JP5931584B2 - フジツボ類幼生用フェロモントラップとその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、フジツボ類幼生用フェロモントラップとその製造方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、代表的な汚損性付着生物であるフジツボ類幼生を、捕捉・回収するのに好適なフジツボ類幼生用フェロモントラップとその製造方法に関する。
フジツボ類は臨海発電施設の冷却水路系における代表的な汚損性付着生物である。冷却水路系に付着したフジツボ類は、冷却水の流動抵抗の増加に伴う流量の低下、管の閉塞や腐食促進等の問題を引き起こす（非特許文献１及び２を参照）。
フジツボ類の付着を防止するために、塩素等の薬剤注入が多くの発電所で行われている。しかしながら、薬剤の有害性から、放出口で検出されないこと等といった使用量制限があり、十分な効果が得られない場合がある（非特許文献３を参照）。また、亜酸化銅系塗料も薬剤注入と共に広く用いられているが、環境中に残留した成分が生物に悪影響を与える可能性があるとして、国外においては一部で規制の動きも出始めている。
ところで、フジツボ類のキプリス幼生の同種認識には, フェロモンが重要な役割を果たしている可能性が指摘されている（非特許文献５及び６を参照）。このフェロモンをフジツボ類幼生に対するフェロモントラップ、即ちフェロモンを誘引源としてフジツボ類幼生を捕獲する装置として応用することができれば、臨海発電所の冷却水路系における付着被害を大幅に低減できる可能性がある。
フジツボ類のキプリス幼生が付着、変態して幼体となる一連の過程は着生と称されているが、この着生を誘起するフェロモン(着生フェロモン)には岸壁等の基盤上に吸着した状態で幼生の着生を誘起する基盤吸着性のものと、海水中に拡散した状態で効果を発現する拡散性のものの２種類が存在すると考えられている（非特許文献７を参照）。
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海水中に拡散した状態で効果を発現する拡散性の着生フェロモンタンパク質をフェロモントラップに用いることによって、海水中を浮遊するフジツボ幼生を広範囲に誘引して捕捉することができる極めて有効なフェロモントラップの提供が可能になるものと考えられる。そして、このようなフェロモントラップの実用化に際しては、魚類等からの捕食による破壊が引き起こされることなく海水中で安定に存在できる十分な強度の確保と、拡散性着生フェロモンタンパク質を安定に保持しながらも拡散させることができる機能とを両立することのできる担体の提供が望まれる。
本発明は、海水中での安定性の保持と魚類等からの捕食による破壊の防止のための十分な強度の確保と、フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を安定に保持しながらも拡散させることができる機能とを両立することのできる担体により構成されるフジツボ類幼生用フェロモントラップとその製造方法を提供することを目的とする。
かかる課題を解決するため、本願発明者は、１０〜６０ＭＰａという非常に高い圧縮破断応力を示すことで知られている超高強度の親水性ダブルネットワークゲル（Gong JP, Katsuyama Y, Kurokawa T, Osada Y (2003) Double-network hydrogels with extremely high mechanical strength. Adv. Mater. 15, 1155-1158.）に注目し、この親水性ダブルネットワークゲルと本願発明者がタテジマフジツボについて鋭意研究した結果得られた拡散性着生フェロモンタンパク質とにより、フェロモントラップを作製することについて鋭意研究を行った。その結果、親水性ダブルネットワークゲルの製造工程における硬脆性ゲル調製の際に拡散性着生フェロモンタンパク質を添加することで、拡散性着生フェロモンタンパク質を安定に保持しながらも拡散させることができる機能を親水性ダブルネットワークゲルに付与でき、しかも親水性ダブルネットワークゲルの強度低下も生じないことを知見した。一方で、親水性ダブルネットワークゲルの製造工程における硬脆性ゲル調製の後に拡散性着生フェロモンタンパク質を添加しても、拡散性着生フェロモンタンパク質を安定に保持しながらも拡散させることができる機能を親水性ダブルネットワークゲルに付与できず、しかも親水性ダブルネットワークゲルの強度低下を引き起こす可能性があることを知見した。本願発明者は、これらに知見に基づいてさらに種々検討を重ね、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップは、硬脆性ゲル及び軟伸性ゲルの混合相と軟伸性ゲルの単相からなる親水性ダブルネットワークゲルの、少なくとも混合相側にフジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を含むものとしている。
ここで、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップにおいて、拡散性着生フェロモンタンパク質は、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体により産生されるタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものとすることが好ましい。
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
また、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップにおいて、拡散性着生フェロモンタンパク質は、例えば以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載のタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものとすることが好ましい。
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質
さらに、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップにおいて、硬脆性ゲルを構成する第一のポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸とＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋重合体であり、第二のポリマーがアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋重合体であることが好ましい。
次に、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法は、以下の工程（１）〜（３）を含むようにしている。
（１）フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質、第一のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化して硬脆性ゲルを調製する工程
（２）硬脆性ゲルを粉砕して微粒子を得る工程
（３）微粒子、第二のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化する工程
（１）フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質、第一のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化して硬脆性ゲルを調製する工程
（２）硬脆性ゲルを粉砕して微粒子を得る工程
（３）微粒子、第二のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化する工程
ここで、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法において、拡散性着生フェロモンタンパク質は、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体により産生されるタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものとすることが好ましい。
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
また、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法において、拡散性着生フェロモンタンパク質は、例えば以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載のタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものとすることが好ましい。
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質
さらに、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法において、第一のモノマーが２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸であり、第二のモノマーがアクリルアミドであり、架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドであることが好ましい。
