JP5961556B2 - 複合粒子を含むｍｒｉ造影剤 - Google Patents

Description

本発明は、複合粒子を含むＭＲＩ造影剤に関する。

体内画像診断方法の１つであるＭＲＩ法（磁気共鳴イメージング法）においては、特定の組織をより鮮明に造影するために、造影剤が使用されることが多い。造影剤とは、診断に当たって正常組織と目的組織の画像コントラストを増強するための検査用の医薬品であって、通常、静脈注射で使用される。ＭＲＩ用の造影剤としては、通常、核磁気共鳴に影響を与える磁性物質が用いられており、例えばガドリニウム製剤や鉄製剤が市販されている。

鉄製剤は、ガドリニウム製剤に比べ、生体安全性に優れており、また、低用量で高い造影効果を発揮する、という利点を有している。

しかしながら、従来の鉄製剤は、一般的に、静脈内投与後わずか数分で肝臓の正常組織に取り込まれ、肝腫瘍領域には全く取り込まれない。このため、ＭＲＩ造影剤としては、肝腫瘍の陰性造影にしか用いることができない。一方、血中安定性が高く、肝集積性が低い鉄製剤も臨床開発されている（例えば特許文献１）が、主にマクロファージに貪食されて、リンパ節への集積性が高いことが分かっており、細網内皮系に取り込まれやすいという点では違いはない。このように、従来のガドリニウム製剤や鉄製剤には、生体投与時の体内動態に問題があった。

生体投与時の体内動態を改善した方法としては、例えば、コア無機ナノ粒子の表面に対して、シラン基などを介して、ポリマーを被覆させる方法が提案されている（例えば特許文献２）。

国際公開第２００６／０６８６５３号パンフレット 特表２００９−５１９３１６号公報

しかしながら、これら従来の製剤は、分散安定性が低く、かつマクロファージに貪食されやすいという問題があった。そこで本発明者らは、分散安定性が高く、かつ、マクロファージに貪食されにくく、機能が向上したＭＲＩ造影剤の提供を目的とする。

本発明は、複合粒子を含むＭＲＩ造影剤であって、前記複合粒子が、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子であり、前記微粒子が、超常磁性を示す無機微粒子であり、前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、３０，０００以上である。

リビングラジカル重合により、超高密度で、かつ、分子量の大きいグラフト鎖を結合させた本発明に係る複合粒子は、分散安定性が高く、細網内皮系細胞に貪食されにくいため肝臓や脾臓などの組織に蓄積されにくい。また上述の複合粒子は、ＥＰＲ効果（Enhanced Permeability and Retention Effect）により腫瘍へ蓄積し、さらには緩和度が大きいため、低濃度でも造影効果（コントラスト）を発揮できる。このような高性能なＭＲＩ造影剤の開発により、高精度な画像診断が可能となり、先端医療の発展に貢献できる。

図１は、ＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真である。 図２は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６）の緩和度測定のためのＭＲＩファントム画像である。 図３は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ３〜５および８）１００倍希釈溶液の室温６ヶ月保存後の写真である。 図４は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ１〜１３）のマクロファージによる貪食作用を示す図である。 図５（ａ）は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ５）を投与したマウスの肝臓病理組織写真である。 図５（ｂ）は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ８）を投与したマウスの肝臓病理組織写真である。 図６は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６および９）を投与したマウスの血中残存率を示す図である。 図７（ａ）は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６および９）を投与したマウスの組織中蓄積率を示す図である。 図７（ｂ）は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６および９）を投与したマウスの重量あたり組織中蓄積率を示す図である。 図８（ａ）は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６）を投与する担癌マウスの左大腿部の腫瘍の位置を示す写真である。 図８（ｂ）は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６）を投与する前のマウス腫瘍のＭＲＩ造影画像である。 図８（ｃ）は、本発明に係るＭＲＩ造影剤の複合粒子（表１、ｒｕｎ６）を投与した２４時間後のマウス腫瘍のＭＲＩ造影画像である。

本発明者らは、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で所定の分子量の高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子が、長期に渡って、生理的条件下において分散安定性に優れていることを見出した。この知見に基づき、本発明者らは上記課題を解決した。このように分散安定性が優れることにより、本発明のＭＲＩ造影剤には、（ａ）取り扱いが容易、（ｂ）安定な薬効を提供、（ｃ）安全性が向上という利点がある。ＭＲＩ造影剤は、通常、患者に投与する直前に医療現場で調製されるため、取り扱いが容易な本発明のＭＲＩ造影剤は、調製から投与までの時間を短縮でき、医療従事者に対して特に有利である。また、複合粒子が凝集しやすい（すなわち分散安定性が低い）造影剤は、血中で異物として認識され、代謝排出されるので、薬効が低下し、十分な造影効果が得にくい。従って、分散安定性に優れる本発明のＭＲＩ造影剤は、薬効が安定する。また、複合粒子が凝集しやすい（すなわち分散安定性が低い）造影剤は、血中で血栓を形成する恐れがあり、安全性が低いのに対し、本発明のＭＲＩ造影剤は、分散安定性が高いため、このような恐れが低く、その結果、安全性が向上している。

