JP6041306B2 - ポリヌクレオチドを用いたコイル及びその製造方法 - Google Patents
ポリヌクレオチドを用いたコイル及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6041306B2 JP6041306B2 JP2013042322A JP2013042322A JP6041306B2 JP 6041306 B2 JP6041306 B2 JP 6041306B2 JP 2013042322 A JP2013042322 A JP 2013042322A JP 2013042322 A JP2013042322 A JP 2013042322A JP 6041306 B2 JP6041306 B2 JP 6041306B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- scaffold
- coil
- coil structure
- dna
- staple
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 23
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000255925 Diptera Species 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 22
- 238000013461 design Methods 0.000 description 17
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 9
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 9
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012576 optical tweezer Methods 0.000 description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000005653 Brownian motion process Effects 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 235000013290 Sagittaria latifolia Nutrition 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005537 brownian motion Methods 0.000 description 1
- 235000015246 common arrowhead Nutrition 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005674 electromagnetic induction Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Images
Description
本発明は、ポリヌクレオチド、特に核酸を用いた結合手段によって複数の微小部品を組み立てる装置および方法に関し、特に、ナノスケール構造を有するコイル構造及びその製造方法に関する。
サブミクロンからミクロンサイズの構造物を作成する技術としては、集束イオンビームやフォトリソグラフィー技術を用いた手法があるが、この手法ではレーザー光の集束限界である２００ｎｍ前後によって、構造物の空間分解能が決定される。
近年、DNAorigami技術を利用して微細な構造を作成することが提案されている（非特許文献１）。DNAorigamiは、ＤＮＡ分子を自己集合させることによって二次元的もしくは三次元的なナノサイズの形状をデザイン、作成する技術である（非特許文献２）。
また、特許文献１では、複数の部品が組み立てられた状態を表す設計図から求められた、部品及び２種類の一本鎖塩基配列よりなる結合手段を供給する順序に関する情報に基づいて、一本鎖塩基配列で修飾され、且つ前記部品を結合させる対象物に、一本鎖塩基配列で修飾された前記部品及び結合手段を、順次供給し（ステップＳ２〜Ｓ４）、前記対象物を修飾する一本鎖塩基配列と、前記部品を修飾する一本鎖塩基配列とに、前記結合手段をそれぞれハイブリダイズすることにより、前記対象物と前記部品とを結合させることが開示されている。
Ｐａｕｌ Ｗ．Ｋ．Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ他、"Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns" 2006 NATURE Publishing Group Vol 440/16 March 2006/doi:10.1038/nature 04586, p.297-302.
Ｈｅｎｄｒｉｋ Ｄｉｅｔｚ他、"Folding DNA into Twisted and Curved Nanoscale Shapes" www.sciencemag.org SCIENCE VOL 325 7 AUGUST 2009, p.725-730.
