JP5970824B2 - 光干渉観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、生物試料などの３次元物体観察、微細な凹凸表面形状測定等に用いられる光干渉観察装置に関する。

従来、生物試料などの３次元構造を観察するには、コンフォーカル顕微鏡やＯＣＴ（Optical Coherence Tomography）などが用いられている。コンフォーカル顕微鏡は、高分解能の３次元情報を得ることができるが、３次元的なプローブ走査が必要である。

ＯＣＴは、μｍオーダーの深さ方向の分解能とｍｍオーダーの深さ方向の観察範囲という特長を備えており、細胞の三次元構造を観察する有望な技術である（例えば、非特許文献１参照）。ＯＣＴは干渉の原理を利用し、光軸方向（Ｚ方向）においては高い分解能を得ることができる。これは光源スペクトルの幅で決まる。フーリエドメイン方式のＯＣＴでは、ＸＹ面内をプローブで走査するだけでＺ方向に分解した情報を得ることができる。しかしながら、ＸＹ面内で高い分解能を得ようとすると、対物レンズのＮＡを大きくせざるを得ず、一度のＸＹ面内走査で得られるピントずれが少ないＺ方向の幅は制限される。したがって、所望のＺ方向の領域を観察しようとすると、ＸＹ面内の精密な走査とＺ方向のステップが必要になる。

上記フーリエドメイン方式には、主に、白色光源に分光器を組み合わせたタイプ、波長走査型光源を用いたタイプがある。タイムドメイン方式のＯＣＴでは、ＸＹ面内のプローブ走査に加えて、物体あるいは参照面をＺ方向に機械的に走査する必要がある。フルフィールド型のＯＣＴは、空間的にコヒーレントな平面波で照明し、ＸＹ面内の２次元走査なしに３次元情報を得ることができる。このタイプのＯＣＴにも、物体あるいは参照面を機械的に走査するタイムドメイン方式、波長走査型光源を用いたフーリエドメイン方式が存在する。

D.huang, EA Swanson, cP Lin, JS Schuman, WG Stinson, W Chang, MR Hee, t Flotte, K Gragory, CA Puliafito and et. al, "Optical coherence tomography" Science Vol.254, No.5035, 1178-1181, 1991

ところで、上記のフルフィールド型ＯＣＴにおいてもピントの合致範囲が狭い場合にはＺ方向のステップが必要となる。また、フルフィールド型ＯＣＴでは平面波を照射するため、試料の散乱ポテンシャルの３次元検出帯域が通常のＯＣＴに比べて狭くなってしまう。また、ＯＣＴ全般として、落射照明を用いて試料からの後方散乱光を検出しているので、後方散乱の弱い物体の観察や光軸に略平行な面構造、線構造の検出には不向きであるといった問題があった。

本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、広い検出帯域を有するとともに短時間で観察を行うことができる光干渉観察装置を提供することを目的とする。

本発明の光干渉観察装置は、複数の波長の光を放射する光源と、前記光源からの光を被観察物に少なくとも２方向から照射する照明光学系と、前記照明光学系からの光を参照光と照明光とに分岐する光分岐部材と、前記照明光を被観察物に照射することで発生する前記被観察物の構造情報を含んだ測定光と前記参照光とを干渉させ、前記２方向からの照射で発生するそれぞれの前記測定光と前記参照光とが干渉して生じた第一、第二干渉光を検出する検出部と、前記検出部で検出された前記第一干渉光および前記第二干渉光に基づき画像データを生成する画像データ処理部とを備え、前記被観察物の構造を観察することを特徴とする。

また、上記光干渉観察装置においては、前記画像データ処理部は、前記第一干渉光に基づき第一画像データを生成すると共に、前記第二干渉光に基づき第二画像データを生成し、
前記第一及び第二画像データを前記光源の光の波数毎に所定の変換処理を行うことで前記被観察物の構造情報としての物体散乱ポテンシャル情報を生成して前記被観察物の画像データを生成するのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記光源は、前記被観察物に照射される光の波長を走査する波長走査型光源であるのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記照明光学系は、レーザー光源と前記レーザー光源の光を複数に分割するビームスプリッターと前記分割された光を前記被観察部に導く複数の光ファイバーとから構成されているのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記画像データ処理部は、前記第一及び前記第二画像データを前記波数の関数としてフーリエ変換処理するステップと、前記波数ごとの複素振幅分布を算出するステップと、前記複素振幅分布に関して２次元フーリエ変換処理して前記複素振幅分布のスペクトルを求めるステップと、求められた前記複素振幅分布のスペクトルに基づき物体散乱ポテンシャルの３次元スペクトルを求めて合成するステップと、合成した散乱ポテンシャルの３次元スペクトルを３次元逆フーリエ変換処理して前記被観察物の散乱ポテンシャルを求めるステップとから成るのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記照明光学系は、少なくとも２つの方向から前記被観察物を照明するための第一照明部と第二照明部とを備え、前記第一照明部と前記第二照明部とは前記被観察物に対して少なくとも２方向から照明するのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記照明光学系の第一照明部および第二照明部は、該照明光学系の光軸に対して所定の角度をなす前記照明光を射出可能な光学ユニットを有するのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記照明光学系は、落斜照明光学系又は透過照明光学系の少なくとも一方を含むのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記照明光学系は、落斜照明光学系および透過照明光学系を組み合わせることで構成されているのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記光学ユニットは、前記所定の角度の前記照明光を射出する光射出部を複数有するのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記照明光学系は、前記複数の光射出部から前記被観察物に対して前記照明光を異なる方向から同時に射出させるのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記照明光学系は、前記複数の光射出部から前記被観察物に対して前記照明光を異なる方向から時間順次に射出させるのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記複数の光射出部は所定の光路長差を有し、前記複数の光射出部における光路長差を較正する光路長較正部を備えるのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記光路長較正部は、較正用部材の特徴点による干渉光を用いて被観察物位置の座標と画像検出器上の座標関係も較正するのが好ましい。