本明細書において、「複合粒子は分散安定性が優れる」とは、通常の溶媒中で、肉眼的に明らかな複合粒子の凝集や沈降物が見られない状態を意味する。また、「複合粒子は長期に渡り分散安定性が優れる」とは、通常の保存条件および溶媒中にて、複合粒子を数ヶ月間保存した場合に、肉眼的に明らかな凝集や沈降物が見られない状態を意味する。なお、通常の保存条件とは１８〜３０℃前後の温度で、かつ約６０％以下の相対湿度を備えた条件である。通常の溶媒としては、医薬品製剤で一般的に用いられる生理食塩水などの水性溶剤が好ましい。

一般的に、複合粒子のグラフト鎖分子量が大きいと、微粒子と結合している付近と比較して、鎖先端のグラフト鎖の密度は低下する。そのため、細網内皮系細胞に貪食されやすいことが予想される。しかしながら、この予想に反して、本発明のＭＲＩ造影剤に含まれる複合粒子は、細網内皮系細胞に貪食されにくいという特徴を示す。本発明における「細網内皮系」とは、異物を貪食することにより生体の防御に関与している細胞の総称であり、代表的なものとしてマクロファージが挙げられる。

このような複合粒子によって、血液循環系を介して、腫瘍組織に集積を示すという特徴を示し、さらには、腫瘍組織内の病的状態に依存し、腫瘍組織内において異なる集積度分布を示すという特徴を有するＭＲＩ造影剤の提供が可能である。腫瘍組織において集積を示すことの確認は、ＭＲＩ画像において、被験動物に本発明のＭＲＩ造影剤を投与前に比べ、投与後に、被験動物の腫瘍組織に該当する部分においてコントラストが強くなることにより確認できる。

すなわち、本発明は、前記のとおり、複合粒子を含むＭＲＩ造影剤であって、前記複合粒子は、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子であり、前記微粒子は、超常磁性を示す無機微粒子であり、前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、３０，０００以上である。

本発明において、「ＭＲＩ造影剤」とは、臨床現場で利用されているＭＲＩ(磁気共鳴イメージング)装置を利用した、体内画像診断法において投与される物質（薬剤）である。ＭＲＩ測定対象中に当該物質が存在する場合、存在しなかった場合に比べて、測定画像上における測定対象の写り方が大きく変化したように見えるため、画像にコントラストをつけることが可能である。

本発明において、「高分子グラフト鎖」とは、微粒子表面から重合反応によってモノマーを２個以上伸長して形成されたポリマー鎖を意味する。また、「超高密度」とは、グラフト鎖間で立体反発が生じる程度までグラフト鎖が密集した場合のグラフト鎖の密度を意味し、この場合、グラフト鎖は、表面に垂直な方向にほぼ伸びきった形態をとる。また、「結合」とは、一般的な化学反応により形成される結合を意味し、例えば、共有結合、イオン結合等が挙げられる。

本発明のＭＲＩ造影剤において、前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）は、３０，０００以上であり、３０，０００〜３２０，０００であるのが好ましく、３０，０００〜１６０，０００であるのがより好ましく、３５，０００〜１６０，０００であるのが最も好ましい。このグラフト鎖の数平均分子量を制御することにより、細網内皮系細胞の貪食作用に違いがみられ、本発明のＭＲＩ造影剤の血中滞留性を制御することが可能である。具体的には、グラフト鎖の数平均分子量が大きい場合、ＭＲＩ造影剤の血中滞留性は向上する。また、グラフト鎖の数平均分子量が大きい場合、細網内皮系細胞に貪食されにくい。前記高分子グラフト鎖の数平均重合度は、１０〜１００,０００であり、例えばモノマーの分子量が５００であるときは、５０〜５００であるのが好ましく、５０〜３５０がより好ましく、７０〜３５０が最も好ましい。この数平均分子量は、例えばＧＰＣにより測定することができる。この数平均重合度は、数平均分子量／モノマー分子量から算出することができる。

本発明のＭＲＩ造影剤において、前記微粒子は、超常磁性を示す無機微粒子である。このような無機微粒子としては、例えば、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、合金（例えば、ＦｅＰｔ、ＦｅＣｏ）、酸化鉄（例えばフェライト、マグネタイト）等が挙げられる。前記フェライトは、市販のＭＲＩ造影剤用鉄製剤において実績があり、好ましい。「フェライト」は酸化鉄を主成分とするセラミックスの総称であり、磁性材料として広く使用される。無機微粒子として、より好ましくは、スピネル型の結晶構造を有するフェライトであり、さらにより好ましくは、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）である。なお、ＳＰＩＯ（超常磁性酸化鉄製剤）や、ＵＳＰＩＯ（Ｕｌｔｒａ−Ｓｍａｌｌ ＳＰＩＯ）、ＭＩＯＮ（単結晶型酸化鉄ナノ粒子製剤）と呼ばれるものは、ＭＲＩ造影剤用鉄製剤に含まれる。

