JP5933204B2 - 抗gpr−9−6および抗teck抗体ならびにgpr−9−6およびteckの機能の調節因子の同定方法 - Google Patents
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Description
ケモカインは、広範な生物学的機能を媒介する約40の6〜14kDの(非グリコシル化)ヘパリン結合性タンパク質の大きく、発達しつつあるファミリーである〔非特許文献1〕。ケモカインは、2つのジスルフィド結合を形成する4つのシステイン残基の位置に基づいてファミリーに分けられうる〔非特許文献2、3、4〕。また、ケモカインレセプターは、それらが結合するケモカインのタイプに基づいてファミリーに分けられうるが、レセプターサブファミリーを区別する明かな構造差異は同定されていない〔非特許文献5〕。さらに、十分に特徴づけられたケモカインレセプターと配列相同性を共有する多数のいわゆる「オーファン(orphan)」ケモカインレセプター(例えば、GPR−9−6)が存在する。しかし、オーファンレセプターの生物学的機能および特異的なアゴニストは不明なままである。
本明細書で使用した略語を挙げる:ECV304、ヒト臍静脈内皮細胞株(ATCCアクセッション番号CRL−1998);ADEC、アデノイド発現ケモカイン;IP10、IFN−ガンマ誘導性10kDaタンパク質;IMDC、未熟樹状細胞;I−TAC、インターフェロン誘導性T細胞アルファ化学誘引物質;MCP−1、単球化学誘引物質タンパク質;SDF、ストロマ細胞由来因子;MDC、成熟樹状細胞ケモカイン;MIG、インターフェロン−ガンマによって誘導されたモノカイン;RANTES、regulated on activation normal T cell expressed ;MIP3、マクロファージ炎症性タンパク質3;MIP4、マクロファージ炎症性タンパク質4;TECK、胸腺発現ケモカイン;SLC、二次リンパ様組織ケモカイン;DC、樹状細胞。
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、用語「抗体」はポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を包含することを意図する。用語ポリクローナルおよびモノクローナルは、抗体調製の等質性の程度をいい、特定の産生方法に限定されることを意図しない。本明細書で使用される用語「抗体」はまた、ヒト、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニア化 (veneered) または単鎖抗体のフラグメントを含む抗体の機能的フラグメントをも包含する。機能的フラグメントは、哺乳類GPR−9−6に結合する抗原結合性フラグメントを含む。例えば、限定されないがFv、Fab、Fab’およびF(ab’)2フラグメントを含む哺乳類GPR−9−6またはその一部に結合しうる抗体フラグメントは、本発明により包含される。かかるフラグメントは、酵素開裂または組換え技術により産生されうる。例えば、パパインまたはペプシン開裂は、それぞれFabまたはF(ab’)2フラグメントを作製しうる。必要な基質特質性を有する他のプロテアーゼもまた、FabまたはF(ab’)2フラグメントを作製するのに使用しうる。1つまたはそれ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて、種々の切断型で、抗体はまた産生されうる。例えば、F(ab’)2重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、CH1ドメインおよび重鎖のヒンジ領域をコードするDNA配列を含むように設計されうる。
他の局面において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、哺乳類TECK、好ましくは天然に存在するまたは内因性ヒトTECKに対する結合特異性を有する。1つの態様において、抗体は、IgGまたはIgGの抗原結合性フラグメントである。他の態様において、抗体または抗原結合性フラグメントは、哺乳類TECKに結合して、レセプター(例えば、GPR−9−6(CCR9))へのTECKの結合、および/またはTECK結合に応答してレセプターにより媒介される1つまたはそれ以上の機能を阻害(低減または妨害)しうる。
本発明はまた、哺乳類GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種に結合しうる薬剤(すなわち、分子または化合物)を検出または同定するための方法に関する。
哺乳類GPR−9−6またはその機能的変種に結合する薬剤は、かかる薬剤が本明細書に記載のようなGPR−9−6の1つまたはそれ以上の機能を調節(阻害(低減または妨害)または促進)しうるかどうか測定するために、1つまたはそれ以上の適切なアッセイでさらに研究されうる。例えば、薬剤は、細胞外酸性化アッセイ、カルシウムフラックスアッセイ、リガンド結合アッセイ、化学走性アッセイまたは脱顆粒もしくは炎症伝達物質放出をモニターするアッセイで試験されうる(例えば、Hesselgesserら、J.Biol.Chem.273(25):15687-15692(1998)およびWO 98/02151を参照のこと)。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントならびに本明細書に記載される方法により同定される薬剤の有効性を治療剤と同様にインビボで評価するために使用されうる炎症のインビボモデルが入手可能である。例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモットまたは霊長類(例えば、アカゲザルマカク(rhesus macaque))等の適切な動物に哺乳類GPR−9−6と反応性であるケモカインおよび抗体またはその抗原結合性フラグメントの皮内注入による白血球浸潤が、モニターされうる(例えば、Van Damme,J.ら、J.Exp.Med.,176:59−65(1992);Zachariae、C.O.C.ら、J.Exp.Med.171:2177−2182(1990);Jose,P.J.ら、J.Exp.Med.179:881−887(1994))。一つの態様では、皮膚バイオプシーが、白血球(例えば、GPr−9−6+T細胞)の浸潤について組織学的に評価される。他の態様では、化学走性および管外遊走が可能である標識された細胞(例えば、例として111Inで標識した哺乳類GPR−9−6を発現する安定に形質移入した細胞)が動物に投与される。例えば、哺乳類GPR−9−6に結合する評価対象の抗体または薬剤は、GPR−9−6リガンドまたはアゴニスト(例えば、TECK)が試験動物に投与される前、それと同時または後のいずれかに投与されうる。抗体または薬剤の非存在下での炎症の程度と比較した、抗体または薬剤の存在下での炎症の程度の減少は、阻害の指標である。
本発明の抗体は、GPR−9−6が細胞の表面上で検出されうる手順における適用を有する。該レセプターは、これが発現される白血球細胞型のマーカーを提供する。例えば、本明細書に記載の抗体(例えば、mAb 3C3、mAb GPR96−1)などの、哺乳類GPR−9−6タンパク質またはペプチドに対する抗体は、哺乳類GPR−9−6を発現する細胞を検出および/または定量するために使用することができる。一態様では、抗体を用いて(例えば、GPR−9−6+CLA-veα4β7+veCD4+記憶T細胞などの粘膜にホーミング(home)する白血球を単離するために)細胞混合物の中からGPR−9−6を発現する細胞を選別することができる。細胞を計測および/または選別するために適した方法を本目的(例えば、フローサイトメトリー、蛍光標示式細胞分取)に使用することができる。細胞の計測数を、白血球細胞型(例えば、粘膜にホーミングする白血球、IEL、LPL)の増加または減少が観察される疾患または症状の診断に使用することができる。
哺乳類GPR−9−6タンパク質に特徴的な少なくとも1の機能の阻害または促進により、本発明による哺乳類GPR−9−6機能の調節は、レセプター媒介性機能の阻害または促進の有効かつ選択的な方法を提供する。いったんリンパ球がある部位で漸増すると、単球などの他の白血球細胞型は、二次シグナルにより漸増されうる。したがって、リガンド、インヒビターおよび/またはプロモーターを含む、本明細書に記載のようにして同定されるものなどの、GPR−9−6機能を調節しうる薬剤を用いて白血球機能(例えば、漸増および/または蓄積を含む白血球浸潤)を調節することができる。
・全身アナフィラキシーまたは過敏症反応、(例えば、ペニシリン、セファロスポリンなどに対する)薬物アレルギー、虫刺されによるアレルギー;乾癬、および皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、じんま疹などの炎症性皮膚病;脈管炎(例えば、壊死性、皮膚性および過敏性脈管炎);脊椎性関節症(spondyloarthropathy);強皮症;喘息、アレルギー性鼻炎などの呼吸器系アレルギー性疾患を含む炎症性またはアレルギー性の疾患および症状;
・関節炎(例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎)、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年発症糖尿病、糸球体腎炎およびその他の腎炎、自己免疫甲状腺炎、ベーチェット病などの自己免疫疾患;
・同種移植片拒絶または対宿主性移植片病を含む(例えば、移植術における)移植片拒絶;
・限定されないが、アテローム性動脈硬化、再狭窄、筋炎(多発性筋炎、皮膚筋炎を含む)を含む、阻害されうる望ましくない炎症性応答が治療されうる他の疾患または症状;
・癌、特に、皮膚T細胞リンパ腫(例えば、菌状息肉腫)などの皮膚または臓器の白血球浸潤を伴うもの;
が含まれる。
・新生物形成性疾患、網膜症(例えば、糖尿病網膜症)および黄斑変性を含む、血管新生または新生脈管形成がある役割を果たす疾患;
