JP5993857B2 - 感覚性ニューロパチーに関連するsptlc2遺伝子の突然変異 - Google Patents
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Description
本発明は、SPTLC2遺伝子における核酸変異と感覚性ニューロパチーとの間に明確な関連を初めて確認した。したがって、前記新規遺伝子マーカーは、感覚性ニューロパチー関連疾患もしくは障害を発症する危険性に関して信頼できる診断または予測を提供する。こうした遺伝的変異の同定は、治療に対する応答が個体間で変化する理由に関する洞察を提供するだけでなく、改善されたリスク評価および個別化医療の適用を通して、罹患率および死亡率を潜在的に減少させる可能性もある。
本発明は、特定の実施形態に関しておよび特定の図面を参照して説明されるが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲における如何なる参照符号も範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。説明する図面は概略的なものに過ぎず、限定的でない。図面において、いくつかの要素のサイズは説明のため誇張されており、正確な縮尺で示されていない可能性がある。本明細書および特許請求の範囲において「含む(comprising)」という用語が使用される場合、これは他の要素またはステップを排除するものではない。単数名詞に言及する際、不定冠詞または定冠詞、例えば「1つ(a)」または「1つ(an)」、「その(the)」が使用される場合、何か他に特記されていない限り、これはその名詞の複数形を含む。
膨大な数にのぼる患者における既知のHSAN遺伝子の系統的スクリーニングでは、発端者の19%でのみ病原性突然変異が認められた(Rotthierら2009)。このことは、他の疾患関連遺伝子の関与を示唆する。大規模なHSANコホートにおいて一連の機能的候補遺伝子をスクリーニングすることによって、本発明者らは、典型的なHSAN I型の表現型を呈する4人の発端患者において、スフィンゴ脂質のデノボ生合成経路の最初の酵素であり律速酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SPT)のSPTLC2サブユニット中に3つのヘテロ接合型ミスセンス突然変異を同定した。SPTLC2はHSAN I型の原因から以前に除外されていたので(Dawkinsら2002)、このことは特に驚くべきことである。さらに、これらの突然変異は部分的なSPT活性の喪失から完全なSPT活性の喪失まで引き起こし、神経毒性代謝産物である1−デオキシスフィンガニン形成の原因となる。したがって、本発見はHSAN関連疾患の遺伝的異質性を拡大し、SPTの欠損を伴うHSANニューロパチーの群を増大させる。
(a)前記対象のSPTLC2遺伝子において1つまたは複数の核酸変異体の有無を検出するための手段または試薬、および
(b)場合によって、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたはこれに罹患しているかを、ステップ(a)の手段によって検出された核酸変異体から決定するための手段。
(a)以下の位置、すなわちcDNA配列(配列番号2)で特定され得るようなSPTLC2遺伝子のコード領域の1145、1075または1510の1箇所または複数個所において、核酸変異体の有無を検出するための手段または試薬、および
(b)場合によって、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたはこれに罹患しているかを、ステップ(a)の手段によって検出された核酸変異体から決定するための手段。
(i)適切な場合には、生物試料中に存在する標的SPTLC2ポリ核酸を得るおよび/またはそれらのヌクレオチド配列を得るための手段、
(ii)標的SPTLC2核酸の検出に適した少なくとも1つのオリゴヌクレオチドおよび/または標的SPTLC2ポリ核酸の増幅に適した少なくとも1つのオリゴヌクレオチド対、
(iii)適切な場合には、核酸を変性させるための薬剤、
(iv)適切な場合には、二本鎖または一本鎖の核酸分子を修飾することができる酵素、
(v)適切な場合には、ハイブリダイゼーション緩衝液または前記緩衝液を作製するのに必要な成分、
(vi)適切な場合には、洗浄液または前記溶液を作製するのに必要な成分、
(vii)適切な場合には、部分的または完全に変性したポリ核酸を検出するための手段および/または前記ハイブリダイゼーションにおいて形成されたハイブリッドを検出するための手段および/または核酸の酵素的修飾を検出するための手段、
(viii)適切な場合には、固形担体上の既知の位置にオリゴヌクレオチドを結合させる手段。
SPTLC2の突然変異はHSAN−Iに関係する