「超常磁性」とは、磁性無機ナノ微粒子で起こる現象であり、外部から磁場をかけられた際に、全体として磁化を持つようになることを意味する。超常磁性体は、強磁性体が単一の磁区しか持たない大きさまでに微細化されたナノ粒子が示す特性であり、磁場を取り除いても磁化（磁気記憶）が残る強磁性体と異なり、超常磁性体は、磁場を取り除かれると磁化を失う。したがって、超常磁性を示す前記無機微粒子の粒径は、５０ｎｍ以下であることが好ましい。この粒径は、例えば、透過型電子顕微鏡法により測定することができる。本発明の複合粒子が超常磁性を示すかどうかは、例えば、ＳＱＵＩＤ（Superconducting Quantum Interference Device、超電導量子干渉素子）磁束計装置によって確認することができる(Macromolecules, 42(4), p1219-1228, 2009)。

超常磁性を示す無機微粒子は、ＭＲＩ測定において、画像を作り出すために使用されるＭＲ信号を出す原子核（臨床ＭＲＩでは概して水のプロトン）の緩和時間（Ｔ_１、Ｔ_２共に）に影響を与える。該無機微粒子を含む鉄製剤は、主にＴ_２を短くする効果（厳密には、局所磁場の不均一性誘発によるＴ_２＊の短縮）によって、Ｔ_２強調画像においてコントラストを強調する。

造影剤のＴ_２短縮率を示す値として、Ｔ_２の逆数で表される横緩和度（Ｒ_２）が用いられる。複合粒子のＲ_２は、基本的に超常磁性を示す前記無機微粒子の磁化に依存し、既存のＳＰＩＯやＵＳＰＩＯのＲ_２は、概ね２０〜２００［Ｆｅ ｍＭ^−１・ｓ^−１］である(Advanced Drug Delivery Reviews, Vol.58, p1471-1504, 2006)。Ｒ_２が大きいほど、より低い濃度で高いＴ_２短縮効果を示す。超常磁性を示す前記無機微粒子がマグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）であり、陰性造影剤として用いるとき、複合粒子の横緩和度（Ｒ_２）が１００［Ｆｅ ｍＭ^−１・ｓ^−１］（磁場強度１．５Ｔ）以上であることが好ましく、２００［Ｆｅ ｍＭ^−１・ｓ^−１］（磁場強度１．５Ｔ）以上であることがより好ましい。

本発明のＭＲＩ造影剤において、前記高分子グラフト鎖のグラフト密度は、例えば０．１本鎖／ｎｍ^２以上であり、０．１〜１．２本鎖／ｎｍ^２であるのが好ましく、０．１〜０．５本鎖／ｎｍ^２であるのがより好ましく、０．１５〜０．４５本鎖／ｎｍ^２であるのが最も好ましい。このグラフト密度を制御することにより、本発明のＭＲＩ造影剤における複合粒子の血中滞留性を制御することが可能である。本発明において、「グラフト密度」または「密度」とは、微粒子表面の単位面積（ｎｍ^２）あたりの表面に結合したグラフト鎖の本数を意味する。グラフト密度（s ）は、元素分析により微粒子表面から伸長して形成された高分子グラフト鎖の量（グラフト量、ｗ）を求め、その値とコア微粒子の表面積（Ｓ、ｎｍ^２）、グラフトポリマーの数平均分子量Ｍｎならびにアボガドロ数（Ａｖ）を用いて以下のようにして算出される。
算出方法：s＝（ｗ／Ｍｎ）Ａｖ／Ｓ

本発明のＭＲＩ造影剤において、前記複合粒子の平均粒径は、１０００ｎｍ以下であるのが好ましく、１０〜５００ｎｍであるのがより好ましく、１０〜２５０ｎｍであるのがさらにより好ましい。本発明のＭＲＩ造影剤は、その血中滞留性が平均粒径にほとんど依存しない。そのため、本発明のＭＲＩ造影剤は、所定の分子量を有するグラフト鎖を有していれば、前記微粒子の粒径を大きくし、その結果、前記複合粒子の平均粒径が大きくなった場合でも、生体内から排除されにくい。その結果、本発明のＭＲＩ造影剤は、従来よりも感度に優れ、かつ、低投与量で効果を発揮することができる。平均粒径とは、コア微粒子にグラフト鎖を付与した複合粒子全体の流体力学的直径を意味する。なお、平均粒径の粒径分布が小さい複合粒子である場合、ＭＲＩ造影剤の大きさが均一となり、ＤＤＳ用途のためには、好ましい。前記平均粒径は、動的光散乱式粒径分布測定法により測定することができる。