しかしながら、上記の技術は、三次元構造物において、硬い物性を持った形状の製造方法は開示されているものの、柔らかい物性を持ったナノ構造物の作成を目的としたものではない。従って、ナノサイズの機能的なコイルとしては働かせることはできなかった。
図１は、DNAorigamiの基本コンセプトを示す図である。本発明はベースとして、DNAorigami技術を用いているが、ＤＮＡ分子はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの塩基配列から構成された二重らせん構造（２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ））をしており、約１０．５塩基ごとに１周する（図１（ａ））。この周期性を利用して２本鎖ＤＮＡ同士を２０−５０ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドで連結しバンドル化していくのがDNAorigamiの基本である。この自然な周期に合わせて連結すれば、２次元的なシート構造（図１（ｂ））や、そのシート構造を積み重ねて３次元構造に拡張することもできる（図１（ｃ）、図１（ｄ））。
DNAorigamiは、ＤＮＡ分子を自己集合させることによって二次元的もしくは三次元的なナノサイズの形状をデザイン、作成する技術である。
ただし、図１に示すものは、平面構造とその層構造を基本としているので、３次元に拡張した場合、立方体や直方体の構造物に限定される。また、この場合、密にバンドル化されることになり、硬い構造物となるため、柔らかい構造物を得ることができない。
また、非特許文献２では、図２Ａ〜Ｃのように、一本鎖のＤＮＡにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする２重らせん構造であって２１塩基で２周するらせん構造をベースにし、２１／３＝７塩基より増やしたり、減らしたりすることで、構造歪みを形成することができることを示している。
しかしながら、非特許文献２の技術は、堅い構造に構造歪みを形成してねじれ構造等を作成することはできるが、あくまで、リジッドな構造であり、コイルのような柔らかい物性を持った柔軟な構造を作成することはできない。
本発明は、柔らかい物性を持ったナノ構造物の作成を目的とする。
例えば、ＤＮＡをベースにしたナノサイズのコイルを提供することを目的とする。
例えば、ＤＮＡをベースにしたナノサイズのコイルを提供することを目的とする。
本発明では、曲率を持った柔らかい３次元コイル構造を実現するために、核酸分子の周期性から意図的にずらした連結を行うことで、構造内に歪みを発生させ曲率を作り出した。加えて、コイル形状に全体的に周期的な３次元構造を持たせるために、内部の歪を均一に保つよう工夫を行った。
このデザインによって、コイル構造が実現でき、電子顕微鏡のネガティブ染色観察による確認と、光ピンセット法を用いたバネ定数の実測によって、ピコニュートンオーダーの微小な力を定量出来るコイルとして働くことが確認できた。
コイル形状の周期と直径はある程度チューニングが可能であり、超微細回路の鋳型のチューニングやバネ定数のチューニングができることを意味する。
バネとしての物性を持たせるためにコイル状の形状を作成しているが、そのためには、ＤＮＡ分子内で均一な構造歪みをデザインし、ある曲率を持って曲げる必要がある。この均一な構造歪みのデザインと周期性を持ったコイル形状の実現が従来のデザインとは異なる。
本発明の一観点によれば、２本鎖ポリヌクレオチドが形成する二重らせん構造の周期性を利用して、１本鎖ポリヌクレオチドからなるスカフォールドを、前記１本鎖ポリヌクレオチドと部分的に相補的なオリゴヌクレオチドからなるステイプルにより連結しバンドル化されてなる、曲率を持った柔らかい３次元コイル構造であって、前記連結の位置を、前記周期性からずらした位置としていることを特徴とする３次元コイル構造が提供される。
構造内に歪みを発生させて曲率を作り出し、コイル形状として、全体的に周期的な３次元構造を持たせるために、内部の歪を均一に保つような構造とした。自然な周期に合わせて連結すれば、２次元的なシート構造や、そのシート構造を積み重ねて３次元構造に拡張することもできる。
前記連結の位置には、前記スカフォールドに塩基の欠失又は塩基の挿入の少なくともいずれか一方がなされていることを特徴とする。
これにより、歪みを形成し、柔らかい構造を作成することができる。
これにより、歪みを形成し、柔らかい構造を作成することができる。
前記スカフォールドを２本束ねた場合に、以下の条件とすることを特徴とする。
１）スカフォールドに、７又は１４塩基毎に塩基の挿入がある。
２）１）の塩基の挿入数がそれぞれ３以上である。
３）前記ステイプルが、３７塩基から４３塩基である。
１）スカフォールドに、７又は１４塩基毎に塩基の挿入がある。
２）１）の塩基の挿入数がそれぞれ３以上である。
３）前記ステイプルが、３７塩基から４３塩基である。
ステイプルを、３７塩基から４３塩基までにして、２本鎖ポリヌクレオチドが形成される程度に隙間を空ける。
スカフォールドを４本束ねた場合に、以下の条件とすることを特徴とする。
