ES2626015T3

ES2626015T3 - Medios y procedimientos para tratar y/o prevenir cáncer dependiente de ligando natural de AHR

Info

Publication number: ES2626015T3
Application number: ES12758452.2T
Authority: ES
Inventors: Michael Platten; Christiane OPITZ; Wolfgang Wick; Ulrike LITZENBURGER
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2011-09-07
Filing date: 2012-09-07
Publication date: 2017-07-21
Anticipated expiration: 2032-09-07
Also published as: JP2014526450A; RU2640913C2; RU2014104696A; AU2012306285A1; ZA201401011B; MX348941B; CA2846275C; IL231107A0; CA2846275A1; AU2012306285B2; IL231107A; EP2753315B1; US20140294860A1; MX2014002776A; BR112014004937A2; HK1201471A1; KR20140074330A; JP6047160B2; CN104023713A; EP2753315A1

Abstract

Inhibidor de AHR para uso en el tratamiento y/o la prevención de un cáncer dependiente de ligando natural de AHR, en el que dicho ligando natural de AHR es quinurenina.

Description

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de la invención, usando el programa GAP en toda la región de secuencia con los siguientes ajustes: peso de hueco: 50, peso de longitud: 3, coincidencia media: 10,000 y no coincidencia media: 0,000, que, a menos que se especifique otra cosa, se usarán siempre como ajustes estándares para alineamientos de secuencia. Se entenderá que las variantes anteriormente mencionadas seguirán exhibiendo esencialmente las mismas actividades biológicas especificadas para AHR anteriormente.

Un compuesto que inhibe directamente la actividad de AHR es, preferiblemente, un compuesto que es capaz de interaccionar físicamente con el polipéptido AHR y, así, inhibir su actividad. Tal inhibición puede aparecer si el compuesto se une a un dominio de interacción de AHR o a su dominio de unión a ligando e inhibe así la función biológica del AHR como se especifica en otro lugar de la presente memoria. Preferiblemente, el inhibidor bloquea el dominio de unión a ligando de quinurenina, concretamente interacciona con el dominio de unión a ligando del dominio PAS-B o el dominio de unión a ligando formado por Tyr310, Phe324, His326 y Arg352 (posiciones aminoacídicas correspondientes a AHR humano). Como alternativa, el compuesto puede desencadenar un efecto alostérico sobre el polipéptido AHR, dando como resultado la inhibición de la función biológica también. Puede desencadenarse una inhibición indirecta por un compuesto que reduce o previene la transcripción y/o traducción de polipéptidos AHR y, por tanto, la cantidad de polipéptidos AHR disponibles en una célula. El inhibidor de AHR reducirá al menos la actividad de AHR en una medida estadísticamente significativa. Por supuesto, preferiblemente el inhibidor reducirá la actividad de AHR por debajo de los límites detectables. La inhibición cualitativa y/o cuantitativa de la actividad de AHR puede medirse mediante ensayos bien conocidos en la materia y, preferiblemente, por aquellos descritos en los ejemplos acompañantes a continuación. La actividad de AHR puede detectarse determinando la inducción de la expresión génica de su gen diana endógeno CYP1A1 mediante un ensayo de etoxirresorufina-O-desetilasa (EROD).

Como alternativa, puede detectarse la actividad de AHR usando un ensayo de gen informador en el que la expresión del gen informador está controlada por un promotor dependiente del elemento de respuesta a dioxinas (DRE). Se describen ensayos preferidos particulares para determinar la actividad de AHR en los Ejemplos acompañantes con detalle.

Preferiblemente, un inhibidor de AHR es un compuesto de molécula pequeña.