本発明のＭＲＩ造影剤において、前記高分子グラフト鎖は、例えば微粒子表面上の重合開始基を基点としたモノマーのリビングラジカル重合によって得ることができる。上記モノマーの種類としては、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体およびスチレン誘導体からなる群から選択される１以上が好ましいが、これらに限定されず、当業者の認識する範囲で適宜選択されてもよい。この高分子グラフト鎖は、別の高分子グラフト鎖と結合していてもよい。具体的にはリビングラジカル重合において、モノマーの１種として架橋性モノマーを用いてブロック共重合体をグラフトし、導入した架橋性基を反応させてもよい。またリビングラジカル重合は、ランダム重合、ブロック重合、組成傾斜型等であってもよい。高分子グラフト鎖は、その末端および末端近傍に特異的なリガンドを導入されていてもよい。そのようなリガンドを有する複合粒子を含むＭＲＩ造影剤は、選択的にリガンドを標的臓器へ届けることができるので好ましい。特異的なリガンドとしては、当該分野で知られる特異的なリガンドであれば特に限定されない。

本発明のＭＲＩ造影剤において、前記高分子グラフト鎖の分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１〜１．５であるのが好ましい。分子量分布が１〜１．５の範囲である場合、ＭＲＩ造影剤は均質なグラフト表面を有するからである。

また、本発明のＭＲＩ造影剤の複合粒子において、微粒子から遠い領域の高分子グラフト鎖が、特定の病変組織指向性な高分子であってもよい。前記特定の病変組織指向性な高分子としては、例えば、病変時に高発現する分子マーカーに対する標的分子が挙げられる。このようなＭＲＩ造影剤は、腫瘍以外の病変にも特異的に集積することができ、その結果、かかる病変をＭＲＩ信号コントラストとして検出することが可能である。

本発明のＭＲＩ造影剤は、例えば、標的とする患部（臓器、組織、細胞、病原体等）の、腫瘍診断用に用いられるのが好ましい。本発明のＭＲＩ造影剤は、血中からの除去のために働くタンパク質の吸着が抑制されており、その結果、血中残存率が高いことが特徴である。そのため、本発明のＭＲＩ造影剤は癌組織への集積が高い。この理由としては、ＥＰＲ効果（Enhanced Permeability and Retention Effect）が考えられる。数十〜２５０ｎｍの分子サイズをもつ物質は癌組織の血管の解剖学特徴によって、集積することが知られている。本発明のＭＲＩ造影剤は血中滞留性が高く、その結果として、血流を介して癌組織を通過する確率が高くなる。この結果として、癌により多く集積すると考えられる。

また、本発明のＭＲＩ造影剤は、肝臓への移行率が低く、腫瘍へ集積する性質を示す。そのため、本発明のＭＲＩ造影剤を用いて、ＭＲＩ法により様々な臓器の腫瘍を検出することが可能である。

本発明のＭＲＩ造影剤において、複合粒子は、例えば以下のようにして製造することができる。まず、重合開始基含有カップリング剤としての化合物を、化学吸着法により微粒子表面に固定する。そして、１種類以上のモノマーを供給してリビングラジカル・グラフト重合を行う。重合開始基含有カップリング剤を予め微粒子表面に固定することにより、微粒子表面上でグラフト密度を一定に保持しつつグラフト重合を進行させることができる。つまり、グラフト量はグラフト鎖のＭｎ（数平均分子量）に比例して増大させることができ、重合をリビング的に進行させ、微粒子表面上のほぼすべてのグラフト鎖をほぼ均等に成長させることができる。すなわち、本発明の複合粒子においては、微粒子表面上の隣接グラフト鎖間の立体障害が軽減されているのである。なお、リビングラジカル・グラフト重合の間、微粒子の表面に固定していない重合開始剤を共存させてもよい。

重合開始基含有カップリング剤としての化合物は、微粒子との親和性等を考慮して選択することができる。具体的には、微粒子が酸化鉄の粒子である場合、その重合開始基含有カップリング剤としては、下式（Ｉ）に示すシラン化合物が好ましい。

前記式中、ｎは整数であり、３〜１０が好ましく、４〜８がより好ましい。Ｒ^１は、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル基であり、Ｃ_１またはＣ_２アルキル基が好ましい。Ｒ^２は、Ｃ_１またはＣ_２アルキル基である。Ｘはハロゲン原子であり、臭素または塩素原子が好ましい。式（Ｉ）で表わされる化合物としては、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシヘキシルトリエトキシシラン（ＢＨＥ）等が挙げられる。

微粒子が酸化鉄である場合、その重合開始基を含有しないカップリング剤としては、アルキルシランカップリング剤等が挙げられる。

微粒子表面のグラフト密度は、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合を調整することで、変更することができる。具体的には、微粒子が酸化鉄ナノ粒子である場合、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合が１：０であれば、グラフト密度は０．１本鎖／ｎｍ^２以上である。

重合終了後、目的とする複合粒子は、反応液から当該分野で通常用いられる方法、例えば抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈殿、ろ過、乾燥、吸着、析出、クロマトグラフィーなどの方法を単独または組み合わせることにより、単離することができる。

