAhr機能を有するマウスでのLCA+免疫細胞による浸潤を減少させるが、Ahr欠損マウスでは減少させないことを明らかにし（図4d）、そのことから、TDOによってもたらされる、AHRを介した抗腫瘍免疫応答の抑制が、Tdo発現腫瘍の増殖を強める宿主の作用の一因となることが示唆された。それに加えて、Ahr機能を有するマウスにおいてTdoの発現は、Tdoを発現しない腫瘍と比べて、腫瘍増殖を大いに高め、同時に、Ahr欠損マウスにおいて非常に低いレベルではあるが同じ作用が観察された（図4c）。マウス神経膠腫細胞は機能性AHRを発現するので、これらの結果は、Ahr欠損マウスにおいてTDOによりもたらされる腫瘍増殖の増加が、腫瘍細胞それ自体に及ぼすTDOのオートクリン作用に起因することを示唆する。こうした考えは、KynがAHRノックダウン後にヒト神経膠腫細胞の運動性を誘導することができなかったという事実によって裏付けられる（図4e）。また、Kynに対応するコロニー形成性生存の増加は、AHRをノックダウンした神経膠腫細胞において消失した（図4f）。最後に、in vivo実験は、ヒト神経膠腫細胞におけるAHRノックダウンの誘導が、免疫不全マウスでの腫瘍増殖を阻害することを示し（図4g）、Trp分解のオートクリン作用にとってAHRシグナル伝達が重要であることが明確に示された。

次に、TDOにより生成されたKynが、ヒト脳腫瘍組織においてAHRを活性化するかどうかを調べた。確かに、TDO発現は、ヒト神経膠腫組織においてAHRおよびAHR標的遺伝子の発現と相関しており（図5a、b、c）、神経膠腫細胞における構成的TDO発現がAHRを活性化するのに十分なレベルのKynを生成することが示された。TDO-Kyn-AHRシグナル伝達経路が、神経膠腫以外の癌においても活性化されるかどうかを検討するために、さまざまなヒト腫瘍の実体に関するマイクロアレイデータを分析した。興味深いことに、TDO発現は、AHR標的遺伝子CYP1B1の発現と、神経膠腫において相関していた（図5c）のみならず、B細胞リンパ腫、ユーイング肉腫、膀胱癌、顎癌、結腸直腸癌、肺癌、および卵巣癌においても相関していた（図5d）。この知見は、TDO-Kyn-AHR経路が脳腫瘍に限定されず、癌に共通する特性であると思われることを示す。Rembrandtデータベースの分析から、TDO、AHR、またはAHR標的遺伝子CYP1B1を高発現する神経膠腫患者（WHOグレードII-IV）の全生存は、これらの遺伝子を中程度に発現する、または低発現する患者と比べて減少することが明らかになった（図5e）。最後に、膠芽細胞腫（WHOグレードIV）患者において、AHR標的CYP1B1、IL1B、IL6、およびIL8の発現は、神経膠腫細胞ではTDOにより生成されたKynによって制御されるものである（図3h）が、WHOグレードとは無関係に生存を予想することが判明し（図5f）、したがって、神経膠腫の悪性表現型にとってAHR活性化が重要であることがさらに明確に示された。まとめると、これらのデータは、内因性の腫瘍に由来するKynが、オートクリン/パラクリンの様式でAHRを活性化して、腫瘍の進行を促進することを示唆する（図5g）。
本発明の実施形態として例えば以下を挙げることができる。
［実施形態１］
天然AHRリガンド依存性癌を治療および/または予防するための方法であって、前記癌に罹患した被験体に、治療上有効な量のAHR阻害剤を投与することを含む、前記方法。
［実施形態２］
前記癌が、脳腫瘍、好ましくは神経膠腫、黒色腫、結腸直腸腺癌、結腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、乳癌、肝細胞癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、膵臓腺癌、中皮腫、および小細胞肺癌（SCLC）からなる一群から選択される、実施形態１に記載の方法。
［実施形態３］
前記AHR阻害剤が小分子化合物である、実施形態１に記載の方法。
［実施形態４］
前記小分子化合物が、植物性化合物またはその誘導体である、実施形態３に記載の方法。
［実施形態５］
前記植物性化合物またはその誘導体が、フラボンまたはその誘導体である、実施形態４に記載の方法。
［実施形態６］
前記フラボンまたはその誘導体が、3,4-ジメトキシフラボン、3´-メトキシ-4´-ニトロフラボン、4´,5,7-トリヒドロキシフラボン（アピゲニン）、または1-メチル-N-[2-メチル-4-[2-(2-メチルフェニル)ジアゼニル]フェニル-1H-ピラゾール-5-カルボキサミドである、実施形態４に記載の方法。
［実施形態７］
前記植物性化合物またはその誘導体が、レスベラトロールもしくはその誘導体、エピガロカテキン、または没食子酸エピガロカテキンである、実施形態４に記載の方法。
［実施形態８］
前記小分子化合物が、下記の一般式（I）で特徴付けられる化合物、