１）構造的に弱い曲がる部位（スカフォールドクロスオーバ）をコイル構造の途中に配置せずに、端に配置する。
２）ステイプルクロスオーバとステイプルの端が、スカフォールド間でアライメントする。
３）スカフォールドに１６塩基以上ごとに塩基の挿入又は欠失がある。
４）３）の塩基の挿入数又は欠失数が、それぞれ２以上である。
１）構造的に弱い曲がる部位（スカフォールドクロスオーバ）をコイル構造の途中に配置せずに、端に配置する。
２）ステイプルクロスオーバとステイプルの端が、スカフォールド間でアライメントする。
３）スカフォールドに１６塩基以上ごとに塩基の挿入又は欠失がある。
４）３）の塩基の挿入数又は欠失数が、それぞれ２以上である。
本発明の他の観点によれば、２本鎖ポリヌクレオチドの周期性を利用して、１本鎖ポリヌクレオチドからなるスカフォールド（足場）を、オリゴヌクレオチドからなるステイプルにより連結しバンドル化されてなる、曲率を持った柔らかい３次元コイル構造を作成する製造方法であって、前記連結の位置を、前記２本鎖ポリヌクレオチドの周期性からずらした位置とし、前記連結の位置に、前記スカフォールドに塩基の欠失又は塩基の挿入の少なくともいずれか一方を配置することを特徴とする３次元コイル構造の製造方法が提供される。
本発明によれば、柔らかい物性を持ったナノ構造物を実現することができる。例えば、ＤＮＡをベースにしたナノサイズのコイルを提供することができる。
本手法では、ボトムアップ的に直径２ｎｍのＤＮＡ分子を自己集合させているため、空間分解能は１−２ｎｍであり百倍近い微細化を実現している。
柔らかい物性を持ったナノ構造物が作成された例は初めてである。コイルとしての物性を持たせるためにコイル状の形状を作成しているが、そのためには、ＤＮＡ分子内で均一な構造歪みをデザインし、ある曲率を持って曲げる必要がある。この均一な構造歪みのデザインと周期性を持ったコイル形状の実現が従来のデザインとは異なる。
本明細書において、コイル（coil）とは、針金など「ひも状」のものを、螺旋状や渦巻状に巻いたもののことであり、例えば、以下のようなものにその性質が利用され、それらを指して呼ばれることもある。
１）電気電子分野
電磁誘導
インダクタ
電磁石・ソレノイド - 電動機の主要要素など
変動磁場から電気エネルギーを取り出す - 発電機や誘導コイル、磁気センサ（の実現方法のひとつ）など
変圧器
ループアンテナ
その他
電熱器や電灯などのフィラメントなどで効率よく発熱を利用するため
抵抗器（巻線抵抗）
２）機械分野等
ばね - コイルばね
電磁誘導
インダクタ
電磁石・ソレノイド - 電動機の主要要素など
変動磁場から電気エネルギーを取り出す - 発電機や誘導コイル、磁気センサ（の実現方法のひとつ）など
変圧器
ループアンテナ
その他
電熱器や電灯などのフィラメントなどで効率よく発熱を利用するため
抵抗器（巻線抵抗）
２）機械分野等
ばね - コイルばね
図３に示すように、堅い構造と柔軟な構造とは、力と変位ｘとの関係により区別できる。図３（ａ）に示す構造は２本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）構造であり、相転移が生じるようなバネ定数ｋを有する。図３（ｃ）に示す構造は、ＤＮＡｏｒｉｇａｍｉロッドのような硬い構造であり、バネ定数ｋが測定できない。
ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドには、核酸が包含され、核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが包含される。オリゴヌクレオチドの塩基長は、通常１０〜１００ｎｔ、好ましくは１０〜６０ｎｔである。
一方、図３（ｂ）に示すコイルバネ構造では、力と変位との関係が直線的である。すなわち、バネ定数ｋが一定又は線形的に変位することが特徴である。
本発明によって、曲率を持った柔らかい構造を実現することができることを確かめるため、その一例である３次元コイル構造の作成を検討した。
柔軟な構造を実現するために、ＤＮＡ分子の周期性から意図的にずらした連結を行うことで、３次元構造内に歪みを発生させ曲率を作り出す。加えて、コイル形状として、全体的に周期的な３次元構造を持たせるために、内部の歪を均一に保つような構造とした。
図４Ａ、図４Ｂは、DNAorigamiの基本的な製造方法を示す図である。コイル形状を作成するために、基本的には非特許文献２の方法を用いる。均一な歪みを実現するために、様々な工夫や試行錯誤（挿入、欠失の数や配置など）を行った。
図４Ａ、図４Ｂに示すように、スカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ：足場）となる１本鎖ポリヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）と、ステイプル（ｓｔａｐｌｅ：ホチキスの針のような固定用)となるオリゴヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）とを用いて、例えば、６０℃で１６塩基部のアニールを行い、次いで、３０℃で８塩基部のアニールを行うことで、DNAorigamiの基本的な構造が完成する。