本発明のＭＲＩ造影剤は、前記のように腫瘍の診断用に用いられるのが好ましい。腫瘍としては、非新生生物性の膨張および真性腫瘍が挙げられる。前記真性腫瘍には、良性腫瘍と悪性腫瘍とが挙げられる。前記悪性腫瘍としては、脳腫瘍、舌癌、喉頭癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、骨肉腫、軟骨肉腫、中皮腫、皮膚癌、白血病、神経芽腫、骨髄腫、リンパ腫等が挙げられる。

本発明のＭＲＩ造影剤は、経口および非経口のいずれの方式でも投与可能である。経口投与の場合、本発明のＭＲＩ造影剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤またはシロップ剤等の形態で投与できる。非経口投与の場合、本発明のＭＲＩ造影剤は、例えば、注射剤、座剤、点眼剤、経肺剤、経鼻投与剤、軟膏、クリーム剤等の形態で投与できる。注射剤の場合、例えば、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与等により、投与される。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて従来周知の方法により製造することができる。

以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＢＰＥ：（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン
ＢＰＰ：１−（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシ−２−プロペン
ＰＥＧＭＡ：ポリエチレングリコールメタクリレート
ＰＥＭＡ：（４−ヒドロキシフェニル）エチルメタクリレート
ｄＮ−ｂｉｂｙ：Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ、ジノニルビピリジン
ＥＢＩＢ：エチル２−ブロモイソブチレート
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＧＰＣ：ゲル濾過クロマトグラフィー
ＴＧＡ：熱重量分析
ＴＥＭ：透過型電子顕微鏡
ＭＲＩ：磁気共鳴イメージング

＜複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の製造例＞

（１）重合開始基含有カップリング剤（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）の合成

ＢＰＥの合成は、２段階反応により行った。第１段階として、アリルアルコール（１７０ｇ）、トリエチルアミン（２３７ｇ）およびジクロロメタン（２Ｌ）の混合溶液を氷冷し、その中へ２−ブロモイソブチリルブロマイド（４５０ｇ）を滴下した。その後、反応液を０℃で３時間攪拌し、さらに室温で１０時間攪拌した。反応液を濃縮し、ＴＨＦを加え、塩を析出させ、濾過し、濾液を濃縮した後、得られたものをクロロホルム（１Ｌ）により希釈し、それを１Ｎ塩酸水溶液（２×１Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１Ｌ）、純水（２×１Ｌ）の順で洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮後、減圧蒸留により精製し、１−（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシ−２−プロペン（ＢＰＰ）を収率９０％で得た。

第２段階として、フラスコの中へＢＰＰ（１００ｇ）、トリエトキシシラン（１７０ｇ）およびカルステッド触媒（６００μＬ）を順次入れ、その混合液をアルゴン雰囲気下、室温で１２時間攪拌した。反応後減圧蒸留により精製し、ＢＰＥを収率７０％で合成した。

（２）オレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子の合成
Hyeonらの報告（Nature Materials, Vol.3, p891-895, 2004）に従い、オレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子を合成した。
先ず、オレイン酸鉄錯体を合成した。塩化鉄（ＦｅＣｌ_３６Ｈ_２Ｏ、１０．８ｇ）とオレイン酸ナトリウム（３６．５ｇ）を、エタノール（８０ｍＬ）、水（６０ｍＬ）およびヘキサン（１４０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、その溶液を７０℃で４時間攪拌した。反応終了後、上層の有機層を回収し、前記有機層を純水で３回洗浄した。その後、前記有機層をロータリーエバポレータで減圧濃縮し、溶媒を除去した。得られた残渣を７０℃で１晩、真空乾燥してオレイン酸鉄錯体を得た。このオレイン酸鉄錯体（３６ｇ）とオレイン酸（５．７ｇ）をトリオクチルアミン（２００ｇ）に溶かし、その溶液を、５℃／ｍｉｎの昇温速度で３７０℃まで加熱した。３７０℃に達した後、さらに、同温度で３０分間、還流下で加熱を続けた。その後、反応溶液を室温まで冷却し、ＴＨＦで希釈した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）でオレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子を回収した。透過型電子顕微鏡法により前記酸化鉄ナノ粒子の投影面積円相当径（平均粒径）を測定したところ、７、１０、１５および２０ｎｍであった。この酸化鉄は、Ｘ線回折法により、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）であることを確認した。

（３）オレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子表面への開始基の導入
（２）で得た前記酸化鉄ナノ粒子をＴＨＦに分散させ、分散液（１ｗｔ％）を作成した。前記分散液へアンモニア水（１ｗｔ％）を加え、しばらく攪拌した後、（１）で得たＢＰＥ（２ｗｔ％）を加え、３日間、室温で攪拌した。この溶液を攪拌中、定期的に、超音波照射した。その後、粒子を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）で回収し、ＴＨＦによる再分散、遠心分離をくりかえすことにより、開始基を有する酸化鉄ナノ粒子を得た。