・細菌感染およびらい病ならびに特にウイルス感染などの感染性疾患;
・AIDSなどの免疫不全症候群を有する個体、放射線治療、化学療法または免疫抑制を起こす他の治療を受けている個体などにおける免疫抑制;レセプター機能の認識不全または他の原因による免疫抑制
が含まれる。
該方法によれば、1種またはそれ以上の薬剤を適切な経路により、単独で、または別の薬物と組み合わせて被験体に投与することができる。薬剤(例えば、リガンド結合を阻害する分子、抗GPR−9−6抗体またはその抗原結合性フラグメント、抗TECK抗体またはその抗原結合性フラグメント)の有効量が投与される。有効量は、GPR−9−6レセプター機能の阻害または促進に充分であり、それにより、GPR−9−6媒介過程(例えば、炎症性応答)がそれぞれ阻害または促進される量などの、投与条件下で所望の治療効果または予防効果を達成するのに充分な量である。薬剤は、単回投与または反復投与で行われ得る。用量は、当該技術分野で公知の方法により決定され得、例えば、選ばれる具体的な薬剤、被験体の年齢、薬物に対する過敏性および耐性および全身の健康状態(overall well-being)に依存する。抗体の適切な用量は、1回の治療につき、約0.01mg/体重kg〜約100mg/体重kgである。例えば、経口、治療食、局所、経皮、直腸、非経口(例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、鞘内、皮内での注射)および吸入(例えば、気管支内、鼻腔内または経口の吸入、点鼻)の投与経路を含むさまざまな投与経路を、薬剤および治療する疾患または症状に応じて用いることができる。投与は、指示通り、局所または全身に行いうる。好ましい投与形態は、選択した具体的な薬剤(例えば、GPR−9−6アンタゴニスト、抗TECK抗体)および治療している具体的な症状(例えば、疾患)に応じて変わりうるが、経口または非経口投与が一般的に好ましい。
細胞集団の精製
ヒト末梢血を10%(v/v)0.1M EDTA中に採取し、1-Step Polymorphs グラジエント(1.113±0.01g/ml、Accurate Chemical Co., Westbury, NY)上に重層し、400×gで30分間室温で遠心分離した。好中球層および単核細胞層を回収し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(Life Technologies, Grand Island, NY)中に再懸濁し、約750×gで15分間遠心分離した。赤血球は、ペレットをE−Lyse(5ml/107細胞)(Cardinal Associates, Santa Fe, NM)に5分間氷上で再懸濁することにより好中球画分中に溶解した。両方の細胞画分を氷冷DPBSで2回洗浄した。単核細胞を、タンパク質でコーティングしたプラスティックに2〜3時間接着させた後、非接着性細胞を静かにプレートから洗い流した。さらに12時間後、非接着性樹状細胞をプレートから洗い流し、抗CD19および抗CD2でコーティングした磁気ビーズ(Dynabeads; Dynal, Oslo, Norway)(細胞あたり5ビーズ)でBリンパ球およびTリンパ球を枯渇させた。50ng/ml顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF、R and D Systems, Minneapolis, MN)および40ng/ml IL−4(R and D Systems)ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Gibco BRL, Grand Island, NY)10%ウシ胎仔血清(FCS、HyClone, Logan, UT)に加えて添加物:ペニシリン50U/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、L−グルタミン2mM、HEPES 10mM、MEMピルビン酸ナトリウム10mM、MEM非必須アミノ酸0.1mMおよび2−メルカプトエタノール5.5×10-5M(すべてGibco BRL, Grand Island, NY製)中で残った細胞を7日間培養し(Sallusto, F.および Lanzabecchia, A.,J. Exp. Med., 179:1109-1118(1994))、未熟樹状細胞(IMDC)を生じさせ、場合によっては、さらに24時間10ng/ml LPS中で培養したものを用いて該樹状細胞を成熟させた。関連するMiltenyi Beads(Millenyi Biotek, Bergisch Gladbach, Germany)により、107単核細胞につき20μlのビーズを用い、PBS/1%BSA/5mM EDTA中、5×107細胞/mlで30分間4℃で、CD4+、CD8+、CD14+、CD56+およびCD19+集団を単核細胞から精製した。次いで、それらをスピンダウンし、PBS/1%BSA/5mM EDTA中に5×107細胞/mlで再懸濁し、磁場内のVSカラム(Miltenyi Biotech, Auburn, CA 95603)に通して非標識細胞を除去した。磁場外で20mlのPBS/1%BSA/5mM EDTAをVSカラムに通すことにより、細胞を取り出した。
CD4、CD8、CD14、CD19、CD49d、CD56、CD62L、CLA、CD45RA、CD45RO、CXCR5、CD80およびCD86に結合する標識抗体をPharmingen (San Diego, CA)から入手して免疫蛍光試験に使用し、一方、抗αEおよび抗CD83はBeckman Coulter (Fullerton, CA)から入手した。OKT3、抗ヒトCD3 mAbはAmerican Type Culture Collection (ATCC,Manassas, VA)から入手し、抗ヒトCD28 mAbはBecton Dickinson (Mountain View, CA)から入手した。抗ケモカインレセプターmAbのいくつかはLeukoSite, Inc.(Cambridge, MA)で作製し、クローン名を抗CCR3(7B11)、抗CCR4(2B10)、抗CCR6(11A9)および抗CXCR3(1C6)と命名する。FACS解析で使用した数種類の抗ケモカインレセプターmAbは市販の供給源から入手した。免疫蛍光試験に使用した抗CCR2、抗CCR6および抗CXCR5 mAbはR and D Systems(Minneapolis, MN)から入手したが、抗CCR5および抗CXCR4はPharmingen (San Diego, CA )から入手した。組換えヒトケモカインは、Peprotech (Rocky Hill, NJ)および R&D Systems(Minneapolis, MN)から入手し、場合によっては、記載のように(Clark-Lewis, I. ら、Biochemistry, 30:3128-3135(1991))、最適化し、かつ完全自動ペプチド合成装置(430A型;Applied Biosystems, Foster City, CA )に適合させた固相法を用いて合成した。ヒト内皮細胞株ECV304をATCCから購入した。すべてのサイトカインは、R&D Systems (Minneapolis, MN)から入手した。
配列MADDYGSESTSSMEDYVNFNFTDFYC(配列番号:3)を有する、GPR−9−6のNH2末端からなるペプチドを作製した。1日目に、完全フロイントアジュバント(FCA、Sigma, St. Louis, MO)中で調製したGPR−9−6ペプチド/KLHコンジュゲート10μgで、20日目に、不完全フロイントアジュバント(IFA、Sigma, St. Louis, MO)中で調製したGPR−9−6ペプチド/KLHコンジュゲート10μgで、そして40日目に、PBS中で調製したGPR−9−6ペプチド/KLHコンジュゲート10μgでBALB/Cマウスをi.p.免疫した。60日目、PBS中GPR−9−6ペプチド/KLH10μgでマウスを追加免疫し、4日後、脾臓を取り出し、SP2/0骨髄腫細胞(ATCC)と融合させた(Coligan ら、 Current Protocols in Immunology 2.5.1 (1992))。GPR−9−6ペプチドでコーティングしたプレートを用い、融合細胞をELISAによりスクリーニングした。抗GPR−9−6mAbを産生するハイブリドーマをGPR−9−6トランスフェクタントとの反応性について調べ、さらなる特性評価のためにサブクローニングした。ハイブリドーマLS129−3C3−E3−1とも称するマウスハイブリドーマ3C3は、FCS(10%)、IL−6(100ng/ml)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50μl/ml)、L−グルタミン(2mM)、HEPES(10mM)、MEMピルビン酸ナトリウム(10mM)、MEM非必須アミノ酸(0.1mM)および2−メルカプトエタノール(5.5×10-5M)を加えたDMEM中、37℃、5%CO2雰囲気で培養することができる。
先に記載したように(Murphy, E.ら、J. Exp. Med.,183:901-913(1997))、6穴Falconプレートを10μg/mlの抗CD28および2μg/mlのOKT3で一晩コーティングした後、PBSで2回洗浄した。臍帯血CD4+リンパ球(Poietic Systems, German Town, MD)を105〜106細胞/mlで、10%FCSおよびIL−2(4ng/ml)を加えたDMEM中で培養した。IL−12(5ng/ml)および抗IL−4(1μg/ml)をTH1に対して使用し、IL−4(5ng/ml)および抗IFNγ(1μg/ml)をTH2に対して使用した。4〜5日後、活性化したTH1およびTH2リンパ球をDMEM中で1回洗浄し、10%FCSおよびIL−2(1ng/ml)を加えたDMEM中で4〜7日間培養した。この後、活性化したTH1およびTH2リンパ球を、アポトーシスを阻害するための抗CD95L(1μg/ml)を添加した以外は上述のようにして抗CD28/OKT3およびサイトカインで5日間再度刺激した。4〜5日後、TH1およびTH2リンパ球を洗浄し、次いで、IL−2とともに再度4日間培養した。活性化したTH1およびTH2リンパ球をこのようにして最高3回維持した。