本発明によれば、親水性ダブルネットワークゲルに、フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を安定に保持しながらも拡散させることができる機能を付与することが可能となる。しかも、親水性ダブルネットワークゲルの特徴である強度の高さを、フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を含ませない場合と同等のレベルで維持することができるので、魚類等からの捕食による破壊が引き起こされることなく海水中で安定に存在することができる。したがって、海水中での実際の利用に極めて好適なフジツボ類幼生のフェロモントラップの提供が可能となる。
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップは、硬脆性ゲル及び軟伸性ゲルの混合相と軟伸性ゲルの単相からなる親水性ダブルネットワークゲル（以下、単にＤＮゲルと呼ぶこともある）の、少なくとも混合相側にフジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を含むものとしている。
ＤＮゲルは、相互独立な高分子網目構造を有する二種類の高分子ゲルから構成され、硬くて脆いゲル（硬脆性ゲル）と軟らかくて伸びるゲル（軟伸性ゲル）との混合相中に多量の軟伸性ゲルを配置することにより、親水性ゲルとしては驚異的な高強度を有するものである（Gong JP, Katsuyama Y, Kurokawa T, Osada Y (2003) Double-network hydrogels with extremely high mechanical strength. Adv. Mater. 15, 1155-1158.）。
本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップは、以下の工程（１）〜（３）により製造される。
（１）フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質、第一のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化して硬脆性ゲルを調製する工程
（２）硬脆性ゲルを粉砕して微粒子を得る工程
（３）微粒子、第二のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化する工程
（１）フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質、第一のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化して硬脆性ゲルを調製する工程
（２）硬脆性ゲルを粉砕して微粒子を得る工程
（３）微粒子、第二のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化する工程
ＤＮゲル自体の製造方法は、例えば、特開２００８−１６３０５５号等に開示されている方法に準拠すればよい。本発明では、フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を工程（１）において添加する点に特徴がある。この工程よりも後にフジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を添加しても、フェロモントラップに所望の機能を付与できないばかりか、ＤＮゲル自体の強度も低下させてしまうことになる。以下、本発明のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法について、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質を用いてタテジマフジツボ幼生用フェロモントラップを製造する場合を例に挙げて説明する。
＜工程（１）＞
工程（１）では、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質、第一のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化して硬脆性ゲルを調製する
工程（１）では、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質、第一のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化して硬脆性ゲルを調製する
タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体を用いて生産することができる。
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
このように形質転換体を用いることで、拡散性着生フェロモンタンパク質を、タテジマフジツボ成体から抽出する場合よりも効率よく生産することができる。
形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをベクターに挿入し、大腸菌、酵母、昆虫細胞等の宿主中で発現させることにより得られる。そして、得られた形質転換体を培養することにより、目的のタンパク質を培養物に蓄積させることで生産することができる。ベクターシステムとしては、例えば、ｐＥＴ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＹＥＳ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＩＺＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＢａｃＶｅｃｔｏｒ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられ、好適にはｐＴＥ１００／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、宿主としては、例えばＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、別のタンパク質生産方法として、無細胞タンパク質発現系が挙げられる。無細胞タンパク質発現系の例としては、例えば、ラピッドトランスレーションシステム（ロッシュ社）等を挙げることができる。
本発明のポリヌクレオチドは例えば以下の様にして得ることが可能である。まず、タテジマフジツボからｔｏｔａｌＲＮＡ抽出を行い、これを用いてｍＲＮＡを精製した後、市販のキットによりｃＤＮＡライブラリ−を構築する。ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出法としては、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−Ｍｉｎｉ８０およびＱｕｉｃｋＧｅｎｅ ＲＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ ＳＩＩ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた方法等が挙げられるが、これに限定されるものではない。ｍＲＮＡを精製する方法としては、例えばＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を用いたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ精製法等が挙げられるが、これに限定されるものではない。ｃＤＮＡライブラリ−の構築は、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クロンテック）等を用いて行うことができるが、これを用いた方法に限定されるものではない。
形質転換体により生産されたタンパク質は、例えば固定化金属イオンアフィニティーカラム及びイオン交換カラムクロマトグラフィーにより分画し、精製するようにしてもよい。
尚、上記（ｂ）に記載の「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドは形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば、８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それよりも相同性の低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。この条件をより具体的に示すと、例えば「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度が挙げられる。
上記の形質転換体を用いることで、以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載のタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質が得られる。
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質
詳細には、配列番号１又は２のポリヌクレオチドを含む形質転換体を用いることによって、配列番号４に記載のタンパク質、またはこのタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質が得られる。また、配列番号３のポリヌクレオチドを含む形質転換体を用いることによって、配列番号５に記載のタンパク質、またはこのタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質が得られる。