また、上記光干渉観察装置においては、前記光学ユニットは、照明光を異なる方向に反射させる走査ミラーを含み、前記走査ミラーは、前記照明光のスポットがリング上を移動するように前記照明光を反射させ、前記光源は、前記リング上を移動するスポット位置ごとに所定の波長走査を行うのが好ましい。

本発明によれば、機械的な走査なしに、広い検出帯域を有するとともに短時間で観察を行うことができる。

第１実施形態に係る観察装置の概略構成を示す図。 光源の構成を示した図。 光ファイバー１０２から照射される照明光で得られる帯域を示す図。 光ファイバー１０３から照射される照明光で得られる帯域を示す図。 光ファイバー１０４から照射される照明光で得られる帯域を示す図。 光ファイバー１０５から照射される照明光で得られる帯域を示す図。 光ファイバー１０６から照射される照明光で得られる帯域を示す図。 合成によって得られる帯域を示す図。 偏光ビームスプリッターに代えてビームスプリッターを備え、１／４波長板に代えて偏光板を備えた観察装置に係る構成を示す図。 第２実施形態に係る観察装置が備える波長走査型レーザーの概略構成を示す図。 第２実施形態において測定光と参照光との干渉強度を示す図。 図８に示した信号をフーリエ変換したスペクトルを示す図。 第１および第２実施形態の観察装置の変形例に係る構成を示す図。 第３実施形態により付加される透過照明系の構成を示す図。 透過照明による３次元検出帯域を示す図。 落射照明と透過照明とを組み合わせた３次元検出帯域を示す図。 本実施形態における効果を説明するための図。 第４実施形態に係る観察装置の構成を示す図。 光路長差の較正方法を説明するための図。 複数の点光源を形成する別の構成を示す図。

以下、本発明の光干渉観察装置に係る実施形態として３次元観察装置に適用した構成について図面を参照しながら説明する。

（第１実施形態）
本実施形態に係る観察装置は、波長走査型の光源からの射出光を分岐して複数の照明光と参照光を生成し、照明光で試料を照明し、試料からの後方散乱光（測定光）を参照光との干渉によって検出するフルフィールド型のＯＣＴから構成されるものである。また、本実施形態では、波長走査型光源を用いたフーリエドメイン方式のＯＣＴについて説明する。

図１は第１実施形態に係る観察装置の概略構成を示す図である。図２（ａ）は光源の構成を示した図であり、図２（ｂ）は各照明光を照射する光ファイバーの位置関係を示す図である。
図１において、光軸方向をＺ方向とし、光軸に垂直で紙面に垂直な方向をＸ方向、紙面内の方向をＹ方向とする。

図１、２に示されるように、本実施形態に係る観察装置１００は、光源（照明光学系）５０のレーザー光源部５１の光を複数のビームスプリッター（分岐手段）５２ａ〜５２ｆで分割し、光ファイバー（光出射部）１０１〜１０６を用いて参照光及び照明光を生成するようになっている。

レーザー光源部５１の波長走査の条件の一例としては、例えば試料１３として光散乱性の強い生体試料を用いた場合、中心波長８００ｎｍ、走査幅１００ｎｍに設定される。なお、生体試料であっても、散乱が弱い場合は中心波長を近赤外域とする必要は無く、上記波長走査条件は限定されるものではない。

具体的にビームスプリッター５２ａは、レーザー光源部５１に最も近い位置に配置されており、レーザー光源部５１から照射された光の一部を透過させることで光ファイバー１０１〜１０３に導くとともに、レーザー光源部５１から照射された光の一部を反射させることで光ファイバー１０４〜１０６に導くようになっている。

ビームスプリッター５２ｂは、ビームスプリッター５２ａを透過した光の一部を反射させてレンズ５３を介して光ファイバー１０１に導くとともに、それ以外の光を透過させるようになっている。このような構成に基づき、光ファイバー１０１は、参照光を照射する点光源を構成している。

ビームスプリッター５２ｃは、ビームスプリッター５２ｂを透過した光の一部を反射させることで、レンズ５３を介して光ファイバー１０２に導くとともに、ビームスプリッター５２ｂを透過した光の一部を透過させることでレンズ５３を介して光ファイバー１０３に導くようになっている。

ビームスプリッター５２ｄは、ビームスプリッター５２ａで反射されたレーザー光源部５１からの照射光の一部を透過又は反射させ、ビームスプリッター５２ｆ、５２ｅに向かう照射光に分割する。

ビームスプリッター５２ｅはビームスプリッター５２ｄで反射された光を透過及び反射させることで、レンズ５３を介して透過光を光ファイバー１０４に導き、レンズ５３を介して反射光を光ファイバー１０５に導くようになっている。

ビームスプリッター５２ｆはビームスプリッター５２ｄを透過した光を反射させることで光ファイバー１０６へと導くようになっている。なお、光ファイバー１０２〜１０６は、各々が照明光を照射する点光源を構成している。

本実施形態に係る光源５０は、図２（ａ）に示すようにレーザー光源部５１及び光ファイバー１０１間における光路長と、レーザー光源部５１及び光ファイバー１０２〜１０６間における光路長とが異なっており、レーザー光源部５１及び光ファイバー１０１間における光路長の方が短く設定され、レーザー光源部５１及び光ファイバー１０２〜１０６間における光路長はそれぞれ同じ値に設定されている。ここで、光ファイバー１０１〜１０６は等しい長さのものを用いている。また、光ファイバー１０２〜１０６は、図２（ｂ）に示すように、それぞれの照明光が後述のように試料１３に対して所定の異なる方向から所定の角度で照射される位置に設けられている。

図１に示したように、光ファイバー１０１から照射された参照光用の光束は、コリメートレンズ１で光軸に平行な平面波に変換されるようになっている。また、光ファイバー１０２〜１０６から照射された照明光用の光束の各々はコリメートレンズ２で、それぞれ光軸に対して所定の角度、方位をもつ平面波に変換されるようになっている。

また、光源５０は、光ファイバー１０１を介してＰ偏光の直線偏光からなる参照光を照射し、光ファイバー１０２〜１０６を介してＳ偏光の直線偏光からなる照明光を照射するように構成されている。これにより、光ファイバー１０１から照射された参照光（Ｐ偏光）は偏光ビームスプリッター３を透過し、光ファイバー１０２〜１０６から照射された照明光の各々（Ｓ偏光）は偏光ビームスプリッター３で反射されるようになっている。

