JP6030087B2 - 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に、本発明は、胚体内胚葉細胞を他の細胞型へ分化させるのに有用な因子の同定に関する。
本出願は、2004年4月27日に出願されたPDX 1発現内胚葉(PDX 1 EXPRESSING ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第60/566,293号、2004年7月14日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第60/587,942号及び2004年7月9日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第60/586,566号の通常の出願として米国特許法第119条(e)項のもと、優先権を主張する2005年4月26日に出願されたPDX 1発現内胚葉(PDX 1 EXPRESSING ENDODERM)という表題の米国特許出願第11/115,868号の一部継続出願である。本出願はまた、2004年7月14日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第60/587,942号及び2004年7月9日に出願された胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国仮特許出願第60/586,566号、並びに2003年12月23日に出願された胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米
国仮特許出願第60/532,004号に対する通常の出願として米国特許法第119条(e)項のもと、優先権を主張する2004年12月23日に出願された胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国特許出願第11/021,618号の一部継続出願
である。
ヒト多能性幹細胞、例えば胚性幹(ES)細胞及び胚性生殖(EG)細胞は、1994年に線維芽細胞フィーダーを含有しない(Bongso et al., 1994)そして線維芽細胞フィー
ダーを含有する(Hogan, 1997)培養物中でまず単離された。後に、Thomson、Reubinoff
及びShamblottは、有糸分裂不活性化マウスフィーダー層を用いたヒトES及びEG細胞
の連続培養を確立した(Reubinoff et al., 2000;Shamblott et al., 1998;Thomson et
al., 1998)。
とも2つの健常ドナー器官が、首尾よい移植のために十分な島細胞を得るために必要とされる。ヒト胚性幹細胞は、ヒト細胞療法のための相当量の高品質分化細胞を発達させるた
めの出発物質の供給源を提供する。
本発明の実施形態は、胚体内胚葉細胞のようなPDX1陽性(PDX1発現)内胚葉細胞及び/又はPDX1陰性内胚葉細胞(PDX1を有意に発現しない内胚葉細胞)を含む細胞集団における細胞を、細胞療法に有用である細胞へ分化させるのに有用である1つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。例えば、本明細書中に記載する方法のいくつかの実施形態は、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱(これらに限定されない)を包含する組織及び/又は器官に関する前駆体である細胞への胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な因子を同定する方法に関する。いくつか実施形態では、かかる前駆体細胞はPDX1陽性内胚葉細胞である。他の実施形態では、かかる前駆体細胞は、PDX1を有意に発現しない内胚葉細胞である。
つかの実施形態では、成長因子としては、FGF10、FGF4、FGF2、Wnt3A又はWnt3Bが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、候補分化因子は、小分子であり得る。特定の実施形態では、小分子は、レチノイン酸のようなレチノイド化合物である。或いは、いくつかの実施形態では、候補分化因子は、レチノイドでなく、前腸分化因子でなく、或いはTGFβスーパーファミリーの成員ではない。他の実施形態では、候補分化因子は、レチノイド化合物、前腸分化因子又は成長因子であるTGFβスーパーファミリーの成員(例えば、アクチビンA及びB)以外の任意の分子である。さらなる他の実施形態では、候補分化因子は、胚体内胚葉細胞の分化を引き起こすことがこれまでに知られていない因子である。
、肝細胞核因子4a(HNF4a)、CXC型ケモカイン受容体4(CXCR4)、フォンウィルブランド因子(VWF)、血管細胞接着分子−1(VACM1)、アポリポタンパク質A1(APOA1)、グルコース輸送体−2(GLUT2)、α−1−アンチトリプシン(AAT)、グルコキナーゼ(GLUKO)並びにヒト造血発現ホメオボックス(hHEX)及びCDX2が挙げられるが、これらに限定されない。
はそうでなければ候補分化因子を供給した後に複数回評価される。或る特定の実施形態では、マーカー発現は、Q−PCRにより評価される。他の実施形態では、マーカー発現は、免疫細胞化学により評価される。
(CDX2)から成る群から選択される、項目13に記載の方法。
(CDX2)から成る群から選択される、項目1に記載の方法。
れる、項目1に記載の方法。
しかしながら上記のin vitro分化細胞組成物は、in vivo用途に用いられ得る。
年4月27日に出願された内胚葉を発現するPDX1(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)という表題の米国特許仮出願第60/566,293号;2004年7月9日に出願された胚体内胚葉細胞の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国特許仮出願第60/586,566号;2004年7月14日に出願された胚体内胚葉細胞の単離のためのケモカイン細胞表面受容体(CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国特許仮出願第60/587,942号;2004年12月23日に出願された胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)という表題の米国特許出
願第11/021,618号;及び2005年4月26日に出願された内胚葉を発現するPDX1(PDX1 EXPRESSING ENDODERM)という表題の米国特許出願第11/115,868号にも見出され得る。
原腸形成と呼ばれる初期ヒト発達におけるきわめて重大な段階は、受精後2〜3週間で起こる。原腸形成は、3つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に有意である(Lu et al., 2001;Schoenwolf and Smith, 2000)
。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成に関与するが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及びその他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成に関与する胚葉として定義される(Grapin-Botton and Melton, 2000;Kimelman and Griffin, 2000;Tremblay et al., 2000;Wells and Melton,
1999;Wells and Melton, 2000)。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼
ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質である。
本出願全体を通して用いられるような或る特定のいくつかの用語及び語句は、以下のように提示される意味を有する:
生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の測定は、発現されるマーカーの相対量又は絶対量の検出、或いは単にマーカーの存在又は非存在の検出を指す。
本明細書中に記載する実施形態は、幹細胞のような多能性細胞を、多分化能胚体内胚葉細胞へ分化させることによる培養物中での胚体内胚葉細胞の産生のための新規規定プロセスに関する。上述したように、胚体内胚葉細胞は、外胚葉又は中胚葉から産生される組織へ分化するのではなく、腸管並びに腸管に由来する器官へ分化する。或る特定の好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、hESCに由来する。かかるプロセスは、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺及び胸腺のような組織に由来するヒト内胚葉の効率的な産生に関する基盤を提供することができる。例えば、胚体内胚葉の産生は、機能的なインスリン生産β細胞への幹細胞の分化における第1の工程であり得る。有用な量のインスリン生産β細胞を得るためには、膵臓島/β細胞最終結果物に到達する前に起きる分化工程それぞれに関して、高効率の分化が望まれる。胚体内胚葉細胞への幹細胞の分化は、機能的な膵臓島/β細胞の産生に対しておそらく一番初めの工程を表す(図1に示されるように)ため、この工程での高効率の分化が特に望まれる。
及び一時的に特定された様式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。胚体内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、胚体内胚葉細胞と特異的に結合する試薬を用いることにより、集団中の他の細胞からの胚体内胚葉細胞の単離及び/又は精製により達成され得る。
異的である細胞マーカー、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、測定するための方法に関する。
胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化された細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に、そして2004年12月23日に出願された胚体内胚葉(DEF
INITIVE ENDODERM)という表題の米国特許第11/021,618号に記載されている。
これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化された細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。かかる多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化無しで多能性状態で培養物中で維持されることができる。かかる方法は、例えば米国特許第5,453,357号、同第5,670,372号、同第5,690,926号、同第5,843,780号、同第6,200,806号及び同第6,251,671号に記載されている。
10日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、成長因子は、それらの付加後約4日で除去される。
胚体内胚葉へのhESC培養の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を測定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより測定される。或いは或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより判定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的PCR(Q−PCR)の使用による。Q−PCRを実施する方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知である他の方法は、マーカー遺伝子発現を定量するためにも用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにhESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が判定される。
C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)]。CXCR4受容体はま
た、T細胞へのHIV−1の進入のための共受容体として機能する[Feng, Y., et al. Science, 272, 872-877 (1996)]。[McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)]により実施される広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体CXCR4及びその特有のリガンドであるSDF−1[Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)]の発現は、マウスにおいて初期発達及び成体期中に示された。発達に
おけるCXCR4/SDF1相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで崩壊される[Nagasawa et al. Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q., et al Immunmity, 10, 463-471 (1999)]場合、それが後期胚致死性をもたらしたことが実証された際に明らかとなってきた。McGrath他は、CXCR4は、RNアーゼ保護及びin situハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸形成胚(E7.5)中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーRNAであることを実証した。原腸形成胚では、CXCR4/SDF−1シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞の遊走を誘導することに主に関与されるようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。E7.2−7.8マウス胚では、CXCR4及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している[McGrath, K.E. et al.
