JP5927081B2 - 分光測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、分光測定方法に関するものである。

従来、標本に含まれている成分の情報を取得するために、標本の各位置からの特定の光を検出し、検出された光を分光することによりラマンスペクトルや赤外吸収スペクトルなどの分光スペクトルを取得し、取得された分光スペクトルを解析することが行われている（例えば、特許文献１および非特許文献１参照。）。

標本からの光が微弱である場合には１回の分光スペクトルの測定に時間を要し、十分な数の分光スペクトルが得られるまでの時間が長くなる。特許文献１および非特許文献１では、ライン状の照明光を用いて複数の位置の分光スペクトルを同時に取得したり、標本からの光を検出する検出器の電荷読出しと照明光の掃引とを同期させたりすることにより、全体の測定時間の短縮を図っている。

特表２０１０−５１７０２９号公報

Charlene A． Drumm 外１名、"Microscopic Raman Line-Imaging with Principal Component Analysis"，Applied Spectroscopy，Vol．49，Issue 9，pp．1331-1337 (1995)

しかしながら、特許文献１および非特許文献１により空間的に十分に高い精度で分光スペクトルを取得するためには、少なくとも一の方向には十分に小さい距離間隔で分光スペクトルを測定する必要があり、全体の測定時間を十分に短縮することは難しい。全体の測定時間をさらに短縮するために一部の位置における分光スペクトルの測定を省くことが考えられるが、恣意的に測定位置の一部を省いた場合には、標本の重要な情報を取得し損ねる可能性があり、空間的な測定精度が不十分となる。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、空間的に十分に高い測定精度を維持しつつ全体の測定時間を短縮することができる分光測定方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本上の測定領域を構成する複数の区画のうち指定された一部の区画の分光スペクトルを測定する測定ステップと、該測定ステップにおいて得られた分光スペクトルを分析することにより該分光スペクトルに含まれる情報を表すスカラ値を前記測定ステップにおいて測定された各区画について算出するスカラ値算出ステップと、該スカラ値算出ステップにおいて算出されたスカラ値を用いて、前記測定ステップにおいて測定されなかった区画のスカラ値を２種類の補間法により補間する補間ステップと、該補間ステップにおいて前記２種類の補間法により補間された２つのスカラ値の差分の絶対値が所定の閾値以上である区画を抽出する抽出ステップと、該抽出ステップにおいて抽出された区画を指定して前記測定ステップ、スカラ値算出ステップ、補間ステップおよび抽出ステップを再度実行させる反復ステップとを含む分光測定方法を提供する。

本発明によれば、測定ステップにおいて測定した観察領域内の一部の区画の分光スペクトルから、当該一部の区画において標本に含まれている成分の情報を測定算出ステップにおいてスカラ値として取得することができる。
この場合に、測定ステップにおいて測定されなかった区画のスカラ値が補間ステップにおいて２種類の補間法によって補間される。

異なる種類の補間法によって補間された２つのスカラ値は、算出されたスカラ値の変動が十分に小さい領域においては略一致し、算出されたスカラ値の変動が十分に大きい領域においては互いに異なる。スカラ値の変動が大きい領域は、測定の対象としている標本内の成分の特性が大きく変化している領域であり、観察者にとって重要な領域である。このような重要な領域に該当する区画が抽出ステップにおいて抽出されて、反復ステップにおいて追加で分光スペクトルが測定され、スカラ値が追加で算出される。

このように、最初の測定ステップにおいては一部の区画を省いて分光スペクトルを測定し、観察者にとって重要な情報を含む区画であって未だ測定されていない区画については追加で分光スペクトルの測定が実行される。これにより、空間的に十分に高い測定精度を維持しつつ全体の測定時間を短縮することができる。

上記発明においては、前記測定ステップにおいて、ライン状の照明光を一列に並ぶ複数の前記区画に照射してこれら複数の区画からの光を検出することにより、前記複数の区画の分光スペクトルを同時に測定してもよい。
このようにすることで、全体の測定時間をさらに短縮することができる。

