JP5926178B2 - 向上したオフ速度を有するアプタマーを生成するための方法 - Google Patents

向上したオフ速度を有するアプタマーを生成するための方法 Download PDF

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Description

関連出願
[0001] この出願は２００９年７月９日に出願された米国出願一連番号１２／４９９，９６７の一部継続出願であり、それは２００８年７月１７日に出願された米国出願一連番号１２／１７５，４３４の一部継続出願であり、それは２００７年７月１７日に出願された米国仮出願一連番号６０／９５０，２８１、２００７年７月１７日に出願された米国仮出願一連番号６０／９５０，２９３、２００７年７月１７日に出願された米国仮出願一連番号６０／９５０，２８３、２００８年２月２６日に出願された米国仮出願一連番号６１／０３１，４２０および２００８年５月８日に出願された米国仮出願一連番号６１／０５１，５９４に対して優先権を主張する。この出願は２００７年１月１６日に出願された米国出願一連番号１１／６２３，５８０の一部継続出願でもある。これらの出願のそれぞれを本明細書にそのまま援用する。
発明の分野
[0002] 本開示は、１種類以上の目的の組織学的または細胞学的標的に高度に特異的であるオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が遅いアプタマーの同定および使用を記述する。本開示は、これらのオフ速度が遅いアプタマーの組成およびそれらの選択のための方法を記述する。本開示は、検出法のための向上した官能性を有するアプタマー構築物も記述する。さらに、本開示は、これらの向上したアプタマーにより可能になる適用、例えば疾患状態の診断のためのマーカー特異的アプタマーを用いた組織学的および／または細胞学的標本中の１種類以上の特異的マーカーの同定を向上させるための方法を記述する。
[0003] 以下の記述は本開示に関連する情報の要約を提供するものであり、本明細書おいて提供される情報または参照される刊行物のいずれかが特許請求される発明に対する先行技術であることの容認ではない。
[0004] ＳＥＬＥＸプロセスは標的分子に高い特異性で結合することができる核酸分子のインビトロ選択のための方法であり、“核酸リガンド”と題された米国特許第５，４７５，０９６号および“核酸リガンド”と題された米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照）において記述されており、そのそれぞれを本明細書に特に援用する。これらの特許は本明細書においてまとめてＳＥＬＥＸ特許と呼ばれ、あらゆる望まれる標的分子に対するアプタマーを作るための方法を記述している。
[0005] 基本的なＳＥＬＥＸプロセスは、いくつかの特定の目的を達成するために改変されてきた。例えば、“構造に基づく核酸の選択のための方法”と題された米国特許第５，７０７，７９６号は、曲がった（ｂｅｎｔ）ＤＮＡのような特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するための、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸプロセスの使用を記述している。“テオフィリンおよびカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”と題された米国特許第５，５８０，７３７号は、カウンターＳＥＬＥＸと呼ばれる、密接に関連する分子を識別することが可能な高度に特異的なアプタマーを同定するための方法を記述している。“指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：溶液ＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第５，５６７，５８８号は、標的分子に関する高い、および低い親和性を有するオリゴヌクレオチドの間の高度に効率的な分配を達成するＳＥＬＥＸに基づく方法を記述している。“ＨＩＶ−ＲＴおよびＨＩＶ−１ Ｒｅｖに対する核酸リガンド”と題された米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸが実施された後に向上したアプタマーを得るための方法を記述している。“指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：化学Ｓ
ＥＬＥＸ（Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）”と題された米国特許第５，７０５，３３７号は、アプタマーをその標的に共有結合させるための方法を記述している。“指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：組織ＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第６，３７６，４２４号は、特異的なマーカーの精製無しで細胞または組織特異的マーカーに対するアプタマーを生成するための方法を記述している。
[0006] そのＳＥＬＥＸプロセスは、そのリガンドに向上した特性、例えば向上したインビボでの安定性または向上した送達特性を与える修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーの同定を含む。そのような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸプロセスで同定されたアプタマーが、“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”と題された米国特許第５，６６０，９８５号において記述されており、それはピリミジンの５’および２’位において化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記述している。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１個以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーを記述している。
[0007] ＳＥＬＥＸプロセスのさらなる改変が米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および米国特許第６，２９１，１８４号において記述されており、そのそれぞれが“指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択および溶液ＳＥＬＥＸ”と題されており；例えば、“核酸リガンドの光選択”と題された米国特許第６，４５８，５３９号も参照。これらの特許は本明細書においてまとめて“光ＳＥＬＥＸ特許”と呼ばれ、標的分子に結合する、および／または標的分子と光架橋する、および／または標的分子を光不活性化することが可能な光反応性官能基を含有するアプタマーを選択するための様々なＳＥＬＥＸ法を記述している。結果として得られる光反応性アプタマーは、光架橋アプタマーまたは光アプタマーと呼ばれる。
[0008] これらのＳＥＬＥＸおよび光ＳＥＬＥＸプロセスは有用であるが、インビトロ選択技法から生じるアプタマーの向上した特性をもたらすプロセスに関する必要性が常に存在する。例えば、天然に生じるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを用いて達成される結合親和性よりも優れた結合親和性で分子を標的化するアプタマー、およびそのようなアプタマーを生成するための方法に関する必要性が存在する。例えばインビトロアッセイ、診断、療法的または画像化適用のような多くの適用のため、アプタマー／標的親和性複合体からの遅い解離速度を有するアプタマーを産生することは有意義である。そのような試薬を生成するため、いくつかの技法が提案されている（例えば、ＷＯ９９／２７１３３およびＵＳ２００５／０００３３６２参照）。しかし、これらの選択プロセスは、標的との速い会合速度論（すなわち速いオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ））を有する試薬の選択および標的との遅い解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）速度論（例えば遅いオフ速度）を有する試薬の選択を識別しない。従って、オフ速度が遅いアプタマーの選択を有利にする一方で単に標的との速い会合速度を有するアプタマーの選択を阻害する新規のプロセスおよび技法に関する必要性が存在する。
[0009] 最後に、異なるビルトイン官能性を含むアプタマー構築物に関する必要性が存在する。これらの官能性には、固定化のためのタグ、検出のための標識、分離を促進する、または制御するための手段等も含まれてよい。
[0010] 細胞学は、細胞の形態、構造、およ部分構造の評価で構成され、診断の道具としてあらゆる体液または器官に適用することができる。標本は流体、例えば尿、胃液、痰、胸膜液、髄液、滲出液等の中に放出された細胞であってよく、または穿刺生検もしくは
吸引、擦過、もしくは細胞学用ブラシにより集められてよい。吸引生検はリンパ節、甲状腺、唾液腺、乳房、子宮内膜、または前立腺において実施されてよい。細胞学的評価は細胞器官の病変、細胞死（壊死、アポトーシス）、細胞の損傷および応答、細胞老化、アミロイド沈着症、自己免疫疾患を評価するために、ならびに癌を他の疾患状態から識別するために用いられる。
[0011] 組織学は、疾患状態の診断のための組織の形態および構造の評価で構成され、悪性腫瘍の同定は大部分が組織学的情報に基づく。体には上皮、結合組織、筋、および神経という４つの主な組織のカテゴリーが存在する。組織の特徴を直接顕微鏡的に可視化することは、組織試料の厚さのために難しい。従って、その後の分析のための組織試料の薄い代表的な切片の生成を可能にするための技法が開発されてきた。組織化学は細胞および組織の化学組成の研究であり、典型的には特異的な染色反応を用いて特定の構成要素を同定し、位置を特定する。
[0012] 細胞学および組織学の試料は共に免疫学的試薬を用いて評価されてきた。視覚化のための色素または他のシグナルを送る部分を導入するために、特異的なマーカーに対する抗体が用いられてきた。しばしば、その免疫学的方法は、その固定された試料をその免疫学的試薬に対して透過性にする追加の必要性のため、標準的な方法よりも過酷（ｈａｒｓｈｅｒ）であり、従ってその固定方法は人為的結果（ａｒｔｉｆａｃｔ）の生成を防ぐためにそれに続く免疫染色と注意深く釣り合いを取られてよい。その抗体の大きさは固定された細胞および組織の中への拡散を制限する。その抗体のＦｃ部分は細胞または組織の構造物と非特異的に結合して間違った結果を生じる可能性がある。
[0013] 細胞学者および組織学者は最近、単一の集められた標本に対して実施される試験の数および範囲を増大させるよう求められている。これらの目標を成し遂げるためには、以下の特徴の１種類以上を提供することができる試薬を有するのが好都合であろう：（１）著しい試料の損傷無しに同じ試料に連続して適用される；（２）多数のプロセスの工程を低減または排除するように予め標識されている；（３）単一の切片からの多数の標的の検出のために同時に検出することができるいくつかの異なる色素または検出可能な部分で予め標識されている；（４）下記で記述するような抗原修復プロセスに関する必要性を排除する；（５）透過処理プロセスを低減または排除する；（６）非標的との非特異的結合を低減または排除する；（７）標識の位置を安定化する；および（８）組織を通って迅速に拡散して速やかな標的の染色を促進する。オフ速度が遅いアプタマーは、（１）それらが化学的に合成されたものであるため、より一貫性があり信頼できる試薬；（２）低減した貯蔵必要条件を有する化学的に堅牢な（ｒｏｂｕｓｔ）試薬；および標的の新規タンパク質に対する結合試薬の迅速かつハイスループットな発見の提供に加えて、これらの必要性の全てに取り組むことができるであろう。
米国特許第５，４７５，０９６号 米国特許第５，２７０，１６３号 ＷＯ９１／１９８１３ 米国特許第５，７０７，７９６号 米国特許第５，５８０，７３７号 米国特許第５，５６７，５８８号 米国特許第５，４９６，９３８号 米国特許第５，７０５，３３７号 米国特許第６，３７６，４２４号 米国特許第５，６６０，９８５号 米国特許第５，７６３，１７７号 米国特許第６，００１，５７７号 米国特許第６，２９１，１８４号 米国特許第６，４５８，５３９号 ＷＯ９９／２７１３３ ＵＳ２００５／０００３３６２
[0014] 本開示は、新規アプタマーならびにそのようなアプタマーを生成する、および使用する方法を記述する。特に、本開示は、オフ速度が遅い（解離速度が遅い）アプタマー、Ｃ−５修飾ピリミジンを含有するオフ速度が遅いアプタマー、および希釈により、競合剤の添加により、または両方のアプローチの組み合わせによりオフ速度が遅いアプタマーを選択するためのプロセスを記述する。加えて、タンパク質およびペプチドのような様々な標的に対するオフ速度が遅いアプタマーを記述する。独特の構造的特徴および融解温度を有するオフ速度が遅いアプタマーも記述する。本開示は、光反応性官能基を有するオフ速度が遅いアプタマー、ポリアニオン性物質の存在に対して難分解性であるアプタマー、およびこれらのアプタマーに関する選択プロセス、ならびに様々な適用においてそれらの有用性を向上させるための様々な他の官能性を伴って構築されたアプタマーも記述する。
[0015] 本開示は、１種類以上の目的の標的に結合可能なアプタマーを生成するための向上したＳＥＬＥＸ法を記述する。より具体的には、本開示は、以前のＳＥＬＥＸ法で得られたアプタマーおよび光アプタマーよりも遅いそれぞれの標的からの解離速度を有するアプタマーおよび／または光アプタマーを生成するための方法を記述する。一般的に、候補混合物を標的と接触させ、そして核酸−標的複合体の形成が起こるのを可能にした後、遅いオフ速度の濃縮プロセスを導入し、ここで、速い解離速度を有する核酸−標的複合体は解離して再形成されず、一方で遅い解離速度を有する複合体は完全なままであろう。遅いオフ速度の濃縮プロセスを導入するための方法には、核酸および標的の混合物への競合剤分子の添加、その核酸および標的分子の混合物の希釈、またはこれらの両方の組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。本開示はさらに、これらの方法を用いて得られるアプタマーおよび光アプタマーを記述する。
[0016] １態様において、その方法は、核酸の候補混合物を調製し；その候補混合物を標的と接触させ、ここで、その標的に対して最高の相対的親和性を有する核酸が優先的にその標的に結合して核酸−標的複合体を形成し；遅いオフ速度の濃縮プロセスを導入して、比較的速い解離速度を有する核酸−標的分子複合体の解離を誘導し；候補混合物において、未結合（ｆｒｅｅ）核酸から、残っている結合した核酸−標的複合体を分配し；そしてその標的に結合した核酸を同定することを含む。そのプロセスにはさらに、その標的に結合する核酸を増幅して、標的分子に結合し、さらに、遅い解離速度を有する核酸−標的分子複合体を生成する核酸が濃縮された核酸の混合物を得る反復工程が含まれてもよい。
[0017] 別の態様において、核酸の候補混合物には、遅い解離速度を有する修飾された核酸−標的複合体の形成を助けることができる修飾ヌクレオチド塩基を含有する核酸が含まれる。光活性基もしくは他の官能基を含有するヌクレオチド、または光活性基のための位置維持基（ｐｌａｃｅｈｏｌｄｅｒｓ）を含有するヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチドを用いてＳＥＬＥＸを実施するための向上した方法が“向上したＳＥＬＥＸおよび光ＳＥＬＥＸ”と題された、２００８年７月１７日に出願された米国出願一連番号１２／１７５，３８８において開示されており、それを本明細書にそのまま援用する。位置維持ヌクレオチドは、光反応性ではない修飾ヌクレオチドのＳＥＬＥＸ中またはＳＥＬＥＸ後導入のために用いられてもよい。
[0018] 本明細書で記述される様々な方法および工程を用いて、（１）標的に結合可能であるかまたは（２）標的に結合し、続いてＵＶもしくは可視スペクトルの光を照射された際に標的と共有結合を形成可能であるかのどちらかであるアプタマーを生成することができる。
[0019] 別の観点において、本明細書で記述される様々な方法および工程を用いて、標的への結合および／または架橋を通して標的の生理活性を修飾することができるアプタマーを生成することができる。１態様において、特定の疾患プロセスに関係がある、または関連する独特の標的に対するアプタマーが同定される。このアプタマーをインビトロまたはインビボのどちらかで診断試薬として用いることができる。別の態様において、疾患状態と関係がある標的に対するアプタマーは個体に投与され、インビボで疾患を処置するために用いられてよい。本明細書で同定されるアプタマーおよび光アプタマーは、限定では無いがアプタマー、オリゴヌクレオチド、抗体およびリガンドを使用することができるあらゆる診断、画像化、ハイスループットスクリーニングまたは標的検証技法または手順またはアッセイにおいて用いることができる。例えば、本明細書で同定されるアプタマーおよび光アプタマーを、“試験試料の多重分析”と題された、２００８年７月１７日に出願された米国出願一連番号１２／１７５，４４６において詳細に記述されている方法に従って用いることができ、それを本明細書にそのまま援用する。
[0020] 様々な態様は、細胞学的および／または組織学的試料中の特異的な標的の同定および視覚化のための、ならびに組織学／細胞学の試薬としてのオフ速度が遅いアプタマーの有用性を記述する。１態様において、１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーが、細胞または組織試料の細胞学的または組織学的評価において前記の細胞または組織試料中の１種類以上の可能性のある標的を検出するために用いられる。その細胞学的または組織学的評価は以下のことを含む：ａ）細胞または組織試料を得て、前記の試料を複数の細胞試料分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）または調製物または組織切片に分割し；ｂ）第１の細胞試料調製物または組織切片を標的に対するオフ速度が遅いアプタマーを含む溶液と接触させ；ｃ）場合により、工程ｂ）で得られた結果を、第２の細胞試料分割量または組織切片を前記のオフ速度が遅いアプタマーを欠いた工程ｂ）におけるような溶液と反応させることにより調製された陰性対照と比較し；そしてｄ）前記のオフ速度の遅いアプタマーを前記の標的の存在または非存在の指標として検出する。
[0021] １態様において、オフ速度が遅いアプタマーは、診断的適用において、場合により固定された細胞または組織試料からの１種類以上の標的に関して、その特定の細胞または組織における使用のために選択される。従って、オフ速度が遅いアプタマーは、固定された立体構造において（それが架橋されていようが、またはそうでなければ修飾されていようが）、およびなされる診断に特有の細胞／組織環境において、その標的を特異的に認識するであろう。従って、抗原修復プロセスは不要であろう。
[0022] 別の態様において、オフ速度が遅いアプタマーは、その細胞学的または組織学的試料の内部でそのオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）をそれの（それらの）特異的な標的（単数または複数）に架橋結合させるために用いることができる光反応性の、または化学的に反応性の部分を用いて生成される。そのオフ速度が遅いアプタマーとその特異的な標的の間で共有結合を作る能力は、組織学的または細胞学的調製において必要とされる試料の処理の工程を通した標的に特異的な検出可能部分の保持を促進することができる。
[0023] 他の態様は、抗体よりも実質的に小さく、細胞または組織試料中で向上した分散能力を有しているはずであるオフ速度が遅いアプタマーに頼っている。さらに他の態様
は、細胞および組織試料に対してなされる損傷を低減することができ、実質的に染色プロセスを速めることもできるであろう多数のプロセス工程の排除に頼っている。
[0024] さらに多くの態様は、単一のスライドからの多数の標的をその対応する特異的なオフ速度が遅いアプタマーを用いて分析することを含み、それは廃棄物、処理時間、結果までの時間を低減し、あらゆるその後の試験の必要または記録保管目的（ａｒｃｈｉｖａｌ ｐｕｒｐｏｓｅｓ）のために元の標本を保存するであろう。一部の態様において、これらの多数のオフ速度が遅いアプタマーをそれらの対応する標的と連続的な様式で接触させる。他の態様において、これらの多数のオフ速度が遅いアプタマーをそれらの対応する標的と同時の様式で接触させる。１態様において、その１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーはそれぞれ異なる検出可能部分を用いて生成される。
[0025] 別の態様において、組織学的または細胞学的試料中で標的に特異的なオフ速度が遅いアプタマーの検出により同定された１種類以上の標的（単数または複数）の存在は、疑わしい腫瘍のタイプおよび起源の判別のために用いることができる。これらの標的には腫瘍特異的マーカーおよび組織特異的マーカー、例えばホルモン類またはサイトケラチン類が含まれてよい。別の態様において、組織学的または細胞学的試料中で標的に特異的なオフ速度が遅いアプタマーの検出により同定された１種類以上の標的（単数または複数）の存在は、適切な療法剤の選択のために、および可能性のある結果を評価するために用いられてよい。
[0026] １態様において、組織学的または細胞学的評価の工程ａ）およびｂ）は以下の工程の１つ以上を含んでいてよい：細胞または組織試料の収集、その細胞または組織試料の固定、脱水、透徹（ｃｌｅａｒｉｎｇ）、その細胞または組織試料の顕微鏡スライド上での固定化、その細胞または組織試料の透過処理、抗原修復のための処理、染色、脱染、洗浄、およびブロッキング。１態様において、その細胞試料は細胞のブロックから生成される。１態様において、組織試料に関する固定および脱水工程は凍結工程で置き換えられる。
[0027] １態様において、１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーを染色工程の前に組織学的または細胞学的試料と接触させる。別の態様において、検出可能な部分／標識、例えば蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）または色素を含有する１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーを、その標的分子を染色するために組織学的または細胞学的試料と接触させる。
[0028] １態様において、組織学的または細胞学的評価における使用のための１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーは、さらにブロッキング物質、競合剤、界面活性剤、安定剤、キャリヤー核酸、ポリ陰イオン性物質等を含んでいてよい緩衝された溶液中で混合される。
[0029] 別の態様において、組織学的または細胞学的試料と接触した１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーは、核酸増幅法における核酸標的として働くことができる。その核酸増幅法にはＰＣＲ、ｑ−ベータレプリカーゼ、ローリングサークル増幅、鎖置換、ヘリカーゼ依存性の増幅、ループに仲介される等温増幅、リガーゼ連鎖反応、ならびに制限および環状化に助けられるローリングサークル増幅が含まれてよい。
[0030] １態様は特定の疾患状態の診断のための方法を記述し、前記の方法は以下のことを含む：ａ）組織または細胞試料を得て、前記の試料を複数の組織切片または細胞調製物に分割し；ｂ）前記の組織切片または細胞調製物の１つを、前記の組織または細胞試料の内部に含有される１種類以上の標的に対する１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーを
含む溶液と接触させ；ｃ）場合により、工程ｂ）で得られた結果を、第２の組織切片または細胞調製物を前記のオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）を欠いた工程ｂ）におけるような溶液と接触させることにより調製された陰性対照と比較し；ｄ）場合により、工程ｂ）で得られた結果を、その組織または細胞型および疾患状態に適した形態学的分析のために前記の第３の組織切片または細胞調製物を染色することにより調製された第３の組織切片または細胞調製物と比較し；そしてｅ）前記の疾患状態を診断する。
[0031] １態様において、その１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーは検出可能部分を用いて生成され、それらのそれぞれの標的（単数または複数）との反応の後、未反応のオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）を除去するための任意の洗浄工程の後直接検出することができる。他の態様において、その１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーのそれらのそれぞれの標的（単数または複数）との相互作用は、シグナルの生成を支持するための要素の２種類の構成要素が反応した後検出される。
[0032] 別の態様において、そのオフ速度が遅いアプタマーは、任意の固定された組織または細胞標本を用いて選択、同定、生成、および／または合成される。ＳＥＬＥＸプロセスの前に、その固定された組織を、試料の膜を透過性にするために、染色プロセスにおいて用いられる方法と同等の方法により処理してよい。ＳＥＬＥＸプロセスにおいて用いられる固定の方法は、実際の組織学的／細胞学的手順で組織または細胞試料に対して用いられる固定方法と同じものであってよい。そのオフ速度が遅いアプタマーがそれに対して特異的である標的は、分析される試料中に存在するであろう固定された立体構造で、選択プロセスにおいてアプタマーライブラリーに提示される必要がある。
[0033] 別の態様において、組織学的または細胞学的試料中でその同族のオフ速度が遅いアプタマーの存在により検出される標的は、その療法計画の設計を導くために、または利用可能な療法計画に対する可能性のある応答を予測するために用いられてよい。
[0034] １態様において、アプタマー試薬を用いる様々な組織化学および細胞学の適用のためのキットを、本明細書で開示される方法に基づいて調製することができる。