Un “compuesto de molécula pequeña” en el sentido de la invención es una molécula orgánica que tiene un peso molecular de menos de 10 kDa, menos de 5 kDa, menos de 2 kDa, menos de 1 kDa o menos de 500 Da. Preferiblemente, la molécula pequeña no es un polímero. Preferiblemente, una molécula pequeña como se hace referencia de acuerdo con la presente invención es permeable por células y puede difundir en el citoplasma para unirse al polipéptido AHR. Las moléculas pequeñas como se hace referencia en la presente memoria pueden sintetizarse artificialmente y pueden estar comprendidas en colecciones químicas para cribar los inhibidores potenciales de AHR. Como alternativa, las moléculas pequeñas pueden obtenerse a partir de fuentes naturales tales como tejidos, células u organismos enteros mediante extracción. Son fuentes adecuadas, en particular, plantas, tejido vegetal o microorganismos. Sin embargo, pueden preverse también otras fuentes de inhibidores de molécula pequeña de AHR. Por ejemplo, el 7-cetocolesterol es aparentemente un inhibidor competitivo de AHR en seres humanos (Savouret 2001, J. Biol. Chem. 276 (5): 3054-9).

En una realización preferida, dicho compuesto de molécula pequeña es un compuesto vegetal.

Un “compuesto vegetal” como se usa en la presente memoria es una molécula pequeña obtenible mediante extracción de una planta, tejido vegetal o célula vegetal. Habitualmente, los compuestos vegetales de molécula pequeña son metabolitos tales como metabolitos vegetales primarios o, con particular preferencia, secundarios. En una realización más preferida, dicho compuesto vegetal o derivado del mismo es una flavona. Lo más preferiblemente, el compuesto de molécula pequeña es 3,4-dimetoxiflavona, 3’-metoxi-4’-nitroflavona, 4’,5,7trihidroxiflavona (apigenina) o 1-metil-N-[2-metil-4-[2-(2-metilfenil)diacenil]fenil-1H-pirazol-5-carboxamida. En otra realización más preferida, dicho compuesto vegetal o derivado del mismo es resveratrol (trans-3,5,4’trihidroxiestilbeno), epigalocatequina o galato de epigalocatequina.

En otra realización preferida, dicho compuesto de molécula pequeña es un compuesto caracterizado por la siguiente fórmula general (I):

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en la que

(i): R1 y R2 son independientemente entre sí hidrógeno o un alquilo C1 a C12,

(ii): R3 a R11 son independientemente entre sí hidrógeno, un alquilo C1 a C12, hidroxilo o un alcoxi C1 a C12, y

(iii) la línea discontinua representa un doble enlace o dos hidrógenos. En particular, es más preferido un compuesto que tiene cualquiera de las siguientes fórmulas (II) a (V):

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Como se discute anteriormente, pueden diseñarse versiones inactivas del polipéptido ARNT por el especialista en la materia sin más basándose en las secuencias polinucleotídicas o aminoacídicas específicas anteriormente mencionadas o las variantes de las mismas. Además, estos polipéptidos de ARNT inactivos o polinucleótidos que los codifican pueden introducirse en las células cancerosas que se van a tratar por procedimientos bien conocidos en la materia. En particular, se prevé la transferencia génica a través de sistemas de expresión víricos de acuerdo con la presente invención como sistema de suministro para polinucleótidos que codifican ARNT inactivo. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en la materia (véase más arriba).

