JP5983222B2 - 細胞培養方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、過酸化水素による殺菌を利用した細胞培養方法及び装置に関する。

人体の様々な部位の組織、細胞、受精卵等を用いて細胞培養を行い、再生医療に使用することが実用化されつつある。この細胞培養は、培養中に細胞等が細菌等に汚染されないようにすることが重要である。そのため、細胞培養前に作業雰囲気を無菌状態にするために殺菌処理が行われる。

殺菌処理には一般に殺菌剤が用いられ、オゾンガス（例えば、特許文献１参照。）、過酸化水素（例えば、特許文献３、４参照。）等の使用が提案されている。また、殺菌剤ではないが、加熱した水蒸気を殺菌に使用することも提案されている（例えば、特許文献２参照。）。

国際公開第２００４／０１１５９３号 特開２００６−１１５７９８号公報 特開２００６−６８１２２号公報 国際公開第２０１２／０４３６８２号

細胞培養するに際しては確実な無菌雰囲気を確保しなければならない。さらに再生医療の普及のためには培養の生産性も高めなければならない。

しかるに、無菌化の手法としてオゾンガス等の殺菌性ガスを用いる殺菌方法は、無菌雰囲気中にガスが残留して培養細胞をも死滅させる危険性がある。

また、水蒸気による加熱殺菌は、殺菌処理に長時間を要し、殺菌も不確実になりやすいという問題がある。

過酸化水素を使用する場合は無菌性の確保について信頼性が高いが、従来の過酸化水素水の噴霧方法は、過酸化水素水を気化させるために加熱板に滴下したり、超音波振動装置により気化したりするものであって、短時間に大量の気化が困難であるため殺菌処理に長時間を要し、ひいては細胞培養の生産性に劣るという欠点がある。

本発明は上記問題点を解決し、細胞培養のための確実な無菌性確保と高い生産性得ることを課題としている。

上記課題を解決するため、本発明は次のような構成を採用する。

すなわち、請求項１に係る発明は、過酸化水素水と圧縮エアとを気化室（１６ｃ）内にスプレーし、スプレーされた過酸化水素水を気化室（１６ｃ）に配置された加熱手段（１６ａ）によって沸点以上に加熱して完全に気化させた後、これを細胞の培養操作を行う操作部（３）、細胞の培養を行う培養部（４ａ，４ｂ）、並びに材料及び器具を出し入れするための入出庫部（２）の少なくとも三者に噴霧すると共に、上記気化した過酸化水素水に向かって１２０℃以上の無菌の加熱エアを吐出し殺菌した後に細胞培養を開始する細胞培養方法を採用する。

請求項２に記載されるように、請求項１記載の細胞培養方法において、過酸化水素水と圧縮エアとを二流体スプレーノズル（１５）によって気化室（１６ｃ）内にスプレーして気化させ、この気化させたものを吐出ノズル（１６ｂ）から吐出させて上記三者に噴霧することも可能である。

請求項３に記載されるように、請求項１又は２に記載の細胞培養方法において、上記操作部（３）、培養部（４ａ，４ｂ）及び入出庫部（２）の各々に過酸化水素水を噴霧した後、常温以上の無菌エアを吹き込むことで余剰の過酸化水素水を気化させることも可能である。

請求項４に係る発明は、細胞の培養操作を行う操作部（３）、細胞の培養を行う培養部（４ａ，４ｂ）、並びに材料及び器具を出し入れするための入出庫部（２）の少なくとも三者を備え、入出庫部（２）と操作部（３）との間及び操作部（３）と培養部（４ａ，４ｂ）との間が各々開閉可能な密閉扉（９，２３ａ，２３ｂ）で隔絶された細胞培養装置において、過酸化水素水と圧縮空気とを気化室（１６ｃ）内にスプレーし、スプレーされた過酸化水素水を気化室（１６ｃ）に配置された加熱手段（１６ａ）によって沸点以上に加熱して完全に気化させた後、これを上記三者に噴霧し殺菌する噴霧器（１３）が設けられ、熱風供給部が設けられ、この熱風供給部からの１２０℃以上の無菌の加熱エアを、上記噴霧器から吐出される過酸化水素水のガスに向けて吐出する補助ノズルを備える細胞培養装置を採用する。