（４）酸化鉄ナノ粒子を用いた表面開始リビングラジカル重合

（３）で得た開始基を有する酸化鉄ナノ粒子、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）、（４−ヒドロキシフェニル）エチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ、ジノニルビピリジン（ｄＮ−ｂｉｂｙ）およびエチル２−ブロモイソブチレート（ＥＢＩＢ）をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後、７０℃で所定時間重合して、高分子グラフト鎖が酸化鉄ナノ粒子表面に結合した複合粒子を得た。この重合条件を表１に示す。

複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の精製は、遠心分離とアセトン、純水への再分散を繰り返すことにより行った。

複合粒子は、純水に分散させ室温保存した。複合粒子をフッ化水素で処理することにより、高分子グラフト鎖を酸化鉄ナノ粒子から切り出し、高分子グラフト鎖の分子量及び分子量分布をゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により求めた。

熱重量分析（ＴＧＡ）により求めたグラフト量から、グラフト密度を算出し、全てのサンプルにおいて、０．１５〜０．４３鎖／ｎｍ^２以上の高いグラフト密度を有していることを確認した。なお、ここで用いた重合条件および重合結果を表１にまとめ、また、それをサンプルリストとした。図１に、複合粒子（ｒｕｎ６）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示した。

＜複合粒子の緩和度測定＞
酸化鉄微粒子の粒径が異なる、実施例ｒｕｎ２（７ｎｍ）、ｒｕｎ３（１０ｎｍ）、ｒｕｎ６（２０ｎｍ）で得られた複合粒子について、以下のようにしてＮＭＲおよびＭＲＩを用いて緩和時間を測定した。

ＮＭＲ（ＥＸ‐４００、日本電子株式会社）を用いてＣＰＭＧ（Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ）法によりＴ_２を測定した。１ｍＭ Ｆｅ相当の複合粒子存在下における、Ｈ_２Ｏのプロトンシグナルを測定対象とした（９９％Ｄ_２Ｏ／２４℃）。その結果から求めたＲ_２は、１１８［Ｆｅ ｍＭ^−１・ｓ^−１］（ｒｕｎ２）、１５１［Ｆｅ ｍＭ^−１・ｓ^−１］（ｒｕｎ３）、３２６［Ｆｅ ｍＭ^−１・ｓ^−１］（ｒｕｎ６）であった。よって、得られた複合粒子は、ＭＲＩ造影剤として必要なＴ_２短縮効果を示すことが分かった。また、より低い濃度でも高いＴ_２短縮効果を示す、２００［Ｆｅ ｍＭ^−１・ｓ^−１］以上のＲ_２を示す複合粒子（ｒｕｎ６）を得ることができた。なお、この測定で用いたＮＭＲは、磁場強度９．４Ｔだが、Ｔ_２緩和は、磁場強度の違いによる影響はほとんど受けない（ＭＲＩ「超」講義 第２版 Ｑ＆Ａで学ぶ原理と臨床応用、メディカル・サイエンス・インターナショナル出版）。

次に、ＭＲＩ（Ｕｎｉｔｙ ＩＮＯＶＡ ４．７Ｔ、バリアン・テクノロジーズ・ジャパン・リミテッド）を用いたファントム実験を行った。複合粒子（ｒｕｎ６）を蒸留水で０．００１〜２．０ｍＭ Ｆｅの濃度に希釈し、図２右に示すように配置し、スピンエコー法によりＴ_２を測定した（測定条件：ＴＲ／ＴＥ＝４０００／０．０８ｍｓ）。比較対照には既存ガドリニウム系造影剤であるマグネビスト（ＭＶ、１ｍＭ Ｇｄ、バイエル薬品株式会社）、陰性対照には蒸留水を用いた。図２右に示す円中の数字は、複合粒子の濃度（ｍＭ）であり、ＭＶは、前記比較対照の既存ガドリニウム系造影剤である。図２左に、複合粒子（ｒｕｎ６）の緩和度測定のためのＭＲＩファントム画像を示す。その結果、Ｔ_２測定画像を見ると複合粒子は濃度依存的に暗くなり、既存品より低濃度でも十分なＭＲＩコントラスト画像を得られることが確認された。なお、他の複合粒子を用いた場合も同様の結果が得られた。磁場強度は、４．７Ｔであった。