[0035] 図１は、組織学的スライドに関するいくつかの異なる染色、染色される物質およびその染色される物質の予想される色を図説する。 [0035] 図１は、組織学的スライドに関するいくつかの異なる染色、染色される物質およびその染色される物質の予想される色を図説する。 [0036] 図２は、遅いオフ速度の濃縮プロセスを組み込む工程を含む例示的なＳＥＬＥＸ法を図説する。 [0037] 図３は、本開示において用いられる代表的なアプタマーの鋳型、プライマー、および相補的オリゴヌクレオチド配列を図説する。そのオリゴヌクレオチドは標準的固相合成技法により調製された。Ｂ＝ｄＴ−ビオチン。 [0038] 図４は、実施例２で記述されるような遅いオフ速度の濃縮プロセスを含まずに（図４Ａ）、および含んで（図４Ｂ）選択された親和性アプタマーに関する解離速度定数のヒストグラムを図説する。 [0039] 図５Ａおよび５Ｂは、実施例２で記述される選択プロセスにおいて、候補混合物を調製する、または様々な工程を実施するために用いられたオリゴヌクレオチドを示す。そのオリゴヌクレオチドは標準的固相合成技法により調製された。ＢｒｄＵ（５−ブロモ−ｄＵＴＰ）、アントラキノン（ＡＱ）、およびソラレン（Ｐｓｏｒ）発色団をホスホロアミダイトとして購入し、合成の間に順方向プライマーの５’末端に添加した。４−アジド−２−ニトロ−アニリン（ＡＮＡ）をパラ−ニトロ−フェニルカーボネート誘導体として調製し、合成後に５’ヘキシルアミンホスホロアミダイトにカップリングさせた。この実施例では、１および２と称される２種類の候補混合物配列を用いた。Ｂ＝ｄＴ−ビオチン。鋳型１（図５Ａ）は５’−ＢｒｄＵ、ＡＱ、およびＡＮＡを含有する候補混合物と共にのみ用いられた。鋳型２（図５Ｂ）は実施例２に関して５’−Ｐｓｏｒを含有する候補混合物と共にのみ用いられた。 [0039] 図５Ａおよび５Ｂは、実施例２で記述される選択プロセスにおいて、候補混合物を調製する、または様々な工程を実施するために用いられたオリゴヌクレオチドを示す。そのオリゴヌクレオチドは標準的固相合成技法により調製された。ＢｒｄＵ（５−ブロモ−ｄＵＴＰ）、アントラキノン（ＡＱ）、およびソラレン（Ｐｓｏｒ）発色団をホスホロアミダイトとして購入し、合成の間に順方向プライマーの５’末端に添加した。４−アジド−２−ニトロ−アニリン（ＡＮＡ）をパラ−ニトロ−フェニルカーボネート誘導体として調製し、合成後に５’ヘキシルアミンホスホロアミダイトにカップリングさせた。この実施例では、１および２と称される２種類の候補混合物配列を用いた。Ｂ＝ｄＴ−ビオチン。鋳型１（図５Ａ）は５’−ＢｒｄＵ、ＡＱ、およびＡＮＡを含有する候補混合物と共にのみ用いられた。鋳型２（図５Ｂ）は実施例２に関して５’−Ｐｓｏｒを含有する候補混合物と共にのみ用いられた。 [0040] 図６は、図５Ａおよび５Ｂにおいて図説されているような順方向プライマーの５’末端にカップリングした発色団の化学構造を図説する。 [0040] 図６は、図５Ａおよび５Ｂにおいて図説されているような順方向プライマーの５’末端にカップリングした発色団の化学構造を図説する。 [0041] 図７は、実施例３において記述されているような５’固定光ＳＥＬＥＸを用いるＴＩＭＰ−３ ５’ＡＮＡ／ＢｎｄＵ濃縮ライブラリーの架橋活性のＰＡＧＥ分析を図説する。ゲルは、未結合アプタマー（Ａｆ）、分子内で架橋されたアプタマー（Ａｆ ＊）、および架橋されたタンパク質：アプタマー複合体（Ｐ：Ａ）の分離を図説する。 [0042] 図８は、それに関してアプタマーが同定されている５００を超える標的のチャートである。これらのアプタマーの多くは、それらのそれぞれの標的からの遅い解離速度を有するように設計された。 [0042] 図８は、それに関してアプタマーが同定されている５００を超える標的のチャートである。これらのアプタマーの多くは、それらのそれぞれの標的からの遅い解離速度を有するように設計された。 [0042] 図８は、それに関してアプタマーが同定されている５００を超える標的のチャートである。これらのアプタマーの多くは、それらのそれぞれの標的からの遅い解離速度を有するように設計された。 [0042] 図８は、それに関してアプタマーが同定されている５００を超える標的のチャートである。これらのアプタマーの多くは、それらのそれぞれの標的からの遅い解離速度を有するように設計された。 [0042] 図８は、それに関してアプタマーが同定されている５００を超える標的のチャートである。これらのアプタマーの多くは、それらのそれぞれの標的からの遅い解離速度を有するように設計された。 [0043] 図９Ａ〜図９Ｄは、固定化タグ、標識、光架橋部分、スペーサー、および遊離可能部分を含む、様々な異なる、および任意の官能性を含有するアプタマー構築物を図説する。 [0044] 図１０Ａ〜図１０Ｆは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を図説する。 [0044] 図１０Ａ〜図１０Ｆは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を図説する。 [0044] 図１０Ａ〜図１０Ｆは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を図説する。 [0044] 図１０Ａ〜図１０Ｆは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を図説する。 [0044] 図１０Ａ〜図１０Ｆは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を図説する。 [0044] 図１０Ａ〜図１０Ｆは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を図説する。 [0045] 図１１は、本開示で記述されるアプタマーおよびプライマー構築物を図説する。Ｃｙ３はシアニン３色素、ＰＣは光切断可能なリンカー、ＡＮＡは光反応性架橋基、（ＡＢ）２はｄＡ残基により分離されたビオチン残基の対、そして（Ｔ）８はポリｄＴリンカーを表す。プライマー構築物は、アプタマー構築物の完全な３’固定領域に相補的である。 [0046] 図１２Ａ〜１２Ｃは、３種類の異なる標的に関する伝統的なアプタマーに対するオフ速度が遅いアプタマーに関する用量反応曲線を図説する。 [0046] 図１２Ａ〜１２Ｃは、３種類の異なる標的に関する伝統的なアプタマーに対するオフ速度が遅いアプタマーに関する用量反応曲線を図説する。 [0046] 図１２Ａ〜１２Ｃは、３種類の異なる標的に関する伝統的なアプタマーに対するオフ速度が遅いアプタマーに関する用量反応曲線を図説する。 [0047] 図１３Ａおよび１３Ｂは、標的がペプチドであったオフ速度が遅いアプタマーに関する性能曲線を図説する。 [0047] 図１３Ａおよび１３Ｂは、標的がペプチドであったオフ速度が遅いアプタマーに関する性能曲線を図説する。 [0048] 図１４は、この開示に含まれるヌクレオチドの塩基修飾を記述している。用いられてよいＲ基を、そのヌクレオチドの結合点とそのＲ基の間で用いられてよいリンカー（Ｘ）に加えて記述する。様々な“Ｒ”基に関する結合の位置もそれぞれのＲ基上に示す。 [0048] 図１４は、この開示に含まれるヌクレオチドの塩基修飾を記述している。用いられてよいＲ基を、そのヌクレオチドの結合点とそのＲ基の間で用いられてよいリンカー（Ｘ）に加えて記述する。様々な“Ｒ”基に関する結合の位置もそれぞれのＲ基上に示す。 [0049] 図１５は、Ｃ−５修飾ピリミジンを含有するオフ速度が遅いアプタマーのトロンビンに対する結合定数の決定において用いられたプロットを図説する。 [0050] 図１６は、５’−ビオチンタグ、脱塩基スペーサーおよびＣｙ３標識を含むアプタマー構築物を図説する。この構築物は、実施例９〜１１で記述されるアプタマーの合成において用いられた。 [0051] 図１７Ａは、１００ｎＭ Ｃｙ３−ＨＥＲ２アプタマー＋１ｎＭ デキストラン硫酸で染色したＨＥＲ２陽性浸潤性腺管癌の組織を図説する。核はＤＡＰＩで対比染色されている。図１７Ｂは、図１７Ａにおけるものと同じ試料からの拡大されたＣｙ３チャンネルの逆重畳積分を図説しており、膜性のアプタマーの位置を示している。図１７Ｃは、１００ｎＭ Ｃｙ３−ＨＥＲ２アプタマー＋１ｎＭ デキストラン硫酸で染色したＨＥＲ２陰性乳房腫瘍を図説する。核はＤＡＰＩで対比染色されている。 [0052] 図１８Ａは、競合剤の非存在下でＣｙ３−ＨＥＲ２アプタマーで染色したＨＥＲ２陽性乳癌組織を図説する。図１８Ｂは、緩衝液での洗浄および１ｍＭデキストラン硫酸との３０分間の保温の後の図１８Ａにおけるような腫瘍組織を図説する。 [0053] 図１９Ａ〜Ｃは、以下の条件の下で１ｍＭデキストラン硫酸の存在下でＣｙ３−ＨＥＲ２アプタマーで染色したＨＥＲ２ ＩＨＣ３＋の浸潤性腺管癌の凍結切片を図説する：１分間（図１９Ａ）、５分間（図１９Ｂ）および３０分間（図１９Ｃ）の染色時間において[アプタマー]＝１００ｎＭ、ならびに１分間の染色時間において[アプタマー]＝１μＭ（図１９Ｄ）。 [0054] 図２０Ａは、ＨＥＲ２ ＳＯＭＡマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）が１ｍＭデキストラン硫酸の存在下で解離した際の核の蛍光を図説する。示したデータはｎ＝５の核に関する平均＋／−ＳＤであり、非線形回帰からの曲線の当てはめを含む。分かりやすくするために５番目の時点ごとに示す。図２０Ｂは、ＳＯＭＡマーが１ｍＭデキストラン硫酸および１００ｎＭ非蛍光ＨＥＲ２ ＳＯＭＡマーの存在下で解離した際の膜の蛍光を図説する。示したデータは、着目したｎ＝５の領域に関する平均＋／−ＳＤであり、非線形回帰からの曲線の当てはめを含む。 [0055] 図２１Ａは、１００ｎＭ Ｃｙ３ ＥＧＦＲアプタマー３１３８−４９＋１ｍＭデキストラン硫酸で染色した正常な皮膚を図説しており；核はＤＡＰＩで対比染色されている。図２１Ｂは、１００ｎＭ Ｃｙ３ ＥＧＦＲアプタマー３１５９−１＋１ｍＭデキストラン硫酸で染色した正常な皮膚を図説しており、核はＤＡＰＩで対比染色されている。図２１Ｃは、１００ｎＭビオチン化ＥＧＦＲアプタマー３１５９−１＋１ｍＭデキストラン硫酸による正常な皮膚の染色を図説しており、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼにより検出した。 [0056] 図２２Ａは、ヒト前立腺組織における標準的な抗体免疫蛍光を図説する。図２２Ｂは、２０ｎＭ Ｑｄｏｔ６０５−ＰＳＡアプタマー＋１ｍＭデキストラン硫酸で染色した前立腺組織を図説しており、核はＤＡＰＩで対比染色されている。図２２Ｃは、拡大された、ＤＡＰＩ対比染色無しの、図２２Ｂにおけるような前立腺組織におけるＰＳＡのアプタマー染色を図説する。図２２Ｄは、ＤＡＰＩ染色有り（図２２Ｄ）および無し（図２２Ｅ）での、図２２ＢおよびＣにおけるような前立腺組織を図説する。
[0057] 本明細書で開示される本発明の実施は、別途示さない限り、当技術分野の技術レベル内の化学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技法の一般に行われる方法を用いる。そのような技法は文献において完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（現行版）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌ． ＩおよびＩＩ（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ監修）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ監修、現行版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修、現行版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ監修、現行版；Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（Ｓ．Ｅ． Ｍｉｌｌｓ、現行版）を参照。この明細書において引用されるすべての刊行物、公開された特許文書、および特許出願は、本発明が属する当技術分野（単数または複数）の技術のレベルを示す。本明細書で引用されるすべての刊行物、公開された特許文書、および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、公開された特許文書、または特許出願を具体的に、かつ個別に援用することを示したのと同じ程度まで本明細書に援用される。
[0058] 付随する請求項を含めて、この明細書で用いられる際、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”には、内容が明確に別途指示しない限り、複数の言及も含まれ、“少なくとも１つ”および“１つ以上”と互換的に用いられる。従って、“アプタマー（単数）”への言及にはアプタマー（複数）の混合物が含まれ、“プローブ（単数）”への言及にはプローブ（複数）の混合物が含まれる、などである。
[0059] 本明細書で用いられる際、用語“約”は、数値が関連する項目の基本的な機能が変わらないような、数値の重要でない修正または変動を表す。
[0060] 本明細書で用いられる際、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、“含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、“含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）”、“含まれること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”、“含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）”、“含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”、およびそれらのあらゆる変形は、非排他的な包含を含むことが意図されており、従って、要素もしくは要素のリストを含む、要素もしくは要素のリストが含まれる、または要素もしくは要素のリストを含有する、問題のプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または組成物には、それらの要素のみが含まれるのでなく、問題のそのようなプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または組成物に明確に列挙されていない、または本来備わっていない他の要素も含まれてよい。
[0061] 本明細書で用いられる際、“核酸リガンド”、“アプタマー”および“クローン”は互換的に用いられ、標的分子に対して望ましい作用を有する、または有する可能性がある非天然存在核酸を指す。望ましい作用には標的の結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を修正する、または変化させる方式での標的との反応、（自殺阻害剤におけるような）標的への共有結合および標的と別の分子の間の反応の促進が含まれるが、それらに限定されない。１態様において、その作用は標的分子に関する特異的結合親和性であり、そのような標的分子は主にワトソン／クリック塩基対形成または三重鎖らせん結合に依存しない機構によりアプタマーに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここでそのアプタマーは標的分子に結合される既知の生理的機能を有する核酸では無い。アプタマーには、以下の：（ａ）その候補混合物をその標的と接触させ、ここで、その候補混合物中で他の核酸と比較してその標的に対して増大した親和性を有する核酸をその候補混合物の残りの部分から分配してよく；（ｂ）その親和性が増加した、および／またはオフ速度が遅い核酸をその候補混合物の残りの部分から分配し；そして（ｃ）その親和性が増加したオフ速度が遅い核酸を増幅して核酸のリガンド濃縮混合物を得て、それによりその標的分子に対するアプタマーを同定することを含む方法により核酸の候補混合物から同定される核酸が含まれ、そのアプタマーは所与の標的のリガンドである。親和性相互作用は程度の問題であることが認識されている；しかし、この文脈では、それの標的に関するアプタマーの“特異的結合親和性”は、そのアプタマーが混合物または試料中の他の非標的構成要素に結合するよりも一般にはるかに高い程度の親和性でそれの標的に結合することを意味する。“アプタマー（単数）”または“核酸リガンド”は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは種のコピーのセットである。アプタマーにはあらゆる適切な数のヌクレオチドが含まれ得る。“アプタマー（複数）”は、１個より多くのそのような分子のセットを指す。異なるアプタマーは、同じ数または異なる数のどちらかのヌクレオチドを有してよい。アプタマーはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖、二本鎖であってよく、または二本鎖領域を含有していてよい。
[0062] 本明細書において、“遅いオフ速度”または“遅い解離の速度”または“遅い解離速度”は、アプタマー／標的複合体が解離し始めるのにかかる時間を指す。これは、半減期、ｔ１／２、またはアプタマー／標的複合体の５０％が解離した時点として表すことができる。ｔ１／２値として表される、オフ速度が遅いアプタマーのオフ速度または解離速度は、約１５分以上、約３０分以上、約６０分以上、約９０分以上、約１２０分以上、約１５０分以上、約１８０分以上、約２１０分以上、および約２４０分以上であることができる。
[0063] １態様において、核酸の合成ライブラリーを生成するための方法は以下のことを含む：１）核酸を合成し；２）その核酸を脱保護し；３）その核酸を精製し；そして４）その核酸を分析する。合成工程において、単量体混合物を調製し、ここで、最終産物においてそれぞれのヌクレオチドの等しい比率をもたらすように、その混合物中の様々なヌクレオチドの比率を最適化する。その混合物中の単量体の１種類以上が修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。この手順においてアミダイト保護基が用いられ、１態様においてその
単量体の濃度は０．１Ｍである。合成の間、産物核酸において５’保護基が保持される。合成は固体支持体（調節孔ガラス、ＣＰＧ）上で行われ、少なくとも約８０サイクルを完了して最終産物を合成する。
[0064] 合成プロセスの後、その核酸産物を脱保護する。１．０Ｍ水性リジン緩衝液、ｐＨ９．０を用いて脱プリン塩基部位を切断し、一方でその産物を支持体（調節孔ガラス、ＣＰＧ）上に保持する。これらの切断された切り詰められた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）配列を脱イオン（ｄＩ）水で２回洗い流す。その２回の洗浄の後、脱保護工程のための準備において、５００μＬのｄＩ水を添加する。この工程には１．０ｍＬのｔ−ブチルアミン：メタノール：水、１：１：２を用いた７０℃で５時間の処理が含まれ、続いて凍結、ろ過、および蒸発乾固を行う。その核酸産物を、ＰＲＰ−３ ＨＰＬＣカラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）上で保護基の疎水性に基づいて精製する。適切なカラム画分を集めてプールし、脱塩し、蒸発乾固させて揮発性溶離緩衝液を除去する。その最終産物を遠心分離プロセスにより水で洗浄し、次いで再懸濁する。最後に、再懸濁された物質を処理して最終産物を脱保護する。最終産物を塩基組成、プライマー伸張、および配列決定ゲルにより特性付けする。
[0065] 固相を用いた酵素的方法により核酸の候補混合物または核酸のライブラリーを生成することもできる。１態様において、この方法は上記と同じ基本的工程を含む。この場合、目的はアンチセンスライブラリーの合成であり、これらのライブラリーは５’ビオチン修飾を伴って生成される。全ての残りの合成プロセスは上記の通りである。一度合成ライブラリーを調製したら、その核酸を古典的プライマー伸張法において１種類以上の修飾ヌクレオチドを含有するプライマー伸張混合物中で用いて、最終候補混合物を生成することができる。
[0066] アプタマーはライブラリーの合成に用いられるのと同じ化学により合成することができる。しかし、ヌクレオチドの混合物の代わりに、合成のそれぞれの工程で１種類のヌクレオチドを導入し、型にはまった方法により生成される最終的な配列を制御する。配列中の望まれる位置において、合成プロセスの中に修飾ヌクレオチドを導入してよい。必要に応じて、ヌクレオチドの既知の化学修飾を用いて他の官能性を導入してよい。
[0067] 本明細書で用いられる際、“候補混合物”は、それから望まれるリガンドが選択される、異なる配列の核酸の混合物である。候補混合物の源は、天然存在核酸もしくはその断片、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸、または前述の技法の組み合わせにより作製された核酸からのものであることができる。修飾ヌクレオチド、例えば光反応基または他の修飾を有するヌクレオチドをその候補混合物の中に組み込むことができる。加えて、ＳＥＬＥＸプロセスを用いて候補混合物を生成することができ、すなわち、第１のＳＥＬＥＸプロセス実験を用いてリガンドが濃縮された核酸の混合物を生成することができ、それが第２のＳＥＬＥＸプロセス実験において候補混合物として用いられる。候補混合物は、１種類以上の一般的な構造モチーフを有する核酸を含むこともできる。本明細書において用いられる際、候補混合物は時々“プール”または“ライブラリー”とも呼ばれる。例えば、“ＲＮＡプール”はＲＮＡで構成される候補混合物を指す。
[0068] 様々な態様において、候補混合物中のそれぞれの核酸は、増幅プロセスを容易にするために、ランダム化領域のどちらかの側に固定された配列を有していてよい。核酸の候補混合物中の核酸はそれぞれさらに、増幅プロセスの間の高分子量パラサイトの形成を防ぐために、それらの５’および３’末端に固定された領域または“テール”配列を含むことができる。
[0069] 本明細書で用いられる際、“核酸”、“オリゴヌクレオチド”、および“ポリ
ヌクレオチド”はあらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指して互換的に用いられ、そのようなヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／または類似体または化学的に修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが含まれてよい。用語“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、および“核酸”には二本鎖または一本鎖の分子および三重らせん分子が含まれる。
[0070] 存在する場合、ヌクレオチドの化学的修飾には、単独でまたはあらゆる組み合わせで、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾（例えば５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（５−（Ｎ−ｔｒｙｐｔａｍｉｎｏｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、または５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、異常な塩基対形成の組み合わせ、例えばイソ塩基（ｉｓｏｂａｓｅｓ）、イソシチジンおよびイソグアニジン、および同様のものが含まれ得る。
[0071] １態様において、用語“Ｃ−５修飾ピリミジン”はＣ−５位に修飾を有するピリミジンを指し、図１４において図説されているそれらの部分が含まれるが、それらに限定されない。Ｃ−５修飾ピリミジンの例には、米国特許第５，７１９，２７３号および第５，９４５，５２７号において記述されているＣ−５修飾ピリミジンが含まれる。Ｃ−５修飾の例には、Ｃ−５位のデオキシウリジンの、すぐ下で図説されているような以下のものから選択される置換基による置換が含まれる：ベンジルカルボキシアミド（あるいはベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（あるいはナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（あるいはトリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、およびイソブチルカルボキシアミド（あるいはイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）。
[0072] 上記で描写したように、代表的なＣ−５修飾ピリミジンには以下のものが含まれる：５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）および５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）。
[0073] 修飾には、キャッピングまたはＰＥＧ化のような３’および５’修飾も含まれ得る。他の修飾には、類似体による天然存在ヌクレオチドの１個以上の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結による修飾（例えばメチルホスホネート類、ホスホトリエステル類、ホスホアミデート類、カルバメート類等）および荷電連結による修飾（例えばホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類等）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）による修飾、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、ならびに修飾連結による修飾（例えばアルファアノマー核酸等）が含まれ得る。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホネート基またはリン酸基により置換して；標準的な保護基により保護して；またはさらなるヌクレオチドへの、もしくは固体支持体へのさらなる連結を作るために活性化してよい。その５’および３’末端のＯＨ基はリン酸化することができ、またはアミン類、約１から約２０個までの炭素原子の有機性キャッピング基部分、もしくは約１から約２０個までのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーもしくは他の親水性もしくは疎水性の生物学的もしくは合成ポリマーの有機性キャッピング基部分で置換することができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に与えられてよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成要素により中断されてよい。ポリヌクレオチドは、重合の後に例えば標識化構成要素とのコンジュゲート化によりさらに修飾されてよい。
[0074] ポリヌクレオチドは当技術において一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似型を含有することもでき、それには２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖類、エピマー糖類、例えばアラビノース、キシロース類またはリキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式類似体および脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上記で言及したように、１個以上のホスホジエステル連結を代わりの連結基により置換してよい。これらの代わりの連結基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（“チオエート”）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（“ジチオエート”）、（Ｏ）ＮＲ２（“アミデート”）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（“ホルムアセタール”）により置換されている態様が含まれ、ここでそれぞれのＲまたはＲ’は独立してＨまたは場合によりエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。糖類、プリン類、およびピリミジン類の類似型の置換は最終産物の設計において好都合である可能性があり、例えばポリアミド主鎖のような代わりの主鎖構造も好都合である可能性がある。
[0075] １態様において、アプタマーの可変領域には修飾塩基を含むヌクレオチドが含まれる。特定の修飾アプタマーは、記述される方法、デバイス、およびキットのいずれにおいても用いられてよい。これらの修飾ヌクレオチドは、それらのそれぞれの標的からのオフ速度が非常に遅く、一方で標的に対して高い親和性を維持している新規アプタマーをもたらすことが示されている。１態様において、ピリミジン塩基のＣ−５位を修飾してよい。修飾塩基を有するヌクレオチドを含有するアプタマーは、天然存在ヌクレオチド（すなわち非修飾ヌクレオチド）のみを含む標準的なアプタマーの特性とは異なるいくつかの特性を有する。１態様において、ヌクレオチドの修飾のための方法にはアミド連結の使用が含まれる。しかし、他の適切な修飾のための方法が用いられてもよい。
[0076] 本明細書で用いられる際、“修飾核酸”は１個以上の修飾ヌクレオチドを含有する核酸配列を指す。一部の態様において、修飾ヌクレオチドがＳＥＬＥＸプロセスと適合することが望ましい可能性がある。
[0077] “ポリペプチド”、“ペプチド”、および“タンパク質”は、本明細書においてあらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指して互換的に用いられる。そのポリマーは線状または分枝状であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでいてよく、および／またはそれは非アミノ酸により中断されていてよい。その用語は、天然に、または介入により；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、またはいずれかの他の操作もしくは修飾、例えば標識化構成要素とのコンジュゲート化により修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。例えばアミノ酸の１種類以上の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当技術において知られている他の修飾を含有するポリペプチドも、その定義内に含まれる。ポリペプチドは一本鎖または会合鎖（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｉｎｓ）であることができる。“マーカー”は標的分子、しばしばタンパク質を記述するために用いられ、それはそれに関して診断が望まれている特定の疾患または病気の特異的な指標または予測因子（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）である。
[0078] 本明細書で用いられる際、“光反応性ヌクレオチド”は、特定の波長の光の照射の際にタンパク質のような標的と光架橋することができるあらゆる修飾ヌクレオチドを意味する。例えば、光ＳＥＬＥＸプロセスにより生成される光アプタマーには、以下のものから選択される光反応基が含まれ得る：５−ブロモウラシル（ＢｒＵ）、５−ヨードウラシル（ＩＵ）、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラシル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、５−ブロモデオキシウリジン、８−ブロモ−２’−デオキシアデニン、５−ヨード−２’−デオキシウラシル、５−ヨード−２’−デオキシシトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］シトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン、および７−デアザ−７−ブロモグアニン。“光反応性ピリミジン”は、特定の波長の照射の際に標的と光架橋することができるあらゆる修飾ピリミジンを意味する。例示的な光反応性ピリミジン類には５−ブロモ−ウラシル（ＢｒｄＵ）、５−ブロモ−シトシン（ＢｒｄＣ）、５−ヨード−ウラシル（ＩｄＵ）、および５−ヨード−シトシン（ＩｄＣ）が含まれる。様々な態様において、光反応性官能基は標的またはオリゴヌクレオチドの修飾されていない部分によっては吸収されない波長の光を吸収するであろう。
[0079] “ＳＥＬＥＸ”は、望ましい方式で標的と相互作用する（例えばタンパク質に結合する）核酸の選択を、それらの選択された核酸の増幅と組み合わせるプロセスを指す。選択／増幅工程の任意の反復サイクリングが、非常に多数の核酸を含有するプールから標的と最も強く相互作用する１つまたは少数の核酸を選択することを可能にする。選択／増幅手順のサイクリングは、選択された目的が達成されるまで続けられる。ＳＥＬＥＸの方法論はＳＥＬＥＸ特許において記述されている。ＳＥＬＥＸプロセスの一部の態様において、それらの標的に非共有結合的に結合するアプタマーが生成される。ＳＥＬＥＸプロセスの他の態様において、それらの標的に共有結合するアプタマーが生成される。一部の態様において、ＳＥＬＥＸプロセスにおいて用いられる標的は、分析試料がその分析試料の組織学的または細胞学的特性付けにおいてそのオフ速度が遅いアプタマーの使用の間に固定されているであろう様式と同じ様式で固定される。
[0080] 本明細書で用いられる際、用語“増幅”または“増幅すること”は、分子または分子のクラスの量またはコピー数を増大させるあらゆるプロセスまたはプロセス工程の組み合わせを意味する。