El término “translocador nuclear de AHR (ARNT)” como se usa en la presente memoria hace referencia a una proteína de unión del factor de transcripción AHR. Se encuentran los detalles ya en otro lugar de esta memoria descriptiva. El polipéptido ARNT al que se hace referencia en la presente memoria como inhibidor de AHR es un polipéptido que sigue siendo capaz de interaccionar con AHR, pero que previene la translocación nuclear o que dirige al complejo de AHR/ARNT a la maquinaria de degradación proteica de la célula. Es bien conocido por el especialista en la materia cómo pueden diseñarse dichos polipéptidos ARNT inhibidores modificados. Preferiblemente, se muestra un polinucleótido que codifica el polipéptido ARNT (no modificado) como se hace referencia en la presente memoria en el número de acceso a Genbank: NM_001197325.1 (GI: 309747070). Preferiblemente, dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica como se muestra en el número de acceso a Genbank: (proteína) NP_001184254.1 (GI: 309747071). Además, un polipéptido de ARNT de acuerdo con la presente invención puede ser una variante de los polinucleótidos o polipéptidos de ARNT específicos anteriormente mencionados. Las variantes de los polinucleótidos anteriormente mencionados comprenden una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones nucleotídicas y, preferiblemente, dan como resultado un aminoácido codificado que tiene una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones aminoacídicas, concretamente una variante polipeptídica según la invención. Un polinucleótido variante comprenderá, preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a las secuencias de ácido nucleico específicas a las que se hace referencia anteriormente. Además, un polinucleótido variante puede tener, preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia aminoacídica que es al menos un 40 % al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a las secuencias aminoacídicas a las que se hace referencia anteriormente. Se describe con detalle cómo puede calcularse la identidad de secuencia entre dos secuencias dadas en otro lugar de la presente memoria.

Los polipéptidos AHRR o polinucleótidos que los codifican pueden introducirse en células cancerosas que se van a tratar mediante procedimientos bien conocidos en la materia. En particular, se prevé la transferencia génica a través de sistemas de expresión víricos de acuerdo con la presente invención como sistema de suministro para polinucleótidos que codifican ARNT inactivo. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en la materia y se describen, p.ej., en Gardlík 2005, Med Sci Monit. 11 (4): RA110-21; Salmons 1993, Hum Gene Ther. 4 (2): 129-41.

En otra realización preferida, dicho inhibidor de AHR es un inhibidor de ácido nucleico.

Un “inhibidor de ácido nucleico” como se hace referencia en la presente memoria es una molécula de ácido nucleico tal como un aptámero que inhibe la actividad del polipéptido AHR al unirse al polipéptido de manera similar a la descrita para los anticuerpos anteriores o a una molécula de ácido nucleico que, debido a que es complementaria del polinucleótido que codifica el polipéptido AHR, se une a dicho polinucleótido e inhibe la transcripción o traducción del mismo. Por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor puede actuar como oligonucleótido formador de tripe hélice al interferir con la transcripción apropiada del gen de AHR. Además, un ácido nucleico inhibidor puede ser una ribozima que se une específicamente a y degrada los transcritos de AHR. Como alternativa, puede ser un ARN no codificante, ARNip o microARN capaz de unirse al transcrito y degradarlo o al menos inhibir una traducción eficaz del mismo. El último tipo de ácidos nucleicos inhibidores se caracteriza porque comprenden habitualmente una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de una secuencia en los transcritos de AHR. Tal secuencia complementaria será de suficiente longitud y comprenderá un número suficiente de nucleótidos coincidentes para permitir la hibridación específica con el transcrito en la célula. Tales inhibidores de ácido nucleico pueden expresarse en una célula cancerosa tras suministro por un sistema de transferencia génica como se hace referencia en otro lugar de la presente memoria. Los ácidos nucleicos inhibidores pueden expresarse, preferiblemente, bajo una secuencia de control de la expresión. Por tanto, la mediación de la iARN para inhibir la expresión del gen diana puede modularse por una secuencia de control de la expresión que puede regularse por un estímulo exógeno, tal como el operador tet, cuya actividad puede regularse por tetraciclina, o promotores termoinducibles o bajo el control de un promotor específico de tejido o específico de tejido. Sin embargo, los inhibidores de ácido nucleico pueden suministrarse también por sistemas de suministro basados en liposomas.

Por tanto, en otra realización más preferida, dicho inhibidor de ácido nucleico se selecciona del grupo consistente en: una ribozima, una molécula no codificante, un oligonucleótido inhibidor, un aptámero, un microARN y un ARNip.