また、光ファイバー１０１から照射された参照光は偏光ビームスプリッター４を透過し、１／４波長板５、対物光学系６を経て参照ミラー７に入射するようになっている。対物光学系６は第１対物レンズ６ａおよび第２対物レンズ６ｂから構成されるものである。

参照ミラー７で反射された光は参照光として、対物光学系６、１／４波長板５を経て偏光ビームスプリッター４に入射するようになっている。そして、参照光は１／４波長板５を２回通過して偏光面が９０°回転しているので偏光ビームスプリッター４で反射されるようになっている。

偏光ビームスプリッター４で反射した参照光はリレー光学系８、偏光板９を経て２次元画像検出器（光検出部）１０に入射する。２次元画像検出器１０は、例えばＣＣＤ等から構成されるものである。リレー光学系８は第１リレーレンズ８ａおよび第２リレーレンズ８ｂから構成される。

一方、偏光ビームスプリッター４で反射された各照明光は、１／４波長板１１、対物光学系１２を経て試料１３に入射するようになっている。対物光学系（観察光学系）１２は第１対物レンズ１２ａおよび第２対物レンズ１２ｂから構成される。

試料１３からの後方散乱光は測定光となって光路をもどり、偏光ビームスプリッター４を透過して２次元画像検出器１０へと入射する。ここで、測定光と参照光とは偏光板９を通ることで干渉する。すなわち、偏光板９は、参照光及び測定光を合成する合成手段を構成している。これにより、２次元画像検出器１０には干渉画像が検出されることとなる。なお、全ての照明光の光路長差は既知とされているが、観察装置１００は後述のように光路長差を検出し、該光路長差を較正するようにしている。

本実施形態に係る観察装置１００は、光源５０が不図示のシャッター機構で光ファイバー１０２〜１０６を介して照射される５つの照明光を切り換え、各々を別々に試料１３に照射可能となっている。
このような構成に基づき、観察装置１００は、各測定光及び参照光における干渉画像を２次元画像検出器１０が検出し、該２次元画像検出器１０に接続された画像処理部４０が試料１３におけるデータ（干渉強度データ）を取得することができる。画像処理部４０は取得したデータに基づいて後述のように試料１３の散乱ポテンシャルを算出し、散乱ポテンシャルのデータに基づき試料１３の画像を生成し、不図示の表示部に表示させるようになっている。

続いて、本実施形態における画像処理部４０によるデータの取得手順について具体的に説明する。
まず、観察装置１００は、光源５０の不図示のシャッターを制御し、光ファイバー１０２から照明光を射出させ、他の光ファイバー１０３〜１０６からの照明光を遮断する。そして、観察装置１００は、この状態で波長走査データのセットを２次元画像検出器１０によって取得する。

続いて、観察装置１００は、光源５０のシャッターの開閉を順次制御することでファイバーを光ファイバー１０３から光ファイバー１０６へと切り換えつつ、波長走査データのセットを２次元画像検出器１０によって取得する。

ここで、各々の照明光でレーザー光源部５１が波長走査してえられた画像データのセットをＤ_ｍ（ｘ、ｙ、ｋ）とする。なお、ｘ、ｙとは２次元画像検出器１０上の座標から倍率関係で変換した物体（試料１３）上の横座標を表すものである。また、ｋとは波長走査で変化する光の波数を表すものである。ｍとは光ファイバー１０２〜１０６から照射される各照明光を表し、本実施例ではｍ＝０〜４により表される。

続いて、画像処理部４０によるデータ解析方法及び作用について説明する。
まず、座標（ｘ、ｙ）ごとに、Ｄ_ｍを波数ｋでフーリエ変換し、所定のバンドパスフィルターを施して信号成分を抽出し、ＤＣ成分、共役成分を除去する。さらに、逆フーリエ変換を施すことによって複素振幅分布Ｕ_ｍ（ｘ、ｙ、ｋ）を算出する。これにより、光波数ごとに分解された複素振幅分布を得ることができる。複素振幅分布Ｕ_ｍ（ｘ、ｙ、ｋ）は、試料の散乱ポテンシャル、照明光の複素振幅分布、瞳関数と式（１）の関係がある。ここで、式（１）中のＷ（ｘ、ｙ、ｚ）は、試料の散乱ポテンシャル（Ｖ（ｘ、ｙ、ｚ））及び照明光の複素振幅分布（Ｑ（ｘ、ｙ、ｚ））の積である。なお、照明光の複素振幅分布Ｑは、Ｑ（ｘ、ｙ、ｚ）＝exp[ik（μ_ｘｘ+μ_ｙｙ+μ_ｚｚ）]で表され、照明光（ｍ＝０〜４）に対応したμ_ｘ、μ_ｙ、μ_ｚが適用される。

続いて、較正等によって既知である照明光間の光路長差の影響を補正する。基準とする照明光（ｍ＝０）に対する光路長差をδ_ｍ（ｍ＝１〜４）とすると、exp（−ikδ_ｍ）を複素振幅分布Ｕ_ｍに乗算する。

続いて、補正を施したＵ_ｍ（ｘ、ｙ、ｋ）をｘ、ｙに関して２次元フーリエ変換を行い、複素振幅分布のスペクトルを求める。複素振幅分布のスペクトルは、物体散乱ポテンシャルの３次元スペクトルと下式（２）のような関係になっている。また、下式（３）のν_ｘ、ν_ｙ、ν_ｚの関係式を満たす。この装置で検出される散乱ポテンシャルは、光学系の瞳内を通過する検出光と照明光の波数ベクトルの差に対応した波数ベクトルをもつことになる。