また、上記発明においては、前記測定ステップにおいて、一列に並ぶ複数の前記区画の分光スペクトルを測定し、前記補間ステップにおいて、前記一列に並ぶ複数の区画のスカラ値を用いて、当該複数の区画と同一の列に含まれる前記測定されなかった区画のスカラ値を当該複数の区画の配列方向に補間してもよい。
このようにすることで、列毎に未測定の区画のスカラ値の補間が実行されることとなり、規則的に区画が配列されている場合に好適である。

また、上記発明においては、前記２種類の補間法が、スプライン補間法および最小二乗法であってもよい。
このようにすることで、スカラ値の変動が大きい領域おいては２種類の補間法によって補間されたスカラ値の乖離量を十分に大きくし、観察者にとって重要な区画をより確実に抽出することができる。

また、上記発明においては、前前記測定ステップが、２次元方向に分布する複数の前記区画の分光スペクトルを測定し、前記補間ステップにおいて、前記２次元方向に分布する複数の区画のスカラ値を用いて、前記測定されなかった区画のスカラ値を前記２次元方向に補間してもよい。
このようにすることで、２次元方向のスカラ値の変化を加味して未測定の区画のスカラ値をより正確に補間することができる。

また、上記発明においては、前記２種類の補間法が、スプライン補間法、逆距離加重補間法およびクリギング補間法のうちの２つであってもよい。
このようにすることで、スカラ値の変動が大きい領域おいては２種類の補間法によって補間されたスカラ値の乖離量を十分に大きくし、観察者にとって重要な区画をより確実に抽出することができる。

また、上記発明においては、前記スカラ値が、前記複数の区画の分光スペクトルの集合を主成分分析して得られた主成分軸と前記分光スペクトルとの内積、前記複数の区画の分光スペクトルの集合を独立成分分析して得られた独立成分ベクトルと前記分光スペクトルとの内積、または、前記分光スペクトルの所定の周波数帯域における強度または２つの所定の周波数帯域における強度の比であってもよい。
このようにすることで、標本に含まれる特性の成分の分布を解析することができる。

また、上記発明においては、前記分光スペクトルが、ラマンスペクトル、近赤外吸収スペクトル、中赤外吸収スペクトル、遠赤外吸収スペクトル、可視吸収スペクトル、紫外吸収スペクトルまたは蛍光スペクトルであってもよい。
このようにすることで、標本に含まれる特性の成分の分布を解析することができる。

本発明によれば、空間的に十分に高い測定精度を維持しつつ全体の測定時間を短縮することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る分光測定方法を示すフローチャートである。 図１の分光測定方法によって測定される標本の観察領域を構成する区画を説明する図である。 図１の分光測定方法の測定ステップを説明する図である。 図１の分光測定方法の補間ステップを説明する図であり、観察面をＸＹ軸に設定し、スカラ値をＺ軸に設定したときのＸＹＺ空間を示している。 図４の（ａ）Ｙ＝Ｙ８および（ｂ）Ｙ＝Ｙ６におけるＸＺ平面を示しており、スプライン曲線（実線）および最小二乗曲線（破線）によって未測定の区画のスカラ値を補間する処理を説明する図である。 ２回目の補間ステップにおいて新しいスカラ値が追加されたＸＹＺ空間を示している。

以下に、本発明の一実施形態に係る分光測定方法について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る分光測定方法は、図１に示されるように、標本の観察領域内の一部の区画における分光スペクトルを顕微鏡によって測定する測定ステップＳ１と、該測定ステップＳ１により取得された分光スペクトルに基づくスカラ値を算出するスカラ値算出ステップＳ２と、測定ステップＳ１によって測定されなかった区画におけるスカラ値を２種類の補間法により補間する補間ステップＳ３と、該補間ステップＳ３において補間された２つのスカラ値の乖離量Ｄが所定の閾値Ｆより大きい未測定の区画を抽出する抽出ステップＳ４と、該抽出ステップＳ４において抽出された区画を指定して測定ステップＳ１から抽出ステップＳ４までを反復させる反復ステップＳ５とを含んでいる。