[0081] “ＳＥＬＥＸ標的”または“標的分子”または“標的”は、本明細書において、それに対して核酸が望ましい様式で作用し得るあらゆる化合物を指す。ＳＥＬＥＸ標的分子は、限定では無く、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、前述のものいずれかのいずれかの部分または断片等であることができる。さらに、その標的は１種類以上の様式で修飾されていてよい。例えば、タンパク質はグリコシル化、リン酸化、アセチル化、リン脂質等により修飾されていてよい。その標的は異なるレベルまで修飾されていてよい。オフ速度が遅いアプタマーは、修飾のタイプまたはレベルを識別するように生成することができるであろう。１態様において、ＳＥＬＥＸ標的には、例えば既知の核酸結合タンパク質（例えば転写因子）のような、核酸に結合することが知られている分子は含まれない。事実上、あらゆる化学的または生物学的作用因子は適切なＳＥＬＥＸ標的である可能性がある。あらゆる大きさの分子がＳＥＬＥＸ標的として働く可能性がある。標的はまた、その標的とその核酸の間の相互作用の可能性または強度を増進するような特定の方法で修飾することができる。標的には、個々の化合物または分子のあらゆる軽微な変形、例えばタンパク質の場合、例えばアミノ酸配列の軽微な変形、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または分子の同一性を実質的に変化させないあらゆる他の操作もしくは修飾、例えば標識構成要素とのコンジュゲート化も含まれ得る。“標的分子（単数）”または“標的（単数）”は、アプタマーに結合することができる分子または多分子構造の１つのタイプまたは種のコピーのセットである。“標的分子（複数）”または“標的（複数）”は、分子の１個より多くのそのようなセットを指す。標的がペプチドであるＳＥＬＥＸプロセスの態様が“精製されたタンパク質無しでの改変されたＳＥＬＥＸプロセス”と題された米国特許第６，３７６，１９０号において記述されており、それを本明細書にそのまま援用する。図７は、様々なオフ速度が遅いアプタマーを含め、それに関してアプタマーが生成されている５００種類を超える標的を列挙する。その標的は特定の疾患状態または病気を示す“マーカー”または分子であってもよく、それはその特定の疾患状態の診断において、または適切な療法計画の選択のために、または可能性のある療法的有効性の指標として用いられてよい。そのようなマーカーの例には、前立腺癌に関する前立腺特異的抗原、心臓疾患に関するＣＭＢＫ、癌に関するＣＥＡ、ＣＡ１２５、子宮頚癌に関するＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８等が含まれる。療法的有効性を予測するマーカーの例は、ＨＥＲ２である。
[0082] “組織標的”または“組織”は、上記のＳＥＬＥＸ標的の特定の亜集団を指す。この定義に従うと、組織は不均質な環境にある巨大分子の集合である。本明細書で用いられる際、組織は単一の細胞型、細胞型の集合、細胞の凝集物、または巨大分子の凝集物を指す。これは、典型的にはタンパク質のような単離された可溶性分子であるより単純なＳＥＬＥＸ標的とは異なる。１態様において、組織はより単純なＳＥＬＥＸ標的よりも数桁大きい不溶性巨大分子である。組織は多数の巨大分子で構成される複合的な標的であり、それぞれの巨大分子は多数のエピトープを有し、それはタンパク質、脂質、炭水化物等、またはそれらの組み合わせであることができる。組織は一般に、構造および組成両方に関して流動的であることも、または固定されている（ｒｉｇｉｄ）ことも可能である、巨大分子の物理的アレイである。細胞外マトリックスは、構造的に、および組成的にの両方でより固定されている組織の例であり、一方で膜二重層は、構造および組成がより流動的である。組織は一般に可溶性ではなく、固相に留まり、従って分配は比較的容易に成し遂げることができる。組織には、通常は特定の種類の細胞の凝集物が、所与の器官、例えば腎臓組織、脳組織の全体的な細胞基礎構造（ｆａｂｒｉｃ）を示すのに一般的に用いられる構造物質の１つを形成するそれらの細胞間物質と一緒に含まれるが、それらに限定されない。組織の４つの一般的な種類は、上皮組織、結合組織、神経組織、および筋組織である。
[0083] この定義内に入る組織の例には、巨大分子の不均質な凝集物、例えば無細胞であるフィブリン凝塊；細胞の均質または不均質な凝集物；特定の機能を有する細胞を含有するより高次の構造、例えば器官、腫瘍、リンパ節、動脈等；および個々の細胞が含まれるが、それらに限定されない。組織または細胞は、それらの天然の環境中にあるか、単離されているか、または組織培養中にあることが可能である。その組織は、損なわれていないか、または改変されていることが可能である。その改変には、形質転換、形質移入、活性化、および下部構造単離、例えば細胞膜、細胞核、細胞小器官等の単離のような多数の変化が含まれることが可能である。
[0084] 組織、細胞または細胞下構造物の源は、原核生物および真核生物から得ることができる。これにはヒト、動物、植物、細菌、真菌およびウイルス構造物が含まれる。
[0085] 組織ＳＥＬＥＸプロセスが既知の疾患を有する患者から得られた組織／細胞試料から標的特異的なオフ速度が遅いアプタマーを同定するために用いられる場合、二次的な、および任意の対抗選択を実施することは価値がある可能性がある。その対抗選択は、密接に関連しているが異なる細胞型を識別する能力を提供する。この手順において、元々選択されたオフ速度が遅いアプタマーは正常な、または疾患にかかっていない提供者からの組織試料と共に保温されるであろう。このプレスクリーニングされた候補混合物中の、正常な組織と反応したあらゆるオフ速度が遅いアプタマーは、その後の選択から排除されるであろう。この追加の工程は、最終的な選択されたオフ速度が遅いアプタマーが高度に特異的であることを保証するであろう。その正常な組織試料およびその疾患にかかった組織試料は、同じ様式で処理（すなわち固定）されるべきである。
[0086] 本明細書で用いられる際、“競合剤分子”および“競合剤”は、非標的分子と非特異的複合体を形成することができるあらゆる分子を指して互換的に用いられる。この文脈において、非標的分子には未結合のアプタマーが含まれ、ここで、例えば、競合剤を用いてアプタマーが別の非標的分子に非特異的に結合する（再結合する）のを阻害することができる。“競合剤分子（単数）”または“競合剤（単数）”は、分子の１つのタイプまたは種のコピーのセットである。“競合剤分子（複数）”または“競合剤（複数）”は、分子の１個より多くのそのようなセットを指す。競合剤分子には、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えばヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、デキストラン硫酸、ポリデキストラン、脱塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロホスフェート）が含まれるが、それらに限定されない。様々な態様において、１種類以上の競合剤の組み合わせを用いることができる。
[0087] 本明細書で用いられる際、“非特異的複合体”はアプタマーおよびその標的分子以外の２個以上の分子間の非共有結合的会合を指す。非特異的複合体は複数種類の分子の間の相互作用である。非特異的複合体には、アプタマーおよび非標的分子、競合剤および非標的分子、競合剤および標的分子、ならびに標的分子および非標的分子間で形成される複合体が含まれる。
[0088] 本明細書で用いられる際、用語“遅いオフ速度の濃縮プロセス”は、遅い解離速度を有するアプタマー親和性複合体の相対濃度が、より速い、より望ましくない解離速度を有するアプタマー親和性複合体の濃度と比較して増大するように、候補混合物の特定の構成要素の相対濃度を変化させるプロセスを指す。１態様において、その遅いオフ速度の濃縮プロセスは溶液に基づく遅いオフ速度の濃縮プロセスである。この態様において、混合物中でアプタマー親和性複合体を形成する標的または核酸のどちらも遅いオフ速度の濃縮プロセスの間に固体支持体上に固定されないように、溶液に基づく遅いオフ速度の濃縮プロセスは溶液中で行われる。様々な態様において、遅いオフ速度の濃縮プロセスには
、競合剤分子との保温の追加、混合物の希釈、またはこれらの組み合わせ（例えば競合剤分子の存在下での混合物の希釈）を含む、１個以上の工程が含まれる可能性がある。遅いオフ速度の濃縮プロセスの効果は一般に異なるアプタマー親和性複合体（すなわち候補混合物において標的分子および異なる核酸の間で形成されるアプタマー親和性複合体）の異なる解離速度に依存するため、遅いオフ速度の濃縮プロセスの期間は、遅い解離速度を有するアプタマー親和性複合体を高い比率で保持する一方で速い解離速度を有するアプタマー親和性複合体の数を実質的に低減するように選択される。その遅いオフ速度の濃縮プロセスは、ＳＥＬＥＸプロセスの間の１個以上のサイクルにおいて用いられてよい。希釈および競合剤の添加を組み合わせて用いる場合、それらは同時に、またはあらゆる順序で連続して行われてよい。その遅いオフ速度の濃縮プロセスは、混合物中の総標的（タンパク質）濃度が低い場合に用いることができる。１態様において、その遅いオフ速度の濃縮プロセスが希釈を含む場合、核酸をＳＥＬＥＸプロセスのその後のラウンドのために回収することに留意して、その混合物を現実的である限り希釈することができる。１態様において、その遅いオフ速度の濃縮プロセスには競合剤および希釈の使用が含まれ、競合剤を使用しない場合に必要である可能性があるよりも混合物を少なく希釈することが可能になる。
[0089] １態様において、その遅いオフ速度の濃縮プロセスには競合剤の添加が含まれ、その競合剤はポリアニオン（例えばヘパリンまたはデキストラン硫酸（デキストラン））である。ヘパリンまたはデキストランは、以前のＳＥＬＥＸ選択において特異的アプタマーの同定で用いられてきた。しかし、そのような方法ではヘパリンまたはデキストランが平衡工程の間に存在し、そこでその標的およびアプタマーが結合して複合体を形成する。そのような方法において、ヘパリンまたはデキストランの濃度が増大するにつれて、低親和性標的／アプタマー複合体に対する高親和性標的／アプタマー複合体の比率が増大する。しかし、高濃度のヘパリンまたはデキストランは、核酸および競合剤の間の標的結合に関する競合のため、平衡における高親和性標的／アプタマー複合体の数を低減する可能性がある。対照的に、ここで記述される方法は標的／アプタマー複合体が形成可能となった後に競合剤を添加し、従って形成される複合体の数には影響を及ぼさない。標的およびアプタマー間で平衡結合が起こった後の競合剤の添加は、より少ない標的／アプタマー複合体を含む新たな平衡までの時間に展開する非平衡状態を作り出す。速いオフ速度の複合体がまず解離すると考えられるため、新たな平衡に達する前に標的／アプタマー複合体を捕捉することは、遅いオフ速度のアプタマーに関して試料を濃縮する。
[0090] 別の態様において、遅いオフ速度の濃縮プロセスにおいて、ポリアニオンの存在に対して難分解性であるアプタマーの同定を容易にするためにポリアニオン性競合剤（例えばデキストラン硫酸または別のポリアニオン性物質）が用いられる。この文脈において、“ポリアニオン難分解性アプタマー”は、非ポリアニオン難分解性アプタマーを含むアプタマー／標的複合体よりもポリアニオン難分解性物質も含有する溶液中で解離する可能性がより低いアプタマー／標的複合体を形成することができるアプタマーである。この方式で、ポリアニオン難分解性アプタマーは、試料中の標的の存在または量または濃度を検出するための分析法の実施において、その検出法がそれに対してそのアプタマーが難分解性であるポリアニオン性物質（例えばデキストラン硫酸）の使用を含む場合に用いることができる。
[0091] 従って、１態様において、ポリアニオン難分解性アプタマーを生成するための方法を提供する。この態様において、核酸の候補混合物を標的と接触させた後、候補混合物中の標的および核酸が平衡に達することを可能にする。溶液中にポリアニオン性競合剤を導入し、候補混合物中のオフ速度が速いアプタマーの大部分がその標的分子から解離することを保証するのに十分な期間の間保温しておく。また、ポリアニオン性競合剤の存在下で解離し得る候補混合物中のアプタマーは、標的分子から遊離するであろう。その混合
物を分配して、標的分子と会合したままである高親和性のオフ速度が遅いアプタマーを単離し、あらゆる複合体化していない物質を溶液から除去する。次いで、アプタマーを標的分子から遊離させて単離することができる。単離されたアプタマーをを増幅し、追加の選択ラウンドを適用して選択されたアプタマーの総合的な性能を増大させることもできる。特定の適用に関してオフ速度が遅いアプタマーの選択が必要ではない場合、このプロセスを最小限の保温時間で用いることもできる。
[0092] 従って、１態様において、遅い（長い）オフ速度を有するアプタマーの同定または生成のために改変されたＳＥＬＥＸプロセスを提供し、ここで、標的および候補混合物を接触させ、候補混合物中に含有される標的および核酸間の平衡結合が起こるのに十分な期間の間一緒に保温する。平衡結合の後、過剰な競合剤分子、例えばポリアニオン競合剤を混合物に添加し、あらかじめ決められた期間の間過剰な競合剤分子と一緒に保温する。このあらかじめ決められた保温期間より短いオフ速度を有するアプタマーのかなりの割合が、あらかじめ決められた保温期間の間に標的から解離するであろう。標的に非特異的に結合して標的上のアプタマー結合部位を占めることができる過剰な競合剤分子のため、これらのオフ速度が“速い”アプタマーの標的との再会合は最小限である。より長いオフ速度を有するアプタマーのかなりの割合が、あらかじめ決められた保温期間の間標的と複合体化したままであろう。その保温期間の最後に、核酸−標的複合体を混合物の残りから分配すると、速いオフ速度を有するアプタマーからのオフ速度が遅いアプタマーの集団の分離が可能になる。解離工程を用いてそれらの標的からオフ速度が遅いアプタマーを解離させることができ、そして標的分子に関する高い親和性および特異性を有するオフ速度が遅いアプタマー（個々のアプタマーまたはオフ速度が遅いアプタマーのグループのどちらか）の単離、同定、配列決定、合成および増幅が可能になる。一般に行われるＳＥＬＥＸの様に、改変されたＳＥＬＥＸプロセスの１つのラウンドから同定されたアプタマー配列を新規候補混合物の合成において用いることができ、従って接触、平衡結合、競合剤分子の添加、競合剤分子との保温およびオフ速度が遅いアプタマーの分配の工程を必要に応じた回数反復する／繰り返すことができる。
[0093] 競合剤の添加の前に候補混合物の標的との平衡結合を可能にすることおよびその後に過剰な競合剤を添加してあらかじめ決められた期間の間競合剤と共に保温することの組み合わせは、以前に達成されたオフ速度よりもはるかに長いオフ速度を有するアプタマーの集団の選択を可能する。
[0094] 一度望まれる標的に対する特異的なオフ速度が遅いアプタマーが選択されると、それを合成により、またはクローニングもしくはその特定の核酸配列を生成するためのあらゆる他の方法により生成することができる。
[0095] その標的のみならず正常な組織または細胞試料内のその標的（単数または複数）の密接に関連する構造類似体にも結合する能力を有するリガンドを効果的に除く“カウンターＳＥＬＥＸ”と呼ばれるプロセスにより、さらなる特異性を導入することができる。この態様において、特定の組織に関してオフ速度が遅いアプタマーが選択され、次いでそれに関してそのアプタマーが望まれている特定の特徴を有しない関連する組織に対して対抗選択が行われる。その対抗選択は、類似の細胞株もしくは細胞型、異なる細胞、正常な組織、血漿もしくは血液、非特異的抗体または他の入手可能なリガンドに対して行うことができる。この対抗選択の例は、腫瘍細胞標的（例えば悪性黒色腫）を用いる第１の選択およびその次の得られた核酸の腫瘍では無い（ｎｏｔ ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｉｃ）類似の細胞型（例えば正常ヒトメラニン細胞）に対する対抗選択であろう。正常組織および腫瘍性組織の両方と相互作用するアプタマーはこの負の選択により除去され、その腫瘍細胞に特異的に結合するアプタマーだけが同定される（または保持される）であろう。結果として得られたアプタマーは、腫瘍に特異的であろう。この技法は、２種類の密接に関連す
る標的を、すなわち、癌細胞とその同じ組織型の癌化していない細胞を識別することができるアプタマーを同定する能力を提供するであろう。その対抗選択はインビボでも行うことができる。この方法を用いて、複雑な組織表面上の特異的な標的に対するアプタマーを生成することができるだけでなく、特定のタイプの正常な組織および異常な組織の間の違いを認識することもできる。
[0096] 細胞または組織標的に対するオフ速度が遅いアプタマーを生成するため、その細胞または組織試料をまず候補混合物と混合し、平衡結合を達成する。平衡結合を達成するため、その候補混合物を標的と共に少なくとも約５分間、または少なくとも約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間もしくは約６時間保温する。一度平衡結合が達成されたら、選択プロセスを進めてよい。
[0097] １態様において、オフ速度増進プロセスとして競合剤が用いられる。競合剤分子の候補混合物および標的の混合物とのあらかじめ決められた保温期間は、標的の性質および（もしあるならば）その標的に関する既知のアプタマーの既知のオフ速度のような要因を考慮して、必要に応じて選択されてよい。あらかじめ決められた保温期間は、以下の期間から選択することができる：少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間。
[0098] 他の態様において、オフ速度増進プロセスとして希釈を用いて、その希釈された候補混合物、標的／アプタマー複合体の保温をあらかじめ決められた期間行うことができ、それは以下の期間から選択することができる：少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間。
[0099] 本開示の態様は、オフ速度が遅いアプタマーの同定、生成、合成および使用、ならびにあらゆる特定のアプタマーの使用に関する。これらは、一般に行われるＳＥＬＥＸにより通常得られるアプタマーの解離半減期より高い非共有結合性アプタマー−標的複合体からの解離半減期（ｔ１／２）を有するアプタマーである。アプタマーおよび標的の非共有結合性複合体を含有する混合物に関して、ｔ１／２はアプタマーの半分がアプタマー−標的複合体から解離するのにかかる時間に相当する。本開示に従う解離速度が遅いアプタマーのｔ１／２は、以下のものの１つから選択される：約１５分以上；約１５分〜約３０分；約３０分〜約２４０分；約３０分〜約６０分；約６０分〜約９０分；約９０分〜約１２０分；約１２０分〜約１５０分；約１５０分〜約１８０分；約１８０分〜約２１０分；約２１０分〜約２４０分。
[00100] ＳＥＬＥＸの手順により同定されるアプタマーに特徴的な特徴は、それの標的に関するそれの高い親和性である。アプタマーは、以下のものの１つから選択される、それの標的に関する解離定数（Ｋｄ）を有するであろう：約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約１ｐＭ未満。
[00101] 本明細書で用いられる際、用語“標識化剤”、“標識”、または“検出可能部分”、または“検出可能要素”または“検出可能構成要素”は、標的分子／アプタマー複合体を検出するために用いることができる１種類以上の試薬を指す。検出可能部分または標識は、直接または間接的に検出可能である。一般に、検出可能であるあらゆるレポーター分子は標識であり得る。標識には、例えば以下のもの：（ｉ）シグナルを生じること
により直接検出することができるレポーター分子、（ｉｉ）続いてレポーター分子を含有する同族分子（ｃｏｇｎａｔｅ）に結合することにより間接的に検出可能である特異的結合対メンバー、（ｉｉｉ）質量分析により検出可能な質量タグ、（ｉｖ）増幅またはライゲーションのための鋳型を提供することができるオリゴヌクレオチドプライマー、および（ｖ）例えばリプレッサータンパク質のようなリガンドとして働くことができる特異的なポリヌクレオチド配列または認識配列が含まれ、ここで、最後の２つの例では、そのオリゴヌクレオチドプライマーまたはリプレッサータンパク質は、レポーター分子等を有する、または有することが可能であろう。そのレポーター分子は、触媒、例えば酵素、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、色素、蛍光分子、量子ドット、化学発光分子、補酵素、酵素基質、放射性基、小さい有機分子、増幅可能なポリヌクレオチド配列、ラテックスまたは炭素粒子のような粒子、金属ゾル、微結晶、リポソーム、細胞等であることができ、それは色素、触媒または他の検出可能な基、質量分析目的のためにそれがコンジュゲートされた分子の重量を変化させる質量タグ、および同様のものでさらに標識されていてよく、またはされていなくてもよい。標識は電磁または電気化学物質から選択することができる。１態様において、その検出可能標識は蛍光色素である。本明細書の開示に基づいて、他の標識および標識スキームが当業者には明らかであろう。
[00102] 検出可能部分（要素または構成要素）には、上記で列挙したレポーター分子のいずれか、およびいずれかの方式で検出可能シグナルを生じるのに用いることができるあらゆる他の化学物質または構成要素が含まれ得る。その検出可能部分またはシグナルを生じる標識は、蛍光シグナル、化学発光シグナル、またはその部分の同一性に応じたあらゆる他の検出可能シグナルを介して検出されてよい。その検出可能部分が酵素（例えばアルカリホスファターゼ）である場合、酵素基質および酵素活性に必要なあらゆる追加の因子の存在下でそのシグナルを生じさせてよい。その検出可能部分が酵素基質である場合、酵素および酵素活性に必要なあらゆる追加の因子の存在下でそのシグナルを生じさせてよい。標的分子に検出可能部分を付着させるための適切な試薬の構成には、検出可能部分の標的分子への共有結合、検出可能部分の標的分子に共有結合している別の標識化剤構成要素との非共有結合的会合、および検出可能部分の標的分子と非共有結合的に会合している標識化剤構成要素への共有結合が含まれる。
[00103] 検出可能部分は標識されたｄＮＴＰ、ホスホラミダイト類として生成された色素、もしくはオリゴヌクレオチド合成の間に用いることができる他の化学を用いることにより合成の間にアプタマー中に組み込まれてよく、または合成後に最終的なアプタマー生成物の修飾により組み込まれてよい。シグナルの生成を増進するために、それぞれのアプタマーが多数の検出可能部分を含んでいてよい。同じ試料、例えば組織学的組織切片からの多数の標的を検出する場合、多数の標的の同時分析のためにそれぞれの標的に特異的なアプタマーが独特の検出可能部分を伴って生成されてよい。
[00104] 一部の態様において、その標識されたアプタマーは組織または細胞試料の迅速かつ特異的な染色を可能にする。例えば、一部の場合において、組織切片または細胞調製物の特異的な標的の染色は、約１５分以内、約１０分以内、約５分以内、および約１分以内に達成することができる。迅速な染色は、術中設定（ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ
ｓｅｔｔｉｎｇ）における異常な、または疾患にかかった組織の診断において特に好都合である。
[00105] 本明細書で用いられる際、“分配”は、それにより混合物の１種類以上の構成要素をその混合物の他の構成要素から分離するあらゆるプロセスを意味する。例えば、標的分子に結合しているアプタマーを標的分子に結合していない他の核酸から、および非標的分子から分配することができる。より広く述べると、分配はそれらの標的分子への相対的親和性および／または解離速度に基づいて候補混合物中の全ての核酸を少なくとも２
つのプールに分離することを可能にする。分配は、濾過、親和性クロマトグラフィー、液体−液体分配、ＨＰＬＣ等を含め、当技術で知られている様々な方法により達成することができる。例えば、核酸−タンパク質対はニトロセルロースフィルターに結合することができるが、未結合核酸はニトロセルロースフィルターに結合しない。核酸−標的複合体を特異的に保持するカラムも分配に使用することができる。例えば、カラム上に結合している標的分子と会合することができるオリゴヌクレオチドは、最も高い親和性のアプタマーを分離および単離するためにカラムクロマトグラフィーの使用を可能にする。その上に標的分子がコンジュゲートしているビーズも、混合物中のアプタマーを分配するのに用いることができる。そのビーズが常磁性である場合、分配は磁場の適用により達成することができる。表面プラズモン共鳴技術を用いて、標的をセンサーチップ上に固定して混合物をそのチップ上を流すことにより混合物中の核酸を分配することができ、ここでその標的に関する親和性を有する核酸はその標的に結合することができ、残った核酸を洗い流すことができる。液体−液体分配を濾過ゲル遅延および密度勾配遠心分離と同様に用いることができる。標的分子上の親和性タグを用いて、溶液中で未結合であるアプタマーからタグ付けされた標的に結合した核酸分子を分離することができる。例えば、ビオチン化された標的分子を、ストレプトアビジン常磁性ビーズを用いて、それらに結合したアプタマーと共に、未結合核酸配列の溶液から隔離することができる。調製の間に親和性タグをアプタマー中に組み込むこともできる。生物学的組織（組織切片または細胞調製物）中の１種類以上の標的に特異的なアプタマーを生成するために組織ＳＥＬＥＸが用いられる場合、候補混合物中の非特異的な核酸は、その組織試料を１系列以上の緩衝された試薬で洗浄することにより、その標的に特異的なアプタマーから分離することができる。
[00106] 本明細書で用いられる際、“光ＳＥＬＥＸ”は指数関数的濃縮によるリガンドの光化学的系統的進化（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の頭文字であり、光架橋アプタマーを生成するＳＥＬＥＸプロセスの態様を指す。光ＳＥＬＥＸプロセスの１態様において、ＲＮＡまたはｓｓＤＮＡランダム化オリゴヌクレオチドライブラリーのどちらかにおいて天然塩基の代わりに光の吸収により活性化される光反応性ヌクレオチドを組み込み、その核酸標的分子混合物に照射し、核酸−標的分子複合体中に組み込まれた一部の核酸を光反応性官能基を介して標的分子に架橋させ、そしてその選択工程は光架橋活性に関する選択である。光ＳＥＬＥＸプロセスは光ＳＥＬＥＸ特許において非常に詳細に記述されている。
[00107] 本明細書において、“光アプタマー”および“光反応性アプタマー”は、標的分子に共有結合する、または標的分子と“架橋する”ことができる１個以上の光反応性官能基を含有するアプタマーを指して互換的に用いられる。例えば、天然存在核酸残基を修飾して、核酸残基上に適切な波長の線源に対する曝露の際の光反応性を与える化学的官能基を含ませることができる。一部の態様において、最初に光反応性アプタマーを同定する。他の態様において、アプタマーをまず同定し、続いてそれを修飾して１個以上の光反応性官能基を組み込み、それにより光アプタマーを生成する。これらの態様において、例えばアプタマー中のチミジンおよび／またはシチジンヌクレオチドの１個以上のような１個以上の他のヌクレオチドの代わりに光反応性核酸残基で置換することによるか、または１個以上の核酸残基を光反応性官能基を含むように修飾することによるかのどちらかにより、１個以上の光反応性核酸残基をアプタマー内に組み込むことができる。
[00108] さらに他の態様において、特定のヌクレオチドを修飾して、親和性複合体中でそれらの標的に結合して共有結合的架橋を形成するオフ速度が遅いアプタマーを生成してよい。この方法は、それらのそれぞれの標的に結合して次いでそれに連結されることができるオフ速度が遅いアプタマーを含む。様々な態様において、そのオフ速度が遅いアプタマーは、光の照射の際にその標的分子に光架橋することができる光反応基を含有してい
てよい。他の態様において、そのオフ速度が遅いアプタマーは、照射の非存在下においてその標的との結合の形成が可能である。そのオフ速度が遅いアプタマーおよび標的の間の緊密なイオン相互作用も、照射の際に起こる可能性がある。化学的架橋に関する他の機構が用いられてもよい。オフ速度が遅いアプタマーのその特異的な標的への架橋は、架橋活性化因子、例えば照射または特定の化学薬剤により開始されてよい。１態様において、光架橋は電磁照射への曝露により起こる。電磁照射には、紫外光、可視光、Ｘ線、およびガンマ線が含まれる。架橋の工程は組織または細胞試料の分析に、そのアッセイ手順のあらゆる点において追加されてよい。
[00109] 光反応基は、光発色団を含有し、標的と光架橋可能であるあらゆる化学構造であることができる。本明細書において光反応基と称されるが、一部の場合では、下記で記述するように、照射はオフ速度が遅いアプタマーおよびその標的の間で共有結合が起こるために必要ではない。一部の態様において、その光反応基は標的またはオリゴヌクレオチドの非修飾部分により吸収されない波長の光を吸収するであろう。光反応基には、５−ハロ−ウリジン類、５−ハロ−シトシン類、７−ハロ−アデノシン類、２−ニトロ−５−アジドベンゾイル類、ジアジリン類、アリールアジド類、フッ素化アリールアジド類、ベンゾフェノン類、アミノ−ベンゾフェノン類、ソラレン類、アントラキノン類等が含まれる。
[00110] 光アプタマーに組み込んでよい例示的な光反応性官能基には、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラシル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−チオウラシル、４−チオシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］シトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン、および７−デアザ−７−ブロモグアニンが含まれる。
[00111] これらの例示的なヌクレオシドに基づく光反応性官能基に加えて、適切なリンカー分子を用いてアプタマーの末端に付加することができる他の光反応性官能基を用いることもできる。そのような光反応性官能基には、ベンゾフェノン、アントラキノン、４−アジド−２−ニトロ−アニリン、ソラレン、これらのいずれかの誘導体、および同様のものが含まれる。
[00112] 光アプタマーに組み込まれる光反応性官能基をいずれかの適切な方法により活性化してよい。１態様において、光アプタマーおよびそれが結合した標的分子を電磁放射線源に曝露することにより、光反応性官能基を含有する光アプタマーをそれの標的に架橋することができる。適切なタイプの電磁放射線には、紫外光、可視光、Ｘ線、およびガンマ線が含まれる。適切な放射線源には、単色光またはフィルター処理した多色光のどちらかを利用する線源が含まれる。
[00113] 本明細書で用いられる際、用語“親和性ＳＥＬＥＸプロセス”は、標的に対する非光架橋アプタマーが生成されるＳＥＬＥＸプロセスの態様を指す。親和性ＳＥＬＥＸプロセスの一部の態様において、標的を核酸の候補混合物と接触させる前または後のどちらかで、標的が固体支持体上に固定される。標的の固体支持体との会合は、候補混合物中の結合している核酸であって、遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いた場合はその標的に結合したままである前記核酸を、候補混合物の残りの部分から分配することを可能にする
。用語“ビーズ親和性ＳＥＬＥＸプロセス”は、例えば核酸の候補混合物との接触の前に標的をビーズ上に固定する、親和性ＳＥＬＥＸプロセスの特定の態様を指す。一部の態様において、そのビーズは常磁性ビーズである。用語“フィルター親和性ＳＥＬＥＸプロセス”は、それらのフィルター、例えばニトロセルロースフィルターとの会合により、核酸標的複合体が候補混合物から分配される態様を指す。これには標的および核酸が最初に溶液中で接触し、そしてフィルターと接触する態様が含まれ、核酸がフィルター上にあらかじめ固定された標的と接触する態様も含まれる。用語“プレート親和性ＳＥＬＥＸプロセス”は、標的が例えばマルチウェルマイクロタイタープレートのようなプレートの表面上に固定される態様を指す。一部の態様において、そのプレートはポリスチレンで構成される。一部の態様において、その標的はプレート親和性ＳＥＬＥＸプロセスにおいて疎水性相互作用によりそのプレートに付着する。