3μm孔径Transwell組織培養インサート(insert)を、コーティングせずに、または2%ゼラチンで2時間コーティングして用いた。次いで、5%FCSを加えた0.45mlのDMEMをチャンバの下側ウェルに入れ、2×105EVC304細胞を、0.2mlのDMEM5%FCS中の各ゼラチンコーティングインサートに加えた。2日後、ウェルおよびインサートを、0.5%HSA(ヒト血清アルブミン)、10mM HEPESを含有するRPMI−1640(Gibco BRL, Grand Island, NY)で2回洗浄し、次いで、ケモカインを下側ウェルに加えた。研究対象の細胞をRPMI中で1回洗浄し、TH1/TH2リンパ球、細胞株およびトランスフェクタントは4×106細胞/mlで、または休止CD4リンパ球は107細胞/mlで、RPMI0.5%HSAおよび10mM HEPES中に再懸濁した。細胞懸濁液の200μlアリコート(投入量は、それぞれ8×105細胞および2×106細胞)を各インサートに加えた。2〜4時間後、インサートを取り出し、ゲートを目的の細胞を獲得するために設定したBecton Dickinson FACScanで30秒間、ECV304単層を通って下側ウェルに移動した細胞の数を計測した。この技術を用いると、100%移動は、TH1/TH2細胞では25000細胞、休止CD4リンパ球では75000細胞であると考えられ、ここで、この数は、1分間にわたってFACScanで計測した下側ウェル内の細胞を表す。移動する細胞の表現型を研究するため、24mm径インサートを使用し、6ウェルプレートでCD4リンパ球を用いて同一の実験を行った。化学走性アッセイは、フィブロネクチンでコーティングしたインサート(10μg/ml)を用いたこと以外はECV304移動アッセイと同一であった。すべての場合において、データポイントは、2つ組の(duplicate)ウェルの結果であり、平均値を示し、エラーバーはサンプルの標準偏差を示す。
DPBS中107細胞/mlをFura2色素(Molecular Probes, Eugene, OR)により2mMで30分間標識し、DPBS中で3回洗浄し、1mM CaCl2、0.5mM MgCl2、10mM HEPESおよび5.5mMグルコースを含有するDPBS中に106細胞/mlで再懸濁した。次いで、10%NP−40および10mM EDTAを用い、細胞を蛍光光度計(日立、F2000型蛍光分光光度計、励起340nm、発光510nm)で解析して最大および最低Ca2+動員を確立した。
QIAGENチップを用い、製造業者(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA)が推奨するとおりにプラスミドDNAを単離した。DNAのライゲーション、制限エンドヌクレアーゼ消化およびゲル電気泳動を前述のようにして行った(Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, NY)(1989) )。アガロースゲル抽出によるDNA精製を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用い、製造業者(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA )が推奨するとおりに行った。プラスミドDNAを化学的形質転換(GIBCO, Inc.)により大腸菌に導入した。酵素をNew England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)、GIBCO Bethesda Research Laboratories, Inc. (Gaitherburg, MD)または Boehringer Mannheim, Inc.(ドイツ)から購入した。RNAは、標準的なイソチオシアン酸グアニジン法(Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, NY)(1989))または推奨されるようなRNeasyキット(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA)のいずれかを用い、凍結された組織または細胞から単離した。DNAシークエンシングは、FS DyeDeoxy Terminatorサイクルシークエンシングキットおよび377型DNAシークエンサー(Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、Sequi−Net(Colorado State University )により行った。配列は、SeqMan(DNASTAR, Inc., Madison WI)を用いて解析した。
GenBankに寄託されたヌクレオチド配列(U45982)(配列番号:1)(これは参照により本明細書に取り込まれる)に基づいて、GPR−9−6の完全コード領域を増幅するためのPCRにおける使用のためのプライマーを設計した。BamHIおよびXbaI部位をプライマー対BAZ201
GPR−9−6のコード領域をPCRにより増幅し、pcDNA3(Invitrogen, San Diego, CA)のBamHI/XbaI部位に指向的にクローニングした。次いで、トランスフェクタントをマウス前Bリンパ腫細胞株L1.2内で作製し、10%ウシ胎仔血清(HyClone, Logan, UT)、2mM L−グルタミン、50単位/ml Pen/Strep、0.55mM β−メルカプトエタノール、10mM HEPESおよび1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL)を加えたRPMI−1640中で維持した。pcDNA3中の線状化GPR−9−6を20μg用い、次のようにして該細胞株をトランスフェクトした。L1.2細胞をPBS中で2回洗浄し、同0.8ml中に再懸濁した。プラスミドDNAを該細胞と混合し、10分間、室温でインキュベートし、0.4cmエレクトロポレーションキュベットに移した。ついでシングルパルスを250V、960μFで負荷した。エレクトロポレーションの後、10分間、室温でインキュベートした。トランスフェクションの48時間後、G418(Geneticin, Gibco BRL)を加えて終濃度を0.8mg/mlとし、薬剤選別下で2〜3週間、細胞をバルク培養(bulk culture)で成長させた。次いで、トランスフェクタントを、GPR−9−6ペプチドに対する反応性を有するmAbで染色し(下記参照)、FACScan(Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA)で解析してGPR−9−6の表面発現を確認し、限界希釈によりクローニングした。実験の前に、トランスフェクトした細胞を5mM n−酪酸で24時間処理した(Palmero, D.P. ら、J. Biotech.,19:35-47(1991))。
ノーザンブロットは、ClonTech社から購入するか、または以下のようにして調製した。全RNAを、1.2%ホルムアルデヒドアガロースゲル上での電気泳動により分離し、上述(Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, NY)(1989))のようなキャピラリー法によりナイロン膜(Hybond-N+; Amersham Corp., Arlington Heights, IL)に移し、Stratalinker(Stratagene, Inc.)を用いて架橋した。放射標識したプローブとのハイブリダイゼーションは、ExpressHyb Solution(Clonetech )により製造業者の指示したプロトコルを用いて行った。オートラジオグラフィー暴露の長さは、対応する図の説明に記載している。完全長のゲル精製したTECKおよびGPR−9−6のDNAフラグメントをハイブリダイゼーションに用いた。
GPR−9−6に対するmAb、mAb 3C3はGPR−9−6トランスフェクタントと選択的に反応する
他の公知の白血球ケモカインレセプターとの密接な系統発生的関連性により(図1)、本発明者らは、寄託されたGenBank配列から設計したプライマーを用いてPCRによりGPR−9−6をクローニングした。GPR−9−6/L1.2トランスフェクタントを調製し、KLHに結合したGPR−9−6のNH2末端の最初の26個のアミノ酸(配列番号:3)でマウスを免疫した融合細胞内でGPR−9−6に対するmAbで染色した。mAb 3C3と命名したmAbは、GPR−9−6/L1.2トランスフェクタントと反応したが、親L1.2細胞とは反応しなかった。mAb 3C3は、IgG2bアイソタイプを有することがわかった。交差反応性試験では、mAb 3C3は、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7またはCXCR1、CXCR2、CXCR3およびCXCR4トランスフェクタントと交差反応しなかった。CCR6は、GPR−9−6とより密接に関連するケモカインレセプターの1つであることから、そのデータを本明細書に示す(図2A〜2B)。また、GPR−9−6のNH2末端ペプチド(配列番号:3)は、mAb 3C3のGPR−9−6トランスフェクタントへの結合を完全にブロックすることがわかり(データ示さず)、さらにこのmAbの特異性を検証した。