Dev. Biology 213, 442-456 (1999)]。
形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるSOX17マーカー及び/又はCXCR4マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団(例えば、多能性幹細胞)におけるSOX17マーカー及び/又はCXCR4マーカーの発現よりも飛躍的に高い。
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、かかる細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び/又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子(例えば、ポリペプチド)に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、CXCR4に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインSDF−1又はSDF−1に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。かかる分子としては、SDF−1フラグメント、SDF−1融合体又はSDF−1模倣体が挙げられるが、これらに限定されない。
、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物において胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズ結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界中へ細胞/抗体/ビーズ複合体をさらす。いったん胚体内胚葉細胞が培養物において他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は崩壊されて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度平板培養される。
いくつかの方法では、細胞は、無作為な分化を受ける。しかしながら、好ましい方法では、細胞は、主として胚体内胚葉へ分化するように指示される。いくつかの好ましい富化、単離及び/又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のin vitro産生に
関する。本明細書中に記載する方法を使用して、細胞集団又は細胞培養物は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約2〜約1000倍、胚体内胚葉含有量が富化され得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約5〜約500倍富化され得る。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約10〜約200倍富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約20〜約100倍富化され得る。さらなる他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約40〜約80倍富化され得る。或る特定の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約2〜約20倍富化され得る。
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉を富化された細胞集団が挙げられる。例えば、培養物中の細胞の少なくとも約50〜80%が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時機(これらに限定されない)を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約95%以上の多能性細胞の胚体内胚葉への転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばCXCR4受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。
90%、又は90%より多くが胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、ここでGATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及びCRIP1マーカーの発現は、少なくとも約5%から少なくとも約95%を上回るヒト細胞においてOCT4、SPARC、AFP、TM及び/又はSOX7マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記パーセントは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
胞集団のような組成物に関するが、ここでGATA4、MIXL1、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1及びCRIP1マーカーの発現は、少なくとも約5%から少なくとも約95%を上回る内胚葉細胞においてOCT4、SPARC、AFP、TM及び/又はSOX7マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。
PDX1(STF−1、IDX−1及びIPF−1とも呼ばれる)は、膵臓及び吻側十二指腸の発達に必要な転写因子である。PDX1はまず、マウスにおけるE8.5に始まって、後方前腸内胚葉から生じ、且つ外分泌細胞及び内分泌細胞の両方を産生する膵臓内胚葉で発現される。後に、PDX1は、膵臓内分泌部のβ細胞及びいくつかのデルタ細胞に制限されるようになる。この発現パターンは、成体において維持される。PDX1はまた、発達初期に、形成中の膵臓に隣接している十二指腸内胚葉で、続いて十二指腸細胞及び腸内分泌細胞で、胃洞で、並びに総胆管、胆嚢管及び胆管で発現される。この発現領域もまた、膵臓での発現が制限されるようになる時点で、大部分が吻側十二指腸へ制限されるようになる。
本明細書中に記載する他の分化プロセスの実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞の産生のための新規に規定されたプロセスに関し、ここでPDX−1陽性内胚葉細胞は、腸管の前腸/中腸領域に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞(PDX−1陽性前腸/中腸内胚葉)である。いくつかの好ましい実施形態は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生のためのプロセスに関する。いくつかの実施形態では、これらのPDX1陽性前腸内胚葉細胞は、腸管の前方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞(PDX−1陽性前腸内胚葉)である。さらなる好ましい実施形態は、前腸の後方部分のPDX1陽性内胚葉細胞の産生のためのプロセスに関する。いくつかの実施形態では、これらのPDX1陽性内胚葉細胞は、腸管の前腸領域の後方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。
tro方法論に関する。通常、かかる方法は、規定され、且つ時間的に指定された形式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へ特異的に結合する試薬を使用することにより、集団における他の細胞からのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の単離及び/又は精製により達成することができる。代替法として、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、PDX1発現の検出を可能にするように、緑色蛍光タンパク質(GFP)のようなレポーター遺伝子で標識することができる。続いて、かかる蛍光標識された細胞は、蛍光標示式細胞分取器(FACS)により精製することができる。本発明のさらなる態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団、並びにPDX1陽性前腸内胚葉への及びPDX1陽性前腸内胚葉からの分化に有用な因子を同定する方法に関する。
びHOXC6から成る群から選択されるマーカーの1つ又は複数を発現する。
本明細書中に記載されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含むPDX1陽性前腸内胚葉細胞培養物及び集団は、上述されたような多能性細胞から生成されるPDX1陰性胚体内胚葉から産生される。好ましい方法は、出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、hESCはまず、PDX1陰性胚体内胚葉細胞へ変換されて、続いてPDX1陽性前腸内胚葉細胞へ変換される。しかしながら、PDX1陽性前腸内胚葉の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を使用して産生される胚体内胚葉細胞に限定されるものではないことが理解されよう。むしろ、任意のPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載する方法で使用することができる。
、分化された多能性細胞を、約1ng/ml〜約1000ng/mlのアクチビンAを含む培地中で成長又は維持させることにより条件付けされる。さらに他の実施形態では、培地は、分化された多能性細胞を、約1ng/ml〜約1000ng/mlのBMP4を含む培地中で成長又は維持させることにより条件付けされる。好ましい実施形態では、条件培地は、分化されたhESCを、約25ng/mlのアクチビンA及び約2μMのRAを含む培地(例えば、RPMI)中で24時間、成長又は維持させることにより調製される。
クチビンA及び分化されたhESCにより約24時間条件付けした低血清RPMI培地(ここで、分化されたhESCは、約100ng/mlのアクチビンAを含む低血清RPMI中で約5日間分化させたものである)を含む培養物中で、PDX1陽性前腸内胚葉細胞
へ分化される。別の好ましい実施形態では、アクチビンB及び/又はFGF−10もまた、それぞれ25ng/ml及び50ng/mlで培養物中に存在する。
多能性細胞からの胚体内胚葉細胞の分化と同様に、PDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉への分化の進行は、これらの細胞型の特徴的なマーカー発現を測定することによりモニタリングすることができる。かかるモニタリングにより、様々な条件(例えば、1つ又は複数の分化因子濃度及び環境条件)下での所望の量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生に十分な時間を判定することが可能となる。好ましい実施形態で