[00114] 本開示は、細胞または組織試料中の１種類以上の標的に結合することができるアプタマーを生成する、および用いるための向上したＳＥＬＥＸ法を記述する。より具体的には、本開示は、以前のＳＥＬＥＸ法を用いて得られるアプタマーよりも遅いそれらのそれぞれの標的からの解離速度を有するアプタマーおよび／または光アプタマーを同定するための方法を記述する。本開示はさらに、本明細書で記述される方法を用いて得られるアプタマーおよび／または光アプタマー、ならびにその同じ物を用いる方法を記述する。場合により、その組織選択プロセスにより選択された特異的な標的の同一性を、伝統的な生化学的単離、精製、および特性付けにより確認するのが望ましい可能性がある。これらの方法は、質量分析、２−Ｄ電気泳動等を含むことができるであろう。
[00115] １態様において、遅いそれの標的からの解離速度を有するアプタマーを同定するための方法であって、以下の：（ａ）核酸配列の候補混合物を調製し；（ｂ）その候補混合物を組織または細胞試料と接触させ、ここで、前記の組織または細胞試料中で目的の標的に対して最高の相対的親和性を有する核酸がその標的に優先的に結合して核酸−標的複合体を形成し；（ｃ）遅いオフ速度の濃縮プロセスを適用して、比較的速い解離速度を有する核酸−標的複合体の解離を可能にし；（ｄ）候補混合物中の未結合核酸および非標的分子の両方から、残りの核酸−標的複合体を分配し；そして（ｅ）目的の標的に対するアプタマーを同定することを含む前記方法を提供する。そのプロセスにはさらに、その標的に結合する核酸を増幅して、その標的に結合することができ、さらに、遅い解離速度を有する核酸−標的複合体を生成することができる配列が濃縮された核酸の混合物を生じる、反復工程が含まれてよい。上記で定義したように、その遅いオフ速度の濃縮プロセスは、（ａ）核酸−標的分子複合体を含有する候補混合物を希釈すること；（ｂ）核酸−標的分子複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加し、そしてその核酸−標的分子複合体を含有する候補混合物を希釈すること；および（ｃ）核酸−標的分子複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加することから選択することができる。
[00116] 場合によりその組織または細胞試料は、そのオフ速度が遅いアプタマーの選択プロセスにおいて、それらの使用の前に固定される。化学的固定剤は標的エピトープを予測可能かつ再現性のある方式で変化させる可能性があり、それはそのエピトープの固定された形に特異的なアプタマーの選択を可能にする。
[00117] １態様において、遅いそれの標的からの解離速度を有するアプタマーを生成するための方法であって、以下の：（ａ）核酸配列の候補混合物を調製し；（ｂ）その候補混合物を組織または細胞試料と接触させ、ここで、その標的に対して最高の相対的親和性を有する核酸がその標的に優先的に結合して核酸−標的複合体を形成し；（ｃ）遅いオフ速度の濃縮プロセスを適用して、比較的速い解離速度を有する核酸−標的複合体の解離を可能にし；（ｄ）候補混合物中の未結合核酸および非標的分子の両方から、残りの核酸
−標的複合体を分配し；そして（ｅ）その標的に対するアプタマーを生成することを含む前記方法を提供する。そのプロセスにはさらに、その標的に結合する核酸を増幅して、その標的に結合することができ、さらに、遅い解離速度を有する核酸−標的複合体を生成することができる配列が濃縮された核酸の混合物を生じる、反復工程が含まれてよい。上記で定義したように、その遅いオフ速度の濃縮プロセスは、（ａ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈すること；（ｂ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加し、そしてその核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈すること；および（ｃ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加することから選択することができる。
[00118] １態様において、遅いそれの標的からの解離速度を有するアプタマーを同定するための方法であって、以下の：（ａ）核酸の候補混合物を調製し；（ｂ）その候補混合物を組織または細胞試料と接触させ、ここで、候補混合物中で他の核酸と比較してその標的に対して増大した親和性を有する核酸がその標的に結合して核酸−標的複合体を形成し；（ｃ）その候補混合物および標的を、平衡結合を達成するのに十分な期間の間、一緒に保温し；（ｄ）（ｃ）の混合物に遅いオフ速度の濃縮プロセスを適用して比較的速い解離速度を有する核酸−標的複合体の解離を可能にし；（ｅ）（ｄ）からの候補混合物、核酸−標的複合体および競合剤分子の混合物を、あらかじめ決められた期間の間保温し；（ｆ）その候補混合物から核酸−標的複合体を分配し；（ｇ）その核酸−標的複合体を解離させて未結合核酸を生成し；（ｈ）その未結合核酸を増幅して増大された親和性でその標的に結合することができる核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得ることを含み、それによりその標的に対するアプタマーを同定することができる、前記方法を提供する。上記で定義したように、その遅いオフ速度の濃縮プロセスは、（ａ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈すること；（ｂ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加し、そしてその核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈すること；および（ｃ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加することから選択することができる。
[00119] 別の態様において、遅いそれの標的からの解離速度を有するアプタマーを生成するための方法であって、以下の：（ａ）核酸の候補混合物を調製し；（ｂ）その候補混合物を組織または細胞試料と接触させ、ここで、候補混合物中で他の核酸と比較してその標的に対して増大した親和性を有する核酸がその標的に結合して核酸−標的複合体を形成し；（ｃ）その候補混合物および標的を、平衡結合を達成するのに十分な期間の間、一緒に保温し；（ｄ）（ｃ）の混合物に遅いオフ速度の濃縮プロセスを適用して比較的速い解離速度を有する核酸−標的複合体の解離を可能にし；（ｅ）（ｄ）からの候補混合物、核酸−標的複合体および競合剤分子の混合物を、あらかじめ決められた期間の間保温し；（ｆ）その候補混合物から核酸−標的複合体を分配し；（ｇ）その核酸−標的複合体を解離させて未結合核酸を生成し；（ｈ）その未結合核酸を増幅して増大された親和性でその標的に結合することができる核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得ることを含み、それによりその標的に対するアプタマーを生成することができる、前記方法を提供する。上記で定義したように、その遅いオフ速度の濃縮プロセスは、（ａ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈すること；（ｂ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加し、そしてその核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈すること；および（ｃ）核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加することから選択することができる。
[00120] 別の態様において、遅いそれの標的からの解離速度を有するアプタマーを同定する方法であって、以下の：（ａ）核酸の候補混合物を調製し、ここで、その候補混合物は、その候補混合物の少なくとも１種類の、またはそれぞれの核酸中の１個、いくつか、または全てのピリミジンが５位において化学的に修飾されている修飾された核酸を含み
；（ｂ）その候補混合物を細胞または組織試料と接触させ、ここで、候補混合物中で他の核酸と比較してその標的に対して増大した親和性を有する核酸がその標的に結合して核酸−標的複合体を形成し；（ｃ）親和性が増大した核酸を候補混合物の残りから分配し；そして（ｄ）親和性が増大した核酸を増幅して、増大した親和性で標的に結合することができる核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得ることを含み、それによりその標的に対するアプタマーを同定することができる、前記方法を提供する。
[00121] 別の態様において、遅いそれの標的からの解離速度を有するアプタマーを生成するための方法であって、以下の：（ａ）核酸の候補混合物を調製し、ここで、その候補混合物は、その候補混合物の少なくとも１種類の、またはそれぞれの核酸中の１個、いくつか、または全てのピリミジンが５位において化学的に修飾されている修飾された核酸を含み；（ｂ）その候補混合物を組織または細胞試料と接触させ、ここで、候補混合物中で他の核酸と比較してその標的に対して増大した親和性を有する核酸がその標的に結合して核酸−標的複合体を形成し；（ｃ）親和性が増大した核酸を候補混合物の残りから分配し；そして（ｄ）親和性が増大した核酸を増幅して、増大した親和性で標的に結合することができる核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、それによりその標的に対するアプタマーを同定するプロセスにより同定される核酸配列を含むアプタマーを調製する、または合成することを含む前記方法を提供する。
[00122] 別の態様において、アプタマーおよびその標的の非共有結合性複合体が提供され、ここでそのアプタマーのその標的からの解離半減期（ｔ１／２）は以下のものの１つから選択される：約１５分以上；約１５分〜約３０分；約３０分〜約２４０分；約３０分〜約６０分；約６０分〜約９０分；約９０分〜約１２０分；約１２０分〜約１５０分；約１５０分〜約１８０分；約１８０分〜約２１０分；約２１０分〜約２４０分。
[00123] 別の態様において、アプタマーおよび標的の非共有結合性複合体が提供され、ここでそのアプタマーはその標的に関して約１００ｎＭ以下のＫｄを有し、ここでそのアプタマーのその標的からの解離半減期（ｔ１／２）は約１５分以上であり、ここでそのアプタマーの核酸配列中の１個、いくつか、または全てのピリミジンがその塩基の５位において修飾されている。その修飾は図１４において示されている化合物のグループから選択されてよく、これらの修飾を“塩基修飾ヌクレオチド”と称する。アプタマーは望まれる塩基修飾ピリミジンのあらゆる組み合わせを用いて設計されてよい。
[00124] 光活性基を含有するヌクレオチドまたは光活性基のための位置維持基を含有するヌクレオチドを含め、修飾ヌクレオチドを用いてＳＥＬＥＸを実施するための向上した方法が、“向上したＳＥＬＥＸおよび光ＳＥＬＥＸ”と題された、２００８年７月１７日に出願された米国出願一連番号１２／１７５，３８８において開示されており、それを本明細書にそのまま援用する。別の態様において、核酸分子の候補混合物には、比較的遅い解離速度を有する修飾核酸−標的複合体の形成を助けることができる修飾ヌクレオチド塩基を含有する核酸が含まれる。
[00125] 本明細書で記述される様々な方法および工程を用いて、（１）標的分子に結合することができるかまたは（２）標的分子に結合し、続いて照射の際に標的分子と共有結合を形成することができるかのどちらかであるアプタマーを生成することができる。
[00126] 本明細書で記述される方法に従って同定されるアプタマーは、ある範囲の診断的および療法的方法において有用である。オフ速度が遅いアプタマーは、より長い期間の間標的に結合するであろう。これは、標的に対するアプタマーの結合を標的分子の存在、非存在、量（ａｍｏｕｎｔ）または量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）を検出するために用いることができる診断法において有用であり、アプタマーおよび標的の相互作用の延長はそのよ
うな検出を容易にする。オフ速度が遅いアプタマーがインビトロまたはインビボの画像化法において用いられる場合に類似の利点がもたらされる可能性がある。また、アプタマーおよび標的の相互作用の延長は、その延長された相互作用が、例えばその標的分子または下流のシグナル伝達カスケードのより長い活性化または阻害により、向上した療法的作用を可能にすることができる場合に、向上した療法的処置方法を提供する。これらのオフ速度が遅いアプタマーおよび高い親和性を有するアプタマーは、細胞学的および組織学的分子検出および同定法において用いることができる。
[00127] 従って、様々な態様において、記述した方法により得られた、同定された、または生成されたオフ速度が遅いアプタマーを、様々な医学的処置の方法または（インビトロまたはインビボでの）診断の方法において用いることができる。１態様において、オフ速度が遅いアプタマーを疾患の処置の方法において用いることができる。１態様において、オフ速度が遅いアプタマーをインビボでの疾患の診断のための方法において用いることができる。別の態様において、オフ速度が遅いアプタマーを疾患の診断のためにインビトロで用いることができる。別の態様において、オフ速度が遅いアプタマーを、疾患の処置または診断の方法における使用のための療法剤（例えば医薬組成物）の製造または診断剤の製造において用いることができる。オフ速度が遅いアプタマーの診断的または療法的適用は、それの標的に対するオフ速度が遅いアプタマーの特異的および／または高親和性結合に応じた診断的または療法的結果を伴う可能性がある。オフ速度が遅いアプタマーは、薬物開発プロセスにおける標的の検証およびハイスループットスクリーニングアッセイにおいて用いられてもよい。
[00128] １態様において、オフ速度が遅いアプタマーはインビボでの分子画像化に適した試薬である。この態様において、オフ速度が遅いアプタマーをインビボで用いて病変、疾患プロセス、または個体（例えばヒトまたは動物）の体内の他の状態を検出することができ、ここでそのアプタマーのそれの標的への結合は疾患プロセスまたは他の状態の存在を示す。例えば、ＶＥＧＦ受容体は腫瘍およびそれらの新規血管系の内部で豊富に発現されているため、ＶＥＧＦ受容体に対するアプタマーをインビボで用いて個体の体の特定の領域（例えば組織、器官等）において癌の存在を検出することができ、または、ＥＧＦ受容体はしばしば腫瘍細胞上で高レベルで発現されているため、ＥＧＦ受容体に対するアプタマーをインビボで用いて個体の体の特定の領域（例えば組織、器官等）において癌の存在を検出することができる。すなわち、その分子標的は誘導される受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であり、これはそのような標的が細胞の外側に位置し、血管系を通してアクセス可能であるためである。加えて、例え特定のＥＣＤの一部の小さな割合が細胞死を含む生物学的プロセスを通して取り除かれる可能性があるとしても、ＥＣＤは病変部位に局在する傾向がある。
[00129] 分子画像化に関する明確な候補である、高親和性モノクローナル抗体は、この適用に関して選択される試薬ではなくなってきている。分子画像化試薬は正確である必要性を有する。それらは、それらの意図される標的に関する高い結合活性およびヒトまたは動物における他の標的に関する低い結合活性を有していなければならない。オフ速度が遅いアプタマーは、それらをインビボでの分子画像化での使用に望ましいものにする独特の利点を有する。一方で、それらは遅い解離速度定数を有するように選択され、従ってインビボでかなりの長さの時間（少なくとも約１５分間）の間、意図される標的上に留まることが可能である。他方で、オフ速度が遅いアプタマーは血管系からの非常に速いクリアランスを有することが期待される。遅い解離速度定数および血管系からの速いクリアランスは、インビボでの分子画像化に望まれる２つの特性である。速度論的視点（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）から、優れたインビボ分子画像化試薬は病変部位に局在し続けなければならず、一方で周囲の血管系における未結合試薬濃度は低くなる。これはシグナル対ノイズの制約である。適切なシグナル対ノイズ比は、血管系における過剰なシグナル中での病変
部位におけるシグナルの蓄積により得られる可能性があり、または病変部位におけるシグナルの保持の一方で血管系での濃度が減少することにより得られる可能性がある。
[00130] オフ速度が遅いアプタマーとほぼ同じ分子量および正味電荷を有する、遅いオフ速度の特性を持たないアプタマーは、１０年より長い期間動物およびヒトにおいて研究されてきた。一般に、これらのアプタマーは通常腎臓および／または肝臓に入り、次いで排出のためにさらに代謝されることにより、血管系から迅速に排除されることが見出されている。そのようなアプタマーは、（例えばＰＥＧのような）高分子量付加物がアプタマーに連結されていない限り、いわゆる“初回通過（ｆｉｒｓｔ ｐａｓｓ）”クリアランスを示す。その標的が一部の腫瘍において高濃度で見られる細胞外タンパク質（ＥＣＤではない）であるテネイシンＣであるアプタマーを用いて実験が行われてきた。これらの実験において、テネイシンＣ特異的アプタマーは迅速に排除され、テネイシンＣの細胞外局所濃度が非常に高いため、腫瘍の部位に保持されることが可能であった。対照的に、オフ速度が遅いアプタマーはアプタマーの速いクリアランス速度を維持するが、それらの遅い解離速度のため、速度論的な利点を提供すると考えられ、それはそれらを目的の部位（例えば病変部位）におけるそれの存在がいくらか希薄である可能性がある標的（例えば腫瘍上のＥＣＤ）に関して使用するのに適したものにする。
[00131] 分子画像化のための代わりの試薬は、オフ速度が遅いアプタマーの２つの特性（すなわち遅い解離速度および体からの速いクリアランス）を共有しない。モノクローナル抗体はしばしば高い親和性および特異性を有し、遅い解離速度定数を有する可能性がある；しかし、モノクローナル抗体は血管系からの非常に遅いクリアランス速度を有する。例えばファージディスプレイを通して同定された短いペプチドは、速いクリアランスを有するが、劣った親和性および特異性ならびにそれらの意図される標的からの速い解離速度を有する可能性がある。抗体模倣体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）の特定のペプチド版であるＡｆｆｉｂｏｄｙは妥当な親和性および特異性を有する可能性があり、モノクローナル抗体よりも速いクリアランスを有する可能性があるが、それらの標的からの遅い解離速度を達成するため、ａｆｆｉｂｏｄｙはしばしば二量体およびより高次の多量体へと作られ、それはそれらの解離速度を高めると同時にそれらのクリアランスを遅くする。
[00132] オフ速度が遅いアプタマーを、インビボでの分子画像化のために、そのオフ速度が遅いアプタマーを体内でヌクレアーゼから保護し、かつそのオフ速度が遅いアプタマーが一度結合した意図される標的を検出するための１種類以上の低分子量付加物と共に用いることができる。例えば、オフ速度が遅いアプタマーは血中のヌクレアーゼ、典型的には（ＤＮＡに関して）そのオフ速度が遅いアプタマーの５’および３’末端の位置においてエキソヌクレアーゼ難分解性付加物を用いることにより容易に妨害されるエキソヌクレアーゼ、または（ＲＮＡに関して）そのオフ速度が遅いアプタマー中に（例えば２’フルオロヌクレオチドのような）エンドヌクレアーゼ難分解性ピリミジンを組み込むことにより容易に妨害されるエンドヌクレアーゼにより攻撃される可能性がある。オフ速度が遅いアプタマー−標的複合体の検出は、そのオフ速度が遅いアプタマーに検出部分を付着させることにより達成することができる。一部の態様において、これらの目的のための検出部分には放射性分子（例えばテクネチウム９９）のためのケージ、磁気共鳴検出のための鉄のクラスター、ＰＥＴ画像化のためのフッ素の同位体、および同様のものが含まれる可能性がある。体内のオフ速度が遅いアプタマーの完全性を保護し、意図される標的の検出を可能にするためにオフ速度が遅いアプタマーに対してなされる修飾は、それらがそのオフ速度が遅いアプタマーのそれの標的との相互作用を妨げず、そのオフ速度が遅いアプタマーが血管系から排除されるのを遅くしすぎないように設計されるべきである。
[00133] デバイスの固体表面に接着させた１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーを
有する診断またはアッセイデバイス、例えばカラム、試験細片またはバイオチップも提供する。そのアプタマー（単数または複数）を、アプタマーが固体表面と接触した標的分子に結合してアプタマー−標的複合体を形成し、それがデバイス表面に接着したままであり、それにより標的を捕捉して標的の検出および場合により定量化を可能にすることができるように配置することができる。オフ速度が遅いアプタマー（同じまたは異なっていてよい）のアレイをそのようなデバイス上で提供することができる。
[00134] 別の態様において、オフ速度が遅いアプタマーおよび標的分子を含む複合体を提供する。他の態様において、それらの対応する標的分子に関する高い親和性ならびにアプタマーおよび標的の非共有結合性複合体からの遅い解離速度（ｔ１／２）を有することを特徴とするアプタマーのクラスを提供する。
[00135] 基本的なＳＥＬＥＸプロセスは一般に、異なる配列の核酸の候補混合物の調製で始まる。その候補混合物には一般に、２つの固定領域（すなわち候補混合物のメンバーのそれぞれが同じ位置に同じ配列を含有する）および可変領域を含む核酸配列が含まれる。典型的には、その固定配列領域はそれらが下記で記述する増幅工程を補助する、または候補混合物中の核酸の所与の構造配置の潜在能力を増進するように選択される。可変領域は典型的には候補混合物中のそれぞれの核酸の標的結合領域を提供し、この可変領域は完全にランダム化することができ（すなわちある塩基を見出す可能性があらゆる位置において４分の１である）、または部分的にのみランダム化することができる（例えばある塩基を見出す可能性を、あらゆる位置において０〜１００パーセントのあらゆるレベルで選択することができる）。その調製された候補混合物を、標的および候補混合物のメンバーの間で結合が起こるのに適した条件下で、選択された標的と接触させる。これらの条件下で、標的および候補混合物の核酸の間の相互作用は一般に、その対のメンバーの間で最も強い相対的親和性を有する核酸−標的対を形成する。その標的に関して最高の親和性を有する核酸を、その標的に対してより低い親和性を有する核酸から分配する。その分配プロセスは、最大数の高親和性候補を保持する方式で実施される。その標的に対して比較的高い親和性を有するものとして分配の間に選択された核酸を増幅して、その標的に関して比較的高い親和性を有する核酸が濃縮された新規候補混合物を作り出す。上記の分配および増幅工程を反復することにより、新規に形成される候補混合物が含有する独特の配列は徐々により少なくなり、その核酸混合物のその標的に対する親和性の平均の度合いは一般に増大するであろう。極端に言えば、ＳＥＬＥＸプロセスは、標的分子に対して最高の親和性を有する元の候補混合物からの核酸に相当する１種類または非常に少数の独特の核酸を含有する候補混合物を生じるであろう。しかし、この基本的なＳＥＬＥＸプロセスは、遅いそれらの標的からのオフ速度を有するアプタマーに関しては選択しない。
[00136] ＳＥＬＥＸ特許および光ＳＥＬＥＸ特許は、このプロセスに関して非常に詳細に記述し、詳述する。これらの特許には、プロセスにおいて使用することができる様々な標的；最初の候補混合物の調製のための方法；候補混合物内の核酸を分配するための方法；および分配された核酸を増幅して濃縮された候補混合物を生成するための方法の記述が含まれる。ＳＥＬＥＸ特許は、そのタンパク質が核酸結合性タンパク質であるタンパク質標的およびそうではないタンパク質標的を含めて、いくつかの異なるタイプの標的分子に対して得られるアプタマー溶液も記述する。図２に関連して、本明細書で開示する改変されたＳＥＬＥＸプロセスには、核酸の候補混合物の標的（単数または複数）との平衡化後の遅いオフ速度の濃縮プロセスの導入、およびＳＥＬＥＸプロセスにおける続く工程の前の分配工程が含まれる。基本的なＳＥＬＥＸプロセスへの遅いオフ速度の濃縮プロセスの導入は、様々な解離速度を含む核酸−標的複合体のセットからの遅い解離速度を有するアプタマー親和性複合体の濃縮のための手段を提供する。従って、改変されたＳＥＬＥＸプロセスは、標的分子に結合し、そして一度結合すると比較的遅いその標的分子からの解離速度（本明細書において“オフ速度”とも称される）を有するアプタマーを同定するた
めの方法を提供する。
[00137] 本明細書において、“結合”は一般にリガンドおよび標的の間の非共有結合的会合の形成を指すが、そのような結合は必ずしも可逆的ではない。用語“核酸−標的複合体”または“複合体”または“親和性複合体”は、そのような非共有結合的会合の生成物を指して用いられる。
[00138] 様々な態様において、オフ速度が遅いアプタマーは一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドであることができる。アプタマーは非標準の、または修飾された塩基を含有することができる。さらに、アプタマーはあらゆるタイプの修飾を含有することができる。本明細書で用いられる際、“修飾塩基”には、天然核酸残基に対する比較的単純な修飾が含まれてよく、そのような修飾は核酸残基の物理的特性に変化を与える。そのような修飾には、ピリミジンの５位における修飾、疎水性基、例えばベンジル、イソブチル、インドール、もしくはナフチルメチルでの置換、または親水性基、例えば四級アミンもしくはグアニジウム、もしくはより“中性の”基、例えばイミダゾールおよび同様のものでの置換が含まれるが、それらに限定されない。追加の修飾がリボース環において、例えば２’位に存在していてよく、例えば２’−アミノ（２’−ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）であり、またはホスホジエステル主鎖において存在していてよく、例えばホスホロチオエート類またはメチルホスホネート類である。
[00139] 様々な態様において、修飾ヌクレオチド塩基を含有する核酸配列のランダム化されたセットを含有する候補混合物を、ある量の標的分子と混合し、標的分子との結合平衡を確立させる。一般に、標的分子に高い親和性で結合する核酸の一部のみが、標的とともに効率的に分配されるであろう。
[00140] 様々な態様において、その候補混合物には修飾された基を含む可変領域を有する核酸配列が含まれる。修飾された基は修飾されたヌクレオチド塩基であることができる。その可変領域は、完全にまたは部分的にランダムな配列を含有することができ；それはその可変領域内に組み込まれる固定配列のサブ部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎｓ）も含有することができる。固定領域内のヌクレオチドも修飾されたヌクレオチド塩基を含有することができ、またはそれらは天然存在塩基の標準的なセットを含有することができる。
[00141] 一部の態様において、試験混合物のメンバーが分配された後に増幅が起こり、増幅されるのは核酸である。例えば、一連の３つの反応によりＲＮＡ分子の増幅を行うことができる：選択されたＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてそれぞれのｃＤＮＡのコピー数を増大させ、ｃＤＮＡコピーを転写して選択されたＲＮＡと同じ配列を有するＲＮＡ分子を得る。当業者に認識されるであろうように、直接的なＤＮＡ複製、直接的なＲＮＡ増幅等を含む、当技術で既知のあらゆる反応または反応の組み合わせを適宜用いることができる。その増幅法は、増幅前の混合物における異なる配列の比率に相当する増幅された混合物の比率をもたらすことができる。核酸に対する多くの修飾が酵素的増幅と適合することが知られている。必要であれば、増幅のそれぞれのラウンドの後に、増幅と適合しない修飾を行うことができる。
[00142] その核酸候補混合物を様々な方式で修飾して、その核酸の、促進特性または他の望ましい特性、特に核酸と標的の間の相互作用を増進する特性を有する可能性を増進することができる。意図される修飾には、望まれるリガンド−標的相互作用を増進するための正しい電荷、分極率、水素結合、または静電相互作用を有する他の化学基を導入する修飾が含まれる。例えば、核酸の親和性および／または解離速度を含む結合特性を増進する可能性がある修飾には、親水性部分、疎水性部分、強固な構造、タンパク質中で見られる官能基、例えばイミダゾール類、一級アルコール、カルボキシレート類、グアニジウム
基類、アミノ基類、チオール類および同様のものが含まれる。修飾を用いて、広い範囲の標的に対するオフ速度が遅いアプタマーを生成するために適用することができるストリンジェントな選択圧下でのアプタマー−標的複合体の存続を増大させることもできる。１態様において、オフ速度が遅いアプタマーを生成するために用いられる候補混合物の生成においてＢｎｄＵ（５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド−ｄＵ）が用いられるが、他の修飾ヌクレオチドもそのようなアプタマーの生成に十分に適している。他の修飾ヌクレオチドを図１４に示す。この適用の目的のための修飾ヌクレオチド候補混合物は、天然存在および天然存在以外のヌクレオチド両方を含む、あらゆるＲＮＡまたはＤＮＡ候補混合物である。適切な修飾には、核酸の全ての残基上、核酸の単一の残基上、ランダムな残基上、全てのピリミジンもしくは全てのプリン上、核酸中の特定の塩基（すなわちＧ、Ｃ、Ａ、ＴまたはＵ）の全ての出現における修飾、または特定の適用に適している可能性があるあらゆる他の修飾スキームが含まれる。修飾はアプタマーの促進活性または結合能力に関する必要条件ではないことが認識されている。アプタマーには、修飾ｄＵＴＰおよびｄＣＴＰ残基が含まれてもよい。
[00143] オフ速度が遅いアプタマーに関する候補混合物は、Ｃ−５塩基位で異なる修飾を有するピリミジンのセットを含んでいてよい。Ｃ−５修飾はアミド連結により、直接、もしくは間接的に、または別のタイプの連結により導入することができる。これらの候補混合物をＳＥＬＥＸプロセスで用いてオフ速度が遅いアプタマーを同定する。このプロセスには遅いオフ速度の濃縮プロセスの使用も含まれてよい。候補混合物は酵素的に、または合成的に生成されてよい。