スカフォールドとして利用するＤＮＡは、Ｍ１３ｍｐ１８ファージから精製された長鎖環状ＤＮＡ（７０００ｎｔ程度）を用い、ステイプルとして利用するＤＮＡはＤＮＡ合成メーカーから２０−５０ｎｔのオリゴＤＮＡとして購入する。スカフォールド１種類 (１０ｎＭ)と１００種類程度のステイプル(１００ｎＭ)を混合し、マグネシウムイオン存在下で市販のサーマルサイクラーを用いて、９０℃から２５℃の範囲内で徐々に冷却（アニーリング）を行う。マグネシウムイオン（Ｍｇ＋２）濃度、冷却条件は、DNAorigamiのデザインによって変わるが、本実施の形態によるコイルにおいては、１８−２６ｍＭのマグネシウムイオンにおいて、欠損率の少ないコイルが得られた。冷却条件は、８０℃から６０℃まで２時間かけて冷却し（６分で１℃ずつ下げる）、続けて、６０℃から２５℃まで２時間かけて冷却（３．３分で１℃ずつ下げる）を行った。得られたサンプルは、２％のアガロースゲル電気泳動を行う。サンプルの中には、デザイン通りのDNAorigamiとは別に、二量体化したものや、欠損したorigamiも含まれる。欠損のない均一なDNAorigamiは、コンパクトな形状をとるために電気泳動によって最も泳動距離が長く、バンドもシャープになる。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド溶液で染色、ＵＶにて可視化した後に、目的のバンドを切り出し、精製する。
以下に、バネのデザインに必要なパラメータを様々に変えた時の結果について示す。
まず、本発明の第１の実施の形態として、２ヘリックスバンドルの場合の、バネ形成技術について説明する。
まず、本発明の第１の実施の形態として、２ヘリックスバンドルの場合の、バネ形成技術について説明する。
スカフォールドとは、DNAorigamiの足場配列の役割を果たす長鎖ＤＮＡであり、７０００ｎｔ以上の１本鎖ＤＮＡが採用されることが多い。
ステイプルとは、化学合成された短い１本鎖ＤＮＡ（数１０ｎｔ程度）であり、足場配列をホチキスのように留める役割を果たす。
図５Ａは、スカフォールドＤＮＡを２本束ねた場合に、コイルとなるか否かを条件別に示した図である。
図５Ａ（ａ）は、スカフォールド（足場）の一構造例を示す図でありであり、ファージＤＮＡを精製した１本鎖ＤＮＡである。Ｐ７３０８は、これをベースにＤＮＡの長さを調節した。図５Ｃに、塩基配列の情報を示す。
また、図５Ａ（ｃ）は、例としてタイプ１の場合の、対応するデザイン図を模式的に示した図である。図５Ａ（ｃ）に示すように、Ｌ１がスカフォールドであり、Ｌ２（矢印）がステイプルであり、Ｎinsertionと「わっか」で示したのが塩基の挿入の位置と数である。
図５Ａ（ｂ）からわかるように、基本的には、Ｎinsertionが３以上という条件が、柔軟なコイル構造を形成するために必要な構造歪みの強さである。また、Ｎseparationは、７又は１４であることが条件である。
尚、一番右のタイプ３のデザインで、柔軟なコイル構造が形成できずうまくいかない理由は、ステイプルに７塩基の隙間を作っているために、空いている隙間にはスカフォールドとステイプルの間で２本鎖ＤＮＡが形成されずに、１本鎖ＤＮＡの状態となっていることに起因する。１本鎖ＤＮＡは柔らかいため、せっかく３塩基の挿入を入れて歪ませても、歪みがそこで解消されているためと推測される。実際に、このようなデザインでは、図５Ｂ（ｄ）に示すようなバネとは異なる形状となっており、一方、成功例では、図５Ｂ（ｅ）に示すように、バネの構造を示していることがわかる。
以上に示すように、２本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を２本束ねた場合に、コイルとなるか否かは、以下の通りである。
（条件）
１）Ｎinsertionが３以上である。
２）Ｎseparationは、７又は１４である。
（条件）
１）Ｎinsertionが３以上である。
２）Ｎseparationは、７又は１４である。
次に、本発明の第２の実施の形態として、４ヘリックスバンドルの場合の、バネ形成技術について説明する。
図６Ａから図９までは、２本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）を４本束ねた場合に、コイルとなるか否かを条件別に示した図である。
これらの図について、簡単には、横軸に塩基が割り当てられるようになっており、青い横線Ｌ１１が１本鎖ＤＮＡである。４本の横線が、スカフォールドとなるＤＮＡで、このＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（２０−５０ｍｅｒの１本鎖オリゴＤＮＡでステイプルと呼ばれる。）が１５０種類程度結合することで、２本鎖ＤＮＡが４本でき、さらにその４本がお互いに連結されてバンドル化されている。
黒い横線Ｌ１２および縦線Ｌ１３で示されているのが、ステイプルである。ステイプルの縦線Ｌ１３の線は、ここで２本鎖ＤＮＡが連結されることを示す。ステイプルの線は矢印になっているが、１本鎖ＤＮＡの５’から３’への方向を示している。■（黒塗りの四角）は５’端であり、▲（黒塗りの三角）は３’端である。２，３の数字がわっか形状の中に書かれているが、ここに塩基を２つもしくは３つ挿入することを示す。×印は、逆に、この位置で塩基を欠失させるということを示す。×１つが、塩基１つを欠失することを示す。