さらに詳細には、配列番号５に記載のタンパク質は、配列番号４に記載のタンパク質から、シグナルペプチド（１５残基）を除いたものであることから、配列番号５に記載のタンパク質、またはこのタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質を用いることが好適であり、このタンパク質を生産する上では、配列番号３のポリヌクレオチドを含む形質転換体を用いることが好適である。但し、シグナルペプチドを含んでいてもタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとしての機能に相違はなく、配列番号１又は２のポリヌクレオチドを含む形質転換体を用いても構わない。尚、配列番号２に記載の塩基配列は、配列番号４に記載の２５１残基のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。
ここで、上記（ｄ）における「９０％以上の同一性」とは、配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列に、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加された状態で、配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性が確保されているという意味である。同一性の範囲は、より好ましくは９５％以上である。
尚、上記（ｃ）又は（ｄ）に記載のタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質は、上述した形質転換体を用いる場合よりも生産効率は落ちるものの、タテジマフジツボ成体から抽出・精製することもできる。具体的には、タテジマフジツボ成体抽出物をタンパク質濃縮処理した後、カラムクロマトグラフィーを利用してタンパク質精製を行うことで得られる。
タテジマフジツボ成体抽出物は、タテジマフジツボ成体の全組織をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中でホモジナイズした後、遠心分離により上清を回収することにより得られる。このタテジマフジツボ成体抽出物には、本発明のタンパク質を含む複数のタンパク質が混在している。
タンパク質濃縮は、例えば硫酸アンモニウムを用いた塩析処理により行うことができる。
カラムクロマトグラフィーは、ゲルろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの順で行う。陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液にはＮａＣｌ溶液を用いればよい。また、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの溶出液にはＫＨ２ＰＯ４溶液を用いればよい。
ゲルろ過に用いるゲル粒子としては、例えばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＨＷ−５５Ｆ（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
陰イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えばＣＨＴ（登録商標） ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム（ｔｙｐｅ Ｉ； ４０μｍ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ； １０ ×１８０ ｍｍ； Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
尚、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質の溶媒への添加量は、特に限定されるものではないが、このタンパク質の海水中の濃度が１．０μｇ／ｍＬ未満の場合には、タテジマフジツボ幼生の着生を十分に誘起できない。したがって、フェロモントラップ周辺の海水濃度が１．０μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上となるように、添加量を決定することが好ましい。例えば、１０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ程度とすることが好ましい。
第一のモノマー分子は、例えば、正又は負に荷電し得る基を有する不飽和モノマー、好適には酸性基（例えば、カルボキシル基、リン酸基及びスルホン酸基）や塩基性基（例えば、アミノ基）を有する不飽和モノマーであり、具体的には、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アクリル酸、メタクリル酸又はそれらの塩等が挙げられるが、好ましくは、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸である。
架橋剤としては、例えばＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
溶媒としては、例えば水等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
溶媒中の第一のモノマー分子の濃度は、１Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）程度が好適であるが、この濃度に限定されるものではない。
溶媒中の架橋剤の濃度は、４０ｍＭ程度が好適であるが、この濃度に限定されるものではない。
ゲル化は、第一のモノマー分子を架橋及び重合することで生じる。第一のモノマー分子を架橋及び重合する方法としては、例えば紫外線照射などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
＜工程（２）＞
工程（２）では、工程（１）で得られた硬脆性ゲルを粉砕して微粒子を得る。ここで、粉砕は凍結乾燥を経てから行うことが好ましい。この場合、微粒子を得やすいものとできる。また、微粒子を多孔質化させて次工程において第二モノマーと架橋剤を含む溶媒を侵入させやすいものとして、微粒子内で第二モノマーの架橋及び重合を進行させやすくできる。
工程（２）では、工程（１）で得られた硬脆性ゲルを粉砕して微粒子を得る。ここで、粉砕は凍結乾燥を経てから行うことが好ましい。この場合、微粒子を得やすいものとできる。また、微粒子を多孔質化させて次工程において第二モノマーと架橋剤を含む溶媒を侵入させやすいものとして、微粒子内で第二モノマーの架橋及び重合を進行させやすくできる。
凍結乾燥は、定法にしたがって行えばよい。また、粉砕は、例えば凍結乾燥品を乳鉢等に入れてすりつぶすことにより行うことができる。
尚、上述したタテジマフジツボの着生フェロモンタンパク質は、数回の凍結融解、及び９０℃で１０分間の加熱後においても活性を維持することが本願発明者の実験により確認されている。したがって、このように凍結乾燥工程を経るような場合においても、活性を十分に維持することができるという利点がある。
但し、凍結乾燥を経ることなく、物理的な粉砕処理によって粉砕を行うようにしても構わない。
＜工程（３）＞
工程（３）では、工程（２）で得られた微粒子、第二のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化する。これにより、フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を含むＤＮゲルが得られる。
工程（３）では、工程（２）で得られた微粒子、第二のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化する。これにより、フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を含むＤＮゲルが得られる。
第二のモノマー分子は、例えば、電気的に中性な基を有する不飽和モノマーであり、具体的には、ジメチルシロキサン、スチレン、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−アクリルアミド、ビニルピリジン、メチルメタクリレート、トリフルオロエチルアクリレート等のフッ素含有不飽和モノマー、ヒドロキシエチルアクリレート又は酢酸ビニル等が挙げられるが、好ましくは、アクリルアミドである。
架橋剤としては、例えばＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、工程（１）とは別の架橋剤としてもよいし、同じ架橋剤としてもよい。
溶媒としては、例えば水等が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、工程（１）とは別の溶剤としてもよいし、同じ溶剤としてもよい。
溶媒中の第二のモノマー分子の濃度は、４Ｍ程度が好適であるが、この濃度に限定されるものではない。
溶媒中の架橋剤の濃度は、４０ｍＭ程度が好適であるが、この濃度に限定されるものではない。
第二のモノマー分子と架橋剤とを含む溶媒に対する微粒子の添加量は、ＤＮゲルの強度が確保される限り、特に限定されるものではないが、０．１％〜１５％（ｖ／ｗ）程度添加するのが好適であり、０．５％〜１５％程度添加するのがより好適である。また、強度を最大限に高める上では、１％〜１０％とすることが好適であり、１％〜５％とすることがより好適であり、１．５％〜２．５％とすることがさらに好適である。因みに、このように微粒子が少なく、ＤＮゲル全体に対するフェロモン含有量が相対的に低下してしまう場合においても、フェロモントラップとしての活性は十分に維持される。つまり、ＤＮゲルの強度を最大限に高めながらも、フェロモントラップとしての活性は十分に維持することが可能である。