＜複合粒子の分散安定性評価＞
ｒｕｎ１〜１３で得た複合粒子の分散安定性を評価するため、長期保存実験を行った。酸化鉄微粒子の粒径が１０ｎｍの各複合粒子（実施例ｒｕｎ３、４、５および比較例ｒｕｎ８、各５ｍＬ）を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて、粒子濃度が０．０３８ｗｔ％となるように調整し、室温で６ヶ月間保存した。保存開始前には、いずれの複合粒子も凝集はみられず、ＬＢ−５５０（ＨＯＲＩＢＡ社製）を利用した動的光散乱式粒径分布測定の結果、平均粒径（流体力学的直径、本測定ではメジアン径を採用）は４０ｎｍ未満であり、すべて優れた分散安定性を示した。これら複合粒子を、室温で６ヶ月間保存すると、比較例ｒｕｎ８でのみ沈殿が生じた（図３）。同様に複合粒子の粒径分布測定したところ、比較例ｒｕｎ８：２９６ｎｍ、ｒｕｎ３：１２０ｎｍ、ｒｕｎ４：７５ｎｍ、ｒｕｎ５：２４ｎｍ、となり、グラフト鎖長が大きいほど保存開始前の分散性を維持した。これらの結果から、グラフト鎖分子量が大きい複合粒子は分散安定性に優れており、長期間の保存に適していることが確認できた。これは、リビングラジカル重合により高分子グラフト鎖が結合した複合粒子が、水性溶媒中に単純に混ぜるだけでも、長期に渡る分散安定性を維持する特徴を示した驚くべき結果である。

＜マウス腹腔内マクロファージによる複合粒子の貪食作用＞
複合粒子の細網内皮系への取り込まれやすさを評価するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏマクロファージ実験を行った。３％チオグリコレート（ＳＩＧＭＡ社製）、２ｍＬを腹腔内投与したマウス（８週齢、ＩＣＲ雄マウス）を３日後に犠牲死させ、Ｈａｎｋｓ液（Ｇｉｂｃｏ社製）で腹腔内よりマクロファージを回収した。回収したマクロファージはＨａｎｋｓ液および培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社製）で洗浄後、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。３時間後培地を除去し、培地で３０μｇＦｅ／ｍＬに調整した複合粒子（実施例ｒｕｎ１〜７、１１、１２、比較例ｒｕｎ８〜１０、１３）を添加した。培養２４時間後に培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄後、Ｐｅｒｌ’ｓ Ｐｒｕｓｓｉａｎ Ｂｌｕｅ染色により複合粒子を貪食したマクロファージを染色し、吸光度（５９０ｎｍ）を測定した（図４）。陰性対照にはＰＢＳ、陽性対照には既存酸化鉄造影剤であるリゾビスト（バイエル株式会社、３０μｇＦｅ／ｍＬ）を用いた。その結果、実施例の複合粒子を用いた場合は、陰性対照との差がなく、マクロファージに貪食されないことが確認できた。一般的に、複合粒子のグラフト鎖分子量が大きいと、微粒子と結合している付近に比べ、グラフト鎖先端部の密度は低下し、細網内皮系に認識されやすくなり、貪食されやすいと考えられている。よって、グラフト鎖分子量が小さい複合粒子は、マクロファージに貪食されにくいと考えていた。しかしながら、予想に反して、グラフト鎖分子量が小さい複合粒子（比較例）に比べ、大きい複合粒子（本発明）のほうがマクロファージに貪食されにくいことを確認できた。

＜マウス肝臓マクロファージによる複合粒子の貪食作用＞
複合粒子の肝臓での取り込まれやすさを評価するため、肝臓の病理組織学的評価を行った。生理食塩水を用いて複合粒子濃度を１．９ｗｔ％に調整した複合粒子（実施例ｒｕｎ５および比較例ｒｕｎ８、各３００μＬ）の溶液を、マウス（６週齢、ＩＣＲ雄マウス）の尾より静脈内投与した。投与３日後に犠牲死させ、摘出した肝臓をホルマリン固定後、パラフィン包埋、薄切し、ＨＥ染色した。肝臓の病理組織学的評価の結果、比較例ｒｕｎ８（酸化鉄微粒子の粒径；１０ｎｍ、Ｍｎ；２９，０００）では、円内に示した肝臓マクロファージ（クッパー細胞）が褐色状に染色され、酸化鉄ナノ粒子（複合粒子）が貪食されたことが示された（図５（ｂ））。ｒｕｎ５（酸化鉄微粒子の粒径；１０ｎｍ、Ｍｎ；１５４，０００）では、円内に示した正常なクッパー細胞が見られるのみで貪食作用は認められなかった（図５（ａ））。この結果から、実施例の複合粒子は、肝細網内皮系ではクッパー細胞に貪食されず、投与３日後には肝臓中に蓄積されていないことが確認できた。

＜ＲＩ標識複合粒子の体内動態評価＞
（１）複合粒子の放射性同位元素（ＲＩ）による標識
実施例ｒｕｎ６（酸化鉄微粒子の粒径；２０ｎｍ、Ｍｎ；１０９，０００）および比較例ｒｕｎ９（酸化鉄微粒子の粒径；２０ｎｍ、Ｍｎ；１１，０００）の複合粒子の分散液（複合粒子濃度として１ｗｔ％、溶媒＝純水、１００μＬ）をマイクロ遠心チューブに入れ、さらにＮａ^１２５Ｉ（５μＬ、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ ＮＥＺ０３３）、次いでＣｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ溶液（濃度＝０．２ｍｇ／ｍ１、溶媒＝０．５Ｍリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有、１００μＬ）を加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。そこへメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（濃度＝４ｍｇ／ｍＬ、溶媒＝純粋、１００μＬ）をさらに加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。得られた混合物をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）で分離精製（溶出液；生理食塩水）し、微粒子（^１２５Ｉ標識複合粒子）含有留出を^１２５Ｉ標識複合粒子分散液として回収した。