最初の末梢血の二色試験において、GPR−9−6は、CD4リンパ球の少量サブセット(2〜4%)上、ならびにCD8リンパ球の極少量サブセット上で発現されることがわかったが(図3A〜3B)、Bリンパ球は低く不均一なレベルのGPR−9−6を発現した。単球、好塩基球、好酸球、好中球およびNK細胞は、使用した条件下でGPR−9−6を発現しなかった(図3C〜3I)。TcRhighGPR−9−6-ve胸腺細胞の少量サブセットは明白であったが、GPR−9−6は、全てのレベルのTcRを発現する胸腺細胞の大量サブセットで発現された。三色実験では、GPR−9−6は、CD4、CD8およびCD4+veCD8+ve胸腺細胞の大部分、および未成熟CD4-veCD8-ve胸腺細胞の約50%に見られた(データ示さず)。GPR−9−6の発現は、未成熟樹状細胞でも成熟樹状細胞でも認められなかった(図4D)。しかしながら、予期したとおり、未成熟樹状細胞は、LPS活性化によりダウンレギュレートされるCCR5を発現したが、CD83およびCD86はアップレギュレートされた(図4A〜4C)。大きな数の一群の(a large panel of)細胞株の検査では、GPR−9−6がいくつかのT細胞株上に見られた(表1)。臍帯CD4+リンパ球はGPR−9−6を発現せず(図4E)、TH1またはTH2リンパ球を作製するためのIL−12およびIL−4の存在下でのこれらの細胞の慢性活性化は、GPR−9−6の発現を誘導しなかった(図4H)。しかしながら、予期した通り、CXCR3は明らかにTH1リンパ球においてアップレギュレートされたが(図4F)、粘膜部位へのリンパ球輸送(trafficking)に利用されるインテグリン、α4β7は、TH1およびTH2の両方のリンパ球においてアップレギュレートされた(図4G)。
GPR−9−6を発現するCD4リンパ球の少量サブセットを、三色染色によってより詳細に調べた(図6A〜6F)。GPR−9−6を発現するCD4リンパ球は主に記憶表現型であり、最も高レベルのGPR−9−6を発現する細胞はすべて記憶表現型であった。興味深いことに、皮膚に輸送される記憶CLA+veCD4リンパ球は、GPR−9−6を発現しなかった。対照的に、粘膜部位に輸送される記憶α4β7highCD4リンパ球のサブセットは、明らかにGPR−9−6を発現した。αEβ7の発現により定義される記憶CD4リンパ球のサブセットもまた、GPR−9−6陽性サブセットとGPR−9−6陰性サブセットに明確に細分された。GPR−9−6highCD4リンパ球は、末梢リンパ節への輸送に関与するホーミングレセプターであるCD62Lを発現しなかったが、GPR−9−6dullCD62L+veリンパ球の少量サブセットは明白であった。
試験したすべての公表されたケモカインのうち、TECKのみがGPR−9−6/L1.2トランスフェクタントの化学走性を誘導する能力を有することがわかった(図8A)。MCP−1−4、MIP−1α、MIP−1β、エオタキシン(eotaxin)−1、エオタキシン−2、RANTES、I−309、TARC、MDC、MIP4、SLC、HCC1、フラクタルカイン(fractalkine)、リンフォタクチン(lymphotactin)、MIG、IP−10、ITAC、ADEC、IL−8、gro−α、gro−β、gro−γ、ロイコタクチン(leukotactin)、SDF−1α、SDF−1β、MIP3およびMIP4はすべて、GPR−9−6/L1.2トランスフェクタントの化学走性を誘導しえないとわかった。L1.2/GPR−9−6トランスフェクタントのTECK誘導性化学走性は、mAb 3C3によって阻害されたが、抗CCR3 mAb 7B11には阻害されなかった(図8B)。TECKは、試験したその他のトランスフェクタント(CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7およびCXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、データ示さず)のいずれにも作用しなかった。興味深いことに、TECKはまた、GPR−9−6を発現するT細胞株MOLT−4(図8D)およびMOLT−13(図8F)に作用することがわかった(表1)。TECKは、GPR−9−6を発現しないSKW3(図8E)などの他の細胞株に関しては化学走性ではなかった。T細胞株MOLT−4を用いると、TECK誘導性化学走性は、百日咳毒素により阻害されることが示された(図8C)。さらに、抗GPR−9−6mAb 3C3は、MOLT−13細胞のTECKへの化学走性をブロックしたが、該細胞のSDF1α誘導性化学走性に対する影響はなかった(図8F)。カルシウム動員実験では、TECKはまた、MOLT−4などのGPR−9−6+ve細胞株におけるCa2+フラックスを誘導することがわかったが(図9A〜9C)、該細胞が関連レセプターを発現しないMDCなどのケモカインは効果がなかった。
GPR−9−6の粘膜ホーミングリンパ球上での発現により、リンパ様組織および粘膜組織におけるTECK転写物およびGPR−9−6転写物の分布を調べた(図12A〜12B)。TECKは胸腺および小腸で選択的に発現されたが(図12A)、GPR−9−6は、胸腺は高レベルで発現され、脾臓および末梢血白血球での発現は弱かった(図12B)。GPR−9−6転写物は、小腸におけるノーザンブロット解析では検出されなかったが、GPR−9−6メッセージは、より感度の高いRT−PCR技術を用いて小腸、胸腺、リンパ節および脾臓で検出された(図12C)。TECKおよびGPR−9−6の両方のメッセージは、脳でも結腸でも検出されなかった。他のノーザンブロットでは、TECKおよびGPR−9−6は、TH1、TH2、Tr1(Grouxら、Nature 389:737-742(1997))リンパ球、LAK細胞、単球、CD34由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、星状細胞、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および肺静脈内皮細胞(PUVEC)では検出されなかった(データ示さず)。最終的に、GPR−9−6転写物は、mAb 3C3で染色し、該mAbの特異性をさらに検証することにより、先にGPR−9−6+であることが示された細胞株にのみ存在することが示された(図12B)。
GPR−9−6が主に記憶α4β7highCD4リンパ球で発現されることから、α4β7を発現しないか、中レベルまたは高レベルのα4β7を発現するCD45RA-ve記憶CD4およびCD8リンパ球を単離した。α4β7high記憶CD8リンパ球およびα4β7+veCLA-ve記憶CD4リンパ球のみがTECKに対して化学走性を示した(図13A〜13B)。
数種の異なる接着分子が、末梢リンパ節などの別の生理的位置(Gallitin, W.M.ら、Nature, 304:30-34(1983))、Peyers Patches (Hamman, A.ら、J. Immunol., 152:3282-3292(1994); Andrew, D.P.ら、Eur. J. Immunol., 26:897-905(1996))および炎症部位(Frenette, P.S.ら、Cell, 84:563-574(1996); Tietz, W.Y. ら、J. Immunol., 161(2):963-970(1998); Picker, L.J.ら、J. Immunol., 145:3247-3255(1990))へのリンパ球サブセットの輸送に関与している。これらのリンパ球サブセットで発現される特異的ケモカインレセプターは、白血球の活性化、停止(arrest)および経内皮(transendothelial)移動を媒介する領域で発現されるケモカインと相互作用しうると考えられる。したがって、ある種の接着分子の発現により規定されるCD4サブセットはまた、これらの部位へのリンパ球の輸送に重要な公知のオーファンケモカインレセプターまたはまだ発見されていないケモカインレセプターを発現しうる。本明細書に記載した研究は、粘膜部位への記憶CD4およびCD8リンパ球サブセットの選択的輸送に関与しうる、かかるケモカインレセプターの一種に関連する。
本明細書に記載のように、GPR−9−6発現は、mAb 3C3を用いてMOLT−4およびMOLT−13細胞上で検出された(表1)。MOLT細胞株は、急性T細胞リンパ芽球性白血病(ATL)と診断された患者由来のヒトT細胞株である。CEM、PEER、HUT78、PM1、SKW3およびJURKATを含む他のT細胞白血病細胞株はGPR−9−6を発現しなかった。さらなる研究では、T細胞株がTECK誘導性化学走性を示す能力をインビトロ化学走性アッセイで評価した。ALT細胞、MOLT−4およびMOLT−13は、TECK誘導性化学走性を示したが、他のT細胞株(CEM、PEER)では示さなかった。
リンパ球単離
ヒト腸の上皮および固有層由来のリンパ球を上述(Zabal, B.A. ら、J. Exp. Med.,190:1241-1256(1999))のようにして単離した。簡単には、腸の小片を切り開き、平らにして氷冷HBSSで洗浄した。はさみで粘膜から漿膜を分離し、廃棄した。粘膜を細片に切り刻み、冷0.15%(w/v)HBSS中ジチオトレイトール(dithiolthreitol)(DTT/HBSS)とともに30分間インキュベートした。次いで、冷HBSSで粘膜を洗浄し、粘液を除去した。次いで、粘膜細片を冷1mM HBSS中EDTA中、攪拌下で90分間インキュベートし、上皮および上皮内リンパ球(IEL)を取り出した。上皮細胞が該細片から脱落しなくなるまで、攪拌下、1mM EDTA含有HBSS中でのインキュベーションを数回繰り返した。残った粘膜細片を50メッシュの漉し器(Sigma. St. Louis, MO)に通して破砕し、固有層リンパ球(LPL)を単離した。
単離したリンパ球をFACSバッファー中に≦1×106mlの濃度で再懸濁した。非特異的抗体結合をウマIgG(Sigma. St. Louis, MO)を用いてブロックした。非結合抗GPR−9−6(CCR9)抗体(mAb 3C3)を、ビオチニル化ウマ抗マウスIgG二次抗体(Vector Laboratories, Burlingame, CA)およびストレプトアビジンPerCP(Phamingen, San Diego, CA)を用いて検出した。