ゲル化は、第二のモノマー分子を架橋及び重合することで生じる。第二のモノマー分子を架橋及び重合する方法としては、例えば紫外線照射などが挙げられるが、これに限定されるものではない。このゲル化の際に、第二のモノマー分子が架橋及び重合することで形成される分子鎖が微粒子中の架橋網目構造（第一のモノマー分子を架橋及び重合することで得られる第一のポリマーにより構成される架橋網目構造）に侵入する。これにより、硬脆性ゲル及び軟伸性ゲルの混合相と軟伸性ゲルの単相からなるＤＮゲルが形成される。
フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質は、工程（１）で添加するようにしているので、少なくともＤＮゲルの混合相に含まれることになり、単相には実質的には殆ど含まれないことになる。
以上の工程により得られたＤＮゲルは、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質を安定に保持しながらも拡散させることができる機能が付与されている。しかもＤＮゲルの特徴である強度の高さを、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質を含ませない場合と同等のレベルで維持することができるので、魚類等からの捕食による破壊が引き起こされることなく海水中で安定に存在することができる。したがって、海水中での実際の利用に極めて好適なフジツボ類幼生のフェロモントラップの提供が可能となる。
上記ＤＮゲルは、フジツボ幼生を捕捉するための海洋中の所望の位置に配置してフェロモントラップとして用いるようにしてもよいし、フジツボ幼生を付着させるための基体や網などに配置して、これを海洋中に沈め、フェロモントラップとして用いるようにしてもよい。
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の実施形態では、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質を用いた場合を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、他のフジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を用いるようにしてもよい。また、フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質は、フジツボ成体試料等から抽出したもの、形質転換体により産生されたもの、活性部位を見出してフェロモン活性を有するオリゴペプチドのような形で化学的に合成されたもの等を単独であるいは組み合わせてもちいてもよい。
また、ＤＮゲルには、一種類のフジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質だけでなく、二種類以上のフジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を含ませて、複数種のフジツボ類を同時に誘引するフェロモントラップとしてもよい。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
尚、以降の説明では、拡散性着生フェロモンタンパク質をＷＳＰ（Ｗａｔｅｒｂｏｒｎｅ Ｓｅｔｔｌｅｍｅｎｔ Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）と略記する。
［実施例１］
＜１．フジツボ試料＞
本実施例において使用したフジツボ成体は、浜名湖（静岡県）の牡蠣養殖場で用いられている竹筒に付着していたタテジマフジツボ成体であり、当該竹筒に付着していたタテジマフジツボ以外の他種生物を取り除いた後に濾過海水（０．２μｍフィルター濾過）で洗浄し、電力中央研究所環境科学研究所実験室内の水槽に収容して、文献１（野方靖行等 (2011)、 日本沿岸産フジツボ4種の幼生付着に与える塩分の影響、Sessile Organisms 28, 47-54.）の方法に従って飼育したものである。
＜１．フジツボ試料＞
本実施例において使用したフジツボ成体は、浜名湖（静岡県）の牡蠣養殖場で用いられている竹筒に付着していたタテジマフジツボ成体であり、当該竹筒に付着していたタテジマフジツボ以外の他種生物を取り除いた後に濾過海水（０．２μｍフィルター濾過）で洗浄し、電力中央研究所環境科学研究所実験室内の水槽に収容して、文献１（野方靖行等 (2011)、 日本沿岸産フジツボ4種の幼生付着に与える塩分の影響、Sessile Organisms 28, 47-54.）の方法に従って飼育したものである。
また、本実施例において使用したフジツボ幼生は、上記タテジマフジツボ成体から孵化したノープリウス幼生を文献２（吉村えり奈等（2006)、フジツボ幼生の簡便な飼育方法について、Sessile Organisms 23, 39-42.）の方法に従って飼育、変態させたものである。
＜２．組換え体によるＷＳＰ生産＞
（１）組換え体の作製
発現産物の抽出精製およびスケールアップが比較的容易である大腸菌とプラスミドベクターを用いた系を採用し、Champion pET Directional TOPO（登録商標） Expression Kits with pTE100/D-TOPO（登録商標） vector (Invitrogen Corporation)を用いて発現系を構築した。ＷＳＰは６×His-tag融合タンパク質として発現させた。
（１）組換え体の作製
発現産物の抽出精製およびスケールアップが比較的容易である大腸菌とプラスミドベクターを用いた系を採用し、Champion pET Directional TOPO（登録商標） Expression Kits with pTE100/D-TOPO（登録商標） vector (Invitrogen Corporation)を用いて発現系を構築した。ＷＳＰは６×His-tag融合タンパク質として発現させた。
鋳型として用いるfirst strand cDNAは、以下の方法により合成した。タテジマフジツボ生体軟組織からQuickGene-Mini80およびQuickGene RNA tissue kit SII (FUJIFILM Corporation)を用いてtotal RNAを抽出した. 得られたtotal RNAからOligotex-dT30<Super> mRNA Purification kit (TaKaRa Bio Inc.) を用いてpoly (A)+ RNAを精製し、SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories Inc.) を用いてfirst strand cDNAを合成した。
合成したfirst strand cDNAを鋳型とし、ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースに登録されているタテジマフジツボのＷＳＰのｃＤＮＡ塩基配列情報（ＡＢ６９５０９０）に基づいて設計された拡散性フェロモンcDNAの全ORF（配列番号３）を増幅させるプライマーセット（配列番号６及び７）とKOD-Plus-DNA Polymerase (TOYOBO Corporation, Ltd.)を用いて増幅を行った。尚、配列番号６の５’末端から４ｂｐまでの塩基は、pTE100/D-TOPO vector挿入のためのオーバーハングである。増幅は、「９４℃、２分間」を１サイクル、「９４℃、１５秒間」→「５５℃、３０秒間」→「６８℃、４．５分間」を３０サイクルの条件で行った。
増幅されたDNA断片は、２％アガロースゲル電気泳動に供した後、SYBR Safe(Invitrogen Corporation)により染色し、DNAバンドを可視化した。DNA断片をQIAquick（登録商標） Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて精製し、pET100/D-TOPO（登録商標） vectorおよびOne Shot（登録商標） TOP10 Chemically Competent E. coli (Invitrogen Corporation)を用いてサブクローニングした。
次に、Miniprep DNA Purification Kit (TaKaRa Bio Inc)を用いてプラスミドを精製し、発現用大腸菌BL21 Star (DE3) One Shot（登録商標） Chemically Competent E. coli (Invitrogen Corporation)に形質転換した。形質転換後の大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１リットルのLuria-Bertani培地でＯＤ６００ｎｍ＝０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。その後、培養液に０．５ｍＭのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド(IPTG)を添加し、３７℃で４時間発現誘導を行った。
（２）組換え体により生産されたＷＳＰの精製