続いて、光の波数、照明光の波数ベクトルを参照しながら、物体散乱ポテンシャルの３次元スペクトルを合成する。この３次元スペクトルの合成においては、各々の照明条件で得られたスペクトルデータから等間隔格子点上のスペクトルデータを補間によって求める。それらを合成する際に、格子点上に１つのスペクトルデータしかない場合にはそのデータを採用し、複数存在する場合には平均値を採用する。さらに、画像処理部４０は、合成した散乱ポテンシャルの３次元スペクトルを３次元逆フーリエ変換して、物体の散乱ポテンシャルを求める。合成した３次元スペクトルを下式（４）する。そして、下式（５）の演算を行う。

ところで、本実施形態に係る観察装置１００は、光ファイバー１０２〜１０６から照射される照明光の方位、角度に対応した３次元検出帯域内の情報を測定できる。図３は光ファイバー１０２から照射される照明光で得られる３次元検出帯域（物体散乱ポテンシャルの中でこの境界で囲まれた空間周波数領域内の成分が検出される）を示すものである。図３は説明の都合上、左図と右図に分けて2次元的な表現をしている。図３のρ_ｘ、ρ_ｙ、ρ_ｚは、波数ベクトルのｘ、ｙ、ｚ成分を示す。図３の左図は検出される空間周波数領域のρ_ｘ-ρ_ｚ断面図（ρ_ｙ＝0）であり、右図はこの空間周波数領域をρ_ｚの負から正の方向に眺めた矢視図である。よって、図３の３次元検出帯域は、ρ_ｚ軸を回転中心として左図を回転した駒状の領域となる。
同様に、図４は光ファイバー１０３から照射される照明光で得られる３次元検出帯域を示すものであり、図５は光ファイバー１０４から照射される照明光で得られる３次元検出帯域を示すものであり、図６は光ファイバー１０５から照射される照明光で得られる３次元検出帯域を示すものであり、図７は光ファイバー１０６から照射される照明光で得られる３次元検出帯域を示すものである。
図３と同様に、図４〜図７のρ_ｘ、ρ_ｙ、ρ_ｚは、波数ベクトルのｘ、ｙ、ｚ成分を示す。図４および図６の左図はρ_ｘ-ρ_ｚ断面（ρ_ｙ＝0）を、図５および図７の左図はρ_ｙ-ρ_ｚ断面（ρ_ｘ＝0）を示している。右図はこの空間周波数領域をρ_ｚの負から正の方向に眺めた矢視図である。

なお、本実施形態においては、３次元スペクトルの合成において各３次元帯域が重なる部分では平均操作を行ったが、光軸に平行な照明光（ｍ＝０）で得られるスペクトルを優先して使用することも可能である。このような合成によって得られる３次元検出帯域は図８に示されるものとなる。図８の左図は合成された検出帯域のρ_ｘ-ρ_ｚ断面図（ρ_ｙ＝0）を示し、右図は合成された領域をρ_ｚの負から正の方向に眺めた矢視図である。

ところで、照明光の試料１３に対する入射角は、物体（試料１３）の散乱ポテンシャルの着目する周波数成分によって選択可能である。すなわち、照明光の入射角を大きくすれば、検出帯域に隙間が生じるものの、高い周波数成分を得ることができる。

一般に物体散乱ポテンシャルの高周波成分ほど小さく、それに相当する信号光が弱くなる傾向があり、本実施形態では入射角の大きな照明光が高周波成分を検出するようになっている。したがって、入射角の大きな照明光の振幅を大きくすることにより、或いは信号の強度に基づいて、照明光の振幅を調整することにより、ＳＮ比の改善を図ることも可能である。

以上述べたように、本実施形態に係る観察装置１００によれば、試料１３に対して光ファイバー１０２〜１０６から照明光を順次照射し、照明光の各々により上述のような検出帯域が得られるので、単一点光源照明の場合（図３参照）に比べて広い検出帯域での物体（試料１３）の散乱ポテンシャル情報を取得することができる。

なお、上記実施形態では、レーザー光源部５１からの射出光を複数（５つ）に分割して照明光を形成したが、レーザー光路を切り換えて複数の照明光を得るようにしてもよい。この場合、レーザーを参照光用と照明光用の２つに分割し、照明光の光路を切り換えればよい。また、５つに分割して照明光を形成したが、照明用光ファイバー（１０２〜１０６）は、最低限２つ以上の方向から試料を照明すればよく、少なくとも２つ以上の光ファイバーがあればよい。

また、上記実施形態では、偏光ビームスプリッター４と１／４波長板１１、５とを用いて参照光および照明光を分離及び合成する制御を行っているが、偏光ビームスプリッター４及び１／４波長板１１、５を用いない構成も適用可能である。

図９は、偏光ビームスプリッター４に代えてビームスプリッター２０を備え、１／４波長板１１、５に代えて偏光板２１、２２を備えた観察装置１００に係る構成を示す図である。なお、図９に示す構成は、ビームスプリッター２０及び偏光板２１、２２以外の構成については上記実施形態と同様であることから詳細な説明については省略するものとする。
図９に示した構成によれば、上記実施形態に比べて、２次元画像検出器１０に入射する光量が減少するものの、同様に広い検出帯域での散乱ポテンシャル情報を得ることができる。

また、光源５０の波長走査は、光の波数ｋが等間隔になるように走査するのが望ましい。例えば波数ｋの間隔が等間隔から大きくずれてしまう場合、２次元画像データのピクセルごとに、波数ｋで等間隔になるように干渉強度信号に補間操作を施すようにすればよい。

（第２実施形態）
続いて、観察装置の第２実施形態に係る構成について説明する。本実施形態と上記第１実施形態との違いは、波長走査型レーザーの構成及びデータ解析方法の一部であり、それ以外の構成については同一である。そこで、以下の説明では、第１実施形態と同一の部材及び構成については同じ符号を付し、詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

図１０は第２実施形態に係る観察装置が備える光源部１５０の概略構成を示す図である。本実施形態に係る光源部１５０は、第１実施形態と異なり、各照明光の光路長が、所定の異なる光路長になるように設定されている。また、本実施形態では、シャッターによる照明光の切り換えは行わず、異なる光路長差を付与した各照明光を同時に試料に照明しつつ波長走査を行うようになっている。