このような分光測定方法は、標本に照明光を照射して標本からの光を検出することにより、標本に含まれている分子の情報を含む分光スペクトルを取得する顕微鏡と、該顕微鏡によって取得された分光スペクトルを解析するとともに解析結果に基づいて顕微鏡を制御する制御装置とを備える顕微鏡システムによって実施される。例えば、制御装置は、ＣＰＵ（中央処理装置）と記憶装置とを備え、本実施形態の分光測定方法は記憶装置にプログラムとして記憶されている。そして、プログラムがＣＰＵにより記憶装置から読み出されて実行されることにより、上記の測定ステップＳ１から反復ステップＳ５までの処理が実施されるようになっている。

まず、測定ステップＳ１において、顕微鏡は、観察領域を構成する複数の区画のうち一部の区画の分光スペクトルを測定する。標本上の観察領域Ａは、図２に示されるように、２軸方向（Ｘ方向、Ｙ方向）に並ぶ複数の区画Ｂに区切られている。これらの区画Ｂのうち一部の区画を制御装置が測定対象区画Ｂ’として指定し、指定された測定対象区画Ｂ’についてのみ、顕微鏡は分光スペクトルを測定するようになっている。本実施形態においては、Ｘ軸方向に１０、Ｙ軸方向に８ずつ並んだ合計８０の区画Ｂが設定され、これら８０の区画ＢのうちＸ＝Ｘ１，Ｘ４，Ｘ７，Ｘ１０に対応する３２の区画Ｂが測定対象区画Ｂ’に指定されていることとする。

顕微鏡は、制御装置からの指令に基づき、図３に示されるように、Ｘ軸方向に延びるライン状の照明光Ｌを測定対象区画Ｂ’に照射し、該測定対象区画Ｂ’において発生した光を検出し、検出された光りを分光することにより、各測定対象区画Ｂ’における分光スペクトルを取得する。そして、顕微鏡は、照明光Ｌの照射位置をＸ軸方向およびＹ軸方向に移動し分光スペクトルの取得を繰り返すことにより、指定された全ての測定対象区画Ｂ’の分光スペクトルを取得する。このときに、顕微鏡は、ライン状の照明光ＬをＹ軸方向に並ぶ複数（図示する例では４）の測定対象区画Ｂ’に同時に照射することにより、複数の測定対象区画Ｂ’の分光スペクトルを同時に取得するようになっている。

なお、顕微鏡によるラマンスペクトルの測定方法は、適宜変更可能である。例えば、ライン状の照明光Ｌに代えて、スポット状の照明光を用いてもよい。この場合、一度の測定で１つの測定対象区画Ｂ’のラマンスペクトルが取得される。

以下、本実施形態においては、顕微鏡によって測定される分光スペクトルとしてラマンスペクトルについて説明する。本実施形態の分光測定方法において測定される分光スペクトルは、ラマンスペクトルの他に、近赤外吸収スペクトル、中赤外吸収スペクトル、遠赤外吸収スペクトル、可視吸収スペクトル、紫外吸収スペクトルまたは蛍光スペクトルであってもよい。

次に、スカラ値算出ステップＳ２において、測定ステップＳ１において得られたラマンスペクトルを分析することにより、各測定対象区画Ｂ’におけるラマンスペクトルに含まれている情報、例えば、特定の分子からのラマン散乱光の強度などを表すスカラ値を算出する。例えば、取得された全てのラマンスペクトルの集合であるハイパーラマンスペクトルを主成分分析することにより主成分軸を算出し、該主成分軸と各ラマンスペクトルとの内積である主成分スコアを算出し、該主成分スコアを各ラマンスペクトルが測定された測定対象区画Ｂ’のスカラ値とする。