発現誘導を行った大腸菌を遠心分離(５，０００×ｇ、４℃、１０分間)により集め、菌体ペレットにCelLytic B (Sigma-Aldrich)を加え１５分間激しく攪拌することで完全に溶菌させた。遠心分離(２１，０００×ｇ、４℃、１５分間)により不溶物を除去し、上清を限外濾過(Amicon Ultra（登録商標）-15, 10kDa cutoff; Millipore Corporation)により濃縮した。次に０．５ＭNaClを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウム(pH 7.4) (以下、buffer Dと呼ぶ)に対して透析を行った後、同緩衝液で平衡化したNi Sepharose High Performanceカラム(１６×１１０ｍｍ; GE Healthcare)に添加した。非吸着部をbuffer Dを用いて流速２ｍＬ／分で洗浄後、吸着部をbuffer D中のイミダゾールの直線濃度勾配 (０−２０ｍＭ）により溶出させた。タンパク質の溶出を２８０ｎｍにおける吸光度でモニターし、得られたタンパク質画分の幼生着生誘起活性をそれぞれ測定した。
発現誘導を行った大腸菌を遠心分離(５，０００×ｇ、４℃、１０分間)により集め、菌体ペレットにCelLytic B (Sigma-Aldrich)を加え１５分間激しく攪拌することで完全に溶菌させた。遠心分離(２１，０００×ｇ、４℃、１５分間)により不溶物を除去し、上清を限外濾過(Amicon Ultra（登録商標）-15, 10kDa cutoff; Millipore Corporation)により濃縮した。次に０．５ＭNaClを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウム(pH 7.4) (以下、buffer Dと呼ぶ)に対して透析を行った後、同緩衝液で平衡化したNi Sepharose High Performanceカラム(１６×１１０ｍｍ; GE Healthcare)に添加した。非吸着部をbuffer Dを用いて流速２ｍＬ／分で洗浄後、吸着部をbuffer D中のイミダゾールの直線濃度勾配 (０−２０ｍＭ）により溶出させた。タンパク質の溶出を２８０ｎｍにおける吸光度でモニターし、得られたタンパク質画分の幼生着生誘起活性をそれぞれ測定した。
尚、幼生着生誘起活性は、２４−ウェルポリスチレンプレートを用いた試験により測定した。試料（０，０．１，１．０および１０μｇ）とキプリス幼生（２日齢）約１０個体を純水で８０％に希釈した濾過海水（８０％濾過海水、総量１ｍＬ）と共にウェル中に収容し、暗条件、２５℃で３時間静置した。静置後、幼生の総数、付着数および死亡数を実体顕微鏡下でカウントし、付着率｛付着数／（総数−死亡数）｝を算出した。試験はフェロモンの各濃度につき３ウェルを用い、異なる幼生バッチを使用して３回繰り返した。測定結果はＳｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓの多重比較による検定を行い、危険率５％における有意差を判定した。
活性の認められた画分を限外濾過で濃縮後、５０ｍＭ Tris-HCl(pH 7.5)（以下、buffer Aと呼ぶ）に対して透析を行い、同緩衝液で平衡化したTOYOPEARL（登録商標） Super Q-650Sカラム(２０×１００ｍｍ; Tosoh Corporation)に添加した。非吸着部をbuffer Aを用いて流速２ｍＬ／分で洗浄した後、吸着部をbuffer A中のNaClの直線濃度勾配(０−５００ｍＭ)により溶出させた。
そして、得られたタンパク質画分の幼生着生誘起活性を測定し、活性を示した画分をＷＳＰとして得た。以降の説明では、このＷＳＰを「精製組換え体ＷＳＰ」と呼ぶこととする。
以上の手順により、培養液１リットル（菌体ペレット湿重量約１４ｇ）当たり３．０１ｍｇの精製組換え体ＷＳＰを得た。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから推定された分子量は２８，１００±４００であり、配列番号５に記載のアミノ酸配列（配列番号４に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたもの）から算出された分子量である２７，１４０．４とほぼ一致することも明らかとなった。また、配列番号５に記載のアミノ酸配列の理論的ｐＩは６．３９であった。
さらに、２４−ウェルポリスチレンプレートを用いた幼生着生誘起活性測定を行った結果、精製した組換え体ＷＳＰは１．０μｇ／ｍＬ以上で幼生の付着率を有意に上昇させ、１０μｇ／ｍＬ添加した場合の付着率は無添加時３倍程度まで上昇した（図２）。
＜３．ＷＳＰ含有ダブルネットワーク（ＤＮ）ゲルの作製＞
（１）製法１
水を溶媒として、３５μｇ／ｍＬの精製組換え体ＷＳＰを含む１Ｍ ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）／４０ｍＭ Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡｍ）の水溶液を調製し、この水溶液を２枚のガラス板に３ｍｍのシリコンスペーサーを挟み込むことにより形成された空間に流し込んだ。そして、紫外線照射下で一晩重合させ、精製組換え体ＷＳＰを含むＰＡＭＰＳ（Ｐｏｌｙ−ＡＭＰＳ）ゲルを得た。
（１）製法１
水を溶媒として、３５μｇ／ｍＬの精製組換え体ＷＳＰを含む１Ｍ ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）／４０ｍＭ Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡｍ）の水溶液を調製し、この水溶液を２枚のガラス板に３ｍｍのシリコンスペーサーを挟み込むことにより形成された空間に流し込んだ。そして、紫外線照射下で一晩重合させ、精製組換え体ＷＳＰを含むＰＡＭＰＳ（Ｐｏｌｙ−ＡＭＰＳ）ゲルを得た。
精製組換え体ＷＳＰを含むＰＡＭＰＳゲルを細断した後、凍結乾燥させてからさらに微粉末状に粉砕した。
次に、水を溶媒として、４Ｍ アクリルアミド（ＡＡｍ）／４０ｍＭ ＭＢＡＡｍの水溶液を調製し、上記で得られたゲル粉末を１５％（ｖ／ｗ）添加した。これを２枚のガラス板に０．５ｍｍのシリコンスペーサーを挟み込むことにより形成された空間に流し込んだ。そして、紫外線照射により一晩重合させ、精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルを得た。
精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルをbuffer Aと共に透析膜に収容し、buffer Aに対して室温で２日間透析することで未重合モノマーを除去した。未重合モノマー除去後の精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルをＷＳＰゲルＡとして以下の実験に用いた。
また、同様の手法で、３５μｇ／ｍＬの精製組換え体ＷＳＰの代わりに、３５μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してゲルを作製し、これをＢＳＡゲルＡとして以下の実験に用いた。
（２）製法２
水を溶媒として、１Ｍ ＡＭＰＳ／４０ｍＭ ＭＢＡＡｍの水溶液を調製し、製法１と同様の手法で重合粉砕することで、ＰＡＭＰＳゲル粉末を得た。
水を溶媒として、１Ｍ ＡＭＰＳ／４０ｍＭ ＭＢＡＡｍの水溶液を調製し、製法１と同様の手法で重合粉砕することで、ＰＡＭＰＳゲル粉末を得た。
次に、水を溶媒として、３５μｇ／ｍＬの精製組換え体ＷＳＰを含む４Ｍ ＡＡｍ／４０ｍＭ ＭＢＡＡｍの水溶液を調製し、上記で得られたゲル粉末を１５％（ｖ／ｗ）添加した。これを製法１と同様の手法で重合させ、未重合モノマーを除去し、ＷＳＰゲルＢとして後述する実験に用いた。
また、同様の手法で、３５μｇ／ｍＬの精製組換え体ＷＳＰの代わりに、３５μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してゲルを作製し、これをＢＳＡゲルＢとして後述する実験に用いた。
（３）幼生着生誘起効果の検討
ガラス製シャーレ(φ１２０ｍｍ)にゲル（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ)を２枚を重ねて一箇所に設置し、１００ｍＬの８０％濾過海水と共にキプリス幼生約１００個体を収容した。.暗条件、２５℃で４８時間静置した後、幼生の総数、付着数および死亡数を実体顕微鏡下でカウントし、総付着率{総付着数／（総数−死亡数）｝を算出した。また、ゲルを設置したシャーレの領域（シャーレ１／３領域, 図１（ｂ）を参照)をゲル周辺とし、ゲル周辺への付着率｛（ゲル周辺への付着数＋ゲルへの付着数）／総付着数｝を算出した
ガラス製シャーレ(φ１２０ｍｍ)にゲル（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ)を２枚を重ねて一箇所に設置し、１００ｍＬの８０％濾過海水と共にキプリス幼生約１００個体を収容した。.暗条件、２５℃で４８時間静置した後、幼生の総数、付着数および死亡数を実体顕微鏡下でカウントし、総付着率{総付着数／（総数−死亡数）｝を算出した。また、ゲルを設置したシャーレの領域（シャーレ１／３領域, 図１（ｂ）を参照)をゲル周辺とし、ゲル周辺への付着率｛（ゲル周辺への付着数＋ゲルへの付着数）／総付着数｝を算出した
試験は、５種類のゲル（ＷＳＰゲルＡ、ＷＳＰゲルＢ、ＢＳＡゲルＡ、ＢＳＡゲルＢ、及びコントロールゲル）それぞれについて行い、異なる幼生バッチを使用して３−６回繰り返した。またゲルを用いない試験についても同様の方法で行い、比較対照とした。
尚、コントロールゲルとは、ＷＳＰやＢＳＡ等のタンパク質を添加せずに、製法１（または製法２）と同様の手法で作製されたゲルである。
実験結果を図１及び表１に示す。
図１中、（ａ）がゲルを使用せずに試験した結果であり、（ｂ）がコントロールゲルを使用して試験した結果であり、（ｃ）がＢＳＡゲルＡを使用して試験した結果であり、（ｄ）がＷＳＰゲルＡを使用して試験した結果であり、（ｅ）がＢＳＡゲルＢを使用して試験した結果であり、（ｆ）がＷＳＰゲルＢを使用して試験した結果である。