孔径5μmのポリカーボネート膜を備えた24ウェルTranswellプレート(Corning Costar, Cambridge, MA)を用い、化学走性アッセイを行った。簡単には、0.5%BSAを有するRPMI1640中に希釈した600μlのTECKをTranswellプレートの底部チャンバに入れ、100μlの細胞(IELは1×106、LPLは5×105)を各インサートに入れた。抗体阻害実験のために、インサートをウェルに加える前に、IELまたはLPLを40μg/mlのmAb 3C3、対照マウスIgG2b(クローン49.2、PharMingen, San Diego, CA)とともに、または培地のみで10分間4℃でインキュベートした。次いで、プレートを37℃、5%CO2中で3時間インキュベートした。アッセイ中に下側チャンバに移動した細胞の数をFACS解析により測定し、40秒間隔の間で小リンパ球の光散乱プロフィル特性により検出器を通過した数を計測した。100%細胞遊走に相当する数は、投入細胞懸濁液をFACSにより40秒間計測したときに記録された数の6分の1に等しかった。
GPR−9−6(CCR9)発現は、フローサイトメトリーにより末梢血白血球の少量サブセットのみで検出された。対照的に、実質的にすべてのIELおよびLPLが高レベルのGPR−9−6を発現した(図16A〜16C)。さらに、インビトロ化学走性アッセイにより、IELおよびLPLの両方がTECK誘導性化学走性を示し、これは抗GPR−9−6抗体(mAb 3C3)により阻害されうるが、アイソタイプ対照抗体(IgG2b)によっては阻害されえないことが明らかになった(図17Aおよび17B)。したがって、GPR−9−6(CCR9)は、IELおよびLPLにより発現されるTECKの主な生理的レセプターである。データは、腸の上皮内での白血球の局所輸送がTECKとGPR−9−6(CCR9)との相互作用に媒介されることを示す。
C57/Blackマウスを、安定にGPR−9−6を発現するトランスフェクトL1.2細胞(GPR−9−6/L1.2)1000万個で免疫した(実施例1参照)。免疫する前に、トランスフェクトL1.2細胞をPBS(Sigma )中のマイトマイシンC(50μg/ml)で処理した。3週間後、マイトマイシンCで処理したGPR−9−6/L1.2トランスフェクタントでマウスを再度免疫した。その後、マウスをGPR−9−6/L1.2トランスフェクタント1000万個で3週間ごとに免疫した。マウスは、GPR−9−6/L1.2トランスフェクタントで最低4回免疫した。ハイブリドーマ形成のため、最後の免疫から3〜4日後の免疫化マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞をSP2/0骨髄腫細胞に融合した。GPR−9−6(CCR9)に特異的に結合する(すなわちGPR−9−6/L1.2トランスフェクタントを染色するが、他のケモカインレセプターを発現するL1.2細胞トランスフェクタントは染色しない)抗体を産生するハイブリドーマをFACS解析により同定した。
Balb/cマウスを、まず完全フロイントアジュバント(Sigma, F 5881)中10μgのヒトTECK(Peprotech, Rocky Hill, NJ 330-45)で腹腔内免疫した。3週間後、マウスを、不完全フロイントアジュバント(Sigma, F 5506)中10μgのヒトTECK(Peprotech, Rocky Hill, NJ 330-45)で腹腔内免疫した。その後、PBS中10μgのTECKで3週間ごとにマウスを腹腔内免疫した。各マウスは最低4回免疫した。ハイブリドーマ形成のため、最後の免疫から3〜4日後の免疫化マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞をSP2/0骨髄腫細胞に融合した。TECKに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを、2μg/mlのTECKでコーティングしたプレート用いてELISAにより同定した。次いで、インビトロアッセイにおいて、抗TECK抗体をGPR−9−6/L1.2トランスフェクタントのTECK誘導性(150nM)化学走性を阻害する能力について試験した。
Qiagen Mini Kitを用い、胸腺および炎症小腸または非炎症小腸のヒト試料からRNAを調製した。該RNAを逆転写し、BAZ203(配列番号:6)およびBAZ204(配列番号:7)を用い、記載(実施例1参照)のようにしてPCRによりTECKのコード領域を増幅した。PCR産物を酵素BamH1およびXbalで切断し、pBluescript II KSにライゲートした。pBluescript II(M13およびT3)内の配列にアニーリングするプライマーを用いて挿入物のシークエンシングを行った。シークエンシングデータにより、異なる形態のTECKがこれらの組織で発現されることが明らかになった。トレオニン(T)またはメチオニン(M)のいずれかを有するアミノ酸104の多型が見られた(配列番号:9)。アミノ酸109(アラニン)の欠損をもたらす塩基326〜328のフレームシフト欠失を有するスプライス変種も見られた。
TECKは小腸の表皮細胞により高度に発現される
インサイチューハイブリダイゼーション
合成オリゴヌクレオチド5プライムプライマー(t aag gat ccg caa ggt gcc ttt gaa gac tgc t;配列番号:12)およびオリゴヌクレオチド3プライムプライマー(caa gaa ttc tta att gtt ctt tct ggg cat;配列番号:13)を用いて、胸腺からRT−PCRにより調製されたマウスcDNAのプールからTECKプローブをまず増幅し、BamH1およびEcoR1によりサブクローニングした。2回目のPCR増幅工程を、RNAポリメラーゼ部位を導入するために、合成オリゴヌクレオチドプライマーm_TECK T3(aat taa ccc tca cta aag gga act gtg gct ttt tgc ctg c;配列番号:14)およびm_TECK T7(taa tac gac tca cta tag ggt gtt ggt ctt tct ggg cat c;配列番号:15)を用いて行った。DIG RNA Labeling Kit/Genius 4 Kit(Roche Molecular Biochemicals)を用い、センスおよびアンチセンスジゴキシゲニン標識プローブを合成した。
インサイチューハイブリダーゼーションを用いてマウス腸におけるTECK発現の細胞性部位を直接評価した。TECK発現は、小腸の絨毛およびリーベルキューン陰窩の上皮に局在した。絨毛での発現は、基底部で最大であり、より低レベルのTECKハイブリダイゼーションが絨毛の上部に向かって検出された。TECKの発現は小腸に接着したパイアー斑(PP)では検出されなかった(図24A〜24C)。
〔1〕 哺乳類GPR−9−6に結合し、該GPR−9−6へのリガンドの結合を阻害する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔2〕 該哺乳類GPR−9−6がヒトGPR−9−6である、前記〔1〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔3〕 該リガンドがTECKである、前記〔1〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔4〕 GPR−9−6への該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合が、配列番号:3のアミノ酸配列からなるペプチドにより阻害されうる、前記〔1〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔5〕 GPR−9−6への該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合がmAb 3C3により阻害されうる、前記〔1〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔6〕 該抗体または抗原結合性フラグメントが、mAb 3C3と同一または同様のエピトープに結合する、前記〔5〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔7〕 GPR−9−6への該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合がmAb GPR96−1により阻害されうる、前記〔1〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔8〕 該抗体または抗原結合性フラグメントが、mAb GPR−9−6と同一または同様のエピトープに結合する、前記〔7〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔9〕 マウスハイブリドーマ3C3により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔10〕 哺乳類GPR−9−6に結合し、該GPR−9−6へのリガンドの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞。
〔11〕 該哺乳類GPR−9−6がヒトGPR−9−6である、前記〔10〕記載の単離された細胞。
〔12〕 該リガンドがTECKである、前記〔11〕記載の単離された細胞。
〔13〕 該単離された細胞が、該抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする1またはそれ以上の外来核酸分子を含有する不死化B細胞、ハイブリドーマおよび組換え細胞からなる群より選択されてなる、前記〔12〕記載の単離された細胞。
〔14〕 マウスハイブリドーマ3C3。