は、所望の量のPDX1陽性前腸内胚葉の産生に十分な時間は、PDX1の発現を検出することにより測定される。いくつかの実施形態では、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより測定される。或いは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより判定することができる。かかる実施形態では、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。上述したように、マーカー遺伝子により産生される発現マーカーを定量化する好ましい方法は、Q−PCRの使用によるものである。特定の実施形態では、Q−PCRは、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の発現の欠如を定量化することにより、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉培養物の細胞の進行をモニタリングするのに使用される。同様に、当該技術分野で既知の他の方法を使用して、マーカー遺伝子発現を定量化することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、そのマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することにより検出することができる。いくつかの実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにPDX1陰性胚体内胚葉であるhESC及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が判定される。
本明細書中に記載されるプロセスのさらなる態様に関しては、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は富化され、単離され且つ/又は精製され得る。いくつかの実施形態では、このような細胞を細胞培養物から単離することにより、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に関して富化された細胞集団が産生される。
又はその生物学的に活性な断片により置き換えられる。他の実施形態では、GFPをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片は、フレーム内で、PDX1をコードする核酸の少なくとも一部分と融合され、それにより融合タンパク質を生成する。このような実施形態では、融合タンパク質は、GFPと類似の蛍光活性を保持する。
では、細胞は無作為分化を受ける。しかしながら好ましい実施形態では、細胞は主としてPDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び/又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からのPDX1陽性前腸内胚葉細胞のin vi
tro産生に関する。
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような細胞組成物に関し、ここでPDX1陽性内胚葉細胞は、腸管の前方部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞(PDX1陽性前腸内胚葉)である。或る特定の実施形態によれば、PDX1陽性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態では、これらの細胞はヒト細胞である。
1陽性前腸内胚葉細胞及び中胚葉細胞から成る群から選択される1つ又は複数の細胞型の細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関する。いくつかの実施形態では、hESCは、培養物において総細胞の約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満を構成する。他の実施形態では、PDX1陰性胚体内胚葉細胞は、培養物において総細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満を構成する。さらなる他の実施形態では、中胚葉細胞は、培養物において総細胞の約90%未満、約85%未満、約80%未満、約75%未満、約70%未満、約65%未満、約60%未満、約55%未満、約50%未満、約45%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満又は約1%未満を構成する。
X1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約100のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約10のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約5のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約4のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約2のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約2のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約4のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約5のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約10のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約20のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約50のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約100のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1000のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約10,000のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約100,000のPDX1陽性前腸内胚葉細胞及び約1のPDX1陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約1,000,000のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物が意図される。
C1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多いことが理解されよう。いくつかの実施形態では、SOX17、HOXA13及びHOXC6から成る群から選択される1つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約5%のヒト細胞において、少なくとも約10%のヒト細胞において、少なくとも約15%のヒト細胞において、少なくとも約20%のヒト細胞において、少なくとも約25%のヒト細胞において、少なくとも約30%のヒト細胞において、少なくとも約35%のヒト細胞において、少なくとも約40%のヒト細胞において、少なくとも約45%のヒト細胞において、少なくとも約50%のヒト細胞において、少なくとも約55%のヒト細胞において、少なくとも約60%のヒト細胞において、少なくとも約65%のヒト細胞において、少なくとも約70%のヒト細胞において、少なくとも約75%のヒト細胞のヒト細胞において、少なくとも約80%のヒト細胞において、少なくとも約85%のヒト細胞において、少なくとも約90%のヒト細胞において、少なくとも約95%のヒト細胞において、或いは少なくとも約98%のヒト細胞において、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞のパーセント(ここで、SOX17、HOXA13及びHOXC6から成る群から選択される1つ又は複数のマーカーの発現は、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い)は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。
葉細胞において、或いは少なくとも約98%の内胚葉細胞において、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1及び/又はNFMマーカーの発現よりも多い。
本明細書中に記載するプロセスのいくつかの態様は、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団におけるPDX1遺伝子産物の発現を増大させる方法に関する。かかる実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を、PDX1遺伝子産物の発現を増大させるのに十分な量で、分化因子と接触させる。分化因子と接触するSOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1陰性であってもPDX1陽性であってもよい。いくつかの実施形態では、分化因子はレチノイドであり得る。或る特定の実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を、約0.01μM〜約50μMの範囲の濃度でレチノイドと接触させる。好ましい実施形態では、レチノイドはRAである。
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る少なくとも1つの分化因子を同定する方法に関する。これらの方法のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞、例えばヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。次に細胞集団は、候補分化因子を提供される。候補分化因子の提供の前であるか又はほぼ同じである第1の時点で、マーカーの発現が測定される。或いはマーカーの発現は、候補分
化因子の提供後に測定され得る。第1の時点の後であり、候補分化因子を細胞集団に提供する工程の後である第2の時点で、同一マーカーの発現が再び測定される。候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得るか否かは、第1の時点でのマーカーの発現を、第2の時点でのマーカーの発現と比較することにより測定される。第2の時点でのマーカーの発現が、第1の時点でのマーカーの発現と比較して増大されるか又は減少される場合には、候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る。