各種試験における幼生の死亡率は何れも１％以下であった。また、ゲルを設置しない試験とコントロールゲルを用いた試験の幼生の総付着率はそれぞれ約１３％および１６％であり、ＤＮゲルを設置したことによる変化は認められなかった。
ゲルを用いない試験およびＷＳＰゲルＡ以外のゲルを用いた試験のゲル周辺への付着率は、何れも４０％以下であった。 一方、ＷＳＰゲルＡを用いた試験の幼生の総付着率は他の試験区よりも有意に高く、約６０％であった。また、ＷＳＰゲルＡを用いた試験におけるゲル周辺への付着率は最も高く、総付着個体の約８０％が密集して付着している様子が確認された。
以上の結果から、製法１で作製したＷＳＰ含有ＤＮゲルを用いることで、フェロモントラップとして優れた効果が発揮されることが明らかとなった。
尚、ＷＳＰゲルＡ及びＢＳＡゲルＡの強度は、コントロールゲルの強度と同等であり、タンパク質を含有することによる強度低下は認められなかった。一方で、ＷＳＰゲルＢ及びＢＳＡゲルＢは、コントロールゲル、ＷＳＰゲルＡ及びＢＳＡゲルＡと比較して脆い傾向にあり、試験終了後にシャーレ中に千切れたゲル破片がしばしば観察された。この点からも、製法１で作製したＷＳＰ含有ＤＮゲルを用いることの優位性が示された。
＜４．フジツボ成体からのＷＳＰの抽出及び精製＞
（１）抽出及び精製
ＷＳＰの抽出及び精製の全行程は０−４℃で行った。タテジマフジツボ成体を竹筒からはがし取り、全組織(２００ｇ ｗｅｔ ｗｔ)をブレンダーで細断した。２倍量(ｖ／ｗ)のbuffer Aを加えホモジナイズし、遠心分離(１０，０００×ｇ、４℃、３０分間)を行った。遠心分離後の上清に粉末硫安を用いて０−７０％飽和硫安分画し、遠心分離(１０，０００×ｇ、４℃、３０分間)により得られた沈殿を０．２Ｍ NaClを含むbuffer A (以下、buffer Bと呼ぶ)に再溶解した。得られた粗抽出液をbuffer Bで平衡化したTOYOPEARL（登録商標） HW-55Fカラム(１５×９４０ｍｍ;Tosoh Corporation)に添加し、流速１ｍＬ／分で溶出した。タンパク質の溶出を２８０ｎｍにおける吸光度でモニターし、得られたタンパク質画分の幼生着生誘起活性をそれぞれ測定した。幼生着生誘起活性の測定は、＜２．組換え体ＷＳＰ生産＞の欄で説明した通りとした。
（１）抽出及び精製
ＷＳＰの抽出及び精製の全行程は０−４℃で行った。タテジマフジツボ成体を竹筒からはがし取り、全組織(２００ｇ ｗｅｔ ｗｔ)をブレンダーで細断した。２倍量(ｖ／ｗ)のbuffer Aを加えホモジナイズし、遠心分離(１０，０００×ｇ、４℃、３０分間)を行った。遠心分離後の上清に粉末硫安を用いて０−７０％飽和硫安分画し、遠心分離(１０，０００×ｇ、４℃、３０分間)により得られた沈殿を０．２Ｍ NaClを含むbuffer A (以下、buffer Bと呼ぶ)に再溶解した。得られた粗抽出液をbuffer Bで平衡化したTOYOPEARL（登録商標） HW-55Fカラム(１５×９４０ｍｍ;Tosoh Corporation)に添加し、流速１ｍＬ／分で溶出した。タンパク質の溶出を２８０ｎｍにおける吸光度でモニターし、得られたタンパク質画分の幼生着生誘起活性をそれぞれ測定した。幼生着生誘起活性の測定は、＜２．組換え体ＷＳＰ生産＞の欄で説明した通りとした。
比較的高い活性を示した画分をSDS-PAGE（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法）に供し、ＳＩＰＣ（Settlement Inducing Protein Complex）とは異なる分子であることを確認した。SDS-PAGEは、Bio-Rad Laboratories製プレキャストゲル(Mini-PROTEAN（登録商標） TGX、４−２０％グラジエントゲル)を用い、Laemmliの方法（Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.）に従って行った。泳動後のゲルはクーマシーブリリアントブルー(CBB R-250)染色, または銀染色(Silver StainII Kit, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)によりタンパク質バンドを可視化した。
次に、限外濾過(Amicon Ultra（登録商標）-15, 10kDa cutoff; Millipore Corporation)により濃縮した。濃縮されたタンパク質溶液をbuffer Aに対して透析し、脱塩した後、同緩衝液で平衡化したTOYOPEARL（登録商標） Super Q-650Sカラム(２０×１００ｍｍ; Tosoh Corporation)に添加した。非吸着部を流速２ｍＬ／分で洗浄後、吸着部をbuffer A中のNaClの直線濃度勾配(０−４００ｍＭ、２ｍＬ／分)により溶出させた。活性を示したタンパク質画分を限外濾過で濃縮後、５ｍＭ リン酸カリウム(pH 6.8) (以下、buffer Cと呼ぶ)に対して透析を行った。次に、同緩衝液で平衡化したCHT（登録商標） ceramic hydroxyapatiteカラム(type I; ４０μｍ particle size; １０×１８０ｍｍ；Bio-Rad Laboratories)に添加した。非吸着部を流速１ｍＬ／分で洗浄後、吸着部をbuffer Cのリン酸カリウムの直線濃度勾配(５−４００ｍＭ、１ｍＬ／分)により溶出させた。活性を示したタンパク質画分を集め、フジツボ成体から抽出した精製ＷＳＰを得た。
以上の手順により、タテジマフジツボ成体全組織２００ｇから１．２ｍｇの精製ＷＳＰを得た。尚、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析から、この精製ＷＳＰの分子量は３１，６００±５００と推定された。
また、TSK G3000SWカラム(２１．５×３００ｍｍ; Tosoh Corporation) を利用して、以下の手順により、精製ＷＳＰの非還元条件下での分子量の推定を行った。０．２Ｍ NaClを含む２０ｍＭ リン酸カリウム(pH 7.2) を緩衝液に用い、流速は０．２ｍＬ／分とした。標準タンパク質には馬心筋チトクロームc (12,400 Da)、 酵母ミオキナーゼ(32,000 Da)、酵母エノラーゼ(67,000 Da)、豚心筋乳酸脱水素酵素(142,000 Da)および酵母グルタミン酸脱水素酵素(290,000 Da)を用いた(Oriental Yeast Corporation, Ltd)。その結果、非還元条件下での分子量は、４１，８００±９００と推定された。以上の結果から、ＷＰＳは単量体であると考えられた。
さらに、２４−ウェルポリスチレンプレートを用いた幼生着生誘起活性測定結果から、ＷＳＰを１．０μｇ／ｍＬ以上添加することで、幼生の付着率は有意に上昇し、１０μｇ／ｍＬ添加した場合の付着率はＷＳＰ無添加時の４倍程度まで上昇した（図３）。以上の結果から、タテジマフジツボ成体から得られたＷＳＰは上記組換え体から得られたＷＳＰと同等の活性を有することが明らかとなった。
また、３種類のレクチン(レンズマメレクチン, 小麦胚芽レクチンおよびコンカナバリンＡ)による活性阻害について検討した結果、活性阻害は認められなかった。このことから、ＷＳＰは糖鎖修飾を受けていないか、または幼生着生誘起活性発現に糖鎖は関与していない可能性が示唆された。
（２）幼生着生誘起活性の検討
（２−１）実験方法
ＷＳＰの海水中への拡散および幼生着生誘起効果を、アガロースゲルを用いた試験により検証した。精製ＷＳＰを１０μｇ添加した８０％濾過海水（最終液量１ｍＬ）を、１％アガロースにより固化させた。これをＷＳＰを含まない１％アガロースゲル２個と共にガラス製シャーレ（φ１２０ｍｍ）に等間隔で固定した。シャーレに１００ｍＬの８０％濾過海水と共にキプリス幼生約５０個体を収容し、暗条件、２５℃で２４時間静置した。静置後、幼生の総数、総付着数、死亡数を実体顕微鏡下でカウントし、総付着率｛総付着数／（総数−死亡数）｝を算出した。次に、シャーレを各アガロースゲルの周囲３領域に１２０°角で等分割し、ＷＳＰを含むアガロースゲル周辺への付着率｛（ＷＳＰを含むアガロースゲル周辺への付着数＋ＷＳＰを含むアガロースゲルへの付着数）／総付着数｝を算出した。ＷＳＰを含まない１％アガロースゲル３個を用いた試験（コントロール試験）も同時に行い、異なる幼生バッチを使用してそれぞれ３回繰り返した。試験結果はSteel-Dwassの多重比較による検定を行い、危険率５％における有意差を判定した。
（２−１）実験方法
ＷＳＰの海水中への拡散および幼生着生誘起効果を、アガロースゲルを用いた試験により検証した。精製ＷＳＰを１０μｇ添加した８０％濾過海水（最終液量１ｍＬ）を、１％アガロースにより固化させた。これをＷＳＰを含まない１％アガロースゲル２個と共にガラス製シャーレ（φ１２０ｍｍ）に等間隔で固定した。シャーレに１００ｍＬの８０％濾過海水と共にキプリス幼生約５０個体を収容し、暗条件、２５℃で２４時間静置した。静置後、幼生の総数、総付着数、死亡数を実体顕微鏡下でカウントし、総付着率｛総付着数／（総数−死亡数）｝を算出した。次に、シャーレを各アガロースゲルの周囲３領域に１２０°角で等分割し、ＷＳＰを含むアガロースゲル周辺への付着率｛（ＷＳＰを含むアガロースゲル周辺への付着数＋ＷＳＰを含むアガロースゲルへの付着数）／総付着数｝を算出した。ＷＳＰを含まない１％アガロースゲル３個を用いた試験（コントロール試験）も同時に行い、異なる幼生バッチを使用してそれぞれ３回繰り返した。試験結果はSteel-Dwassの多重比較による検定を行い、危険率５％における有意差を判定した。
（２−２）実験結果
実験結果を表２及び図４に示す。
実験結果を表２及び図４に示す。