請求項５に記載されるように、請求項４に記載の細胞培養装置において、上記噴霧器（１３）が、過酸化水素水と圧縮空気とをスプレーする二流体スプレーノズル（１５）と、二流体スプレーノズル（１５）でスプレーされたものを気化させる気化室（１６ｃ）と、気化室（１６ｃ）から気化されたものを吐出する吐出ノズル（１６ｂ）とを具備したものとすることも可能である。

本発明によれば、過酸化水素水と圧縮エアとを気化室（１６ｃ）内にスプレーし、スプレーされた過酸化水素水を気化室（１６ｃ）に配置された加熱手段（１６ａ）によって沸点以上に加熱して完全に気化させた後、これを細胞の培養操作を行う操作部（３）、細胞の培養を行う培養部（４ａ，４ｂ）、及び材料及び器具を出し入れするための入出庫部（２）の少なくとも三者に噴霧し殺菌した後に細胞培養を開始する細胞培方法であるから、細胞培養に際して、細菌等による汚染を確実に防止することができ、しかも殺菌を短時間で行うことができる。従って、細胞培養の生産性が向上する。

また、本発明において過酸化水素水と圧縮エアとを二流体スプレーノズル（１５）によって気化室（１６ｃ）内にスプレーして気化させ、この気化させたものを吐出ノズル（１６ｂ）から吐出させ、この吐出させたものを上記三者に噴霧するようにした場合は、簡便に大量の過酸化水素水を気化することができるため、殺菌時間を短縮することができる。

また、本発明において、気化した過酸化水素水を熱風と混合して上記操作部（３）、培養部（４ａ，４ｂ）及び入出庫部（２）の各々に送って噴霧するようにした場合は、過酸化水素水の噴霧を細胞培養装置の細部まで行き渡らせて隅々まで確実に殺菌することができる。

また、本発明において、操作部（３）、培養部（４ａ，４ｂ）及び入出庫部（２）の各々に過酸化水素水を噴霧した後、常温以上の無菌エアを吹き込むことで余剰の過酸化水素水を気化させるようにした場合は、細胞培養装置内にわずかに残存する過酸化水素水をも完全に消滅させることができる。

本発明に係る細胞培養装置の概略図である。 過酸化水素水の噴霧器である。

以下、本発明を実施するための細胞培養方法及び装置について説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。

図１に示すように、本発明に係る細胞培養装置は、その外殻１内に入出庫部２と、操作部３と、培養部４ａ，４ｂとを具備する。

入出庫部２と操作部３との間、操作部３と培養部４ａ，４ｂとの間は、各々隔壁５，６によって仕切られている。また、培養部４ａ，４ｂは、隔壁７によって複数個に仕切られている。

入出庫部２は、細胞培養に必要な細胞、組織等の検体、培地、トリプトシン、トリプシンインヒビター、バッファ、生理的食塩水等の薬品、シャーレ、ピペット、遠心管等の器材の搬入を行ったり、培養した細胞、廃棄薬品、器材等の搬出を行ったりするための部屋である。

入出庫部２の外殻１と隔壁５には、各々密閉扉８，９が設けられる。外殻１の密閉扉８により入出庫部２は外部と隔離され、隔壁５の密閉扉９により入出庫部２は操作部３と隔離される。密閉扉８，９は各々開閉自在である。

また、入出庫部２の外殻１には、ファン１０と、ファン１０からのエアの導入用及び排気用のＨＥＰＡフィルタ１１，１２と、過酸化水素水の噴霧器１３とが取り付けられる。

ファン１０は入出庫部２内にエアを圧送するためのもので、このエアはＨＥＰＡフィルタ１１により除菌され無菌化された後、入出庫部２内に流入し、その一部がＨＥＰＡフィルタ１２から入出庫部２外に排出される。これにより、入出庫部２内が無菌エアにより陽圧化される。