本実施形態では、光ファイバー１０１から照射される参照光と光ファイバー１０２〜１０６から照射される各照明光との光路差を９ｍｍ、１０．５ｍｍ、１２ｍｍ、１３．５ｍｍ、１５ｍｍに設定している。各光ファイバー１０１〜１０６の長さを等しくし、図１０の様にレンズ５３の配置位置の違いによって、光路長差を調整する。この場合、高い波長走査分解能が必要となる。なお、図１０に示す構成は、ビームスプリッター５２ｃ〜５２ｆとレンズ５３との間隔ｄ１〜ｄ５が順次大きくなるように設定される点において図２に示す図とは異なっている。

図１１は本実施形態において、試料１３で反射された照明光（測定光）と参照光との干渉強度を示す図である。なお、図１１における横軸は、光の波数（単位；ｍｍ^−１）を示し、中心波数を２０００ｍｍ^−１（波長：５００ｎｍ）とした。また、縦軸は干渉強度を示すものである。
図１１は異なる光路長差をもった光の多光束干渉を示し、この信号を波数ｋでフーリエ変換することで図１２に示されるスペクトルが得られる。このように本実施形態においては、多光束干渉の干渉強度をフーリエ変換することで該干渉強度に含まれる試料１３からの反射散乱光成分を上記スペクトルとして抽出する。

図１２はこの信号を波数ｋでフーリエ変換したスペクトルを示すものである。なお、図１２における横軸は変調周波数を示し、縦軸は信号スペクトルを示している。図１２においては、ゼロ周波数近傍の信号はＤＣ成分を示し、低周波の信号は測定光間の干渉成分（異なる照明光による）を示している。

解析に必要な参照光と測定光の干渉成分は比較的高い周波数をもつ５つのピークをもった信号である。そのため、これらの５つの信号成分を個別にバンドパスフィルターで切り出したものは、第１実施形態の解析で得られるものと同じ情報となる。ただし、あらかじめ付与した照明光の光路長差の情報は上述のように既知とされており、その光路長差に対応した補正処理を行うことが前提となる。
具体的には、上述した（数式１）の複素振幅分布Ｕ_ｍ（ｘ、ｙ、ｋ）に対して、較正等によって既知である照明光間の光路長差の影響を補正する。すなわち、基準とする照明光（ｍ＝０）に対する光路長差をδ_ｍ（ｍ＝１〜４）とすると、exp（−ikδ_ｍ）を乗算する。この後のデータ処理については第１実施形態と同様であることから説明を省略する。

なお、例えば参照光の強度を調整することで、この不要な成分（測定光間の干渉成分）を信号成分に対して相対的に低減させるようにしても良い。このように不要な成分を無視することができれば、上述した光路差を０．７５ｍｍ、２．２５ｍｍ、３．７５ｍｍ、５．２５ｍｍ、６．７５ｍｍに設定することができる。これによれば、上述した場合（光路差９ｍｍ、１０．５ｍｍ、１２ｍｍ、１３．５ｍｍ、１５ｍｍの場合）に比べて低い波長走査分解能が許される。

以上述べたように、本実施形態によれば、第１実施形態と異なり、５つの照明光の切り替え操作を行わずに同時に試料１３に対して照射するので、より高速にデータを取得することができる。さらに、後述する照明光の光路長差検出も複数の照明光に対して同時にリアルタイム検出が可能となるため、高精度を得ることができる。

また、上記第２実施形態においては、５つの照明光を同時に照射する場合を例に説明したが、複数の照明光を複数のグループ分け、照明光を照射するグループを順次切り替えるようにしても良い。例えば、５つの照明光の中心に対応する光および周辺の１個に対応する光のグループを４回切り替えて測定しても構わない。また、５つの照明光の中心に対応する光および周辺の２個に対応する光のグループを２回切り替えて測定しても構わない。なお、各グループには５つの照明光の中心部に対応する照明光が常に含まれるようにし、照明光の位相関係を補正する。

続いて、上記実施形態１，２に係る観察装置の変形例について説明する。なお、本変形例は暗視野照明で観察を行う点において上記実施形態と相違しており、それ以外の構成は同一である。図１３（ａ）は本変形例に係る観察装置に係る構成を示す図であり、図１３（ｂ）は各照明光を照射する光ファイバーの位置関係を示す図である。なお、図１３は図９に係る構成について本変形例を適用した構成を示すものである。
図１３（ａ）においても、光軸方向をＺ方向とし、光軸に垂直で紙面に垂直な方向をＸ方向、紙面内の方向をＹ方向とする。

本変形例では、図１３（ａ），（ｂ）に示されるように、光軸に平行な照明光（光ファイバー１０２）を除く光ファイバー１０３〜１０６を介して照明光を照射する。そして、リレー光学系８の物体側ＮＡ（開口数）を対物光学系６、１２の像側ＮＡよりも小さくするようにしている。この状態で、照明光の対物光学系６、１２への入射角が、対物光学系の像側ＮＡ相当よりも小さく、かつ、リレー光学系８の物体側ＮＡ相当よりも大きくなるように設定する（暗視野照明）。このような構成では、図１３に示されるように試料１３がガラス基板（光軸に垂直）Ｇなどの試料室で保持されている場合に、試料室のガラス基板Ｇ平面からの正反射光を除去することができる。

（第３実施形態）
続いて、観察装置の第３実施形態に係る構成について説明する。本実施形態は、第１実施形態に係る構成に対して透過照明を追加した構成となっており、それ以外の構成については同一である。そこで、以下の説明では、第１実施形態と同一の部材及び構成については同じ符号を付し、詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

本実施形態では、光源５０の分割数を４つ増やし、透過照明にも所定の入射角で４方位からの照明を行う構成になっている。図１４は本実施形態により付加した透過照明系の構成を示す図であり、図１４（ａ）は透過照明系の構成を示した図であり、図１４（ｂ）は各透過照明光を照射する光ファイバーの位置関係を示す図である。なお、光学系の屈折率分散の影響を抑えるために、透過照明系についても落射照明系と同じ構成を採用している。図１４（ａ）においても、光軸方向をＺ方向とし、光軸に垂直で紙面に垂直な方向をＸ方向、紙面内の方向をＹ方向とする。