図６Ａは、スカフォールドとなるＤＮＡ自体で連結する部分であるスカフォールドクロスオーバをコイル構造の延在方向の途中に配置せずに、端部に配置した構造を示す図である。図６Ａ（ａ）は、この構造の概略形状を示す図であり、図６Ａ（ｂ）は、コイルとして機能する成功例の詳細な構造例を示す図であり、図６Ｃ（ｄ）は、コイルとして機能しない失敗例の詳細な構造例を示す図であり、図６Ｂ（ｃ）は、コイルを形成しているが、延在方向に変位が生じている例を示す図である。図６Ｄは、失敗例の構成を示す図である。
図６Ａ（ｂ）に示すように、スカフォールドクロスオーバをコイル構造の延在方向の端部に配置した構造では成功例が見られる。
図７Ａは、スカフォールドクロスオーバをコイル構造の延在方向の途中に配置した例を示す図（図７Ａ（ａ））であり、図７Ｂ（ｂ）、図７Ｃ（ｃ）に示すように、いずれの構成もコイルとして機能していないことがわかる。
図８Ａは、スカフォールドクロスオーバをコイル構造の延在方向の途中に複数配置した例を示す図（図８Ａ（ａ））であり、図８Ａ（ｂ）、図８Ｂ（ｃ）に示すように、いずれの構成もコイルとして機能していない。
図９は、失敗例の形状例を示す図である。
図９は、失敗例の形状例を示す図である。
以上のことから、４へリックスバンドルの場合の、バネ機能を実現するために、図６から図９までを参照して、以下のような条件が見出された。
・コイル構造を安定して形成させるための必要条件
１）スカフォールドクロスオーバをコイル構造の途中に配置せずに、端に配置する。
２）構造的に弱い曲がる部位（ステイプルクロスオーバ）とステイプルの端を縦方向に一列に配置する。
３）挿入および欠失の数は、２以上にする。
４）４へリックスバンドルでは、挿入または欠失の位置を１６塩基以上離す。
・コイル構造を安定して形成させるための必要条件
１）スカフォールドクロスオーバをコイル構造の途中に配置せずに、端に配置する。
２）構造的に弱い曲がる部位（ステイプルクロスオーバ）とステイプルの端を縦方向に一列に配置する。
３）挿入および欠失の数は、２以上にする。
４）４へリックスバンドルでは、挿入または欠失の位置を１６塩基以上離す。
以下に、それぞれの条件について詳細に説明する。
条件１）については、図１０を参照して説明する。
スカフォールドクロスオーバとは、隣り合ったスカフォールドとなるＤＮＡで連結する部分であり、図１０において、丸で囲んだ部分を指す。
スカフォールドクロスオーバとは、隣り合ったスカフォールドとなるＤＮＡで連結する部分であり、図１０において、丸で囲んだ部分を指す。
ＤＮＡをバンドル化する時に、このスカフォールドクロスオーバと、ステイプルで連結されるステイプルクロスオーバの２種類が使われる。
スカフォールドクロスオーバがコイル構造の途中にある場合には、その領域とスカフォールドクロスオーバのみから構成される領域を比べると、内部の構造歪みに違いが出てくる。一方、コイル構造には空間的に均一な歪みの形成が不可欠であるため、スカフォールドクロスオーバをコイルの端に配置する構成が好ましい。実際に、成功例は、図１０の（ａ）に含まれる。
一方、図８Ａ、図８Ｂ、図９のように、図１０（ｂ）、（ｃ）の構成をベースにすると、成功例は発見できなかった。
条件２）については、図６Ａ（ｂ）の成功例を見ると、図１１の示すように、スカフォールドクロスオーバとステイプルとの継ぎ目（矢印のおしりと頭のすきま）がそろっている。
クロスオーバの位置と、ステイプルの継ぎ目とは、しっかり二重らせんが形成されている領域と比べて相対的に構造が弱い部分になる。つまり、この位置で曲がりやすくすることができることを意味し、この位置をＤＮＡの延在方向と直交する縦に揃えることで、４本のバンドル化されたＤＮＡが共同的に揃って曲がりやすくなるものと推定される。
条件３）については、実験的に、１つの挿入もしくは欠失では構造歪みの形成が不十分であり、コイルでなく、図１２（ａ）に示すように、波打つような構造が形成されるのみとなっている。
条件４）については、図１２（ｂ）に示すように、４へリックスバンドルでは、８塩基ごとに構造歪みを作成するのは、無理な歪みが延在方向のどこかの位置で制御できなくなり、全体的なコイル構造を形成できないと推定される。
実際に、成功例のデザインは、３２塩基以上離しており、また、１６塩基以上離して配置すると、成功とは言えないデザインでも部分的にはコイル構造が形成できており、成功例に近いデザインとなることがわかる。
次に、上記の実験で作成したバネ構造の特性を評価した。図１３Ａ、図１３Ｂは、上記のようにして作成したコイルの物性として、バネ定数を求めるためのシステムの概要を示す図である。
１）ＤＮＡバネ１１の作成時に、ビオチン化したステイプルおよび、ＤＩＧ（ジゴギキゲニン）化したステイプルをバネ両端に挿入する。
２）ＤＩＧ抗体でコートした直径２００ｎｍの蛍光ポリスチレンビーズ１５とＤＮＡバネ１１を混合して、ビーズ１５にＤＮＡバネ１１を結合する。
３）ニュートラアビジンコートしたカバーガラス１７に、上記サンプルを流して、ＤＮＡバネ１１をガラス１７上に結合する（図１３Ａ（ａ））。
４）蛍光ビーズ１５のブラウン運動を解析してガラス１７上で等方的に運動しているビーズ１５を選ぶ（図１３Ａ（ｂ））。この解析により、ガラス１７とビーズ１５に摩擦がない、表面の影響を受けていないビーズをセレクションできる。