子であると知られている分子を含む。代替的な実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト胚体内胚葉細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。
。
脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、aFGF、FGF−4、FGF−6、ケラチノサイト成長因子(KGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、血小板由来成長因子−BB、β神経成長因子、アクチビンA、形質転換増殖因子β1(TGF−β1)、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、バースト促進活性(BPA)、赤血球系促進活性(EPA)、PGE2、インスリン増殖因子−1(IG
F−1)、IGF−II、ニュートロフィン増殖因子(NGF)、ニュートロフィン−3、ニュートロフィン4/5、毛様体神経栄養因子、グリア由来ネキシン、デキサメタソン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンフォテリシンB、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン、TWS119、オキシトシン、バソプレッシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、リポトロピン、ヒト甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、性腺刺激ホルモン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン放出抑制因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、上皮小体ホルモン、グルカゴン様ペプチド1、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作動性小腸ペプチド、サブスタンスP、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤ラクトゲン、レラキシン、アンギオテンシンII、カルシトリオール、心房性ナトリウム利尿ペプチド及びメラトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフェリン、アンドロスチエン(androstiene)、カル
シトリオール、コラーゲン、デキサメタソン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンフォテリシンB、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン及びTWS119から成る群から選択される1つ又は複数の成長因子を含む。
子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約0.1ng/ml〜約10mg/mlの範囲であるよう、細胞集団に提供される。いくつかの実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約1ng/ml〜約1mg/mlの範囲である。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約10ng/ml〜約100μg/mlの範囲である。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約100ng/ml〜約10μg/mlの範囲である。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約5ng/ml、約25ng/ml、約50ng/ml、約75ng/ml、約100ng/ml、約125ng/ml、約150ng/ml、約175ng/ml、約200ng/ml、約225ng/ml、約250ng/ml、約275ng/ml、約300ng/ml、約325ng/ml、約350ng/ml、約375ng/ml、約400ng/ml、約425ng/ml、約450ng/ml、約475ng/ml、約500ng/ml、約525ng/ml、約550ng/ml、約575ng/ml、約600ng/ml、約625ng/ml、約650ng/ml、約675ng/ml、約700ng/ml、約725ng/ml、約750ng/ml、約775ng/ml、約800ng/ml、約825ng/ml、約850ng/ml、約875ng/ml、約900ng/ml、約925ng/ml、約950ng/ml、約975ng/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml、約10μg/ml、約11μg/ml、約12μg/ml、約13μg/ml、約14μg/ml、約15μg/ml、約16μg/ml、約17μg/ml、約18μg/ml、約19μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約50μg/ml、約75μg/ml、約100μg/ml、約125μg/ml、約150μg/ml、約175μg/ml、約200μg/ml、約250μg/ml、約300μg/ml、約350μg/ml、約400μg/ml、約450μg/ml、約500μg/ml、約550μg/ml、約600μg/ml、約650μg/ml、約700μg/ml、約750μg/ml、約800μg/ml、約850μg/ml、約900μg/ml、約950μg/ml、約1000μg/mlであるか、又は約1000μg/mlより高い。
1及び第2の時点の両方で測定される。そのような実施形態では、同一の複数のマーカーの発現が、第1及び第2の時点の両方で測定される。いくつかの実施形態では、その各々が第1の時点の後であり、且つその各々が候補分化因子を細胞集団に提供した後である複数の時点で、マーカー発現が測定される。或る特定のいくつかの実施形態では、マーカー発現はQ−PCRにより測定される。他の実施形態では、マーカー発現は免疫細胞化学により測定される。
が、第1の時点でのこのマーカーの発現と比較して、増大したか又は減少したかがさらに測定される。少なくとも1つのマーカーの発現の増大又は減少は、候補分化因子が胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る、ということを示す。同様に、複数のマーカーの発現が測定される場合、第2の時点での複数のマーカーの発現が、第1の時点でのこの複数のマーカーの発現と比較して、増大したか又は減少したかがさらに測定される。マーカー発現の増大又は減少は、第1及び第2の時点での細胞集団中のマーカーの量、レベル又は活性を測定するか又は評価することにより判定され得る。このような判定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子発現と相対的であるか、或いは絶対的であり得る。マーカー発現が第1の時点と比較して第2の時点で増大される或る特定のいくつかの実施形態では、増大の量は、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、少なくとも約100倍であるか、又は少なくとも約100倍より多い。いくつかの実施形態では、増大の量は、2倍未満である。マーカー発現が第1の時点と比較して第2の時点で減少される実施形態では、減少の量は、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、少なくとも約100倍であるか、又は少なくとも約100倍より多い。いくつかの実施形態では、減少の量は、2倍未満である。
化する。いくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に提供後、ヒト胚体内胚葉細胞は、腸管に由来する細胞に分化する。このような細胞としては、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の細胞、並びにこのような細胞の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらの細胞は、より高度な構造、例えば組織及び/又は器官にさらに発達し得る。
本明細書中に記載するスクリーニング方法の態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な1つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。かかる方法では、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、細胞培養物又は細胞集団におけるPDX1の発現が測定される。PDX1の発現を測定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞を、候補分化因子と接触させる。いくつかの実施形態では、PDX1の発現は、細胞を候補分化因子と接触させる時点で、或いは接触させた直後に測定される。続いて、PDX1発現は、細胞を候補分化因子と接触させた後の1つ又は複数の時点で測定される。PDX1の発現が、候補分化因子との接触前のPDX1発現と比較して、候補分化因子との接触後に増大されていれば、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進す
ることが可能であるとして同定される。
法における使用のために意図される小分子は、上記で例示した種類に限定されないことが当業者に理解されよう。通常、小分子は、10,000amu未満の分子量である。好ましい実施形態では、小分子は、レチノイド、例えばRAである。
本明細書中に記載するスクリーニング方法の他の態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが可能な1つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。かかる方法では、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、細胞培養物又は細胞集団におけるマーカーの発現が測定される。マーカーの発現を測定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞を候補分化因子と接触させる。いくつかの実施形態では、マーカーの発現は、細胞を候補分化因子と接触させる時点で、或いは接触させた直後に測定される。続いて、同一マーカーの発現は、細胞を候補分化因子と接触させた後の1つ又は複数の時点で測定される。マーカーの発現が、候補分化因子との接触前のマーカー発現と比較して、候補分化因子との接触後に増大又は減少された場合、候補分化因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが可能であるとして同定される。好ましい実施形態では、マーカーの発現は、Q−PCRにより測定される。