透過照明系９０は、図１４（ａ）に示すように光ファイバー２０２〜２０５を介して照射された照明光の光束の各々はコリメートレンズ２で、それぞれ光軸に対して所定の角度、方位をもつ平面波に変換されるようになっている。本実施形態では、光軸と平行な照明光を除いた４方向から光ファイバー２０２〜２０５を介して照射するようにしている。

透過照明光は、偏光ビームスプリッター１０８を反射し、偏光ビームスプリッター１０９で反射された後、１／４波長板１１０、対物光学系１１１を経て試料１３を透過する。対物光学系１１１は第１対物レンズ１１１ａおよび第２対物レンズ１１１ｂから構成される。試料１３を透過した透過散乱光は、図１に示した対物光学系１２、１／４波長板１１、偏光ビームスプリッター４、リレー光学系８、及び偏光板９を経て、２次元画像検出器１０へと入射する。
ここで、本実施形態に係る透過照明による３次元検出帯域（例えば、光ファイバー２０３から照射される透過照明光によるもの）を図１５に示す。また、本実施形態で得られる落射照明と透過照明とを組み合わせた３次元検出帯域を図１６に示す。図１５および図１６の左図は検出される空間周波数領域のρ_ｘ-ρ_ｚ断面図（ρ_ｙ＝0）であり、右図はこの空間周波数領域をρ_ｚの負から正の方向に眺めた図である。

図１６に示されるように、落射照明だけの帯域（第１実施形態の図８参照）に比べて、さらに帯域を拡大できることがわかる。本実施形態によれば、例えば試料１３として図１７に模式的に示したような立体的な細胞を観察した場合に、細胞膜の上面部１３ａに加えて側面部分１３ｂも検出できるようになる。第１実施形態では、試料１３の後方散乱性が弱いときには検出できないものの、透過照明を付加した本実施形態によれば良好な観察を行うことができる。

（第４実施形態）
続いて、観察装置の第４実施形態に係る構成について説明する。本実施形態は上記第１実施形態に対して照明光学系を変更した構成となっており、それ以外の構成については同一である。そこで、以下の説明では、第１実施形態と同一の部材及び構成については同じ符号を付し、詳細な説明については省略若しくは簡略化するものとする。

第１実施形態では、照明光として固定された複数の点光源を用いたが、本実施形態においては、照明光がリング上を回転する走査型光源から照射されるようになっている。図１８は本実施形態に係る観察装置３００の構成を示す図である。

本実施形態に係る観察装置３００では、光源３５０にてレーザー光源部５１の光が参照光用と照明光用とに分割される。光源３５０は、レーザー光源部５１と、該レーザー光源部５１から照射された光を参照光用と照明光用とに分離するビームスプリッター（不図示）と、分離後の照明光を照射する光ファイバー３０１と、分離後の参照光を照射する光ファイバー３０２と、を含んでいる。

第１実施形態では、照明光用として複数のビームスプリッター５２ａ〜５２ｆにより分離された５つの点光源を用いたが、本実施形態では光ファイバー３０１から照射された照明光はレンズ３０３を介して走査ミラーＭＲで反射される。ここで、走査ミラーＭＲは、集光レンズ３０４の焦点面上にリング状のスポットの軌跡を描くように照明光を反射させるようになっている。そして、集光レンズ３０４を通った光は、コリメートレンズ３０５で光軸に対して所定の角度、方位をもつ平面波に変換されるようになっている。すなわち、本実施形態では、走査ミラーＭＲで照明光を反射させることで複数の光ファイバーを用いることなく、上記実施形態と同様に異なる方向から所定角度で試料１３に入射する複数種類の照明光を生成することができる。
一方、光ファイバー３０２から照射された照明光はコリメートレンズ３０６で光軸に平行な平面波に変換されるようになっている。

このようにして生成された照明光及び参照光は、上記実施形態と同様、干渉画像が２次元画像検出器１０によって検出され、観察装置３００は試料１３におけるデータ（干渉強度データ）を取得することができる。

ここで、リング上の各点ごとに波長走査のデータセットを取得し、データ解析を行う。本実施形態で得られる帯域は、図８に示した中心の帯域を除き、方位をステップ数に応じて増やしたものとなるため、より等方的な検出帯域を得ることができる。なお、リング上を回転する走査型光源を第３実施形態で説明した透過照明系に適用するようにしても構わない。

本実施形態によれば、照明光を走査ミラーＭＲで反射させることでスポットの軌跡がリング上を移動するため、上記実施形態と同様、光ファイバー３０１のみを介して複数の照明光を照射することができる。よって、単一点光源照明の場合に比べて広い検出帯域を有する。

以上述べたように、本発明では、上述した実施形態のように、異なる角度、方位の照明光によって得られる散乱光を検出し、物体散乱ポテンシャルのスペクトルを合成するため、照明光間の位相関係が重要となる。そこで、上記実施形態では複数の照明光の光路長差の較正を行っている。以下、較正方法について説明する。

図１９は光路長差の較正方法を説明するための図である。光路長差を較正する方法としては、後述する３つの方法を例示することができる。なお、図１９は第１実施形態に係る観察装置１００の構成を例に挙げて図示している。

第１としては、画像処理部４０は、例えば光学系の倍率関係があらかじめ既知の場合に、図１９に示される較正用平面ミラー３０を設置して波長走査データを取得することで照明角、方位、照明光間の光路長差を抽出することが可能となる。これにより、画像処理部４０は光路長差を較正することで高精度かつ高精細な観察を行うことができる。

第２としては、例えば光学系（図１における対物光学系６，１２、及びリレー光学系８）の倍率関係が既知で無い場合に、図１９に示される較正用リファレンス３１を設置して波長走査データを取得することで光路長差を抽出することができる。この較正用リファレンス３１は、複数の微小な散乱点を既知の座標に配置したものであり、該較正用リファレンス３１に対して光源５０から照明光を照射することで散乱点からの散乱光と参照光の干渉光に基づいて光学系の倍率、照明角、方位、照明光間の光路長差を抽出することが可能となる。これにより、画像処理部４０は光路長差を較正することで高精度かつ高精細な観察を行うことができる。