Una “ribozima” de acuerdo con la presente invención es una molécula de ARN que comprende una secuencia complementaria del transcrito de AHR. Además, la ribozima comprende una secuencia de ácido nucleico que es capaz de desencadenar la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster en el transcrito de AHR. Las ribozimas como se hace

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Ensayo de liberación de cromo

Se valoró la inhibición de la citotoxicidad celular inmunitaria usando el ensayo de liberación de cromo 51 estandarizado (Procedimientos suplementarios). Se calculó la lisis específica en porcentaje como sigue: [liberación de 51Cr experimental -liberación mínima] / [liberación máxima -liberación mínima] x 100. Se efectuó este experimento con al menos 4 donantes de PBMC diferentes.

Ensayo de la técnica de puntos por inmunoadsorción ligada a enzima (ELISpot)

Se aislaron células dendríticas (DC) de la médula ósea de ratones C57BL/6N sanos y se cultivaron en RPMI 1640 que contenía GM-CSF 20 ng/ml (Immunotools) durante 5 días. Se retiraron los bazos de ratones portadores de tumor y se trituraron a través de un tamiz celular de 40 μm. Se lisaron los eritrocitos y se aislaron los linfocitos T por MACS usando el kit de aislamiento de linfocitos T en cubeta II (Miltenyi GmbH). Se sembraron 2 x 105 DC en una placa de ELISpot (Millipore) que se había recubierto con anticuerpo anti-IFNγ (Mabtech AB, Nacka Strand, Suecia) y se sometieron a pulsos de 10 μg de lisado de GL261, generado en PBS mediante ciclos de liofilización repetidos, durante 4 h antes de la adición de 1 x 105 linfocitos T. Después de 36 h, se detectaron linfocitos T productores de IFNγ con anticuerpo anti-IFNγ biotinilado, estreptavidina-ALP y BCIP/NBTPLUS (Mabtech) y se cuantificaron usando un analizador ImmunoSpot (Cellular Technology Limited, Shaker Heights, OH, EE.UU.).

Detección de la translocación de AHR

Para la detección de la translocación de AHR, se expusieron 7000 células Tao BpRc1c con AHR marcado con GFP por pocillo a Kyn 50 μM o Trp 50 μM, se fijaron con formaldehído al 3,7 % en PBS, se permeabilizaron con Triton X100 al 0,1 %, se incubaron con Hoechst 33342 1 μg/ml (Invitrogen) y se formaron imágenes en un BD Pathway™ Imager 855 en modo no confocal usando un objetivo de 20x U-Apo 340 (Olympus, NA 0,75). Se efectuó un análisis adicional de la intensidad de fluorescencia usando el software Attovision (BD Biosciences). Además, se comparó el contenido de proteína AHR en las fracciones nuclear y citoplasmática de células de glioma N-229 por inmunotransferencia.

Ensayo de unión a radioligando con Kyn marcada con 3H

Se obtuvo L-3H-Kyn con una actividad específica de 11 Ci/mmol en Quotient Bioresearch (Radiochemicals) Ltd. (Cardiff, RU). Se efectuaron ensayos de unión con L-3H-Kyn usando citosol de hígado de ratón de ratones competentes de Ahr y deficientes en Ahr. Se definió la unión específica como la diferencia de radiactividad entre el citosol competente de Ahr y deficiente en Ahr.

Experimentos animales

Todos los procedimientos animales seguían las directrices de investigación animal en laboratorios institucionales y se aprobaron por las autoridades gubernamentales. Se inyectaron las células de glioma humano s.c. o se implantaron estereotácticamente en el estriado derecho de 6 ratones atímicos de 6-12 semanas de edad (CD1nu/nu) y se monitorizaron. Se efectuó el agotamiento de linfocitos NK mediante inyección i.p. bisemanal de anticuerpo de conejo anti-asialo-GM1 (Wako Chemicals, Düsseldorf, Alemania) empezado 2 días antes de la inyección de células tumorales. Se inyectaron los controles con IgG de conejo (Calbiochem, Darmstadt, Alemania). Para la inducción de la desactivación génica de AHR, se administró in vivo doxiciclina a los ratones a una concentración de 2 mg/ml en agua de bebida que contiene sacarosa. Se inyectaron células de glioma de murino s.c. en el flanco derecho de ratones C57BL6/N de tipo silvestre de 6-12 semanas de edad o ratones AHR-/-C57/B16.