[00144] 上記のように、そのヌクレオチドを、リボース位および／またはホスフェート位および／または塩基位の修飾を含め、いくつかの方式で修飾することができる。特定の修飾が、“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”と題された米国特許第５，６６０，９８５号、“パラジウムに触媒される炭素−炭素カップリングに関する方法および生成物”と題された米国特許第５，４２８，１４９号、“パラジウムに触媒される方法によるプリンヌクレオシド修飾”と題された米国特許第５，５８０，９７２号において記述されており、その全てを本明細書に援用する。１態様において、修飾は、別の化学基がピリミジンの５位または糖の２’位に付着する修飾である。個々のヌクレオチド上に組み込まれることができる他の化学基のタイプには制限は無い。一部の態様において、結果として生じた修飾ヌクレオチドは増幅可能であるか、または増幅工程に続いて修飾することができる（例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：化学ＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第６，３００，０７４号を参照）。
[00145] さらに他の態様において、それらの標的分子に結合し、親和性複合体の光活性化の際にそれらの標的分子に対して共有結合性の架橋を形成するアプタマーを生成するために、特定のヌクレオチドを修飾する。この方法は、標的分子に結合し、標的分子と光架橋する、および／または標的分子を光不活性化するアプタマーを含む。様々な態様において、そのアプタマーは光の照射の際に標的分子と光架橋することができる光反応基を含有する。他の態様において、そのアプタマーは照射の非存在下で標的と結合を形成することができる。
[00146] 光反応基は、光発色団を含有し、標的分子と光架橋可能であるあらゆる化学構造であることができる。本明細書において光反応基と称されるが、一部の場合では、下記で記述するように、照射はアプタマーおよびその標的の間で共有結合が起こるために必要ではない。一部の態様において、その光反応基は標的またはオリゴヌクレオチドの非修飾部分により吸収されない波長の光を吸収するであろう。光反応基には、５−ハロ−ウリジン類、５−ハロ−シトシン類、７−ハロ−アデノシン類、２−ニトロ−５−アジドベンゾイル類、ジアジリン類、アリールアジド類、フッ素化アリールアジド類、ベンゾフェノ
ン類、アミノ−ベンゾフェノン類、ソラレン類、アントラキノン類等が含まれる。
[00147] その光反応基は一般に、会合した核酸−標的対の照射の際に標的と結合を形成する。一部の場合では、照射は結合の形成が起こるのに必要ではない。典型的に起こる光架橋は、会合したアプタマーと標的の間の共有結合の形成であろう。しかし、アプタマーと標的の間の緊密なイオン相互作用も、照射の際に起こる可能性がある。
[00148] １態様において、光架橋は電磁照射への曝露により起こる。電磁照射には、紫外光、可視光、Ｘ線、およびガンマ線が含まれる。
[00149] 様々な他の態様において、ＳＥＬＥＸ法を用いたオリゴヌクレオチドの限定された選択に、光ＳＥＬＥＸ法を用いた選択が続く。光反応基を含有するオリゴヌクレオチドを用いて、最初のＳＥＬＥＸ選択ラウンドを行う。いくつかのＳＥＬＥＸラウンドの後、光ＳＥＬＥＸを行って、標的分子に結合することができるオリゴヌクレオチドを選択する。別の態様において、アプタマー配列中に切断可能または遊離可能セクション（要素または構成要素とも記述される）を含むアプタマーの生成を記述する。これらの追加の構成要素または要素は、アプタマー中に追加の官能性を導入する構造的要素または構成要素であり、従ってそれらは官能性要素または構成要素である。そのアプタマーは、さらに以下の追加の構成要素（官能性または構造的要素または構成要素または部分とも、これらの用語のあらゆる組み合わせで記述される）の１種類以上を用いて生成される：標識または検出可能構成要素、スペーサー構成要素、および特異的結合タグまたは固定化要素もしくは構成要素。
[00150] 上述のように、本開示は、細胞または組織試料の内部で１種類以上の目的の標的に結合し、一度結合すると遅い解離速度またはオフ速度を有するアプタマーを同定するための方法を提供する。この方法で得られる遅いオフ速度は、約１時間、さらには約２４０分もの半減期を超えることができ、すなわち、一度核酸−標的複合体のセットが生成されると、そのセット中の複合体の半分は１時間後に結合したままである。遅いオフ速度の濃縮プロセスの効果はアプタマー親和性複合体の異なる解離速度に依存するため、遅いオフ速度の濃縮プロセスの期間は、遅い解離速度を有するアプタマー親和性複合体の高い比率を保持する一方で速い解離速度を有するアプタマー親和性複合体の数を実質的に低減するように選択される。例えば、遅いオフ速度の濃縮プロセスを課した後比較的長い期間の間その混合物を保温すると、より短い保温期間を有する遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いて選択されたアプタマーよりも、より長い解離速度を有するアプタマーが選択されるであろう。
[00151] 様々な態様において、候補混合物をある量の細胞または組織試料と混合し、目的の標的（単数または複数）との結合平衡の確立を可能にする。溶液中で未結合である核酸から標的に結合した核酸を分配する前に、遅いオフ速度の濃縮プロセスを課して、結合した集団を遅い解離速度に関して濃縮する。上記のように、その遅いオフ速度の濃縮プロセスは、競合剤分子の添加により、試料の希釈により、競合剤分子の存在下での試料希釈の組み合わせにより適用することができる。従って、１態様において、核酸−標的複合体を含有する混合物中に競合剤分子を導入し、結合した核酸から未結合の核酸を分配する前にその混合物をある期間の間保温することにより、遅いオフ速度の濃縮プロセスを適用する。競合剤分子の量は一般に核酸分子の量よりも少なくとも１桁多く、そして２桁以上多くてもよい。別の態様において、核酸−標的複合体の試料混合物の体積を数倍（例えば２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘの少なくとも約１つ）に希釈し、結合した核酸から未結合の核酸を分配する前にその混合物をある期間の間保温することにより、遅いオフ速度の濃縮プロセスを適用する。希釈体積は一般に元の体積よりも少なくとも１桁多く、約２桁以上多くてもよい。さらに別の態様において、競合剤分子および希釈の両方の組み合わせを用いて
、遅いオフ速度の濃縮プロセスを適用する。別の態様において、結果として解離が遅いアプタマーの頻度が増大したことが示されている候補混合物を用いて、いくつかの候補アプタマーを選択する。これらのアプタマーをスクリーニングして、解離速度が遅いアプタマーを同定する。
[00152] 別の態様において、アプタマーの固定領域中に切断可能または遊離可能セクションを含む遅いオフ速度のアプタマーを生成する。そのアプタマーは、以下の追加の構成要素の１つ以上を含めて生成することもできる：標識された構成要素、スペーサー構成要素、および特異的結合タグ。これらの要素のいずれかまたは全てを一本鎖アプタマー中に導入してよい。１態様において、その要素はそのアプタマーの５’端に導入される。別の態様において、これらの要素の１つ以上は、一方の鎖が望まれる様々な要素および様々な標的結合領域を含有する第二の鎖の固定配列セクションの１つに相補的な配列を含有する部分的に二本鎖のアプタマーを作り出すことにより含められる。
[00153] “遊離可能”または“切断可能”要素または部分または構成要素は、官能基中の特定の結合が壊されて２つの別個の構成要素を生成することができる官能基を指す。様々な態様において、その官能基はその官能基（光切断可能）に適切な波長で照射することにより、または適切な化学的もしくは酵素的試薬を用いた処理により切断することができる。別の態様において、その遊離可能要素は還元剤で処理して結合を破壊することができるジスルフィド結合であってもよい。その遊離可能要素は、固体支持体に付着したアプタマー／標的親和性複合体が例えばその複合体の溶離によりその固体支持体から分離されるのを可能にする。その遊離可能要素は、アッセイの残りの条件に対して安定であってよく、アプタマー／標的複合体を破壊しないであろう条件の下で遊離可能であってよい。
[00154] 本明細書で開示するように、アプタマーはさらに“タグ”または“固定化構成要素または要素”または“特異的結合構成要素または要素”を含むことができ、それはアプタマー（およびそれに結合しているあらゆる標的分子）の固体支持体への付着または固定化のための手段を提供する構成要素を指す。“タグ”は、プローブと会合することができる構成要素の１つのタイプまたは種のコピーのセットである。“タグ（複数）”は、構成要素の１つより多くのそのようなセットを指す。そのタグはあらゆる適切な方法によりアプタマーに付着させることができ、またはアプタマー中に含ませることができる。一般に、そのタグはそのアプタマーが固体支持体に付着しているプローブまたは受容体と直接または間接的にのどちらかで会合することを可能にする。そのプローブはそれのそのタグとの相互作用において非常に特異的であることができ、全ての続く処理工程または手順の間その会合を保持することができる。タグは、アプタマー親和性複合体（または場合により共有結合性アプタマー親和性複合体）の固体支持体上の空間的に定められた場所（ａｄｄｒｅｓｓ）への局在を可能にすることができる。従って、異なるタグは、異なるアプタマー共有結合性複合体の固体支持体上の異なる空間的に定められた場所への局在を可能にすることができる。タグは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、ａｆｆｙｂｏｄｙ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、これらの構造物のあらゆる断片もしくは誘導体、前記のもののあらゆる組み合わせ、またはプローブ（または以下で記述するようなリンカー分子）が特異性を持って結合する、またはそうでなければ会合するように設計され得る、または設定され得るあらゆる他の構造であることができる。一般に、タグはそれが分子内でそれ自体、またはそれが付着している、もしくはそれがその一部であるアプタマーと相互作用しないように設定される。ＳＥＬＥＸを用いてアプタマーを同定する場合、そのタグはＳＥＬＥＸ前またはＳＥＬＥＸ後のどちらかでそのアプタマーに付加することができる。そのタグはＳＥＬＥＸ後にそのアプタマーの５’端上に含まれ、またはそのタグはＳＥＬＥＸ後のプロセスにおいてそのアプタマーの３’および５’端両方の上に含まれてよい。図９Ｄで図説するように、蛍光色素（例えばＣｙ３）、光切断可能およびビオチン部
分は全てアプタマーの末端に付加される。光切断可能部分および色素間の相互作用の可能性のため、これらの２つの部分の間にスペーサーが挿入される。全ての構築物は標準的なホスホロアミダイト化学を用いて合成することができる。代表的なアプタマー構築物を図１０Ａ〜図１０Ｆに示す。官能性は５’および３’端の間で分かれていることができ、またはどちらかの端において組み合わせられていることができる。光切断可能部分に加えて、化学的または酵素的に切断可能な部分を含め、他の切断可能部分を用いることができる。様々なスペーサー部分を用いることができ、１個以上のビオチン部分が含まれることができる。ビオチン以外のタグ（固定化または特異的結合要素または構成要素とも呼ばれる）も組み込むことができる。適切な構築試薬には、ビオチンホスホロアミダイト、ＰＣリンカー（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＮ １０−４９２０−０２）；ＰＣビオチンホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＮ １０−４９５０−０２）；ｄＳｐａｃｅｒ ＣＥホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＮ １０−１９１４−０２）；Ｃｙ３ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＮ １０−５９１３−０２）；およびＡｒｍ２６−Ａｃｈスペーサーアミダイト（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ ＰＮ ＳＰ２６Ａｃｈ−０５）が含まれる。標的特異的なオフ速度が遅いアプタマー上のこのタイプのタグは、二次的な試薬、例えば標識を組織または細胞試料中に導入するために用いることができる。例えば、そのオフ速度が遅いアプタマーがビオチンタグを含有する場合、標識されたアビジン分子を導入してシグナルを生成することができるであろう。
[00155] １態様において、アプタマーの可変領域の生成においてヌクレオチドの塩基修飾が用いられる。これらの修飾ヌクレオチドは非常に遅いそれらの標的からのオフ速度を有するアプタマーを生成することが示されている。本開示の方法において、候補混合物は、候補混合物の少なくとも１つまたはそれぞれの核酸中の１個、いくつか（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個の内の１個、または少なくとも１個）または全てのピリミジンが５位において化学的に修飾されている修飾核酸を含んでいてよい。場合により、候補混合物の核酸中の全てのＣ残基が５位において化学的に修飾されている。場合により、候補混合物の核酸中の全てのＴ残基が５位において化学的に修飾されている。場合により、候補混合物の核酸中の全てのＵ残基が５位において化学的に修飾されている。
[00156] “細胞学的標本または試料”には、広い範囲の標本のタイプが含まれてよい。これらには、腹部および骨盤洗浄液、体腔液（胸膜性、腹膜性）、尿、胃／食道洗浄液、細針吸引液（ＦＮＡ）、乳汁、ＣＳＦ、嚢胞液、関節液、および気管支洗浄液が含まれる。ＰＡＰ塗抹標本に関して行われるように、ＦＮＡ標本またはブラシで収集した標本から塗抹標本を調製することができる。
[00157] “細胞学プロトコル”は一般に試料の収集、試料の固定、試料の固定化、および染色で構成される。“細胞の調製”には、その調製された細胞の染色のための１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーの使用を含め、試料の収集の後の処理工程の全てが含まれてよい。
[00158] 試料の収集には、その試料を未処理の輸送容器中に直接置くこと、その試料をあるタイプの媒体を含有する輸送容器中に置くこと、またはその試料を処理もしくは固定一切無しでスライドの上に直接置くこと（固定化）が含まれてよい。
[00159] 試料の固定化は、その収集された標本の一部をポリリジン、ゼラチン、またはシランで処理されたガラススライドに適用することにより向上させることができる。スライドは、細胞の薄い平らな層をそのスライドにわたって塗抹することにより調製するこ
とができる。機械的歪みおよび乾燥による人為的結果を最小限にするために注意が払われる。液体標本は細胞ブロック法で処理されてよく、または液体標本は固定溶液と１：１で、室温において１０分間混合されてよい。
[00160] 細胞ブロックは、残留滲出液、痰、尿沈降物、胃腸液、細胞のこすり落とし、または細針吸引液から調製されてよい。細胞は遠心分離または膜濾過により濃縮され、または詰め込まれる（ｐａｃｋｅｄ）。細胞ブロック調製のためのいくつかの方法が開発されてきた。代表的な手順には、固定沈降物、細菌寒天、または膜濾過法が含まれる。固定沈降物法では、細胞沈降物をブアン液、ピクリン酸、または緩衝されたホルマリンのような固定剤と混合し、次いでその混合物を遠心分離して固定された細胞をペレットにする。上清を除去し、細胞のペレットを可能な限り完全に乾燥させる。そのペレットを集め、レンズペーパーで包み、次いで組織カセットの中に置く。その組織カセットを追加の固定剤と共にジャーの中に置き、組織試料として加工する。寒天法は非常に類似しているが、そのペレットを移し、ペーパータオル上で乾燥させ、次いで半分に切る。その切った面をガラススライド上の一滴の溶けた寒天の中に置き、次いでそのペレットを寒天で覆い、寒天の中に泡ができていないのを確かめる。その寒天を固まらせ、次いで全ての過剰な寒天を切り取る。これを組織カセットの中に置き、組織の処理は完了である。あるいは、そのペレットを６５℃の２％液体寒天中で直接懸濁し、その試料を遠心分離してよい。その寒天細胞ペレットを４℃で１時間凝固させる。その固体寒天を遠心分離チューブから取り外し、半分に切る。その寒天を濾紙、次いで組織カセットの中に包む。この工程からの処理は上記の通りである。あらゆるこれらの手順において、遠心分離の工程は膜濾過の工程で置き換えられてよい。これらのプロセスの全てを“細胞ブロック試料”を生成するために用いることができる。
[00161] 細胞ブロックは、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ樹脂、ＬＲ Ｗｈｉｔｅ、ＬＲ Ｇｏｌｄ、Ｕｎｉｃｒｙｌ、およびＭｏｎｏＳｔｅｐを含む専用の樹脂を用いて調製されてよい。これらの樹脂は低い粘度を有しており、低温および紫外（ＵＶ）光で重合することができる。包理プロセスは脱水工程の間に試料を次第に冷却すること、その試料をその樹脂に移し、ブロックを最終的な低温において適切なＵＶ波長で重合させることに頼っている。
[00162] 細胞ブロックの切片を細胞形態学的試験のためにヘマトキシリン−エオジンで染色し、一方で追加の切片を特異的マーカーに関する試験のために用いる。
[00163] そのプロセスが細胞学的か組織学的かを問わず、試料の分解を防ぐために、その試料を追加の処理の前に固定することができる。この工程は“固定”と呼ばれ、互換的に用いることができる広い範囲の物質および手順を表す。試料の固定のプロトコルおよび試薬は、検出される標的および分析される特定の細胞／組織のタイプに基づいて経験的に最適に選択される。試料の固定は、エタノール、ポリエチレングリコール、メタノール、ホルマリン、またはイソプロパノールのような試薬に頼っている。試料は、収集およびそのスライドへの取り付けの後できるだけ早く固定されるべきである。しかし、選択される固定剤は様々な分子標的中に構造的変化を導入する可能性があり、それはそれらのその後の検出をより困難にする。固定および固定化のプロセスならびにそれらの連続はその細胞の外観に変更を加える可能性があり、細胞検査技師はこれらの変化を予測し、認識しなければならない。固定剤は特定の細胞型の収縮を引き起こす可能性があり、細胞質が粒状または網状に見えるようにする可能性がある。多くの固定剤は、細胞の構成要素を架橋することにより作用する。これは特定のエピトープを損傷する、またはそれに変更を加える、新しいエピトープを生成する、分子の会合を引き起こす、および膜の透過性を低減する可能性がある。ホルマリン固定は最も一般的な細胞学的／組織学的アプローチの１つである。ホルマリンは隣接するタンパク質の間で、またはタンパク質内でメチル架橋を形成する。沈降または凝集も固定のために用いられ、エタノールはこのタイプの固定において頻
繁に用いられる。固定に関して架橋および沈降の組み合わせを用いることもできる。強い固定プロセスは形態学的情報の保存において最適であり、一方でより弱い固定プロセスは分子標的の保存に最適である。
[00164] 代表的な固定剤は、５０％無水エタノール、２ｍＭポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１．８５％ホルムアルデヒドであろう。この配合に関する変形には、エタノール（５０％〜９５％）、メタノール（２０％〜５０％）、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）のみが含まれる。別の一般的な固定剤は、２％ＰＥＧ１５００、５０％エタノール、および３％メタノールである。スライドを室温で固定剤中に１０〜１５分間置き、次いで取り出して乾燥させる。一度スライドを固定したら、それらをＰＢＳのような緩衝された溶液ですすぐことができる。
[00165] 広い範囲の染料を用いて、細胞の、細胞下の、および組織の特徴または形態学的構造を差次的に強調する、および収縮させる（ｃｏｎｔｒａｃｔ）、または“染色する”ことができる。ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｙｌｉｎ）は核を青または黒色に染色するために用いられる。オレンジＧ−６およびエオシンアズールは共に細胞の細胞質を染色する。オレンジＧはケラチンおよびグリコーゲンを含有する細胞を黄色に染色する。エオシンＹは核、毛様体、赤血球、および表在上皮扁平細胞を染色するために用いられる。ロマノフスキー染色は空気乾燥したスライドに関して用いられ、多形性を増進し、細胞外物質を細胞質内物質と識別するのに有用である。
[00166] 染色プロセスは、細胞のその染色に対する透過性を増大させるための処理を含んでいてよい。界面活性剤を用いた細胞の処理は、透過性を増大させるために用いられてよい。細胞および組織の透過性を増大させるため、固定された試料をさらに溶媒、サポニン、または非イオン性界面活性剤を用いて処理してよい。酵素的消化も組織試料中の特定の標的の接近可能性を向上させることができる。
[00167] 染色の後、増大するアルコール濃度でのアルコールすすぎの連続を用いて試料を脱水する。最後の洗浄は、スライドに適用されるカバーガラスの屈折率に近い屈折率を有するキシレンまたはキシレン代替物、例えばシトラステルペンを用いて行われる。この最後の工程は透徹と呼ばれる。一度試料を脱水および透徹したら、封入媒体を適用する。封入媒体はガラスに近い屈折率を有するように選択され、カバーガラスをスライドに接着させることができる。それは細胞試料の追加の乾燥、収縮、または退色も防ぐであろう。
[00168] 用いられる染色または処理工程に関わらず、その細胞学的標本の最終的な評価は、あるタイプの顕微鏡および視覚による形態の検査およびマーカーの存在または非存在の決定によりなされる。利用される顕微鏡法には、明視野、位相差、蛍光、および微分干渉コントラストが含まれる。
[00169] 試験の後にその試料に関して第２の検査が必要である場合、カバーガラスを取り外してスライドを脱染することができる。脱染には、元々そのスライドを染色するのに用いられた元の溶媒系の、染料の添加無しでの、元の染色手順に対して逆の順序での使用が含まれる。脱染は、そのスライドを酸アルコール中に、その細胞が無色になるまで浸すことにより完了されてもよい。一度無色になったら、そのスライドを水浴中で十分にすすぎ、第２の染色手順を適用する。
[00170] 加えて、細胞の形態学的分析と組み合わせて、特異的な分子試薬、例えば抗体または核酸プローブの使用により、特定の分子の識別が可能である可能性がある。これは診断細胞学の正確さを向上させる。顕微解剖を用いて、追加の評価のために、特に異常
な染色体、遺伝子発現、または変異の遺伝学的評価のために細胞の亜集団を単離することができる。
[00171] 組織学において、組織標本は上皮、結合組織、軟骨、骨、筋、神経、血管、心臓、リンパ系、呼吸器管、尿管、内分泌系、および生殖系から集めることができる。
[00172] 組織学的評価のための組織試料の調製には、固定、脱水、浸透、包理、および薄切が含まれる。組織学において用いられる固定試薬は細胞学において用いられる固定試薬と非常に類似しており、または同じであり、個々のタンパク質のような分子的特徴を犠牲にして形態学的特徴を保存する同じ問題を有する。組織試料を固定および脱水せず、代わりに凍結させ、次いで凍結している間に薄切する場合、時間を節約することができる。これはより穏やかな処理工程であり、より多くの個々のマーカーを保存することができる。しかし、氷の結晶の導入により細胞下の情報が失われるため、凍結は組織試料の長期保管には許容し得ない。凍結された組織試料中の氷は、薄切プロセスが非常に薄い切片を生成するのも妨げ、従って細胞下構造の一部の顕微鏡的分解能および画像化が失われる可能性がある。ホルマリン固定に加えて、リン脂質（膜）を固定および染色するために四酸化オスミウムが用いられる。
[00173] 組織の脱水は、増大するアルコール濃度での連続的な洗浄により成し遂げられる。透徹はアルコールおよび包理物質と混和性である物質を必要とし、５０：５０ アルコール：透徹試薬で開始し、次いで１００％透徹剤（キシレンまたはキシレン代替物）での段階的なプロセスを含む。浸透は組織を包理剤（温ワックス、ニトロセルロース溶液）の液体型と共に、最初に５０：５０ 包理剤：透徹剤、および１００％包理剤で保温することを含む。包理は、組織を型枠またはカセット中に置き、溶けた包理剤、例えばワックス、寒天、またはゼラチンで満たすことにより完了する。包理剤を固まらせる。次いで固まった組織試料を、染色およびその後の試験のために薄い切片に切り分けることができる。
[00174] 染色の前に、その組織切片からワックスを除き、再水和する。組織からワックスを除くためにキシレンが用いられ、キシレンの１回以上の交換を用いてよく、その組織を減少する濃度のアルコール中での連続的な洗浄により再水和する。ワックスを除く前に、その組織切片をガラススライドに、８０℃において２０分間熱固定化することができる。組織学染色を図１で列挙する。
[00175] レーザーキャプチャー顕微解剖は、さらなる分析のための組織切片からの細胞の亜集団の単離を可能にする。
[00176] 細胞学におけるように、顕微鏡的特徴の可視化を増進するために、その組織切片または薄片を様々な染色剤を用いて染色することができる。特定の特徴を強める、または同定するために、染色剤の大きなメニューが利用可能である。
[00177] 免疫学的試薬の細胞学的／組織学的試料との相互作用をさらに増大させるために、“抗原修復”のためのいくつかの技法が開発されてきた。第１のそのような技法は、固定された試料の高温加熱に頼っている。この方法は、熱誘導エピトープ修復またはＨＩＥＲとも呼ばれる。蒸気加熱、マイクロ波照射、加圧加熱、水浴、および圧力蒸煮（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｏｏｋｉｎｇ）、またはこれらの加熱の方法の組み合わせを含む、様々な加熱技法が用いられてきた。抗原修復溶液には水、シトレート、または通常生理食塩水緩衝液が含まれる。抗原修復にとって重要なことは高温における時間であるが、より低い温度でのより長い時間もうまく用いられてきた。抗原修復にとっての別の重要なことは、加熱溶液のｐＨである。低いｐＨは最高の免疫染色を与えることが分かったが、バック
グラウンドももたらし、それは陰性対照としての第２の組織切片の使用を必要とした。最も着実な利益（バックグラウンドの増大無しでの免疫染色の増大）は、緩衝剤の組成に関わらず、高いｐＨの溶液で見出された。特定の標的に関する抗原修復プロセスは、熱、時間、ｐＨおよび緩衝剤の組成をプロセス最適化のための変数として用いて、その標的に関して経験的に最適化されるべきである。マイクロ波抗原修復法の使用は、抗体試薬を用いた異なる標的の連続的な染色を可能にした。しかし、染色工程の間の抗体および酵素の複合体に必要な時間は、細胞膜抗原を分解することも示されている。マイクロ波加熱法はインサイチュハイブリダイゼーション法も同様に向上させてきた。
[00178] 抗原修復プロセスを開始するために、まずその切片のワックスを除き、水和させる。次いでスライドをディッシュまたはジャー中の１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０の中に置く。代表的な手順は１１００Ｗマイクロ波を用い、スライドを１００％電力で２分間マイクロ波照射し、スライドが液体中で覆われているままであることをチェックして確かめた後、続いてスライドを２０％電力を用いて１８分間マイクロ波照射する。次いでそのスライドを覆われていない容器中で放冷し、次いで蒸留水ですすぐ。ＨＩＥＲは、標的の免疫化学試薬に対する反応性を向上させるために酵素消化と組み合わせて用いることができる。
[00179] １つのそのような酵素消化プロトコルは、プロテイナーゼＫを用いる。２０μｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫを５０ｍＭトリス塩基、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００、ｐＨ８．０緩衝液中で調製する。そのプロセスはまず、キシレンの２回交換、それぞれ５分間で切片のワックスを除くことを含む。次いで１００％エタノールの２回交換、それぞれ３分間、９５％および８０％エタノール、それぞれ１分間、次いで蒸留水中でのすすぎでその試料を水和する。切片をプロテイナーゼＫの使用液で覆い、加湿したチャンバー中で３７℃において１０〜２０分間保温する（場合により保温時間は組織のタイプおよび固定の程度に応じて変更されてよい）。その切片を室温で１０分間冷まし、次いでＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０中で２×２分間すすぐ。望まれるならば、内在性の化合物および酵素からの干渉の可能性を排除するために切片をブロッキングしてよい。次いでその切片を、一次抗体希釈緩衝液中で適切に希釈された一次抗体と共に室温で１時間、または４℃で一夜保温する。次いでその切片をＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で２×２分間すすぐ。特定の適用に関して必要であるならば、追加のブロッキングを実施した後ＰＢＳ
Ｔｗｅｅｎ２０での３×２分間の追加のすすぎを行ってよく、その後最終的に免疫染色のプロトコルが完了する。
[00180] 室温での１％ＳＤＳによる単純な処理も免疫組織化学染色を向上させることが示されている。抗原修復法は、自由に浮遊している切片と同様にスライドにマウントされた切片にも適用されてきた。別の処理の選択肢は、そのスライドをクエン酸および０．１ Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ４０をｐＨ６．０で含有するジャーの中に置き、９５℃に加熱することである。次いでそのスライドをＰＢＳのような緩衝溶液で洗浄する。
[00181] 組織の免疫学的染色に関して、切片を血清または脱脂粉乳のようなタンパク質溶液中に浸すことにより抗体の組織タンパク質との非特異的会合をブロックするのが有用である可能性がある。
[00182] “オフ速度が遅いアプタマーで処理した試料”は、検出される１種類以上の標的に対する１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーで処理されてよいあらゆる細胞学的または組織学的スライドまたは切片を意味することを意図する。その処理プロセスには、そのスライドまたは切片を、１種類以上の緩衝液または試薬中に、１種類以上の温度において、そのオフ速度が遅いアプタマーと標的、そのオフ速度が遅いアプタマーとその後の検出部分の間の望まれる相互作用を完了するのに十分な期間の間置くこと、分配、ブロッ
キング反応、または他のプロセス工程が含まれてよい。