ヒトES細胞
内胚葉発達についてのわれわれの研究のために、多能性であり、そして正常核型を保持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のための免疫学的又は機械的方法を用いて、5日齢胚内部細胞塊からES細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株hESCyt−25を、患者によるインフォームドコンセント後に、in vitro
受精サイクルからの過剰凍結胚から得た。解凍時に、ES培地(DMEM、20%FBS、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ITSサプリメント)中のマウス胚線維芽細胞(MEF)上に孵化胚盤胞をプレート化した。胚が培養皿に接着し、そして約2週間後、非分化hESCの領域を、MEFとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再プレート化することにより移動を成し遂げた。誘導以来、hESCyt−25を、100回にわたって逐次継代した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、hESCyt−25ヒト胚性幹細胞株を用いた。
hESCyt−25特徴づけ
ヒト胚性幹細胞株hESCyt−25は、培養中に18ヶ月にわたって、正常形態学、核型、増殖及び自己再生特性を保持した。この細胞株は、OCT4、SSEA−4及びTRA−1−60抗原(これらはすべて、未分化hESCに特有である)に対する強い免疫反応性を示し、そしてアルカリ性ホスファターゼ活性、並びに他の確立されたhESC株と同一の形態学を示す。さらにヒト幹細胞株hESCyt−25は、懸濁液中で培養される場合、胚様体(EB)も容易に形成する。その多能性性質の実証として、hESCyT−25は、3つの主要胚葉を表わす種々の細胞型に分化する。ZIC1に関するQ−PCR、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学(ICC)により、外胚葉産生を実証した。β−IIIチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のEBを処理して、臓側内胚葉(VE)、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理細胞は、高レベルのα−フェトタンパク質(AFP)及びSOX7(VEの2つのマーカー)を54時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でAFPを発現した。以下で記載するように、hESCyT−25細胞株は、AFP発現の非存在下でのSOX17に関するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q−PCR)及び免疫細胞化学により立証されるように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のEBを、いくつかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三つの胚葉を表わす細胞を形成する能力により示されるように、hESCyT−25株は多能性である。
SOX17抗体の産生
hESC培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトSOX17タンパク質に対して高められる抗体の産生に着手した。
し、その発現は、器官形成の開始まで腸管で維持される(しかし、発現のレベルは、A−P軸に沿って変化する)。SOX17はまた、胚体外内胚葉細胞のサブセットでも発現する。このタンパク質の発現はまた、中胚葉又は外胚葉では観察されていない。SOX17は、胚体外系統を排除するためのマーカーと併用される場合、胚体内胚葉系統に適切なマーカーであることが現在発見されている。
番号1)の一部(図2)は、抗体産生会社GENOVAC(Freiberg, Germany)にて、そこで開発された手順に従って、ラットにおける遺伝子免疫化に使用した。遺伝子免疫化に関する手段は、米国特許第5,830,876号、同第5,817,637号、同第6,165,993号及び同第6,261,281号、並びに国際特許出願公開第WO00/29442号及び同第WO99/13915号に見出すことができる。
ン受容体に対する遺伝子免疫化は、甲状腺炎を引き起こし、且つ自然受容体を認識するモノクローナル抗体の産生を可能にする(Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies
recognizing the native receptor), J. Immunol. 160: 1458-1465、Kilpatrick et al (1998) 遺伝子銃送達されるDNAベースの免疫化は、Flt−3受容体に対するマウス
モノクローナル抗体の迅速な産生を媒介する(Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor), Hybridoma 17: 569-576、Schmolke et al., (1998) DNA免疫化により産生されるE2特異的モノクローナル抗体によるヒト血清におけるG型肝炎ウイルス粒子の同定(Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization), J. Virol. 72: 4541-4545、Krasemann et al., (1999) 異例の核酸ベースの免疫化戦略を用いたタンパク質に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy), J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri et al, (1996) DNA免疫化によるヘリコバクター・ピロリ細胞空胞化毒素の規定部分に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA
immunization), J. Biotechnol. 51: 191-194に見出すことができる。
用した。SOX17、SOX7及びEGFPの産生に用いられる発現ベクターは、それぞれpCMV6(OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD)、pCMV−SPORT6(Invitrogen, Carlsbad, CA)及びpEGFP−N1(Clonetech, Palo Alto, CA)であった
。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化MDXヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン2000(Invitrogen Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルDNAで一過的に
トランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの36時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有
する50mM TRIS−HCl(pH8)、150mM NaCl、0.1% SDS、
0.5%デオキシコール酸中に収集した。NuPAGE(4〜12%ポリアクリルアミド勾配、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのSDS−PAGEにより分離され、且つPDV
F膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移入された細胞タンパク質100μgのウェスタンブロット分析は、10mM TRIS−HCl(pH8)、150
mM NaCl、10%BSA、0.05%Tween−20(Sigma, St. Louis, MO)中
のラットSOX17抗血清の1/1000希釈で、アルカリホスファターゼ結合抗ラットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)によりプロービングし
て、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用される標準サイズのタンパク質は、広範囲の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。
れたヒト線維芽細胞から作製されるタンパク質抽出物を、SOX17抗体によりウェスタンブロットでプロービングした。hSOX17トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物のみが、ヒトSOX17タンパク質の予測された46Kda分子量に近い約51Kdaのバンドを生じた。ヒトSOX7又はEGFPトランスフェクト細胞のいずれかから作製される抽出物に対してSOX17抗体の反応性は見られなかった。さらに、SOX17抗体は、hSOX発現構築でトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の核を明らかに標識したが、EGFPのみでトランスフェクトした細胞は標識しなかった。したがって、SOX17抗体は、ICCによる特異性を示す。
胚体内胚葉のマーカーとしてのSOX17抗体の確認
部分的に分化させたhESCをSOX17及びAFP抗体で同時標識して、SOX17抗体がヒトSOX17タンパク質に特異的であること、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。SOX17、SOX7(これは、SOX遺伝子ファミリーサブグループFの密接に関連する成員である(図3))及びAFPはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、AFP及びSOX7は、ICCにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。SOX17抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはAFP陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図5Aは、少数のSOX17細胞がAFPで同時標識されることを示すが、SOX17+細胞の区域においてAFP+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた(図5B)。同様に、壁側内胚葉は、SOX17を発現することが報告されているため、壁側マーカーSPARC及び/又はトロンボモジュリン(TM)と共にSOX17による抗体同時標識を使用して、壁側内胚葉であるSOX17+細胞を同定
することができる。図6A〜図6Cに示されるように、トロンボモジュリン及びSOX17同時標識された壁側内胚葉細胞は、hES細胞の無作為分化により産生された。
徴であるTM又はSPARCマーカーの発現よりも多い。したがって、SOX17に関して陽性であるが、AFPに対して陰性であり、且つTM又はSPARCに対して陰性である細胞は、胚体内胚葉である。
7抗体標識細胞数における10倍の差に反映している(図7B)。さらに、図8Aに示されるように、hESCのアクチビンA処理は、処理無しと比較して6.8倍分AFP遺伝子発現を抑制した。これは、図8B及び図8Cに示されるように、これらの培養物におけるAFP標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、AFP遺伝子発現におけるこのおよそ7倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のAFP抗体標識細胞数における同様の7倍の減少の結果であることが実証された(図9A及び図9B)。この結果は、Q−PCRにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて有意である。
ト(95%を超える標識細胞)並びにSOX17及びAFP(臓側内胚葉)に関して同時標識する少量パーセント(5%未満)の細胞を認識した。アクチビンによるhESC培養物の処理は、SOX17遺伝子発現並びにSOX17標識細胞の顕著な増大をもたらし、AFP mRNAの発現及びAFP抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。
Q−PCR遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的RT−PCR(Q−PCR)が、hESC分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定は、Q−PCRにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Q−PCR分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感受性及び必要なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Q−PCRの極めて高い感受性により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の顕在的な分化に先立つ特定の分化経路に対する偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することができない。このため、Q−PCRは、分化処理の成功をスクリーニングするための少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Q−PCRは、半ハイスループットスケール(semi-high throughput scale)の分析にて定量
的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。
施することであった。かかるアプローチにより、今後のさらなるマーカー遺伝子の分析用のcDNAサンプルの積上げが可能となり、したがって、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。
00ngからの逆転写は、オリゴdT及び無作為なプライマーのミックスを含有するiScript逆転写酵素キット(BioRad)を使用して実施した。続いて、反応物それぞれ20μLを総容量100μLにまで希釈して、3μlをそれぞれ400nM順方向プライマー及び逆方向プライマー並びに2×SYBR Greenマスターミックス(Qiagen) 5μLを含有するQ−PCR反応物10μLにおいて使用した。2段階サイクリングパラメータは、85〜94℃(具体的には各プライマー組に関するアンプリコンの融点に従って選択される)で5秒の変性、続く60℃での45秒のアニール/伸長を用いて使用された。各伸長段階の最後の15秒の間に、蛍光データを収集した。3点の10倍希釈シリーズを使用して、各実施に関する標準曲線を作成して、サイクル閾値(Ct)をこの標準曲線に基づいて定量値へ変換した。各サンプルに関する定量値は、ハウスキーピング遺伝子性能に対して標準化され、続いて平均値及び標準偏差は、三重反復サンプルに関して算出された。PCRサイクリングの終わりには、融解曲線分析を実施して、反応物の特異性を確かめた。単一の特異的産物は、そのPCRアンプリコンに適したTmでの単一ピークにより示
された。さらに、逆転写酵素無しで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増幅しない。
結合タンパク質(TATA-binding protein)(TBP)及びグルクロニダーゼβ(glucoronida
se beta)(GUS)の発現レベルを測定した。本発明者等の結果により、β−2−ミクログロブリン(bata-2-microglobulin)発現レベルが、分化の間に増大されることが示され、したがって本発明者等は、標準化に関してこの遺伝子の使用を排除した。他の遺伝子は、経時的に、並びに複数の処理にわたって不変的な発現レベルを示した。本発明者等は日常的に、サイクロフィリンG及びGUSの両方を使用して、すべてのサンプルに関して標準化因子を算出した。多数のHGの使用は、同時に標準化プロセスに固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増大させる。
7(臓側内胚葉)、SPARC(壁側内胚葉)及びブラキュリ(中胚葉)を発現すると予測された。さらに、ZIC1は、初期外胚葉の誘導をさらに除外するのに本明細書で使用された。最後に、GATA4及びHNF3bは、胚体及び胚体外内胚葉の両方で発現され、したがって、胚体内胚葉におけるSOX17発現と相関する(表1)。表1に記載するマーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを強調する代表的な実験を図11〜図14に示している。
らしたことが明らかである。さらに、このSOX17発現は、胚体外内胚葉とは対照的に主として胚体内胚葉を表した。この結論は、SOX17遺伝子発現が、AFP、SOX7及びSPARC遺伝子発現と逆相関したという観察から生じる。
胚体内胚葉へのヒトES細胞の指示された分化
ヒトES細胞培養物は、それらの未分化状態を活性で維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞(AFP、SPARC及びSOX7発現)並びにZIC1及びネスチン(外胚葉)及びブラキュリ(中胚葉)発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ES細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して実験又は特定されていない。それ自体で、またデフォルトで、ES細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特徴づけの大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたES細胞培養物においてSOX17hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意な多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。
FPlo/SPARC/TMlo胚体内胚葉細胞となるようにhESCを効率的にプログラミングすることが可能な多数の手順を探究してきた。本発明者等は、SOX17遺伝子発現に関してQ−PCRにより集団レベルで、及びSOX17タンパク質の抗体標識により個々の細胞のレベルで測定される場合、これらの細胞の数及び増殖能力を増大させることを目的とした様々な分化プロトコルを適用した。
を創出するのに使用するためのノーダル/アクチビン/BMPのようなTGFβファミリー成長因子の影響を分析及び記載した。通常の実験では、アクチビンA、アクチビンB、BMP又はこれらの成長因子の組合せを未分化ヒト幹細胞系hESCyt−25の培養物へ添加して、分化プロセスを開始させた。
理時間がSOX17の増大された発現をもたらすことを示している。
より示されるように、胚体内胚葉へのhESCの分化に有益であった(図23)。
れるように培養物中で分裂することを実証した。矢印は、PCNA/DAPI標識有糸分裂プレートパターン及び位相差有糸分裂プロフィールにより明らかなように有糸分裂中であるSOX17/PCNA/DAPIで標識された細胞を示す。
ケモカイン受容体4(CXCR4)発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、hESCは、TGFβファミリー、より具体的にはアクチビン/ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清(FBS)の比率が、hESCからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンAの所定濃度で、より高いレベルのFBSが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンAの非存在下では、胚体内胚葉系統へのhESCの分化は、非常に非効率であり、FBS濃度は、hESCの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。
ー発現の増大レベルを有したことを実証している。発現のこれらのパターンはCXCR4のパターンと反比例し、CXCR4が、この発達期間にhESCに由来する中胚葉又は外胚葉中ではそれほど高度に発現されないことを示した。
もまた測定した。hESCは、高用量アクチビンA及び低FBS濃度(0.5%〜2.0%)の存在下で分化させた場合、SOX17+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に分
布した。高用量アクチビンAを使用したが、FBSは10%(v/v)で包含された場合、SOX17+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布される
のではなく、常に単離クラスターに出現した(図29A及び図29C、並びに図29B及び図29E)。外因性アクチビンAが使用されなかった場合に、SOX17+細胞のさら
なる減少が観察された。これらの条件下では、SOX17+細胞はまたクラスターに出現
し、これらのクラスターは、高アクチビンA低FBS処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった(図29C及び図29F)。これらの結果は、CXCR4発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、CXCR4陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンAの用量はまた、胚体内胚葉がhESCから得られ得る効率に影響を及ぼす。この実施例は、アクチビンAの用量を増大させることにより培養物におけるCXCR4+
細胞の比率が増大することを実証する。
403−100)1μlを添加して、氷上で45分間ラベリングした。細胞は、2%ヒト血清を含有するPBS(緩衝液)5mlを添加することにより洗浄して、ペレット化した。緩衝液5mlによる第2の洗浄を完了させた後、細胞は、105個の細胞当たり緩衝液
50μl中に再懸濁させた。二次抗体(FITC結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、cat# 715−096−151)を最終濃度5μg/mlで添加して、30分
間標識させた後、上述のように緩衝液中で2回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に5×106個の細胞/mlで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps
Research Institute)にてスタッフによりFACS Vantage(Beckton Dicklenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的PCRによる遺伝子発現分析用の総RNAの単離のために、RLT溶解緩衝液(Qiagen)へ直接収集した。
容量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増大することが観察された(図30A〜図30C)。CXCR4+細胞は、R4ゲート内に納まり、このゲートは、事象の0.2%
がR4ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。CXCR4+細胞
の劇的に増大する数は、アクチビンA用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝子発現における強健な増大と相関する(図31A〜図31D)。
CXCR4陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を激減させる
上記実施例8で同定されるCXCR4+及びCXCR4-細胞を収集して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に測定した。
関した(図30A〜図30C)。また、各集団からのCXCR4+細胞の単離は、この集
団におけるほぼすべてのCXCR4遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を収集するためのFACS方法の効率を実証している。
だけでなく、CXCR4+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現も
含有することが明らかとなった。図31A〜図31Dに示されるように、CXCR4+細
胞はさらに、SOX17、GSC、HNF3B及びMIXL1に関して母A100集団を上回って富化した。さらに、CXCR4-分画は、これらの胚体内胚葉マーカーに関して
非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、CXCR4+及びCXCR4-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図33A〜図33Dは、CXCR4+細胞が、A100母集団に対してブラキュリ、MOX1
、ZIC1及びSOX7の遺伝子発現に関して激減したことを示す。このA100母集団は、低用量条件又はアクチビンA無しの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンAの存在下で分化されるhESCからのCXCR4+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内胚
葉である集団を生じることを示す。
CXCR4を使用した細胞集団における胚体内胚葉細胞の定量化
本明細書中ですでに確定されるような、及び2003年12月23日に出願された「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」と題する米国仮特許出願第60/532,004号で測
定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量化を確認するために、CXCR4及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をFACSにより分析した。
いて、選別した細胞集団をQ−PCRにより分析して、胚体及び胚体外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対発現レベルを測定した。最適に分化させた培地から採取されるCXCR4選別した細胞は、98%を超える純度の胚体内胚葉細胞の単離をもたらした。
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製された胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からRNAを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製された集団からのRNAの遺伝子チップ分析により分析した。Q−PCRも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の潜在性をさらに研究した。
てはCXCR4(R&D Systems、cat#FAB170P)を使用して達成された。細胞
は、トリプシン/EDTA(Invitrogen、cat#25300−054)を使用して解離させて、2%ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で洗浄して、氷上で10分間100%ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清800μl中で5×106個の細胞にフィコエリトリン結合抗体200μlを添加
することにより氷上で30分間実施した。細胞をPBS緩衝液8mlで2度洗浄して、同1ml中に再懸濁させた。FACS単離は、FACS Vantage(BD Biosciences)
を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された。細胞は、RLT溶解緩衝液へ直接収集して、RNAは、製造業者の指示書に従ってRNeasy(Qiagen)により単離した。
.0高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して、発現プロフィールデータの作成のためにExpression Analysis(Durham, NC)へ正副2通提出した。提示されたデータは、2つの
集団、すなわちhESCと胚体内胚葉の間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。hESCに見出される発現レベルを上回る発現レベルの頑強な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉の高度に特性化される新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにQ−PCRによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、またhESC分化の経時変化中のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。
レチノイン酸及びFGF−10は、胚体内胚葉培養物において特異的にPDX1を誘導する
以下の実験は、RA及びFGF−10が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を誘導することを実証する。
び50ng/ml FGF−10を細胞培養物へ添加した。RA/FGF−10添加の4
8時間後に、PDX1マーカー遺伝子及び前腸内胚葉に特異的でない他のマーカー遺伝子の発現をQ−PCRにより定量した。
FGF−10は、RA単独を上回るPDX1発現のさらなる増大を提供する
この実施例は、RA及びFGF−10の組合せが、RA単独よりも大いにPDX1発現を誘導することを示す。
−10のいずれかと併用した1μM RA、或いはFGF−4及びFGF−10の両方と
併用した1μM RA。PDX1、SOX7及びNFMの発現は、RA又はRA/FGF
の96時間後に、Q−PCRにより定量された。
レチノイン酸用量は、in vitroで前方−後方(A−P)位置に影響を及ぼす
RAの用量がin vitro細胞培養物のA−P位置に影響を及ぼすかどうかを判定す
るために、以下の実験を実施した。
、またPDX1の最も頑強な増大をもたらした(図38A及び図38B)。RAの中間的な用量(0.2μM)は、中腸内胚葉マーカー(CDX1、HOXC6)を誘導した(図38C及び図41Eを参照)のに対して、RAの最小用量(0.04μM)は、後腸内胚葉のマーカー(HOXA13)を優先的に誘導した(図38Dを参照)。RA用量は、神経(SOX1)又はニューロン(NFM)マーカーのいずれかの相対発現に対して実質的に影響しなかった(図38F及び図38Gを参照)。この実施例は、in vitroで
モルフォゲンとしての、特に分化hESCの内胚葉誘導体のモルフォゲンとしてのRAの使用を強調する。
B27サプリメントの使用は、PDX1の発現を増強する
胚体内胚葉におけるPDX1発現は、多数の因子の使用及び細胞成長/分化状態により影響を与え得る。以下の実験では、B27サプリメントの使用が胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を増強することを示す。
び50ng/ml FGF−10と共に50ng/mlのアクチビンA(無し、+FBS
、+B27)、並びに同様に2%血清代替物(SR)の2μM RA及び50ng/ml FGF−10と共に50ng/mlのアクチビンAのいずれかを施した。B27サプリメント(Gibco/BRL)は、2%FBS/DMEM/F12へ直接1/50希釈として添加した
(+B27)。二重反復細胞サンプルを各点に関して採取して、総RNAを単離して、上述のようにQ−PCRへ付した。
PDX1の誘導を増強するためのアクチビンBの使用
この実施例は、アクチビンBの使用が、in vitro細胞培養物においてPDX1陽
性細胞へのPDX1陰性細胞の分化を増強することを示す。
アクチビンAを添加せずに2%FBS/RPMIを施した。PDX1発現を誘導するために、培養物それぞれに、6日目に2%FBS/RPMI中で2μMにてレチノイン酸を施した。1日目〜5日目にアクチビンAで処置した培養物に、種々の投与組合せのアクチビンA及びアクチビンBを供給したか、或いは50ng/mlでのアクチビンA単独中の状態のままであった。アクチビンA無しの対照培養物(NF)にはアクチビンAもアクチビンBも供給しなかった。このRA/アクチビン処理は3日間実施して、3日目にPDX1遺伝子発現を二重反復細胞サンプルからのQ−PCRにより測定した。
PDX1の誘導を増強するための血清用量の使用
胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現は、分化プロセス全体にわたって細胞培養物中に存在する血清の量により影響を受ける。以下の実験は、PDX1陰性胚体内胚葉へのhESCの分化中の培養物における血清のレベルが、PDX1陽性内胚葉へのこれらの細胞のさらなる分化中のPDX1の発現に影響したことを示す。
PDX1の誘導を増強するための条件培地の使用
また、胚体内胚葉細胞におけるPDX1の発現に影響を与える他の因子及び成長条件を研究した。以下の実験は、PDX1陽性内胚葉細胞へのPDX1陰性胚体内胚葉細胞の分化に対する条件培地の影響を示す。
PDX1へ結合する抗体の確証
PDX1へ結合する抗体は、細胞集団におけるPDX1発現の誘導をモニタリングするための有用なツールである。この実施例は、PDX1に対するウサギポリクローナル抗体及びIgY抗体を使用して、このタンパク質の存在を検出することができることを示す。
細胞可溶化物は、SDS−PAGEにより分離して、エレクトロブロッティングにより膜へ転写して、その後IgY α−PDX1一次抗血清で、それに続いてアルカリホスファ
ターゼ結合ウサギ抗IgY(Rb α−IgY)二次抗体でプロービングした。一次抗体
及び二次抗体の種々の希釈は、細長い膜を分離するために以下の組合せで適用した:A(500倍一次希釈、10,000倍二次希釈)、B(2,000倍、10,000倍)、C(500倍、40,000倍)、D(2,000倍、40,000倍)、E(8,000倍、40,000倍)。
抗体の結合を免疫組織化学により試験した。かかる実験用のPDX1発現細胞を産生するために、MS1−V細胞(ATCC#CRL−2460)をPDX1−EGFPの発現ベクター(pEGFP−N1(Clontech)を用いて構築した)で一過的にトランスフェクトした。続いて、トランスフェクトした細胞をRb α−PDX1及びα−EGFP抗血清で
標識した。トランスフェクトした細胞は、Cy5結合二次抗体の使用によるEGFP蛍光並びにα−EGFP免疫組織化学の両方により可視化した。PDX1免疫蛍光は、α−Rb Cy3結合二次抗体の使用により可視化した。
ヒト膵臓組織の免疫組織化学
この実施例は、PDX1に対する特異性を有する抗体を使用して、免疫組織化学によりヒトPDX1陽性細胞を同定することができることを示す。
合されたイヌ抗モルモット(D α−GP)二次抗体でインスリンに関して染色した。第
2の実験では、ヒト膵臓の同じパラフィン包埋切片を、1/4000希釈でのIgY α
−PDX1一次抗体で、これに続いて1/300希釈でのAF555へ結合されたRbα−IgY二次抗体でPDX1に関して染色した。第1の実験及び第2の実験から収集した画像を併せた。第3の実験では、また、IgY α−PDX1抗体で染色した細胞をDA
PIでも染色した。
レチノイン酸処理細胞からのPDX1の免疫沈降
RAの存在下で分化させた胚体内胚葉細胞におけるPDX1発現、及びRAを用いて分化させなかった胚体内胚葉細胞におけるPDX1の欠如をさらに確認するために、ウサギ抗PDX1(Rb α−PDX1)抗体を使用して、RA分化させた胚体内胚葉細胞及びR
A分化させていない胚体内胚葉細胞の両方からPDX1を免疫沈降させた。免疫沈降させたRAは、IgY α−PDX1抗体を使用してウェスタンブロット分析により検出した
。
−PDX1及びウサギ特異的二次抗体を各可溶化液へ添加することにより免疫沈降させた。沈降物を遠心分離により収集した。免疫沈降物をSDS含有緩衝液中に溶解させた後、ポリアクリルアミドゲル上へ負荷した。分離後、タンパク質をエレクトロブロッティングにより膜へ転写し、その後IgY α−PDX1一次抗体、これに続いて標識Rb α−IgY二次抗体でプロービングした。
PDX1プロモーター−EGFPトランスジェニックhESC系の生成
細胞単離に関してPDX1マーカーを使用するために、本発明者等は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を発現可能なレポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けした。この実施例は、PDX1調節領域の制御下でレポーター遺伝子を含有するレポーターカセットを含むベクターの構築について記載する。この実施例はまた、このベクターでトランスフェクトした細胞(例えば、ヒト胚性幹細胞)、並びにそのゲノムに組み込まれたこのレポーターカセットを有する細胞の調製について記載する。
PDX1陽性前腸内胚葉の単離
以下の実施例は、PDX1プロモーター/EGFPカセットを含むhESCがPDX1陽性内胚葉細胞へ分化され得て、これに続いて蛍光標示式細胞分取器(FACS)により単離され得ることを実証する。
プルが、EGFPに関してゲーティングすることなく採取され(Live)、単一の生細胞は、EGFP陽性(GFP)及びGFP陰性(Neg)集団へゲーティングされた。一実験では、EGFP陽性分画は、蛍光強度に従って2つの同様のサイズの集団に分離された(Hi及びLo)。
DNAへ変換された。Q−PCRは、上述したように実施した。免疫組織化学分析に関して、細胞をPBS中に選別して、4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定して、Cytospin遠心分離機を使用してスライドガラス上へ接着させた。サイトケラチン19(KRT19)に対する一次抗体はChemicon製であり、肝細胞核因子3β(HNF3β)に対する一次抗体はSanta Cruz製であり、グルコーストランスポーター2(GLUT2)に対する一次抗体はR&D systems製であった。FITC(緑色)又はローダミン(赤色)に結合させた適切な二次抗体を使用して、一次抗体の結合を検出した。
マウス腎臓被膜下のヒト胚体内胚葉細胞の移植
本明細書中に記載される方法を用いて産生されたヒト胚体内胚葉細胞が、腸管由来の細胞を産生するよう分化因子に応答し得ることを実証するために、このようなヒト胚体内胚葉細胞をin vivo分化プロトコールに付した。
を屠殺し、移植組織を取り出して、切片にして、組織学的及び免疫細胞化学的分析に付した。
in vitroでヒト胚体内胚葉細胞の分化を促進することが可能な分化因子の同定
本明細書中に記載する分化因子のスクリーニング方法を例証するために、様々な時点で或る特定のマーカー遺伝子産物の標準化した発現レベルを測定しながら、本明細書中に記載する方法を使用して産生されるヒト胚体内胚葉細胞の集団に、いくつかの候補分化因子を別個に供給した。
葉細胞の分化最終形に影響を及ぼし得ることを示す。
候補分化因子に応答したマーカーアップレギュレーション及びダウンレギュレーション
本明細書中に記載する分化因子スクリーニング方法をさらに例証するために、ヒト胚体内胚葉細胞の集団を、実施例25に記載される手順に類似した手順を使用して候補分化因子
を用いてスクリーニングした。
P7A)、チロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)、肝細胞核因子4a(HNF4a)、CXC型ケモカイン受容体4(CXCR4)、フォンウィルブランド因子(VWF)、血管細胞接着分子−1(VACM1)、アポリポタンパク質A1(APOA1)、グルコーストランスポーター−2(GLUT2)、α−1−アンチトリプシン(AAT)、グルコキナーゼ(GLUKO)及びヒト造血発現ホメオボックス(hHEX)に関するマーカー遺伝子産物(mRNA)の発現を、Q−PCRを使用して定量した。
た胚体内胚葉細胞培養物においてモニタリングされた。上記の結果と一致して、図52H〜図52Jは、GLUT2、APOA1及びVCAM1 mRNA発現が、胚体内胚葉に
おける発現と比較して、9日目及び10日目に5ng/mlでのFGF2及びBMP4の組合せに応答して増大されたことを示す。これらのマーカーに関するmRNA発現は、100ng/mlでのFGF2及びBMP4の組合せに応答して実質的に増大されなかった。APOA1及びVCAM1マーカーmRNAの場合、9日目及び10日目の発現の最大の増大は、Wnt3A及びBMP4の組合せにより媒介された(図52I及び図52J)。
多数の文献及び特許参考文献を、本特許出願中で引用してきた。
Claims (17)
- 血清を含む培地中にヒト胚体内胚葉細胞及びアクチビンAを含むインビトロ細胞培養物であって、該培地の5%(v/v)未満が血清であり、該培地は無血清ではない、細胞培養物。
- 前記培地がTGFβスーパーファミリー成長因子をさらに含む、請求項1に記載の細胞培養物。
- 前記培地がWntファミリー成員をさらに含む、請求項1または2に記載の細胞培養物。
- 前記Wntファミリー成員がWnt3aである、請求項3に記載の細胞培養物。
- 前記培地の2%(v/v)未満が血清である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記培地の0.2%(v/v)未満が血清である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 前記培地が血清代替物を含まない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞培養物。
- 以下の工程(a)を含む請求項1に記載の細胞培養物を産生する方法。
(a)血清及びアクチビンAを含む増殖培地中でヒト多能性細胞の集団を培養してヒト胚体内胚葉細胞を産生する工程であって、該増殖培地の5%(v/v)未満が血清であり、該増殖培地は無血清ではない、工程。 - 前記増殖培地が血清代替物を含まない、請求項8に記載の方法。
- 前記増殖培地がノーダル及びアクチビンBからなる群より選択されるTGFβスーパーファミリー成長因子をさらに含む、請求項8または9に記載の方法。
- 前記増殖培地中に少なくとも10ng/mlのアクチビンAが存在する、請求項8〜10
のいずれか1項に記載の方法。 - 前記増殖培地中に少なくとも100ng/mlのアクチビンAが存在する、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増殖培地がさらにWntファミリー成員を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Wntファミリー成員がWnt3aである、請求項13に記載の方法。
- 前記増殖培地が2%(v/v)未満の血清を含む、請求項8〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増殖培地が0.2%(v/v)未満の血清を含む、請求項8〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、分化の最初の3日間にわたり0.5〜2.0%(v/v)の血清グラジエントで前記ヒト多能性細胞を培養することを含む、請求項8〜16のいずれか1項に記載の方法。
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