また、無菌エアの加熱手段である電熱器１４がＨＥＰＡフィルタ１１の下流側に設けられる。ＨＥＰＡフィルタ１１を通った無菌エアは、必要に応じて電熱器１４によって加熱されたうえで、無菌の熱風として入出庫部２内に供給される。例えば、噴霧器１３から過酸化水素水の噴霧が入出庫部２内に吹き込まれた後、上記無菌の熱風が入出庫部２内に吹き込まれるようにすれば、入出庫部２内の余剰の過酸化水素水が速やかに気化され、入出庫部２外へ確実に排出されることになる。無菌エアを加熱する場合は、望ましくは１２０℃以下の温度とされる。

噴霧器１３は、図２に示すように、殺菌剤である過酸化水素の水溶液を霧滴状にして供給する二流体スプレーノズルである過酸化水素水供給部１５と、この過酸化水素水供給部１５から供給された過酸化水素水の霧滴をその沸点以上の非分解温度以下に加熱して気化させる気化部１６とを備える。

過酸化水素水供給部１５は、過酸化水素水供給路１５ａ及び圧縮空気供給路１５ｂからそれぞれ過酸化水素の水溶液と圧縮空気を導入して過酸化水素の水溶液を気化部１６内に噴霧するようになっている。

気化部１６は内外壁間にヒータ１６ａを挟み込んだパイプであり、このパイプ内の気化室１６ｃに吹き込まれた過酸化水素水の霧滴を加熱し気化させる。気化した過酸化水素水のガスは吐出ノズル１６ｂから気化部１６外に凝結ミストＭとなって噴出する。ヒータ１６ａは、この実施の形態ではバンドヒータであるが、誘導加熱器等他の加熱手段で代替することも可能である。

なお、過酸化水素水供給部１５に送られる過酸化水素水は、１０〜６０重量％、望ましくは３０〜４０重量％の過酸化水素を含んだ水溶液であり、必要に応じて安定剤等を含んだものが用いられる。

過酸化水素水は図１に示すタンク１７に溜められ、ここから過酸化水素水供給部１５である二流体スプレーノズルに供給される。図示しないコンプレッサから過酸化水素水供給部１５に送られる圧縮エアは０．２〜０．４ＭＰａの圧力が望ましく、ＨＥＰＡフィルタ１８を経て過酸化水素水供給部１５に供給される。また、気化部１６内の温度は１２０℃〜１６０℃に保持される。

この噴霧器１３内で生成された過酸化水素水のガスは、吐出ノズル１６ｂから過酸化水素水のミストＭとなって入出庫部２内に流入し、入出庫部２の外殻１の内面、隔壁５その他に斑なく万遍に接触して殺菌する。

また、図１に示すように、噴霧器１３の吐出ノズル１６ｂの近傍には無菌の加熱エアを過酸化水素水のミストＭに向かって吐出する補助ノズル１９が必要に応じて設けられる。この加熱エアは、ファン２０からの送風をフィルタ２１により除菌し、電熱器２２により加熱することにより得ることができる。この加熱エアが補助ノズル１９から噴き出すと、吐出ノズル１６ｂから吐出される過酸化水素水のミストＭと混じり合い、これにより過酸化水素水のミストＭは加速されて入出庫部２内の隅々まで行き渡る。補助ノズル１９から噴き出す加熱エアは１２０℃以上であるのが望ましい。

操作部３は、培養部４ａ，４ｂから培養後のシャーレを取り出したり、培地交換や細胞をシャーレから剥離して複数の別なシャーレに分配して増殖させる継代培養操作等を行ったりするための部屋である。これらの操作はグローブ（図示せず）により手作業で外部から行われ、或いは操作部３内に設置されたロボット（図示せず）により行われる。

操作部３には、上記入出庫部２の場合と同様に、ファン１０、エアの導入用及び排出用のＨＥＰＡフィルタ１１，１２、電熱器１４、過酸化水素水の噴霧器１３、補助ノズル１９等が設けられる。