[式中、
(i) R ¹ およびR ² は互いに独立に、水素、またはC ₁ - C ₁₂ アルキルである、
(ii) R ³ 〜R ¹¹ は、互いに独立に、水素、C ₁ - C ₁₂ アルキル、ヒドロキシル、またはC ₁ - C ₁₂ アルコキシである、ならびに
(iii) 破線は二重結合または2つの水素のいずれかを表す]
である、実施形態３に記載の方法。
［実施形態９］
前記AHR阻害剤が、AHRタンパク質に特異的に結合して阻害する抗体である、実施形態１に記載の方法。
［実施形態１０］
前記AHR阻害剤が、AHRリプレッサータンパク質、または不活性なAHR核トランスロケーター（ARNT）である、実施形態１に記載の方法。
［実施形態１１］
前記AHR阻害剤が核酸阻害剤である、実施形態１に記載の方法。
［実施形態１２］
前記核酸リプレッサーが、AHRをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合し、リボザイム、アンチセンス分子、阻害剤オリゴヌクレオチド、アプタマー、マイクロRNA、および低分子干渉RNA（siRNA）からなる一群から選択される、実施形態１１に記載の方法。
［実施形態１３］
天然AHRリガンド依存性癌の治療および/または予防に使用するためのAHR阻害剤。
［実施形態１４］
前記AHR阻害剤が、実施形態３〜１２のいずれか１つに記載のAHR阻害剤である、実施形態１３に記載のAHR阻害剤。
［実施形態１５］
前記癌が、実施形態２に記載の癌である、実施形態１３に記載のAHR阻害剤。

Claims (15)

1. 天然AHRリガンド依存性癌を治療および/または予防するための医薬組成物であって、治療上有効な量のAHR阻害剤を含み、ここで前記天然AHRリガンドがキヌレニンである、前記医薬組成物。
2. 前記癌が、脳腫瘍、好ましくは神経膠腫、黒色腫、結腸直腸腺癌、結腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、乳癌、肝細胞癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、膵臓腺癌、中皮腫、および小細胞肺癌（SCLC）からなる一群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記AHR阻害剤が小分子化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記小分子化合物が、植物性化合物またはその誘導体である、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記植物性化合物またはその誘導体が、フラボンまたはその誘導体である、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記フラボンまたはその誘導体が、3,4-ジメトキシフラボン、3’-メトキシ-4’-ニトロフラボン、4’,5,7-トリヒドロキシフラボン（アピゲニン）、または1-メチル-N-[2-メチル-4-[2-(2-メチルフェニル)ジアゼニル]フェニル-1H-ピラゾール-5-カルボキサミドである、請求項４に記載の医薬組成物。
7. 前記植物性化合物またはその誘導体が、レスベラトロールもしくはその誘導体、エピガロカテキン、または没食子酸エピガロカテキンである、請求項４に記載の医薬組成物。
8. 前記小分子化合物が、下記の一般式（I）で特徴付けられる化合物、
   

   

   [式中、
   (i) R¹ およびR² は互いに独立に、水素、またはC₁ - C₁₂アルキルである、
   (ii) R³ 〜R¹¹ は、互いに独立に、水素、C₁ - C₁₂ アルキル、ヒドロキシル、またはC₁ - C₁₂ アルコキシである、ならびに
   (iii) 破線は二重結合または2つの水素のいずれかを表す]
   である、請求項３に記載の医薬組成物。
9. 前記AHR阻害剤が、AHRタンパク質に特異的に結合して阻害する抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
10. 前記AHR阻害剤が、AHRリプレッサータンパク質、または不活性なAHR核トランスロケーター（ARNT）である、請求項１に記載の医薬組成物。
11. 前記AHR阻害剤が核酸阻害剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
12. 前記核酸阻害剤が、AHRをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合し、リボザイム、アンチセンス分子、阻害剤オリゴヌクレオチド、アプタマー、マイクロRNA、および低分子干渉RNA（siRNA）からなる一群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 天然AHRリガンド依存性癌の治療および/または予防のための医薬の製造におけるAHR阻害剤の使用であって、ここで前記天然AHRリガンドがキヌレニンである、前記使用。
14. 前記AHR阻害剤が、請求項３〜１２のいずれか１つに記載のAHR阻害剤である、請求項１３に記載の使用。
15. 前記癌が、脳腫瘍、好ましくは神経膠腫、黒色腫、結腸直腸腺癌、結腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、乳癌、肝細胞癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、膵臓腺癌、中皮腫、および小細胞肺癌（SCLC）からなる一群から選択される癌である、請求項１３に記載の使用。

Images