第３としては、例えば試料１３を一対のガラス基板Ｇ間に保持する試料ホルダー３３に平面部がある場合には、その平面部を較正用ミラーとして利用するものである。具体的に、平面部３３ａに複数の微小な散乱点を既知の座標に配置した試料ホルダー３３を基準点付きホルダーとして利用し、該平面部３３ａに対して光源５０から照明光を照射することで散乱点からの散乱光と参照光の干渉光に基づいて光学系の倍率、照明角、方位、照明光間の光路長差を抽出することが可能となる。この場合、試料ホルダー３３に試料１３を保持した状態で光路長差を抽出できるので、リアルタイムでの較正が可能となり、試料１３の温度変化などに起因したドリフトの影響を軽減できる。

なお、第２実施形態に示したように複数の角度、方位の照明光を上記試料ホルダー３３（平面部３３ａ）に同時に入射するようにすれば、照明光間の光路長差をリアルタイムに検出、較正できるので、より高精度、高精細な観察を行うことができる。本説明では、画像処理部４０が光路長差を較正する光路長較正部を兼ねた場合について説明したが、光路長較正部を画像処理部４０とは別途に設けるようにしても良いし、観察装置の全体の制御を行う制御部の一部が光路長較正部を構成するようにしても良い。

また、上記実施形態では、生物試料等について３次元観察を行う場合を例に説明したが、本発明は微細な凹凸を含む２次元的な表面形状測定に適用することもできる。このような測定は、５つの照明光を同時に被検面に入射させ、反射光を検出する上記第２実施形態に係る観察装置により実現可能である。なお、光学系のピントは被検面に合わせる。

表面形状測定を行う場合のデータ解析は、第２実施形態と同様、波長走査して得られた画像データセットを、波数ｋでフーリエ変換して、照明角ごとの干渉信号成分をバンドパスフィルターで別々に抽出し、それぞれを逆フーリエ変換する。これにより、照明角ごと、光の波数ごとの複素振幅分布に分解できる。

続いて、求めた複素振幅分布に照明光間の光路長差の補正を施し、複素振幅分布にＸＹの２次元フーリエ変換を施す。また、照明角ごとに付与された波数ベクトル分だけスペクトルをシフトして合成する。さらに、逆フーリエ変換を行い、複素振幅分布を求める。求めた複素振幅分布から位相を算出し、被検面の形状を算出する。これら一連の解析処理によって、光の波数ごとに被検面形状の測定値が算出される（波長走査ポイント数分の被検面形状データが得られる）。なお、スペクトル合成時には必要に応じて平均処理を施すことでより高精度な測定結果を得ることができる。

このように第２実施形態に係る観察装置を２次元的な表面形状測定に適用すれば、照明光の切り換えが不要となるため、高速で測定を行うことができる。このとき、被検面形状の検出帯域は、単一点光源照明の場合に比べて帯域が拡大するので、より微細な構造の定量的な測定が可能になる。また、前述の方法により照明光の光路長差を較正するようにすれば、より高精度な計測を行うことができる。

上記実施形態に係る観察装置のように本発明に係る構成を生物試料等の３次元観察に適用した場合は、波長走査（波長幅）、複数角度の照明によって３次元検出帯域の拡大効果を得ることができる。一方、本発明を２次元的な表面形状計測に適用した場合は、波長走査により、ＤＣ、信号成分、共役成分の分離、位相分布抽出の効果を得ることができ、２次元的な検出帯域の拡大効果は複数角度の照明によって得ることができる。

なお、本発明は上記実施形態或いは変形例に係る構成に限定されることは無く、発明の趣旨を逸脱しない範囲内において適宜変更可能である。例えば、上記実施形態では、波長走査可能な光源５０であればレーザー光を用いる必要は無い。

また、上記実施形態では、光源の光ファイバー１０１（参照光）と光ファイバー１０２〜１０６（照明光）とを別の場所に配置して、偏光ビームスプリッター３を介して分岐していたが、これに限ることは無く、同一箇所に配置ができる。具体的には、例えば図１において、光ファイバー１０１の場所に、光ファイバー１０１の代わりに光ファイバー１０２〜１０６の照明光源を配置し、偏光ビームスプリッター３を外す。そして、参照ミラー７の光軸上の位置を移動して、試料１３と所定の光路長差を設けるようにする。このように図１の構成を変更することで、光源（光ファイバー）を一箇所に配置できる。

このとき、光ファイバー１０２からの射出光を試料１３に向かう照明光と参照ミラーに向かう参照光に分岐するために、ＰＢＳ４に対するＳ偏光、Ｐ偏光の２つの偏光成分を同時に射出するようになっている。例えば、射出光が直線偏光で、その偏光面がＰＢＳのＳ偏光、Ｐ偏光と平行ではない所定の角度を有する状態にする。

光ファイバー１０２が偏波面保存ファイバーの場合は、例えば、偏波面の方位を回転、調整する機構を付与し、照明光と参照光の強度比を調整できるようにしてもよい。

また、上記変形例の参照ミラー７の光軸上の位置を変更しない場合には、光ファイバー１０２に偏波面保存ファイバーを用い、伝搬する２つの偏光成分（直交）に光路長差を付与するような構成とすればよい。

また、上記２つの変形例ではＰＢＳ４等による偏光制御によって参照光と照明光の分岐を行ったが、偏光を用いずに分岐させることも可能である。この場合、ＰＢＳ４をＢＳに置き換え、ＱＷＰ５、１１（両腕）を除いた構成とする。

さらに対物レンズ６（参照腕側）の瞳面上の光ファイバー１０３〜１０６の射出点に相当する位置に、これらファイバーから来る光をカットする遮光部材を配置し、光ファイバー１０２からの光だけが通過するようにする。