また、培養部４ａ，４ｂとの間の隔壁６には、密閉扉２３ａ，２３ｂが設けられる。

上記入出庫部２の場合と同様に、操作部３に過酸化水素水のミストＭが吹き込まれて操作部３内が殺菌され、その後無菌エアが吹き込まれて陽圧化される。

培養部４ａ，４ｂは、検体、細胞等を培養するための部屋である。図１では二室として記載されるが、適宜増減可能である。複数に区画された場合は、異なる検体を同時に培養することが可能である。

培養部４ａ，４ｂの外殻１には、ＨＥＰＡフィルタ２４ａ、２４ｂが設けられている。

なお、培養部４ａ，４ｂの殺菌は、後述するように操作部３内の殺菌と同時に行われる。

次に、上記細胞培養装置の作用について説明する。

上記入出庫部２内に搬入される薬品、器材等はフィルム等により包装、密封され、ガンマ線殺菌等により無菌状態とされている。また、検体は無菌状態で密封されている。

これらが開放された密閉扉８から入出庫部２内に搬入され、密閉扉８が閉じられた後、過酸化水素水の噴霧器１３により気化された過酸化水素水のミストＭが入出庫部２内に噴霧される。このとき補助ノズル１９から無菌の加熱エアが吹き出し、噴霧器１３の吐出ノズル１６ｂから吹き出す過酸化水素水のミストＭと混じり合ってミストＭを加速させる。これにより、ミストＭは入出庫部２内の隅々まで速やかに行き渡る。

過酸化水素水のミストＭが一定時間噴霧された後、ファン１０からＨＥＰＡフィルタ１１を通して送られる無菌エアが入出庫部２内に流入し、これにより入出庫部２内が陽圧化される。このとき電熱器１４がＯＮにされ、ＨＥＰＡフィルタ１１を通して送られる無菌エアが電熱器１４によって加熱される。これにより、入出庫部２内に熱風が一定時間吹き込まれることになり、入出庫部２内に僅かに残存する過酸化水素水は速やかに気化され、ＨＥＰＡフィルタ１２から入出庫部２外に排出される。

その後、入出庫部２内で検体、薬品や器材の密封包材が開封され、内容物がむき出しにされる。

一方、操作部３内が、噴霧器１３の吐出ノズル１６ｂから吐出された過酸化水素水のミストＭと補助ノズル１９から吐出された熱風とにより殺菌処理される。そして、ファン１０からＨＥＰＡフィルタ１１を通して送られる無菌エアによって操作部３内が陽圧化される。

その後、入出庫部２と操作部３との間の隔壁５における密閉扉９が開放され、入出庫部２内から操作部３内へと内容物が移される。

操作部３内に搬入された内容物の一種である検体は、必要に応じて遠心分離後、シャーレに培地と共に移される。

その後、密閉扉９が閉じられたうえで、密閉扉８が開放され、密封包材が入出庫部２から外殻１の外へ排出される。さらに、密閉扉８が閉じられた後、入出庫部２内が無菌化され、陽圧化される。

上述したように、操作部３内は過酸化水素水のミストＭにより殺菌され、無菌エアにより陽圧化されているが、操作部３内の殺菌の際に操作部３と培養部４ａ，４ｂとの間の隔壁６の密閉扉２３ａ，２３ｂが開放されることにより、培養部４ａ，４ｂ内も同時に噴霧器１３からの過酸化水素水のミストＭにより殺菌処理される。また、ファン１０から送られ、ＨＥＰＡフィルタ１１を通って無菌化されたエアが一定時間吹き込まれることにより、培養部４ａ，４ｂ内に残存する過酸化水素がＨＥＰＡフィルタ２４ａ，２４ｂから完全に外部に排出される。

上記操作部３内でシャーレに培地と共に移された検体は、グローブ又はロボットにより、密閉扉２３ａ，２３ｂから培養部４ａ，４ｂの所望の部屋に入れられ、培養される。

培養部４ａ，４ｂで培養されたシャーレは、開放された密閉扉２３ａ，２３ｂから操作部３内に取り出される。そして、操作部４内で培地交換や細胞をシャーレから剥離して複数の別のシャーレに分配して増殖させる継代培養操作等が行われる。これらの操作はグローブにより手作業で外部から行うことが可能であるが、操作部内に設置されたロボットの操作により行うことも可能である。