もしくは、ハイパーラマンスペクトルを独立成分分析し、得られた独立成分ベクトルと各ラマンスペクトルとの内積を該ラマンスペクトルが測定された測定対象区画Ｂ’のスカラ値としてもよく、各ラマンスペクトルの所定の周波数帯域におけるバンド強度（ピーク強度または面積強度）をその測定対象区画Ｂ’のスカラ値としてもよい。

次に、補間ステップＳ３において、スカラ値算出ステップＳ２において算出された各測定対象区画Ｂ’のスカラ値を用いて未測定の区画Ｂのスカラ値を補間する。具体的には、２種類の補間法により測定対象区画Ｂ’のスカラ値ＺのＸ軸方向の変化を近似した２種類の近似曲線を求める。図４は、測定対象区画Ｂ’のＸ軸方向の位置を横軸（Ｘ軸）に設定し、スカラ値Ｚを縦軸（Ｚ軸）に設定したＸＺ平面に、各スカラ値Ｚ（黒点を参照。）をプロットしたものである。図４には、Ｙ軸方向に並ぶ複数のＸＺ平面を同時に図示するために、ＸＹＺ空間が示されている。また、図４においては、図が複雑になることを防ぐために、一部の測定対象区画Ｂ’のスカラ値Ｚのみが示されている。

本実施形態においては、２種類の補間法として、多項式を用いた補間法であるスプライン法および最小二乗法について説明する。スプライン法によって、プロットされた各点を通り、該点同士を滑らかに接続するような多項式のスプライン曲線が算出される。最小二乗法によって、Ｘ軸方向に並ぶスカラ値との誤差の２乗和を最小とするような多項式の最小二乗曲線が算出される。

算出されたスプライン曲線（実線）および最小二乗曲線（破線）をＸＺ平面に描くと、図５（ａ），（ｂ）のようになる。図５（ａ）は、スカラ値がＸ軸方向に比較的大きく変化しているＹ＝Ｙ８におけるＸＺ平面を示し、図５（ｂ）はスカラ値ＺがＸ軸方向に比較的小さく変化しているＹ＝Ｙ６におけるＸＺ平面を示している。２つの近似曲線によって未測定の区画Ｂのスカラ値が補間される。図５（ａ），（ｂ）に示されるように、互いに異なる性質を有する２つの近似曲線によって補間された各位置のスカラ値Ｚ同士は、スカラ値Ｚの変化が大きい領域においては大きく乖離し、スカラ値Ｚの変化が小さい領域においては略一致する。

次に、抽出ステップＳ４において、補間ステップＳ３において算出された２つの近似曲線の、各未測定の区画Ｂにおける乖離量Ｄに基づいて、スカラ値の取得が必要な未測定の区画Ｂを抽出する。すなわち、未測定の区画Ｂに対応するＸ＝Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５，Ｘ６，Ｘ８，Ｘ９における最小二乗法によるスカラ値Ｚとスプライン法によるスカラ値Ｚとの差分の絶対値を乖離量Ｄとして計算する。そして、得られた乖離量Ｄが所定の閾値Ｆよりも大きい未測定の区画Ｂを抽出する。乖離量Ｄが所定の閾値Ｆよりも大きい未測定の区画Ｂの抽出は、Ｙ＝Ｙ１〜Ｙ８における全てのＸＺ平面について実行される。

次に、反復ステップＳ５において、抽出ステップＳ４において抽出された未測定の区画Ｂを測定対象区画Ｂ’に新たに指定し、当該新たに指定された測定対象区画Ｂ’のラマンスペクトルの取得を顕微鏡に実行させる。これにより、抽出ステップＳ４において未測定の区画Ｂが抽出されなくなるまで、上記の測定ステップＳ１から抽出ステップＳ４までの処理が反復される。