また、上記実施形態では、光源５０からの光束の分割、引き回しに光ファイバー１０１〜１０６を用いたが、レンズアレイ等を用いて複数の点光源を形成するような構成にしてもよい。図２０は複数の点光源を形成する別の構成を示す図である。図２０に示されるように、マルチレンズアレイ６０、ビームスプリッター６１、反射ミラー６２を組み合わせることで複数の点光源を形成し、コリメートレンズ６３で光軸に対して所定の角度、方位の照明光を形成することができる。この場合、反射ミラー６２は複数の照明光における光路長がそれぞれ異なるように配置されている。なお、ビームスプリッター６１に代えて、偏光ビームスプリッターおよび１／４波長板の組み合わせを用いるようにしても構わない。

また、上記実施例では、波長走査型の光源を使用していたが、これに限られず、例えば、参照面を走査する方式の光干渉観察装置でも良い。
具体的には、下記の通りである。
参照面走査方式の光干渉観察装置は、光源として、波長幅が広く、空間的にコヒーレントな光源が必要である。例えば、波長幅の広いＳＬＤが望ましい。あるいは、白色光源を一旦レンズで集光してＰＨ（ピンホール）を介して、空間コヒーレントを付与した光源が採用できる。その検出器としては、２次元画像センサー（ＣＣＤ）などである。参照面を光軸方向に等速で走査し、測定光と参照光の干渉強度を検出する。この検出に使用する領域としては、加速−等速−減速の制御で等速部分を使えばよい。また、正弦波状に走査して、等速と見なせる部分を用いることなども可能である。２次元画像センサーのピクセルごとに、「参照面走査距離L」対「干渉強度Ｉ」のデータを得る。２次元画像センサーのピクセルごとに上記データをフーリエ変換し、信号成分をバンドパスフィルタで抽出する（ＤＣ成分、共役成分は不要）。この抽出した成分が上記式（１）に相当する。周波数をｆとすると（ｆはＬだけ走査したときの振動回数）、光の波数ｋとは次式、
ｋ＝２πｆ／２L
の関係がある。
分母が２Lとなっているのは、往復で光路長が２倍変化するためである。このように、よく知られたフーリエ分光の原理で、光の波数ごとに上記式（１）の情報が得られることになる。なお、上記以外は波長走査のときと同じである。

９…偏光板（合成手段）、１２…対物光学系（観察光学系）、３０…較正用平面ミラー、３１…較正用リファレンス、３３…試料ホルダー、４０…画像処理部、５０，３５０…光源（照明光学系）、５２ａ〜５２ｆ…ビームスプリッター（分岐手段）、９０…透過照明系、１０１〜１０６…光ファイバー（光出射部）、２０２〜２０５…光ファイバー（光出射部）、１００，３００…観察装置、３０１，３０２…光ファイバー

Claims (12)

1. 複数の波長の光を放射する光源と、
   前記光源から放射された光を参照光と、
   被観察物を異なる方向から照明する少なくとも２つの照明光とに分岐する照明光学系と、
   前記少なくとも２つの照明光を前記被観察物に照射することで発生する測定光と、前記参照光とが干渉して生じた干渉光を検出する検出部と、
   前記検出部で検出された前記干渉光に基づき、前記被観察物の画像データを生成する画像データ処理部とを備え、
   前記画像データ処理部は、
   前記検出された干渉光に基づいて前記干渉光に関するデータを生成するステップと、
   前記干渉光に関するデータに基づいて、前記光源の光の波数の関数としてフーリエ変換するステップと、
   前記波数毎の複素振幅分布を算出するステップと、
   前記複素振幅分布に関して２次元フーリエ変換処理して、前記複素振幅分布のスペクトルを求めるステップと、
   前記少なくとも２つの照明光の各々に対応して求められた前記複素振幅分布のスペクトルに基づき、前記被観察物の構造情報としての物体散乱ポテンシャルの３次元スペクトルをそれぞれ求めて合成するステップと、
   合成した物体散乱ポテンシャルの３次元スペクトルを３次元逆フーリエ変換処理して前記被観察物の前記物体散乱ポテンシャルを求めるステップと、
   前記被観察物の前記物体散乱ポテンシャルに基づき、前記被観察物の画像データを生成するステップと、を含む、
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
2. 請求項１に記載の光干渉観察装置において、
   前記少なくとも２つの照明光は、前記被観察物に対して同時に射出される
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
3. 請求項１に記載の光干渉観察装置において、
   前記照明光学系は、前記少なくとも２つの照明光は、前記被観察物に対して時間順次に射出される
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
4. 請求項３に記載の光干渉観察装置において、
   前記照明光学系は、前記照明光を異なる方向に反射させる走査ミラーを備え、
   前記走査ミラーは、前記照明光のスポットがリング上を移動するように前記照明光を反射させる
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
5. 請求項１乃至請求項４に記載の光干渉観察装置において、
   前記光源は、前記被観察物に照射される光の波長を走査する波長走査型光源である
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
6. 請求項１乃至請求項４に記載の光干渉観察装置において、
   前記光源は、白色光源である
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
7. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の光干渉観察装置において、
   前記被観察物に対する前記少なくとも２つの照明光の入射角は可変である
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
8. 請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の光干渉観察装置において、
   前記少なくとも２つの照明光は所定の光路長差を有し、
   前記光路長差を較正する光路長較正部を備える
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
9. 請求項８に記載の光干渉観察装置において、
   前記光路長較正部は、較正用部材の特徴点による干渉光を用いて被観察物位置の座標と画像検出器上の座標関係も較正する
   ことを特徴とする光干渉観察装置。
10. 請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の光干渉観察装置において、
    前記照明光学系は、前記光源からの光を前記参照光と前記照明光とに分岐する第１のビームスプリッターと、
    前記照明光を前記少なくとも２つの照明光に分岐する第２のビームスプリッターと、
    前記第１および第２のビームスプリッターにより分岐された光を前記被観察物に導く複数の光ファイバーと、を備える
    ことを特徴とする光干渉観察装置。
11. 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の光干渉観察装置において、
    前記照明光学系は、落斜照明光学系又は透過照明光学系の少なくとも一方を含む
    ことを特徴とする光干渉観察装置。
12. 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の光干渉観察装置において、
    前記照明光学系は、落斜照明光学系および透過照明光学系を含む、
    ことを特徴とする光干渉観察装置。

Images