コントロール試験の総付着率は何れも３０％程度であり、また特定の箇所に密集する傾向は認められなかった。一方、精製ＷＳＰを含むアガロースゲルを設置した試験の幼生の総付着率は何れも６０％以上であり、また付着した幼生の約８５％が精製ＷＳＰを含むアガロースゲル周辺に付着していた。以上の結果から、精製ＷＳＰがアガロースゲルから海水中に徐々に拡散し、アガロースゲル周囲への幼生の着生を誘起したことが示唆された。したがって、フジツボ成体から抽出したＷＳＰを用いて、＜３．ＷＳＰ含有ダブルネットワーク（ＤＮ）ゲルの作製＞の（１）製法１と同様の手法でＤＮゲルを作製した場合にも、組換え体ＷＳＰを用いた場合と同様の効果が奏され得るものと考えられた。
＜５．フジツボ成体から抽出・精製されたＷＳＰの遺伝子的解析＞
（１）解析方法
精製ＷＳＰをジチオトレイトールおよびモノヨード酢酸を用いて還元Ｓ−カルボキシメチル化し（文献３：Crestfield AM, Moore S, Stein WH (1963) The preparation and enzymatic hydrolysis of reduced and S-carboxymethylated proteins. J. Biol. Chem. 238, 622-627.）、酵素／基質のモル比が１／１００になるようにリシルエンドペプチダーゼ（Achromobacter proteinase I）を加え、３７℃、１５時間消化した。その後、TSKgel ODS-120Tカラム（４．６×２５０ｍｍ；Tosoh Corporation）を用いた逆相ＨＰＬＣに供し、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線濃度勾配（１０−８０％、１ｍＬ／分）により溶出した。逆相ＨＰＬＣからのペプチドの溶出を２１５ｎｍの吸光度でモニターし、ペプチドを手動分取した。得られた各ペプチドを文献４（Hirano H, Watanabe T (1990) Microsequencing of proteins electrotransferred onto immobilizing matrices from polyacrylamide gel electrophoresis: application to an insoluble protein. Electrophoresis 11, 573-580.）の方法に従ってpolyvinylidene fluoride（PVDF）膜にブロットし、PPSQ-21A automated gas-phase protein/peptide sequencer(Shimadzu Corporation)を用いてアミノ酸配列を解析した。また未消化の還元Ｓ−カルボキシメチル化ＷＳＰをPPSQ-21A automated gas-phase protein/peptide sequencerに供し、Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。これにより得られた部分アミノ酸配列を基に、縮重プライマーを設計した。縮重プライマーの塩基配列を配列番号８及び９に示す。
（１）解析方法
精製ＷＳＰをジチオトレイトールおよびモノヨード酢酸を用いて還元Ｓ−カルボキシメチル化し（文献３：Crestfield AM, Moore S, Stein WH (1963) The preparation and enzymatic hydrolysis of reduced and S-carboxymethylated proteins. J. Biol. Chem. 238, 622-627.）、酵素／基質のモル比が１／１００になるようにリシルエンドペプチダーゼ（Achromobacter proteinase I）を加え、３７℃、１５時間消化した。その後、TSKgel ODS-120Tカラム（４．６×２５０ｍｍ；Tosoh Corporation）を用いた逆相ＨＰＬＣに供し、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線濃度勾配（１０−８０％、１ｍＬ／分）により溶出した。逆相ＨＰＬＣからのペプチドの溶出を２１５ｎｍの吸光度でモニターし、ペプチドを手動分取した。得られた各ペプチドを文献４（Hirano H, Watanabe T (1990) Microsequencing of proteins electrotransferred onto immobilizing matrices from polyacrylamide gel electrophoresis: application to an insoluble protein. Electrophoresis 11, 573-580.）の方法に従ってpolyvinylidene fluoride（PVDF）膜にブロットし、PPSQ-21A automated gas-phase protein/peptide sequencer(Shimadzu Corporation)を用いてアミノ酸配列を解析した。また未消化の還元Ｓ−カルボキシメチル化ＷＳＰをPPSQ-21A automated gas-phase protein/peptide sequencerに供し、Ｎ末端アミノ酸配列を解析した。これにより得られた部分アミノ酸配列を基に、縮重プライマーを設計した。縮重プライマーの塩基配列を配列番号８及び９に示す。
次に、タテジマフジツボ生体軟組織からQuickGene-Mini80およびQuickGene RNA tissue kit SII(FUJIFILM Corporation)を用いてtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAからOligotex-dT30<Super> mRNA Purification kit(TaKaRa Bio Inc.)を用いてpoly(A)+ RNAを精製し、SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Laboratories Inc.)を用いてfirst strand cDNAを合成した。得られたfirst strand cDNAを鋳型とし、設計した縮重プライマーおよびAdvantage（登録商標） 2 PCR Kit(Clontech Laboratories,Inc.)を用いたreverse transcription polymerase chain reactionを行った。反応にはTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） T600(TaKaRa Bio Inc.)を用い、「９５℃、１分間」を１サイクル、「９５℃、３０秒間」→「５５℃、３０秒間」→「６８℃、３０秒間」を３５サイクル繰り返した後、「６８℃、３分間」を１サイクルの条件で行った。
増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動に供した後、SYBR Safe(Invitrogen Corporation)により染色し、ＤＮＡバンドを可視化した。ＤＮＡ断片をQIAquick（登録商標） Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製し、pCR（登録商標）2.1-TOPO（登録商標） vectorおよびOne Shot（登録商標） TOP10 Chemically Competent Escherichia coli (Invitrogen Corporation)を用いてサブクローニングした。Miniprep DNA Purification Kit(TaKaRa Bio Inc)を用いてプラスミドを精製し、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をM13 forward (-20)、M13 reverseプライマー、BigDye terminator cycle sequencing kit ver.3.1(Applied Biosystems)およびABI Prism（登録商標） 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて解析した。
ｃＤＮＡの３’−および５’末端の解析には、RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法を用いた。上記で得られた部分ｃＤＮＡ塩基配列を基に３’−および５’−ＲＡＣＥ法に用いるプライマーを設計し（配列番号１０及び１１を参照）、SMART RACE cDNA Amplification Kitを用いてｃＤＮＡの３’−および５’−末端の増幅を行った。増幅産物はＲＴ−ＰＣＲと同様の方法でサブクローニングおよび塩基配列解析を行い、拡散性フェロモンの全ｃＤＮＡ塩基配列を解析した。
尚、表３に、本実施例で使用したプライマーを示しておく。
（２）解析結果
解析したｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）と対応するアミノ酸配列（配列番号３）を図５に示す。クローニングしたｃＤＮＡは９０７ｂｐ（配列番号１）からなり、２５１残基のアミノ酸（配列番号４）をコードする７５３ｂｐ（配列番号２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。ｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列には、解析した部分アミノ酸配列が全て含まれていた。またSignalP 4.0 Server（Petersen TN, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H (2011) SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat. Methods 8, 785-786., 573-580.）を用いた解析の結果から、このアミノ酸配列はＮ末端に１５残基のシグナルペプチドを有する分泌タンパク質と推測された。この結果に従いシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列のＮ末端は、タテジマフジツボ成体から抽出・精製したＷＳＰのＮ末端と一致した。以上の結果から、クローニングしたｃＤＮＡはＷＳＰをコードしているものと判断された。また、シグナルペプチドを除いた２３６残基のタンパク質（配列番号５）の分子量は２７，１４０．４と算出された。