〔15〕 a)生物学的試料と、哺乳類GPR−9−6または該レセプターの一部に結合し、レセプターへのリガンドの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを哺乳類GPR−9−6またはその一部への該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程;および
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程;
を含み、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該レセプターまたは該レセプターの一部の存在を示す、生物学的試料中の哺乳類GPR−9−6またはその一部の検出方法。
〔16〕 生物学的試料がヒト起源である、前記〔15〕記載の方法。
〔17〕 抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
a)mAb 3C3;
b)哺乳類GPR−9−6への結合に関してmAb 3C3と競合しうる抗体;
c)哺乳類GPR−9−6またはその一部に結合する(a)または(b)の抗原結合性フラグメント;および
d)前述の組み合わせ、
からなる群から選択される、前記〔16〕記載の方法。
〔18〕 抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
a)mAb GPR96−1;
b)哺乳類GPR−9−6への結合に関してmAb GPR96−1と競合しうる抗体;
c)哺乳類GPR−9−6またはその一部に結合する(a)または(b)の抗原フラグメント;および
d)前述の組み合わせ、
からなる群より選択される、前記〔16〕記載の方法。
〔19〕 a)参照薬剤、
b)試験薬剤、および
c)機能的な哺乳類GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種を含有する組成物を、該GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種への該参照薬剤の結合に適した条件下で組み合わせる工程;ならびに
該参照薬剤と該GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種との複合体の形成を検出または測定する工程を含み、適切な対照と比較した該複合体の形成の減少が、該試験薬剤が該GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種に結合することを示す、哺乳類GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種に結合する薬剤を検出および同定する方法。
〔20〕 該参照薬剤が、放射性同位体、エピトープ、アフィニティ標識、酵素、蛍光群および化学発光群からなる群より選択される標識で標識化される、前記〔19〕記載の方法。
〔21〕 該参照薬剤がTECKである、前記〔19〕記載の方法。
〔22〕 該参照薬剤が該GPR−9−6に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔19〕記載の方法。
〔23〕 機能的な哺乳類GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種を含有する該組成物が哺乳類GPR−9−6を発現する細胞である、前記〔19〕記載の方法。
〔24〕 該細胞が組換え細胞である、前記〔23〕記載の方法。
〔25〕 該細胞が細胞株である、前記〔23〕記載の方法。
〔26〕 該細胞がMOLT−4およびMOLT−13からなる群より選択される、前記〔25〕記載の方法。
〔27〕 機能的な哺乳類GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種を含有する該組成物が、哺乳類GPR−9−6またはそのリガンド結合性変種を発現する細胞の膜調製物である、前記〔19〕記載の方法。
〔28〕 a)試験対象の薬剤、該GPR−9−6のリガンドまたはプロモーターおよび該GPR−9−6を発現する細胞を、リガンド誘導性応答またはプロモーター誘導性応答を検出するのに適した条件下で組み合わせる工程;および
b)該応答を阻害する試験化合物の能力を測定する工程、
を含み、該薬剤によるリガンド誘導性応答またはプロモーター誘導性応答の阻害が、該薬剤がインヒビターであることの指標である、哺乳類GPR−9−6レセプターのインヒビターを検出または同定する方法。
〔29〕 該細胞がヒトGPR−9−6を発現する組換え細胞である、前記〔28〕記載の方法。
〔30〕 該リガンドまたはプロモーターがTECKである、前記〔29〕記載の方法。
〔31〕 該応答が化学走性またはCa2+フラックスである、前記〔28〕記載の方法。
〔32〕 被験体に哺乳類GPR−9−6機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、炎症性疾患を有する被験体の治療方法。
〔33〕 該炎症性疾患がクローン病または結腸炎である、前記〔32〕記載の方法。
〔34〕 該アンタゴニストが哺乳類GPR−9−6へのリガンドの結合を阻害する、前記〔32〕記載の方法。
〔35〕 該リガンドがTECKである、前記〔34〕記載の方法。
〔36〕 該アンタゴニストが哺乳類GPR−9−6またはその抗原結合性フラグメントに結合する抗体である、前記〔34〕記載の方法。
〔37〕 被験体にGPR−9−6機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、被験体における白血球のGPR−9−6媒介性ホーミングの阻害方法。
〔38〕 該アンタゴニストが、GPR−9−6へのリガンドの結合を阻害する、前記〔37〕記載の方法。
〔39〕 該リガンドがTECKである、前記〔38〕記載の方法。
〔40〕 該アンタゴニストが、GPR−9−6に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔39〕記載の方法。
〔41〕 被験体にGPR−9−6機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、被験体における粘膜組織への白血球のGPR−9−6媒介性ホーミングの阻害方法。
〔42〕 該被験体にGPR−9−6機能のアンタゴニストの有効量を投与する工程を含む、炎症性腸疾患を有する患者の治療方法。
〔43〕 該アンタゴニストがGPR−9−6へのリガンドの結合を阻害する、前記〔42〕記載の方法。
〔44〕 該リガンドがTECKである、前記〔43〕記載の方法。
〔45〕 該アンタゴニストがGPR−9−6に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔44〕記載の方法。
〔46〕 GPR−9−6を発現する細胞とそれに結合する薬剤とを接触させ、それにより該GPR−9−6の機能を調節する工程を含む、GPR−9−6機能の調節方法。
〔47〕 該薬剤がGPR−9−6の機能を阻害しうる、前記〔46〕記載の方法。
〔48〕 該薬剤が抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔47〕記載の方法。
〔49〕 該機能が、リガンド結合、リガンド誘導性化学走性およびリガンド誘導性Ca2+フラックスからなる群より選択される、前記〔48〕記載の方法。
〔50〕 該リガンドがTECKである、前記〔49〕記載の方法。
〔51〕 a)哺乳類GPR−9−6または該レセプターの一部に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントがレセプターへのリガンドの結合を阻害する;および、
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類GPR−9−6またはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な1またはそれ以上の補助試薬、
を含有してなる、生物学的試料中の哺乳類GPR−9−6またはその一部の存在の検出に使用するための試験キット。
〔52〕 抗体が、
a)mAb 3C3;
b)哺乳類GPR−9−6への結合に関してmAb 3C3と競合しうる抗体;
c)哺乳類GPR−9−6またはその一部に結合する(a)または(b)の抗原結合性フラグメント;および
d)前述の組み合わせ、
からなる群より選択されてなる、前記〔51〕記載の試験キット。
〔53〕 抗体が、
a)mAb GPR96−1;
b)哺乳類GPR−9−6への結合に関してmAb GPR96−1と競合しうる抗体;
c)哺乳類GPR−9−6またはその一部に結合する(a)または(b)の抗原結合性フラグメント;および
d)前述の組み合わせ
からなる群より選択されてなる、前記〔51〕記載の試験キット。
〔54〕 哺乳類TECKに結合し、レセプターへの該TECKの結合を阻害する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔55〕 該哺乳類TECKがヒトTECKである、前記〔54〕記載の抗体またはその抗原フラグメント。
〔56〕 該レセプターがGPR−9−6である、前記〔54〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔57〕 TECKへの該抗体または該抗原結合性フラグメントの結合が、mAb 11.3.1および/またはmAb 16.3.1により阻害されうる、前記〔54〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔58〕 該抗体または抗原結合性フラグメントが、mAb 11.3.1と同一または同様のエピトープに結合する、前記〔57〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔59〕 該抗体または抗原結合性フラグメントが、mAb 16.3.1と同一または類似のエピトープに結合する、前記〔57〕記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