例えば、反復ステップＳ５において、図５（ａ）において乖離量Ｄが比較的大きいＸ＝Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５が抽出される。この場合、２回目の測定ステップＳ１において、Ｘ＝Ｘ２，Ｘ３，Ｘ５、Ｙ＝Ｙ８の区画Ｂのラマンスペクトルが追加で取得され、２回目のスカラ値算出ステップＳ２において、新たに取得されたラマンスペクトルからスカラ値が算出される。そして、２回目の補間ステップＳ３において、新たに算出されたスカラ値Ｚは、図６に示されるようにＸＺ平面に追加され、先に算出されたスカラ値と新たに算出されたスカラ値とを含むＸ＝Ｘ１〜Ｘ６，Ｘ７，Ｘ１０におけるスカラ値の変化が２種類の近似曲線によって近似され、それまでに算出された全てのスカラ値を加味した未測定の区画Ｂのスカラ値が補間される。

このように、本実施形態によれば、最初に観察領域Ａ内の全ての区画Ｂのうち一部を省いてラマンスペクトルを測定し、測定されなかった区画Ｂのスカラ値を２種類の補間法によって推定する。そして、２種類の補間法によって推定されたスカラ値の乖離量Ｄが十分に大きかった場合、すなわち、その未測定の区画Ｂにおける測定対象の分子の含有量などの特性の変化が大きく、当該未測定の区画Ｂのラマンスペクトルが観察者にとって重要な情報を有している場合には、当該未測定の区画Ｂのラマンスペクトルを追加で測定する。

ステップＳ２，Ｓ３，Ｓ４のような演算処理の所要時間に比べて１回のラマンスペクトルの測定の所要時間は長く、このラマンスペクトルの測定の所要時間が全体の処理時間の短縮にとって障害となる。本実施形態によれば、ラマンスペクトルの測定回数を減らしつつ、観察者にとって重要な情報を含む区画Ｂのラマンスペクトルは確実に追加で測定することにより、空間的に十分に高い測定精度を確保しながら全体の測定時間を効果的に短縮することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、補間ステップＳ３において未測定の区画Ｂのスカラ値を、２種類の補間法を用いて２次元的に補間することとしたが、これに代えて、３次元的に補間することとしてもよい。この場合、２種類の補間法によって、図４に示されるようなＸＹＺ空間にプロットされた各点のＸＹ方向の変化を近似した３次元の近似曲面が求められる。２種類の補間法としては、例えば、スプライン法と、逆距離加重法またはクリギング法とが用いられる。

図５（ａ），（ｂ）のように、未測定の区画Ｂのスカラ値をＸ軸方向に２次元的に補間した場合には、測定対象区画Ｂ’のスカラ値のＹ軸方向の変化は未測定の区画Ｂのスカラ値の補間に加味されないこととなる。これに対し、３次元的に補間した場合には、測定されたスカラ値の２次元方向の変化が加味されるので、未測定の区画Ｂのスカラ値をより高い精度で補間することができる。

この変形例においては、抽出ステップＳ４において、例えば、以下のような処理が行われる。補間ステップＳ３において算出された２種類の近似曲面のスカラ値Ｚの差分の絶対値を乖離量Ｄとして計算し、算出された乖離量Ｄが所定の閾値Ｆよりも大きい領域を抽出する。そして、抽出された領域のＸＹ平面における重心位置を算出する。反復ステップＳ５は、抽出ステップＳ４において算出された重心位置を含む領域を新たな測定対象区画に指定する。このように、重心位置を含む領域を追加の測定対象区画とすることで、追加で実行されるラマンスペクトルの測定回数を最小とすることができる。