SPTLC2(染色体座位14q24.3)のコード配列およびイントロン−エキソン境界部位を、以前にスクリーニングされ、他の既知HSAN遺伝子(SPTLC1、RAB7A、WNK1/HSN2の全コード領域、FAM134B、NTRK1、NGFBおよびCCT5)における突然変異について陰性であると分かった(Rotthierら2009、Kurthら2009)78人のHSAN罹患患者において解析した。本出願人らは、4人の発端患者において3つのヘテロ接合型ミスセンス突然変異を同定し、その人たちに関する臨床的および電気生理学的な情報を表1および表2にまとめる。この突然変異は300人のヨーロッパ人対照個体には存在しなかった。
SPTLC2突然変異はSPT活性の低下に関係する
SPTLC2の3つの突然変異全ては、それらが機能的に重要であり得ることを示す高度に保存されたアミノ酸(図3a)を標的にする。本出願人らは、安定的にトランスフェクトされたFlp−in HEK293細胞において、これらの突然変異がSPT活性に与える影響の試験に着手した。Flp−inシステムは、特異的なゲノム位置における導入遺伝子1コピーの安定的挿入を確実なものにする。この方法で、異なる導入遺伝子の適度なおよび等しい発現が得られる。SPT下流にあるスフィンゴ脂質のデノボ生合成経路を阻害するカビ毒であるフモニシンB1(Wangら1991)(図1)で細胞を24時間処理した。SPTによるパルミトイルCoAとセリンとの縮合がこの生合成経路の律速ステップであるため、結果として生じるスフィンガニン(SA)の蓄積は、標準的なSPT活性(L−セリンの取り込み)を反映する。野生型(wt)SPTLC2の安定発現は、GFPを安定的に発現している対照細胞と比較して、SA蓄積を8倍増大させた。これは、野生型SPTLC2の過剰発現がより高いSPT活性を実際に導くという以前の報告(Hornemannら2006)に一致する。これに反して、G382V突然変異型の安定発現は、基礎レベルより上にSA蓄積を増大させなかった。V359M発現細胞およびI504F発現細胞は、SA蓄積の増大を示したが、野生型SPTLC2発現細胞よりずっと不明瞭であった(図4a)。したがって、これら3つの突然変異は、部分的なSPT活性の喪失から完全なSPT活性の喪失までをもたらす。
S.セレビシエにおいてSPTLC2突然変異型はインビボSPT活性に異なる影響を与える
インビボで標準SPT活性の喪失を確証するために、本出願人らは、対応する酵母の突然変異型を(図3A)、ヘテロ接合型LCB2欠損酵母系統(LCB2はSPTLC2のS.セレビシエ相同分子種である。LCB2配列に対するGenBank受託番号はNM_001180370である。)で発現させ、内在性LCB2を有するまたは有さない2つの一倍体胞子を得るために、四分子分析を行った。期待された通り、4つの胞子全ては、これらが野生型または突然変異型のLCB2を発現したかどうかに関係なく、許容温度である18℃で生育した。制限温度(37℃)では、(残存)SPT活性を有する胞子は生育可能であるが、LCB2を有さないまたは機能しないLCB2を有する胞子は、フィトスフィンゴ脂質を産生し生育するために、フィトスフィンゴシンの外部添加に依存する(Dunnら2000)。フィトスフィンゴシンなしで4つの等しい大きさのコロニーが出現したこと(図5)から明らかであるように、野生型LCB2はLCB2の欠損を相補することができた。これとは対照的であるが、ドミナントネガティブであるLCB2のK366T突然変異(Gableら2002)と類似して、G369V突然変異(SPTLC2のG382Vに対応する。)を発現している酵母胞子は、内在性のLCB2が存在する時のみコロニーを生じた。このことは、この突然変異型がLCB2欠損を相補できないことを示す。V346M突然変異型およびI491F突然変異型(SPTLC2のV359MおよびI504Fにそれぞれ対応する。)によってもたらされた残存活性は、37℃での成長を回復するのに十分であった。これは、本出願人らの生化学的なデータと一致する。
突然変異型SPTはそのアミノ酸基質に対して曖昧性を示す
最近の報告によって、HSAN−IのSPTLC1突然変異はSPT酵素の基質特異性に影響することが示されている。すなわち、突然変異型SPTは、別の基質としてL−アラニンおよびそれほどではないがグリシンを代謝することができる。これは、非定型および神経毒性のスフィンゴイド塩基代謝産物1−デオキシ−SAおよび1−デオキシメチル−SAの形成をもたらす(Zitomerら2009、Pennoら2010)。末梢神経におけるこれらの代謝産物の蓄積はHSAN−Iの根本原因であるとみなされていた(Pennoら2010)。SPTLC2突然変異がSPTの酵素親和性に対して同様に影響を及ぼし、代替代謝産物の同様の蓄積を起こすかどうかを試験するために、突然変異型を発現しているHEK293細胞のスフィンゴイド塩基プロファイルを解析した。野生型SPTLC2を安定的に発現している細胞において、1−デオキシ−SAの量は対照細胞と類似しており(図6a)、このことは、SPT活性の増大それ自体は基質特異性を変化させないことを示す。これに反して、突然変異体の発現は、対照細胞と比較して20倍までの高い1−デオキシ−SAレベルをもたらし、最高レベルはG382VまたはI504Fの突然変異型酵素を安定的に発現しているHEK細胞であった。HEK細胞およびリンパ芽球細胞の両方における1−デオキシメチル−SA発生レベルは検出限界を下回った。