操作部３では異なる検体を操作するごとに上記無菌化処理が行われる。また、培養部４ａ，４ｂも検体を変えるたびに無菌化処理が行われる。この処理により交叉汚染が完全に防止される。

培養後の細胞、不必要となった薬品、器材等は入出庫部２の密閉扉８から外部に搬出される。

その他、入出庫部２、操作部３、培養部４ａ，４ｂの各部は無菌化処理後の無菌性を維持するためにファン１０により送風され、ＨＥＰＡフィルタ１１を通過して無菌化されたエアにより陽圧化されるが、この陽圧化を保持するための送風時は望ましくは電熱器１４はＯＦＦにされる。また、入出庫部２、操作部３、培養部４ａ，４ｂの各部内はＨＥＰＡフィルタ１１，１２により外部と隔絶された状態で無菌性が維持される。また、入出庫部２、操作部３、培養部４ａ，４ｂの各部内に噴霧された余剰の過酸化水素はＨＥＰＡフィルタ１２，２４ａ，２４ｂを通じて外部に排出されるが、この排出される過酸化水素は触媒を通過させて分解するのが望ましい。

本発明は以上説明したように構成されるが、上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々変更可能である。

２…入出庫部
３…操作部
４ａ，４ｂ…培養部
９，２３ａ，２３ｂ…密閉扉
１３…噴霧器
１５…二流体スプレーノズル
１６ａ…ヒータ
１６ｂ…吐出ノズル
１６ｃ…気化室
１９…補助ノズル

Claims (5)

1. 過酸化水素水と圧縮エアとを気化室内にスプレーし、スプレーされた過酸化水素水を気化室に配置された加熱手段によって沸点以上に加熱して完全に気化させた後、これを細胞の培養操作を行う操作部、細胞の培養を行う培養部、並びに材料及び器具を出し入れするための入出庫部の少なくとも三者に噴霧すると共に、上記気化した過酸化水素水に向かって１２０℃以上の無菌の加熱エアを吐出し殺菌した後に細胞培養を開始することを特徴とする細胞培養方法。
2. 請求項１記載の細胞培養方法において、過酸化水素水と圧縮エアとを二流体スプレーノズルによって気化室内にスプレーして気化させ、この気化させたものを吐出ノズルから吐出させて上記三者に噴霧することを特徴とする細胞培養方法。
3. 請求項１又は２に記載の細胞培養方法において、上記操作部、培養部及び入出庫部の各々に過酸化水素水を噴霧した後、常温以上の無菌エアを吹き込むことで余剰の過酸化水素水を気化させることを特徴とする細胞培養方法。
4. 細胞の培養操作を行う操作部、細胞の培養を行う培養部、並びに材料及び器具を出し入れするための入出庫部の少なくとも三者を備え、入出庫部と操作部との間及び操作部と培養部との間が各々開閉可能な密閉扉で隔絶された細胞培養装置において、過酸化水素水と圧縮空気とを気化室内にスプレーし、スプレーされた過酸化水素水を気化室に配置された加熱手段によって沸点以上に加熱して完全に気化させた後、これを上記三者に噴霧し殺菌する噴霧器が設けられ、熱風供給部が設けられ、この熱風供給部からの１２０℃以上の無菌の加熱エアを、上記噴霧器から吐出される過酸化水素水のガスに向けて吐出する補助ノズルを備えることを特徴とする細胞培養装置。
5. 請求項４に記載の細胞培養装置において、上記噴霧器が、過酸化水素水と圧縮空気とをスプレーする二流体スプレーノズルと、二流体スプレーノズルでスプレーされたものを気化させる気化室と、気化室から気化されたものを吐出する吐出ノズルとを具備することを特徴とする細胞培養装置。

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