５）ビーズ１５を光ピンセットによりトラップする。
６）ガラス１７面をピエゾステージのコントロールによって一方向にスライドさせる。
７）ビーズ１５は、トラップされているためある１点Ｐ１で固定されているが、ガラス１７面に固定されたバネ１１の端はピエゾによって平行移動し、バネ１１が徐々に引き延ばされる（図１３Ｂ（ａ））。
８）さらにステージを動かし続けると、トラップされたビーズ１５がトラップ中心からずれてくる。このトラップ中心からの距離からどのくらいの力がバネ１１に加わるかがわかる。
９）引き延ばしたバネ１１の長さとその時の力が実測でき、Force-extension curveが求まる（図１３Ｂ（ｂ））。
１０）このカーブの傾きがバネ定数であり、十分に引き延ばされた領域を除いて、緩やかなバネ定数の変化が観察された。
１）ＤＮＡバネ１１の作成時に、ビオチン化したステイプルおよび、ＤＩＧ（ジゴギキゲニン）化したステイプルをバネ両端に挿入する。
２）ＤＩＧ抗体でコートした直径２００ｎｍの蛍光ポリスチレンビーズ１５とＤＮＡバネ１１を混合して、ビーズ１５にＤＮＡバネ１１を結合する。
３）ニュートラアビジンコートしたカバーガラス１７に、上記サンプルを流して、ＤＮＡバネ１１をガラス１７上に結合する（図１３Ａ（ａ））。
４）蛍光ビーズ１５のブラウン運動を解析してガラス１７上で等方的に運動しているビーズ１５を選ぶ（図１３Ａ（ｂ））。この解析により、ガラス１７とビーズ１５に摩擦がない、表面の影響を受けていないビーズをセレクションできる。
５）ビーズ１５を光ピンセットによりトラップする。
６）ガラス１７面をピエゾステージのコントロールによって一方向にスライドさせる。
７）ビーズ１５は、トラップされているためある１点Ｐ１で固定されているが、ガラス１７面に固定されたバネ１１の端はピエゾによって平行移動し、バネ１１が徐々に引き延ばされる（図１３Ｂ（ａ））。
８）さらにステージを動かし続けると、トラップされたビーズ１５がトラップ中心からずれてくる。このトラップ中心からの距離からどのくらいの力がバネ１１に加わるかがわかる。
９）引き延ばしたバネ１１の長さとその時の力が実測でき、Force-extension curveが求まる（図１３Ｂ（ｂ））。
１０）このカーブの傾きがバネ定数であり、十分に引き延ばされた領域を除いて、緩やかなバネ定数の変化が観察された。
このように、一般的なバネと同様な特性が得られたことから、柔軟なバネ構造が得られていることが実証できた。
以上のように、このデザインによって、コイル構造が実現でき、電子顕微鏡のネガティブ染色観察による確認と、光ピンセット法を用いたバネ定数の実測によって、ピコニュートンオーダーの微小な力を定量出来るバネとして働くことが確認できた。
コイル形状の周期と直径はある程度チューニングが可能であり、超微細回路の鋳型のチューニングやバネ定数のチューニングができることを意味する。
以上に示すように、作成したナノサイズのバネは、DNAorigamiという手法を活用したものであり、ＤＮＡ分子のみから構成され、化学修飾が容易に可能である。
例えば、Ａｕ（金）粒子などの金属を化学結合によってＤＮＡ上にきれいに１ｎｍの精度で配置させることが可能であり、ナノサイズの配線形成等が可能となる。この形状を鋳型にして金属粒子を配置すれば、ナノサイズのコイルを作成することができ、次世代の極小電子部品作成に使うことができる。
また、金属ではなく蛍光分子をバネにラベリングすることにより、バネの伸び縮みに応じて蛍光分子間の距離が変化し、セルフクエンチング効果による蛍光強度変化が期待できる。
逆に、蛍光強度のモニタリングからバネの伸びが分かり、どのくらいの力がバネにかかっているか定量することが可能になる。医療分野などにも適用が可能である。
マイクロからナノサイズの極小領域で力場がどのようになっているか可視化できるため、ナノサイエンスやナノバイオロジー、メカノバイオロジーの分野で有用なツールとなりうる。
尚、本願の対象は、ＲＮＡでも基本的には同じ製造方法で作成することは可能なので、核酸全体に適用できる。ただし、ＲＮＡは構造安定性がＤＮＡよりも不安定であり、工学的応用としてはＤＮＡでの作成の方が好ましい。
上記の実施の形態において、添付図面に図示されている構成等については、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を発揮する範囲内で適宜変更することが可能である。その他、本発明の目的の範囲を逸脱しない限りにおいて適宜変更して実施することが可能である。また、本発明の各構成要素は、任意に取捨選択することができ、取捨選択した構成を具備する発明も本発明に含まれるものである。
例えば、上記の実施の形態では、コイル形状の作成を例にして説明したが、柔軟な微細構造であれば、微小なバネや接点スイッチなどの弾性部品など、弾性部品と一般的な剛性部品との組み合わせなど種々の構造に適用可能である。
本発明は、ナノ構造のコイルに利用可能である。
１１…ＤＮＡバネ、１５…ビーズ、１７…ガラス。
Claims (6)