対象
本試験のために、一群の78人の遺伝性の潰瘍断節性感覚性ニューロパチー患者を選択した。組み入れ基準はRotthierら2009で既に述べられている。このコホートは、臨床的特徴および異なる遺伝様式において大きな変動を示すが、全ての患者は進行性の遠位型感覚機能障害を共有する。本試験に組み入れる前に、全ての患者または彼らの法定代理人から治療担当医師によってインフォームドコンセントを得た。
DNA試料は全て、全ゲノム増幅キット「GenomiPhi V2 DNA Amplificationキット」(GE Healthcare)を使用して増幅した。SPTLC2およびSPTLC3のエキソンの100bp上流および100bp下流までのコード領域およびエキソン−イントロン境界部位を、Primer3およびSNPboxソフトウェアツール(RozenおよびSkaletsky2000、Weckxら2004)を用いて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCRで増幅した。プライマー配列を表3および表4に列挙する。突然変異スクリーニングは、BigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencingキット(Applied Biosystems)を使用して、精製PCR断片のダイレクトDNAシークエンシングによって行い、ABI3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems)で分離した。得られた配列を整列させ、novoSNP(Weckxら2005)およびSeqMan(商標)IIプログラムを用いて解析した。配列変異体は、最初のDNA試料に関する再PCRおよび両方向のシークエンシングによって確認した。
SPTLC2cDNA(NM_004863.2)を増幅し、Gateway(登録商標)エントリーベクターpDONR221(Invitrogen)に以下のプライマーを使用してクローニングした。
SPTLC2_attb1: 5’−gggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgcggccggagcccggaggctgct−3’ (配列番号4);および
SPTLC2_attb2: 5’−ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccgtcttctgtttcttcatacgtc−3’ (配列番号5)
SPTLC2突然変異は、以下のプライマーを使用して部位特異的突然変異誘発によって導入した。
SPTLC2_V359M_fw: 5’−ccacaggccggggtatggtggagtac−3’ (配列番号6)
SPTLC2_V359M_rv: 5’−gtactccaccataccccggcctgtgg−3’ (配列番号7)
SPTLC2_G382V_fw: 5’−gaacgttcacaaagagttttgttgcttctggaggatatattgg−3’ (配列番号8)
SPTLC2_G382V_rv: 5’−ccaatatatcctccagaagcaacaaaactctttgtgaacgttc−3’ (配列番号9)
SPTLC2_I504F_fw: 5’−ttcctgccaccccaatttttgagtccagagcc−3’ (配列番号10)
SPTLC2_I504F_rv: 5’−ggctctggactcaaaaattggggtggcaggaa−3’ (配列番号11)
LCB2_HA_fw:5’−gccactacctgagcccgttgtcagcgtagtctgggacgtcgtatgggtaagcgtagtctggga cgtcgtatgggtaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtagacacccctccttattacatttc−3’ (配列番号12)
LCB2_HA_rv:5’−gaaatgtaataaggaggggtgtctacccatacgacgtcccagactacgcttacccatacgacgt cccagactacgcttacccatacgacgtcccagactacgctgacaacgggctcaggtagtggc−3’ (配列番号13)
LCB2_V346M_fw: 5’−gcccaactggtcgcggtatgtgtgaaatatttggcg−3’ (配列番号14)
LCB2_V346M_rv: 5’−cgccaaatatttcacacataccgcgaccagttgggc−3’(配列番号15)
LCB2_G369V_fw: 5’−gtactttcactaagtcgtttgttgctgctggtggttacattg−3’ (配列番号16)
LCB2_G369V_rv: 5’−caatgtaaccaccagcagcaacaaacgacttagtgaaagtac−3’(配列番号17)