[00183] ブロッキング反応には、内在性のビオチンのレベルを低減させる；内在性の荷電効果を排除する；内在性のヌクレアーゼを不活性化する；および／またはペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような内在性の酵素を不活性化する必要性が含まれる可能性がある。内在性のヌクレアーゼはプロテイナーゼＫを用いた分解により、熱処理、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのようなキレート剤の使用、キャリヤーＤＮＡまたはＲＮＡの導入、カオトロープ、例えば尿素、チオ尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸リチウム等、またはジエチルピロカーボネートを用いた処理により不活性化することができる。アルカリホスファターゼは、０．１Ｎ ＨＣｌを用いて室温で５分間処理することにより、または１ｍＭレバミゾールを用いた処理により不活性化することができる。ペルオキシダーゼ活性は、０．０３％過酸化水素を用いた処理により排除することができる。内在性のビオチンは、そのスライドまたは切片をアビジン（ストレプトアビジン、ニュートラアビジンで代用することができる）溶液に室温で少なくとも１５分間浸すことによりブロックすることができる。次いでそのスライドまたは切片を緩衝液中で少なくとも１０分間洗浄する。これを少なくとも３回繰り返す。次いで、そのスライドまたは切片をビオチン溶液中に１０分間浸す。これを少なくとも３回、その度に新しいビオチン溶液を用いて繰り返してよい。緩衝液での洗浄の手順を繰り返す。単一の診断目的に関して用いられる全てのスライドまたは切片は、同じブロッキングプロトコルで処理されるべきである。細胞もしくは組織の構造または目的の標的（単数または複数）のどちらかを損傷するのを防ぐために、ブロッキングプロトコルは最小限であるべきであるが、これらのプロトコルの１種類以上を組み合わせて１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーとの反応の前にスライドまたは切片を“ブロックする”ことができるであろう。
[00184] １態様において、細胞学的試料を集め、ガラススライドに適用し、固定し、集められた試料および診断される疾患状態に適した構造的／形態学的特徴に関して染色し、顕微鏡検査してよく、次いでそれを望まれる標的（単数または複数）に対する１種類のオフ速度が遅いアプタマーと反応させてよい。その方法にはさらに、以下の工程の１種類以上が含まれてよい；抗原修復工程；細胞の透過性を増大させるための処理（透過処理）；１つ以上のブロッキング工程；脱水；透徹；洗浄工程；および／または脱染工程。個々の工程の順序は必要に応じて入れ替えてよい。そのオフ速度が遅いアプタマーは、場合によりそれらの特異的な標的と架橋するように設計されてよい。
[00185] １態様において、細胞学的試料を集め、ガラススライドに適用し、固定し、集められた試料および診断される疾患状態に適した構造的／形態学的特徴に関して染色し、顕微鏡検査してよく、次いでそれを望まれる標的（単数または複数）に対する１種類の架橋性のオフ速度が遅いアプタマーまたは光アプタマーと反応させてよい。その方法にはさらに、以下の工程の１種類以上が含まれてよい；抗原修復工程；細胞の透過性を増大させるための処理（透過処理）；脱水；透徹；１つ以上のブロッキング工程；洗浄工程；および／または脱染工程。個々の工程の順序は必要に応じて入れ替えてよいが、その架橋プロセスを活性化する追加の工程を含む。
[00186] 別の態様において、細胞ブロック手順からの切片を利用することができる。細胞ブロックが用いられる場合、その試料をあたかもそれが組織試料であるかのように調製することができる。ある切片を、その細胞型および診断される疾患状態に適切であるように染色することができる。別の切片を、特定の標的（単数または複数）の検出のための１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーで処理することができる。そして、別の切片を、そのオフ速度が遅いアプタマーで処理した切片と同じ試薬および順序で、そのオフ速度が遅いアプタマーの非存在下で処理して、陰性対照の切片として利用することができる。場合により、これらのオフ速度が遅いアプタマーは架橋性のオフ速度が遅いアプタマーまた
は光アプタマーであってよい。これらの手順は組織切片に適用されてよい。
[00187] 一部の態様において、一度そのオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）がその組織または細胞試料と平衡化してオフ速度が遅いアプタマー標的親和性複合体を形成したら、速度論的負荷を用いることができる。速度論的負荷が導入される場合、そのオフ速度が遅いアプタマーとあらゆる非標的分子の間の非特異的複合体はそれらの解離の後に再形成されそうにない。非特異的複合体は一般に、オフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体よりも急速に解離するため、速度論的負荷はオフ速度が遅いアプタマーが非標的との非特異的複合体中に含まれる可能性を低減する。効果的な速度論的負荷は、そのアッセイに、最初のオフ速度が遅いアプタマーの結合事象およびあらゆるその後の任意の共有結合性相互作用の特異性の他に追加の特異性を与えることができる。従って、速度論的負荷は特異性の第２の決定要素を提供する。１態様において、１０ｍＭデキストラン硫酸を組織または細胞と会合しているオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体に添加し、それを約１５分間保温する。別の態様において、その速度論的負荷は１０ｍＭデキストラン硫酸の存在下で開始される。競合剤を用いる速度論的負荷の場合、その競合剤は、例えばオフ速度が遅いアプタマーが非標的分子に非特異的に再結合するのを防ぐための、未結合のオフ速度が遅いアプタマーと非特異的複合体を形成することができるあらゆる分子であることもできる。そのような競合剤分子には、ポリカチオン類（例えばスペルミン、スペルミジン、ポリリジン、およびポリアルギニン）およびアミノ酸（例えばアルギニンおよびリジン）が含まれる。競合剤が速度論的負荷として用いられる場合、その試料中のタンパク質全体またはオフ速度が遅いアプタマー全体の予想される濃度と比較してかなり高い濃度が利用される。１態様において、約１０ｍＭのデキストラン硫酸が速度論的負荷における競合剤として用いられる。１態様において、速度論的負荷は、オフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する組織または細胞試料に競合剤を添加し、その試料を約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約１０分間、約３０分間、および約６０分間以上の時間の間保温することを含む。別の態様において、速度論的負荷は、オフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する組織または細胞試料に競合剤を添加し、オフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体の測定されるレベルの非特異的複合体の測定されるレベルに対する比率が増大するような時間の間保温することを含む。
[00188] 一部の態様において、速度論的負荷は、その試験試料を結合緩衝液またはオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体の天然の解離速度を著しく増大させないいずれかの他の溶液と接触させることにより実施される。希釈度は約２×、約３×、約４×、約５×、またはいずれかの適切なより大きい希釈度であることができる。より大きい希釈は、希釈後のタンパク質およびオフ速度が遅いアプタマー全体の濃度を、従ってそれらの再会合の速度を低減させることにより、より効果的な速度論的負荷を提供する。１態様において、そのオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体は希釈剤の添加により効果的に希釈され、約３０秒以上、約１分以上、約２分以上、約３分以上、約４分以上、約５分以上、約１０分以上、約３０分以上、および約６０分以上の時間の間保温される。別の態様において、そのオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体は希釈剤の添加により効果的に希釈され、オフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体の測定されるレベルの非特異的複合体の測定されるレベルに対する比率が増大するような時間の間保温される。
[00189] 一部の態様において、速度論的負荷は、試料の希釈の効果および競合剤の導入の効果が同時に実現されるような方式で実施される。例えば、組織または細胞試料は、大きい体積の競合剤の添加により効果的に希釈することができる。これらの２つの速度論的負荷戦略を組み合わせることは、一方の戦略を用いて達成することができるよりも効果的な速度論的負荷を提供することができる。１態様において、効果的な希釈度は約２×、約３×、約４×、約５×、またはいずれかの適切なより大きい希釈度であることができ、競合剤は約１０ｍＭデキストラン硫酸である。１態様において、その競合剤は約１ｍＭデ
キストラン硫酸である。１態様において、速度論的負荷は、オフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する組織または細胞試料をある体積の希釈剤と接触させ、そのオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する混合物に競合剤を添加し、そのオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する混合物を約３０秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約１０分、約３０分、および約６０分以上の時間の間保温することを含む。別の態様において、速度論的負荷は、オフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する混合物を希釈し、そのオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する混合物に競合剤を添加し、そのオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体を含有する混合物をオフ速度が遅いアプタマーの親和性複合体の測定されるレベルの非特異的複合体の測定されるレベルに対する比率が増大するような時間の間保温することを含む。１態様において、その速度論的負荷の工程に続く手順の中に架橋工程が導入される。別の態様において、その架橋工程は速度論的負荷の工程および洗浄の工程に続く手順の中に導入される。
[00190] 別の態様において、組織標本を集め、凍結させ、または固定し、脱水し、包理媒体を浸透させ、包理媒体中で包理し、薄く切り、マウントし、透徹し、集められた試料および診断される疾患状態に関する適切な特徴に関して染色し、顕微鏡検査し、次いで望まれる標的（単数または複数）に対する１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーと反応させる。その方法にはさらに、以下の工程の１種類以上が含まれてよい；抗原修復工程；組織の透過性を増大させるための処理（透過処理）；１つ以上のブロッキング工程；脱水；洗浄工程；および／または脱染工程。個々の工程の順序は必要に応じて入れ替えてよい。最初の顕微鏡検査までの全てのプロセスは、自由に浮遊する組織切片に対して完了させることができる。場合によりこれらのオフ速度が遅いアプタマーは架橋性のオフ速度が遅いアプタマーまたは光アプタマーであってよい。
[00191] 別の態様において、多数の組織切片が診断手順において用いられる。１つの切片を、その組織の形態学的構造および特徴の評価のために、その組織のタイプおよび診断される疾患状態に適切であるように染色する。別の切片を、緩衝された溶液中で、特定の標的（単数または複数）の検出のための１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーを用いて処理する。そして、別の切片を、そのオフ速度が遅いアプタマーで処理した切片と同じ試薬および順序で、その１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーの非存在下で処理して、陰性対照の切片として利用し、ここでそのオフ速度が遅いアプタマーの反応の工程はそのオフ速度が遅いアプタマーの反応の工程において用いられる緩衝された溶液を用いた処理で置き換えられる。
[00192] 別の態様において、スライドにマウントされた塗抹標本、細胞ブロック、または組織切片を処理してその試料のワックスを除くことができ、次いでそれを染色の前に再水和することができる。選択される染色剤は、その試料および診断される疾患状態に適しているであろう。顕微鏡的評価の前に、そのスライドにマウントされた試料をカバーガラスで覆ってよい。形態学的または構造的特徴の顕微鏡的評価が完了したら、次いでそのカバーガラスを取り外してよく、その試料を場合により試薬、例えば酸アルコールで処理してその試料を脱染してよい。脱染プロトコルが用いられる場合、その試料を脱イオン水で数回洗浄するべきである。１種類以上の標的特異的なオフ速度が遅いアプタマーとの反応のための試料を調製するために、場合によりブロッキングプロトコルを用いることができる。１態様は、ブロッキング剤としてデキストラン硫酸（ＤｅｘＳＯ４）または別のポリアニオン性化合物を用いる。他のポリアニオン性物質には、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ポリデキストラン、脱塩基ホスホジエステルポリマー類、ｄＮＴＰ、およびピロホスフェートが含まれ得る。１態様において、そのオフ速度が遅いアプタマーのすすぎ溶液は、デキストラン硫酸のようなポリアニオン性物質を含有していてよい。それぞれのオフ速度が遅いアプタマーの濃度が１〜２０ｎＭである１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーの緩衝された溶液を用いてよい。そのオフ速度が遅いアプタ
マーの溶液を試料に適用して、室温または３７℃で、目的の特定の標的（単数または複数）との反応または結合を最大化するように（経験的に）選択された期間の間保温することができる。保温時間は１８時間もの長さであってもよい。その緩衝されたオフ速度が遅いアプタマーの溶液は、そのオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）の組織もしくは細胞試料中、または組織もしくは細胞試料上の核酸結合部位との非特異的相互作用を最小限にするための様々な他の物質、例えば非特異的ポリヌクレオチドを含有していてよい。次いでその緩衝されたオフ速度が遅いアプタマーの溶液を、オフ速度が遅いアプタマーのすすぎ溶液を用いて、試料からすすぎ落としてよい。カバーガラスを再度適用し、オフ速度が遅いアプタマーを通して試料に導入された可能性のある１種類以上の特異的な検出可能部分の検出のために試料を顕微鏡検査してよい。
[00193] 別の態様において、オフ速度が遅いアプタマーの結合を通して試料に導入される検出可能部分は、そのオフ速度が遅いアプタマーに直接付着している蛍光性、化学発光性、または比色分析用検出可能部分であってよい。その緩衝されたオフ速度が遅いアプタマーの溶液中で１種類より多くのオフ速度が遅いアプタマーが用いられる場合、それぞれのオフ速度が遅いアプタマーには独特の検出および／または励起の波長を有する検出可能部分が含まれていてよい。従って、多数の標的を同時に検出することができる。場合により、これらのオフ速度が遅いアプタマーはそれらの特異的な標的に架橋するように設計することができる。
[00194] 他の態様において、その標的は連続的に検出されてよい。この態様において、一度伝統的な染色による形態学的評価が完了したら、その試料を特異的な第１の標的に対する第１のオフ速度が遅いアプタマーと反応させることができ、その試料中に特異的な第１の標的が存在するならば、その第１のオフ速度が遅いアプタマーの存在により第１の検出可能部分を導入することができる。次いでその試料を、その第１のオフ速度が遅いアプタマー／第１の標的の対を解離させるのに十分な熱、緩衝剤、ｐＨ、イオン強度の条件で処理することができる。次いで第１のオフ速度が遅いアプタマーをその試料から洗い流し、第２の標的に対する第２のオフ速度が遅いアプタマーをその試料と反応させる。次いで、その試料中に第２の標的が存在するならば、その第２の検出可能部分を検出することができる。全ての望まれる標的が評価されたら、このサイクルを完了してよい。
[00195] 別の態様において、そのオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）は、シグナルの生成を支持するための要素を用いて設計することができる。１態様において、そのシグナルの生成を支持するための要素は、それがそのオフ速度が遅いアプタマーの標的への結合を妨げないようようにそのオフ速度が遅いアプタマーに付着した、またはタグを介して付着した酵素であってよい。一度そのオフ速度が遅いアプタマーが特異的な標的に結合すると、過剰なオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）は除去され、その酵素はそれの特異的な基質と反応して、その酵素が固定化されていることができる位置において検出可能なシグナルを生成することができる。沈降性、比色分析用、または蛍光性の基質を用いることができる。別の態様において、そのオフ速度が遅いアプタマーに付着した酵素を、シグナルを増大させるために用いることができる。別の態様において、シグナルの生成を支持するための要素は２つの構成要素で構成される。シグナルの生成を支持するための要素の第１の構成要素はそのオフ速度が遅いアプタマーの中に設計されており、シグナルの生成を支持するための要素の第２の構成要素であるアビジンのような対応する受容体と反応するビオチンのようなリガンドである。その第２の構成要素は検出可能部分に付着することができる。
[00196] 別の態様において、試料中の特異的な標的と反応したオフ速度が遅いアプタマーは組み合わせて用いることができ、またはＰＣＲ、ローリングサークル増幅、ｑ−ベータレプリカーゼ、鎖置換、ヘリカーゼ依存性の増幅、ループに仲介される等温増幅、リ
ガーゼ連鎖反応、制限および環状化に助けられるローリングサークル増幅等を含む様々な核酸増幅法における核酸標的として働くことができる。例えば、標的に固定化されたオフ速度が遅いアプタマーは、ＰＣＲ反応のための鋳型として働いてその試料を覆う溶液中にＰＣＲ産物の多数のコピーを生成することができる。そのＰＣＲ産物の検出は、標識されたＰＣＲ産物のアレイへのハイブリダイゼーションにより、リアルタイムＰＣＲ測定により、ゲル電気泳動、配列決定法等により、多種多様な方法で完了することができるであろう。
[00197] 別の態様において、その組織または細胞試料をあらゆる形態学的染色手順の前に１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーと反応させる。
[00198] 細胞学的評価におけるオフ速度が遅いアプタマーの使用の１態様は、ＰＡＰ塗抹標本評価の、ハイリスクＨＰＶ１６および／または１８株からの分子標的に特異的なオフ速度が遅いアプタマーとの組み合わせであろう。この場合、そのオフ速度が遅いアプタマーは、Ｅ６もしくはＥ７タンパク質と、またはＥ６もしくはＥ７およびＬ１もしくはＥ２もしくはＬ２タンパク質の内の１種類に反応するように設計することができる。代表的なＰＡＰ塗抹標本染色プロトコルは、染料、ハリスヘマトキシリン、オレンジＧ６、およびＥＡ５０の組み合わせを利用する。ＥＡ５０はエオシンＹ、ビスマルクブラウン、およびファストグリーンを含有する組み合わせ染料である。ヘマトキシリンは核を青く染色し、その他の染料はケラチンと反応して細胞の細胞質をケラチン含有量に応じて緑色〜青色またはピンク色に染色する。その染色プロトコルは、ヘマトキシリン（５分間）で開始されてよい。それぞれの染色工程の後に、次の工程の前に数回の洗浄（実施例３に関する）が続いてよい。アルコール処理の工程の後は洗浄サイクルを除いてよい。次いでそのスライドを、０．１％ＨＣｌ溶液で１分間、次いで０．０２％アンモニウム水で１分間、９５％試薬グレードエタノールで２分間を２サイクル、オレンジＧ６で２分間、９５％試薬グレードエタノールで２分間を２サイクル、ＥＡ５０で３分間、そして最後に９５％試薬グレードエタノールで２分間を２サイクル処理することができる。そのスライドをアルコールで脱水し、キシレンで透徹し、次いでマウント媒体を適用し、カバーガラスを適用することができる。次いでスライドを顕微鏡検査することができる。次いでカバーガラスを取り外し、そのスライドを酸アルコールの１回以上のすすぎで処理して染料を除去し、形態学的検査のために用いる。一度その塗抹標本を脱染したら、そのスライドをオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）を含有する反応溶液で覆い、３０分間から一夜まで保温することができるであろう。その保温期間は、オフ速度が遅いアプタマーのそれの特異的な標的との会合を最適化する一方でバックグラウンドの染色を最小限にするように選択されるべきである。
[00199] 反応溶液または緩衝された溶液は、独立して０．００５〜４０ｎＭのそれぞれ目的の標的に特異的な１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーを含有することができるであろう。例えば、そのオフ速度が遅いアプタマーの濃度は、以下の濃度のいずれか以下であることができるであろう；混合物中のオフ速度が遅いアプタマーにより０．００５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、３５ｎＭ、または４０ｎＭ。その反応溶液は、緩衝液、例えばＳＢ１７（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＴＷＥＥＮ−２０）または細胞もしくは組織における変化を最小限にする、もしくはオフ速度が遅いアプタマーの切片（組織または細胞）中への拡散を促進するように経験的に選択された他の緩衝液を含有することができるであろう。その反応溶液はさらに、例えばニシン精子ＤＮＡ等を含む、そのオフ速度が遅いアプタマーの試料由来の核酸への非特異的結合を最小限にするための物質を含有していてよい。追加の構成要素には、デキストラン硫酸、カゼインのようなキャリヤータンパク質等が含まれることができるであろう。場合により速度論的負荷工程を利用することができるであろう。
[00200] １態様において、いくつかの関連する腫瘍タイプからの組織切片または細胞を用いて、望まれる腫瘍マーカーと反応するオフ速度が遅いアプタマーを選択および生成することができる。異なる組織切片中のマーカーは、異なる組織切片中の異なる物質と架橋または会合することができるため、その腫瘍タイプに特有の特定の局在した環境中のその特定のマーカーの存在を識別するオフ速度が遅いアプタマーを選択および生成することができる可能性がある。従って、例えば未分化乏突起細胞腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍ）、星状細胞腫、および乏突起星細胞腫を識別するために用いることができるオフ速度が遅いアプタマーの集団（ｐａｎｅｌ）を同定することができる可能性がある。場合により、これらのオフ速度が遅いアプタマーは光アプタマーまたは架橋性アプタマーであってよい。
[00201] 別の態様において、腫瘍タイプを識別するために選択および生成されるオフ速度が遅いアプタマーは、反応混合物中のそれぞれのオフ速度が遅いアプタマーが、そのオフ速度が遅いアプタマーに独特の特異的なシグナルを生成するであろう独特の蛍光性または他のタイプの標識を含有するように生成されてよい。標識の独特の組み合わせの検出は、腫瘍のタイプの識別を提供するために用いられるであろう。それぞれのオフ速度が遅いアプタマーは、組織切片または細胞調製物中でのそのオフ速度が遅いアプタマーとそれの特異的な標的の相互作用の際に生成するシグナルを増大させるために蛍光または他の標識の多数のコピーを有するように生成することもできるであろう。シグナルを生成する標識は、染色された細胞または組織において明確に見ることができ、オフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）との反応の前にその試料を脱染する必要性を排除するように選択することができる。場合により、これらのオフ速度が遅いアプタマーは光アプタマーまたは架橋性アプタマーであってよい。
[00202] 別の態様において、その組織切片または細胞は、特定の腫瘍マーカーに対して選択および生成されたオフ速度が遅いアプタマーと反応させることができる。その腫瘍マーカーに対するオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）に加えて、その組織切片または細胞は、１種類以上のホルモンまたは他のタイプの腫瘍に特異的なマーカーであって、その腫瘍により産生される可能性があり、その腫瘍のタイプおよび由来を同定するのを助ける可能性がある前記ホルモンまたはマーカーに特異的である１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーと反応させることができる。
[00203] 別の態様において、その組織切片または細胞は、その疾患に関する予後を確立するために用いることができる１種類以上のマーカーに対して選択および生成された１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーと反応させることができる。１態様において、その組織切片または細胞は、適切な療法剤の選択を支持するために用いることができる１種類以上のマーカーに対して選択および生成された１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーと反応させることができる。例えば、神経膠腫における高レベルの特異的グリコシドヒドロラーゼＹＫＬ−４０の存在は、より少ないＹＫＬ−４０を有する神経膠腫におけるよりも乏しい予後を示している可能性がある。ＹＫＬ−４０レベルの差次的発現は、対照の物質と比較した、組織切片または細胞調製物において観察されるオフ速度が遅いアプタマーでの染色のレベルにより確立することができる。
[00204] 組織または細胞試料の分析に関する態様のいずれかにおいて、１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーのその試料との最初の保温の後に、そのオフ速度が遅いアプタマー（単数または複数）を場合により適切な架橋活性化因子への曝露によりそれらの対応する標的に架橋することができる。
[00205] 別の態様において、特定の疾患状態を示す１種類以上の標的に特異的な一種
類以上のオフ速度が遅いアプタマーで構成されていてよい組織学的または細胞学的試薬を提供する。標的には腫瘍特異的マーカー、ホルモン、または他の分子が含まれてよい。そのオフ速度が遅いアプタマーに加えて、その試薬は緩衝剤、塩類、界面活性剤、ブロッキング試薬、競合剤、および安定剤で構成されていてよい。
[00206] 本開示の別の観点は、試験試料を分析するための本明細書において開示される方法のいずれかを都合よく実施するのに有用なキットに関する。開示される方法の多用途性を増進するために、その試薬を、その試薬の比率がその方法およびアッセイの実質的な最適化を提供するように、同じまたは別個の容器中に包装された組み合わせで提供することができる。その試薬はそれぞれ別個の容器に入っていてよく、または様々な試薬がその試薬の交差反応性および安定性に応じて１個以上の容器中で組み合わせられていることができる。
[00207] キットは、包装された組み合わせの中に、少なくとも１種類のアプタマーおよび非特異的結合を低減するための少なくとも１種類の競合剤を含む。そのキットには、試料の希釈およびスライドの洗浄のための洗浄溶液、例えば緩衝された水性媒体、試料調製試薬等も含まれてよい。加えて、そのキットはその分析法の間に望まれる速度論的負荷を実施するのに適した試薬を含有していてよい。キット中の様々な試薬の相対的な量は、そのアッセイの間に起こる必要がある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を提供するために、およびそのアッセイの感度をさらに実質的に最適化するために、広く異なっていることができる。適切な状況の下で、キット中の試薬の１種類以上を、賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができ、それは溶解すると本開示に従う方法またはアッセイを実施するための適切な濃度を有する試薬溶液を提供するであろう。そのキットにはさらに、本明細書で記述されるような方法のいずれかに従う方法が書かれた記述が含まれ得る。
[00208] １態様において、試験試料中に存在する可能性のある１種類以上の標的の検出および／または定量化のためのキットには、標的に関する特異的な親和性を有する少なくとも１種類のアプタマー、および非特異的結合を低減するための少なくとも１種類のポリアニオン性競合剤が含まれる。
[00209] 別の態様において、試験試料中に存在する可能性のある１種類以上の標的の検出および／または定量化のためのキットには、共有結合的に付着した検出部分／標識を有する、標的に関する特異的な親和性を有する少なくとも１種類のアプタマー、および非特異的結合を低減するための少なくとも１種類のポリアニオン性競合剤が含まれる。
[00210] 別の態様において、試験試料中に存在する可能性のある１種類以上の標的の検出および／または定量化のためのキットには、標的に関する特異的な親和性および二次染色試薬により染色されることができる共有結合性部分を有する少なくとも１種類のアプタマー、ならびに非特異的結合を低減するための少なくとも１種類のポリアニオン性競合剤が含まれる。
[00211] 加えて、上記のキットのいずれも、そのキットの検出法の間の速度論的負荷の実施のための試薬および物質を含有していてよい。
[00212] 本開示の方法を、実施例１〜１１に一般的に図説する。実施例１は、修飾ヌクレオチドで構成される候補混合物を用いる一般的な親和性ＳＥＬＥＸ法を記述する。実施例２は、修飾ヌクレオチドおよび５’末端光反応基で構成される候補混合物を用いる光ＳＥＬＥＸ法、ならびに平衡化アプタマー：標的混合物に対して遅いオフ速度の濃縮プロセスを提供するために希釈が用いられる向上したＳＥＬＥＸ法を記述する。実施例３は、