Imagenología de resonancia magnética (IRM)

Se efectuaron los barridos de IRM mostrados en la Fig. 3g usando una bobina para animales pequeños de transmisión/recepción desarrollada por el cliente en un escáner de IRM 1.5 T de cuerpo entero convencional (Symphony, Siemens, Erlangen, Alemania).

Micromatriz

Se trataron células de glioma U87 con Kyn 100 μM durante 8 h o 24 h, después de lo cual se recolectaron las células y se aisló el ARN usando el kit RNAeasy (Qiagen). Se sometió el ARN a análisis de micromatriz como se detalla en los Procedimientos suplementarios. Para cada uno de los cuatro tratamientos (8 h, 24 h, tratado con Kyn, no tratado), se hibridaron dos matrices y se calcularon las relaciones de log2 medias de la expresión génica en muestras tratadas con Kyn frente a no tratadas. Se detallan análisis adicionales de los datos en los Procedimientos suplementarios. Para las muestras clínicas, se adquirieron los datos de micromatrices y clínicos del REpository for Molecular BRAin Neoplasia DaTa (REMBRANDT) (Procedimientos suplementarios). El análisis de supervivencia en el conjunto de datos de glioblastoma primario no tratado (n= 362) de la red The Cancer Genome Atlas (TCGA) se efectuó usando el módulo de análisis de Kaplan-Meier del análisis de micromatrices y plataforma de visualización R2 (http://r2.amc.nl).

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Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± EEM. Se efectuó el análisis de la significación usando la prueba de t de Student (SigmaPlot). Los valores de P < 0,05 se consideraron significativos. Se analizó la correlación de Ki67 y TDO por correlación de rangos de Spearman (SPSS, IBM, Somers, NY, EE.UU.). Se analizaron las correlaciones entre TDO y AHR (Fig. 6c) así como entre TDO y CYP1B1 (Fig. 6d) mediante correlación de rangos de Spearman (Sigmaplot). Se analizó la intensidad de fluorescencia nuclear usando ANOVA de un factor en rangos (p=<0,001) seguido del procedimiento de Dunn (p<0,05).

Ejemplo 2: Efectos autocrinos y paracrinos de Kyn generada por TDO

De acuerdo con los estudios subyacentes de la presente invención, un cribado de líneas celulares cancerosas humanas reveló la degradación constitutiva de Trp y la liberación de altas cantidades micromolares de Kyn en células tumorales cerebrales, a saber líneas celulares de glioma y células iniciadoras de glioma (GIC), pero no astrocitos humanos (Fig. 1a). Sorprendentemente, IDO1 e IDO2 no daban cuenta del catabolismo constitutivo de Trp en tumores cerebrales. En lugar de ello, la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO), que se expresa predominantemente en el hígado y se cree que regula las concentraciones de Trp sistémico, se expresaba fuertemente en células de glioma humano y se correlacionaba con la liberación de Kyn (Fig. 1b). La inhibición farmacológica o desactivación génica de TDO bloqueaba la liberación de Kyn por células de glioma, mientras que la desactivación génica de IDO1 e IDO2 no tenía efecto (Fig. 1c,d), confirmando por tanto que la TDO es la enzima degradante de Trp fundamental en células de glioma humano. En especímenes de tumor cerebral humano, los niveles de proteína TDO aumentaban con la malignidad y se correlacionaban con el índice de proliferación (Fig. 1e-g). Como se describe anteriormente (Miller 2004, Neurobiol Dis 15(3), 618, el cerebro humano sano mostraba solo una débil tinción de TDO en las neuronas (Fig. 1e). La expresión de TDO no estaba confinada a los gliomas, sino que se detectaba también en otros tipos de cánceres a los que se hace referencia en otro lugar de la presente memoria, incluyendo carcinoma hepatocelular, carcinoma de colon, cáncer de mama, NSCLC, carcinoma ovárico, melanoma maligno (metástasis cerebrales) y carcinoma de células renales.