- ２本鎖ポリヌクレオチドが形成する二重らせん構造の周期性を利用して、１本鎖ポリヌクレオチドからなるスカフォールドを、前記１本鎖ポリヌクレオチドと部分的に相補的なオリゴヌクレオチドからなるステイプルにより連結しバンドル化されてなる、曲率を持った柔らかい３次元コイル構造であって、
連結の位置を、前記周期性からずらした位置としていることを特徴とする３次元コイル構造。 - 連結の位置には、
スカフォールドに塩基の欠失又は塩基の挿入の少なくともいずれか一方がなされていることを特徴とする請求項１に記載の３次元コイル構造。 - スカフォールドを２本に束ねた場合に、以下の条件とすることを特徴とする請求項２に記載の３次元コイル構造。
１）スカフォールドに、７又は１４塩基毎に塩基の挿入がある。
２）１）の塩基の挿入数がそれぞれ３以上である。 - スカフォールドを４本に束ねた場合に、以下の条件とすることを特徴とする請求項２に記載の３次元コイル構造。
１）スカフォールドクロスオーバをコイル構造の端に配置する。
２）ステイプルクロスオーバとステイプルの継ぎ目が、ポリヌクレオチドの延在方向と直交する縦方向に揃っている。 - さらに以下の条件とすることを特徴とする請求項４記載の３次元コイル構造。
１）スカフォールドに１６塩基以上ごとに塩基の挿入又は欠失がある。
２）１）の塩基の挿入数又は欠失数が、それぞれ２以上である。 - ２本鎖ポリヌクレオチドが形成する二重らせん構造の周期性を利用して、１本鎖ポリヌクレオチドからなるスカフォールドを、前記１本鎖ポリヌクレオチドと部分的に相補的なオリゴヌクレオチドからなるステイプルにより連結しバンドル化されてなる、曲率を持った柔らかい３次元コイル構造を作成する製造方法であって、
連結の位置を、前記周期性からずらした位置とし、
連結の位置に、スカフォールドに塩基の欠失又は塩基の挿入の少なくともいずれか一方を配置することを特徴とする３次元コイル構造の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013042322A JP6041306B2 (ja) | 2013-03-04 | 2013-03-04 | ポリヌクレオチドを用いたコイル及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013042322A JP6041306B2 (ja) | 2013-03-04 | 2013-03-04 | ポリヌクレオチドを用いたコイル及びその製造方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014168831A JP2014168831A (ja) | 2014-09-18 |
| JP2014168831A5 JP2014168831A5 (ja) | 2016-04-21 |
| JP6041306B2 true JP6041306B2 (ja) | 2016-12-07 |
Family
ID=51691645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013042322A Active JP6041306B2 (ja) | 2013-03-04 | 2013-03-04 | ポリヌクレオチドを用いたコイル及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6041306B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7272643B2 (ja) * | 2019-05-27 | 2023-05-12 | 国立研究開発法人理化学研究所 | ナノデバイス、フォースセンサ、力の測定方法、および試薬キット |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009093558A1 (ja) * | 2008-01-22 | 2009-07-30 | Tokyo Institute Of Technology | 核酸構造体及びその核酸構造体を用いた核酸構造物、並びにその核酸構造物の作製方法 |
| JP2010082731A (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-15 | Kyoto Univ | 塩基配列を用いた部品の組み立て装置及び組み立て方法 |
| KR20140050027A (ko) * | 2011-07-01 | 2014-04-28 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 예정된 형상을 갖는 나노입자의 형성 방법 |
| WO2013148186A1 (en) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | President And Fellows Of Harvard College | Lipid-coated nucleic acid nanostructures of defined shape |
-
2013