LCB2_ I491F_fw: 5’−cttatcctgctactccgctgtttgaatcaagagtaagattctg−3’(配列番号18)
LCB2_I491F_rv: 5’−cagaatcttactcttgattcaaacagcggagtagcaggataag−3’(配列番号19)
LCB2_K366T_fw: 5’−ctaatgggtactttcactacttcgtttggtgctgctggtg−3’(配列番号20)
LCB2_K366T_rv: 5’−caccagcagcaccaaacgaagtagtgaaagtacccattag−3’(配列番号21)
HEK293Flp−in細胞を10%ウシ胎仔血清、L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを追加したDMEM中で37℃および5%CO2で培養した。リンパ芽球様細胞系を10%ウシ胎仔血清、L−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン/ストレプトマイシンを追加したRPMIで37℃および5%CO2で培養した。細胞培養培地および追加物は全てInvitrogenから得た。
全血液試料を15mlのフィコールパックと混合し、10分間遠心分離した。洗浄後、リンパ球をエプスタインバールウイルスで形質転換し、37℃で2時間インキュベートした。遠心分離後、1%フィトヘマグルチニンを加えた4mlのRPMI完全培地にペレットを再懸濁させた。細胞を24ウェルプレートに播種して、37℃および5%CO2で最低3日間インキュベートした。細胞を分割し、必要に応じて新鮮な培地を補充した。
野生型または突然変異型のLCB2を含有するYCplac111コンストラクトを、カナマイシン抵抗性遺伝子でLCB2が置換されたヘテロ接合型LCB2欠損系統(BY4743)に形質転換し(Gietzら2007)、胞子形成させた。得られた四分子を分離してLCB2の内在性の発現を欠く一倍体胞子を獲得し、フィトスフィンゴシン(15μM、Avanti Polar Lipid)および0.1%テルギトールを有するYPD培地で26℃で生育させた。2日後、異なる生育培地、すなわち18℃および37℃(酵母SPT突然変異型は温度感受性生育の表現型を有する[Dunnら2000]。)のYPD培地、ロイシンなしの合成最少培地(形質転換された胞子の選抜を可能にする。)およびジェネテシン(LCB2欠損胞子の選抜)を有するYPD培地にレプリカ培養を行った。各コンストラクトに関して、少なくとも6つの四分子を解析した。別段の指定がない限り、培地および追加物はSigmaから得た。
全mRNAをRNeasy miniキット(Qiagen)を使用して精製した。Turbo DNA freeキット(Ambion)を使用してDNA不活化を行い、cDNA合成をSuperscript III first strand synthesis system for RT−PCR(Invitrogen)を用いて行った。SPTLC2の発現(内在性およびコンストラクト)を以下のプライマーの組み合わせを使用して解析した。
SPTLC2_Fw:5’−gagtccagagccaggttttg−3’(配列番号22)、および
SPTLC2_3’UTR_Rv:5’−ctgagggagcaccaaaaag−3’(配列番号23)(内在性のSPTLC2発現用)、または
V5_Rv:5’−gagagggttagggataggcttac−3’(配列番号24)(SPTLC2コンストラクト用)。
本アッセイは、Pennoら2010に記載されているように行った。手短に述べると、細胞が指数関数的に生育する培地にフモニシンB1(Sigma)を10μg/mlの終濃度で添加した。負の対照として、SPT阻害剤のミリオシン(10μg/ml、Sigma)をフモニシンB1とともに添加した。フモニシンB1を添加してから24時間後に、細胞をPBSで2回洗浄し、回収して、計数した(Coulter(登録商標)Z2、Beckman Coulter)。次に、この細胞を塩基性条件下で脂質抽出にかけた(以下を参照されたい。)。スフィンゴイド塩基をLC−MSによって定量化した。合成C17スフィンゴシン(Avanti Polar Lipids)を内部抽出標準として各試料に添加した。
SPT活性をRuttiら2009に記載の放射活性ベースのアッセイを使用して測定した。手短に述べると、400μgの全細胞可溶化物、50mMのHEPES(pH8.0)、0.5mMのL−セリン、0.05mMのパルミトイルCoA、20μMのピリドキサール−5’−リン酸、0.2%のショ糖モノラウレート(sucrose monolaureate)(全てSigma)および0.1μCiのL−[U−14C]セリン(Amersham)を混合し、37℃でインキュベートした。対照反応において、SPT活性はミリオシン(40μM、Sigma)の添加によって特異的に阻害された。60分後に反応を終了し、Rileyら1999の方法に従って脂質を抽出した(以下を参照されたい。)。