〔60〕 マウスハイブリドーマGPR96−1により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔61〕 マウスハイブリドーマGPR96−1。
〔62〕 マウスハイブリドーマ11.3.1により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔63〕 マウスハイブリドーマ11.3.1。
〔64〕 マウスハイブリドーマ16.3.1により産生された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
〔65〕 マウスハイブリドーマ16.3.1。
〔66〕 哺乳類TECKに結合し、レセプターへの該TECKの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生する単離された細胞。
〔67〕 該哺乳類TECKがヒトTECKである、前記〔66〕記載の単離された細胞。
〔68〕 レセプターがGPR−9−6である、前記〔66〕記載の単離された細胞。
〔69〕 a)生物学的試料と、哺乳類TECKまたはその一部に結合し、レセプターへのTECKの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを、哺乳類TECKまたはその一部への該抗体またはその抗原フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程;および
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程;
を含み、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該レセプターまたは該レセプターの一部の存在を示す、生物学的試料中の哺乳類TECKまたはその一部の検出方法。
〔70〕 a)哺乳類TECKまたは該レセプターの一部に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントがレセプターへのTECKの結合を阻害する;および
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類TECKまたはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な1またはそれ以上の補助試薬、
を含有してなる、生物学的試料中の哺乳類TECKまたはその一部の存在の検出に使用するための試験キット。
〔71〕 GPR−9−6機能のアンタゴニストの有効量を被験体に投与する工程を含む、癌を有する被験体の治療方法。
〔72〕 該アンタゴニストが、GPR−9−6に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、前記〔62〕記載の方法。
〔73〕 GPR−9−6に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの有効量を被験体に投与する工程を含み、該抗体またはフラグメントが補体を活性化しうる、癌を有する被験体の治療方法。
〔74〕 免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質の有効量を被験体に投与する工程を含み、該免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質が、さらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合したGPR−9−6に結合する抗体の少なくとも抗原結合部分を含有する、癌を有する被験体の治療方法。
〔75〕 該さらなる治療薬剤が細胞傷害剤である、前記〔74〕記載の方法。
〔76〕 さらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合したGPR−9−6に結合する抗体の抗原結合部分を少なくとも含有する免疫複合体。
〔77〕 さらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合したGPR−9−6に結合する抗体の抗原結合部分を少なくとも含有し、該抗体の抗原結合部分および該さらなる治療薬剤が連続するポリペプチドの一部である、抗原結合性融合タンパク質。
Claims (30)
- 哺乳類GPR−9−6に結合し、該GPR−9−6へのリガンドの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該リガンドがTECKであり、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されたmAb GPR96−1と競合するものであり、ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは、細胞表面上に発現している配列番号:2からなるポリペプチドに結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 該哺乳類GPR−9−6がヒトGPR−9−6である、請求項1記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- a)マウスハイブリドーマ3C3(ATCC受託番号HB−12653)により産生されるmAb 3C3、
b)マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されるmAb GPR96−1、
c)マウスハイブリドーマ11.3.1(ATCC受託番号PTA−1469)により産生されるmAb 11.3.1、
d)マウスハイブリドーマ16.3.1(ATCC受託番号PTA−1468)により産生されるmAb 16.3.1、または
e) a)、b)、c)もしくはd)の抗原結合性フラグメント、
をコードする核酸であって、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントである、核酸。 - 請求項3記載の核酸を含むベクター。
- a)生物学的試料と、哺乳類GPR−9−6または該レセプターの一部に結合し、該レセプターへのTECKの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを、哺乳類GPR−9−6またはその一部への該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程;および
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程;
を含む、生物学的試料中の哺乳類GPR−9−6またはその一部の検出方法であって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該レセプターまたは該レセプターの一部の存在を示し、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されたmAb GPR96−1と競合するものであり、ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは、細胞表面上に発現している配列番号:2からなるポリペプチドに結合する、方法。 - 生物学的試料がヒト起源のものである、請求項5記載の方法。
- ヒトTECKに結合し、レセプターへの該TECKの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該レセプターがGPR−9−6であり、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマ11.3.1(ATCC受託番号PTA−1469)により産生されたmAb 11.3.1またはマウスハイブリドーマ16.3.1(ATCC受託番号PTA−1468)により産生されたmAb 16.3.1と競合するものであり、該抗体は、哺乳類GPR−9−6を発現する細胞のTECK誘導性化学走性を阻害し、ヒトTECKは、配列番号:9または配列番号:11からなる配列を有する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 該mAb 11.3.1および該mAb 16.3.1が、配列番号:11からなるポリペプチドに結合する、請求項7記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- 抗体の発現に適した条件下で単離された細胞を維持する工程を含む、抗体を産生する方法であって、該単離された細胞は、
a)マウスハイブリドーマ3C3(ATCC受託番号HB−12653)により産生されるmAb 3C3、
b)マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されるmAb GPR96−1、
c)マウスハイブリドーマ11.3.1(ATCC受託番号PTA−1469)により産生されるmAb 11.3.1、
d)マウスハイブリドーマ16.3.1(ATCC受託番号PTA−1468)により産生されるmAb 16.3.1、または
e) a)、b)、c)もしくはd)の抗原結合性フラグメント
を産生し、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’) 2 フラグメントまたはFvフラグメントであり、該単離された細胞が、ハイブリドーマおよび組換え細胞からなる群より選択され、該ハイブリドーマが、マウスハイブリドーマ3C3(ATCC受託番号HB−12653)、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)、マウスハイブリドーマ11.3.1(ATCC受託番号PTA−1469)またはマウスハイブリドーマ16.3.1(ATCC受託番号PTA−1468)を他の細胞と融合することによって得られる、方法。 - 該抗体の回収および精製をさらに含む、請求項9記載の方法。