希釈工程への競合剤の添加により実施例２で記述される方法を拡張する。実施例４は、遅いオフ速度の濃縮プロセスの有効性を図説する。遅いオフ速度の濃縮プロセスの非存在下で選択される修飾ヌクレオチド５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ＢｎｄＵＴＰ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ｉＢｕｄＵＴＰ）、または５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ＴｒｐｄＵＴＰ）を用いたアプタマーに関する平均解離半減期値（ｔ１／２）は２０分であり、一部のアプタマーは１時間までのｔ１／２値を有していた。これは、以前に天然塩基または他の修飾ヌクレオチドを用いて記述されたものよりも実質的に長い。遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いて選択されたアプタマーに関する平均は、８５分を超えた。より具体的には、図４Ｂに関連して、遅いオフ速度の濃縮プロセスの導入は、約１５分以上、約３０分以上、約６０分以上、約９０分以上、約１２０分以上、約１５０分以上、約１８０分以上、約２１０分以上、および約２４０分以上のｔ１／２値を有するアプタマーを生成した。アプタマー：標的複合体に関するこれらの解離速度は前例がない。
[00213] 実施例５は、ＮａｐｄＵ（５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−ｄＵ）候補混合物を用いる遅いオフ速度のアプタマーの生成を記述する。
[00214] 実施例６は、ペプチド標的に対する遅いオフ速度のアプタマーの生成を記述する。
[00215] 実施例７は、一般に用いられるアプタマーと比較したオフ速度が遅いアプタマーの有用性を図説する。
[00216] 実施例８は、ＢｎｄＵ候補混合物を用いるオフ速度が遅いアプタマーの生成を図説する。
[00217] 実施例９は、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ−２）に対するオフ速度が遅いＢｎｄＵアプタマーの生成および組織学的適用を記述する。
[00218] 実施例１０は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−１）に対するオフ速度が遅いＢｎｄＵアプタマーの生成および組織学的適用を記述する。
[00219] 実施例１１は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に対するオフ速度が遅いＢｎｄＵアプタマーの生成および組織学的適用を記述する。
[00220] 以下の実施例は説明的な目的のみのために提供され、添付された特許請求の範囲において定義される本発明の範囲を限定することを意図していない。
実施例１．核酸ライブラリーにおける修飾ヌクレオチドの組み込みは、親和性ＳＥＬＥＸにおいてより高い親和性が濃縮されたライブラリーをもたらす
[00221] Ａ．候補混合物の調製
[00222] ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、５−メチル−ｄＣＴＰ（ＭｅｄＣＴＰ）およびｄＴＴＰまたは３種類のｄＵＴＰ類似体：５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ＢｎｄＵＴＰ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ｉＢｕｄＵＴＰ）、もしくは５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ＴｒｐｄＵＴＰ）の内の１種類のどちらかを用いて、候補混合物を調製した。候補混合物を、ビオチン化された鋳型にアニーリングしたプライマーのポリメラーゼ伸長により調製した（図３）。それぞれの候補混合物組成物に関して、４．８ｎｍｏｌの順方向ＰＣＲプライマーおよび４ｎｍｏｌの鋳型を、１００μＬの１×ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ）中で混ぜ合わせ、９５℃に８分間加熱し、氷上で冷却した。１×ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、０．１２５Ｕ／μＬのＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ＭｅｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ類似体を含有する４００μＬの伸長反応物に、それぞれ１００μＬのプライマー：鋳型混合物を添加し、７０℃で３０分間保温した。１ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（ＭａｇｎａＢｉｎｄストレプトアビジン、Ｐｉｅｒｃｅ、１Ｍ ＮａＣｌ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０中５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合しながら２５℃で１０分間保温することにより、鋳型鎖ビオチンを介して二本鎖の産物を捕捉した。ビーズを０．７５ｍＬ ＳＢ１Ｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）で３回洗浄した。アプタマー鎖を１．２ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを用いてビーズから溶離させ、０．３ｍＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、そして１５μＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で候補混合物をおよそ０．２ｍＬに濃縮し、そしてＵＶ吸収分光法により定量化した。
[00223] Ｂ．標的タンパク質の固定化
[00224] （Ｈｉｓ）６タグ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のようなポリＨｉｓタグを有する標的タンパク質を購入し、Ｃｏ＋２−ＮＴＡ常磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅ ＴＡＬＯＮ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、または以下Ｔａｌｏｎビーズと呼ぶ）上に固定した。標的タンパク質を、０．５ｍＬのＢ／Ｗ緩衝液（５０ｍＭ リン酸Ｎａ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ
ＮａＣｌ、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０）中で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．５ｍＬのＴＡＬＯＮビーズ（Ｂ／Ｗ緩衝液で３回あらかじめ洗浄し、Ｂ／Ｗ緩衝液中で１０ｍｇ／ｍＬに再懸濁した）に添加した。混合物を２５℃で３０分間回転させ、使用するまで４℃で保管した。（Ｈｉｓ）６ペプチドでコートしたＴＡＬＯＮビーズも調製し、上記のように保管した。使用の前に、ビーズをＢ／Ｗ緩衝液で３回、ＳＢ１Ｔで１回洗浄し、ＳＢ１Ｔ中で再懸濁した。
[00225] Ｃ．アプタマー選択スキーム
[00226] 親和性選択を、それぞれの候補混合物を用いて別々に行い、標的タンパク質ビーズ（シグナル、Ｓ）および（Ｈｉｓ）６ビーズ（バックグラウンド、Ｂ）間で結合を比較した。それぞれの試料に関して、４０μＬのＳＢ１Ｔ中０．５μＭの候補ＤＮＡ混合物を調製した。１μＬの（Ｈｉｓ）６相補的オリゴ（１ｍＭ）（図３）を、１０μＬのタンパク質競合剤混合物（ＳＢ１Ｔ中の０．１％ＨＳＡ、１０μＭカゼイン、および１０μＭプロトロンビン）とともにそのＤＮＡに添加した。
[00227] ５０μＬの標的タンパク質でコートされたビーズまたは（Ｈｉｓ）６でコートされたビーズ（ＳＢ１Ｔ中５ｍｇ／ｍＬ）をＤＮＡ混合物に添加し、混合しながら３７℃で１５分間保温することにより、結合反応を行った。ＤＮＡ溶液を除去し、０．１ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＳＢ１Ｔを用いて３７℃で５回、ビーズを洗浄した。示さない限り、全ての洗浄は１００μＬの洗浄溶液中でビーズを再懸濁し、３０秒間混合し、磁石でビーズを分離し、洗浄溶液を除去することにより行われた。１００μＬ ＳＢ１Ｔ＋２Ｍグアニジン−ＨＣｌを添加し、混合しながら３７℃で５分間保温することにより、結合したアプタマーをビーズから溶離した。磁気分離の後、アプタマー溶離物を新しいチューブに移した。最初の２回の選択ラウンドの後、５回の標的ビーズ洗浄の内の最後の２回を、３０秒間ではなく５分間行った。
[00228] ビオチン化逆方向ＰＣＲプライマーをストレプトアビジンでコートされた常磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅ−ストレプトアビジンＣ１（ＳＡビーズ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に固定することにより、プライマービーズを調製した。５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）をＮａＣｌＴ（５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ＴＷＥＥＮ−２０）で１回洗浄し
、５ｍＬビオチン化逆方向ＰＣＲプライマー（ＮａＣｌＴ中５μＭ）中で再懸濁した。その試料を２５℃で１５分間保温し、５ｍＬのＮａＣｌＴで２回洗浄し、１２．５ｍＬのＮａＣｌＴ（４ｍｇ／ｍＬ）中で再懸濁し、４℃で保管した。
[00229] ２５μＬのプライマービーズ（ＮａＣｌＴ中４ｍｇ／ｍＬ）をグアニジン緩衝液中の１００μＬアプタマー溶液に添加し、混合しながら５０℃で１５分間保温した。アプタマー溶液を除去し、ビーズをＳＢ１Ｔで５回洗浄した。８５μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で１分間保温することにより、アプタマーをビーズから溶離した。磁気分離の後、８０μＬのアプタマー溶離物を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、１μＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で緩衝した。
[00230] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00231] 選択されたアプタマーＤＮＡをＱＰＣＲにより増幅し、定量化した。４８μＬのＤＮＡを１２μＬのＱＰＣＲ混合物（５×ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ順方向ＰＣＲプライマー、１０μＭビオチン化逆方向ＰＣＲプライマー、５×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、０．１２５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）に添加し、ＡＢＩ５７００ ＱＰＣＲ装置において以下のプロトコルで熱サイクルを行った：１サイクルの９９．９℃１５秒間、５５℃１０秒間、７０℃３０分間；３０サイクルの９９．９℃１５秒間、７２℃１分間。装置のソフトウェアを用いて定量化を行い、標的ビーズおよび（Ｈｉｓ）６ビーズで選択されたＤＮＡのコピー数を比較してシグナル／バックグラウンド比を決定した。
[00232] 増幅の後、ＰＣＲ産物をビオチン化アンチセンス鎖を介してＳＡビーズ上に捕捉した。１．２５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を０．５ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨで２回、０．５ｍＬのＳＢ１Ｔで１回洗浄し、２．５ｍＬの３Ｍ ＮａＣｌ中で再懸濁し、４℃で保管した。２５μＬのＳＡビーズ（３Ｍ ＮａＣｌ中４ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物に添加し、混合しながら２５℃で５分間保温した。ビーズをＳＢ１Ｔで１回洗浄し、２００μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で１分間保温することにより、“センス”鎖をビーズから溶離した。溶離された鎖を廃棄し、ビーズをＳＢ１Ｔで３回および１６ｍＭ ＮａＣｌで１回洗浄した。
[00233] 固定されたアンチセンス鎖からのプライマー伸張により、適切なヌクレオチド組成でアプタマーのセンス鎖を調製した。そのビーズを２０μＬのプライマー伸張反応混合物（１×プライマー伸張緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８ ＠ ２０、１０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００１％ＢＳＡ、および０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）、５μＭ順方向ＰＣＲプライマー、０．１２５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、それぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ＭｅｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ類似体のどちらか）中で再懸濁し、混合しながら６８℃で３０分間保温した。そのビーズをＳＢ１Ｔで３回洗浄し、８５μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で１分間保温することにより、アプタマー鎖をビーズから溶離した。磁気分離の後、８０μＬのアプタマー溶離物を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、５μＬの０．１Ｍ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。
[00234] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00235] 選択工程の相対的標的タンパク質濃度を、以下のようにＳ／Ｂ比に応じてそれぞれのラウンドで低下させ、ここでシグナルＳおよびバックグラウンドＢは上記の節Ｃにおいて定義されている：
Ｓ／Ｂ＜１０の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］ｉ
１０≦Ｓ／Ｂ＜１００の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］ｉ／３．２
Ｓ／Ｂ≧１００の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］ｉ／１０
ここで、［Ｐ］＝タンパク質濃度であり、ｉ＝現在のラウンド数である。
[00236] 標的タンパク質濃度を、選択工程に添加される標的タンパク質ビーズ（およびバックグラウンド決定のための（Ｈｉｓ）６ビーズ）の質量を調節することにより低下させた。
[00237] それぞれの選択ラウンドの後、濃縮されたＤＮＡ混合物の収束状態を決定した。５μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物を、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを含有する４ｍＭ ＭｇＣｌ２で２００μＬに希釈した。７５μＬのシリコンオイルを試料に重層し、二本鎖オリゴヌクレオチドの複合体混合物に関するハイブリダイゼーション時間を測定するＣ０ｔ分析を用いて収束に関して分析した。以下のプロトコルで、試料に熱サイクルを行った：３サイクルの９８℃１分間、８５℃１分間；１サイクルの９３℃１分間、８５℃１５分間。８５℃で１５分間の間に、５秒間隔で蛍光画像を測定した。蛍光強度をｌｏｇ（時間）の関数としてプロットして、配列の多様性を評価した。
[00238] Ｆ．平衡結合定数（Ｋｄ）の測定
[00239] ＴＡＬＯＮビーズ分配を用いて、濃縮されたライブラリーの平衡結合定数を測定した。９５℃に加熱し、ゆっくりと３７℃まで冷ますことにより、ＤＮＡを再生させた（ｒｅｎａｔｕｒｅｄ）。複合体を、低濃度の放射標識（ｒａｄｉｏｌａｂｌｅｄ）ＤＮＡ（約１×１０−１１Ｍ）をある範囲の濃度の標的タンパク質（１×１０−７Ｍ〜最終的に１×１０−１２Ｍ）とＳＢ１緩衝液中で混合して３７℃で保温することにより形成した。それぞれの反応物の一部をナイロン膜に移し、乾燥させて、それぞれの反応物中の総カウントを決定した。少量の５ｍｇ／ｍＬ ＴＡＬＯＮビーズをそれぞれの反応物の残りに添加し、３７℃で１分間混合した。一部を真空下でＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＶプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させて、未結合のＤＮＡからタンパク質が結合した複合体を分離して、１００μＬのＳＢ１緩衝液で洗浄した。ナイロン膜およびＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＶプレートをホスホイメージ化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｄ）し、ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００を用いてそれぞれの試料中の放射活性の量を定量化した。捕捉されたＤＮＡの割合をタンパク質濃度の関数としてプロットし、非線形曲線適合アルゴリズムを用いてデータから平衡結合定数（Ｋｄ値）を抽出した。表１は、標的のセットに対してそれぞれの濃縮された候補混合物に関して決定されたＫｄ値を示す。ＮＴは、特定の塩基組成に関して濃縮されたライブラリーが、Ｃ０ｔ分析により決定した際に、元の候補混合物から変化しなかったようであり、従って試験されなかった（ＮＴ）ことを示す。
[00240] 表１は、１５種類の異なるタンパク質標的および４種類の異なるＤＮＡライブラリー：天然存在塩基（ｄＴ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）（ｉＢｕｄＵ）、または５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）（ＴｒｐｄＵ）に対して濃縮されたプールに関する平衡結合定数（Ｋｄ）を示す。ＳＥＬＥＸプロセスにおける修飾塩基の使用は、望まれる高親和性アプタマーの有意により高い百分率をもたらす。通常のヌクレオチドを用いて生成された１４種類のアプタマーの内の２種類のみが望まれる遅い解離速度を有することが観察された。修飾ヌクレオチドを用いて生成されたオフ速度が遅いアプタマーは、ＢｎｄＵＴＰ、ｉＢｕｄＵＴＰ、およびＴｒｐｄＵＴＰに関してそれぞれ１４種類の内の９種類、１４種類の内の７種類、および１４種類の内の１４種類と同定された。
表１．異なる修飾ヌクレオチドを用いて選択された濃縮ライブラリーの平衡結合定数（Ｋｄ）、モル濃度の単位で報告されている。ＮＴ＝未試験。
実施例２．５’固定光ＳＥＬＥＸおよび希釈による遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いる光アプタマーの生成
[00241] Ａ．候補混合物の調製
[00242] ビオチン化された鋳型にアニーリングしたプライマーのポリメラーゼ伸長により、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する候補混合物を調製した（図５Ａ〜Ｂ）。それぞれの鋳型に関して、それぞれ５’末端に独特の発色団を有する４種類の異なる順方向プライマーを用いた（発色団の構造に関して図６を参照）。それぞれの候補混合物に関して、１１ｎｍｏｌの順方向プライマー（５’発色団を有する）および１０ｎｍｏｌの鋳型を、２５０μＬのプライマー伸張緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で混ぜ合わせ、９５℃に５分間加熱し、氷上で冷却した。それぞれ１２５μＬのプライマー：鋳型混合物を、プライマー伸張緩衝液、０．１２５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する１ｍＬの伸長反応物に添加し、７０℃で３０分間保温した。それぞれ１ｍＬの反応物を４つの２５０μＬの分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）に分けて、氷上で冷却した。１ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（ＭａｇｎａＢｉｎｄ−ストレプトアビジン、Ｐｉｅｒｃｅ、１Ｍ ＮａＣｌ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０中５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれ２５０μＬの分割量に添加し、混合しながら２５℃で６０分間保温することにより、鋳型鎖ビオチンを介して二本鎖産物を捕捉した。ビーズを０．５ｍＬのＳＢ１７Ｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）で３回洗浄した。１ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを用いてアプタマー鎖をビーズから溶離し、０．２５ｍＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、１０μＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で候補混合物をおおよそ０．２ｍＬに濃縮し、ＵＶ吸収分光法により定量化した。
[00243] Ｂ．標的タンパク質の調製
[00244] ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）をリジン残基に共有結合させることにより、タグ化されていない標的タンパク質をビオチン化した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５マイクロスピンカラムを用いて、タンパク質（５０μＬ中３００ｐｍｏｌ）をＳＢ１７Ｔ中に交換した。ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを１．５ｍＭまで添加し、反応物を４℃で１６時間保温した。未反応のＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５マイクロスピンカラムを用いて除去した。
[00245] Ｃ．遅いオフ速度の濃縮プロセスおよび光架橋を用いたアプタマー選択
[00246] それぞれの候補混合物を用いて選択を別々に実施し、標的タンパク質を含む試料（シグナルＳ）および標的タンパク質無しの試料（バックグラウンドＢ）の間で結合を比較した。最初の３回のラウンドは親和性に関する選択を伴って実施され（光架橋なし）；第２および第３のラウンドには遅いオフ速度の濃縮プロセスが含まれた。ラウンド４〜８には遅いオフ速度の濃縮プロセスおよび光架橋両方が含まれた。
[00247] それぞれの試料に関して、９０μＬのＤＮＡ混合物を、１０〜２０ｐｍｏｌの候補混合物（最初のラウンドでは１００ｐｍｏｌ）および１００ｐｍｏｌの逆方向プライマーを含むようにＳＢ１７Ｔ中で調製した。試料を９５℃に３分間加熱し、０．１Ｃ／秒の速度で３７℃まで冷却した。試料を１０μＬのタンパク質競合剤混合物（ＳＢ１７Ｔ中０．１％ＨＳＡ、１０μＭカゼイン、および１０μＭプロトロンビン）と混ぜ合わせ、０．５ｍｇのＳＡビーズ（２０ｍＭ ＮａＯＨで２回、ＳＢ１７Ｔで１回あらかじめ洗浄した）に添加し、混合しながら３７℃で５分間保温した。磁気分離によりビーズを移した。
[00248] １０μＬの標的タンパク質（ＳＢ１７Ｔ中０．５μＭ）またはＳＢ１７Ｔを４０μＬのＤＮＡ混合物に添加し、３７℃で３０分間保温することにより、結合反応を行った。
[00249] 遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いる場合、複合体を捕捉する前に９５０μＬのＳＢ１７Ｔ（３７℃にあらかじめ加熱した）を添加することにより試料を２０×希釈し、３７℃で３０分間保温した。
[00250] ０．２５ｍｇ ＭｙＯｎｅ−ＳＡビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、混合しながら３７℃で１５分間保温することにより、タンパク質ビオチンを介してＳＡビーズ上に複合体を捕捉した。ビーズをＳＢ１７Ｔで５回洗浄することにより未結合のＤＮＡを除去した。示さない限り、全ての洗浄は、１００μＬの洗浄溶液中でビーズを再懸濁し、２５℃で３０秒間混合し、磁石でビーズを分離し、洗浄溶液を除去することにより行った。８５μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で１分間保温することにより、アプタマー鎖をビーズから溶離した。磁気分離の後、８０μＬのアプタマー溶離物を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、１μＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で緩衝した。
[00251] 光選択を用いた場合、５０μＬの結合反応物（または任意の希釈による遅いオフ速度の濃縮プロセスの後の１ｍＬの結合反応物）に高圧水銀ランプ（Ｏｐｔｉｃａｌ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．モデル０１３１−０００３−０１、５００Ｗ、３１０ｎｍミラーをセット）を上から照射した。ＢｒｄＵ発色団を有する候補混合物には３７秒間照射し、ＡＮＡ発色団を有する候補混合物には６０秒間照射し、ＡＱまたはソラレン発色団を有する候補混合物には１０分間照射した。ＡＮＡ、ＡＱおよびソラレン発色団に関して追加のフィルター（５ｍｍプレートガラス）を用いて、不要であるが損傷を与える可能性のある３２０ｎｍ未満の波長を排除した。複合体を上記のように捕捉し、ビーズを４Ｍグアニジン−ＨＣｌ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０で５０℃で１０分間１回、２０ｍ
Ｍ ＮａＯＨで２５℃で２分間１回、ＳＢ１７Ｔで２回、および１６ｍＭ ＮａＣｌで１回洗浄することにより、架橋されていないＤＮＡを除去した。増幅工程のために、架橋されたＤＮＡはビーズ表面から除去しなかった。
[00252] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00253] 選択されたアプタマーＤＮＡをＱＰＣＲにより増幅し、定量化した。４８μＬのＤＮＡを１２μＬのＱＰＣＲ混合物（５×ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ順方向ＰＣＲプライマー、１０μＭビオチン化逆方向ＰＣＲプライマー、５×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、０．１２５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）に添加し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭｙＩＱ ＱＰＣＲ装置において以下のプロトコルで熱サイクルを行った：１サイクルの９９．９℃１５秒間、５５℃１０秒間、６８℃３０分間、３０サイクルの９９．９℃１５秒間、７２℃１分間。装置のソフトウェアを用いて定量化を行い、標的タンパク質を伴って、および標的タンパク質無しで選択されたＤＮＡのコピー数を比較して、シグナル／バックグラウンド比を決定した。
[00254] 光選択を用いた場合、ビーズ表面上でのプライマー伸張により、選択されたＤＮＡのｃＤＮＡコピーを調製した。洗浄したビーズを２０μＬのｃＤＮＡ伸張混合物（５μＭ逆方向ＰＣＲプライマー、それぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに０．１２５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼを含有するプライマー伸張緩衝液）中で再懸濁し、混合しながら６８℃で３０分間保温した。ビーズをＳＢ１７Ｔで３回洗浄し、８５μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で１分間保温することにより、アプタマー鎖をビーズから溶離した。磁気分離の後、８０μＬのアプタマー溶離物を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、１μＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で緩衝した。３０サイクルの９９．９℃１５秒間、７２℃１分間の上記のようなＱＰＣＲにより、ｃＤＮＡを増幅し、定量化した。
[00255] 増幅の後、ＰＣＲ産物をビオチン化アンチセンス鎖を介してＳＡビーズ上に捕捉した。１．２５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を０．５ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨで２回、０．５ｍＬのＳＢ１７Ｔで１回洗浄し、１．２５ｍＬの３Ｍ ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で再懸濁し、４℃で保管した。２５μＬのＳＡビーズ（３Ｍ ＮａＣｌＴ中１０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物に添加し、混合しながら２５℃で５分間保温した。ビーズをＳＢ１７Ｔで１回洗浄し、２００μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で１分間保温することにより、“センス”鎖をビーズから溶離した。溶離された鎖を廃棄し、ビーズをＳＢ１７Ｔで３回、１６ｍＭ ＮａＣｌで１回洗浄した。
[00256] 固定されたアンチセンス鎖からのプライマー伸張により、適切な発色団を有するアプタマーセンス鎖を調製した。２０μＬのプライマー伸張反応混合物（１×プライマー伸張緩衝液、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、適切な５’発色団を有する５μＭ順方向プライマー、それぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰ、ならびに０．１２５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ）中でビーズを再懸濁し、混合しながら６８℃で３０分間保温した。ビーズをＳＢ１７Ｔで３回洗浄し、８５μＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で１分間保温することにより、アプタマー鎖をビーズから溶離した。磁気分離の後、８０μＬのアプタマー溶離物を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、５μＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。