解析したｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１）と対応するアミノ酸配列（配列番号３）を図５に示す。クローニングしたｃＤＮＡは９０７ｂｐ（配列番号１）からなり、２５１残基のアミノ酸（配列番号４）をコードする７５３ｂｐ（配列番号２）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。ｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列には、解析した部分アミノ酸配列が全て含まれていた。またSignalP 4.0 Server（Petersen TN, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H (2011) SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nat. Methods 8, 785-786., 573-580.）を用いた解析の結果から、このアミノ酸配列はＮ末端に１５残基のシグナルペプチドを有する分泌タンパク質と推測された。この結果に従いシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列のＮ末端は、タテジマフジツボ成体から抽出・精製したＷＳＰのＮ末端と一致した。以上の結果から、クローニングしたｃＤＮＡはＷＳＰをコードしているものと判断された。また、シグナルペプチドを除いた２３６残基のタンパク質（配列番号５）の分子量は２７，１４０．４と算出された。
［実施例２］
実施例１の＜３．ＷＳＰ含有ダブルネットワーク（ＤＮ）ゲルの作製＞の「（１）製法１」と同様の方法で、ゲル粉末（ＰＡＭＰＳゲル）の添加量を、０．５％、１．５％、２．５％（ｖ／ｗ）として、精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルを作製した。作製したＤＮゲルを用いて、実施例１の＜３．ＷＳＰ含有ダブルネットワーク（ＤＮ）ゲルの作製＞の「（３）幼生着生誘起効果の検討」と同様の方法で、実験を行った。
実施例１の＜３．ＷＳＰ含有ダブルネットワーク（ＤＮ）ゲルの作製＞の「（１）製法１」と同様の方法で、ゲル粉末（ＰＡＭＰＳゲル）の添加量を、０．５％、１．５％、２．５％（ｖ／ｗ）として、精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルを作製した。作製したＤＮゲルを用いて、実施例１の＜３．ＷＳＰ含有ダブルネットワーク（ＤＮ）ゲルの作製＞の「（３）幼生着生誘起効果の検討」と同様の方法で、実験を行った。
実験結果を図６及び表４に示す。
図６中、（ａ）はＤＮゲル無しで実験した結果であり、（ｂ）はＰＡＭＰＳゲル粉末含量０．５％の精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルを用いた実験結果であり、（ｃ）はＰＡＭＰＳゲル粉末含量１．５％の精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルを用いた実験結果であり、（ｄ）はＰＡＭＰＳゲル粉末含量２．５％の精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルを用いた実験結果である。
精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルを用いた場合には、ゲル周辺への付着率が７０％〜９０％と極めて高いものとなることが確認された。実施例１におけるＰＡＭＰＳゲル粉末含量１５％の精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルと比較すると、実施例２における精製組換え体ＷＳＰ含有ＤＮゲルは、ＰＡＭＰＳ含量を減らした結果としてＤＮゲル全体における精製組換え体ＷＳＰ含量が低下していることになるが、本実施例における結果から、このような場合にもいても、フェロモントラップとして優れた効果が発揮されることが明らかとなった。また、特にＰＡＭＰＳ含量を１．５％、２．５％とすることは、ＤＮゲル自体の強度（硬さの確保と脆弱性の解消）の面で極めて有利であることもわかった。
以上、実施例２の実験結果から、ＤＮゲル自体の強度を高めやすいＰＡＭＰＳ含量においても、フェロモントラップとしての優れた効果が十分に発揮されることが明らかとなった。
Claims (8)
- 硬脆性ゲル及び軟伸性ゲルの混合相と前記軟伸性ゲルの単相からなる親水性ダブルネットワークゲルの、少なくとも前記混合相側にフジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質を含むことを特徴とするフジツボ類幼生用フェロモントラップ。
- 前記拡散性着生フェロモンタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体により産生されるタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものである請求項１に記載のフジツボ類幼生用フェロモントラップ。
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 前記拡散性着生フェロモンタンパク質は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載のタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものである請求項１に記載のフジツボ類幼生用フェロモントラップ。
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質 - 前記硬脆性ゲルを構成する第一のポリマーが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸とＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋重合体であり、前記第二のポリマーがアクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋重合体である請求項１〜３のいずれか１項に記載のフジツボ類幼生用フェロモントラップ。
- 以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とするフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法。
（１）フジツボ類の拡散性着生フェロモンタンパク質、第一のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化して硬脆性ゲルを調製する工程
（２）前記硬脆性ゲルを粉砕して微粒子を得る工程
（３）前記微粒子、第二のモノマー分子、及び架橋剤を含む溶媒をゲル化する工程 - 前記拡散性着生フェロモンタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体により産生されるタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものである請求項５に記載のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法。
（ａ）配列番号１、２又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドもしくはこれと相補的なポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 前記拡散性着生フェロモンタンパク質は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に記載のタテジマフジツボの拡散性着生フェロモンタンパク質であり、タテジマフジツボ幼生をトラップするものである請求項５に記載のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法。
（ｃ）配列番号４又は５に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のタンパク質と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列により表され、タテジマフジツボの拡散性着生フェロモンとして機能するタンパク質 - 前記第一のモノマーが２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸であり、前記第二のモノマーがアクリルアミドであり、前記架橋剤がＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドである請求項５〜７のいずれか１項に記載のフジツボ類幼生用フェロモントラップの製造方法。
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