- 炎症性疾患を有する被験体を治療するための医薬の製造における請求項1〜2または7〜8いずれか1項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの使用。
- 被験体における白血球のGPR−9−6媒介性ホーミングを阻害するための医薬の製造における請求項1〜2または7〜8いずれか1項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの使用。
- 該炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項11記載の使用。
- 該炎症性腸疾患がクローン病または結腸炎である、請求項13記載の使用。
- 該被験体がヒトである、請求項11〜14いずれか記載の使用。
- 該抗体または抗原結合性フラグメントが、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または前記いずれかの抗原結合性フラグメントである、請求項11〜15いずれか記載の使用。
- 被験体における粘膜組織への白血球のGPR−9−6媒介性ホーミングを阻害するための医薬の製造における、請求項7または8記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用。
- GPR−9−6を発現する細胞と該GPR−9−6に結合するインヒビターとを接触させ、それにより該GPR−9−6の機能を阻害する工程を含む、GPR−9−6機能のインビトロ阻害方法であって、該インヒビターが、請求項1または2記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントである、インビトロ阻害方法。
- 該インヒビターがGPR−9−6の機能を阻害しうる、請求項18記載の方法。
- 該機能が、TECK結合、TECK誘導性化学走性およびTECK誘導性Ca2+フラックスからなる群より選択される、請求項19記載の方法。
- a)哺乳類GPR−9−6または該レセプターの一部に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントが該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、該リガンドがTECKである;および
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類GPR−9−6またはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な1またはそれ以上の補助試薬
を含んでなる、生物学的試料中の哺乳類GPR−9−6またはその一部の存在の検出に使用するための試験キットであって、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されたmAb GPR96−1と競合するものであり、ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは、細胞表面上に発現している配列番号:2からなるポリペプチドに結合する、試験キット。 - 該哺乳類GPR−9−6がヒトGPR−9−6である、請求項21記載の試験キット。
- a)哺乳類TECKまたはその一部に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合性フラグメント、ここで該抗体またはその抗原結合性フラグメントがレセプターへのTECKの結合を阻害し、該レセプターがGPR−9−6である;および
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントと該哺乳類TECKまたはその一部との複合体の存在を検出するのに適切な1またはそれ以上の補助試薬
を含んでなる、生物学的試料中の哺乳類TECKまたはその一部の存在の検出に使用するための試験キットであって、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントであり、該抗体または該抗原結合性フラグメントは配列番号:11からなるポリペプチドに結合し、該抗体または該抗原結合性フラグメントは、マウスハイブリドーマ11.3.1(ATCC受託番号PTA−1469)により産生されたmAb 11.3.1またはマウスハイブリドーマ16.3.1(ATCC受託番号PTA−1468)により産生されたmAb 16.3.1と競合するものであり、該抗体は、哺乳類GPR−9−6を発現する細胞のTECK誘導性化学走性を阻害する、試験キット。 - 癌を有する被験体を治療するための医薬の製造における請求項1〜2または7〜8いずれか1項記載の抗体または抗原結合性フラグメントの使用。
- 癌を有する被験体を治療するための医薬の製造におけるGPR−9−6に結合する抗体の使用であって、該抗体が、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつ補体を活性化し得、該リガンドがTECKであり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号:2からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されたmAb GPR96−1と競合するものである、使用。
- 癌を有する被験体を治療するための医薬の製造における免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質の使用であって、該免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質が、GPR−9−6に結合し、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつさらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合している抗体の少なくとも抗原結合性部分を含み、該リガンドがTECKであり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号:2からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されたmAb GPR96−1と競合するものであり、該抗原結合性部分が、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントである、使用。
- 該さらなる治療薬剤が細胞傷害剤である、請求項26記載の使用。
- GPR−9−6に結合し、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつさらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合している抗体の少なくとも抗原結合性部分を含む、免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質であって、該リガンドがTECKであり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号:2からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されたmAb GPR96−1と競合するものであり、該抗原結合性部分が、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントである、免疫複合体または抗原結合性融合タンパク質。
- GPR−9−6に結合し、該レセプターへのリガンドの結合を阻害し、かつさらなる治療薬剤に直接的または間接的に結合している抗体の少なくとも抗原結合性部分を含む、抗原結合性融合タンパク質であって、該リガンドがTECKであり、該抗体の抗原結合性部分および該さらなる治療薬剤が連続するポリペプチドの一部であり、該抗体が細胞表面上に発現している配列番号:2からなるポリペプチドに結合し、該抗体は、マウスハイブリドーマGPR96−1(ATCC受託番号PTA−1470)により産生されたmAb GPR96−1と競合するものであり、該抗原結合性部分が、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントである、抗原結合性融合タンパク質。
- a)生物学的試料と、哺乳類TECKまたはその一部に結合し、レセプターへのTECKの結合を阻害する抗体またはその抗原結合性フラグメントとを、哺乳類TECKまたはその一部への該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程、ここで、該レセプターがGPR−9−6である;および
b)該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合を検出する工程;
を含む、生物学的試料中の哺乳類TECKまたはその一部の検出方法であって、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの結合が、該TECKまたは該TECKの一部の存在を示し、TECKレベルの上昇は、炎症性の疾患または状態を示し、該抗原結合性フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントであり、該抗体が、マウスハイブリドーマ11.3.1(ATCC受託番号PTA−1469)により産生されたmAb 11.3.1またはマウスハイブリドーマ16.3.1(ATCC受託番号PTA−1468)により産生されたmAb 16.3.1と競合するものであり、該抗体は、哺乳類GPR−9−6を発現する細胞のTECK誘導性化学走性を阻害し、哺乳類TECKは、配列番号:9または配列番号:11からなる配列を有する、検出方法。
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