（２）ＲＩ標識複合粒子の体内動態評価
（１）で製造した^１２５Ｉ標識複合粒子分散液（ｒｕｎ６および９、各１００μＬ）を、Ｃｏｌｏｎ−２６癌細胞を移植した担癌マウス（８週齢、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス）の尾より静脈内投与した。所定時間経過後にマウス眼より採血しガンマカウンター（ＡＲＣ−３０１Ｂ、アロカ株式会社）により放射活性を測定し、複合粒子の血中残存率を求めた（図６）。また、投与２４時間後に担癌マウスを犠牲死させ、摘出した各臓器の放射活性を測定し、複合粒子の体内分布を評価した（図７（ａ）；組織中蓄積率、図７（ｂ）；重量あたり組織中蓄積率）。血中残存率の結果、比較例ｒｕｎ９（酸化鉄微粒子の粒径；２０ｎｍ、Ｍｎ；１１，０００）では投与直後から残存率が低下する一方で、実施例ｒｕｎ６（酸化鉄微粒子の粒径；２０ｎｍ、Ｍｎ；１０９，０００）では、投与２４時間後まで高い血中残存率（約４０％）を維持し、血中滞留性が高いことを示した。体内分布では、投与２４時間後の組織中蓄積率で両試作品ともに肝臓に８〜１８％、脾臓に１〜２％の蓄積が確認された。従来の酸化鉄系造影剤の投与１時間後の肝細網内皮系への集積率は約８０％であること（Ａｍ Ｊ Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ， １５２， １６７−１７３， １９８９）から、実施例の複合粒子の肝臓および脾臓への集積率は極めて低いことが確認できた。また、実施例ｒｕｎ６の投与２４時間後の重量あたり組織中蓄積率では、腫瘍への蓄積性が高いことが示された。これらの結果から、グラフト鎖分子量が大きい複合粒子は、血中滞留性が延長され、ＥＰＲ効果により腫瘍への集積性が上昇する一方で、肝臓および脾臓へ集積率は低いことが確認できた。

＜複合粒子のＭＲＩによる造影評価＞
実施例ｒｕｎ６（酸化鉄微粒子の粒径；２０ｎｍ、Ｍｎ；１０９，０００）の複合粒子を用いてＭＲＩ実験を行った。麻酔下の担癌マウス（８週齢、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス）をＭＲＩ装置（Ｕｎｉｔｙ ＩＮＯＶＡ ４．７Ｔ、バリアン・テクノロジーズ・ジャパン・リミテッド）にセットし、左大腿部の腫瘍に対して位置決め（投与前）撮影を行った後（図８（ａ）および図８（ｂ）参照）、ｒｕｎ６の複合粒子の生理食塩水による分散液（１００μＭ Ｆｅ／ｋｇ、１００μＬ）を尾より静脈投与し、２４時間後に同腫瘍の撮影を行った（図８（ｃ）参照）。撮影条件は、Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｐｌａｎｅ、１ｍｍ厚、ＴＲ＝３００ｍｓ、ＴＥ＝１０ｍｓ、Ｆｌｉｐ ａｎｇｌｅ＝２０°で行った。その結果、グラジエントエコー（ＧＥ）法測定により撮像したＴ_２強調画像では、複合粒子を投与前には白色画像として撮影された腫瘍が、投与２４時間後の撮影では、腫瘍内部が全体的に陰影され、特に一部は完全な陰影効果が認められた（図８（ｃ）参照）。この結果から、複合粒子は腫瘍に集積することで、Ｔ_２短縮効果を発揮し、信号強度を低下させることが示された。よって複合粒子は、コントラストを強調させるＭＲＩ造影剤として実用的に機能することが確認できた。

本発明のＭＲＩ造影剤は、薬物ナノキャリア、イメージング試薬等としての用途にも適用できる。

Claims (4)

1. 複合粒子を含むＭＲＩ造影剤であって、
   前記複合粒子が、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子であり、
   前記微粒子が、超常磁性を示す無機微粒子であり、
   前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、３０，０００〜３２０，０００であり、
   前記高分子グラフト鎖のグラフト密度が、０．１５本鎖／ｎｍ²以上であるＭＲＩ造影剤。
2. 前記高分子グラフト鎖が、前記微粒子表面上の重合開始基を基点としたアクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体およびスチレン誘導体からなる群から選択される１以上のリビングラジカル重合によって得られる請求項１に記載のＭＲＩ造影剤。
3. 前記高分子グラフト鎖の分子量分布が、１〜１．５である請求項１または２に記載のＭＲＩ造影剤。
4. 腫瘍診断用である請求項１〜３のいずれかに記載のＭＲＩ造影剤。