Se midieron concentraciones reducidas de Trp en los sueros de pacientes de glioma (Fig. 1h). Estas pueden no haberse traducido en niveles aumentados de Kyn (Fig. 1h), porque la Kyn se capta por otras células y se metaboliza hasta ácido quinolínico. Es más, se detectó la acumulación de ácido quinolínico en tejido de glioblastoma que expresa TDO (Fig. 1i). La Kyn suprime la proliferación de linfocitos T alogénicos9. La proliferación de linfocitos T alogénicos se correlacionaba inversamente con la formación de Kyn por TDO derivada de glioma (Fig. 2a). La desactivación génica de TDO en células de glioma (Fig. 4c suplementaria, d; nota suplementaria 9) restauraba la proliferación de linfocitos T alogénicos, mientras que la adición de Kyn a las células con desactivación génica de TDO prevenía la restauración de la proliferación de linfocitos T (Fig. 2b). La concentración de Kyn inhibía dependientemente la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ estimulados por receptor de linfocitos T (Fig. suplementaria 4e). Además, la desactivación génica de TDO daba como resultado la lisis potenciada de células de glioma por PBMC alorreactivas (Fig. 4f suplementaria). Finalmente, se observó infiltración reducida con células positivas de antígeno común de leucocitos (LCA) e inmunitarias CD8+ en secciones de glioma humano con alta expresión de TDO en comparación con aquellas con baja expresión de TDO (Fig. 2c), indicando que la formación de Kyn por TDO puede suprimir las respuestas inmunitarias antitumorales. Los experimentos in vivo en ratones inmunocompetentes demostraron que los tumores que expresan TDO crecían más rápido y exhibían un mayor índice de proliferación que los tumores de control deficientes de TDO (Fig. 2d). La actividad de TDO en tumores suprimía las respuestas inmunitarias antitumorales in vivo, como se evidencia por la liberación reducida de interferón-γ (IFN-γ) por linfocitos T específicos de tumor y la lisis de células tumorales por células de bazo de ratones portadores de tumores que expresan TDO en comparación con ratones portadores de tumores deficientes en TDO (Fig. 2e,f).

A continuación, se valoraron los efectos autocrinos de Kyn sobre células de glioma. Aunque no se detectaron diferencias en la progresión del ciclo celular entre los controles y las células de glioma con desactivación génica de TDO, la desactivación génica de TDO reducía la motilidad y supervivencia clonogénica (Fig. 2g,h). Esta estaba mediada por Kyn, ya que la adición exógena de Kyn restauraba la motilidad y supervivencia clonogénica en ausencia de Trp (Fig. 2i,j), sugiriendo que la Kyn aumenta la motilidad de células de glioma malignas. En GIC, se potenciaba la formación de esferas en respuesta a Kyn. Finalmente, se alteraba la formación tumoral cuando se implantaban ortotópicamente tumores con desactivación génica de TDO en los cerebros de ratones atímicos, que están desprovistos de linfocitos T funcionales (Fig. 2k).

Ejemplo 3: Inhibición mediada por TDO de linfocitos N

Para analizar si la inhibición mediada por TDO de las respuestas de linfocitos NK antitumorales, que son funcionales en ratones atímicos, puede dar cuenta de la formación alterada de tumores con desactivación génica de TDO, se comparó el crecimiento de tumor subcutáneo en presencia o ausencia de linfocitos NK. El agotamiento de linfocitos NK potenciaba en crecimiento tanto de tumores de control como con desactivación génica de TDO pero no restauraba el crecimiento de tumores con desactivación génica de TDO al de los controles (Fig. 2l), sugiriendo que la Kyn generada por la actividad constitutiva de TDO potencia el fenotipo maligno de los gliomas humanos de manera autocrina en ausencia de respuestas de linfocitos T y linfocitos NK antitumorales funcionales.

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