もしくは、未測定の区画Ｂの中心位置をサンプル点として予め設定しておき、該サンプル点における乖離量Ｄを所定の閾値Ｆと比較してもよい。または、乖離量Ｄが所定の閾値Ｆよりも大きい領域を抽出し、抽出された領域を複数に分割し、分割された個々の区画を新たな測定対象区画として指定してもよい。

また、本実施形態においては、測定ステップＳ１において、観察領域Ａ内に規則的に配列する区画Ｂ単位でラマンスペクトルを測定することとしたが、これに代えて、測定対象区画を不規則に指定してラマンスペクトルを測定してもよい。

Ｌ 照明光
Ａ 観察領域
Ｂ 区画
Ｂ’ 測定対象区画
Ｓ１ 測定ステップ
Ｓ２ スカラ値算出ステップ
Ｓ３ 補間ステップ
Ｓ４ 抽出ステップ
Ｓ５ 反復ステップ

Claims (10)

1. 標本上の測定領域を構成する複数の区画のうち指定された一部の区画の分光スペクトルを測定する測定ステップと、
   該測定ステップにおいて得られた分光スペクトルを分析することにより該分光スペクトルに含まれる情報を表すスカラ値を前記測定ステップにおいて測定された各区画について算出するスカラ値算出ステップと、
   該スカラ値算出ステップにおいて算出されたスカラ値を用いて、前記測定ステップにおいて測定されなかった区画のスカラ値を２種類の補間法により補間する補間ステップと、
   該補間ステップにおいて前記２種類の補間法により補間された２つのスカラ値の差分の絶対値が所定の閾値以上である区画を抽出する抽出ステップと、
   該抽出ステップにおいて抽出された区画を指定して前記測定ステップ、スカラ値算出ステップ、補間ステップおよび抽出ステップを再度実行させる反復ステップとを含む分光測定方法。
2. 前記測定ステップにおいて、ライン状の照明光を一列に並ぶ複数の前記区画に照射してこれら複数の区画からの光を検出することにより、前記複数の区画の分光スペクトルを同時に測定する請求項１に記載の分光測定方法。
3. 前記測定ステップにおいて、一列に並ぶ複数の前記区画の分光スペクトルを測定し、
   前記補間ステップにおいて、前記一列に並ぶ複数の区画のスカラ値を用いて、当該複数の区画と同一の列に含まれる前記測定されなかった区画のスカラ値を当該複数の区画の配列方向に補間する請求項１または請求項２に記載の分光測定方法。
4. 前記２種類の補間法が、スプライン補間法および最小二乗法である請求項３に記載の分光測定方法。
5. 前記測定ステップが、２次元方向に分布する複数の前記区画の分光スペクトルを測定し、
   前記補間ステップにおいて、前記２次元方向に分布する複数の区画のスカラ値を用いて、前記測定されなかった区画のスカラ値を前記２次元方向に補間する請求項１または請求項２に記載の分光測定方法。
6. 前記２種類の補間法が、スプライン補間法、逆距離加重補間法およびクリギング補間法のうちの２つである請求項５に記載の分光測定方法。
7. 前記スカラ値が、前記複数の区画の分光スペクトルの集合を主成分分析して得られた主成分軸と前記分光スペクトルとの内積である請求項１から請求項６のいずれかに記載の分光測定方法。
8. 前記スカラ値が、前記複数の区画の分光スペクトルの集合を独立成分分析して得られた独立成分ベクトルと前記分光スペクトルとの内積である請求項１から請求項６のいずれかに記載の分光測定方法。
9. 前記スカラ値が、前記分光スペクトルの所定の周波数帯域における強度または２つの所定の周波数帯域における強度の比である請求項１から請求項６のいずれかに記載の分光測定方法。
10. 前記分光スペクトルが、ラマンスペクトル、近赤外吸収スペクトル、中赤外吸収スペクトル、遠赤外吸収スペクトル、可視吸収スペクトル、紫外吸収スペクトルまたは蛍光スペクトルである請求項１から請求項９のいずれかに記載の分光測定方法。

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