- 2013-03-04 JP JP2013042322A patent/JP6041306B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014168831A (ja) | 2014-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4689624B2 (ja) | ペプチドまたは核酸マイクロパターン形成を使用してカーボンナノチューブを製造する方法 | |
| LaBean et al. | Constructing novel materials with DNA | |
| Nakao et al. | Transfer-printing of highly aligned DNA nanowires | |
| JP5889416B2 (ja) | 構造体形成方法、構造体および二官能性前駆体分子 | |
| US7628972B2 (en) | Nanostructure devices and fabrication method | |
| JP4508894B2 (ja) | 炭素ナノチューブのマトリックス構造及びその製造方法 | |
| JP6041306B2 (ja) | ポリヌクレオチドを用いたコイル及びその製造方法 | |
| Pawlak et al. | Directed rotations of single porphyrin molecules controlled by localized force spectroscopy | |
| Ju et al. | A molecular dynamics study of the mechanical properties of a double-walled carbon nanocoil | |
| US20090278257A1 (en) | Method to assemble structures from nano-materials | |
| Johnson et al. | The path towards functional nanoparticle-DNA origami composites | |
| US20110121496A1 (en) | Shape manipulation of nanostructures | |
| JP2010539468A (ja) | 表面結合分子を有する固体基質およびこの基質を生成および使用する方法 | |
| Lau et al. | Minimalist approach to complexity: templating the assembly of DNA tile structures with sequentially grown input strands | |
| Zhao et al. | Design and implementation of shape memory alloy-actuated nanotweezers for nanoassembly | |
| US7504014B2 (en) | High density interconnections with nanowiring | |
| JP2007296593A (ja) | フラーレンナノワイヤ、その製造方法、および、それを用いた素子 | |
| Mokhtar et al. | DNA Origami Transformers | |
| Pfeifer et al. | Synthetic DNA filaments: From design to applications | |
| TW201341300A (zh) | 奈米粒子鏈之製造方法 | |
| Bell et al. | Manipulation of nanocoils for nanoelectromagnets | |
| Xia et al. | Confined hetero double helix structure induced by graphene nanoribbon | |
| LaBean | Self-assembling DNA nanostructures and DNA-based nanofabrication | |
| Kiehl | DNA-directed assembly of nanocomponents for nanoelectronics, nanophotonics, and nanosensing | |
| Hamada et al. | Extending the Geometrical Design of DNA Nanostructures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160303 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160303 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161025 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161101 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6041306 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |