MX2007000318A - Metodos para identificar factores para diferencoar endodermo definitivo. - Google Patents

Metodos para identificar factores para diferencoar endodermo definitivo.

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Amour Kevin Allen D
Alan D Agulnick
Emmanuel Baetge
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Abstract

Se revelan metodos para identificar uno o mas factores de diferenciacion que son utiles para diferenciar celulas en una poblacion celular que comprende celulas de endodermo definitivo a celulas que son capaces de formar tejidos y/u organos que son derivados del tubo digestivo intestinal.

Description

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR FACTORES PARA DIFERENCIAR ENDODERMO DEFINITIVO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con los campos de medicina y biología celular. La presente invención es concerniente con la identificación de factores que son útiles para diferenciar células de endodermo definitivo a otros tipos de células .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células de tallo pluripotente humanas, tales como células de tallo embriónico (ES) y células de germen embriónico (EG) , fueron aisladas por primera vez en cultivo sin alimentadores de fibroblasto en 1994 (Bongso et al., 1994) y con alimentadores de fibroblasto (Hogan, 1997) . Más tarde, Thomson, Reubinoff y Shamblott establecieron cultivos continuos de células ES y EG humanas utilizándose capas alimentadores de ratón inactivadas mitóticamente (Reubinoff et al., 2000; Shamblott et al., 1998; Thomson et al., 1998). Las células de ES y EG humanas ofrecen oportunidades únicas para investigar etapas prematuras de desarrollo humano también como para intervención terapéutica en varios estados de enfermedad, tales como diabetes mellitus y enfermedad de Parkinson. Por ejemplo, el uso de células ß productoras de insulina derivadas de hESC ofrecerían una vasta mejora con respecto a los procedimientos de terapia celular actuales que utilizan células de pancreasas donadoras para tratamiento de diabetes. Sin embargo, actualmente no es conocido como generar una célula ß productora de insulina a partir de hESC. Como tal, los tratamientos de terapia celular actuales para diabetes mellitus, que utilizan células de isleta de pancreasas donadoras, están limitadas por la escasez de células de isleta de alta calidad necesarias para el transplante. La terapia celular para un solo paciente con diabetes Tipo I requiere un transplante de aproximadamente '8 ' x 108 células de isleta pancreáticas (Shapiro et al., 2000;' Shapiro et al., 2001a; Shapiro et al., 2001b) . Como tal, por lo menos dos órganos donadores saludables son requeridos para obtener células de isleta suficientes para un transplante exitoso. Las células de tallo embriónico humano ofrecen una fuente de material de partida del cual se pueden desarrollar cantidades sustanciales de células diferenciadas de alta calidad para terapias de célula humana . Dos propiedades que hacen a las hESC apropiadas de manera única a las aplicaciones de terapia celular son la pluripotencia y la capacidad de mantener estas células en cultivo en periodos prolongados. La pluripotencia es definida por la capacidad de las hESC para diferenciar a derivados de todas las 3 capas germen primarias (endodermo, mesodermo, ectodermo) que a su vez forman todos los tipos de células somáticas del organismo maduro además de tejidos extraembriónicos (por ejemplo placenta) y células germinales. Aunque la pluripotencia imparte utilidad extraordinaria en los hESC, está propiedad también presenta desafíos sónicos para el estudio y manipulación de estas células y sus derivados. Debido a la gran variedad de tipos de células que pueden surgir al diferenciar los cultivos de hESC, la vasta mayoría de tipos de células son producidas a eficiencias muy bajas. Adicionalmente, el éxito en la evaluación de la producción de cualquier tipo de célula dada depende . críticamente de definir marcadores apropiados. La obtención- . de diferenciación dirigida eficiente-1 es de gran importancia para la aplicación terapéutica de las hESC. Con el fin de usar hESC como material de partida para generar células que son útiles en aplicaciones de terapia celular-, sería ventajoso superar los problemas anteriores. Adicionalmente, sería benéfico identificar factores que promueven la diferenciación de células precursoras derivadas de hESC a tipos de células útiles para terapias celulares.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención son concernientes con métodos para identificar uno o más factores de diferenciación que son útiles para diferenciar células en una población celular que comprende células de endodermo PDXl-positivo (que expresa PDXl) y/o células de endodermo PDX1-negativo (células de endodermo que no expresan significativamente PDXl) , tales como células de endodermo definitivo, a células que son útiles para terapia celular. Por ejemplo, algunas modalidades de los métodos descritos en la presente son concernientes con métodos para identificar factores capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo a células que son precursoras para tejidos y/u órganos que incluyen pero no limitados a páncreas, hígado, pulmones, estómago, intestino, tiroides, timo, faringe, vesícula biliar y vejiga" urinaria. En algunas modalidades, tales células precursoras son células de endodermo PDX1-positivo. En otras modalidades, tales células precursoras son células de endodermo que no expresan significativamente PDXl. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, cultivos celulares o poblaciones celulares de células de endodermo definitivo se ponen en contacto o son provistos de otra manera con un factor de diferenciación candidato (prueba) . En modalidades preferidas, las células de endodermo definitivo son células de endodermo definitivo humanas . En modalidades más preferidas, las células de endodermo definitivo humanas son células multipotentes que se pueden diferenciar a células del tubo intestinal u órganos derivados del mismo. En otras modalidades de los métodos descritos en la presente, cultivos celulares o poblaciones celulares de células de endodermo PDXl-positivo se ponen en contacto o son provistos de otra manera con un factor de diferenciación candidato. En modalidades preferidas, las células de endodermo PDXl-positivo son células de endodermo PDXl-positivo humanas. En ciertas modalidades, las células de endodermo PDXl-positivo humanas son células de endodermo del intestino anterior/intestino medio PDXl-positivo. En modalidades más preferidas, las células de endodermo PDXl-positivo humanas son células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En otras modalidades preferidas, las células de endodermo " PDXl-positivo humanas son células de endodermo PDXl-posi-.tivo de la porción posterior del intestino anterior. En modalidades especialmente preferidas, las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo humanas son células multipotentes que se pueden diferenciar a células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo intestinal. Con respecto a los métodos descritos en la presente, el factor de diferenciación candidato puede ser uno que se sabe que provoca diferenciación celular o uno que no se sabe que provoca diferenciación celular. En ciertas modalidades, el factor de diferenciación candidato puede ser un polipéptido, tal como un factor de crecimiento. En algunas modalidades, el factor de crecimiento incluye pero no está limitado a FGF10, FGF4, FGF2, Wnt3A o Wnt3B. En otras modalidades, el factor de diferenciación candidato puede ser una molécula pequeña. En modalidades particulares, la molécula pequeña es un compuesto retinoide, tal como ácido retinoico. Alternativamente, en algunas modalidades, el factor de diferenciación candidato no es un retinoide, no es un factor de diferenciación del intestino anterior o no es un miembro de la superfamilia TGFß. En otras modalidades, el factor de diferenciación candidato es cualquier molécula diferente a un compuesto retinoide, un factor de diferenciación de intestino anterior o un miembro de la superfamilia de TGFß de factores de crecimiento, tales como activinas A y B. En todavía otras' modalidades, el factor de diferenciación candidato es un factor que no se sabe previamente que provoca la diferenciación de células de endodermo definitivo. Modalidades adicionales de los métodos descritos en la presente son concernientes con pruebas de factor de diferenciación candidatos a una pluralidad de concentraciones. Por ejemplo, un factor de diferenciación candidato puede provocar la diferenciación de células de endodermo definitivo y/o células de endodermo PDXl-positivo solamente a concentraciones por encima de un cierto umbral. Adicionalmente, un factor de diferenciación candidato puede provocar que la misma célula se diferencie a un primer tipo de célula cuando es provisto a una baja concentración y un segundo tipo de célula cuando es provisto a una concentración más alta. En algunas modalidades, el factor de diferenciación candidato es provisto a una o más concentraciones que fluctúan de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 10 mg/ml. Antes de o aproximadamente al mismo tiempo cuando se pone en contacto o de otra manera se proporciona el cultivo celular o población celular que comprende células de endodermo definitivo y/o células de endodermo PDXl-positivo con el factor de diferenciación candidato, por lo menos un marcador es seleccionado y evaluado para determinar su expresión. Esta etapa puede ser denominada como la primera etapa de evaluación del marcador. Alternativamente, esta etapa puede ser determinada como la determinación de . la expresión de - un marcador en un primer punto en el tiempo.- El marcador puede ser cualquier marcador que es útil para verificar la diferenciación celular, sin embargo, los marcadores preferidos incluyen, pero no están limitados a, región determinante de sexo Y-box 17 (SOX17), factor-1 de caja omiótica pancreática-duodenal (PDXl), albúmina, antígeno específico de hepatocito (HAS) , caja omiótica 1 prospero-relacionada (PROX1) , factor 1 de transcripción de tiroides (TITF1) , villina, alfa fetoproteína (AFP) , citocromo P450 7A (CYP7A) , tirosina aminotransferasa (TAT) , factor 4a nuclear de hepatocito (HNF4a) , receptor 4 de quimiocina tipo CXC (CXCR4) , factor de von Willebrand (VWF), molécula-1 de ' adhesión celular vascular (VACM1) , apolipoproteína Al (APOA1) , transportador-2 de glucosa (GLUT2) , alfa-1-antitripsina (AAT) , glucocinasa (GLUKO) , y caja omiótica expresada hematopoyéticamente humana (hHEX) y CDX2. Después que ha transcurrido un tiempo suficiente desde el contacto o de otra manera la provisión de cultivo celular o publicación celular que comprende células de endodermo definitivo y/o células de endodermo PDXl-positivo con el factor de diferenciación candidato, la expresión del por lo menos un marcador en el cultivo celular o población celular es evaluada otra vez. Esta etapa puede ser determinada como la segunda etapa de evaluación del marcador. Alternativamente, esta etapa puede ser determinada como determinación de la expresión de un marcador en un segundo punto en el tiempo. En. modalidades preferidas, el marcador evaluado en los primeros y segundos puntos en el tiempo es el mismo marcador. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, se determina además si la expresión de por lo menos un marcador en el segundo punto en el tiempo se ha incrementado o disminuido, en comparación con la expresión de este marcador en el primer punto en el tiempo. Un incremento o disminución en la expresión del por lo menos un marcador indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo y/o las células de endodermo PDXl-positivo. Un tiempo suficiente entre contacto o de otra manera la provisión de un cultivo celular o población celular que comprende células de endodermo definitivo y/o células de endodermo PDXl-positivo con el factor de diferenciación candidato y determinación de la expresión del por lo menos un marcador en el segundo punto en el tiempo puede ser tan poco como de aproximadamente 1 hora a tanto como aproximadamente 10 días. En algunas modalidades, la expresión del por lo menos un marcador es evaluada múltiples veces subsecuente al contacto o de otra manera la provisión del cultivo celular o población celular que comprende células de endodermo definitivo y/o células de endodermo PDXl-positivo con el factor de diferenciación candidato. En ciertas modalidades, la expresión del marcador es evaluada mediante Q-PCR. En otras modalidades, la expresión del marcador es evaluada mediante inmunocitoquímica. Modalidades adicionales de la presente invención son concernientes con un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En tales métodos, clase de endodermo definitivo PDXl-negativo se pone en contacto con un factor de diferenciación candidato y se determina si la expresión PDXl en la población celular después del contacto con el factor de diferenciación candidato se ha incrementado en comparación con la expresión de PDXl en la publicación celular antes del contacto con el factor de diferenciación candidato. Un incremento en la expresión de PDXl en la población celular indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo del intestino anterior PDXl-positivo. En algunas modalidades, la expresión de PDXl es mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (Q-PCR) . Algunas modalidades del método anterior comprenden además la etapa de determinar la expresión del gen HOXA13 y/o el gen HOXC6 en la población celular antes y después del contacto con el factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades, el factor de diferenciación candidato es una molécula pequeña, por ejemplo un retinoide, tal como RA. En 'otras, el factor de diferenciación candidato es un pollpéptido, - por ejemplo un factor de crecimiento, tal como FGF-10. Todavía otras modalidades de la presente invención - son concernientes con un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En tales métodos, células de endodermo de intestino anterior PDXl- positivo se ponen en contacto con un factor de diferenciación candidato y se determina si la expresión de un marcador en la población es incrementada o disminuida después del contacto con el factor de diferenciación candidato, en comparación con la expresión del mismo marcador en la población antes del contacto con el factor de diferenciación candidato. Un incremento o disminución en la expresión del marcador indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En algunas modalidades, la expresión del marcador es determinada mediante Q-PCR. En algunas modalidades, el factor de diferenciación candidato es una molécula pequeña, por ejemplo un retinoide, tal como RA. En otras, el factor de diferenciación candidato, por ejemplo, un factor de crecimiento, tal como FGF-10. Todavía otras modalidades de la presente invención son concernientes con células diferenciadas mediante los métodos descritos en la presente. Tales células incluyen pero no están limitadas a precursores del páncreas, higado, pulmones, estómago, intestino, tiroides, timo, faringe, vesícula biliar y vejiga urinaria. En algunas modalidades, las células pueden ser diferenciadas terminalmente. Otras modalidades descritas en la presente son concernientes con cultivos celulares y/o poblaciones celulares que comprenden las células descritas anteriormente. En ciertas jurisdicciones, puede no haber alguna definición aceptada en general del término ??que comprende". Como se usa en la presente, el término "que comprende" pretende representar un lenguaje "abierto" que permite la inclusión de cualesquier elementos adicionales. Con esto en mente, modalidades adicionales de la presente invención son descritas con referencia a los párrafos enumerados a continuación: 1. Un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo humanas, en una población celular que comprende células humanas, el método comprende las etapas de: (a) obtener una población celular que comprende células de endodermo definitivo humanas; (b) proporcionar un factor de diferenciación candidato a la población celular; (c) determinar la expresión de un marcador en la población celular en un primer punto en el tiempo; (d) determinar la expresión del mismo marcador en la población celular en un segundo punto en el tiempo, en donde el segundo punto en el tiempo es subsecuente al primer punto' en el tiempo y. en donde el segundo punto .en .el tiempo es subsecuente a la provisión de la población celular con el factor de diferenciación candidato; y (e) determinar si la expresión del marcador en la población celular en el segundo punto en el tiempo es incrementada o disminuida, en comparación con la expresión del marcador en la población celular en el primer punto en el tiempo, en donde un incremento o disminución en la expresión del marcador en la población celular indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo humanas . 2. El método del párrafo 1, en donde las células de endodermo definitivo humanas comprenden por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas en la población celular. 3. El método del párrafo 1, en donde células alimentadoras humanas están presentes en la población celular y en donde por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas diferentes a las células alimentadoras son células de endodermo definitivo . 4. El método del párrafo 1, en donde las células de endodermo definitivo humanas comprenden por lo menos aproximadamente 90% de las células humanas en la población celular. 5. El método del párrafo 1, en donde las células alimentadoras humanas están presentes en la población celular y en donde por lo menos aproximadamente 90% de las células humanas diferentes a las células alimentadoras son células de endodermo definitivo . 6. El método del párrafo 1, en donde las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células, tejidos u órganos derivados del tubo intestinal en respuesta al factor de diferenciación candidato. 7. El método del párrafo 1, en donde las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células precursoras pancreáticas en respuesta al factor de diferenciación candidato. 8. El método del párrafo 7, en donde el marcador es seleccionado del grupo que consiste del factor-1 de caja homeótica pancreática-duodenal (PDXl), caja homeótica Al3 (HOXA13) y caja homeótica C6 (HOXC6) . 9. El método del párrafo 1, en donde las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células precursoras del hígado en respuesta al factor de diferenciación candidato. 10. El método del párrafo 9, en donde el marcador es seleccionado del grupo que consiste de albúmina, caja homeótica 1 prospero-relacionada (PROX1) y antígeno específico de hepatocito (HSA) . 11. El método del párrafo 1, en donde las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células precursoras de pulmón en respuesta al factor de diferenciación candidato . 12. El método del párrafo 11, en donde el marcador es factor 1 de transcripción de tiroides (TITF1) . 13. El método del párrafo 1, en donde las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células precursoras intestinales en respuesta al factor de diferenciación candidato. 14. El método del párrafo 13, en donde el marcador es seleccionado del grupo que consiste de villina y factor 2 de transcripción de caja omiótica tipo caudal (CDX2) . 15. El método del párrafo 1, en donde el primer punto en el tiempo es antes de proporcionar el factor de diferenciación candidato a la población celular. 16. El método del párrafo 1, en donde en primer punto en el tiempo es en aproximadamente el mismo tiempo como la provisión del factor de diferenciación candidato a la población celular. 17. El método del párrafo 1, en donde el primer punto en el tiempo es subsecuente a la provisión del factor de diferenciación candidato a la población celular. 18. El método del párrafo 1, en donde la expresión del marcador es incrementada. 19. El método del párrafo 1, en donde la expresión del marcador es disminuida. ' 20. El método del párrafo 1, en donde la expresión de marcador es determinada mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (Q-PCR) . 21. El método del párrafo 1, en donde la expresión del marcador es determinada mediante inmunocitoquímica. 22. El método del párrafo 1, en donde el marcador es seleccionado del grupo que consiste de factor 1 de caja homeótica pancreática-duodenal (PDXl) , caja homeótica Al3 (HOXA13) y caja homeótica C6 (HOXC6) . 23. El método del párrafo 1, en donde el marcador es seleccionado del grupo que consiste de albúmina, caja homeótica 1 prospero-relacionada (PROXl) y antígeno específico de hepatocito (HSA) . 24. El método del párrafo 1, en donde el marcador es seleccionado del grupo que consiste de villina y factor 2 de transcripción de cada homeótica tipo caudal (CDX2) . 25. El método del párrafo 1, en donde el marcador es 1 de transcripción de tiroides (TITF1) . 26. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende un factor de diferenciación del intestino anterior. 27. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende una molécula pequeña. 28. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende un retinoide. 29. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende ácido retinoico. 30. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende a polipéptido. 31. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende un factor de crecimiento. 32. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende FGF-10. 33. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende FGF-2. 34. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación comprende Wnt3B. 35. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación no es un factor de diferenciación del intestino anterior. 36. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación no es un retinoide. 37. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación no es ácido retinoico. 38. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación es provisto a la población celular a una concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 10 mg/ml . 39. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación es provisto a la población celular a una concentración de entre aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1 mg/ml . 40. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación es provisto a la población celular a una concentración de entre aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 µg/ml. 41. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación es provisto a la población celular a una concentración de entre aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 10 µg/ml. 42. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación es provisto a la población celular a una concentración de aproximadamente 1 µg/ml . 43. El método del párrafo 1, en donde el factor de diferenciación es provisto a la población celular a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml. Se apreciará que los métodos y composiciones descritos anteriormente son concernientes con células cultivadas in vitro. Sin embargo, las composiciones de células diferenciadas in vitro descritas anteriormente pueden ser útiles para aplicaciones in vivo. Modalidades adicionales de la presente invención también se pueden encontrar en la Solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/532,004, intitulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 23 de diciembre de 2003; Solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/566,293, intitulada PDXl EXPRESSING ENDODERM, presentada el 27 de abril de 2004; Solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/586,566, intitulada CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 9 de julio de 2004; Solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/587,942, intitulada CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 14 de julio de 2004; Solicitud de patente estadounidense No. 11/021,618, intitulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 23 de diciembre de 2004, y Solicitud de patente estadounidense No. 11/115,868, intitulada PDXl EXPRESSING ENDODERM, presentada el 26 de abril de 2005.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un esquema de una ruta de diferenciación propuesta para la producción de células beta a partir de hESC. La primera etapa en la ruta compromete a la célula ES al linaje de endodermo definitivo y también representa la primera etapa antes de eventos de diferenciación adicionales a células de endodermo pancreático, endodermo endocrino o células de isleta/beta. La segunda etapa en la ruta muestra la conversión de endodermo definitivo S0X17-positivo/PDXl-negativo a endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Algunos factores .útiles para moderar estas transiciones se muestran en cursivas. Los marcadores relevantes para definir las células objetivo están subrayados. La figura 2 es un diagrama del cADN de SOX17 humano que exhibe las posiciones de porciones conservadas y resalta la región usada para el procedimiento de inmunización mediante GENOVAC . La figura 3 es un diagrama relacional que ilustra que SOX17 está más estrechamente relacionado con SOX7 y un tanto menos a SOX18. Las proteinas SOX17 están más estrechamente relacionadas entre especies homologas que a otros elementos de la subfamilia F de SOX dentro de la misma especie. La figura 4 consiste de bandas de proteína Western blot con el anticuerpo anti-SOX17 de rata. Esta inmunoabsorción demuestra la especificidad de este anticuerpo para proteína SOX17 humana sobreexpresada en fibroblastos (carril 1) y carencia de inmunoreactividad con EGEP (carril 2) o el miembro de familia SOX más estrechamente relacionado SOX7 (carril 3) . Las figuras 5A-B son micrografías que muestran un grupo de células SOX17+ que exhiben un número significativo de células co-marcadas AFP+ (A) . Esto es en contraste con otros grupos S0X174 (B) en donde pocas o ninguna células AFP+ son observadas . Las figuras 6A-C son micrografias que muestran endodermo parietal y S0X17. El panel A muestra inmunocitoquímica para proteína de trombomodulina humana (TM) localizada sobre la superficie celular de células de endodermo parietales en cultivos diferenciados aleatoriamente de células hES . El panel B es el campo idéntico mostrado en A doble marcado para TM y SOX17. El panel C es la imagen de contraste de fase del mismo campo con núcleos marcados con DAPI . Nótese la correlación completa de núcleos marcados con DAPI y la marcación SOX17. Las figuras 7A-B son diagramas de barras que muestran la expresión del gen SOX17 mediante PCR cuantitativa (Q-PCR) y células positivas anti-SOX17 mediante anticuerpo SOX17-específico. El panel A muestra que la activina A incrementa la expresión del gen SOX17 en tanto que el ácido retinoico (RA) suprime fuertemente la expresión de SOX17 en relación con medios de control sin diferenciar (SR20) . El panel B muestra el patrón idéntico también como una magnitud similar de estos cambios es reflejada en el número de células S0X17+, indicando que la medición de Q-PCR de la expresión del gen S0X17 es muy reflejante de cambios a nivel celular individual. La figura 8A es un diagrama de barras que muestra que un cultivo de hESC de diferenciación en presencia de activina A mantiene un bajo nivel de expresión de gen AFP en tanto que se permite que las células se diferencien aleatoriamente en suero bovino fetal al 10% (FBS) que exhibe una fuerte regulación ascendente de AFP. La diferencia en valores de expresión es aproximadamente 7 veces. Las figuras 8B-C son imágenes de dos micrografías que muestran la supresión de expresión de AFP mediante activina es también evidente a nivel de célula individual tal como se indica por los grupos muy raros y pequeños de células AFP+ observadas en condiciones de tratamiento con activina A (fondo) en relación con FBS al 10% solo (parte superior) . Las figuras 9A-B son imágenes comparativas que muestran la cuantificación de número de célula AFP+ utilizando citometría de flujo. Esta figura demuestra que la magnitud de cambio en la expresión de gen AFP (figura 8A) en presencia (panel derecho) y ausencia (panel izquierdo) de activina A corresponde exactamente al número de células AFP+, apoyando adicionalmente la utilidad de análisis de Q-PCR para indicar cambios que ocurren a nivel de célula individual.
Las figuras 10A-F son micrografías que muestran que la exposición de hESC a activina A nodal y activina B (NAA) produce un gran incremento en el número de células S0X17+ en el período de cinco días (A-C) . Al comparar la abundancia relativa de células S0X17+ al número total de células presentes en cada campo, tal como se indica por los núcleos teñidos por DAPI (D-F) , se puede ver que aproximadamente 30-50% de todas las células son inmunoreactivas para S0X17 después de cinco días de tratamiento con NAA. ' . " ' -La figura 11 es un diagrama de barras que demuestra que la activina A (0, 10, 30 o 100 ng/ml) incrementa dependientemente de la dosis la expresión del gen S0X17 en. la diferenciación de hESC. La expresión incrementada es ya robusta después de 3 días de tratamiento sobre cultivos adherentes y continúa a través de los 1, 3 y 5 días subsecuentes del cultivo de suspensión también. Las figuras 12A-C son diagramas de barras que demuestran el efecto de la activina A sobre la expresión de MIXL1 (panel A) , GATA4 (panel B) y HNF3b (panel C) . También se observan incrementos dependientes de la dosis de activina A para otros tres marcadores de endodermo definitivo; MIXL1, GATA4 y HNF3b. Las magnitudes de expresión incrementada en respuesta a la dosis de activina son fuertemente similares a aquellas observadas para S0X17, indicando fuertemente que la activina A está especificando una población de células que co-expresan todos los cuatro genes (S0X17+, MIXL1+, GATA4+ y HNF3b+) . Las figuras 13A-C son diagramas de barras que demuestran el efecto de la activina A sobre la expresión de AFP (panel A) , S0X7 (panel B) y SPARC (panel C) . Hay una disminución dependiente de la dosis de activina A en la expresión del marcador AFP de endodermo visceral. Los marcadores de endodermo primitivo (S0X7) y endodermo parietal (SPARC) permanecen ya sea sin cambios o exhiben supresión en algunos puntos en el tiempo indicando que la activina A no actúa -para especificar estos tipos de célula de endodermo extra-embriónicos . Esto soporta adicionalmente el hecho de que le expresión incrementada de S0X17, MIXL1, GATA4, y HNF3b son debidos a un incremento en el número de células de endodermo definitivo en respuesta a activina A. Las figuras 14A-B son diagramas de barras que muestran el efecto de la activina A sobre ZIC1 (panel A) y expresión de braquiuria (panel B) . La expresión consistente del marcador neural ZIC1 demuestra que no hay efecto dependiente de la dosis de activina A sobre la diferenciación neural. Hay una supresión notable de diferenciación de mesodermo moderada por 100 ng/ml de tratamiento de activina A tal como se indica por la expresión disminuida de braquiuria. Esto es probablemente resultado de la especificación incrementada de endodermo definitivo de los precursores de mesoendodermo. Los niveles más bajos de tratamiento de activina A (10 y 30 ng/ml) mantienen la expresión de braquiuria en puntos en el tiempo más tarde de diferenciación en relación con cultivos de control sin tratar. Las figuras 15A-B son micrografías que muestran diferenciación de endodermo parietal disminuida en respuesta al tratamiento con activinas. Regiones de endodermo parietal TMhl son encontradas a través del cultivo (A) cuando son diferenciadas en suero solo, en tanto que la diferenciación a células TM+ es escasa cuando se incluyen activinas (B) y la intensidad-global de inmunoreactividad TM es más baja." .Las figuras 16A-D son micrografías que muestran la expresión del .marcador en respuesta al tratamiento con activina A y activina B. los hESC fueron tratados por cuatro días consecutivos con activina A y activina B y triplemente marcados con SOX17, AFP y anticuerpos TM. Panel A - S0X17; panel B -AFP; panel C - TM; y panel D - fase/DAPI. Nótense las numerosas células positivas SOX17 (A) asociadas con la ausencia completa de AFP (B) e inmunoreactividad TM (C) . La figura 17 es una micrografía que muestra la apariencia de endodermo definitivo y endodermo visceral in vitro de hESC. Las regiones de endodermo visceral son identificadas por APFhl/SOX17lo _ en tanto que el endodermo definitivo muestra el perfil opuesto completo, SOX17hl/AFPlo ". Este campo fue escogido selectivamente debido a la proximidad de estas dos regiones entre sí. Sin embargo, hay numerosas veces cuando se observan regiones S0X17hl/AFPlo _ en aislamiento absoluto de cualesquier regiones de células AFPhl que sugieren el origen separado de las células de endodermo definitivo de células de endodermo viscerales. La figura 18 es un diagrama que ilustra la familia TGFß de ligandos y receptores . Los factores que activan AR S ads y BR Smads son útiles en la producción de endodermo definitivo a partir de células de tallo embriónico humano (véase, J Cell Physiol. 187:265-76). La figura 19 es un diagrama- dé barras que muestra la inducción de expresión de SOX17 co? respecto al tiempo como resultado del tratamiento con factores de TGFß individuales y combinaciones de factores TBFß. La figura 20 es una gráfica de barras que muestra el incremento en el número de células SOX17+ con el tiempo como resultado del tratamiento con combinaciones de factores TGFß. La figura 21 es una gráfica de barras que muestra la inducción de expresión de SOX17 con respecto al tiempo como resultado del tratamiento con combinaciones de factores TGFß. La figura 22 es una gráfica de barras que muestra que la activina A induce un incremento dependiente de la dosis en el número de células S0X17+. La figura 23 es un gráfica de barras que muestra que la adición de Wnt3a a cultivos tratados con activina A y activina B incrementa la expresión de S0X17 por encima de los niveles inducidos por activina A y activina B solos. Las figuras 24A-C son gráficas de barras que muestran que la diferenciación a endodermo definitivo es mejorada en condiciones de bajo contenido de FBS. El tratamiento de hESC con activinas A y B en medios que contienen FBS al 2% (2AA) produce un nivel 2-3 veces mayor de expresión de S0X17 en comparación con el mismo tratamiento en medios de FBS al 10% (10AA) (panel A) . La inducción del marcador de endodermo definitivo MIXLl (panel B) es también afectada de la misma manera y la supresión de AFP (endodermo visceral) (panel C) es mayor en FBS al 2% que en condiciones de FBS al 10%. Las figuras 25A-D son micrografías que muestran que las células S0X17+ se están dividiendo en el cultivo. Células inmunoreactivas SOX17 están presentes en el borde de diferenciación de una colonia de hESC (C, D) y son marcadas con antígeno nuclear de célula proliferante (PCNA) (panel B) todavía no están co-marcadas con OCT4 (panel C) . Además, figuras mitóticas claras se pueden ver mediante marcación de DAPI de núcleos tanto en células S0X17+ (flechas) también como OCT4+, hESC sin diferenciar (cabezas de flecha) (D) . La figura 26 es una gráfica de barras que muestra el nivel de expresión relativo de CXCR4 en la diferenciación de hESC bajo varias condiciones de medios. Las figuras 27A-D son gráficas de barras que muestran como un pone de marcadores de endodermo definitivo comparten un patrón muy similar de expresión a CXCR4 a través de los mismos tratamientos de diferenciación mostrados en la figura 26. Las figuras 28A-E son gráficas de barras que muestran como los marcadores para mesodermo (BRACHYURY, MOXl) , ectodermo (S0X1, ZICl) y endodermo visceral (S0X7) exhiben una relación inversa de expresión de CXCR4 a través de los mismos tratamientos mostrados en la figura 26. Las figuras 29A-F son micrografías que muestran la diferencia- -relativa en células inmunoreactivas SOX17 a través de tres de las condiciones de medios mostradas en las figuras 26-28. Las figuras 30A-C son gráficas de puntos de citometría de flujo que demuestra el incremento del número de células CXCR4+ con la concentración incrementada de activina A agregada a los medios de diferenciación. Las figuras 31A-D son gráficas de barras que muestran que las células CXCR4+ aisladas del tratamiento con activina A de alta dosis (A100-CX+) son aún enriquecidas adicionalmente para marcadores de endodermo definitivo que la población original (A100) . La figura 32 es una gráfica de barras que muestra la expresión genérica de células CXCR4+ y CXCR4" aisladas utilizando clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) también como la expresión genética en las poblaciones originales. Esto demuestra que las células de CXCR4+ contienen esencialmente toda la expresión genética de CXCR4 presente en cada población original y las poblaciones CXCR4" contienen muy poco o no contienen expresión genética CXCR4. Las figuras 33A-D son gráficas de barras que demuestran el agotamiento de expresión genética de mesodermo (BRACHYURY, MOXl), ectodermo (ZIC1) y endodermo visceral (S0X7) en las células CXCR4+ aisladas del tratamiento con activina A de alta dosis que ya es suprimida en la expresión de estos marcadores -de endodermo no definitivos. Las figuras 34A-M son gráficas de barras que muestran los patrones de expresión de genes de marcador que pueden ser usados para identificar células- de endodermo definitivo. El análisis de expresión de marcadores de endodermo definitivo, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKOR1 y CRIPl es mostrado en los paneles G-L, respectivamente. El análisis de expresión de genes de marcación de linaje descritos previamente, SOX17, SOX7, SOX17/SOX7, TM, ZIC1, y MOXl es mostrado en los paneles A-F, respectivamente. El panel M muestra el análisis de expresión de CXCR4. Con respecto a cada uno de los paneles A-M, la columna marcada hESC indica expresión genética de células de tallo embriónico humano purificadas; 2NF indica células tratadas con FBS al 2%, sin adición de activina; 0.1A100 indica células tratadas con FBS al 0.1%, 100 ng/ml de activina; 1A100 indica células tratadas con FBS al 1%, 100 ng/ml de activina A; y 2A100 indica células tratadas con FBS al 2%, 100 ng/ml de activina A. La figura 35 es una gráfica que muestra la expresión relativa del gen PDXl en un cultivo de hESC después de 4 días y seis días con y sin activina en presencia de ácido retinoico (RA) y factor-10 de crecimiento de fibroblasto (FGF-10) agregado en el día 4. Las figuras 36A-F son gráficas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESC después de 4 días y 6 días con y sin activina en presencia de ácido • retinoico (RA) y factor-10 de crecimiento de fibroblasto (FGF-10) agregado el día 4. Los paneles muestran los niveles relativos de expresión de los siguientes genes marcadores : (A) SOX17; (B) SOX7; (C) AFP; (D) SOX1; (E) ZIC1; y (F) NFM. Las figuras 37A-C son gráficas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESC después de 4 días y 8 días con y sin activina en presencia o ausencia de combinaciones de ácido retinoico (RA) , factor-10 de crecimiento de fibroblasto (FGF-10) y factor-4 de crecimiento de fibroblasto (FGF-4) agregado en el dia 4. Los paneles muestran los niveles de expresión relativos de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) SOX7; y (C) NFM. Las figuras 38A-G son gráficas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de células de endodermo definitivo puestas en cinético con 50 ng/ml de FGF-10 en combinación con ya sea con ácido retinoico (RA) 1 µM, 0.2 µM o 0.04 µM agregado en el día 4. Los paneles muestran los niveles de expresión relativos de los siguientes marcadores: (A) PDXl; (B) HOXA3; (C) HOXC6; (D) HOXA13; (E) CDXl; (F) SOXl; y (G) NFM. Las figuras 39A-E son gráficas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESC después de 4 días y 8 días con y sin activina en presencia de combinaciones de ácido retinoico (RA) , factor-10 de crecimiento de -fibroblasto (FGF-10) y uno de los siguientes: reemplazo de sue.ro (-SR) , suero bovino fetal (FBS) ó B27. Los paneles muestran los niveles de expresión relativos de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) S0X7 ; (C) AFP; (D) ZICl; y (E) NFM. Las figuras 40 A-B son gráficas que muestran la expresión relativa de genes marcadores para páncreas (PDXl, HNF6) e hígado (HNF6) en un cultivo de hESC después de 6 días (justo antes de la adición de RA) y a 9 días (tres días después de exposición a RA) . Varias condiciones fueron incluidas para comparar la adición de activina B a dosis de 10 ng/ml (alO) , 25 ng/ml (a25) ó 50 ng/ml (a50) en presencia ya sea de activina A 25 ng/ml (A25) ó 50 ng/ml (A50) . La condición sin activina A o activina B (NF) sirve como el control negativo para endodermo definitivo y la producción de endodermo PDXl-positivo. Los paneles muestran los niveles de expresión relativos de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl y (B) HNF6. Las figuras 41A-C son gráficas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESC con activina A 100 ng/ml (A100) , 50 ng/ml (A50) o sin activina (NF) A a 5 días (justo antes de la adición de ácido retinoico) y a 2, 4 y 6 días después de exposición de RA (día 7, 9 y 11, respectivamente) . El porcentaje de marcación directamente bajo cada barra indica la dosis de FBS durante los días 3-5 de diferenciación. Comenzando en el día 7, las células tratadas con RA (R) --fueron cultivadas en un medio de RPMI que comprende FBS al 0.5%. La concentración de RA fue de "2 µM el día 7, 1 µM el día 9 y 0.2 µM en el día 11. Los paneles muestran los niveles de expresión relativos de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) ZIC1; (C) SOX7. Las figuras 42A-B son gráficas que muestran la expresión relativa de genes marcadores en un cultivo de hESC tratado primero con activina A en bajo contenido de FBS para inducir endodermo definitivo (día 5) y luego con medio nuevo (A25R) que comprende 25 ng/ml de activina A y RA o varios medios acondicionados (MEFCM, CM#2, CM#3 y CM#4) y RA para inducir endodermo que expresa PDXl . La expresión de marcador fue determinada en los días 5, 6, 7, 8 y 9. Los paneles muestran los niveles de expresión relativos de los siguientes genes marcadores: (A) PDXl; (B) CDXl . La figura 43 es una gráfica que muestra la expresión relativa de PDXl en un cultivo de hESC tratado primero con activina A en bajo contenido de FBS para inducir endodermo definitivo y seguido por medio nuevo que comprende activina A y ácido retinoico (A25R) o cantidades variables de R? en medios acondicionados diluidos en medios nuevos. El volumen total de los medios desde 5 ml en todos los casos . La figura 44 es un análisis Western blot que muestra PDXl inmunoprecipitado de células de endodermo definitivo tratada con RA 3 días (d8) y 4 días (d9) después de la adición -= de RA y 50 ng/ml de activina A. . La figura- 45 es una gráfica de resumen que muestra los resultados de una clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS) de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivas marcadas genéticamente con un reportero EGFP bajo el control del promotor PDXl. La figura 46 es una gráfica que muestra los niveles de expresión de PDXl relativos normalizados a genes de mantenimiento para poblaciones clasificadas de células vivas (Live) , células EGFP-negativas (Neg) y células EGFP-positivas (GFP+) . La figura 47 es una gráfica que muestra niveles de expresión de PDXl relativos normalizados a genes de mantenimiento para poblaciones clasificadas de células vivas (Live) , células EGFP-negativas (Neg) , la mitad de la población de células EGFP-positivas que tiene la intensidad de señal de EGFP más baja (Lo) y la mitad de la población de células EGFP-positivas que tiene la intensidad de señal de EGFP más alta (Hi) . Las figuras 48A-E son gráficas que muestran los niveles de expresión relativos normalizados a genes de mantenimiento de cinco marcadores de endodermo pancreáticos en poblaciones clasificadas de células vivas (Live) , Células EGFP-negativas (Neg) y Células EGFP-positivas (GFP+) . Paneles: A -NKX2.2; B - GLUT2; C-HNF3ß; D-KRT1 9 y E-HNF4a. La figura 49. son gráficas que muestran los niveles de expresión relativos normalizados a genes de mantenimiento de dos marcadores de endodermo no pancreáticos en poblaciones clasificadas de células vivas (Live) , células EGFP-negativas (Neg) y células EGFP-positivas (GFP+) . Paneles: A - ZIC1 y B -GFAP . Las figuras 50A-D muestran la diferenciación in vivo de células de endodermo definitivo que son transplantadas bajo la cápsula de riñon de ratones inmunocomprometidos. Paneles: A - teñido con hetatoxilin-eosina que muestra estructuras semejantes a tubo intestinal; B — inmunoreactividad de anticuerpo contra antígeno específico de hepatocito (hígado) ; C-inmunoreactividad de anticuerpo contra villina (intestino) ; y D-inmunoreactividad de anticuerpo contra CDX2 (intestino) . Las figuras 51A-C son gráficas que muestran los niveles de expresión relativos normalizados de marcadores para tejidos de hígado (albúmina y PR0X1) y pulmón (TITF1) en células puestas en contacto con Wnt3B a 20 ng/ml, FGF2 a 5 ng/ml o FGF2 a 100 ng/ml en los días 5-10. DE se refiere a endodermo definitivo. Paneles: A - albúmina, B - PROX1, y C -TITF1. Las figuras 52A-L son gráficas que muestran los niveles de expresión relativos normalizados de marcadores para tejidos de hígado (AFP, AAT, hHEX, GLUT2, APOA1 y VCAM1) y pulmón (VWF y CXR4) en células puestas en contacto con Wnt3A a 20-50 ng/ml, FGF2 a 5 ng/ml o FGF2 a 100 ng/ml en los días 5-10 y BMP4 en; los días .9 y 10. DE se refiere a endodermo definitivo. Paneles: A-AFP, B-AAT, C-GLUKO, D -hHEX, E-TAT, F-hNF4a-, G-CYP7A, H-GLUT2, I-APOAl, J-VCAM1, K-VWF, y L-CXCR4. ' DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una etapa crucial en el desarrollo humano prematuro denominado gastrulación ocurre 2-3 semanas después de la fertilización. La gastrulación es extremadamente significativa debido a que es en este tiempo que las tres capas germinales primarias son especificadas y organizadas primero (Lu et al., 2001; Schoenwolf y Smith, 2000) . El ectodermo es responsable de la formación inevitable de las cubiertas externas del cuerpo y todo el sistema nervioso mientras que el corazo, sangre, hueso, músculo esqueletal y otros tejidos conectivos son derivados del mesodermo. El endodermo definitivo es definido como la capa germinal que es responsable por la formación de todo el tubo intestinal que incluye el esófago, estómago e intestinos delgado y grueso y los órganos que derivan del tubo intestinal tales como los pulmones, higado, timo, paratiroides y glándula tiroides, vesícula biliar y páncreas (Grapin-Botton y Melton, 2000; Kimelman y Griffin, 2000; Tremblay et al., 2000; Wells y Melton, 1999; Wells y Melton, 2000) . Se debe hacer una distinción muy importante entre el endodermo definitivo y el linaje separado completamente de células denominadas endodermo primitivo: -'El endodermo primitivo es responsable principalmente. .de la- formación de tejidos extra-embriónicos, principalmente las porciones . de endodermo parietal y visceral del saco vitelino placental y el material de matriz extracelular de la membrana de Reichert . Durante la gastrulación, el proceso de formación de endodermo definitivo comienza con un evento de migración celular en el cual las células de mesoendodermo (células competentes para formar mesodermo o endodermo) migran a través de una estructura llamada la línea primitiva. El endodermo definitivo es derivado de células que migran a través de la porción anterior de la línea y a través del nodo (una estructura especializada en la región más anterior de la línea) . A medida que la migración ocurre, el endodermo definitivo puebla primero el tubo intestinal más anterior y culmina con la formación del extremo posterior del tubo intestinal . El endodermo definitivo y las células de endodermo derivadas del mismo representa por consiguiente puntos de partida multipotentes importantes para la derivación de células que componen tejidos diferenciados terminalmente y/u órganos derivados del linaje de endodermo definitivo. Tales células tejidos y/u órganos son extremadamente útiles en terapias celulares. Como tal, los métodos descritos en la presente para identificar factores de diferenciación capaces de provocar la diferenciación de células de endodermo definitivo y/o células de endodermo que expresan PDXl a otros tipos de células derivados del linaje de células de endodermo definitivo son benéficos para el avance de terapia celular. En particular, algunas modalidades de la presente invención son concernientes con métodos para identificar uno o más factores de diferenciación que son útiles para diferenciar células en una población de células que comprende células de endodermo PDXl-positivo y/o células de endodermo definitivo a células que son capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo a células que son precursoras para tejidos y/u órganos que incluyen, pero no están limitados a, páncreas, hígado, pulmones, estómago, intestino, tiroides, timo, faringe, vesícula biliar y vejiga urinaria. Aspectos adicionales que son concernientes con composiciones de células de endodermo definitivo, endodermo PDXl-positivo también como métodos y composiciones útiles para producir tales células son también descritos en la presente.
Definiciones Ciertos términos y frases como se usan en toda esta especificación tienen los significados provistos como sigue: Como se usa en la presente, "embriónico" se refiere a un intervalo de etapas de desarrollo de un organismo que comienza con un solo cigoto y que termina con una estructura multicelular que ya no comprende células pluripotentes o totipotentes diferentes a las células gemeticas desarrolladas. Además de los embriones derivados mediante fusión de gamet, el término "embriónico" se refiere a embriones derivados mediante transferencia nuclear celular somática. Como se usa en la presente, "multipotente" o "célula multipotente" se refiere a un tipo de célula que puede dar surgimiento a un número limitado de otros tipos de células particulares . Como se usa en la presente, "expresión" se refiere a the production of a material o sustancia también como el nivel o cantidad de producción de un material o sustancia. Así, la determinación de la expresión de un marcador específico se refiere a la detección ya sea de la cantidad relativa o absoluta del marcador que es expresada o simplemente detectar la presencia o ausencia del marcador.
Como se usa en la presente, "marcador" se refiere a cualquier molécula que puede ser observada o detectada. Por ejemplo, un marcador puede incluir, pero no está limitado a, ácido nucleico, tal como un transcripto de un gen específico, un producto de polipéptido de un gen, un polipéptido de producto no genético, una glicoproteína, un carbohidrato, un glicolípido, un lípido, una lipoproteína, o una molécula pequeña (por ejemplo, moléculas que tienen un peso molecular de menos de 10,000 amu) . - Cuando se usan en relación con cultivos celulares y/o poblaciones celulares, el término "porción" significa cualquier cantidad no cero de cultivo celular o población celular, que fluctúa desde una sola célula a la totalidad del cultivo celular o población de células . Con respecto a células en cultivos celulares o en poblaciones celulares, la frase "sustancialmente libre de" significa que el tipo de célula especificado del cual el cultivo celular o población celular está libre, está presente en una cantidad de menos de aproximadamente 5% del número total de células presentes en el cultivo celular o población celular. Como se usa en la presente, "retinoide" se refiere a retinol, retinal o ácido retinoico también como derivados de cualquiera de estos compuestos. "Medio acondicionado" significa un medio que es alterado en comparación con un medio base.
Como se usa en la presente, "intestino anterior/intestino medio" se refiere a células de la porción anterior del tubo intestinal, en las que se incluyen células de la unión intestino anterior/intestino medio.
Células de endodermo definitivo y procesos concernientes con las mismas Modalidades descritas en la presente son concernientes con nuevos procesos definidos para la producción de células de endodermo. definitivo en cultivo mediante diferenciación de células pluripotentes, tales como células de tallo a células de endodermo definitivo multipotentes . Como se describe anteriormente, las células de endodermo definitivo no se diferencian en tejidos producidos de ectodermo o mesodermo, sino que más bien, se diferencian al tubo intestinal también como órganos que son derivados del tubo intestinal. En ciertas modalidades preferidas, las células de endodermo definitivo son derivadas de hESC. Tales procesos pueden proporcionar la base para la producción eficiente de tejidos derivados de endodermo humano tales como páncreas, hígado, pulmón, estómago, intestino, tiroides y timo. Por ejemplo, la producción de endodermo definitivo puede ser la primera etapa en la diferenciación de una célula de tallo a una célula ß productora de insulina funcional. Para obtener cantidades útiles de células ß productoras de insulina, una alta eficiencia de diferenciación es deseable para cada una de las etapas de diferenciación que ocurren antes de alcanzar el destino de isleta/célula ß pancreática. Puesto que la diferenciación de células de tallo a células de endodermo definitivo representa quizás la etapa más temprana hacia la producción de células de isleta/ß pancreáticas funcionales (como se muestra en la figura 1) , una alta eficiencia de diferenciación en esta etapa es particularmente deseable. En vista del deseo de diferenciación eficiente de células pluripotentes a células de endodermo definitivo, algunos aspectos de los procesos de diferenciación descritos en la presente son concernientes con metodología in vitro que da como resultado aproximadamente 50-80% de conversión de células pluripotentes a células de endodermo definitivo. Comúnmente, tales métodos abarcan la aplicación de cultivo y condiciones de factor de crecimiento en una manera especificada temporalmente y definida. El enriquecimiento adicional de la población celular para células de endodermo definitivo se puede obtener mediante aislamiento y/o purificación de las células de endodermo definitivo de otras células en la población al utilizar un reactivo que se enlaza específicamente a células de endodermo definitivo. Como tal, algunas modalidades descritas en la presente son concernientes con células de endodermo definitivo también como métodos para producir y aislar y/o purificar tales células .
Con el fin de determinar la cantidad de células de endodermo definitivo en un cultivo celular o población de células, un método para distinguir este tipo de células de las otras células en el cultivo o en la población es deseable. Así, ciertas modalidades descritas en la presente son concernientes con marcadores celulares cuya presencia, ausencia y/o niveles de expresión relativa son específicos para endodermo definitivo y métodos para detectar y determinar la expresión de tales marcadores. En algunas modalidades descritas en la presente, la presencia, ausencia y/o nivel de expresión de un marcador es determinado mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) . Por ejemplo, la cantidad de transcripto producido por ciertos marcadores genéticos, tales como SOX17, CXCR4, OCT4, AFP, TM, SPARC, SOX7, MIXLl, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKOR1, CRIP1 y otros marcadores descritos en la presente es determinada mediante Q-PCR cuantitativa. En otras modalidades, se usa inmunohistoquímica para detectar las proteínas expresadas por los genes mencionados anteriormente. En todavía otras modalidades, se usan ambas técnicas de Q-PCR e inmunohistoquímica para identificar y determinar la cantidad o proporciones relativas de tales marcadores. Al utilizar métodos tales como aquellos descritos anteriormente para determinar la expresión de uno o más marcadores apropiados, es posible identificar células de endodermo definitivo, también como determinar la proporción de células de endodermo definitivo en un cultivo celular o población de células. Por ejemplo, en algunas modalidades de la presente invención, las células de endodermo definitivo o poblaciones de células que son producidas expresan el gen S0X17 y/o el gen CXCR4 a un nivel de aproximadamente 2 órdenes de magnitud mayor que los tipos de células o poblaciones de células de endodermo no definitivo. En otras modalidades, las células o poblaciones de células de endodermo definitivo que son -producidas expresan el gen S0X17 y/o' CXCR4 a un nivel de más de 2 órdenes de magnitud mayor que los tipos de célula o poblaciones de células de endodermo no definitivo. En todavía otras modalidades, las células o poblaciones de células de endodermo definitivo que son producidas expresan uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de SOX17, CXCR4, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKOR1 y CRIP1 a un nivel de aproximadamente 2 o más de 2 órdenes de magnitud mayor que los tipos de células o poblaciones de células de endodermo no definitivo. En algunas modalidades descritas en la presente, las células de endodermo definitivo no expresan sustancialmente PDXl. Modalidades descritas en la presente también son concernientes con composiciones de endodermo definitivo. Por ejemplo, algunas modalidades son concernientes con cultivos celulares que comprende endodermo definitivo, mientras que otras son concernientes con poblaciones celulares enriquecidas en células de endodermo definitivo. Algunas modalidades preferidas son concernientes con cultivos celulares que comprenden células de endodermo definitivo, en donde por lo menos aproximadamente 50-80% de las células en el cultivo son células de endodermo definitivo. Una modalidad especialmente preferida es concerniente con cultivos celulares que comprenden células humanas, en donde por lo menos aproximadamente 50-80% de las células humanas en el cultivo son células de endodermo definitivo. Debido a la eficiencia del procedimiento de diferenciación puede ser ajustado al modificar ciertos parámetros, que incluyen pero no están limitados a, condiciones de cultivo celular, concentraciones de factor de crecimiento y la sincronización de las etapas de cultivo, los procedimientos de diferenciación descritos en la presente pueden dar como resultado aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o mayor de aproximadamente 95% de conversión de células pluripotentes a endodermo definitivo. En otras modalidades preferidas, la conversión de una población de células pluripotentes tales como una población de células de tallo, a la población de célula de endodermo definitivo sustancialmente puro es contemplada. Las composiciones y métodos descritos en la presente tienen varios elementos útiles. Por ejemplo, los cultivos celulares y poblaciones de células que comprende endodermo definitivo también como los métodos para producir tales cultivos celulares y poblaciones de células son útiles para el modelado de las etapas prematuras de desarrollo humano. Además, las composiciones y métodos descritos en la presente pueden también servir para intervención terapéutica en . estados de ; enfermedad, tales como diabetes mellitus. Por ejemplo, puesto que el endodermo definitivo sirve como la fuente para solamente un número limitado de tejidos, puede ser usado en el desarrollo de tipos de tejido o células puros.
Producción de endodermo definitivo a partir de células pluripotentes Los procesos para diferenciar células pluripotentes para producir cultivos de células y poblaciones de células enriquecidas que comprenden endodermo definitivo se describen posteriormente en la presente y en la solicitud de patente estadounidense No. 11/021,618, intitulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 23 de diciembre de 2004. En algunos de estos procesos, las células pluripotentes usadas como material de partida son células de tallo. En ciertos procesos, los cultivos de célula de endodermo definitivo y poblaciones de células enriquecidas que comprende células de endodermo definitivo son producidas a partir de células de tallo embriónicos . Un método preferido para derivar células de endodermo definitivo utiliza células de tallo embriónico humanas como el material de partida para la producción de endodermo definitivo. Tales células pluripotentes pueden ser células que se originan de la mórula, masa de célula interna embriónica o aquellas obtenidas a partir de resaltos gonadales embriónicos . .Las células de tallo --. embriónico humanas pueden ser mantenidas en cultivo en estado vpluripotente sin diferenciación sustancial utilizando métodos . .que son conocidos en el arte. Tales métodos son descritos por ejemplo en las patentes estadounidenses Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926 5,843,780, 6,200,806 y 6,251,671. En algunos procesos para producir células de endodermo definitivo, las hESC son mantenidas sobre una capa alimentadora. En tales procesos, cualquier capa alimentadora que permite que las hESC sean mantenidas en estado pluripotente puede ser usada. Una capa alimentadora usada comúnmente para el cultivo de células de tallo embriónico humanas es una capa de fibroblasto de ratón. Más recientemente, capas alimentadoras de fibroblasto humano han sido desarrolladas para uso en el cultivo de hESC (véase Solicitud de patente estadounidense No. 2002/0072117). Procesos alternativas para producir endodermo definitivo permiten el mantenimiento de hESC pluripotente sin el uso de una capa alimentadora. Métodos para mantener hESC pluripotentes bajo condiciones libres de alimentación se han descrito en la Solicitud de patente estadounidense No. 2003/0175956. Las células de tallo embriónico humanas usadas en la presente pueden ser mantenidas en cultivo ya sea con o sin suero. En algunos procedimientos de mantenimiento de célula de tallo embriónico, se usa reemplazo de suero. En otros, técnicas de cultivo libres de suero, tales como aquellas descritas en la Solicitud- :de patente estadounidense No. 2003/0190748, son • usadas . - -.; . -•-. - . Las células de tallo son mantenidas en cultivo en estado pluripotente mediante pasaje de rutina hasta que se desea que sean diferenciadas a endodermo definitivo. En algunos procesos, la diferenciación a endodermo definitivo es obtenida al proporcionar al cultivo de célula de tallo un factor de crecimiento de la superfamilia TGFß en una cantidad suficiente para promover la diferenciación a endodermo definitivo. Factores de crecimiento de la superfamilia TGFß en una cantidad suficiente para promover la diferenciación a endodermo definitivo. Factores de crecimiento de la superfamilia TGFß que son útiles para la producción de endodermo definitivo son seleccionados de los subgrupos nodal/activina o BMP. En algunos procesos de diferenciación preferidos, el factor de crecimiento es seleccionado del grupo que consiste de Nodal, activina A, activina B y BMP . Adicionalmente, el factor de crecimiento Wnt3a y otros miembros de la superfamilia Wnt son útiles para la producción de células de endodermo definitivo. En ciertos procesos de diferenciación, se pueden usar combinaciones de cualquiera de los factores de crecimiento mencionados anteriormente . Con respecto a algunos de los procesos para la diferenciación de clase de tallo pluripotente a células de endodermo definitivo, los factores de crecimiento mencionados anteriormente son provistos a las células de tal manera que los factores de crecimiento están presentes en los cultivos a concentraciones suficientes para promover la diferenciación de por lo menos una porción de las células de tallo a células de endodermo definitivo. En algunos procesos, los factores de crecimiento mencionados anteriormente están presentes en el cultivo celular a una concentración de por lo menos aproximadamente 5 ng/ml, por lo menos aproximadamente 10 ng/ml, por lo menos aproximadamente 25 ng/ml, por lo menos aproximadamente 50 ng/ml, por lo menos aproximadamente 75 ng/ml, por lo menos aproximadamente 100 ng/ml, por lo menos aproximadamente 200 ng/ml, por lo menos aproximadamente 300 ng/ml, por lo menos aproximadamente 400 ng/ml, por lo menos aproximadamente 500 ng/ml, por lo menos aproximadamente 1000 ng/ml, por lo menos aproximadamente 2000 ng/ml, por lo menos aproximadamente 3000 ng/ml, por lo menos aproximadamente 4000 ng/ml, por lo menos aproximadamente 5000 ng/ml o más de aproximadamente 5000 ng/ml. En ciertos procesos para la diferenciación de células de tallo pluripotentes a células de endodermo definitivo, los factores de crecimiento mencionados anteriormente son removidos del cultivo celular subsecuentemente a su adición. Por ejemplo, los factores de crecimiento pueden ser removidos en aproximadamente un dia, aproximadamente dos días, aproximadamente tres días, aproximadamente cuatro días, aproximadamente cinco días, aproximadamente seis días, aproximadamente siete días, - aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días o aproximadamente diez días después de su adición. En procesos preferidos, los factores de crecimiento son removidos aproximadamente cuatro días después de su adición. Los cultivos de células de endodermo definitivo pueden ser cultivados en medio que contiene suero reducido o sin suero. Bajo ciertas condiciones de cultivo, las concentraciones de suero pueden fluctuar de aproximadamente 0.05% volumen/volumen a aproximadamente 20% volumen/volumen. Por ejemplo, en algunos procesos de diferenciación, la concentración en el suero del medio puede ser menor de aproximadamente 0.05% (v/v), menor de aproximadamente 0.1% (v/v), menor de aproximadamente 0.2% (v/v), menor de aproximadamente 0.3% (v/v), menor de aproximadamente 0 . A% (v/v), menor de aproximadamente 0.5% (v/v), menor de aproximadamente 0.6% (v/v), menor de aproximadamente 0.7% (v/v), menor de aproximadamente 0.8% (v/v), menor de aproximadamente 0.9% (v/v), menor de aproximadamente 1% (v/v), menor de aproximadamente 2% (v/v) , menor de aproximadamente 3% (v/v) , menor de aproximadamente 4% (v/v) , menor de aproximadamente 5% (v/v) , menor de aproximadamente 6% (v/v) , menor de aproximadamente 7% (v/v) , menor de aproximadamente 8% (v/v) , menor de aproximadamente 9% (v/v) , menor de aproximadamente 10% (v/v) , menor de aproximadamente 15% (v/v) o menor de aproximadamente 20% (v/v) . En algunos procesos, las células de endodermo definitivo son cultivadas sin suero o con reemplazo de suero. En todavía otros procesos, las células de endodermo definitivo son cultivadas en presencia de B27. En tales procesos, la concentración del complemento B27 puede fluctuar de aproximadamente 0.1% v/v a aproximadamente 20% v/v.
Verificación de la diferenciación de células pluripotentes a endodermo definitivo El avance del cultivo de hESC a endodermo definitivo puede ser verificado al determinar la expresión de marcadores característica del endodermo definitivo. En algunos procesos, la expresión de ciertos marcadores es determinada al detectar la presencia o ausencia del marcador. Alternativamente, la expresión de ciertos marcadores puede ser determinada al medir el nivel al cual el marcador está presente en las células del cultivo celular o población de células. En tales procesos, la medición de la expresión del marcador puede ser cualitativa o cuantitativa. Un método para cuantificar la expresión de marcadores que son producidos mediante genes marcadores es por medio del uso de PCR cuantitativa (Q-PCR) . Métodos para efectuar Q-PCR son bien conocidos en el arte. Otros métodos que son conocidos en el arte pueden también ser usados para cuantificar la expresión del gen marcador. Por ejemplo, la expresión de un producto de gen marcador puede ser detectada al utilizar anticuerpos específicos para el producto de gen marcador de interés. En. ciertos procesos, la expresión de genes marcadores característicos de endodermo definitivo, también como la carencia de expresión significativa de genes marcadores característica de hESC y otros tipos de células es determinada. Como se describe adicionalmente en los ejemplos a continuación, un marcador confiable de endodermo definitivo es el gen S0X17. Como tal, las células de endodermo definitivo producidas por los procesos descritos en la presente expresan el gen marcador SOX17, produciendo mediante esto el producto genético SOX17. Otros marcadores de endodermo definitivo son MIXLl, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMK0R1 y CREP1. Puesto que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador SOX17 a un nivel más alto que aquel del gen marcador SOX7, que es característico del endodermo definitivo y visceral (véase Tabla 1) , en algunos procesos, la expresión de ambos S0X17 y S0X7 es verificada. En otros procesos, la expresión tanto del gen marcador S0X17 y el gen marcador 0CT4, que es característico de hESC, es verificada. Adicionalmente, debido a que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador S0X17 a un nivel más alto que aquel de los genes marcadores AFP, SPARC o trombomodulina (TM) , la expresión de estos genes puede también ser verificada. Otro marcador de endodermo definitivo es el gen CXCR4;; El gen CXCR4 codifica un receptor de quimiocina de superficie celular cuyo -ligando es el quimioatrayente SDF-I . Los papeles principales de. las células que llevan receptor CXCR4 en el adulto en el adulto se cree que es la migración de células hematopoyéticas a la médula ósea, tráfico de linfocitos y la diferenciación de varios linajes de célula B y célula de sangre de macrófago [Kim, C, y Broxmeyer, H. J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)]. El receptor CXCR también funciona como coreceptor para la entrada de HIV-1 a las células T [Feng, Y., et al. Science, 272, 872-877 (1996)]. En una serie extensa de estudios llevados a cabo por [McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)], la expresión del receptor de quimiocina CXCR4 y su ligando único, SDF-I [Kim, C, y Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)], fueron delineados durante el desarrollo prematuro y la vida adulta en el ratón. La interacción CXCR4/SDF1 en el desarrollo se hizo evidente cuando se demostró si ya sea un gen u otro era alterado en el ratón transgénico [Nagasa a et al. Nature, 382, 635-638 (1996)], Ma, Q., et al Immunity, 10, 463-471 (1999)] daba como resultado mortalidad embriónica posterior. McGrath et al. demostraron que CXCR4 es el ARN mensajero receptor de quimiocina más abundante detectado durante los embriones de gastrulación prematura (E7.5) utilizando una combinación de protección de ARNasa y metodologías de hibridización in situ. En el embrio de gastrulación, la señalización de CXCR4/SDF-1 parece estar - -principalmente involucrada en: inducir- migración de células de capa germinal de línea primitiva'-_y es expresada sobre endodermo definitivo, mesodermo y mesodermo extraembriónico presente en este tiempo. En embriones de ratón ?7.2-7.8, CXCR4 y alfa- fetoproteína son indicando carencia de expresión en endodermo visceral [McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999) ] . Puesto que las células de endodermo definitivo producidas mediante diferenciación de células pluripotentes expresan el gen marcador CXCR4, la expresión CXCR4 puede ser verificada con el fin de dar seguimiento a la producción de células de endodermo definitivo. Adicionalmente, células de endodermo definitivo producidas por los métodos descritos en la presente expresan otros marcadores de endodermo definitivo en los que se incluyen, pero no limitados a, S0X17, MDCLl, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKORl y CRIPl. Puesto que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador CXCR4 a un nivel más alto que aquel del gen marcador S0X7, la expresión de tanto CXCR4 y S0X7 puede ser verificada. En otros procesos, se verifica la expresión tanto del gen marcador CXCR4 como del gen marcador 0CT4. Adicionalmente, debido a que las células de endodermo definitivo expresan el gen marcador CXCR4 a un nivel más alto que aquel de los genes marcadores AFP, SPARC o trombomodulina (TM) , la expresión de estos genes puede también ser verificada. - . Se apreciará que expresión, de CXCR4 en las células de - .endodermo no impide la expresión de -S0X17. Como tal, las células de endodermo definitivo producidas mediante los procesos descritos en la presente expresarán sustancialmente S0X17 y CXCR4 pero no expresarán sustancialmente AFP, TM, SPARC o PDXl. Se apreciará que la expresión del marcador S0X17 y/o CXCR4 es inducida en un intervalo de niveles diferentes en células de endodermo definitivo dependiendo de las condiciones de diferenciación. Como tal, en algunas modalidades descritas en la presente, la expresión del marcador SOX1 7 y/o el marcador CXCR4 en células de endodermo definitivo o poblaciones celulares de endodermo definitivo es por lo menos aproximadamente 2 veces más alta a por lo menos aproximadamente 10,000 veces más alta que la expresión del marcador SOX17 marcador y/o el marcador CXCR4 en células de endodermo no definitivas o poblaciones celulares de endodermo no definitivas, por ejemplo células de tallo pluripotentes. En otras modalidades, la expresión del marcador S0X17 y/o el marcador CXCR4 en células o poblaciones celulares de endodermo definitivo es por lo menos aproximadamente 4 veces más alta, por lo menos aproximadamente 6 veces más alta, por lo menos aproximadamente 8 veces más alta, por lo menos aproximadamente 10 veces más alta, por lo menos aproximadamente 15 veces más alta, por lo menos aproximadamente 20 veces más alta, por lo menos., aproximadamente 40 veces más: alta, por lo menos - aproximadamente 80 veces más alta, por :lo menos aproximadamente 100 veces más alta, por lo menos aproximadamente 150 veces más alta, por lo menos aproximadamente 200 veces más alta, por lo menos aproximadamente 500 veces más alta, por lo menos aproximadamente 750 veces más alta, por lo menos aproximadamente 1000 veces más alta, por lo menos aproximadamente 2500 veces más alta, por lo menos aproximadamente 5000 veces más alta, por lo menos aproximadamente 7500 veces más alta o por lo menos aproximadamente 10,000 veces más alta que la expresión de marcador SOX17 y/o marcador CXCR4 en células o poblaciones celulares de endodermo no definitivo, por ejemplo células de tallo pluripotentes. En algunas modalidades, la expresión de marcador SOX17 y/o marcador CXCR4 en células o poblaciones celulares de endodermo definitivo es infinitamente más alta que la expresión del marcador S0X17 y/o el marcador CXCR4 en células o poblaciones celulares de endodermo no definitivo, por ejemplo células de tallo pluripotentes. También se apreciará que en algunas modalidades descritas en la presente, la expresión de marcadores seleccionados del grupo que consiste de GATA4, MIXLl, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMK0R1 y CRIPl en células o poblaciones celulares de endodermo definitivo es incrementada en comparación con la expresión de GATA4, MIXLl, HNF3b, GSC, FGF17, ..- VWF, CALCR, FOXQl, CMKORl - y CRIP1 en' células o poblaciones celulares de endodermo no. definitivo. Adicionalmente, se apreciará que hay un intervalo de diferencias entre el niveles de expresión del marcador de S0X17 y los niveles de expresión de los marcadores 0CT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en células de endodermo definitivo. Similarmente, existe un intervalo de diferencias entre el nivel de expresión del marcador CXCR4 y los niveles de expresión de los marcadores OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en células de endodermo definitivo. Como tal, en algunas modalidades descritas en la presente, la expresión del marcador SOX17 marcador o el marcador CXCR4 es por lo menos aproximadamente 2 veces más alta a por lo menos .aproximadamente 10,000 veces más alta que la expresión de los marcadores OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7. En otras modalidades, la expresión del marcador SOX17 o el marcador CXCR4 es por lo menos aproximadamente 4 veces más alta, por lo menos aproximadamente 6 veces más alta, por lo menos aproximadamente 8 veces más alta, por lo menos aproximadamente 10 veces más alta, por lo menos aproximadamente 15 veces más alta, por lo menos aproximadamente 20 veces más alta, por lo menos aproximadamente 40 veces más alta, por lo menos aproximadamente iO veces más alta, por lo menos aproximadamente 100 veces mas alta, por lo menos aproximadamente 150 veces mas alta, por lo menos aproximadamente 200 veces mas alta, por lo menos - aproximadamente 500 veces mas alta, por lo menos aproximadamente 750 veces más alta, p.or • lo menos aproximadamente 1000 veces más alta, por lo menos aproximadamente 2500 veces más alta, por lo menos aproximadamente 5000 veces más alta, por lo menos aproximadamente 7500 veces más alta o por lo menos aproximadamente 10,000 veces más alta que la expresión de los marcadores OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7. En algunas modalidades, los marcadores OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 no son expresados significativamente en células de endodermo definitivo. También se apreciará que en algunas modalidades descritas en la presente, la expresión de marcadores seleccionados del grupo que consiste de GATA4, MDCLl, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKORl y CRIP1 en células de endodermo definitivo es incrementada en comparación con la expresión de 0CT4, SPARC, AFP, TM y/o S0X7 en células de endodermo definitivo.
Enriquecimiento, aislamiento y/o purificación de endodermo 5 definitivo Las células de endodermo definitivo producidas mediante cualquiera de los procesos descritos anteriormente, pueden ser enriquecidas, aisladas y/o purificadas al utilizar una etiqueta de afinidad que es específica para tales células. 10 Ejemplos de etiquetas de afinidad específicas para células de -•;- endodermo definitivo son anticuerpos, ligandos u otros agentes de - enlace que son específicos a una molécula marcadora, tal como un polipéptido, que está presente sobre la superficie celular de células de endodermo definitivo pero que no está 15 sustancialmente presente sobre otros tipos de célula que serían encontradas en un cultivo celular producido mediante los métodos descritos en la presente. En algunos procesos, se usa un anticuerpo que se enlaza a CXCR4 como etiqueta de afinidad para el enriquecimiento, aislamiento o purificación de células 20 de endodermo definitivo. En otros procesos, la quimiocina SDF-1 u otras moléculas a base de SDF-I pueden también ser usadas como etiquetas de afinidad. Tales moléculas incluyen, pero no están limitadas a, fragmentos de SDF-1, fusiones de SDF-1 o imitaciones de SDF-1. 25 Los métodos para fabricar anticuerpos y utilizarse para aislamiento celular son conocidos en el arte y tales métodos pueden ser implementados para uso con los anticuerpos y células de endodermo definitivo descritos en la presente. En un proceso, un anticuerpo que se enlaza a CXCR4 es anexado a una perla o cordón magnético y luego se permite que se enlace a células de endodermo definitivo en un cultivo celular que ha sido tratado enzimáticamente para reducir la adhesión intercelular y de sustrato. Los complejos célula/anticuerpo/perla son luego expuestos . a un campo magnético movible que " es usado para separar células • de - endodermo . definitivo enlazadas a la perla de las células > sin enlazar. Una vez que las células de endodermo definitivo están separadas físicamente de otras células en el cultivo, se altera el enlace de anotación y las células son re-depositadas en medio de cultivo de tejido apropiado. Métodos adicionales para obtener cultivos o poblaciones de células de endodermo definitivo enriquecidas, aisladas o purificadas pueden también ser usados. Por ejemplo, en algunas modalidades, en anticuerpo CXCR4 es incubado con un cultivo de célula que contiene endodermo definitivo que ha sido tratado para reducir la adhesión intercelular y de sustrato. Luego las células son lavadas, centrifugadas y re-suspendidas. Luego la suspensión celular es incubada con un anticuerpo secundario, tal como un anticuerpo FITC-conjugado que es capaz de enlazarse al anticuerpo primario. Luego las células son lavadas, centrifugadas y resuspendidas en solución reguladora del pH. Luego la suspensión celular es analizada y clasificada utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) . Las células CXCR4-positivas son recolectadas separadamente de células CXCR4-negativas, dando como resultado mediante esto el aislamiento de tales tipos de células. Si se desea, las composiciones de células aisladas pueden ser purificadas adicionalmente al utilizar un método a base de afinidad alternativo o mediante rondas adicionales de clasificación utilizando los mismos o diferentes marcadores que son específicos para el endodermo -.definitivo. -- En todavía otros procesos, las células de endodermo definitivo son enriquecidas, aisladas y/o purificadas utilizando un ligando u otra molécula que se enlaza a CXCR4. En algunos procesos, la molécula es SDF-1 o un fragmento, fusión o imitación del mismo. En procesos preferidos, las células de endodermo definitivo son enriquecidas, aisladas y/o purificadas de otras células de endodermo no definitivo después que los cultivos de células de tallo son inducidos a diferenciarse hacia el linaje de endodermo definitivo. Se apreciará que los procesos de enriquecimiento, aislamiento y purificación descritos anteriormente pueden ser usados con tales cultivos a cualquier etapa de diferenciación. Además de los procedimientos recién descritos, las células de endodermo definitivo pueden también ser aisladas mediante otras técnicas para aislamiento celular. Adicionalmente, las células de endodermo definitivo pueden también ser enriquecidas o aisladas mediante métodos de subcultivo serial en condiciones de cultivo que promueven la sobrevivencia selectiva o expansión selectiva de las células de endodermo definitivo . Utilizando los métodos descritos en la presente, poblaciones enriquecidas, aisladas y/o purificadas de células de endodermo definitivo o tejidos pueden ser producidos in vitro a partir de cultivos celulares s poblaciones de células pluripotentes, tales como cultivos o poblaciones de células de tallo, que han sufrido por lo menos algo de diferenciación. En algunos métodos, las células sufren diferenciación aleatoria. Sin embargo, en un método preferido, las células son dirigidas a diferenciarse principalmente a endodermo definitivo. Algunos métodos de enriquecimiento, aislamiento y/o purificación preferidos son concernientes con la producción in vitro de endodermo definitivo a partir de células de tallo embriónico humanas. Utilizando los métodos descritos en la presente, poblaciones de células o cultivos celulares pueden ser enriquecidos en contenido de endodermo definitivo por al menos aproximadamente 2 a aproximadamente 1000 veces en comparación con las poblaciones celulares o cultivos celulares sin tratar. En algunas modalidades, las células de endodermo definitivo pueden ser enriquecidas por lo menos aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces, en comparación con las poblaciones celulares o cultivos celulares sin tratar. En otras modalidades, las células de endodermo definitivo pueden ser enriquecidas de por lo menos aproximadamente 10 a aproximadamente 200 veces, en comparación con las poblaciones celulares o cultivos celulares sin tratar. En todavía otras modalidades, las células de endodermo definitivo pueden ser enriquecidas desde por lo menos aproximadamente 20 a aproximadamente 100 veces, en comparación con poblaciones de células i o cultivos celulares sin tratar. En todavía otras modalidades, las células de endodermo definitivo pueden ser enriquecidas desde por lo menos aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, en comparación con poblaciones celulares o cultivos celulares sin tratar. En ciertas modalidades, las células de endodermo definitivo pueden ser enriquecidas de por lo menos aproximadamente 2 a aproximadamente 20 veces, en comparación con poblaciones de células o cultivos celulares sin tratar.
Composiciones que comprenden endodermo definitivo Las composiciones de células producidas mediante los métodos descritos anteriormente incluyen cultivos celulares que comprenden endodermo definitivo y poblaciones de células enriquecidas en endodermo definitivo. Por ejemplo, los cultivos celulares que comprenden células de endodermo definitivo, en donde por lo menos aproximadamente 50-80% de las células en el cultivo son células de endodermo definitivo, pueden ser producidos. Debido a que la eficiencia del proceso de diferenciación puede ser ajustada al modificar ciertos parámetros, los cuales incluyen pero no están limitados a, condiciones de cultivo celular, concentraciones de factor de crecimiento y la sincronización de las etapas de cultivo, los procedimientos de diferenciación descritos en la presente pueden dar- como resultado aproximadamente" 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o mayor de aproximadamente 95% de conversión de células pluripotentes a endodermo definitivo. En procesos en los cuales se usa aislamiento de células de endodermo definitivo, por ejemplo, al utilizar un reactivo de afinidad que se enlaza al receptor CXCR4, una población de célula de endodermo definitivo sustancialmente pura puede ser recuperada. Algunas modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como poblaciones de célula y cultivos celulares, que comprenden tanto células pluripotentes, tales como células de tallo y células de endodermo definitivo. Por ejemplo, al usar los métodos descritos en la presente, se pueden producir composiciones que comprende mezclas de hESC y células de endodermo definitivo. En algunas modalidades, se producen composiciones que comprenden por lo menos aproximadamente 5 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 95 células pluripotentes. En otras modalidades, se producen composiciones que comprenden por lo menos aproximadamente 95 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 5 células pluripotentes . Adicionalmente, se contemplan composiciones que comprenden otras proporciones de células de endodermo definitivo a células pluripotentes. Por ejemplo, composiciones que comprenden por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1,000,000 de células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 100,000 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 10,000 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1000 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 500 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 100 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 10 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 5 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo por aproximadamente cada 2 células pluripotentes, por lo menos aproximadamente 2 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente, por lo menos aproximadamente 5 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula ' pluripotente, por lo menos aproximadamente 10 células " de • ' endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula- pluripotente, por lo menos aproximadamente 20 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente, por lo menos aproximadamente 50 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente, por lo menos aproximadamente 100 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente, por lo menos aproximadamente 1000 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente, por lo menos aproximadamente 10,000 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente, por lo menos aproximadamente 100,000 células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente y por lo menos aproximadamente 1,000,000 de células de endodermo definitivo por aproximadamente cada 1 célula pluripotente son contempladas . En algunas modalidades, las células pluripotentes son células de tallo pluripotente humanas. En ciertas modalidades 5 las células de tallo son derivadas de una mórula, la masa celular interna de un embrión o los resaltos gonadales de un embrión. En ciertas otras modalidades, las células pluripotentes son derivadas de los tejidos gonadales o germinales de una estructura multicelular que ha desarrollado 0 más allá de la etapa embriónica. -.- - . Algunas modalidades descritas • en la presente son concernientes con cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden de por lo menos aproximadamente 5% de células de endodermo definitivo a por lo menos aproximadamente 95% de 5 células de endodermo definitivo. En algunas modalidades los cultivos celulares o poblaciones de células comprenden células mamíferas. En modalidades preferidas, los cultivos celulares o poblaciones de células comprenden células humanas. Por ejemplo, ciertas modalidades específicas son concernientes con cultivos 0 celulares que comprende células humanas, en donde de por lo menos aproximadamente 5% a por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas son células de endodermo definitivo. Otras modalidades son concernientes con cultivos celulares que comprenden células humanas, en donde por lo menos 5 aproximadamente 5%, por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90% o - mayor de 90% de las células humanas son células de endodermo definitivo. En modalidades en donde los cultivos celulares o poblaciones de células comprenden células alimentadoras humanas, los porcentajes anteriores son calculados sin consideración a las células alimentadoras humanas en los cultivos celulares o poblaciones de células. Modalidades adicionales descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células humanas, tales como células de endodermo definitivo humanas, en donde la expresión ya sea del marcador S0X17 o el marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador 0CT4, SPARC, alfa- fetoproteína (AFP) , trombomodulina (TM) y/o S0X7 en por lo menos aproximadamente 5% de las células humanas. En otras modalidades, la expresión ya sea del marcador SOX17 o el marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 15% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 20% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 25% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 30% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 35% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 40% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 45% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 50% de las células. - humanas en por lo menos aproximadamente 55% de las células, -humanas en por lo menos aproximadamente 60% de las. células humanas en por lo menos aproximadamente 65% de lascélulas humanas en por lo menos aproximadamente 70% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 75% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 80% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 85% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 90% de las células humanas en por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas o mayor de 95% de las células humanas . En modalidades en donde los cultivos celulares o poblaciones de células comprenden células alimentadoras humanas, los porcentajes anteriores son calculados sin consideración a las células alimentadoras humanas en los cultivos celulares o poblaciones de células . Se apreciará que algunas modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células humanas, tales como células de endodermo definitivo humanas, en donde la expresión de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste de GATA4, MIXLl, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMK0R1 y CRIP1 es mayor que la expresión de los marcadores 0CT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en de por lo menos aproximadamente 5% a más de por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas. En modalidades en donde los cultivos celulares - o , poblaciones de células comprenden- células alimentadoras humanas, los porcentajes anteriores son calculados sin consideración a las células alimentadoras humanas en los cultivos celulares o poblaciones de células. Todavía otras modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células humanas, tales como células de endodermo definitivo humanas, en donde la expresión tanto del marcador SOX17 como el marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en por lo menos aproximadamente 5% de las células humanas. En otras modalidades, la expresión tanto del marcador de SOX17 como el marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 15% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 20% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 25% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 30% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 35% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 40% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 45% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 50% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 55% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 60% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 65% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 70% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 75% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 80% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 85% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 90% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas o mayor de 95% de las células humanas . En modalidades en donde los cultivos celulares o poblaciones de células comprenden células alimentadoras humanas, los porcentajes anteriores son calculados sin consideración a las células alimentadoras humanas en los cultivos celulares o poblaciones de células. Se apreciará que algunas modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células humanas, tal como células de endodermo definitivo humanas, en donde la expresión de los marcadores GATA4, MIXLl, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKORl y CRIP1 es mayor que la expresión de los marcadores OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en de por lo menos aproximadamente 5% a más de por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas. En modalidades en donde los cultivos celulares o poblaciones de células comprenden células alimentadoras humanas, los porcentajes anteriores son calculados sin consideración a las células alimentadoras humanas en los cultivos celulares o poblaciones de células . Modalidades adicionales descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprende células de endodermo mamíferas, tales como células de endodermo humanas, en donde la expresión ya sea del marcador S0X17 o el marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en por lo menos aproximadamente 5% de las células de endodermo. En otras modalidades, la expresión ya sea del marcador SOX17 o el marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en por lo menos aproximadamente 10% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 15% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 20% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 25% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 30% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 35% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 40% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 45% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 50% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 55% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 60% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 65% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 70% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 75% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 80% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 85% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 90% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 95% de las células de endodermo o en mayor de 95% de las células de endodermo . Se apreciará que algunas modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden células de endodermo mamíferas, en donde la expresión de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste de GATA4, MKL1, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKOR1 y CRIP1 es mayor que la expresión de los marcadores OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 marcadores en de por lo menos aproximadamente 5% a mayor de por lo menos aproximadamente 95% de las células de endodermo . Todavía otras modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células de endodermo mamíferas, tales como células de endodermo humanas, en donde la expresión tanto del marcador S0X17 como el marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador 0CT4, SPARC, AFP, TM y/o S0X7 en por lo menos aproximadamente 5% de las células de endodermo. En otras modalidades, la- expresión tanto del marcador SOX17 como del marcador CXCR4 es mayor que la expresión del marcador OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en por lo menos aproximadamente 10% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 15% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 20% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 25% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 30% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 35% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 40% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 45% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 50% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 55% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 60% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 65% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 70% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 75% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 80% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 85% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 90% de las células de endodermo, en por lo menos aproximadamente 95% de las células de endodermo o en mayor de 95% de las células de endodermo . Se apreciará que algunas modalidades descritas en la pre-s'ente - son concernientes con . composiciones, tales como cultivos celulares o -poblaciones de - células que comprenden células de endodermo mamíferas, en donde la expresión de los marcadores GATA4, MIXLl, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKOR1 y CRIP1 es mayor que la expresión de los marcadores OCT4, SPARC, AFP, TM y/o SOX7 en de por lo menos aproximadamente 5% a mayor de por lo menos aproximadamente 95% de las células de endodermo. Utilizando los métodos descritos en la presente, se pueden producir composiciones que comprenden células de endodermo definitivo sustancialmente libres de otros tipos de células. En algunas modalidades descritas en la presente, las poblaciones de células o cultivos celulares de endodermo definitivo producidos mediante los métodos descritos en la presente están sustancialmente libres de células que expresan significativamente los genes marcadores OCT4, SOX7, AFP, SPARC, TM, ZIC1 o BRACH. En una modalidad, una descripción de una célula de endodermo definitivo basada en la expresión de genes marcadores, S0X17 alta, MIXLl alta, AFP baja, SPARC baja, trombomodulina baja, S0X7 baja, CXCR4 alta.
La expresión genética de PDXl durante el desarrollo El PDXl (también llamado STF-1, IDX-1 y IPF-1) es un factor de transcripción que es necesario para el desarrollo del páncreas y duodeno rostral. El PDXl es expresado primero en el endodermo pancreático, " que .surge del endodermo del intestino anterior posterior y producirá tanto las células exocrinas como endocrinas, partiendo en E8.5 en el retiene. Más tarde, PDXl es restringido a células beta y algunas células delta del páncreas endocrino. Este patrón de expresión es mantenido en el adulto. PDXl es también expresado en el endodermo duodenal prematuramente en desarrollo, que es adyacente a la formación de páncreas, luego en los enterocitos duodenales y células enteroendócrinas, estómago antral y en los conductos biliares común, cístico y biliares. Esta región de expresión también se vuelve limitada, al tiempo en que la expresión pancreática se vuelve restringida, a predominantemente el duodeno rostral.
Células PDXl-positivo y procesos relacionados con las mismas Modalidades de otros procesos de diferenciación descritos en la presente son concernientes con nuevos procesos definidos para la producción de células de endodermo PDX1-positivo, en donde las células de endodermo PDXl-positivo son células multipotentes que se pueden diferenciar a células, tejidos u órganos derivados de la región del intestino anterior/intestino medio del tubo intestinal (endodermo del intestino anterior/intestino medio PDXl-positivo) . Algunas modalidades preferidas son concernientes con procesos para la producción de células de endodermo del intestino anterior PDXl-positivo. En algunas modalidades, estas células de endodermo del intestino anterior PDXl-positivo son células multipotentes que se pueden diferenciar a células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo intestinal (endodermo del intestino anterior PDXl-positivo) . Modalidades preferidas adicionales son concernientes con procesos para la producción de células de endodermo PDXl-positivo de la porción posterior del intestino anterior. En algunas modalidades, estas células de endodermo PDXl-positivo son células multipotentes que se pueden diferenciar a células, tejidos u órganos derivados de la porción posterior de la región del intestino anterior del tubo intestinal. Las células de endodermo del intestino anterior PDX1-positivo, tales como aquellas producidas de acuerdo con los métodos descritos en la presente, pueden ser usadas para producir células ß productoras de insulina, plenamente diferenciadas. En algunas modalidades, células de endodermo del intestino anterior PDXl-positivo son producidas mediante diferenciación de células de endodermo definitivo que no expresan sustancialmente PDXl (células de endodermo definitivo PDXl-negativo; también denominadas en la presente como endodermo definitivo) para formar células del endodermo del intestino anterior PDXl-positívo . Células de endodermo definitivo-- PDXl-negativo pueden ser preparadas mediante -diferenciación de células pluripotentes, tales como células de tallo embriónico, como se describe ' en la presente o mediante cualesquier otros métodos conocidos. Un método conveniente y altamente eficiente para producir endodermo definitivo PDX1-negativo a partir de células pluripotentes es descrito previamente en la presente y en la solicitud de patente estadounidense No. 11/021,618, intitulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 23 de diciembre de 2004. Los procesos para producir células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo proporcionan una base para la produce eficiente de tejidos pancreáticos tales como células acinares, células ductales, y células de isleta a partir de células pluripotentes. En ciertas modalidades preferidas, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo humanas son derivadas de células de endodermo definitivo PDXl-humanas, que a su vez son derivadas de hESC. Estas células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo humanas pueden luego ser usadas para producir células ß productoras de insulina funcionales. Para obtener cantidades útiles de células ß productoras de insulina, una alta eficiencia de diferenciación es deseable para cada una de las etapas de diferenciación que ocurren antes de alcanzar el destino de isleta/célula ß pancreática. Debido a la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo representa una etapa prematura hacia la producción de células de isleta/ß pancreáticas funcionales (como se muestra en la figura 1), una alta eficiencia de diferenciación en esta etapa es particularmente deseable. En vista del deseo de diferenciación eficiente de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo, algunos aspectos de los procesos descritos en la presente son concernientes con metodología in vitro que da como resultado aproximadamente 2-25% de conversión de células de endodermo definitivo PDX1-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Comúnmente, tales métodos abarcan la aplicación de cultivo y condiciones de factor de crecimiento de manera definida y especificada temporalmente. El enriquecimiento adicional de la población celular para células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo puede ser obtenido mediante aislamiento y/o purificación de las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo a partir de otras células en la población al utilizar un reactivo que se enlaza específicamente a la célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Como una alternativa, las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden ser marcadas con un gen reportero, tal como proteína fluorescente verde (GFP) , para permitir la detección de expresión PDXl. Tales células marcadas fluorescentemente pueden luego ser purificadas mediante clasificación de célula activada fluorescente (FACS) . Aspectos adicionales de la presente invención son concernientes con cultivos celulares y poblaciones de células enriquecidas que comprenden células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo también como métodos para identificar factores útiles en la diferenciación a y de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo . Con el fin de determinar la cantidad de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo en un cultivo celular o población de células, es deseable un método para distinguir este tipo de células de las otras células en el cultivo o en la población. Así, ciertas modalidades descritas en la presente son concernientes con marcadores celulares cuya presencia, ausencia y/o niveles de expresión relativos son indicadores de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo también como métodos para detectar y determinar la expresión de tales marcadores. En algunas modalidades descritas en la presente, la presencia, ausencia y/o nivel de expresión de un marcador es determinado mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) . Por ejemplo, la cantidad de transcripto producido por ciertos marcadores genéticos, tales como PDXl, S0X17, S0X7, S0X1, ZIC1, NFM, alfa-fetoproteína (AFP) , caja homeótica A13 (H0XA13) , caja homeótica C6 (H0XC6).,- y/o otros marcadores descritos en la presente es determinada mediante Q-PCR. En. -otras modalidades, se usa inmunohistoquímica para detectar las proteínas expresadas por los genes mencionados anteriormente. En todavía otras modalidades, se usan ambas técnicas de Q-PCR e inmunohistoquímica para identificar y determinar la cantidad o proporciones relativas de tales marcadores. Al utilizar los métodos de diferenciación y detección descritos en la presente, es posible identificar células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo, también como determinar la proporción de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo en un cultivo celular o población de células. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células o poblaciones celulares de endodermo del intestino anterior PDXl-positivo que son producidas expresan el gen PDXl a un nivel de por lo menos aproximadamente 2 órdenes de magnitud mayor que las células o poblaciones de células PDXl-negativas . En otras modalidades, las células y poblaciones de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo que son producidas expresan el gen PDXl a un nivel de 2 o más órdenes de magnitud mayor que las células o poblaciones de células PDXl-negativo. En todavía otras modalidades, células o poblaciones de células de endodermo del intestino anterior PDXl-positivo que son producidas expresan uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de PDXl, S0X17, H0XA13 y H0XC6 a un nivel de aproximadamente 2 o 'más de' 2 'órdenes de magnitud mayor que las células o poblaciones de • células de endodermo -definitivo PDXl-negativo. Las composiciones y métodos descritos en la presente tienen varios elementos útiles. Por ejemplo, los cultivos celulares y poblaciones de células que comprenden endodermo PDXl-positivo, también como los métodos para producir tales cultivos celulares y poblaciones de células, son útiles para el modelado de las etapas prematuras del desarrollo humano. Además, las composiciones y métodos descritos en la presente pueden también servir para intervención terapéutica en estados de enfermedad, tales como diabetes mellitus. Por ejemplo, puesto que el endodermo de intestino anterior PDXl-positivo sirve como la fuente para solo un número limitado de tejidos, puede ser usado en el desarrollo de tejidos puros o tipos de células puros.
Producción de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo a partir de endodermo definitivo PDXl-negativo Cultivos y poblaciones de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo que comprenden células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo que son descritos en la presente son producidos a partir de endodermo definitivo PDXl-negativo, que es generado a partir de células pluripotentes como se describe anteriormente. Un método preferido utiliza células de tallo embriónico humano como el material de partida. En una modalidad, hESC son- primero convertidos a células de endodermo definitivo PDXl-negativo, que son luego convertidas a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Sin embargo, se apreciará que los materiales de partida para la producción de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo no están limitados a células de endodermo definitivo producidas utilizando métodos de diferenciación de célula pluripotente. Más bien, cualesquier células de endodermo definitivo PDXl-negativo pueden ser usadas en los métodos descritos en la presente sin consideración de su origen. En algunas modalidades descritas en la presente, cultivos celulares o poblaciones de células que comprende células de endodermo definitivo PDXl-negativo pueden ser usadas para diferenciación adicional a cultivos celulares y/o poblaciones de células enriquecidas que comprenden células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Por ejemplo, un cultivo celular o población de células que comprende células de endodermo definitivo PDXl-negativo, S0X17-positivo humanas pueden ser usadas. En algunas modalidades, el cultivo celular o población de células puede también comprender factores de diferenciación, tales como activinas, nodales y/o BMPs, restantes de la etapa de diferenciación previa (esto es, la etapa de diferenciación de células pluripotentes a células de endodermo definitivo) . En otras modalidades, los factores utilizados en la etapa -de diferenciación previa son removidos ' del --cultivo celular o población de células antes de la adición factores ' usados para la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo, S0Xl7-positivo a células de endodermo de -intestino anterior PDXl-positivo. En otras modalidades, poblaciones de células enriquecidas para célula de endodermo definitivo PDXl-negativo, S0Xl7-positivo son usadas como fuente para la producción de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Las células de endodermo definitivo PDXl-negativo en el cultivo son diferenciadas a células de endodermo PDXl- positivo al proporcionar a un cultivo celular que comprende células de endodermo definitivo PDXl-negativo, SOX17-positivo un factor de diferenciación que promueve la diferenciación de las células a células de endodermo de intestino anterior PDX1- positivo (factor de diferenciación de intestino anterior) . En algunas modalidades de la presente invención, el factor de diferenciación de intestino anterior es retinoide, tal como ácido retinoico (RA) . En algunas modalidades, el retinoide es usado en conjunción con un factor de crecimiento de fibroblasto, tal como FGF-4 o FGF-10. En otras modalidades, el retinoide es usado en conjunción con un elemento de la superfamilia de TGFß de factores de crecimiento y/o un medio acondicionado . .. Como se define anteriormente, la frase "medio acondicionado" se refiere a un." medio que es alterado en comparación con un medio . base. Por ejemplo, el acondicionamiento de un medio puede provocar que moléculas, tales " como nutrientes y/o factores de crecimiento, sean agregados a agotados de los niveles originales encontrados en el medio base. En algunas modalidades, un medio es acondicionado al permitir que células de ciertos tipos sean cultivadas o mantenidas en el medio bajo ciertas condiciones por un cierto período de tiempo. Por ejemplo, un medio puede ser acondicionado al permitir que las hESC sean expandidas, diferenciadas o mantenidas en un medio de composición definida a una temperatura definida por un número definido de horas . Como se apreciará por aquellos de habilidad en el arte, numerosas combinaciones de células, tipos de medios, duraciones y condiciones ambientales pueden ser usados para producir una disposición casi infinita de medios acondicionados. En algunas modalidades de la presente invención, un medio es acondicionado al permitir que células pluripotentes diferenciadas sean cultivadas o mantenidas en un medio que comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 20% de concentración en el suero. En otras modalidades, un medio es acondicionado al permitir que células pluripotentes diferenciadas sean cultivadas o mantenidas en un medio que comprende aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml de activina A. En todavía otras modalidades, un medio es acondicionado permitiendo que células pluripotentes diferenciadas sean cultivadas o mantenidas en un medio que comprende aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml de BMP . En una modalidad preferida, un medio acondicionado es preparado al permitir que hESC diferenciada sean cultivadas o mantenidas durante 24 horas en un medio, tal como RPMI, que comprende aproximadamente 25 ng/ml de activina A y aproximadamente RA 2 µM. En algunas modalidades descritas en la presente, las células usadas para acondicionar el medio, que es usado para mejorar la diferenciación de endodermo definitivo PDXl-positivo a endodermo de intestino anterior PDXl-positivo, son células que son diferenciadas a partir de células pluripotentes, tales como hESC, durante un período de aproximadamente 5 días en un medio tal como RPMI que comprende aproximadamente 0% a aproximadamente 20% de suero y/o uno o más factores de crecimiento/diferenciación de la superfamilia TGFß. Factores de diferenciación, tales como activina A y BMP4 son suministrados a concentraciones que fluctúan de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En ciertas modalidades de la presente invención, las células usadas para acondicionar el medio son diferenciadas de hESC durante aproximadamente un período de 5 días en RPMI de bajo contenido de suero. De acuerdo con algunas modalidades, RPMI de bajo contenido de suero se refiere a un medio que contiene bajo contenido de - suero, en donde la concentración de suero es incrementada gradualmente en un período de tiempo definido. Por ejemplo, en una modalidad, RPMI de 'bajo contenido de suero comprende una concentración de aproximadamente 0.2% de suero bovino fetal (FBS) en el primer día de cultivo celular, aproximadamente 0.5% de FBS en el segundo día de cultivo celular y aproximadamente 2% de FBS en el tercer día al quinto día del cultivo celular. En otra modalidad, RPMI de bajo contenido de suero comprende una concentración de aproximadamente 0% en el día uno, aproximadamente 0.2% en el día dos y aproximadamente 2% en los días 3-6. En ciertas modalidades preferidas, RPMI de bajo contenido de suero es complementado con uno o más factores de diferenciación, tales como activina A y BMP4. Además de su uso en la preparación de células usadas para condicionar medios, RPMI de bajo contenido de suero puede ser usado como medio para la diferenciación de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo a partir de células de endodermo definitivo PDX1-negativo. Se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte que medios acondicionados pueden ser preparados a partir de medios diferentes a RPMI a condición de que tales medios no interfieran con el crecimiento o mantenimiento de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. También se apreciará que las células usadas para acondicionar el medio pueden ser de varios tipos. En modalidades en donde se usan- células recién diferenciadas para acondicionar un medio, tales células pueden ser diferenciadas en un medio diferente a RPMI a condición de que el medio no inhiba el crecimiento o mantenimiento de tales células. Además, el experimentado en el arte apreciará que ni la duración de acondicionamiento ni la duración de preparación de células usadas para el acondicionamiento se requiere que sea de 24 horas o 5 días, respectivamente, ya que otros períodos de tiempo serán suficientes para obtener los efectos reportados en la presente. En general, el uso de un retinoide en combinación con un factor de crecimiento de fibroblasto, un miembro de la superfamilia de TGFß de factores de crecimiento, un medio acondicionado o una combinación de cualquiera de estos factores de diferenciación de intestino anterior provoca una diferenciación mayor de endodermo definitivo PDXl-negativo a endodermo de intestino anterior PDXl-positivo que el uso de un retinoide solo. En una modalidad preferida, RA y FGF-10 son ambos provistos al cultivo celular de endodermo definitivo PDXl-negativo. En otra modalidad preferida, células de endodermo definitivo PDXl-negativos son diferenciadas en un cultivo que comprende un medio acondicionado, activina A, activina B y RA. Con respecto a algunas de las modalidades de procesos de diferenciación descritos en la presente, los factores de diferenciación de intestino anterior mencionados anteriormente son provistos a las células de tal manera que estos factores están presentes en el "cultivo celular o población de células a concentraciones suficientes para promover la diferenciación de por lo menos una porción del cultivo o población de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Como se define previamente, cuando se usa en relación con cultivos celulares y/o poblaciones de células, el término "porción" significa cualquier cantidad no cero de cultivo celular o población de células, que fluctúa desde una sola célula a la totalidad del cultivo celular o población de células. En algunas modalidades de procesos descritos en la presente, se proporciona un retinoide a las células de un cultivo celular, de tal manera que está presente a una concentración de por lo menos aproximadamente 0.01 µM, por lo menos aproximadamente 0.02 µM, por lo menos aproximadamente 0.04 µM, por lo menos aproximadamente 0.08 µM, por lo menos aproximadamente 0.1 µM, por lo menos aproximadamente 0.2 µM, por lo menos aproximadamente 0.3 µM, por lo menos aproximadamente 0.4 µM, por lo menos aproximadamente 0.5 µM, por lo menos aproximadamente 0.6 µM, por lo menos aproximadamente 0.7 µM, por lo menos aproximadamente 0.8 µM, por lo menos aproximadamente 0.9 µM, por lo menos aproximadamente 1 µM, por lo menos aproximadamente 1.1 µM, por lo menos aproximadamente 1.2 µM, por lo menos aproximadamente 1-.3 µM, por lo menos aproximadamente 1.4 µM, por lo menos aproximadamente 1.5 µM, por lo. 'menos, aproximadamente 1.6 µM, por lo menos aproximadamente ' 1.7 µM, por lo menos aproximadamente 1.8 µM, por lo. menos aproximadamente 1.9 µM, por lo menos aproximadamente 2 µM, por lo menos aproximadamente 2.1 µM, por lo menos aproximadamente 2.2 µM, por lo menos aproximadamente 2.3 µM, por lo menos aproximadamente 2.4 µM, por lo menos aproximadamente 2.5 µM, por lo menos aproximadamente 2.6 µM, por lo menos aproximadamente 2.7 µM, por lo menos aproximadamente 2.8 µM, por lo menos aproximadamente 2.9 µM, por lo menos aproximadamente 3 µM, por lo menos aproximadamente 3.5 µM, por lo menos aproximadamente 4 µM, por lo menos aproximadamente 4.5 µM, por lo menos aproximadamente 5 µM, por lo menos aproximadamente 10 µM, por lo menos aproximadamente 20 µM, por lo menos aproximadamente 30 µM, por lo menos aproximadamente 40 µM o por lo menos aproximadamente 50 µM. En una modalidad preferida, el retinoide es ácido retinoico. En otras modalidades de los procesos descritos en la presente, uno o más factores de diferenciación de la familia de factores de crecimiento de fibroblasto están presentes en el cultivo celular. Por ejemplo, en algunas modalidades, FGF-4 puede estar presente en el cultivo celular a una concentración de por lo menos aproximadamente 10 ng/ml, por lo menos aproximadamente 25 ng/ml, por lo menos aproximadamente 50 -ng/ml, por lo menos aproximadamente. 75 -ng/ml, por lo menos aproximadamente 100 ng/ml, por lo menos; aproximadamente 200 ng/ml, por lo menos aproximadamente. 300 .ng/ml, por lo menos aproximadamente 400 ng/ml, por lo menos aproximadamente 500 ng/ml, o por lo menos aproximadamente 1000 ng/ml. En modalidades adicionales, FGF- 10 está presente en el cultivo celular a una concentración de por lo menos aproximadamente 10 ng/ml, por lo menos aproximadamente 25 ng/ml, por lo menos aproximadamente 50 ng/ml, por lo menos aproximadamente 75 ng/ml, por lo menos aproximadamente 100 ng/ml, por lo menos aproximadamente 200 ng/ml, por lo menos aproximadamente 300 ng/ml, por lo menos aproximadamente 400 ng/ml, por lo menos aproximadamente 500 ng/ml, o por lo menos aproximadamente 1000 ng/ml. En algunas modalidades, ya sea FGF-4 o FGF- 10, pero no ambos, es provisto a cultivo celular junto con RA. En una modalidad preferida, RA está presente en el cultivo celular a 1 µM y FGF- 10 está presente a una concentración de 50 ng/ml. En algunas modalidades de los procesos descritos en la presente, factor de crecimiento de la superfamilia de TGFß y/o un medio acondicionado están presentes en el cultivo celular. Estos factores de diferenciación pueden ser usados en combinación con RA y/u otros factores de diferenciación del intestino anterior medio en los que se incluyen, pero no límites a, FGF-4 y FGF-10. Por ejemplo, en algunas modalidades, activina A y/o activina B pueden estar presentes en el cultivo celular a- una concentración de por lo menos aproximadamente 5 ng/ml,- por lo menos aproximadamente .'10 • ng/ml, por lo menos aproximadamente 25 ng/ml, por lo menos aproximadamente 50 ng/ml, por lo menos aproximadamente 75' ng/ml, por lo menos aproximadamente 100 ng/ml, por lo menos aproximadamente 200 ng/ml, por lo menos aproximadamente 300 ng/ml, por lo menos aproximadamente 400 ng/ml, por lo menos aproximadamente 500 ng/ml, o por lo menos aproximadamente 1000 ng/ml. En modalidades adicionales, un medio acondicionado está presente en el cultivo celular a una concentración de por lo menos aproximadamente 1%, por lo menos aproximadamente 5%, por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 100% del medio total. En algunas modalidades, activina A, activina B y un medio acondicionado son provistos al cultivo celular junto con RA. En una modalidad preferida, células de endodermo definitivo PDXl-negativos son diferenciados a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo en cultivos que comprenden RA aproximadamente 1 µM, activina A aproximadamente 25 ng/ml y medio RPMI de bajo contenido de suero que ha sido acondicionado durante 24 horas mediante hESC diferenciado, en donde las hESC diferenciadas han sido diferenciadas por aproximadamente 5 días en RPMI de bajo contenido de suero que comprende aproximadamente 100 ng/de activina A. En otra modalidad preferida, activina B y/o FGF-10 están también presentes en el cultivo a 25 ng/ml y 50 ng/ml, respectivamente . En ciertas modalidades de los procesos descritos en la presente, los factores de diferenciación de intestino anterior mencionados anteriormente son removidos del cultivo celular subsecuentemente a su adición. Por ejemplo, los factores de diferenciación de intestino anterior pueden ser removidos en el transcurso de aproximadamente un día, aproximadamente dos días, aproximadamente tres días, aproximadamente cuatro días, aproximadamente cinco días, aproximadamente seis días, aproximadamente siete días, aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días o aproximadamente diez días después de su adición.
Los cultivos de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden ser cultivadas en un medio que contiene suero reducido. Las concentraciones de suero pueden fluctuar de aproximadamente 0.05% (volumen/volumen) a aproximadamente 20% (v/v) . En algunas modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son cultivadas con reemplazo de suero. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la concentración del suero del medio puede ser menor de aproximadamente 0.05% (v/v), menor de aproximadamente 0.1% - (v/v), menor de aproximadamente 0.2% (v/v), menor de aproximadamente 0.3% (v/v), menor de aproximadamente 0.4% (v/v), menor de aproximadamente 0.5% (v/v), menor de aproximadamente 0.6% (v/v), menor de aproximadamente 0.7% (v/v), menor de aproximadamente 0.8% (v/v), menor de aproximadamente 0.9% (v/v), menor de aproximadamente 1% (v/v), menor de aproximadamente 2% (v/v) , menor de aproximadamente 3% (v/v) , menor de aproximadamente 4% (v/v) , menor de aproximadamente 5% (v/v) , menor de aproximadamente 6% (v/v) , menor de aproximadamente 7% (v/v) , menor de aproximadamente 8% (v/v) , menor de aproximadamente 9% (v/v) , menor de aproximadamente 10% (v/v) , menor de aproximadamente 15% (v/v) o menos de aproximadamente 20% (v/v) . En algunas modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son cultivadas sin suero. En otras modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son cultivadas con reemplazo de suero. En todavía otras modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son cultivadas en presencia de B27. En tales modalidades B27 puede ser provisto al medio de cultivo en concentraciones que fluctúan de aproximadamente 0.1% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v) o en concentraciones mayores de aproximadamente 20% (v/v) . En ciertas modalidades, la concentración de B27 en el medio es aproximadamente 0.1% (v/v), aproximadamente 0.2% (v/v), aproximadamente 0.3% (v/v), . aproximadamente 0.4% (v/v), aproximadamente 0.5%. (v/v) , .. aproximadamente 0.6% (v/v) , aproximadamente 0.7% (vJv) , ' . aproximadamente 0.8% (v/v) , aproximadamente 0.9% (v/v) , --: aproximadamente 1% (v/v) , aproximadamente 2% (v/v) , aproximadamente 3% (v/v) , aproximadamente 4% (v/v) , aproximadamente 5% (v/v) , aproximadamente 6% (v/v) , aproximadamente 7% (v/v) , aproximadamente 8% (v/v) , aproximadamente 9% (v/v) , aproximadamente 10% (v/v) , aproximadamente 15% (v//vv)) co) aapprrooxxiimmaaddaammeennttee 2200%% (v/v) . Alternativamente, la concentración del suplemento de B27 agregado puede ser medida en términos de múltiplos de la intensidad o fuerza de una solución concentrada de B27 disponible comercialmente. Por ejemplo, B27 está disponible de Invitrogen (Carlsbad, CA) como una solución concentrada 50X. La adición de una cantidad suficiente de esta solución concentrada a un volumen suficiente de medio de cultivo produce un medio complementado con la cantidad deseada de B27. Por ejemplo, la adición de 10 ml de solución concentrada B27 50X a 90 ml de medio de cultivo produciría un medio de cultivo complementado con B27 5X. La concentración del suplemento B27 en el medio puede ser aproximadamente 0.1X, aproximadamente 0.2X, aproximadamente 0.3X, aproximadamente 0.4X, aproximadamente 0.5X, aproximadamente 0.6X, aproximadamente 0.7X, aproximadamente 0.8X, aproximadamente 0.9X, aproximadamente IX, aproximadamente 1.1X, aproximadamente 1.2X, aproximadamente 1.-3X, -aproximadamente 1.4X, .aproximadamente 1.5X, -.aproximadamente 1.6X, aproximadamente 1.7X, aproximadamente 1.8X, aproximadamente 1.9X, aproximadamente 2X, aproximadamente 2.5X, aproximadamente 3X, aproximadamente 3.5X, aproximadamente 4X, aproximadamente 4.5X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 7X, aproximadamente 8X, aproximadamente 9X, aproximadamente 10X, aproximadamente 11X, aproximadamente 12X, aproximadamente 13X, aproximadamente 14X, aproximadamente 15X, aproximadamente 16X, aproximadamente 17X, aproximadamente 18X, aproximadamente 19X, aproximadamente 20X y mayor de aproximadamente 20X.
Verificación de la diferenciación de endodermo definitivo PDXl- negativo a endodermo PDXl-positivo Con la diferenciación de células de endodermo definitivo a partir de células pluripotentes el avance de diferenciación de PDXl-negativo, endodermo definitivo S0X17-positivo a endodermo de intestino anterior PDXl-positivo puede ser verificado al determinar la expresión de marcadores característicos de estos tipos de células. Tal verificación permite determinar la cantidad de tiempo que es suficiente para la producción de una cantidad deseada de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo bajo varias condiciones, por ejemplo, una o más concentraciones de factor de diferenciación y condiciones ambientales. En modalidades preferidas, la cantidad de tiempo que es suficiente para la producción de una cantidad deseada "de endodermo de., intestino anterior PDXl-positivo es' determinada al detectar la expresión de PDXl. En algunas modalidades, la expresión de ciertos marcadores es determinada al detectar la presencia o ausencia del marcador. Alternativamente, la expresión de ciertos marcadores puede ser determinada al medir el nivel al cual el marcador está presente en las células del cultivo celular o población de células. En tales modalidades, la medición de expresión del marcador puede ser cualitativa o cuantitativa. Como se describe anteriormente, un método preferido de cuantificación de los marcadores de expresión son producidos por genes marcadores es por medio del uso de Q-PCR. En modalidades particulares, se usa Q-PCR para verificar el avance de células del cultivo de endodermo definitivo PDXl-negativo, S0X17-positivo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo al cuantificar la expresión de genes marcadores característicos de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo y la carencia de expresión de genes marcadores característicos de otros tipos de células. Otros métodos que son conocidos en el arte pueden también ser usados 5 para cuantificar la expresión del gen marcador. Por ejemplo, la expresión de un producto de gen marcador puede ser detectada al utilizar anticuerpos específicos para el producto de gen marcador de interés. En algunas modalidades, la expresión de r genes marcadores característicos de endodermo de intestino 10 nterior PDXl-positivo, también como la carencia de -expresión :.-'.- significativa de genes marcadores característicos de endodermo definitivo . PDXl-negativo, hESC y otro tipos de células es determinada. - Como se describe adicionalmente en los ejemplos a 15 continuación, PDXl es un gen marcador que está asociado con el endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Como tal, en algunas modalidades de los procesos descritos en la presente, se determina la expresión de PDXl. En otras modalidades, la expresión de otros marcadores, que son expresados en endodermo 20 de intestino anterior PDXl-positivo, en los que se incluyen pero no limitados a, SOX17, HOXA13 y/o HOXC6 es también determinada. Puesto que PDXl puede también ser expresado mediante ciertos otros tipos de células (esto es, endodermo visceral y cierto ectodermo neural), algunas modalidades 25 descritas en la presente son concernientes con la demostración de la ausencia o ausencia sustancial de expresión de gen marcador que está asociada con el endodermo visceral y/o ectodermo neural. Por ejemplo, en algunas modalidades, la expresión de marcadores, que son expresados en endodermo visceral y/o células neurales, en los que se incluyen pero no limitados a, S0X7, AFP, SOXl, ZICl y/o NFM es determinada. En algunas modalidades, cultivos celulares de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo producidos mediante los métodos descritos están sustancialmente libres de células que expresan los genes marcadores SOX7, AFP, - SOXl, ZIC1 o NFM. • En ciertas modalidades, los cultivos celulares de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo producidos mediante los procesos descritos en la presente, están sustancialmente libres de endodermo visceral, endodermo parietal y/o células neurales.
Enriquecimiento, aislamiento y/o purificación de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo Con respecto a aspectos adicionales de los procesos descritos en la presente, las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden ser enriquecidas, aisladas y/o purificadas. En algunas modalidades, poblaciones de células enriquecida por células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son producidas al aislar tales células de cultivo celulares.
En algunas modalidades de los procesos descritos en la presente, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son marcadas fluorescentemente y luego aisladas de célula sin marcar al utilizar un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) . En tales modalidades una proteína fluorescente verde que codifica ácido nucleico (GFP) u otro ácido nucleico que codifica un gen marcador fluorescente expresable es usado para marcar células PDXl-positivas . Por ejemplo, en algunas modalidades, por lo menos una copia de un ácido nucleico que codifica GFP o un fragmento biológicamente activo- del mismo es - introducido . a una célula pluripotente, preferiblemente una " célula de tallo embriónico humana, corriente abajo del promotor PDXl, de tal manera que la expresión del producto de gen GFP o fragmento biológicamente activo del mismo está bajo el control del promotor PDXl. En algunas modalidades, toda la región de codificación del ácido nucleico, que codifica PDXl, es reemplazada por un ácido nucleico que codifica GFP o un fragmento biológicamente activo del mismo. En otras modalidades, el ácido nucleico que codifica GFP o un fragmento biológicamente activo del mismo es fusionado en cuadro con por lo menos una porción del ácido nucleico que codifica PDXl, generando mediante esto una proteína de fusión. En tales modalidades, la proteína de fusión retiene una actividad fluorescente similar a GFP. Las células marcadas fluorescentemente, tales como las células pluripotentes descritas anteriormente, son diferenciadas a endodermo definitivo y luego a endodermo de intestino anterior PDXl-positivo como se describe previamente. Debido a que las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo expresan el gen marcador fluorescente, mientras que las células PDXl-negativo no, estos dos tipos de células pueden ser separados. En algunas modalidades, suspensiones de células que comprenden una mezcla de células PDXl-positivas marcadas fluorescentemente y células PDXl-negativas sin marcar son clasificadas utilizando un.FACS. Las células PDXl-positivas son recolectadas separadamente.de células PDXl-negativas, dando como resultado mediante esto el aislamiento de tales tipos de células. Si se desea, las composiciones de células aisladas pueden ser purificadas adicionalmente mediante rondas adicionales de clasificación utilizando los mismos o diferentes marcadores que son específicos para endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Además de los procedimientos recién descritos, las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden también ser aisladas mediante otras técnicas para aislamiento de células. Adicionalmente, las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden también ser enriquecidas o aisladas mediante métodos de subcultivo serial en condiciones de cultivo que promueven la sobrevivencia selectiva o expansión selectiva de las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Se apreciará que los procedimientos de enriquecimiento, aislamiento y purificación descritos anteriormente pueden ser usados con tales cultivos a cualquier etapa de diferenciación. Utilizando los métodos descritos en la presente, poblaciones enriquecidas, aisladas y/o purificadas de células y/o tejidos de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden ser producidos in vitro a partir de cultivos celulares o .poblaciones - de células de ' endodermo . PDXl-positivo, SOX17- • .positivo que han sufrido por.- lo menos algo de diferenciación.
En algunas modalidades, las - células sufren diferenciación aleatoria. Sin embargo, en una - modalidad preferida, las células son dirigidas a diferenciarse principalmente a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Algunos métodos de enriquecimiento, aislamiento y/o purificación preferidos son concernientes con la producción in vitro de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo a partir de células de tallo embriónico humanas. Utilizando los métodos descritos en la presente, poblaciones de células o cultivos celulares pueden ser enriquecidos en contenido de célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por lo menos aproximadamente 2 a aproximadamente 1000 veces, en comparación con poblaciones de células o cultivos celulares sin tratar. En algunas modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl- positivo pueden ser enriquecidas por al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 500 veces en comparación con poblaciones de células o cultivos celulares sin tratar. En otras modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden ser enriquecidas de por lo menos aproximadamente 10 a aproximadamente 200 veces en comparación con poblaciones de células o cultivos celulares sin tratar. En todavía otras modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl- positivo pueden ser enriquecidas : . de por lo menos - aproximadamente 20 a aproximadamente 10O.- veces en comparación con poblaciones de células o cultivos celulares sin tratar. En todavía otras modalidades, células de- endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden ser enriquecidas de por lo menos aproximadamente 40 a aproximadamente 80 veces, en comparación con poblaciones de células o cultivos celulares sin tratar. En ciertas modalidades, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo pueden ser enriquecidas de por lo menos aproximadamente 2 a aproximadamente 20 veces en comparación con poblaciones de células o cultivos celulares sin tratar.
Composiciones que comprenden endodermo de intestino anterior PDXl-positivo Algunas modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones de células, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células de endodermo PDXl-positivo, en donde las células de endodermo PDXl-positivo son células multipotentes que se pueden diferenciar a células, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo intestinal (endodermo de intestino anterior PDXl-positivo) . De acuerdo con ciertas modalidades, el endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son células mamíferas y en una modalidad preferida, estas células son células humanas. Otras modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células de uno o más tipos de células seleccionados del grupo que consiste de hESC, células de endodermo definitivo PDXl-negativos, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo y células de mesodermo. En algunas modalidades, las hESC comprenden menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% de las células totales en el cultivo. En otras modalidades, las células de endodermo definitivo PDX1-negativos comprenden menos de aproximadamente 90%, menos de aproximadamente 85%, menos de aproximadamente 80%, menos de aproximadamente 75%, menos de aproximadamente 70%, menos de aproximadamente 65%, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 55%, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 45%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 35%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 12%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 6%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% de las células totales en el cultivo. En todavía otras modalidades, las células de. mesodermo comprenden menos de aproximadamente 90%, menos - de aproximadamente 85%:,. menos de aproximadamente 80%, menos de aproximadamente 75%, menos de "aproximadamente 70%, menos de aproximadamente 65%, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 55%, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 45%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 35%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 12%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 6%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% de las células totales en el cultivo. Modalidades adicionales descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, producidas mediante los proceso descritos en la presente, que comprenden endodermo de intestino anterior PDXl-positivo como el tipo de célula mayoritario. En algunas modalidades, los procesos descritos en la presente producen cultivos celulares y/o poblaciones de células que comprenden por lo menos aproximadamente 99%, por lo menos aproximadamente 98%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos- aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 54%, por lo menos aproximadamente 53%, por lo menos aproximadamente 52% o por lo menos aproximadamente 51% de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En modalidades preferidas, las células de los cultivos celulares o poblaciones de células comprenden células humanas. En otras modalidades, los procesos descritos en la presente producen cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 24%, por lo menos aproximadamente 23%, por lo menos aproximadamente 22%, por lo menos aproximadamente 21%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 19%, por lo menos aproximadamente 18%, por lo menos aproximadamente 17%, por lo menos aproximadamente 16%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 14%, por lo menos aproximadamente 13%, por lo menos aproximadamente 12%, por . lo menos aproximadamente 11%, por lo menos aproximadamente 10%, por - lo menos aproximadamente - 9%, por lo menos aproximadamente 8%, por lo menos aproximadamente 7%, por- lo menos aproximadamente 6%, por lo menos aproximadamente 5%, por lo menos aproximadamente 4%, por lo menos aproximadamente 3%, por lo menos aproximadamente 2% o por lo menos aproximadamente 1% de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En modalidades preferidas, las células del cultivo celulares o poblaciones de células comprenden células humanas. En algunas modalidades, el porcentaje de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo en los cultivos celulares o poblaciones se calcula sin consideración a las células alimentadoras remanentes en el cultivo. Todavía otras modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden mezclas de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo y células de endodermo definitivo PDXl-negativos. Por ejemplo, se pueden producir cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden por lo menos aproximadamente 5 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 95 células de endodermo definitivo PDXl-negativos. En otras modalidades, se pueden producir cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden por lo menos aproximadamente 95 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 5 células de endodermo definitivo PDXl-negativo. Adicionalmente, se contemplan cultivos, celulares - o poblaciones de células que comprenden otras . proporciones de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo a células de endodermo definitivo PDX1-negativo. Por ejemplo, composiciones que comprenden por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1,000,000 de células de endodermo definitivo PDXl-negativos, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 100,000 células de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 10,000 células de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1000 células de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 500 células de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 100 células de endodermo definitivo PDX1-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 10 células de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 5 células de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 4 células de endodermo definitivo PDX1-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 2 células de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 1 célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 2 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por aproximadamente cada 1 célula de endodermo definitivo PDX1-negativo, por lo menos aproximadamente 4 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 5 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 10 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDX1-negativo, por lo menos aproximadamente 20 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 50 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo-; PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente ' 100. células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo porcada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDX1-negativo, por lo menos aproximadamente 1000 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 10,000 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo, por lo menos aproximadamente 100,000 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo y por lo menos aproximadamente 1,000,000 células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo por cada aproximadamente 1 célula de endodermo definitivo PDXl-negativo son contempladas .
En algunas modalidades descritas en la presente, las células de endodermo definitivo PDXl-negativo de las cuales células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo son producidas son derivadas de células pluripotentes humanas, tales como células de tallo pluripotentes humanas. En ciertas modalidades, las células pluripotentes humanas son derivadas de una mórula, la masa celular interna de un embrión o los resaltos gonadales de un embrión. En otras ciertas modalidades, las células pluripotentes humanas - son derivadas de los tejidos -gonadales o germinales de una -estructura multicelular que se ha desarrollado más allá de la etapa -embriónica. Modalidades adicionales descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de- células, que comprenden células humanas, en las que se incluyen endodermo de intestino anterior PDXl-positivo humano, en donde la expresión del marcador PDXl es mayor que la expresión del marcador APP, S0X7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en por lo menos aproximadamente 2% de las células humanas. En otras modalidades, la expresión del marcador PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en por lo menos aproximadamente 5% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 15% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 20% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 25% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 30% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 35% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 40% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 45% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 50% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 55% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 60% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 65% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 70% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 75% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 80% • de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 85% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 90% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas o en por lo menos aproximadamente 98% de las células humanas. En algunas modalidades, el porcentaje de células humanas en los cultivos celulares o poblaciones de células en donde la expresión de PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZICl y/o NFM, es calculada sin consideración a las células alimentadoras . Se apreciará que algunas modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprenden células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo humanas, en donde la expresión de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste de S0X17, H0XA13 y H0XC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, S0X7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en de por lo menos aproximadamente 2% a más de por lo menos aproximadamente 98% de las células humanas. En algunas modalidades, la expresión de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste de SOX17, H0XA13 y H0XC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, S0X7, SOXl, ZICl y/o NFM en por lo menos aproximadamente 5% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 15% de las células 'humanas, en por lo menos aproximadamente 20% de las células humanas.- en por lo menos aproximadamente 25% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 30% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 35% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente A 0% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 45% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 50% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 55% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 60% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 65% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 70% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 75% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 80% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 85% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 90% de las células humanas, en por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas o en por lo menos aproximadamente 98% de las células humanas. En algunas modalidades, el porcentaje de células humanas en los cultivos celulares o poblaciones de células, en donde la expresión de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste de S0X17, H0XA13 y H0XC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, S0X7, SOXl, ZIC1 y/o NFM, se calcula sin consideración a las células alimentadoras . Modalidades adicionales descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células,' que- comprenden células endodérmicas mamíferas, tales como células 'de endodermo humanas, en donde la expresión del marcador PDXl es mayor que la expresión del marcador ' AFP, S0X7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en por lo menos aproximadamente 2% de las células endodérmicas. En otras modalidades, la expresión del marcador PDXl es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en por lo menos aproximadamente 5% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 10% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 15% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 20% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 25% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 30% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 35% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 40% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 45% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 50% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 55% de las células endodérmicas, en por 5 lo menos aproximadamente 60% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 65% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 70% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 75% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 80% de 10 - las células endodérmicas, en por . lo menos aproximadamente 85% • - de las células endodérmicas, en por lo- menos aproximadamente 90% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 95% de las células endodérmicas o en por lo menos aproximadamente 98% de las células endodérmicas. 15 Todavía otras modalidades descritas en la presente son concernientes con composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones de células, que comprende células endodérmicas mamíferas, tales como células endodérmicas humanas, en donde la expresión de uno o más marcadores 20 seleccionados del grupo que consiste de SOX17, HOXA13 y HOXC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, SOX7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en por lo menos aproximadamente 2% de las células endodérmicas. En otras modalidades, la expresión de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste de SOX17, 25 HOXA13 y H0XC6 es mayor que la expresión del marcador AFP, S0X7, SOXl, ZIC1 y/o NFM en por lo menos aproximadamente 5% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 10% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 15% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 20% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 25% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 30% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 35% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 40% de las células -endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 45% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 50% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 55% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 60% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 65% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 70% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 75% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 80% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 85% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 90% de las células endodérmicas, en por lo menos aproximadamente 95% de las células endodérmicas o por lo menos aproximadamente 98% de las células endodérmicas. Utilizando los procesos descritos en la presente, se pueden producir composiciones que comprenden células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo sustancialmente libres de otros tipos de células . En algunas modalidades de la presente invención, las poblaciones celulares o cultivos celulares de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo producidos mediante los métodos descritos está sustancialmente libre de células que expresan significativamente los genes marcadores AFP, S0X7, SOXl, ZIC1 y/o NFM. En una modalidad, una descripción de célula de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo basada en la expresión de genes marcadores es PDXl- -alto, AFP bajo, S0X-7-bajo, 'SOXl bajo, ZIC1 bajo y NFM bajo. ..-, Incremento de la expresión de PDXl en una célula de endodermo definitivo SOXl7-positi o Algunos aspectos de los procesos descritos en la presente son concernientes con métodos de incrementar la expresión del producto del gen PDXl en cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden las células de endodermo definitivo SOX17-positivo. En tales modalidades las células de endodermo definitivo S0X17-positivo se ponen en contacto con un factor de diferenciación en una cantidad que es suficiente para incrementar la expresión de producto de gen PDXl. Las células de endodermo definitivo SOX17-positivo se ponen en contacto con el factor de diferenciación pueden ser ya sea PDXl-negativo o PDXl-positivo. En algunas modalidades, el factor de diferenciación puede ser un retinoide. En ciertas modalidades, las células de endodermo definitivo S0X17-positivo se ponen en contacto con un retinoide a una concentración que fluctúa de aproximadamente 0.01 µM a aproximadamente 50 µM. En una modalidad preferida, el retinoide es RA. En otras modalidades de los procesos descritos en la presente, la expresión del producto de gen PDXl en cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden células de endodermo .definitivo S0Xl7-positivo es incrementada al poner en contacto - .' las células S0X17-positivo con un factor de diferenciación de la familia de factor de crecimiento de fibroblasto. Tales factores de diferenciación pueden ser usados ya sea solos o en conjunción con RA. En algunas modalidades, las células de endodermo definitivo SOX17-positivo se ponen en contacto con un factor de crecimiento de fibroblasto a una concentración que fluctúa de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En una modalidad preferida, el factor de crecimiento FGF es FGF-10. En algunas modalidades de los procesos descritos en la presente, la expresión del producto de gen PDXl en cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden células de endodermo definitivo SOX17-positivo es incrementada al poner el contacto las células SOX17-positivo con B27. Este factor de diferenciación puede ser usado ya sea solo o en conjunción con uno o ambos de retinoide y factores de diferenciación de la familia de FGF. En algunas modalidades, las células de endodermo definitivo S0Xl7-positivo se ponen en contacto con B27 a una concentración que fluctúa de aproximadamente 0.1% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v) . En una modalidad preferida, las células de endodermo definitivo SOX17-positivo se ponen en contacto con RA, FGF-10 y B27. Métodos para incrementar la expresión del producto de gen PDXl en cultivos celulares o poblaciones de células que comprenden células de endodermo definitivo SOX17-positivo se pueden llevar a cabo en medio de' cultivo, que contiene suero reducido - o sin suero. En algunas modalidades, .las -concentraciones de suero fluctúan dé aproximadamente 0.05% (v/v) a aproximadamente 20% (v/v) . En algunas modalidades, las células SOX17-positivas son cultivadas con reemplazo de suero.
Identificación de factores capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo Ciertos métodos de selección descritos en la presente son concernientes con métodos para identificar por lo menos un factor de diferenciación que es capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo. En algunas modalidades de estos métodos, poblaciones de células que comprenden células de endodermo definitivo, tales como células de endodermo definitivo humanas, son obtenidas. Luego la población de células es provista con un factor de diferenciación candidato. En un primer punto en el tiempo, que es previo a o aproximadamente al mismo tiempo como en la provisión del factor de diferenciación candidato, se determina la expresión de un marcador. Alternativamente, la expresión del marcador puede ser determinada después de proporcionar el factor de diferenciación candidato. En un segundo punto en el tiempo, que es subsecuente al primer punto en el tiempo y subsecuente a la etapa de proporcionar el factor de diferenciación candidato a la población celular, se determina otra- vez la expresión del mismo marcador. Si el factor de .diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de. las células de endodermo definitivo se determina al comparar la- expresión del marcador en el primer punto en el tiempo con la expresión del marcador en el segundo punto en el tiempo. Si la expresión del marcador en el segundo punto en el tiempo es incrementada o disminuida en comparación con expresión del marcador en el primer punto en el tiempo, entonces el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo. Algunas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente utilizan poblaciones de células o cultivos celulares que comprenden células de endodermo definitivo humanas. Por ejemplo, la población celular puede ser una población sustancialmente purificada de células de endodermo definitivo humanas. Alternativamente, la población de células puede ser una población enriquecida de células de endodermo definitivo humanas, en donde por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97% o mayor de por lo menos aproximadamente 97% de las células humanas en la población de células son células de endodermo definitivo humanas. En otras modalidades descritas en 1.a -. presente, la población de células comprende células humanas en-'.donde por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos.---aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lómenos • ".aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%,' por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85% o mayor de por lo menos aproximadamente 85% de las células humanas son células de endodermo definitivo humanas. En algunas modalidades, la población de células incluye células no humanas, tales como células alimentadoras no humanas. En otras modalidades, la población de células incluye células alimentadoras humanas. En tales modalidades por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 35%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 45%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95% o mayor de por lo menos aproximadamente 95% de las células humanas, diferentes a las células alimentadoras, son células de endodermo definitivo humanas . En algunas modalidades de los métodos de - selección descritos en la presente, las poblaciones de células comprenden además células de endodermo PDXl-positivo que incluyen, pero no limitados a, células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, la población de células se pone en contacto o es provista de otra manera con un factor de diferenciación candidato (prueba) . El factor de diferenciación candidato puede comprender cualquier molécula que puede tener el potencial para promover la diferenciación de células de endodermo definitivo humanas. En algunas modalidades descritas en la presente, el factor de diferenciación candidato comprende una molécula que se sabe que es un factor de diferenciación para uno o más tipos de células. En modalidades alternativas, el factor de diferenciación candidato comprende una molécula que no se sabe que promueva la diferenciación celular. En modalidades preferidas, el factor de diferenciación candidato comprende una molécula que no se sabe que promueva la diferenciación de células de endodermo definitivo humanas. En algunas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, el factor de diferenciación candidato comprende una molécula pequeña. En ^modalidades preferidas, una molécula 'pequeña es un.molecule que tiene una masa molecular de aproximadamente 10, OOO amu o menor. En algunas modalidades, la molécula pequeña comprende un retinoide. En algunas modalidades, la molécula pequeño comprende ácido retinoico. En otras modalidades descritas en la presente, el factor de diferenciación candidato comprende a polipéptido. El polipéptido puede ser cualquier polipéptido en los que se incluyen pero no limitados a, una glicoproteína, una lipoproteína, un proteína de matriz extracelular, una citocina, una quimiocina, una hormona de péptido, una interleucina o un factor de crecimiento. Polipéptidos preferidos incluyen factores de crecimiento. En algunas modalidades preferidas, los factores de diferenciación candidatos comprenden uno o más factores de crecimiento seleccionados del grupo que consiste de FGF10, FGF4, FGF2 y Wnt3B.
En algunas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, los factores de diferenciación candidatos comprenden uno o más factores de crecimiento seleccionados del grupo que consiste de amfiregulina, estimulador ß-linfocito, IL-16, timopoyetina, TRAIL/Apo-2, factor que mejora la colonia de Pre célula B, factor 1 relacionado con la diferenciación endotelial (EDFl) , polipéptido II que activa el monocito endotelial, factor inhibidor de migración de 'macrófago (MIF) , factor que mejora la célula- extérminadora' natural (NKEFA) , proteína 2 mofogené'tica de ueso,1 proteína -8 ' mofogenética de - hueso (proteína' osteogénica 2) , proteína 6 morfogénica de hueso, proteína 7 morfogénica de hueso, factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) , proteína CGI-149 (factor de diferenciación neuroendócrino) , citocina A3 (proteína 1-alfa inflamatoria de macrófago) , proteína relacionada con la diferenciación de célula de gliablastoma (GBDRl) , factor de crecimiento derivado de hepatoma, precursor de neuromedina U-25, factor de crecimiento vascular endolial (VEGF) , factor B de crecimiento vascular endotelial (VEGF-B) , precursor RANTES específico de célula T, factor 1 derivado de célula dendrítica tímica, transferina, interleucina-1 (IL-1) , interleucina-2 (IL-2) , interleucina-3 (IL 3) , interleucina-4 (IL 4) , interleucina-5 (IL 5), interleucina-6 (IL 6), interleucina-7 (IL 7), interleucina-8 (IL 8) , interleucina-9 (IL 9) , interleucina-10 (IL 10), interleucina- 11 (IL 11), interleucina-12 (IL 12), interleucina-13 (IL 13) , factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF) , factor estimulador de colonia de macrófago de granulocito (GM-CSF) , factor estimulador de colonia de macrófago (M-CSF) , eritropoyetina, trombopoyetina, vitamina D3, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor neurotrófico derivado de cerebro, factor inhibidor de leucemia, hormona tiroides, factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) , aFGF, FGF-4, FGF-6, factor de crecimiento de queratinocito (KGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor-BB de crecimiento derivado de plaqueta, factor de crecimiento de nervio beta, activina A, factor beta 1 de crecimiento transformante (TGF-ßl) , interferón-a, interferón-ß, interferón-?, factor- de necrosis de tumor, factor-ß de necrosis de tumor, actividad promotora de estallido (BPA) , actividad promotora de eritroide (EPA) , PGE2, factor-1 de crecimiento de insulina (IGF-I) , IGF-II, factor de crecimiento de neurotrofina (NGF) , neutrofina-3, neutrofina 4/5, factor neurotrófico ciliar, nexina derivada de glial, dexametasona, ß-mercaptoethanol, ácido retinoico, hidroxianisol butilado, 5-azacitidina, Anfotericina B, ácido ascórbico, ascorbato, isobutilxantina, indometacina, ß-glicerolfosfato, nicotinamida, DMSO, tiazolidindionas, TWS 119, oxitocina, vasopresina, hormona estimuladora de melanocito, corticortropina, lipotropina, tirotropina, hormona de crecimiento, prolactina, hormona luteinizante, gonadotropina coriónica humana, hormona estimuladora de folículo, factor que libera corticotropina, factor que libera gonadotropina, factor que libera prolactina, factor inhibidor de prolactina, factor que libera hormona de crecimiento, somatostatina, factor que libera tirotropina, péptido relacionado con gen de calcitonina, hormona paratiroides, péptido 1 semejante a glucagón, polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa, gastrina, secretina, colecistocinina, motilina, péptido intestinal vasoactivo, sustancia1 P, polipéptido .pancreático,-' péptido tirosina, neuropéptido tirosina, insulina, glucagón, lactógeno placental, relaxina, angiotensina II, calcitriol, péptido natriurético atrial, y melatonina, tiroxina, triyodotironina, calcitonina, estradiol, estrona, progesterona, testosterona, cortisol, corticosterona, aldosterona, epinefrina, norepinefrina, androstieno, calcitriol, colágeno, dexametasona, ß-mercaptoetanol, ácido retinoico, hidroxianisol butilado, 5-azacitidina, anfotericina B, ácido ascórbico, ascorbato, isobutilxantina, indometacina, ß-glicerolfosfato, nicotinamida, DMSO, tiazolidindionas, y TWS119. En algunas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, el factor de diferenciación candidato es provisto a la población de células en una o más concentraciones. En algunas modalidades, el factor de diferenciación candidato es provisto a la población de células de tal manera que la concentración del factor de diferenciación candidato en el medio que rodea a las células fluctúa de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 10 mg/ml. En algunas modalidades, la concentración del factor de diferenciación candidato en el medio que rodea a las células fluctúa de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1 mg/ml. En otras modalidades, la concentración del factor de diferenciación candidato en el medio que rodea a las células fluctúa de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 µg/ml. En, todavía otras modalidades/. • la concentración del factor de diferenciación candidatoven .el :medio que rodea a las células fluctúa de aproximadamente" .100 ng/ml a aproximadamente 10 µg/ml. En modalidades preferidas, la concentración del factor de diferenciación candidato en el medio que rodea a las células es aproximadamente 5 ng/ml, aproximadamente 25 ng/ml, aproximadamente 50 ng/ml, aproximadamente 75 ng/ml, aproximadamente 100 ng/ml, aproximadamente 125 ng/ml, aproximadamente 150 ng/ml, aproximadamente 175 ng/ml, aproximadamente 2 20000 nngg//mmll,, aproximadamente 225 nngg//mmll,, aproximadamente 250 ng/ml, aproximadamente 275 nngg//mmll,, aproximadamente 300 ng/ml, aproximadamente 325 ng/ml, aproximadamente 350 ng/ml, aproximadamente 375 ng/ml, aproximadamente 400 ng/ml, aproximadamente 4 419 ?2. -55J iniyg//ImILJl_ f, aproximadamente 450 ng/ml, aproximadamente 475 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 525 ng/ml, aproximadamente 550 ng/ml, aproximadamente 575 ng/ml, aproximadamente 600 ng/ml, aproximadamente 625 ng/ml, aproximadamente 650 ng/ml, aproximadamente 675 ng/ml, aproximadamente 700 ng/ml, aproximadamente 725 ng/ml, aproximadamente 750 ng/ml, aproximadamente 775 ng/ml, aproximadamente 800 ng/ml, aproximadamente 825 ng/ml, aproximadamente 850 ng/ml, aproximadamente 875 ng/ml, aproximadamente 900 ng/ml, aproximadamente 925 ng/ml, aproximadamente 950 ng/ml, aproximadamente 975 ng/ml, aproximadamente 1 µg/ml, " aproximadamente 2 µg/ml, aproximadamente 3 :µg/ml, aproximadamente 4 µg/ml, aproximadamente 5 µg/ml, aproximadamente 6 . µg/ml, aproximadamente 7 µg/ml, aproximadamente 8 µg/ml, aproximadamente 9 µg/ml, aproximadamente 10 µg/ml, aproximadamente 11 µg/ml, aproximadamente 12 µg/ml, aproximadamente 13 µg/ml, aproximadamente 14 µg/ml, aproximadamente 15 µg/ml, aproximadamente 16 µg/ml, aproximadamente 17 µg/ml, aproximadamente 18 µg/ml, aproximadamente 19 µg/ml, aproximadamente 20 µg/ml, aproximadamente 25 µg/ml, aproximadamente 50 µg/ml, aproximadamente 75 µg/ml, aproximadamente 100 µg/ml, aproximadamente 125 µg/ml, aproximadamente 150 µg/ml, aproximadamente 175 µg/ml, aproximadamente 200 µg/ml, aproximadamente 250 µg/ml, aproximadamente 300 µg/ml, aproximadamente 350 µg/ml, aproximadamente 400 µg/ml, aproximadamente 450 µg/ml, aproximadamente 500 µg/ml, aproximadamente 550 µg/ml, aproximadamente 600 µg/ml, aproximadamente 650 µg/ml, aproximadamente 700 µg/ml, aproximadamente 750 µg/ml, aproximadamente 800 µg/ml, aproximadamente 850 µg/ml, aproximadamente 900 µg/ml, aproximadamente 950 µg/ml, aproximadamente 1000 µg/ml o mayor de aproximadamente 1000 µg/ml. En ciertas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, la población de células es provista con un- : factor de diferenciación candidato que comprende cualquier .molécula diferente' al - facto : de diferenciación -de intestino anterior. Por ejemplo, en algunas modalidades, la población de células es provista con un factor de diferenciación candidato que comprende cualquier molécula diferente a un retinoide, un miembro de la superfamilia TGFß de factores de crecimiento, FGF10 o FGF4. En algunas modalidades, la población de células es provista con un factor de diferenciación candidato que comprende cualquier molécula diferente a ácido retinoico. En algunas modalidades, las etapas de los métodos de selección descritos en la presente comprenden determinar la expresión de por lo menos un marcador en un primer punto en el tiempo y un segundo punto en el tiempo. En algunas de estas modalidades, el primer punto puede ser previo a o aproximadamente el mismo tiempo como la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato. Alternativamente, en algunas modalidades, el primer punto en el tiempo es subsecuente a la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades, la expresión de una pluralidad de marcadores es determinada en un primer punto en el tiempo . Además de determinar la expresión de por lo menos un marcador en un primer punto en el tiempo, algunas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente contemplan determinar la expresión de por lo menos un marcador en un segundo punto en el tiempo, que es subsecuente al primer punto en el tiempo y que es subsecuente a la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato. En tales modalidades, la expresión del mismo marcador es determinada tanto en el primero como en el segundo punto en el tiempo. En algunas modalidades, la expresión de una pluralidad de marcadores es determinada tanto en los primeros como en los segundos puntos en el tiempo. En tales modalidades, la expresión de la misma pluralidad de marcadores es determinada tanto en los primeros como los segundos puntos en el tiempo. En algunas modalidades, la expresión del marcador es determinada en una pluralidad de puntos en el tiempo, cada uno de los cuales es subsecuente al primer punto en el tiempo y cada uno de los cuales es subsecuente a la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato. En ciertas modalidades, la expresión del marcador es determinada mediante Q-PCR. En otras modalidades, la expresión del marcador es determinada mediante inmunocitoquímica. En ciertas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, el marcador que tiene su expresión es determinado en los primeros y segundos puntos en el tiempo es un marcador que está asociado con la diferenciación de células de endodermo definitivo humanas a células que son las precursoras de células que componen tejidos y/u órganos que son derivados del tubo intestinal. En "algunas modalidades,- los tejidos y/u órganos que son . derivados - del tubo intestinal comprenden células diferenciadas terminalmente. En algunas modalidades, el marcador es indicador de células pancreáticas o células precursoras pancreáticas. En modalidades preferidas, el marcador es factor-1 de caja homeótica pancreática-duodenal (PDXl) . En otras modalidades, el marcador es la caja homeótica Al3 (HOXA13) o caja homeótica C6 (HOXC6) . Adicionalmente, en otras modalidades, el marcador es indicador de células de hígado o células precursoras de hígado. En ciertas modalidades preferidas, el marcador es albúmina, antígeno específico de hepatocito (HSA) o caja homeótica 1 prospero-relacionado (PROX1) . En otras modalidades, el marcador es indicador de células de pulmón o células precursoras de pulmón. En algunas modalidades preferidas, el marcador es factor 1 de transcripción de tiroides (TITF1) . En todavía otras modalidades, el marcador es indicador de células intestinales o células precursoras intestinales. En modalidades preferidas adicionales, el marcador es villina, transportador 2 de glucosa (GLUT2), apolipoproteína Al (APOA1) , molécula 1 de adhesión celular vascular (VACMl) , factor de von Willebrand (VWF) , receptor 4 de quimiocina tipo CXC (CXCR4) o factor 2 de transcripción de caja homeótica tipo caudal (CDX2) . En todavía otras modalidades, el marcador es indicador de células del estómago o células precursoras del estómago. En modalidades preferidas --adicionales, el marcador es -VCAMl, VWF o CXCR4 : En otras ..modalidades, el marcador es indicador de células de tiroides o células precursoras de tiroides. En tales modalidades el marcador es TITF1. En todavía otras modalidades, el marcador es indicador de células de timo o células precursoras de timo. En algunas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, se permite que un tiempo suficiente transcurra entre la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato y la determinación de la expresión del marcador en el segundo punto en el tiempo. Un tiempo suficiente entre la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato y la determinación de la expresión del marcador en el segundo punto en el tiempo puede ser tan pequeño como de aproximadamente 1 hora a tan grande como de aproximadamente 10 días. En algunas modalidades, la expresión del por lo menos un marcador es determinada múltiples veces subsecuentemente a la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades, el tiempo suficiente es por lo menos aproximadamente 1 horas, por lo menos aproximadamente 6 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 42 horas, '- por. -lo menos aproximadamente 48 horas, por. lo menos aproximadamente 54 horas, por lo menos aproximadamente ' .60 horas, • por- lo menos aproximadamente 66 horas, por lo menos aproximadamente 72 horas, por lo menos aproximadamente 78-' horas,' por lo menos aproximadamente 84 horas, por lo menos aproximadamente 90 horas, por lo menos aproximadamente 96 horas, por lo menos aproximadamente 102 horas, por lo menos aproximadamente 108 horas, por lo menos aproximadamente 114 horas, por lo menos aproximadamente 120 horas, por lo menos aproximadamente 126 horas, por lo menos aproximadamente 132 horas, por lo menos aproximadamente 138 horas, por lo menos aproximadamente 144 horas, por lo menos aproximadamente 150 horas, por lo menos aproximadamente 156 horas, por lo menos aproximadamente 162 horas, por lo menos aproximadamente 168 horas, por lo menos aproximadamente 174 horas, por lo menos aproximadamente 180 horas, por lo menos aproximadamente 186 horas, por lo menos aproximadamente 192 horas, por lo menos aproximadamente 198 horas, por lo menos aproximadamente 204 horas, por lo menos aproximadamente 210 horas, por lo menos aproximadamente 216 horas, por lo menos aproximadamente 222 horas, por lo menos aproximadamente 228 horas, por lo menos aproximadamente 234 horas o por lo menos aproximadamente 240 horas . En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, se determina además si la expresión del marcador en -el segundo punto en el tiempo se ha incrementado o disminuido, > en comparación con la expresión de este marcador en el primer punto en el tiempo. Un incremento o disminución en la expresión del por lo menos un marcador indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de las células de endodermo definitivo. Similarmente, si se determina la expresión de una pluralidad de marcadores, se determina además si la expresión de la pluralidad de marcadores en el segundo punto en el tiempo se ha incrementado o disminuido, en comparación con la expresión de esta pluralidad de marcadores en el primer punto en el tiempo . ün incremento o disminución en la expresión del marcador puede ser determinada al medir o evaluar de otra manera la cantidad, nivel o actividad del marcador en la población de células en los primeros y segundos puntos en el tiempo. Tal determinación puede ser relativa a otros marcadores, por ejemplo expresión de gen de mantenimiento o absoluta. En ciertas modalidades, en donde la expresión del marcador es incrementado en el segundo punto en el tiempo en comparación con el primer punto en el tiempo, la cantidad de incremento es por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 60 veces, por lo menos aproximadamente 7.0 veces, por lo menos aproximadamente 80 veces, por. lo - menos aproximadamente 90 veces, por. lo menos aproximadamente 100 veces o más de por lo menos aproximadamente 100 veces. En algunas modalidades, la cantidad de incremento es menor de 2 veces. En modalidades en donde la expresión del marcador es disminuida en el segundo punto en el tiempo en comparación con el primer punto en el tiempo, la cantidad de disminución es por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 20 veces, por lo menos aproximadamente 30 veces, por lo menos aproximadamente 40 veces, por lo menos aproximadamente 50 veces, por lo menos aproximadamente 60 veces, por lo menos aproximadamente 70 veces, por lo menos aproximadamente 80 veces, por lo menos aproximadamente 90 veces, por lo menos aproximadamente 100 veces o más de por lo menos aproximadamente 100 veces. En algunas modalidades, la cantidad de disminución es menos de 2 veces . En algunas modalidades de los métodos de selección descritos en la presente, después de proporcionar la población de células con un factor de diferenciación candidato, las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a uno o más tipos de células del linaje de endodermo definitivo. En algunas modalidades, después de la provisión a la población de células con un factor 'de diferenciación candidato, las células de endodermo definitivo- .humanas s-e diferencian a células que son derivadas del tubo intestinal. Tales células incluyen, pero no están limitados a, células del páncreas, hígado, pulmones, estómago, intestino, tiroides, timo, faringe, vesícula biliar y vejiga urinaria, también como precursores de tales células. Adicionalmente, estas células pueden desarrollarse adicionalmente a estructuras de orden superiores tales como tejidos y/u órganos. Se apreciará que los métodos de selección similares a aquellos descritos anteriormente pueden ser usados para identificar uno o más factores de diferenciación capaces de promover la diferenciación de células de endodermo PDXl-positivo humanas en una población de células que comprende células de endodermo PDXl-positivo humanas. En ciertas modalidades, las células de endodermo PDXl-positivo humanas son células de endodermo de intestino anterior/intestino medio PDXl-positivo. En modalidades preferidas, las células de endodermo PDXl-positivo humanas son células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En otras modalidades preferidas, las células de endodermo PDXl-positivo humanas son células de endodermo PDXl-positivo de la porción posterior del intestino anterior. En modalidades especialmente preferidas, las células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo humanas son células multipotentes que se pueden diferenciar a célula, tejidos u órganos derivados de la porción anterior del tubo intestinal. ~ ' Identificación de f ctores capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo Aspectos de los métodos de selección descritos en la presente son concernientes con métodos para identificar uno o más factores de diferenciación capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDX1-negativos a Células de endodermo de intestino anterior PDX1-positivo. En tales métodos, un cultivo celular o población de células que comprende células de endodermo definitivo PDXl-negativo es obtenido y se determina la expresión of PDXl en el cultivo celular o población de células. Después de determinar a expresión de PDXl, las células del cultivo celular o población de células se ponen en contacto con un factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades, la expresión de PDXl es determinada al tiempo de contacto o brevemente después del contacto de las células con un factor de diferenciación candidato. Luego se determina la expresión de PDXl a uno o más tiempos después de contacto de las células con el factor de diferenciación candidato. Si la expresión de PDXl se ha incrementado después de contacto con el factor de diferenciación candidato en comparación con la expresión de PDXl antes del contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato es identificado como capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo del intestino anterior PDXl-positivo. En algunas modalidades, los métodos descritos anteriormente para identificar factores capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo también incluyen determinar la expresión del gen HOXA13 y/o el gen HOXC6 en el cultivo celular o población de células. En tales modalidades la expresión de HOXA13 y/o HOXC6 es determinada tanto antes como después que las células se han puesto en contacto con el factor de diferenciación candidato. Si la expresión de PDXl y H0XA13 se ha incrementado después del contacto con el factor de diferenciación candidato, en comparación con la expresión de PDXl y HOXA13 antes del contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato es capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. Similarmente, si la expresión de PDXl y H0XC6 se ha incrementado después del contacto con el factor de diferenciación candidato, en comparación con la expresión de PDXl y H0XC6 antes del contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato es identificado como capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo: PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl^positivo. En una modalidad preferida, un factor de diferenciación candidato es identificado como siendo capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo al determinar la expresión de PDXl, H0XA13 y HOXC6 tanto antes como después del contacto de las células del cultivo celular o población de células con el factor de diferenciación candidato. En modalidades preferidas, la expresión de PDXl, H0XA13 y/o H0XC6 es determinada mediante Q-PCR. Se apreciará que en algunas modalidades, la expresión de uno o más de PDXl, HOXA 13 y H0XC6 puede ser determinada al tiempo de contacto o brevemente después del contacto de las células de los cultivos celulares o poblaciones de células con un factor de diferenciación candidato en lugar de antes de poner en contacto las células con un factor de diferenciación candidato. En tales modalidades la expresión de uno o más de PDXl, HOXA 13 y H0XC6 al tiempo de contacto o brevemente 5 después del contacto de las células con un factor de diferenciación candidato es comparada con la expresión de uno o más de PDXl, H0XA13 y H0XC6 a una o más veces después del contacto de las células con un factor de diferenciación candidato. • ÍO ••- ... En algunas modalidades de. ".los métodos "descritos anteriormente, la una o "más veces -a las cuales se determina la .- expresión de PDXl después del contacto-; con las células con el factor de diferenciación candidato puede fluctuar de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 días. Por ejemplo, 15 la expresión de PDXl puede ser determinada aproximadamente 1 hora después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 horas después del contacto de las 20 células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 horas después del 25 contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 12 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 16 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 24 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 3 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 5 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 7 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 9 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato o más de 10 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato. Factores de diferenciación candidato para uso en los métodos descritos en la presente pueden ser seleccionados de compuestos, tales como polipéptidos y moléculas pequeñas. Por ejemplo, polipéptidos candidato pueden incluir, pero no están limitados a, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, proteínas de matriz extracelular, y péptidos sintéticos. En una modalidad preferida, el factor de crecimiento es de la familia FGF, por ejemplo FGF-10. Las moléculas pequeñas candidato incluyen, pero no están limitadas a, compuestos generados a partir de síntesis química combinatoria y productos naturales, tales como esteroides, esteroides, isoprenoides, terpenoides, fenilpropanoides, alcaloides y flavinoides. Se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte que miles de clases de moléculas pequeñas naturales y sintéticas están disponibles y que las moléculas pequeñas contempladas para uso en los métodos descritos en la presente no están limitadas a las clases ejemplificadas anteriormente. Comúnmente, las moléculas pequeñas tendrán un peso molecular menor de 10,000 amu. En una modalidad preferida, la molécula pequeña es un retinoide, por ejemplo RA.
Identificación de factores capaces de promover la diferenciación de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo Otros aspectos de los métodos de selección descritos en la presente son concernientes con métodos para identificar uno o más factores de diferenciación capaces de promover la diferenciación de células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo. En tales métodos, un cultivo celular o población de células que comprende células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo es obtenida y se determina la expresión 5 de un marcador en el cultivo celular o población de células . Después de determinar la expresión del marcador, las células del cultivo celular o población de células se ponen en contacto con un factor de diferenciación candidato. En algunas modalidades, la expresión del marcador .es determinada al ti de 10 - contacto o -previamente después de poner en contacto las células --. con un factor de diferenciación candidato. Luego la expresión del mismo marcador es determinada a una o más veces después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato. Si la expresión del marcador se ha incrementado o 15 disminuido después del contacto con el factor de diferenciación candidato, en comparación con la expresión del marcador antes del contacto con el factor de diferenciación candidato, el factor de diferenciación candidato es identificado como capaz de promover la diferenciación de células de endodermo de 20 intestino anterior PDXl-positivo. En modalidades preferidas, la expresión del marcador es determinada mediante Q-PCR. En algunas modalidades de los métodos descritos anteriormente, la una o más veces a las cuales se determina la expresión del marcador después del contacto de las células con 25 el factor de diferenciación candidato puede fluctuar de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 días. Por ejemplo, la expresión del marcador puede ser determinada a aproximadamente 1 hora después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 horas: después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 12 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 16 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 24 horas después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 2 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 3 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 4 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 5 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 6 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 7 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 8 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 9 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato, aproximadamente 10 días después del contacto de las células con el factor de diferenciación candidato o más de 10 días después del contacto: de las células con el factor de diferenciación candidato. - _ '.Gomo se describe previamente, los factores de diferenciación candidatos para uso en los métodos descritos enla presente pueden ser seleccionados de compuestos tales como ' polipéptidos y moléculas pequeñas. Aunque cada uno de los métodos revelados en la presente han sido descritos con respecto a células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo, se apreciará que en ciertas modalidades, estos métodos pueden ser usados para producir composiciones que comprenden las células de endodermo de intestino anterior/intestino medio PDXl-positivo que son descritas en la presente y/o las células de endodermo PDXl-positivo de la porción posterior del intestino anterior que son descritas en la presente. Además, cualquiera de los tipos de células de endodermo PDXl-positivo reveladas en esta especificación pueden ser utilizadas en los métodos de selección descritos en la presente. Habiendo descrito en general esta invención, se puede obtener un entendimiento adicional por referencia a ciertos ejemplos específicos que son proporcionados en la presente por propósitos de ilustración solamente y no pretenden ser limitantes .
EJEMPLOS Muchos de los ejemplos a continuación describen el uso- de células humanas pluripotentes. Métodos para- producir • células humanas pluripotentes- son bien conocidos en el arte y han sido descritos en numerosas publicaciones científicas, en las que -se incluyen las patentes estadounidenses Nos. 5,453,357, 5,670,372, 5,690,926, 6,090,622, 6,200,806 y 6,251,671, también como la publicación de solicitud de patente estadounidense No. 2004/0229350.
EJEMPLO 1 Células ES humanas Para los estudios de desarrollo de endodermo se usaron células de tallo embriónico humanas, que son pluripotentes y se pueden dividir aparentemente de manera indefinida en cultivo en tanto que mantienen un cariotipo normal. Células ES fueron derivadas de la masa celular interna del embrio de 5 días utilizando ya sea métodos inmunológicos o mecánicos para aislamiento. En particular, la línea de células de tallo embriónico humana hESCyt-25 fue derivado de un embrio congelado supernumerario de un ciclo de fertilización in vitro enseguida del consentimiento por escrito del paciente. Después de deshelar el blastocisto rallado fue depositado sobre fibroblastos embriónicos de ratón (MEF) , en medio de ES (DMEM, FBS al 20%, sin aminoácidos esenciales, beta-mercaptoetanol, complemento de ITS) . El embrión adherido a la caja de cultivo y después de aproximadamente dos semanas, las regiones de hESC sin • diferenciar fueron transferidas a nuevas cajas con MEF. La transferencia -se llevó a cabo con corte mecánico y una breve digestión con dispasa, seguida por remoción mecánica de los grupos de células, lavado y re-deposición. Desde la derivación, hESCyt-25 se ha hecho pasar serialmente más de 100 veces. Se emplea la línea de células de tallo embriónico humana hESCyt-25 como material de partida para la producción de endodermo definitivo. Se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte que células de tallo u otras células pluripotentes pueden también ser usadas como material de partida para los procedimientos de diferenciación descritos en la presente. Por ejemplo, células obtenidas de resaltos gonadales embriónicos, que pueden ser aisladas mediante métodos conocidos en el arte, pueden ser usadas como material de partida de células pluripotentes.
EJEMPLO 2 Caracterización de hESCvt-25 La línea de células de tallo embriónico humana, hESCyt-25 ha mantenido una morfología, cariotipo, crecimiento y propiedades de auto-renovación normales en más de 18 meses en cultivo. Esta línea celular exhibe fuerte inmunoreactividad para los antígenos 0CT4, SSEA-4 y TRA-1-60, todos los cuales son característicos de hESC sin diferenciar y exhiben actividad fosfatasa alcalina también como una morfología idéntica a otras - líneas de -,hESC establecidas . Además, la línea de células de tallo humano, hESCyt-25,.. también forma fácilmente cuerpos embrioides • (EB) cuando . es cultivada en suspensión. Como demostración de su naturaleza pluripotente, hESCyT-25 se diferencia a varios tipos de células que representan las tres capas de germinación principal. La producción de ectodermo fue demostrada mediante Q-PCR para ZICl también como inmunocitoquímica (ICC) para nestina y marcadores neuronales más maduros . El teñido inmunocitoquímico para ß-III tubulina fue observado en grupos de células alargadas, características de neuronas prematuras. Previamente, se trataron los EB en suspensión con ácido retinoico, para inducir la diferenciación de células de tallo pluripotentes a endodermo visceral (VE) , un linaje extra-embriónico. Las células tratadas expresaron altos niveles de a-fetoproteína (AFP) y SOX7, dos marcadores de VE, por 54 horas de tratamiento. Las células diferenciadas en monocapa expresaron AFP en parches esporádicos como se demuestra mediante teñido inmunocitoquímico. Como se describirá posteriormente en la presente, la linea celular hESCyT-25 fue también capaz de formar endodermo definitivo, tal como es validado mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) e inmunocitoquímica para S0X17, en ausencia de expresión de AFP. Para demostrar la diferenciación a mesodermo, los EB de diferenciación fueron analizados en cuanto a expresión genérica de braquiuria en varios puntos en el tiempo. La expresión de braquiuria se . incrementó progresivamente en el curso -del experimento. En vista de lo anterior, la línea • hESCyT-25 es pluripotente como se muestra por la capacidad de formar células que representan las tres capas germinales.
EJEMPLO 3 Producción de anticuerpo SOXl7 Un obstáculo primario para la identificación de endodermo definitivo en cultivos de hESC es la carencia de herramientas apropiadas. Por consiguiente se emprende la producción de un anticuerpo creado contra proteína S0X17 humana . El marcador S0X17 es expresado en todo el endodermo definitivo a medida que se forma durante la gastrulación y su expresión es mantenida en el tubo intestinal (aunque los niveles de expresión varían a lo largo del eje A-P) hasta alrededor del inicio de la organogénesis. El S0X17 es también expresado en un subconjunto de células de endodermo extra-embriónicas . No se ha observado ninguna expresión de esta proteína en mesodermo o ectodermo. Se ha descubierto ahora que S0X17 es un marcador apropiado para el linaje de endodermo definitivo cuando es usado en conjunción con marcadores para excluir linajes extra-embriónicos . Como se describe . en detalle en la presente, el anticuerpo: S0X17 fue utilizado • para examinar específicamente efectos de varios tratamientos y procedimientos de diferenciación dirigidos .a -' la producción de células de endodermo definitivo S0X17-positivo. Otros anticuerpos reactivos a AFP, SPARC y trombomodulina fueron también usados para descartar la producción de endodermo visceral y parietal (endodermo extra-embriónico) . Con el fin de producir un anticuerpo contra SOX17, una porción del cADN de SOX17 humano (SEQ ID NO: 1) correspondiente a los aminoácidos 172-414 (SEQ ID NO: 2) en el extremo carboxiterminal de la proteína SOX17 (figura 2) fue usada para inmunización genética en ratas en la compañía de producción de anticuerpos, GENOVAC (Freiberg, Alemania de acuerdo con los procedimientos desarrollados ahí. Procedimientos para inmunización genética se pueden encontrar en las patentes estadounidenses Nos. 5,830,876, 5,817,637, 6,165,993 y 6,261,281 también como las publicaciones de solicitud de patente internacional Nos. WO00/29442 y W099/13915. Otros métodos apropiados para inmunización genética son también descritos en la literatura que no es de patentes . Por ejemplo, Barry et al. describe la producción de anticuerpos monoclonales mediante inmunización genética en Biotechniques 16: 616-620, 1994. Ejemplos específicos de métodos de inmunización genética para producir anticuerpos específicos • contra proteínas se pueden encontrar por ejemplo en Costaglia et al., (1998) - Genetic immunizatiOn against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies recognizing the native receptor, J. Immunol. 160: 1458-1465; Kilpatrick et al (1998) Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor, Hybridoma 17: 569-576; Schmolke et al., (1998) Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodies generated by DNA immunization, J. Virol. 72: 4541-4545; Krasemann et al., (1999) Generation of monoclonal antibodies against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy, J. Biotechnol. 73: 119-129; y Ulivieri et al., (1996) Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization, J. Biotechnol. 51: 191-194. SOX7 y SOX18 son los parientes de la familia Sox más cercanos a SOX17 como se ilustra en el dendograma relacional mostrado en la figura 3. Se usó el polipéptido SOX7 humano como control negativo para demostrar que el anticuerpo SOX17 producido mediante inmunización genética es específico para SOX17 y no reacciona con su miembro de familia más cercano. En particular, SOX7 y otras proteínas fueron expresados en fibroblastos humanos y luego analizados en cuanto a reactividad cruzada con el anticuerpo SOX17 mediante Western blot e ICC. Por ejemplo, los siguientes métodos fueron utilizados para la producción de los vectores de expresión SOX17, SOX7 y EGFP, su transfección a fibroblastos humanos y análisis mediante Western blot. Los vectores de expresión usados para la producción de SOX17, SOX7 y EGFP fueron pCMV6 (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) , pCMV-SPORT6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y pEGFP-Nl (Clonetech, Palo Alto, CA) , respectivamente. Para la producción de proteína, fibroblastos humanos MDX inmortalizados con telomerasa fueron transfectados transitoriamente con ADN superenrrollado en presencia de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Lisados celulares totales fueron recolectados 36 horas post-transfección en TRIS-HC1 50 mM (pH 8), NaCl 150 mM, SDS al 0.1%, desoxicolato al 0.5%, que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) . El análisis de Western blot de 100 de proteínas celulares, separadas mediante SDS-PAGE sobre NuPAGE (gradiente de poliacrilamida 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) , y luego transferidas mediante electro-absorción sobre membranas de PDVF (Hercules, CA) , fueron probadas con una dilución 1/1000 del anti-suero de S0X17 de rata en TRIS-HCl 10 mM (pH 8), NaCl 150 mM, BSA al 10%, Tween-20 al 0.05% (Sigma, St. Louis, MO) , seguido por IgG anti-rata conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) , y revelado por medio de teñido de fasfatada alcalina negra de Vector (Vector Laboratories, 'Burlingame•,; ".CA) . El estándar de tamaño de proteínas usado fueron marcadores de color de amplio intervalo (Sigma, St . Louis, MO) . En la figura 4, extractos de proteína fabricados a partir de células de fibroblasto humano que fueron transfectadas transitoriamente con cADN de S0X17, SOX7 o EGFP fueron probadas sobre análisis de Western blot con el anticuerpo SOX17. Solamente el extracto de proteína de células transfectadas de hSOX17 produjeron una banda de -51 Kda que coincidió estrechamente con el peso molecular de 46 Kda predecido de la proteína SOX17 humana. No hubo reactividad del anticuerpo SOX17 a extractos elaborados ya sea de células transfectadas SOX7 o EGFP humanas. Además, el anticuerpo S0X17 claramente marcó los núcleos de células de fibroblasto humanas transfectadas con el constructo de expresión hS0X17 pero no marcó células transfectadas con EGFP solo. Como tal, el anticuerpo S0X17 exhibe especificidad mediante ICC.
EJEMPLO 4 Validación de anticuerpo SOXl7 como marcador de endodermo definitivo hESC parcialmente diferenciados fueron co-marcadas con anticuerpo S0X17 y AFP para demostrar que el anticuerpo S0X17 es específico para proteína S0X17 humana y además marca endodermo definitivo. Se ha demostrado que el S0X17, S0X7 (que es un miembro estrechamente relacionado del subgrupo F de la familia "del gen SOX (figura 3) ) y AFP son cada un expresados en endodermo visceral. Sin embargo, AFP y S0X7 no son expresados en células de endodermo definitivo a niveles detectables mediante ICC y así, pueden ser usados como marcadores negativos para células de endodermo definitivo bonifide. Se demostró que el anticuerpo S0X17 marca poblaciones de células que existen como agrupamiento discretos de células o son entrelazados con células AFP positivas. En particular, la figura 5A muestra que números pequeños de células S0X17 fueron co-marcadas con AFP; sin embargo, también se encontraron regiones en donde hubo poco o nada de células AFP+ en el campo de células S0X17+ (figura 5B) . Similarmente, puesto que el endodermo parietal ha sido reportado que expresa SOX17, la co-marcación de anticuerpo con SOX17 junto con los marcadores parietales SPARC y/o trombomodulina (TM) pueden ser usados para identificar las células S0X17+ que son endodermo parietal. Como se muestra en las figuras 6A-C, las células de endodermo parietales trombomodulina y S0X17 co-marcadas fueron producidas mediante diferenciación aleatoria de células hES. En vista de los experimentos de marcación de células anteriores, la identidad de una célula de endodermo definitivo puede ser establecida por el perfil del marcador S0X17hl/AFPl0 [TM10 o SPARC10] . En otras palabras, la expresión de marcador S0X17 es mayor que la expresión del marcador AFP, que es característica del endodermo visceral y los marcadores TM o SPARC, que son característicos de "endodermo parietal. Así, -aquellas células positivas para SOX17 pero negativas para AFP y negativas para TM o SPARC son de endodermo definitivo. Como una evidencia adicional de la especificidad del perfil marcador SOX17 i/AFPlo/TMlo/SPARCl0 como predictivo de endodermo definitivo, la expresión del gen SOX17 y AFP fue comparada cuantitativamente con el número relativo de células marcadas por anticuerpo. Como se muestra en la figura 7A, hESC tratadas con ácido retinoico (inductor de endodermo visceral) , o activina A (inductor de endodermo definitivo) , dio como resultado una diferencia de 10 veces en el nivel de expresión de mARN de SOX17. Este resultado reflejó la diferencia de 10 veces en el número de células marcadas con anticuerpo SOX17 (figura 7B) . Además, como se muestra en la figura 8A, el tratamiento con activina A de hESC suprimió la expresión del gen AFP por 6.8 veces en comparación con ningún tratamiento. Esto fue reflejado visualmente por una disminución espectacular en el número de células marcadas con AFP en estos cultivos como se muestra en las figuras 8B-C. Para cuantificar esto 5 adicionalmente, se demostró que esta disminución de aproximadamente 7 veces en la expresión del gen AFP era el resultado de una disminución 7 veces similar en el número de células marcadas con anticuerpo AFP tal como se mide mediante citometría de flujo (figuras 9A-B) . - Este resultado es 10- .-extremadamente significativo en - que " -indica que " ' cambios : •• -cuantitativos en expresión genética como se ve -mediante ' Q-PCR refleja cambios en especificación de tipo de célula como se -observa mediante teñido de anticuerpo. La incubación de hESC en presencia de miembros de la 15 familia nodal (Nodal, activina A y activina B-NAA) dio como resultado un incremento significativo en células marcadas con anticuerpo S0X17 con respecto a tiempo. Por 5 días de tratamiento con activina continuo más del 50% de las células fueron marcadas con S0X17 (figuras 10A-F) . Hubieron pocas o 20 ningunas células marcadas con AFP después de 5 días de tratamiento con activina. En resumen, el anticuerpo producido contra los 242 aminoácidos carboxi-terminales de la proteína S0X17 humana identificó la proteína S0X17 humana sobre análisis de Western 25 blot pero no reconoció S0X7, su pariente de familia Sox más cercano. El anticuerpo S0X17 reconocido como subconjunto de células en la diferenciación de cultivos hESC que fueron principalmente S0Xl7+/AFPlo _ (mayor de 95% de células marcadas) también como un porcentaje pequeño (<5%) de células que comarcan para S0X17 y AFP (endodermo visceral) . El tratamiento de cultivos de hESC con activinas dio como resultado una elevación notable de expresión de gen S0X17 también como células SOX17 marcadas y suprimió espectacularmente la expresión de mARN de AFP y el número de célula marcadas con anticuerpo AFP.
. EJEMPLO 5 Análisis de expresión genética mediante Q-PCR En los siguientes experimentos, RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) fue el análisis principal usado para seleccionar los efectos de varios tratamientos en cuanto a diferenciación de hESc. En particular, mediciones en tiempo real de expresión genética fueron analizadas en cuanto a múltiples genes marcadores en múltiples puntos en el tiempo mediante Q-PCR. Genes marcadores característicos de los tipos de células deseados también como indeseables fueron evaluados para ganar un mejor entendimiento de la dinámica global de las poblaciones celulares. La fuerza del análisis de Q-PCR incluye su extrema sensibilidad y relativa facilidad de desarrollo de los marcadores necesarios, ya que la secuencia de genoma está disponible fácilmente. Además, la sensibilidad extremadamente alta de Q-PCR permite la detección de expresión de gen de un número relativamente pequeño de células dentro de una población mucho más grande. Además, la capacidad de detectar niveles muy bajos de expresión genética proporciona indicaciones para "polarización de diferenciación" dentro de la población. La polarización hacia una ruta de diferenciación particular, antes de la diferenciación abierta de aquellos fenotipos celulares, es irreconocible utilizando técnicas inmunocitoquímicas . Por esta razón, Q-PCR proporciona un método de análisis que es por lo menos complementario y potencialmente mucho superior a las técnicas inmunocitoquímicas para " -seleccionar el éxito de tratamiento de diferenciación. Adicionalmente, Q-PCR proporciona un mecanismo mediante el cual evaluar el éxito de un protocolo de diferenciación en un formato cuantitativo a escalas de semi-alto rendimiento de análisis. El procedimiento emprendido en la presente fue efectuar cuantificación relativa utilizando química SYBR Green sobre un instrumento Rotor Gene 3000 (Corbett Research) y un formato de RT-PCR de dos etapas . Tal procedimiento permitió la formación de bancos de muestras de cADN para análisis de genes marcadores adicionales en el futuro, evitando así la variabilidad en la eficiencia de transcripción inversa entre muestras . Los cebadores fueron diseñados para caer sobre fronteras exón-exón o abarcaron interones de por lo menos 800 bp cuando sea posible ya que esto ha sido determinado empíricamente para eliminar la amplificación de ADN genómico contaminante. Cuando los genes marcadores fueron empleados que no contenían intrones o poseen pseudogenes, se efectuó tratamiento de DNasa I de muestras de ARN. Se usó sistemáticamente Q-PCR para medir la expresión genética de múltiples marcadores de tipos de células objetivo y no objetivo con el fin de proporcionar una descripción de perfil amplio de expresión genética en muestras de células. Los •- .marcadores relevantes por " las- fases prematuras de diferenciación de hESC (específicamente ectodermo, mesodermo, endodermo definitivo y endodermo extra-embriónico) y para los cuales los conjuntos de cebador validados están disponibles son proporcionados a continuación en la Tabla 1. La especificidad humana de estos conjuntos de cebador también se ha demostrado. Este es un hecho importante puesto que las hESC fueron frecuentemente cultivadas sobre capas alimentadoras de ratón. Más comúnmente, muestras por triplicado fueron tomadas para cada condición y analizadas independientemente por duplicado para determinar la variabilidad biológica asociada con cada determinación cuantitativa. Para generar una de PCR, el ARN total fue aislado utilizando RNeasy (Qiagen) y cuantificado utilizando RiboGreen (sondas moleculares) . La transcripción inversa de 350-500 ng de ARN total se llevó a cabo utilizando el equipo de transciptasa inversa iScript (BioRad) , que contiene una mezcla de cebadores oligo-dT y aleatorios. Cada reacción de 20 µL fue diluida subsecuentemente a un volumen total de 100 µL y se usaron 3 µL en cada reacción de Q-PCR de 10 µL que contiene 400 nM de cebadores directos e inversos y mezcla maestra SYBR Green 5 µL 2X (Qiagen) . Se usaron parámetros de ciclos de dos etapas empleando una desnaturalización de 5 segundos a 85-9 °C (seleccionado específicamente de acuerdo con la temperatura de fusión del amplicon para cada conjunto de cebadores) seguido por. un recocido/extensión . de 45 segundos- a 60 °C. Los datos de fluores-cencia fueron recolectados durante los últimos 15 segundos de cada fase de extensión. Una serie de dilución de 3 puntos, de 10 veces fue usada para generar la curva estándar para cada corrida y umbrales de ciclos (Ct) fueron convertidos a valores cuantitativos en base a esta curva estándar. Los valores cuantificados para cada muestra fueron normalizados al desempeño de gen de mantenimiento y luego el promedio y desviaciones estándar fueron calculados para muestras por triplicado. En la conclusión del ciclo de PCR, un análisis de curva de fusión fue efectuada para indagar la especificidad de la reacción. Un solo producto específico fue indicado por un pico individual a la Tm apropiada para aquel amplicon de PCR. Además, las reacciones efectuadas sin transcriptasa inversa sirvieron como el control negativo y no amplifican. Una primera etapa en el establecimiento de la metodología Q-PCR fue la validación de genes de mantenimiento apropiados (HG) en el sistema experimental. Puesto que los HG fueron usados para normalizarse a través de muestras para la entrada de ARN, integridad de ARN y eficiencia de RT, fue de valor que los HG exhibieron un nivel de expresión constante con el paso del tiempo en todos los tipos de muestras con el fin de que la normalización sea significativa. Se midieron los niveles de expresión de Cyclophilin Gr hypoxanthine phosphoribosyltransf erase 1 (HPRT) r beta-2-mícroglobulin , hydroxymethylbiane synthase (HMBS) r TATA-binding protein (TBP) r y glucuronidase beta (GUS) en la diferenciación de hESC. Los resultados indican que los niveles de expresión de beta-2-microglobulina se incrementaron en el curso de diferenciación y por consiguiente se excluyó el uso de este gen para la normalización. Los otros genes exhibieron niveles de expresión consistente con el tiempo también como a través de los tratamientos. Se usaron sistemáticamente tanto ciclofilina G y GUS para calcular un factor de normalización para todas las muestras. El uso de múltiples HG reduce simultáneamente la variabilidad inherente al proceso de normalización e incrementa la confiabilidad de los valores de expresión de gen relativos. Después de obtener genes para uso en la normalización, se utilizó luego Q-PCR para determinar los niveles de expresión de gen relativos de muchos genes marcadores a través de muestras que reciben diferentes tratamientos experimentales . Los genes marcadores usados han sido escogidos debido a que exhiben enriquecimiento en poblaciones específicas representativas de las capas generales prematuras y en particular se en enfocado en conjuntos de genes que son expresados diferencialmente en endodermo definitivo y endodermo extra-embriónico. Estos genes, también como sus perfiles de enriquecimiento relativos son resaltados en la Tabla 1. TABLA 1 Puesto que muchos genes son expresados en más de una capa germinal, es útil comparar cuantitativamente niveles de expresión de muchos genes dentro del mismo experimento. SOX17 es expresado en endodermo definitivo y a una extensión más pequeña en endodermo visceral y parietal. S0X7 y AFP son expresados en endodermo visceral en este punto en el tiempo de desarrollo prematuro. SPARC y TM son expresados en endodermo parietal y braquiuria es expresada en mesodermo prematuro. Células de endodermo definitivo fueron predecidas que expresan altos niveles de mARN de S0X17 y bajos niveles de AFP y S0X7 (endodermo visceral) , SPARC (endodermo parietal) y braquiuria (mesodermo) . Además, ..se usó ZIC1 para descargar adicionalmente la inducción de ectodermo prematuro. Finalmente, GATA4 y HNF3b fueron expresados- tanto en endodermo definitivo como extra-embriónico, y así, se correlacionan con la expresión de SOX17 én endodermo definitivo (Tabla 1) . Un experimento representativo es ilustrado en las figuras 11-14 que demuestra cómo los genes marcadores descritos en la Tabla 1 se correlacionan entre sí entre las varias muestras, destacando así patrones específicos de diferenciación a endodermo definitivo y endodermo extra-embriónico también como a mesodermo y tipos de células neurales. En vista de los datos anteriores, es claro que el incremento de las dosis de activina dan como resultado incremento de la expresión del gen SOX17. Además, esta expresión SOX17 representa predominantemente endodermo definitivo en contraposición a endodermo extra-embriónico. Esta conclusión se deriva de la observación de que la expresión del gen S0X17 es inversamente correlacionada con la expresión genética de AFP, S0X7, y SPARC.
EJEMPLO 6 Diferenciación dirigida de células ES humanas a endodermo definitivo Cultivos de células ES humanas se diferencian aleatoriamente si son cultivadas bajo condiciones que no mantienen activamente su estado sin diferenciar. Esta diferenciación heterogénea da como resultado la producción de - .célula- de endodermo extra-embriónicas que consisten tanto- de o endodermo parietal como endodermo visceral (expresión de AFP, SPARC y SOX7) también como derivados ectodermales y mesodermales prematuros tal como son marcados por expresión de ZIC1 y nestina (ectodermo) y braquiuria (mesodermo) . La apariencia de célula de endodermo definitivo no ha sido examinada o especificada por carencia de marcadores de anticuerpo específicos en cultivos de células ES. Como resultado y por determinación, la producción de endodermo definitivo prematuro en cultivos de células ES no ha sido bien estudiado. Puesto que reactivos de anticuerpos satisfactorios para células de endodermo definitivo han estado no disponibles, la mayoría de la caracterización se ha enfocado en ectodermo y endodermo extra-embriónico. Sobre todo, hay significativamente mayores números de tipos de células extra-embriónicas y neuroectodermales en comparación con células de endodermo definitivo S0Xl7hi en cultivos celulares ES aleatoriamente diferenciados . A medida que colonias de hESC sin diferenciar se expanden sobre un lecho de alimentadores de fibroblasto, las células en los bordes de la colonia toman morfologías alternativas que son distintas de aquellas células residentes dentro del interior de la colonia. Muchas de estas células del borde externo pueden ser distinguidas por su morfología de cuerpo de célula más grande, menos uniforme y por la expresión de niveles más altos de OCT4. Se 'ha descrito que a medida que las células ES se comienzan a diferenciar, alteran los niveles de expresión de OCT4 hacia arriba o hacia abajo en relación con las células ES sin diferenciar. La alteración de los niveles de OCT4 por encima o debajo del umbral sin diferenciar puede significar las etapas iniciales de diferenciación a lo lejos del estado pluripotente. Cuando colonias sin diferenciar fueron examinadas mediante inmunocitoquímica SOX17, ocasionalmente pequeños grupos de 10-15 células de células SOX17-positivas fueron detectadas en sitios aleatorios en la periferia y en las uniones entre colonias de hESC sin diferenciar. Como se indica anteriormente, estas cavidades dispersadas de bordes de colonia externos aparecieron ser algunas de las primeras células para diferenciarse a lo lejos de la morfología de célula de ES clásica a medida que la colonia se expande en tamaño y se vuelve más poblada. La colonias plenamente sin diferenciar más jóvenes, más pequeñas (< 1 mm; 4-5 días) no mostraron células S0X17 positivas dentro o en los bordes de la colonia en tanto que colonias más grandes, más viejas (1-2 mm de diámetro, > 5 días) tuvieron parches aislados esporádicos de S0X17 positiva, células AFP negativas en la periferia de algunas colonias o en regiones interiores al borde que no exhiben la morfología de hESC clásica descrita previamente. Dado que esto fue el primer desarrollo- de un anticuerpo SOX17 efectivo, las células de endodermo definitivo generadas en tales cultivos de células ES "sin diferenciar" prematuras nunca han sido demostradas previamente. En base a correlaciones negativas de niveles de expresión de gen S0X17 y SPARC mediante Q-PCR, la vasta mayoría de estas células S0X17 positiva, AFP negativas serán negativas para los marcadores de endodermo parietal mediante co-marcación de anticuerpo. Esto fue demostrado específicamente para células de endodermo parietal que expresan TM como se muestra en las figuras 15A-B. La exposición a factores nodales de activina A y B dio como resultado una disminución espectacular en la intensidad de expresión de TM y el número de células TM positivas. Mediante triple marcación utilizando anticuerpos S0X17, AFP y TM sobre un cultivo tratado con activina, grupos de células positivas S0X17 que fueron también negativas para AFP y TM fueron observadas (figuras 16A-D) . Estas son las primeras demostraciones celulares de células de endodermo definitivo S0X17 positivo en la diferenciación de cultivo hESC (figuras 16A-D y 17) . Con el anticuerpo de S0X17 y herramientas de Q-PCR descritos anteriormente se han explorado un número de procedimientos capaces de programar eficientemente hESC para convertirse en células de endodermo definitivo S0Xl7h:L/AFP:Lo / SPARC/TM10. Se aplicó una variedad de protocolos de diferenciación apuntados a incrementar el- número y capacidad proliferativa de estas células tal como es medida al nivel de población mediante Q-PCR para expresión genética S0X17 y al nivel de células individuales mediante marcación de anticuerpo de proteína S0X17. Fuimos los primeros en analizar y describir el efecto de factores de crecimiento de familia TGFß, tales como nodal/activina/BMP, para uso en crear células de endodermo definitivo a partir de células de tallo embriónico en cultivos celulares in vitro. En experimentos típicos, activina A, activina B, BMP o combinaciones de estos factores de crecimiento fueron agregados a cultivos de la línea de célula de tallo humano sin diferenciar hESCyt-25 para comienza el proceso de diferenciación. Como se muestra en la figura 19, la adición de activina A a 100 ng/ml dio como resultado una inducción de 19 veces de expresión del gen S0X17 contra hESC sin diferenciar por el día 4 de diferenciación. La adición de activina B, un segundo miembro de la familia de activina, junto con activina A, dio como resultado una inducción de 37 veces con respecto a hESC sin diferenciar por el día 4 de tratamiento con activina combinado. Finalmente, la adición de un tercer miembro de la familia de TGFß de los subgrupos de nodal/activina y BMP, BMP4, junto con activina A y activina B, incrementaron las veces de inducción a 57 veces aquella de los hESC sin diferenciar (figura 19) . Cuando la inducción de SOX17 con activinas y BMP f e " comparada con controles de medio sin factor inducciones de 5, 10, y 15 veces se tuvieron como resultado en el punto en el tiempo del día 4. Por cinco días de triple tratamiento con activinas A, B y BMP, S0X17 fue inducido más de 70 veces más alto que hESC. Estos datos indican que dosis más altas y tiempos de tratamiento más altos de los miembros de la familia de TGFß de nodal/activina da como resultado una expresión incrementada de S0X17. La activina A, B y BMP nodales y moléculas relacionadas facilitan la expresión de S0X17 y la formación de endodermo definitivo in vivo o in vitro. Además, la adición de BMP da como resultado una inducción S0X17 mejorada posiblemente por medio de la inducción adicional de Cripto, el co-receptor nodal. Se ha demostrado que la combinación de activinas A y B junto con BMP4 da como resultado incrementos aditivos en inducción de S0X17 y de aquí inducción de endodermo definitivo. La adición de BMP4 por períodos prolongados (>4 días) , en combinación con activina A y B puede inducir S0X17 en endodermo parietal y visceral también como endodermo definitivo. Por consiguiente, en algunas modalidades de la presente invención, es valioso remover BMP4 del tratamiento en el transcurso de 4 días de adición. Para demostrar el efecto del tratamiento con factor TGFß a nivel de célula individual, un curso de tiempo • de adición de.., factor TGFß fue examinado utilizando marcación, de anticuerpo S0X17. Como se muestra previamente en las figuras 10A-F, hubo un incremento espectacular en el número relativo de células S0X17 marcadas con respecto al tiempo. La cuantificación relativa (figura 20) muestra más de un incremento de 20 veces en células S0X17 marcadas. Este resultado que tanto los números de células también como nivel de expresión de gen S0X17 se incrementan con el tiempo de exposición al factor TGFß. Como se muestra en la figura 21, después de cuatro días de exposición a nodal, activina A, activina B y BMP4, el nivel de inducción de SOX17 llega a 168 veces con respecto a las hESC sin diferenciar. La figura 22 muestra que el número relativo de células SOX17-positivas fue también sensible a la dosis, dosis de activina A de 100 ng/ml o más fueron capaces de inducir potentemente la expresión del gen S0X17 y el número de células. Además de los miembros de la familia TGFß, la familia Wnt de moléculas puede mejorar el papel en especificación y/o mantenimiento de endodermo definitivo. El uso de moléculas Wnt fue también benéfico para la diferenciación de hESC a endodermo definitivo como se indica por la expresión del gen S0X17 incrementada en muestras que fueron tratadas con activinas más Wnt3a con respecto a aquellas de activinas sola (figura 23) . . Todos los experimentos descritos anteriormente se efectuaron- utilizando un -medio de cultivo de tejido que contiene -• 10% de suero con factores agregados.' Sorprendentemente, se descubrió que la concentración de suero tenía un --efecto sobre el nivel de expresión de SOX17 en presencia de activinas agregadas como se muestra en las figuras 24A-C. Cuando los niveles del suero fueron reducidos de 10% a 2%, la expresión de SOX17 se triplicó en presencia de activinas A y B. Finalmente, se demostró que las células S0X17+ inducidas por activina se dividen en cultivo como se ilustra en las figuras 25A-D. Las flechas muestran células marcadas con SOX17/PCNA/DAPI que están en mitosis como se evidencia por el patrón de placa mitótico PCNA/DAPI-marcado y el perfil mitótico de contraste de fase.
EJEMPLO 7 La expresión del receptor 4 de quimiocina (CXCR4) se correlaciona con marcadores para endodermo definitivo y no marcadores para mesodermo, ectodermo o endodermo visceral Como se describe anteriormente, las hESC pueden ser inducidas a diferenciarse a la capa germinal de endodermo definitivo mediante la aplicación de citocinas de la familia TGFß y más específicamente de las subfamilia activina/nodal . Adicionalmente, se ha demostrado que la proporción de suero bovino fetal (FBS) en el medio de cultivo de diferenciación afecta la 'eficiencia de diferenciación de' ' endodermo definitivo de hESC. Este efecto es de tal manera que a una concentración dada de activina A en el medio, niveles más altos de FBS inhibirán la diferenciación máxima a endodermo definitivo. En ausencia de activina A exógena, la diferenciación de hESC al linaje de endodermo definitivo es muy ineficiente y la concentración de FBS tiene efectos mucho más moderados sobre el proceso de diferenciación de hESC. En estos experimento, hESC fueron diferenciadas al cultivar el medio RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA; # de cat 61870-036) complementado con 0.5%, 2.0% o 10% de FBS y ya sea con o sin 100 ng/ml de activina A durante 6 días. Además, también se usó un gradiente de FBS que fluctúa de 0.5% a 2.0% sobre los primeros tres días de diferenciación en conjunción con 100 ng/ml de activina A. Después de los 6 días, muestras de réplica fueron recolectadas de cada condición de cultivo y analizada en cuanto a expresión de gen relativo mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Las células restantes fueron fijadas para detección e inmunofluorescente de proteína SOX17. Los niveles de expresión de CXCR4 variaron espectacularmente a través de las 7 condiciones de cultivo usadas (figura 26) . En general, la expresión de CXCR4 fue alta en los cultivos tratados con activina A (AlOO) y baja en aquellos que no recibieron activina A exógena (NF) . Además, entre los cultivos AlOO tratados, la expresión de CXCR4 fue más alta cuando la concentración de FBS fue más baja. Hubo una disminución notable en el nivel de CXCR4 en la condición a 10% de FBS, de tal manera que la expresión relativa estuvo más en línea con las condiciones que no recibieron activina A (NF) . Como se describe anteriormente, la expresión de los genes SOX17, GSC, MIXLl, y HNF3ß es consistente con la caracterización de las célula como endodermo definitivo. La expresión relativa de estos cuatro genes a través de las 7 condiciones de diferenciación refleja aquella de CXCR4 (figuras 27 A-D) . Esto demuestra que CXCR4 es también un marcador de endodermo definitivo. Los linajes de ectodermo y mesodermo pueden ser distinguidos de endodermo definitivo mediante su expresión de varios marcadores. El mesodermo prematuro expresa los genes braquiuria y MOXl en tanto que el neuro-ectodermo naciente expresa SOXl y ZIC1. Las figuras 28A-D demuestran que los cultivos que no recibieron activina A exógena fueron preferiblemente enriquecidos para expresión de gen de mesodermo y ectodermo y que entre los cultivos tratados con activina A, la condición de FBS al 10% también tuvo niveles incrementados de expresión de marcador de mesodermo y ectodermo. Estos patrones de expresión fueron inversos a aquel de CXCR4 e indicaron .que CXCR4 no fue alternativamente expresado en mesodermo . o ectodermo derivado de hESC - en este período de tiempo de,, desarrollo. - -..- . .. .Durante el desarrollo mamífero prematuro, también ocurre la diferenciación a linajes extra-embriónicos . De particular relevancia e la presente es la diferenciación de endodermo visceral que comparte la expresión de muchos genes en común con endodermo definitivo, incluyendo SOX17. Para distinguir el endodermo definitivo de endodermo visceral extra-embriónico se debe examinar un marcador que es distinto entre estos dos. SOX7 representa un marcador que es expresado en el endodermo visceral pero no en el linaje de endodermo definitivo. Así, las condiciones de cultivo que exhiben expresión del gen SOX17 robusta en ausencia de expresión de SOX7 es probable que contengan endodermo definitivo y no endodermo visceral. Se muestra en la figura 28E que SOX7 fue altamente expresado en cultivos que no recibieron activina A, S0X7 también exhibió expresión incrementada a una presencia de activina A cuando FBS fue incluido al 10%. Este patrón es el inverso del patrón de expresión de CXCR4 y sugiere que CXCR4 no es altamente expresado en endodermo visceral. El número relativo de células (SOX17+) SOX17 inmunoreactivas presentes en cada una de las condiciones de diferenciación mencionadas anteriormente también fue determinado. Cuando las hESC fueron diferenciadas en presencia de alta dosis de activina A y baja concentración de FBS (0.5% -2.0%) las células SOX17+ fueron distribuidas ubicuamente en todo el cultivo. Cuando se usó activina A de alta dosis pero FBS fue incluido a 10% (v/v) , las células SOX17+ aparecieron a una frecuencia mucho más baja y siempre aparecieron en grupos aislados en lugar de distribuidas igualmente en todo el cultivo (figuras 29A y C también como B y E) . Se observó una disminución adicional en células S0X17+ cuando no se usó activina A exógena. Bajo estas condiciones, las células SOX17+ también aparecieron en grupos y estos grupos fueron más pequeños y mucho más raros que aquellos encontrados en el tratamiento con alta dosis de activina A, tratamiento con bajo contenido de FBS (figuras 29 C y F) . Estos resultados demuestran que los patrones de expresión de CXCR4 no solamente corresponden a la expresión del gen de endodermo definitivo sino también al número de células de endodermo definitivo en cada condición.
EJEMPLO 8 Condición de diferenciación que enriquecen para incremento de endodermo definitivo la proporción de células CXCR4 positivas La dosis de activina A también afecta la eficiencia a la cual el endodermo definitivo puede ser derivado de hESC. Este ejemplo demuestra que el incremento de la dosis de activina A incrementa la proporción de células CXCR4+ en el cultivo. hESC fueron diferenciadas en medio de RPMI complementado con 0.5%-2% de FBS (incrementado de 0.5% a 1".0% a..-2.0% durante los primeros tres días de diferenciación) y ya sea 0, 10, ó 100 ng/ml de activina A. Después de 7 días de diferenciación, las células - fueron disociadas en PBS sin Ca2+/Mg2+ que contiene 2% de "FBS y 2 mM (EDTA) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron filtradas a través de filtros de nylon de 35 µm, contadas y aglomeradas. Los aglomerados o pelotillas fueron suspendidos en un pequeño volumen de 50% de suero humano/50% de suero de chango normal e incubados durante 2 minutos sobre hielo para bloquear los sitios de enlace de anticuerpo no específicos. A esto, 1 de anticuerpo anti-CXCR4 de ratón (Abeam, # de cat abl0403-100) fue agregado por 50 µl (que contiene aproximadamente 105 células) y la marcación procedió durante 45 minutos sobre hielo. Las células fueron lavadas al agregar 5 ml de PBS que contiene 2% de suero humano (solución de pH regulado) y aglomeradas. Luego un segundo lavado con 5 ml de solución reguladora del pH fue consumado las células fueron luego resuspendidas 50 µl de solución reguladora del pH por 105 células. El anticuerpo secundario (anti-ratón de chango FITC conjugado; Jackson ImmunoResearch, # de cat 715-096-151) fue agregado a una concentración final de 5 µg/ml y se le permite marcar durante 30 minutos seguido por dos lavados en solución reguladora del pH como se indica anteriormente. Las células fueron resuspendidas a 5xl06 células/ml en solución reguladora de pH y analizadas y "clasificadas utilizando un dispositivo FACS Vantage (Beckton -Dickenson) por el equipo en la estación de núcleo de citometría • de flujo (The Scripps Research Institute) . Las células fueron recolectadas directamente a solución reguladora del pH de lisis de RLT (Qiagen) para aislamiento subsecuente de ARN total para análisis de expresión genética mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El número de células CXCR4+ tal como se determina mediante citometría de flujo se observa que se incrementan espectacularmente a medida que la dosis de activina A fue incrementada en el medio de cultivo de diferenciación (figuras 30A-C) . Las células CXCR4+ fueron aquellas que caen dentro de la compuerta de R4 y esta compuerta fue ajustada utilizando un control o referencia secundario de solamente anticuerpo para el cual 0.2% de eventos estuvieron ubicados en la compuerta R. Los números incrementados espectacularmente de células CXCR4+ se correlaciona con un incremento robusto en el expresión genética de endodermo definitivo a medida que la dosis de activina A es incrementada (figuras 31A-D) .
EJEMPLO 9 El aislamiento de células CXCR4 positivas enriquece para expresión genética de endodermo definitivo y agota las células que expresan marcadores de mesodermo , ectodermo y endodermo • visceral Las células CXCR4+ y CXCR4~ de ejemplo 8 anterior fueron recolectadas y analizadas en cuanto a expresión genética relativa y la expresión genética de las poblaciones originales fue determinada simultáneamente. Los niveles relativos de expresión genética de CXCR4 fueron incrementados espectacularmente con la dosis incrementada de activina A (figura 32) . Esto se correlacionó muy bien con el incremento dependiente de la dosis de activina de las células CXCR4+ (figuras 30A-C) . También es claro que el aislamiento de las células CXCR4+ de cada población contó para casi toda la expresión de gen CXCR4 en aquella población. Estudio demuestra la eficiencia del método de FACS para recolectar estas células. El análisis de expresión genética reveló que las células CXCR4+ contienen no solamente la mayoría de la expresión genética de CXCR4, sino que también contiene la expresión genética para otros marcadores de endodermo definitivo. Como se muestra en las figuras 31A-D, las células CXCR4+ fueron enriquecidas adicionalmente con respecto a la población AlOO original para SOX17, GSC, HNF3B, y MDGL1. Además, la fracción CXCR4" que contiene muy poca expresión genética para estos marcadores de endodermo definitivo. Además, las poblaciones de CXCR4+ y CXCR4" exhibieron el patrón inverso de expresión genética para- 'marcadores de mesodermo, ectodermo -y endodermo extra-embriónico. Las figuras 33 A-D muestran que las células - CXCR4+ fueron agotadas para la expresión genética de braquiuria, MOXl, ZIC1, y SOX7 en relación con la población original AlOO. Esta población original AlOO ya era baja en expresión de estos marcadores en relación con las condiciones de baja dosis o sin activina A. Estos resultados muestran que el aislamiento de células CXCR4+ de hESC diferenciadas en presencia de alto contenido de activina A produce una población que está altamente enriquecida para y endodermo definitivo sustancialmente puro.
EJEMPLO 10 Cuantificación de células de endodermo definitivo en una población celular utilizando CXCR4 Para confirmar la cuantificación de la proporción de células de endodermo definitivo presentes en un cultivo celular o población de células tal como se determina previamente en la presente y se determina en la solicitud de patente estadounidense provisional No. 60/532,004, intitulada DEFINITIVE ENDODERM, presentada el 23 de diciembre de 2003, células que expresan CXCR4 y otros marcadores de endodermo definitivo fueron analizados mediante FACS. Utilizando los métodos tales como aquellos descritos en los ejemplos anteriores, hESC fueron diferenciados para producir -endodermo. • En particular,." para incrementar el rendimiento y pureza- en la diferenciación de cultivos celulares, la concentración de suero' del medio fue controlada como sigue: 0.2% de FBS el día 1, 1.0% de FBS en el día 2 y 2.0% de FBS los días 3-6. Los cultivos diferenciados fueron sorteados mediante FACS utilizando tres epítopos de superficie celular, E-Caderina, CXCR4, y trombomodulina . Luego las poblaciones celulares sorteadas fueron analizadas mediante Q-PCR para determinar niveles de expresión relativos de marcadores para endodermo definitivo y endodermo extra-embriónico también como otros tipos de células. Las células CXCR4 clasificadas tomadas de claves óptimamente diferenciados dieron como resultado el aislamiento de células de endodermo definitivo que eran >98% puras. La Tabla 2 muestra los resultados de un análisis de marcador para un cultivo de endodermo definitivo que fue diferenciado de hESC utilizando los métodos descritos en la presente .
Tabla 2 Composición de cultivo de endodermo definitivo En particular, la Tabla 2 indica que las células CXCR4 y SOX17 positivas (endodermo) comprenden de 70%-80% de las células en el cultivo celular. De estas células que expresan SOX17, menos de 2% expresan TM (endodermo parietal) y menos de 1% expresa AFP (endodermo visceral) . Después de restar la proporción de células TM-positivo y AFP-positivo (endodermo parietal y visceral combinados; 3% total) de la proporción de células SOX17/CXCR4 positivo, se puede ver que aproximadamente 67% a aproximadamente 77% del cultivo celular fue endodermo definitivo. Aproximadamente 10% de las células fueron positivas para E-Caderina (ECAD) , que es un marcador para hESC y aproximadamente 10-20% de las células fueron de otros tipos de células . Se ha descubierto que la pureza de endodermo definitivo en la diferenciación de cultivos celulares que son obtenidos antes de la separación por FACS puede ser mejorada en comparación con el procedimiento de bajo contenido de suero descrito anteriormente al mantener la concentración de FBS a <0.5% en todo el procedimiento de diferenciación de 5-6 días.
Sin embargo, el mantenimiento del cultivo celular a <0.5% en todo el procedimiento de diferenciación de 5-6 días también, da como '--resultado un número reducido de células de endodermo definitivo total que son producidas. - Las células de endodermo definitivo producidas mediante los métodos descritos en la presente han sido mantenidas y expandidas en cultivo en presencia de activina por más de 50 días sin diferenciación apreciable. En tales casos, la expresión de SOX17, CXCR4, MIXLl, GATA4, HNF3ß es mantenida en el período de cultivo. Adicionalmente, TM, SPARC, OCT4, AFP, SOX7, ZIC1 y BRACH no fueron detectados en estos cultivos. Es probable que tales células puedan ser mantenidas y expandidas en cultivo por sustancialmente más de 50 días sin diferenciación apreciable.
EJEMPLO 11 Marcadores adicionales de células de endodermo definitivo En el siguiente experimento, se aisló ARN a partir de endodermo definitivo purificado y poblaciones de células de tallo embriónico humanas. Luego la expresión genética fue analizada mediante análisis de chip de gen de ARN de cada población purificada. También se efectuó Q-PCR para investigar adicionalmente el potencial de genes expresados en endodermo definitivo, pero no en células de tallo embriónico, como marcador para endodermo definitivo. Células de tallo embriónico humanas (hESC) fueron mantenidas en medio DMEM/F12 complementado con 20% de reemplazo de suero de expulsión, 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblasto básico humano recombinante (bFGF) , 2-mercaptoetanol 0.1 mM, L-glutamina, aminoácidos no esenciales y penicilina/estreptomicina. Las hESC fueron diferenciadas a endodermo definitivo mediante cultivo durante 5 días en medio RPMI complementado con 100 ng/ml de activina A humana recombinante, suero bovino fetal (FBS) , y penicilina/estreptomicina. La concentración de FBS se hizo variar cada día como sigue: 0.1% (primer día), 0.2% (segundo día) , 2% (días 3-5) . Las células fueron aisladas mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) con el fin de obtener poblaciones purificadas de hESC y endodermo definitivo para análisis de expresión de gen. La inmuno-purificación fue obtenida para hESC utilizando antígeno SSEA4 (R&D Systems, # de cat FAB 1435P) y para endodermo definitivo utilizando CXCR4 (R&D Systems, # de cat FAB 170P) . Las células fueron disociadas utilizando tripsina/EDTA (Invitrogen, # de cat 25300-054), lavadas en solución salina de pH regulado de fosfato (PBS) que contiene 2% de suero humano y resuspendidas en 100% de suero humano sobre hielo durante 10 minutos para bloquear el enlace no específico. El teñido se llevó a cabo durante 30 minutos sobre hielo al agregar 200 µl de anticuerpo ficoeritrina-conjugado a 5 x 106 células en 800 µl de suero humano. Las clase fueron lavadas dos veces con 8 ml de solución reguladora del pH PBS y resuspendidas en 1 ml de la misma. El aislamiento mediante FACS se llevó a cabo por la instalación central del The Scripps Research Institute utilizando un FACS Vantage (BD Biosciences) . Las células fueron recolectadas directamente a la solución reguladora del pH de lisis RLT y el ARN fue aislado mediante RNeasy de acuerdo con las instrucción del fabricante (Qiagen) . El ARN purificado fue sometido por duplicado a análisis de expresión (Durham, NC) para la generación de los datos de perfil de expresión utilizando la plataforma Affymetrix y disposiciones de oligonucleótido de alta densidad U133 Plus 2.0. Los datos presentados son un grupo que identifica genes expresados diferencialmente entre las dos poblaciones, hESC y endodermo definitivo. Los genes que exhibieron un cambio hacia arriba robusto en nivel de expresión con respecto a aquel encontrado en hESC fueron seleccionados como nuevos marcadores candidatos que son altamente característicos de endodermo definitivo. Genes selectos fueron analizados mediante Q-PCR, como se describe anteriormente, para verificar los cambios de expresión genética encontrados sobre el chip de gen y también para investigar el patrón de expresión de estos genes durante un curso de tiempo de diferenciación de hESC. Las figuras 34A-M muestran los resultados de la expresión de gen para ciertos marcadores. Los resultados son exhibidos para -cultivos celulares analizados 1, 3 y 5 días después de la adición de 100 ng/ml de activina A, células de endodermo definitivo que expresan CXCR4 purificadas al final del procedimiento de diferenciación de cinco días (CXDE) , y en hESC purificado. Una comparación de las figuras 34C y G-M demuestran que los seis genes marcadores FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKOR1 y CRIP1, exhiben un patrón de expresión que es casi idéntico entre sí y que es también idéntico al patrón de expresión de CXCR4 y la proporción de SOX17/SOX7. Como se describe previamente, SOX17 es expresado tanto en el endodermo definitivo también como en el endodermo extra-embriónico que expresa SOX7. Puesto que SOX7 no es expresado en el endodermo definitivo, la proporción de SOX17/SOX7 proporciona un valor estimativo confiable de contribución de endodermo definitivo a la expresión de S0X17 atestiguada en la población como un todo. La similaridad de los paneles G-L y M al panel C indica que FGF17, VWF, CALCR, FOXQl, CMKORl y CRIP1 son marcadores probables de endodermo definitivo y que no son expresados significativamente en células de endodermo extra-embriónico. Se apreciará que los resultados Q-PCR descritos en la presente pueden ser confirmados adicionalmente mediante ICC.
EJEMPLO 12 Ácido retinoico y FGF-10 induce PDXl específicamente en cultivos de endodermo definitivo El siguiente experimento demuestra que RA y FGF-10 induce la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo. Células de tallo embriónica humanas fueron cultivadas con o sin activinas durante cuatro días. En el día cuatro, se agregaron RA 1 µM y FGF-10 50 ng/ml al cultivo celular. Cuarenta y ocho horas después de la adición de RA/FGF-10, la expresión del gen marcador PDXl y los otros genes marcadores no específicos al endodermo del intestino anterior fueron cuantificadas mediante Q-PCR. La aplicación de RA a células de endodermo definitivo provocan un incremento robusto en expresión de gen PDXl (véase figura 35) sin incrementar la expresión de endodermo visceral (SOX7, AFP), marcadores de expresión neural (SOXl, ZIC1) , o neuronal (NFM) (véase figura 36A-F) . La expresión del gen PDXl fue inducida a niveles aproximadamente 500 veces más altos que los observados en endodermo definitivo después de 48 horas de exposición a R? 1 µM RA y FGF-10 50 ng/ml. Además, estos resultados demuestran que ocurrió inducción de PDXl sustancial solamente en cultivos celulares que habían sido previamente diferenciados a endodermo definitivo (SOX17) como se indica por la expresión de PDXl 160 veces más alta encontrada en los cultivos celulares tratados con activina en relación con aquellos cultivos que no recibieron activina antes de la aplicación de RA. -. •-. - : .-•- •-.
EJEMPLO 13 FGF-10 proporciona incremento adicional en expresión de PDXl con respecto a RA solo Este ejemplo demuestra que la combinación de RA y FGF-10 induce la expresión PDXl a una extensión mayor que RA solo. Como en el ejemplo previo, hESC fueron cultivadas con o sin activinas durante cuatro días. En el día cuatro, las células fueron tratadas con uno de los siguientes: RA 1 µM solo; RA 1 µM en combinación ya sea con FGF-4 o FGF-10; o RA 1 µM en combinación con ambos FGF-4 y FGF-10. La expresión de PDXl, SOX7 y NFM fue cuantificada mediante Q-PCR noventa y seis horas después de RA o RA/FGF.
El tratamiento de cultivos de hESC con activina seguido por ácido retinoico induce un incremento de 60 veces en la expresión de gen PDXl. La adición de FGF-4 al tratamiento de RA indujo ligeramente más PDXl (aproximadamente 3 veces con respecto a RA solo) . Sin embargo, al agregar FGF-10 y ácido retinoico conjuntamente, la inducción de PDXl fue mejorada adicionalmente 60 veces con respecto a R? solo (véase figura 37A) . Esta inducción de PDXl robusta fue mayor de 1400 veces más alta que con tratamiento sin activina o RA/FGF. Interesantemente, la adición de FGF-4" y FGF-10 abolió simultáneamente el efecto benéfico del FGF-10, - produciendo solo el incremento de PDXl moderado atribuido a la adición de FGF-4. La adición de combinaciones de RA/FGF-4 o RA/FGF-10 no incrementó la expresión de genes marcadores no asociados con endodermo de intestino anterior cuando se compara con células no expuestas a combinaciones de RA/FGF (véase figura 37B-C) .
EJEMPLO 14 La dosis de ácido retinoico afecta la posición anterior- posterior (A-P) in vitro Para determinar si la dosis de RA afecta la posición de A-P en cultivos celulares in vitro, se llevó a cabo el siguiente experimento. Células de tallo embriónico humanas fueron cultivadas con o sin activinas durante cuatro días. En el día 4, FGF-10 a 50 ng/ml fue agregada al cultivo en combinación con RA a 0.04 µM, 0.2 uM ó 1.0 µM. La expresión del gen marcador PDXl también como otros marcadores no específicos para endodermo de intestino anterior fue cuantificada mediante Q-PCR. La adición de ácido retinoico a varias dosis, en combinación con FGF-10 a 50 ng/ml, indujo patrones de expresión de gen diferencial que se correlacionan con patrones de posición anterior-posterior específicos. La dosis más alta de RA (1 µM) indujo preferiblemente la expresión del marcador de endodermo anterior (HOXA3) y también produjo el incremento más robusto en PDXl (figura 38A-B) . La dosis media de RA (0.2 µM) indujo marcadores de endodermo de intestino medio (CDX1, HOXC6) (véase figura 38C y 41E) , en tanto que la dosis más baja de RA ( 0 . 04 µM) indujo preferiblemente un marcador de endodermo de intestino posterior (HOXA13) (véase figura 38D) . La dosis de RA no tuvo esencialmente ningún efecto sobre la expresión relativa ya sea de marcadores neurales (SOXl) o neuronales (NFM) (véase figura 38F-G) . Este ejemplo destaca el uso de RA como morfogen in vitro y en particular como morfogen de derivados de endodermo de la diferenciación de hESC.
EJEMPLO 15 El uso de complemento B27 mejora la expresión de PDXl La expresión de PDXl en endodermo definitivo puede ser influenciada por el uso de una diversidad de factores y condiciones de cultivo celular/diferenciación. En el siguiente experimento, se muestra que el uso del complemento B27 mejora la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo. Células de tallo embriónico humanas fueron inducidas a diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento de células hES sin diferenciar cultivadas sobre alimentadores de fibroblasto embriónico de ratón con alta dosis de activina A (100-200 ng/ml en 0.5-2% de FBS/DMEM/F12) durante 4 dias. El control sin activina A recibió 0.5-2% de FBS/DMEM/F12 sin activina A agregada. A cuatro días,- los cultivos recibieron ya -s.ea nada de activina A en 2% de ..FBS -(ninguno), y 2% de reemplazo de suero (SR) , o 50 ng/ml de activina A junto con RA 2 µM RA y 50 ng/ml de FGF-10 en 2% de FBS/DMEM/F12 (ninguno, +FBS, +B27) y similarmente en 2% de reemplazo de suero (SR) . El complemento B27, (Gibco/BRL) , fue agregado como dilución 1/50 directamente a 2% de FBS/DMEM/F12 (+B27) . Muestras de células duplicadas fueron tomadas para cada punto y ARN total fue aislado y sometido a Q-PCR como se describe previamente. La figura 39A-E muestra que el complemento de B27 libre de suero proporcionó un benéfico adicional para la inducción de expresión de gen PDXl sin inducir un incremento en la expresión de genes marcadores no específicos para endodermo de intestino anterior en comparación con tal expresión del gen marcador en células cultivadas sin suero.
EJEMPLO 16 Uso de activina A para mejorar la inducción de PDXl Este ejemplo muestra que el uso de activina B mejora la diferenciación de células PDXl-negativas a células PDX1-positivas en cultivo celular in vitro. Células de tallo embriónico fueron inducidas a diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento de hESC sin diferenciar cultivadas sobre alimentadores de fibroblasto embriónico de ratón con alta dosis de activina A (50 g/ml) en bajo contenido de suero/RPMI durante 6 días. La dosis de FBS fue 0% en el. día uno, 0.2%-- en el día dos y 2%- en los días 3-6. El control negativo para la producción de endodermo definitivo (NF) recibió 2% de FBS/RPMI sin activina A agregada. Con el fin de inducir la expresión de PDXl, cada uno de los cultivos recibió ácido retinoico a 2 µM en 2% de FBS/RPMI en el día 6. Los cultivos tratados con activina A en los días uno a cinco fueron provistos con diferentes combinaciones de dosificación de activina A y activina B o permanecieron en activina A solo a 50ng/ml. El cultivo de control sin activina A (NF) no fue provisto con activina A ni con activina B. Este tratamiento de RA/activina se llevó a cabo durante 3 días, tiempo en el cual la expresión del gen PDXl fue medida mediante Q-PCR de muestras celulares duplicadas. La figura 40A muestra que la adición de activina B a dosis que fluctúan de 10-50 ng/ml (alO, a25 y a50) en presencia de 25 ng/ml (A25) o 50 ng/ml (A50) de activina A incrementó la expresión de PDXl por lo menos dos veces con respecto al cultivo que recibió solamente activina A a 50 ng/ml. El incremento en PDXl como resultado de la adición de activina B fue sin incremento en la expresión de HNF6 (véase figura 40B) , que es un marcador para hígado también como páncreas en este tiempo en desarrollo. Este resultado sugiere que la proporción de células que se diferencian a páncreas se ha incrementado en relación con el hígado.
EJEMPLO 17 Uso de dosis de suero para mejorar la inducción de PDXl ;< La expresión de PDXl en células de endodermo definitivo es influenciada por la cantidad de suero presente en el cultivo celular en todo el proceso de diferenciación. El siguiente experimento demuestra que el nivel de suero en un clave durante la diferencia hESC a endodermo definitivo PDX1-negativo tiene un efecto sobre la expresión de PDXl durante la diferenciación adicional de estas células a endodermo PDX1-positivo. Células de tallo embriónico humanas fueron inducidas a diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento de cultivo de hESC sin diferenciar sobre alimentadores de fibroblasto embriónico de ratón con alta dosis de activina A (100 ng/ml) en bajo contenido de suero /RPMI durante 5 días. La dosis de FBS fue 0.1% en el día uno, 0.5% en el día dos y ya sea 0.5%, 2% ó 10% en los días 3-5. El control sin activina A (NF) recibió la misma dosificación de FBS/RPMI diariamente, pero sin activina A agregada. La expresión de PDXl fue inducida comenzando en el día 6 mediante la adición de RA. Durante los días 6-7, los cultivos recibieron ácido retinoico a 2 µM en 0.5% de FBS/RPMI, 1 µM en el día 8 y 0.2 µM en el día 9-11. La activina A fue disminuida a 50 ng/ml durante el tratamiento con ácido retinoico y fue dejada ausente del control sin activina A (NF) . La figura 41A muestra que la" dosificación de FBS durante el período de 3 días de inducción de endodermo definitivo (días 3, 4 y 5) tiene una habilidad duradera para cambiar la inducción de la expresión del gen PDXl durante el tratamiento con ácido retinoico. Esto fue sin alteración significativa en el patrón de expresión ZIC1 (figura 41B) o expresión de SOX7 (figura 41C) .
EJEMPLO 18 Uso de medio acondicionado para mejorar la inducción de PDXl Otros factores y condiciones de cultivo que influencian la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo fueron también estudiados . El siguiente experimento muestra el efecto de medios acondicionados sobre la diferenciación de células de endodermo definitivo PDXl-negativo a células de endodermo PDXl-positivo. Células de tallo embriónico humanas fueron inducidas a diferenciarse a endodermo definitivo mediante tratamiento de hESC sin diferenciar cultivadas sobre alimentadores de fibroblasto embriónico de ratón con alta dosis de activina A (100 ng/ml) en bajo contenido de suero/RPMI durante 5 días. La dosis de FBS fue de 0.2% en el día uno, 0.5% en el día dos y 2% en los días 3-5. Los cultivos de endodermo definitivo generados por 5 días de tratamiento con activina A fueron luego inducidos a diferenciarse a endodermo que expresa PDXl mediante la adición de RA en 2% de FBS/RPMI que contiene activina A a 25 ng/ml por cuatro días. El R? fue de 2 µM para los primeros dos días de adición, 1 µM en el tercer día y 0.5 µM en el cuarto día. Este medio base para la inducción de PDXl fue proporcionado nuevo (2A25R) o después de acondicionamiento durante 24 horas por uno de cuatro poblaciones de células diferentes. Medios acondicionados (CM) fueron generados ya sea a partir de fibroblastos embriónicos de ratón (MEFCM) o de hESC que fueron primero diferenciadas durante 5 días por una de tres condiciones: i) 3% de FBS/RPMI (CM2), o ii) activina A (CM3) o iii) proteína 4 morfogénica de hueso (BMP4) (CM4) . Factores de activina A o BMP4 fueron provistos a 100 ng/ml bajo el mismo régimen de dosificación FBS descrito anteriormente (0.2%, 0.5%, 2%) . Estos tres paradigmas de diferenciación diferentes producen tres poblaciones muy diferentes de células humanas mediante las cuales los medios de inducción de PDXl pueden ser acondicionados. El FBS al 3% sin factor de crecimiento agregado (NF) produce una población heterogénea compuesta en gran parte de células de endodermo extra-embriónico, ectodermo y mesodermo. El cultivo tratado con activina A (AlOO) produce una gran proporción de endodermo definitivo y el cultivo tratado con BMP4 (B100) produce principalmente trafectodermo y algo de endodermo extra-embriónico. - -. La figura 42A muestra que PDXl fue inducido equivalentemente en medios nuevos y medios acondicionados en los , primeros dos días de tratamiento con RA. Sin embargo, al tercer día la expresión de PDXl había comenzado a disminuir en los tratamientos con medios nuevos y medios acondicionados MEF. Las hESC diferenciadas produjeron medios acondicionados que dieron como resultado el mantenimiento o incrementos adicionales en la expresión del gen PDXl a niveles 3 a 4 veces mayor que los medios nuevos . El efecto de mantenimiento de alta expresión de PDXl en medios acondicionados por hESC fue amplificado adicionalmente en el día cuatro de tratamiento con RA alcanzando niveles 6 a 7 veces más alto que en medios nuevos. La figura 42B muestran que los tratamientos con medios acondicionados dan como resultado nivel mucho más bajos de expresión genética CDX1, un gen no expresado en la región de endodermo que expresa PDXl. Esto indica que la pureza global de endodermo que expresa PDXl fue mucho mejorada mediante tratamiento de endodermo definitivo con medios acondicionados generados a partir de cultivos de hESC diferenciados La figura 43 muestra que la expresión del gen PDXl exhibió una respuesta de dosis positiva a la cantidad de medios acondicionados aplicados a las células de endodermo definitivo. El volumen total de medios agregados a cada placa fue de 5 ml y el volumen indicado (véase figura 43) de medios acondicionados fue diluido en medios nuevos (A25R) . Es de notar que solo 1 ml de medios acondicionados agregados a 4 ml de medios nuevos fue todavía apto de inducir y mantener niveles de expresión de PDXl más altos que 5 ml de medios nuevos solo. Esto sugiere que el efecto benéfico de medios acondicionados para inducción de endodermo que expresa PDXl es dependiente de la liberación de alguna sustancia o sustancias de las células a los medios acondicionados y que esta(s) sustancia (s) mejora la producción dependiente de la dosis de endodermo que expresa PDXl.
EJEMPLO 19 Validación de anticuerpos qt?e se enlazan a PDXl Los anticuerpos que se enlazan a PDXl son herramientas útiles para verificar la inducción de expresión de PDXl en una población celular. Este ejemplo demuestra que los anticuerpos policlonal de conejo e IgY a PDXl pueden ser usados para detectar la presencia de esta proteína.
En un primer experimento, el enlace de anticuerpo IgY anti-PDXl (IgY a-PDXl) a PDXl en lisados celulares fue validado mediante análisis de Western blot. En este análisis, el enlace de anticuerpo IgY -PDXl a 50 µg de lisado de célula total de fibroblastos humanos MDX12 o células MDX12 transfectadas 24 horas previamente con un vector de expresión de PDXl fue comparado. Los lisados celulares separados mediante SDS-PAGE, transferidos a membrana mediante electro-imunoabsorción y luego probadas con antisuero primario IgY of-PDXl seguido por anticuerpo secundarios anti-IgY de conejo conjugados por fosfatasa alcalina (Rb o¡-IgY) . Dilución diferentes de anticuerpos primarios y secundarios fueron aplicadas a bandas separadas de la membrana en las siguientes combinaciones: A (dilución 500X de primario, dilución 10,000 de secundario), B (2,000x, 10,000x), C (500x, 40,000x), D (2,000x, 40,000), E (8,000x, 40,000x) . El enlace fue detectado en células transfectadas con el vector de expresión PDXl (PDXl-positivo) a todas las combinaciones de anticuerpo probadas. El enlace fue solamente observado en fibroblastos sin transfectar (PDXl-negativo) cuando se usan las concentraciones más altas de anticuerpo primario y secundario conjuntamente (combinación A) . Tal enlace no específico fue caracterizado por la detección de una banda adicional a un peso molecular ligeramente más alto que PDXl tanto en fibroblastos transfectados como sin transfectar.
En un segundo experimento, el enlace de anticuerpo anti-PDXl de conejo policlonal (Rb - PDXl) a PDXl fue probado mediante inmunocitoquímica. Para producir una célula que expresa PDXl para tales experimentos, células MS1-V (ATCC # CRL-2460) fueron transfectadas transitoriamente con vector de expresión de PDXl-EGFP (construido utilizando pEGFP-Nl, Clontech) . Luego las células transfectadas fueron marcadas con Rb a-PDXl y antisuero a-EGFP. Las células transfectadas fueron visualizadas tanto mediante fluorescencia de EGFP también como inmunocitoquímica a-EGFP por medio del uso de un anticuerpo secundario Cy5 conjugado. La inmunofluorescencia de PDXl fue visualizada por medio del uso de un anticuerpo secundario -Rb Cy3 conjugado. El enlace de Rb a-PDXl y los anticuerpos a-EGPF anticuerpos co-localizados con la expresión de GPF.
EJEMPLO 20 Inmunocitoquímica de tejido pancreático humano Este ejemplo muestra que anticuerpos que tienen especificidad por PDXl pueden ser usados para identificar células PDXl-positivas humanas mediante inmunocitoquímica. En un primer experimento, secciones embebidas de parafina de páncreas humanos fueron teñidas por insulina con anticuerpo primario anti-insulina de conejillo de indias (Gp a-Ins) a una dilución 1/200 seguida por anticuerpo secundario de puerco anti-guinea de perro (D a-Gp) conjugado a Cy2 a una dilución 1/100. En un segundo experimento, las mismas secciones embebidas de parafina de páncreas humano fueron teñidas para PDXl con anticuerpo primario IgY a-PDXl a una dilución 1/4000 seguida por anticuerpo secundario Rb a-IgY conjugado a AF555 a una dilución 1/300. Las imágenes recolectadas de los primeros y segundos experimentos fueron luego fusionadas. En un tercer experimento, las células que fueron teñidas con anticuerpos IgY a-PDXl fueron también teñidas con DAPI . El análisis de . las secciones pancreáticas humanas revelaron la presencia de - fuerte teñido de isletas de Langerhans. Aunque la. señal de PDXl más fuente apareció en isleta (insulina-positiva) , un teñido débil fue también visto en tejido acinar (insulina-negativo) . El co-teñido de DAPI y PDXl muestra que PDXl fue en su mayoría pero no exclusivamente localizado al núcleo.
EJEMPLO 21 Inmunoprecipitación de PDXl de células tratadas con ácido retinoico Para confirmar adicionalmente la expresión de PDXl en células de endodermo definitivo que han sido diferenciadas en presencia de RA y la carencia de PDXl en células de endodermo definitivo que no han sido diferenciadas con R?, se usó un anticuerpo anti-PDXl de conejo (Rb a-PDXl) para inmunoprecipitar PDXl tanto de células de endodermo definitivo diferenciadas con RA y sin diferenciar. El R? inmunoprecipitado fue detectado mediante análisis de Western blot utilizando un anticuerpo IgY a-PDXl antibody. Para obtener lisados de células de endodermo definitivo sin diferenciar y diferenciados para inmunoprecipitación, hESC fueron tratadas durante 5 días con activina A a 100 ng/ml en bajo contenido de suero (endodermo definitivo) seguido por tratamiento con activina A a 50 ng/ml y RA completamente trans ,2 µM durante dos días, 1 µM por un día y 0.2 µM por un día (endsdermo de intestino anterior PDXl-positivo) . Como control positivo lisado de células fueron también preparados a partir de células MSl-V (ATCC # CRL-2460) transfectadas con un vector de expresión de PDXl. PDXl fue inmunoprecipitado mediante adición de Rb a-PDXl y anticuerpos secundarios específicos de conejo a cada lisado. El precipitado fue cosechado mediante centrifugación. Los inmunoprecipitados fueron disueltos en solución reguladora que contiene SDS y luego cargados sobre un gel de poliacrilamida. Después de la separación, las proteínas son transfectadas a una membrana mediante electroinmunoabsorción y luego probadas con el anticuerpo primario IgY a-PDXl seguido por anticuerpos secundarios Rb a-IgY marcados. Los inmunoprecipitados recolectados de las células de control positivo MSl-V también como aquellos de las células del día 8 (carril d8, tres días después del inicio del tratamiento de R?) y día 9 (carril d9, cuatro días después del inicio de RA) fueron positivas para proteína PDXl (figura 44) . Los precipitados obtenidos de células de endodermo definitivo sin diferenciar (esto es, células del día 5 tratadas con activina A-designadas (A) en la figura 44) y hESC sin diferenciar (esto es, células de 5 días sin tratar-designadas como (NF) en la figura 44) fueron negativas para PDXl.
EJEMPLO 22 Generación de líneas hESC transgénicas promotor-EGFP de PDXl Con el fin de usar . el marcadores de PDXl para aislamiento de células, se marcaron genéticamente células de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo con un gen reportero expresable. Este ejemplo describe la construcción de un vector que comprende un caset reportero que comprende un gen reportero bajo el control de la región regulatoria de PDXl. Este ejemplo también describe la proporción de una célula, tal como una célula de tallo embriónico, transfectadas con este vector también como una célula que tiene su caset reportero integrado a su genoma. Líneas de células de endodermo definitivo que expresan PDXl marcadas genéticamente con un gen reportero fueron construidas al colocar un gen reportero GFP bajo control de la región regulatoria (promotora) del gen PDXl. En primer lugar, un constructo de plásmido en el cual la expresión de EGFP es impulsada por el promotor de gen PDXl humano fue generado al reemplazar el promotor de CMV del vector pEGFP-Nl (Clontech) con la región de control de PDXl humana (No. de 5 Acceso Genbank AF192496) , que comprende una secuencia de nucleótidos que fluctúa de aproximadamente 4.4 pares de kilobases (kb) corriente arriba a aproximadamente 85 pares de bases (bp) corriente abajo del sitio de inicio de transcripción de PDXl. Esta región contiene los elementos regulatorios 0 caracterizados del gen PDXl y es suficiente para conferir el - - patrón de expresión de PDXl- normal 'en ratones transgénicos. En el vector resultante, la expresión de EFGP es impulsada por el promotor PDXl. En algunos experimentos, este vector puede ser transfectado a hESC. 5 El promotor de PDXl/caset de EGFP fue extirpado del vector anterior y luego sub-clonado a un vector de selección que contiene el gen de fosfotransferasa de neomicina bajo el control del promotor de cinasa-1 de fosfoglicerato. El caset de selección está flanqueado por sitios de reconocimiento de 0 recombinasa flp para permitir la remoción del caset. Este vector de sección fue linealizado y luego introducido a hESC utilizando métodos de lipofección estándar. Enseguida de 10-14 días de selección en G418, clones hESC transgénicos sin diferenciar fueron aislados y expandidos. 5 EJEMPLO 23 Aislamiento de endodermo de intestino anterior PDXl-positivo El siguiente ejemplo demuestra que hESC que comprende el promotor de PDXl/caset de EGFP pueden ser diferenciadas a células de endodermo PDXl-positivo y luego aisladas subsecuentemente mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) . hESC transgénicos de promotor de PDX1/EGFP fueron diferenciadas durante 5 días en un medio que contiene activina A seguido por dos días en un medio que .comprende activina A y RA.. Luego ias células diferenciadas fueron cosechadas mediante digestión de tripsina y clasificadas sobre un dispositivo Becton Dickinson FACS Diva directamente a la solución reguladora del pH de lisis de ARN o PBS. Una muestra de células vivas individuales fue tomada sin compuerta para EGFP (vivos) y las células vivas individuales fueron aplicadas en compuerta a poblaciones de EGFP positivo (GFP) y GFP negativo (Neg) . En un experimento, la fracción EGFP positiva fue separada a dos poblaciones de igual tamaño de acuerdo con la intensidad de fluorescencia (Hi y Lo) . Enseguida de la clasificación, las poblaciones de células fueron analizadas mediante Q-PCR e inmunocitoquímica. Para el análisis de Q-PCR, se preparó ARN utilizando columnas Qiagen RNeasy y luego convertidas a cAD . La Q-PCR se llevó a cabo como se describe previamente. Para análisis de inmunocitoquímica, las células fueron clasificadas a PBS, fijadas por 10 minutos en paraformaldehído al 4% y adheridas a portaobjetos de vidrio utilizando una centrifuga Cytospin. Los anticuerpos primarios para citoqueratina 19 (KRT 19) fueron de Chemicon; al factor 3 beta de hepatocito nuclear (HNF3ß) de Santa Cruz; a transportador 2 de glucosa (GLUT2) de R&D systems. Anticuerpos secundarios apropiados conjugados a FITC (verde) o rodamina (rojo) se usaron para detectar el enlace de los anticuerpos primarios. Una clasificación - de FACS . típica de células diferenciadas es mostrada en la figura 45. El por ciento de o células PDXl-positivo aisladas en este ejemplo fue aproximadamente 7%, que varió dependiendo de la eficiencia de diferenciación de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%. Las células clasificadas fueron sometidas adicionalmente a análisis de Q-PCR analysis. Las células diferenciadas muestran una correlación de fluorescencia de EGFP con la expresión del gen PDXl endógena. En comparación con células que no fluorescen, las células EGFP positivas mostraron un incremento mayor de 20 veces en niveles de expresión de PDXl (figura 46) . La separación de células de alta o baja intensidad de EGFP indicó que el nivel de expresión de EGFP se correlaciona con el nivel de expresión de PDXl (figura 47).
Además del análisis del marcador PDXl, las células clasificadas fueron sometidas a análisis de Q-PCR de varios genes que son expresados en endodermo pancreático. Los productos de cada uno de estos genes marcadores (NKX2.2, GLUT2, KRT19, HNF4a y HNF3ß) fueron todos enriquecidos en fracción EGFP positiva (figuras 48A-E) . En contraste, los marcadores neurales ZIC1 y GFAP no fueron enriquecidos en células que expresan EGFP clasificadas (figuras 49A y B) . Mediante inmunocitoquímica, virtualmente todas las células PDXl-positivo aisladas se ve que expresan KRT19 y GLUT2. Este resultado es esperado para células del linaje de endodermo pancreático. Muchas de estas células fueron también :HNF3ß positivo mediante teñido de anticuerpo.
EJEMPLO 24 Transplante de células de endodermo definitivo humanas bajo cápsula de riñon de ratón Para demostrar que las células de endodermo definitivo humanas producidas utilizándose los métodos descritos en la presente son aptas de responder a factores de diferenciación para producir células que son derivadas del tubo intestinal, tales células de endodermo definitivo humanas fueron sometidas a un protocolo de diferenciación in vivo. Células de endodermo definitivo humanas fueron producidas como se describe en los ejemplos anteriores. Tales células fueron cosechadas y transplantadas bajo la cápsula de riñon de ratones inmunocomprometidos utilizando procedimientos estándar. Después de tres semanas, los ratones fueron sacrificados y el tejido transplantado fue removido, seccionado y sometido a análisis histológico e inmunocitoquímico. Las figuras 50A-D muestran que después de tres semanas post-transplante, las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a célula y estructuras celulares derivadas del tubo intestinal. En particular, la figura 50A muestra secciones teñidas con hematoxilina y eosina de tejido de endodermo definitivo humano transplantado que ha sido diferenciado a estructuras semejantes a tubo intestinal.' La-figura 50B muestra una sección de endodermo definitivo humano transplantada inmunoteñida con anticuerpo a anticuerpo específico de hepatocito (HSA) . Este resultado indica que las céludas de endodermo definitivo humanos son aptas -'de diferenciarse a células de hígado o precursoras de hígado. Las figuras 50C y 50D muestran una sección de endodermo definitivo humano transplantada inmunoteñida con anticuerpo a villina y anticuerpo a factor 2 de transcripción de caja homeótica tipo caudal (CDX2) , respectivamente. Estos resultados indican que las células de endodermo definitivo humano son aptas de diferenciarse a células intestinales o precursores de células intestinales .
EJ?MPLO 25 Identificación de factores de diferenciación capaces de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo humano in vitro Para ejemplificar los métodos de selección de factor de diferenciación descritos en la presente, poblaciones de células de endodermo definitivo humano producidas utilizando los métodos descritos en la presente fueron proporcionadas separadamente con varios factores de diferenciación candidato en tanto que se determinan los niveles de expresión normalizados de ciertos productos de gen marcador en varios puntos en el tiempo. Células de endodermo definitivo humano fueron producidas como se describe en los ejemplos anteriores. En breve, células hESC fueron cultivadas en presencia de 100 ng/ml de activina A en un medio de RPMI de bajo contenido de suero durante cuatro días, en donde la concentración de suero bovino fetal (FBS) en el día 1 fue 0%, en el día 2 fue de 0.2% y en los días 3-4 fue de 2%. Después de la formación de endodermo definitivo, comenzando en el día 5 y terminando en el día 10, las poblaciones de células mantenidas en placas individuales en RPMI que contiene 0.2% de FBS fueron tratadas con uno de: Wnt3B a 20 ng/ml, FGF2 a 5 ng/ml o FGF2 a 100 ng/ml. La expresión de producto de gen marcador para albúmina, PROXl y TITF1 fueron cuantificadas utilizando Q-PCR.
La figura 51A muestra que la expresión del producto de gen de albúmina (un marcador para células precursoras de hígado y de hígado) se incrementó sustancialmente en los días 9 y 10 en respuesta a FGF2 a 5 ng/ml en comparación con la expresión en células de endodermo definitivo en el día 4 pervio al tratamiento con este factor de diferenciación. La expresión del producto de gen de albúmina fue también incrementada en respuesta a 20 ng/ml Wnt3B en los días 9 y 10 en comparación con la expresión de células de endodermo definitivo sin tratar, sin embargo, el incremento no fue tan grande como aquel observado .-para el tratamiento con FGF2 de 5 ng/ml. De significado particular es la observación de que la expresión del producto de gen de albúmina no fue incrementada en los días 9 y 10 en respuesta a FGF2 a 100 ng/ml en comparación con la expresión en células de endodermo definitivo en el día 4. Resultados similares fueron vistos con el marcador PROXl (un segundo marcador para células precursoras de hígado y células de hígado) como se muestra en la figura 51B. La figura 51C muestra que en poblaciones de células provistas con FGF2 100 ng/ml, la expresión del gen marcador TITF1 se incrementó sustancialmente en los días 7, 9 y 10 en comparación con expresión en células de endodermo definitivo en el día 4 previo al tratamiento con este factor de diferenciación, pero FGF2 a 5 ng/ml tuvo muy poco efecto sobre la expresión de este producto genético en comparación con el endodermo definitivo sin tratar.
Tomados conjuntamente, los resultados mostrados en las figuras 51A-C indican que la concentración a la cual el factor de diferenciación candidato es provisto a la población de células puede afectar el destino de diferenciación de las células de endodermo definitivo in vitro.
EJ?MPLO 26 Regulación ascendente y regulación descendente del marcador en respuesta a factores de diferenciación candidato Para ejemplificar adicionalmente los métodos de selección de factor de diferenciación descritos en la presente, poblaciones de células de endodermo definitivo humanas fueron seleccionadas con factores de diferenciación candidato utilizando procedimientos similares a aquellos descritos en ejemplo 25. Células de endodermo definitivo humanos fueron producidas como se describe en los ejemplos anteriores. En breve, células hESC fueron cultivadas en presencia de 100 ng/ml de activina A en un medio de RPMI de bajo contenido de suero durante cuatro días, en donde la concentración de suero bovino fetal (FBS) en el día 1 fue 0%, en el día 2 fue 0.2% y en los días 3-4 fue de 2%. Después de la formación de endodermo definitivo, que comienza en el día 5 y termina en el día 10, las poblaciones de células mantenidas en placas individuales en RPMI que contienen 0.2% de FBS fueron tratadas con uno de: Wnt3A a 20-50 ng/ml, FGF2 a 5 ng/ml o FGF2 a 100 ng/ml. En el día 5 post-formación de endodermo definitivo (día 9 después del inicio de la diferenciación de hESC) , se agregó BMP4 a todos los cultivos a una concentración de 50 ng/ml. La expresión de productos de gen marcador (mRNA) para alfa-fetoproteína (AFP) , citocromo P450 7A (CYP7A) , tirosina aminotransferasa (TAT) , factor 4a nuclear de hepatocito (HNF4a) , receptor 4 de quimiocina tipo CXC (CXCR4), factor de von Willebrand (VWF), molécula 1 de adhesión de célula vascular (VACM1) , apolipoprot-eína Al (APOA1) , transportador 2 de glucosa (GLUT2), alfa-1-antitripsina (AAT), glucocinasa (GLüKO) , y caja homeótica expresada hematopoyéticamente humana (hHEX) fueron cuantificadas utilizando Q-PCR. Las figuras 52A-B muestran que la expresión del producto de gen marcador (un marcador para células precursoras del hígado y células de hígado) y ATT se incrementó sustancialmente en los días 9 y 10 en respuesta a FGF2 a 5 ng/ml y BMP4 a 50 ng/ml en comparación con la expresión en células de endodermo definitivo en el día 4. La expresión de mARN de AFP y AAT no fue incrementada sustancialmente por la concentración más alta de FGF2 (100 ng/ml) aún en presencia de BMP4 (figuras 51A-B días 9 y 10) . En contraste a los resultados anteriores, la expresión de GLUKO, hHEX y TAT mRNAs fue regulada de manera ascendente sustancialmente en presencia de FGF2 a 100 ng/ml y BMP4 a 50 ng/ml en los días 9 y 10 en comparación con la expresión en células de endodermo definitivo en el día 4. En el caso de GLUKO, ni Wnt3A ni FGF2 a 5 ng/ml con o sin BMP4 provocaron un incremento en la expresión de este marcador (figura 52C) . FGF2 a 5 ng/ml, sin embargo, provocó un incremento en la expresión de hHEX en presencia de BMP a una extensión mayor o igual al incremento provocado por FGF2 a 100 ng/ml en presencia de BMP (figura 52D) . La expresión de TAT en los días 9 y 10 en comparación con la expresión en células de endodermo definitivo fue incrementada por cada uno de los factores - -probados (figura- .52E) . Adicionalmente, ' ciertos marcadores de células fueron expresados a un nivel incrementado en comparación con células de endodermo definitivo en presencia de Wnt3A, pero no en respuesta a combinaciones de FGF/BMP. En particular, la expresión de mARN de hNF4a se incrementó significativamente en los días 9 y 10 en respuesta a la combinación de Wnt3A y BMP4 (figura 52F) . Además, CYP7A mostró un incremento marginal en respuesta a Wnt3A/BMP4 en el día 10 (figura 52G) . Varios marcadores que se sabe que son expresados en un número de tipos de células diferentes fueron también observados. Específicamente, los marcadores APOA1, • GLUT2, VCAM1, VWF y CXCR4 fueron examinados. Previamente, la expresión de cada de uno de estos marcadores ha sido correlacionada con tipos de células específicos como sigue: los marcadores APOA1 y GLUT2 son altamente expresados en el hígado y expresados moderadamente en el duodeno en el intestino delgado. El marcador VCAM1 es expresado a un alto nivel en el hígado, expresado a nivel moderado en el estómago, duodeno e intestino delgado y expresado a niveles más bajos pero significativos en el pulmón y páncreas. En contraste, los marcadores VWF y CXCR4 son expresados a alto nivel en el pulmón pero solamente a bajos niveles en el hígado. Tanto VWF y CXCR4 son también expresados a niveles moderados o altos en el estómago, páncreas, duodeno, e intestino delgado. La expresión de cada uno de los marcadores descritos anteriormente fue verificada en cultivos de células de endodermo definitivo puestos en contacto con combinaciones de Wnt3A, FGF2 y BMP4. Consistente con los resultados anteriores, las figuras 52H-J muestran que la expresión de GLUT2, APOA1 y VCAM1 mRNA fue incrementada en respuesta a la combinación de FGF2 a 5 ng/ml y BMP4 en los días 9 y 10 en comparación con la expresión en endodermo definitivo. La expresión de mARN para estos marcadores no fue incrementada sustancialmente en respuesta a la combinación de FGF2 a 100 ng/ml y BMP . En el caso de los m?RN del gen marcador APOAl y VCAM1, el incremento más grande en la expresión en los días 9 y 10 fue moderada por la combinación de Wnt3A y BMP4 (figuras 521-J) . Además de lo anterior, la expresión de ciertos mARN fue disminuida en comparación con la expresión en endodermo definitivo. Por ejemplo, en comparación con la expresión en endodermo definitivo, tanto la expresión de mARN VWF y CXCR4 fue disminuida después del contacto con Wnt3A en presencia y en ausencia de BMP4 también como después del contacto con FGF2 a 5 ng/ml en presencia y en ausencia de BMP4 (figuras 52K-L) . El contacto con el FGF2 a 100 ng/ml, tanto en ausencia como en presencia de BMP4, mostró fuertemente la velocidad de disminución de estos dos marcadores (figuras 52K-L) . En efecto, la expresión de CXCR4 fue mantenida sustancialmente aún en el día 10 (figura 52L) . -- Los métodos, composiciones y dispositivos descritos-en la presente son actualmente representativos de modalidades preferidas y son ejemplares y no pretenden ser limitaciones en el alcance de la invención. Cambios en los mismos y otros usos se les presentarán a aquellos experimentados en el arte que son abarcados en el espíritu de la invención y son definidos por el alcance de la revelación. Así, será evidente para el experimentado en el arte que se pueden efectuar sustituciones y modificaciones varias a la invención revelada en la presente sin desviarse del alcance y espíritu de la invención. Como se usa en las reivindicaciones a continua y en toda esta revelación, por la frase "consiste esencialmente de" se incluyen cualesquier elementos enlistado después de la frase y limitados a otros elementos que no interfieren con o contribuyen con la actividad o acción especificada en la revelación de los elementos enlistados. Así, la frase "consiste esencialmente de" indica que los elementos enlistados son requeridos o determinantes, pero que otros elementos son opcional y pueden o pueden no estar presentes dependiendo de si afectan a no la actividad o acción de los elementos enlistados.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar un factor de diferenciación capaz de promover la diferenciación de células de endodermo definitivo humanas en una poblaciones de células que comprende células humanas, el método está caracterizado porque comprende las etapas de: obtener una población de células que comprende células de endodermo definitivo humanas; proporcionar un factor de diferenciación candidato a la población de células; determinar la expresión de un marcador en la población de células en un primer punto en el tiempo; determinar la expresión del mismo marcador en la población de células en un segundo punto en el tiempo, en donde el segundo punto en el tiempo es subsecuente al primer punto en el tiempo y en donde el segundo punto en el tiempo es subsecuente a la provisión de la población de células con el factor de diferenciación candidato; y determinar si la expresión del marcador en la población de células en el segundo punto en el tiempo es incrementada o disminuida en comparación con la expresión de marcador en la población de células en el primer punto en el tiempo, en donde un incremento o disminución de la expresión del marcador en la población de células indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de provocar la diferenciación de las células de endodermo definitivo humanas. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula de endodermo definitivo humano comprenden por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas en la población de células . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células alimentadoras humanas están presentes en la población de células y en donde por lo menos aproximadamente 10% de las células humanas diferentes a las células alimentadoras son células de endodermo definitivo. . 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las célula de endodermo definitivo humanas comprenden por lo menos aproximadamente 90% de- las células humanas en la población de células. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células alimentadoras humanas están presentes en la población de células y en donde por lo menos aproximadamente 90% de las células humanas diferentes a las células alimentadoras son células de endodermo definitivo. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células, tejidos u órganos derivados del tubo intestinal en respuesta al factor de diferenciación candidato. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células precursoras pancreáticas en respuesta al factor de diferenciación candidato. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, 5 caracterizado porque el marcador es seleccionado del grupo que consiste de factor-1 de caja homeótica pancreática-duodenal (PDXl), caja homeótica Al3 (H0XA13) y caja homeótica C6 (H0XC6) . 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, •10; - carneterizado porque las células "de endodermo definitivo • : .. - humanas se diferencian- a células de precursor de hígado -en respuesta al factor de diferenciación candidato. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el marcador es seleccionado del grupo que 15 consiste de albúmina, caja homeótica 1 prospero-relacionada (PROXl) y antígeno específico de hepatocito (HSA) . 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células precursoras de pulmón en 20 respuesta al factor de diferenciación candidato. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el marcador es factor 1 de transcripción de tiroides (TIFT1) . 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, 25 caracterizado porque las células de endodermo definitivo humanas se diferencian a células precursoras intestinales en respuesta al factor de diferenciación candidato. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el marcador es seleccionado del grupo que consiste de villina y factor 2 de transcripción de caja homeótica tipo caudal (CDX2) . 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer punto en el tiempo es antes de proporcionar el factor de diferenciación candidato a la : población de células. . .- - r • - ' . • : • 16. El método- de conformidad con la reivindicación 1, o caracterizado porque el primer punto en el tiempo es . en aproximadamente el mismo tiempo como la provisión del factor de diferenciación candidato a la población de células. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer punto en el tiempo es subsecuente a la provisión del factor de diferenciación candidato a la población de célula. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del marcador es incrementada. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del marcador es disminuida. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del marcador es determinada mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (Q-PCR) . 21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la expresión del marcador es determinada mediante inmunocitoquímica. 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el marcador es seleccionado del grupo que consiste de factor-1 de caja homeótica pancreática-duodenal (PDXl) , caja homeótica A13 (H0XA13) y caja homeótica C6 (H0XC6) . 2-3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el marcador es seleccionado del grupo que': consiste de albúmina, -caja homeótica 1 prospero-relacionada (PROXl). y antígeno específico de hepatocito (HSA). ; 24. "El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el marcador es seleccionado del grupo que consiste de villina y factor 2 de transcripción de caja homeótica tipo caudal (CDX2) . 25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el marcador es factor 1 de transcripción de tiroides (TITFl) . 26. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende un factor de diferenciación de intestino anterior. 27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende una molécula pequeña. 28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende un retinoide . 29. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende ácido retinoico. 30. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende un polipéptido. 31. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende un factor de crecimiento. 32. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende FGF-10. 33. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende FGF-2. 34. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación comprende Wnt3B. 35. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación no es un factor de diferenciación de intestino anterior. 36. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación no es a retinoide . 37. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación no es ácido retinoico. 38. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación es provisto a la población de células a una concentración de entre aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 10 mg/ml. - 39. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el. factor de diferenciación es provisto a la población de células a una concentración de entre aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1 mg/ml . 40. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación es provisto a la población de células a una concentración de entre aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 µg/ml. 41. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación es provisto a la población de células a una concentración de entre aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 10 µg/ml. 42. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación es provisto a la población de células a una concentración de aproximadamente 1 µg/ml . 43. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el factor de diferenciación es provisto a la población de células a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml.
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