全脂質をRileyら1999の方法に従って細胞または血漿から抽出した。酸加水分解については、乾燥脂質を200μlのメタノールHCl(メタノール中に1N HCl/10M水を入れたもの)に再懸濁させ、12−15時間65℃で保った。この溶液を40μlのKOH(5M)を添加して中和し、続いて以下のように実施した塩基加水分解にかけた。0.5mlの抽出緩衝液(メタノール中に0.125M KOHを入れたもの4容量+クロロホルム1容量)をこの溶液に加えた。続いて、0.5mlのクロロホルム、0.5mlのアルカリ水および100μlの2Mアンモニアをこの順番で加えた。液相を遠心分離(12.000g、5分)で分離させた。上相を吸引し、下相をアルカリ水で2回洗浄した。最後に、脂質をN2下でクロロホルム相の蒸発によって乾燥させ、液体クロマトグラフィー質量分析(LC−MS)解析にかけた。
両側の対のないスチューデントのt検定を使用して統計解析を行った。エラーバー(標準偏差)およびP値(スチューデントのt検定)を3回の独立した実験に基づいて計算した。
Claims (10)
- 感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたは前記疾患に罹患している対象の特定を補助する方法であって、配列番号2における位置1333、1263及び1698のうちの少なくとも1つの位置における、SPTLC2遺伝子の少なくとも1つの核酸変異体の存在を検出することを含み、前記少なくとも1つの核酸変異体の存在により、対象が感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているかまたは前記疾患に罹患しているかが特定される、方法。
- 核酸変異体が、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、欠損および/または挿入である、請求項1に記載の方法。
- 感覚性ニューロパチー疾患が、HSAN1型、HSAN2型、HSAN3型、HSAN4型およびHSAN5型からなる群から選択される遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー疾患である、請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも1つの他の遺伝子における核酸変異体の有無を検出することをさらに含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 他の遺伝子が、SPTLC1、RAB7A、WNK1/HSN2、IKBKAP、FAM134B、NTRK1、NGFβおよびCCT5からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 核酸変異体の存在の検出が、以下の方法:突然変異スキャンニングのための、ハイブリダイゼーション、シークエンシング、PCR、プライマー伸長法、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅(MLPA)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)、制限酵素部位解析または高解像度融解曲線(HRM)解析の少なくとも1つによって行われる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 感覚性ニューロパチー疾患の危険性を有しているまたは前記疾患に罹患している対象を特定するためのキットであって、
(a)配列番号2における位置1333、1263及び1698のうちの少なくとも1つの位置における、SPTLC2遺伝子の1つまたは複数の核酸変異体の有無を検出するための手段、および
(b)ステップ(a)の手段で検出された核酸変異体から、対象が感覚性ニューロパチー疾患に関連する兆候の危険性を有しているかまたは前記兆候を有しているかを決定するための手段
を含むキット。 - ステップ(a)の手段が、標的SPTLC2核酸の検出に適した少なくとも1つのオリゴヌクレオチドおよび/または標的SPTLC2核酸の増幅に適した少なくとも1つのオリゴヌクレオチド対である、請求項7に記載のキット。
- SPTLC2核酸における1つまたは複数の核酸変異体の存在を検出するための、15から30ヌクレオチドからなる単離オリゴヌクレオチドまたはこの相補鎖であって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号2の位置1333、1263又は1698における置換を含む配列に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド又はその相補鎖。
- 位置1333、1263又は1698を含む配列番号2の配列に特異的にハイブリダイズする15から30ヌクレオチドからなる単離オリゴヌクレオチド。
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