[00257] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00258] 実施例１で記述したように、それぞれのラウンドで標的タンパク質を調整した。それぞれの選択ラウンドの後、実施例１で記述したように、濃縮されたプールの収束状態を決定した。
[00259] Ｆ．濃縮されたライブラリーの平衡結合定数
[00260] ＳＡ捕捉ビーズを用いたこと以外は、上記の実施例１で記述したように、結合親和性を決定した。以下の表、表２は、遅いオフ速度の濃縮プロセスを伴う光ＳＥＬＥＸプロトコルを用いて得られた平衡結合定数（Ｋｄ）を要約する。
表２．異なる発色団を用いて選択された濃縮ライブラリーの平衡結合定数（Ｋｄ）、モル濃度の単位で報告されている。収束に失敗したライブラリーに対しては測定を行わなかった（ｘで示す）。
[00261] Ｇ．架橋活性アッセイ
[00262] 飽和タンパク質および光の条件下でタンパク質に架橋されたＤＮＡのパーセントを測定することにより、濃縮されたライブラリーの架橋収率を決定した。放射標識ＤＮＡ（５０ｐＭ）を、ＳＢ１７Ｔ中で逆方向プライマー（１６ｎＭ）と混合し、９５℃に３分間加熱し、０．１℃／秒で３７℃まで冷却した。標的タンパク質を１０ｎＭの終濃度までＤＮＡ混合物に添加し、３７℃で３０分間保温した。タンパク質を含まない対照試料を同時に調製した。飽和用量を用いたこと以外は上記で記述した発色団に固有の条件（ＢｒｄＵに関しては６分間、ＡＮＡに関しては１０分間、ＡＱおよびＰｓｏｒに関しては３０分間）で、試料を架橋した。変性ＰＡＧＥにより試料を分析し（図７）、定量化し、その結果を表３において一覧表にする。
表３．異なる発色団を用いて選択された濃縮ライブラリーの架橋収率、タンパク質に架橋された総ＤＮＡのパーセントの単位で報告されている。収束に失敗したライブラリーに対しては測定を行わなかった（ｘで示す）。
[00263] 実施例３．競合剤を用いた遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いた、遅いオフ速度のアプタマーの生成
[00263] Ａ．候補混合物の調製
[00264] ９４種類のタンパク質標的に関して、ビオチン化された鋳型にアニーリングしたプライマーのポリメラーゼ伸長により、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する候補混合物を調製した。５５ｎｍｏｌの順方向プライマー（５’ＡＮＡ発色団を有する）および５５ｎｍｏｌの鋳型を、０．５ｍＬのプライマー伸張緩衝液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、７ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で混ぜ合わせ、９５℃に５分間、７０℃に５分間、４８℃に５分間加熱し、氷上で冷却した。プライマー伸張緩衝液、０．１２５Ｕ／μＬ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する５．５ｍＬの伸長反応物に、プライマー：鋳型混合物を添加し、７０℃で６０分間保温した。伸長反応の完了後、溶液を氷上で冷却した。２５ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（ＭａｇｎａＢｉｎｄ−ストレプトアビジン、Ｐｉｅｒｃｅ、１Ｍ ＮａＣｌ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０中５ｍｇ／ｍＬ）をプライマー伸張産物に添加し、回転させながら２５℃で１５分間保温することにより、鋳型鎖ビオチンを介して二本鎖産物を捕捉した。４０ｍＬのＳＢ１７Ｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）で３回、ビーズを洗浄した。３５．２ｍＬの２０ｍＭ ＮａＯＨを用いて、振盪しながら５分間、アプタマー鎖をビーズから溶離した。溶離された鎖を８．８ｍＬの８０ｍＭ ＨＣｌで中和し、４００μＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３で緩衝した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で候補混合物をおおよそ０．７ｍＬに濃縮し、ＵＶ吸収分光法により定量化した。
[00265] Ｂ．標的タンパク質の調製
[00266] 実施例２で記述したように、タグ化されていない標的タンパク質をビオチン化した。
[00267] Ｃ．遅いオフ速度の濃縮プロセスおよび光架橋を伴うアプタマー選択
[00268] ラウンド６〜９での遅いオフ速度の濃縮プロセスの間にアプタマーの再結合に関する競合剤として１０ｍＭのデキストラン硫酸を添加して、実施例２で記述したように選択を別個に行った。
[00269] 遅いオフ速度の濃縮プロセスを３種類の異なる方式で用いた。ラウンド２および３では、９５０μＬのＳＢ１７Ｔ（３７℃にあらかじめ加熱した）を添加することにより試料を２０×希釈し、複合体を捕捉する前に３７℃で３０分間保温した。ラウンド４および５では、９５０μＬのＳＢ１７Ｔ（３７℃にあらかじめ加熱した）を添加することにより試料を２０×希釈し、架橋前に３７℃で３０分間保温した。ラウンド６および７では、９５０μＬのＳＢ１７Ｔ（３７℃にあらかじめ加熱した）を添加することにより試料を２０×希釈した。それぞれの希釈された試料の５０μＬを９５０μＬのＳＢ１７Ｔ＋１０ｍＭ ５０００Ｋデキストラン硫酸（３７℃にあらかじめ加熱した）に移すことにより再び希釈して、全体で４００×希釈とし、架橋前に３７℃で６０分間保温した。ラウンド８および９では、９５０μＬのＳＢ１７Ｔ（３７℃にあらかじめ加熱した）を添加することにより試料を２０×希釈し、それぞれの試料の５０μｌを９５０μＬのＳＢ１７Ｔ（３７℃にあらかじめ加熱した）に移すことにより再び希釈して、４００×希釈とした。最後に、それぞれの４００×希釈された試料の内の５０μＬを９５０μＬのＳＢ１７Ｔ＋１０ｍＭ ５０００Ｋデキストラン硫酸（３７℃にあらかじめ加熱した）に移すことにより再び希釈して、全体で８０００×希釈とし、架橋前に３７℃で６０分間保温した。実施例２で記述したように、複合体を捕捉して洗浄した。光架橋を用いた場合、遅いオフ速度の濃縮プロセスの後の１ｍＬの結合反応物を、実施例２におけるような複合体の捕捉の前に、４７０ｎｍ ＬＥＤのアレイを用いて上から６０秒間照射した。
[00270] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00271] 実施例２におけるように増幅および精製を行った。
[00272] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00273] ラウンド６および８を除いて、実施例１で記述したようにそれぞれのラウンドで標的タンパク質を調整した。これらの大規模な希釈の後にシグナルを最大化するため、ラウンド６および８に関して標的タンパク質を１００ｎＭに増大させた。それぞれの選択ラウンドの後、実施例１で記述したように、濃縮されたプールの収束状態を決定した。
[00274] Ｆ．解離速度定数決定プロトコル
[00275] アプタマー：タンパク質複合体の解離に関する速度定数（ｋｏｆｆ）を、希釈の後に結合したままであるあらかじめ形成されたアプタマー：タンパク質複合体の割合を時間の関数として測定することにより、それぞれのアプタマーに関して決定した。放射標識アプタマー（５０ｐＭ）を、ＳＢ１７Ｔ−０．００２（ＴＷＥＥＮ−２０を０．００２％まで低減させたＳＢ１７Ｔ）中で、測定されたＫｄ値より１０倍高い濃度のタンパク質と共に３７℃で平衡化させた。試料を３７℃のＳＢ１７Ｔ−０．００２で１００倍希釈し、様々な時点で分割量を移し、分配して、未結合のアプタマーをタンパク質：アプタマー複合体から分離した。分配は、試料にＺＯＲＢＡＸ樹脂（Ａｇｉｌｅｎｔ）を添加し、その樹脂の上に複合体を捕捉し、試料を真空下でＤｕｒａＰｏｒｅ膜を通過させ、樹脂をＳＢ１７Ｔ−０．００２で洗浄することにより成し遂げられた。ＺＯＲＢＡＸ樹脂では効率的に捕捉されないタンパク質に関しては、そのアッセイはＳＢ１７Ｔ中でビオチン化されたタンパク質を用いて行われ、分配はＳＡビーズで複合体を捕捉することにより成し遂げられた。それぞれの時点で残っている複合体の量を、ＦＵＪＩ ＦＬＡ−３０００ホスホイメージャーで樹脂上の放射標識アプタマーを定量化することにより決定した。複合体の割合を時間の関数としてプロットし、解離速度定数（ｋｏｆｆ）および解離半減期値（ｔ１／２）を、非線形回帰を用いて二分子解離速度論に関する分析的表現にデータを適合させることにより決定した。
[00276] Ｇ．一部のアプタマーの速度論的特性
[00277] 以下の表、表４は、このプロトコルを用いて１０種類の標的に対して選択さ
れたアプタマーに関して得られた解離半減期値（ｔ１／２）を要約する。
表４．競合剤を用いる遅いオフ速度の濃縮工程プロトコルを用いたアプタマーの解離半減期値（ｔ１／２）。
実施例４：遅いオフ速度の濃縮プロセスは、選択されたアプタマーの解離半減期を増大させる
[00278] 遅いオフ速度の濃縮プロセスを含まない、実施例１で記述した親和性ＳＥＬＥＸ法または“核酸リガンドの光選択”と題された米国特許第６，４５８，５３９号において記述されている光ＳＥＬＥＸ法のどちらかにより選択された６５種類のアプタマーに関して、解離半減期値（ｔ１／２）を測定し、プロットした（図４Ａ）。希釈または競合剤を伴う希釈による遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いる、実施例２で記述した遅いオフ速度の濃縮プロセスにより選択された７２種類のアプタマーに関しても、ｔ１／２値を測定し、プロットした（図４Ｂ）。遅いオフ速度の濃縮プロセスの非存在下で選択された、修飾ヌクレオチド５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ＢｎｄＵＴＰ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ｉＢｕｄＵＴＰ）、または５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−ｄＵＴＰ（ＴｒｐｄＵＴＰ）を用いたアプタマーに関する平均ｔ１／２値は２０分であり、一部のアプタマーは１時間までのｔ１／２値を有していた。これは、天然塩基または他の修飾ヌクレオチドで以前に記述されたものよりも実質的に長い。遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いて選択されたアプタマーに関する平均は８５分を超え、いくつかのアプタマーは４時間を超えるｔ１／２値を有していた。
実施例５．ＮａｐｄＵランダムライブラリーからのアプタマーの生成
[00279] Ａ．候補混合物の調製
[00280] ５’−ＡＮＡ光反応基を用いない以外は実施例３で記述したように、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＮａｐｄＵを含有する候補混合物を調製した。
[00281] Ｂ．標的タンパク質の固定化
実施例１で記述したように、標的タンパク質は（Ｈｉｓ）６タグを含有しており、Ｔａｌｏｎビーズを用いてそれを捕捉した。
[00282] Ｃ．遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いたアプタマー選択
[00283] 光架橋を伴わない以外は実施例３で記述したように、アプタマー選択を行った。
[00284] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00285] 実施例３で記述したように、増幅および精製を行った。
[00286] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00287] 実施例３で記述したように、選択のストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00288] Ｆ．アプタマーの特性
[00289] この選択からの４種類のアプタマーの平衡結合定数（Ｋｄ）を表５で列挙する。
表５．ＮａｐｄＵアプタマーの平衡結合定数（Ｋｄ）
実施例６．競合剤を伴う遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いる、ペプチド標的に関するオフ速度が遅いアプタマーの生成
[00290] Ａ．候補混合物の調製
[00291] 実施例３で記述したように、５’ＡＮＡ発色団を有するプライマーのポリメラーゼ伸長によりｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する候補混合物を調製し、精製した。
[00292] Ｂ．遅いオフ速度の濃縮プロセスおよび光架橋を用いたアプタマー選択
[00293] ２９アミノ酸のビオチン化された標的ペプチドＳＭＡＰ２９（ヒツジ骨髄抗細菌ペプチドＭＡＰ−２９、Ａｎａｓｐｅｃ）を用いて、実施例３で記述したように、アプタマー選択を行った。
[00294] Ｃ．アプタマーの増幅および精製
[00295] 実施例３で記述したように、増幅および精製を行った。
[00296] Ｄ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00297] 実施例３で記述したように選択のストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00298] Ｅ．アプタマーの特性
[00299] この選択からのアプタマーの平衡結合定数（Ｋｄ）は、１．２×１０−８Ｍ（実施例１で記述したプロトコルに従って測定した）であった。このアプタマーの解離半減期（ｔ１／２）は６９分であった（実施例３で記述したプロトコルに従って測定した）。結果を図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。
実施例７．遅いオフ速度を有するアプタマーにより試験試料におけるタンパク質測定が可能になった
[00300] Ａ．アプタマー／プライマー混合物および試験試料の調製
[00301] ビオチンＣｙ３検出標識（それぞれ４ｎＭ）を有するアプタマーを、１×ＳＢ１７Ｔ中で、３倍過剰の捕捉プローブ（ビオチンタグおよび光切断可能要素を含有する、アプタマーの３’固定領域に相補的なオリゴヌクレオチド）と混合し、９５℃で４分間、次いで３７℃で１３分間加熱し、１×ＳＢ１７Ｔ中で１：４で希釈した。５５μＬのアプタマー／プライマー混合物をマイクロタイタープレート（Ｈｙｂａｉｄ＃ＡＢ−０４０７）に添加し、ホイルで密封した。マイクロタイタープレートにおいて、既知の濃度のタンパク質分析物をＳＢ１７Ｔ中で混合し、ＳＢ１７Ｔで系列希釈することにより、試験試料を調製した。
[00302] Ｂ．試料の平衡化
[00303] ５５μＬのアプタマー／プライマー混合物を５５μＬの試験試料に添加し、ホイルで密封したマイクロタイタープレート中で３７℃で１５分間保温した。平衡混合物中のそれぞれのアプタマーの終濃度は０．５ｎＭであった。別途言及しない限り、平衡化後はこの方法の全ての続く工程を室温で行った。
[00304] Ｃ．アプタマーの捕捉および未結合タンパク質の除去
[00305] ＤｕｒａＰｏｒｅ濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＶカタログ＃ＭＡＨＶＮ４５５０）を真空濾過により１００μＬの１×ＳＢ１７Ｔで１回洗浄し、１３３μＬの７．５％ストレプトアビジン−アガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）をそれぞれのウェルに添加し、２００μＬの１×ＳＢ１７Ｔで２回洗浄した。１００μＬの平衡化した試料をストレプトアビジン−アガロース樹脂を含有するＤｕｒａｐｏｒｅプレートに移し、熱ミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上で、８００ｒｐｍで５分間保温した。樹脂を２００μＬの１×ＳＢ１７Ｔ＋１００μＭビオチンで１回、２００μＬの１×ＳＢ１７Ｔで１回洗浄した。
[00306] Ｄ．ビオチンによるタンパク質のタグ化
[00307] 使用直前に調製した１００μＬのＳＢ１７Ｔ中１．２ｍＭ ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを、捕捉されたアプタマーおよびアプタマー：タンパク質複合体を有する樹脂に添加し、熱ミキサー上で８００ｒｐｍで２０分間保温した。樹脂を真空濾過により２００μＬの１×ＳＢ１７Ｔで５回洗浄した。
[00308] Ｅ．遅いオフ速度の濃縮プロセスおよび光切断
[00309] Ｄｕｒａｐｏｒｅプレートの底面から水滴誘導装置（ｄｒｉｐ ｄｉｒｅｃｔｏｒ）を取り外し、プレートを１ｍＬマイクロタイター収集プレート上に乗せた。樹脂を、２００μＬの１×ＳＢ１７Ｔで１回、１０００×ｇで３０秒間遠心分離することにより洗浄した。８０μＬの１×ＳＢ１７Ｔ＋１０ｍＭ デキストラン硫酸を樹脂に添加し、熱ミキサー上で８００ｒｐｍで１０分間、ＢｌａｃｋＲａｙ水銀ランプを用いて照射した。ＤｕｒａＰｏｒｅプレートを新しい１ｍＬディープウェルプレートに移し、１０００×ｇで３０秒間遠心分離して光切断されたアプタマーおよびタンパク質：アプタマー複合体を集めた。
[00310] Ｆ．タンパク質の捕捉および未結合アプタマーの除去
[00311] ５０μＬのＭｙＯｎｅ−ストレプトアビジンＣ１常磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１×ＳＢ１７Ｔ中１０ｍｇ／ｍＬ）をマイクロタイタープレートに添加した。磁石で６０秒間ビーズを分離し、上清を除去した。２２５μＬの光切断混合物をビーズに添加し、５分間混合した。磁気ビーズを分離し、洗浄緩衝液を取り替えることにより、ビーズを２００μＬの１×ＳＢ１７Ｔで４回洗浄した。最後の洗浄緩衝液を除去した。
[00312] Ｇ．アプタマーの溶離
[00313] １００μＬのリン酸ナトリウム溶離緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐ
Ｈ１１）をビーズに添加し、５分間混合した。９０μＬの溶離物をマイクロタイタープレートに移し、１０μＬのリン酸ナトリウム中和緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５）で中和した。
[00314] マイクロアレイに対するアプタマーのハイブリダイゼーション
[00315] カスタム顕微鏡スライド支持体上に固定されたそれぞれのアプタマーの可変領域の相補配列で構成されるオリゴヌクレオチド捕捉プローブを用いて、ＤＮＡアレイを調製した。多数のアレイ（サブアレイ）がそれぞれのスライド上に存在し、サブアレイは、試料の適用に関してガスケット（Ｇｒａｃｅ）を取り付けることにより物理的に分離された。アレイを１００μＬのブロッキング緩衝液で前処理し、熱ミキサー上で６５℃で１５分間保温した。３０μＬの高塩ハイブリダイゼーション緩衝液を、マイクロタイタープレートにおいて９０μＬの中和アプタマー溶離物に添加し、サーマルサイクラーにおいて９５℃で５分間保温し、０．１℃／秒で６５℃に冷却した。ブロッキング緩衝液をアレイから除去し、１１０μＬのアプタマー試料をアレイに添加し、加湿チャンバー中で６５℃で２０時間保温した。
[00316] Ｉ．アレイの洗浄
[00317] アプタマー試料をアレイから除去し、ガスケットを適所に置き、アレイを２００μＬの６５℃のリン酸ナトリウムＴｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液で１回洗浄し、ガスケットを除去してパップ（ｐａｐ）ジャー中で２５ｍＬの６５℃のリン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液で３回洗浄した。アレイを窒素銃で乾燥させた。
[00318] Ｊ．アレイ上のシグナルを定量化する
アレイスライドをＴＥＣＡＮ ＬＳ３００ Ｒｅｌｏａｄｅｄ上でＣｙ３検出に適したチャンネルでスキャンし、それぞれのアレイ特徴上のＣｙ３シグナルを定量化する。
[00319] 結果：
[00320] 伝統的なＳＥＬＥＸ法および材料を用いて、３種類の異なる標的（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、およびミエロペルオキシダーゼ）に特異的なアプタマーを生成した。５位修飾ヌクレオチドを用いて標的の同じセットに特異的なアプタマーの第２のセットを作製し、それらのそれぞれの標的に関する非常に遅いオフ速度に関して選択した。伝統的なプロセスで作製されたアプタマーは、およそ５分未満のオフ速度であると測定された。修飾ヌクレオチドを含んで、選択の間に遅いオフ速度の濃縮プロセスを用いて作製されたアプタマーは、２０分より長いオフ速度を有していた。２種類の異なる方法によりそれぞれの標的に関して２セットのアプタマーを作製し、それぞれの標的に関して総数４の異なるアプタマー集団を得た。これらのアプタマー集団が試験試料中で分析物濃度を測定する能力を、上記のように、標的濃度のある範囲に渡って評価した。ＤＮＡチップ検出からの相対的シグナルを、投入標的濃度に対してプロットした。図１２Ａ〜１２Ｃを参照。伝統的なアプタマーの反応曲線は非常に平坦であり、検出の感度はかなり低い。オフ速度が遅いアプタマーを用いたそれぞれの標的の検出の感度は優秀である。そのデータは、最大限の分析性能のためにはオフ速度が遅いアプタマーを用いる必要があることを裏付ける。
実施例８．ヒトトロンビンに対する高親和性ＢｎｄＵアプタマーの生成
[00321] Ａ．候補混合物の調製
[00322] 実施例３で記述したように、５’ＡＮＡ発色団を有するプライマーのポリメラーゼ伸長により、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する候補混合物を調製し、精製した。
[00323] Ｂ．標的タンパク質の調製
[00324] 実施例２で記述したように、ヒトトロンビンをビオチンでタグ化した。
[00325] Ｃ．遅いオフ速度の濃縮および光架橋を用いたアプタマー選択
[00326] 実施例３で記述したように、標的としてビオチン化されたヒトトロンビンを用いてアプタマー選択を行った。
[00327] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00328] 実施例３で記述したように、増幅および精製を行った。
[00329] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00330] 実施例３で記述したように選択のストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00331] Ｆ．アプタマーの特性
[00332] 図１５に示したように、修飾されたＢｎｄＵを含むこの選択からのアプタマー２３３６−１７の平衡結合定数（Ｋｄ）は、４．４×１０−１１Ｍ（実施例１で記述したプロトコルに従って測定した）であった。
[00333] 当技術において、ヒトトロンビンに対する一本鎖ＤＮＡアプタマーが天然のｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴヌクレオチドで構成されるライブラリーから選択された（Bock, et al.,“ヒトトロンビンに結合して阻害する一本鎖ＤＮＡ分子の選択”Nature (1992) 355:564-566）。そのアプタマーの結合親和性は、２．５．×１０−８Ｍから２．０．×１０−７Ｍまでの範囲のＫｄ値を有していた。天然ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、および修飾された５−（１−ペンチニル）−ｄＵＴＰで構成されるライブラリーを用いた類似のプロトコルを用いて、４．×１０−７Ｍから１．×１０−６Ｍまでの範囲のＫｄ値を有するアプタマーが選択された（Latham, et al.,“アプタマー選択における修飾されたヌクレオチドの適用：５−（１−ペンチニル）−２’−デオキシウリジンを含有する新規のトロンビンアプタマー”Nucleic Acid Research (1994) 22(14): 2817-2822）。
[00334] いくつかの特許、特許出願刊行物、および科学的刊行物を記述全体にわたって引用し、および／または記述の最後で列挙する。これらのそれぞれを本明細書にそのまま援用する。同様に、援用される刊行物中で言及されている全ての刊行物をそのまま援用する。
[00335] 引用される刊行物における例およびそれと関連する制限は説明的なものであり、排他的では無いことを意図する。引用される刊行物の他の制限は、明細書を読み、図面を検討すれば当業者に明らかになるであろう。
実施例９．Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ−２）に対する高親和性ＢｎｄＵアプタマーの生成および組織学的適用
[00336] Ａ．候補混合物の調製
[00337] 実施例５で記述したように、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する候補混合物を調製し、精製した。
[00338] Ｂ．標的タンパク質の固定化
[00339] ＨＥＲ２の細胞外ドメインのＨｉｓタグ化Ｆｃ融合物をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得て、実施例１で記述したようにＴａｌｏｎビーズで捕捉した。
[00340] Ｃ．遅いオフ速度の濃縮を用いたアプタマー選択
[00341] 実施例５で記述したように、アプタマー選択を行った。
[00342] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00343] 実施例５で記述したように、増幅および精製を行った。
[00344] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00345] 実施例５で記述したように、選択のストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00346] Ｆ．アプタマーの特性
[00347] 修飾されたＢｎｄＵを用いたこの選択からのアプタマー２６１６−２４の平衡結合定数（Ｋｄ）は、１．５×１０−８Ｍであった。
[00348] ＨＥＲ２アプタマーを、図１６に示したように、ビオチンおよびＣｙ３を含む５’修飾を含めて合成し、ＨＥＲ２タンパク質を染色するそれの能力に関して凍結乳癌組織切片において試験した。非同一化された（Ｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）組織試料を、外科的切除および検死解剖標本から得た。組織を外科的切除したらすぐにＯＣＴ媒体中で凍結させ、薄切するまで−７０℃で保管した。病院の病理学のスタッフがＨＥＲ２の状態の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を標準的な方法論を用いて実施し、標本の非同一化の前に患者の医学的記録から結果を得た。５μｍ凍結組織切片をクライオスタット中で切り、すぐに荷電したスライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ ｐｌｕｓ）上に置き、次いでそのスライドを固定溶液（１００％エタノールまたはアセトン）中に少なくとも１時間浸した。脱イオン水中で２分間すすぎ、続いてＳＢ１８緩衝液（４０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５２ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中で５分間すすぐことにより、ＯＣＴ媒体をスライドから除去した。１ｍＭデキストラン硫酸（ＤＳ）を含む、または含まないＳＢ１８緩衝液中で作製した１０〜１０００ｎＭのアプタマー溶液を、すすいだ切片に様々な時間の間適用し、次いでＳＢ１８＋／−デキストラン硫酸（ＤＳ）で５分間洗浄した。Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｉｇｈｔ ＤＳ−Ｒｉ１カメラ、水銀ランプ照明源、ならびにＤＡＰＩまたはＣｙ３画像化に適したニュートラルデンシティーおよび光学フィルターを備えたＮｉｋｏｎ ８０ｉ正立型顕微鏡を用いて蛍光画像を得た。速い核のアプタマー解離を５Ｈｚで画像化した。時間経過の実験に関して、観察された期間にわたって光退色が蛍光減衰の有意な源では無いことを確証するため、試薬の添加無しで試験を行った。
[00349] １ｍＭ ＤＳの存在下で、そのＨＥＲ２アプタマーは、免疫組織化学（ＩＨＣ）により３＋ＨＥＲ２発現を有するものとして分類されている凍結された乳房腫瘍において、予想される形態学的パターンで細胞膜に結合するが（図１７Ａ、Ｂ）、それはＩＨＣにより０／陰性として分類された乳房腫瘍または乳房ではない陰性対照の組織には結合しない（図１７Ｃ）。ＤＳの非存在下では、そのＨＥＲ２アプタマーは、それが適用されたあらゆる組織において核、細胞質、および間質に結合し、ＩＨＣでＨＥＲ２ ３＋である乳癌組織において有意な膜への局在が無い（図１８Ａ）。ＩＨＣでＨＥＲ２ ３＋である乳癌組織に対するＨＥＲ２アプタマーのみの適用、ならびにそれに続く緩衝液での洗浄およびＤＳとの３０分間の保温（図１８Ｂ）は、ＤＳがそのアプタマーと一緒に適用された際に観察された染色パターンを再現し、これはその非特異的な結合が可逆的であることを示している。同じ塩基組成を有するがランダムな配列を有するスクランブルされたオリゴヌクレオチドは乳癌組織において核への結合のみを示し、それはＤＳで部分的にしか妨げることができず、部分的にしか逆行させることができない（示していない）。
[00350] 凍結組織における特異的ＨＥＲ２アプタマー結合の会合速度論は極めて速く、１００ｎＭで適用された場合（図１９Ａ〜Ｃ）５分未満で、１μＭで適用された場合（図１９Ｄ）１分未満でその標的を飽和する。その染色の速度および単純性は、術中設定における診断的適合性を伴ってタンパク質を標的化する迅速なアッセイはセンチネルリンパ
節における潜在性転移癌の同定を助けることができるであろうことを示している。
[00351] 組織中での結合の速度論を、ＤＳの非存在下でＨＥＲ２＋乳癌凍結切片に蛍光ＨＥＲ２アプタマーを充満させ（ｌｏａｄｉｎｇ）（図１８Ａにおいて見られるような染色パターンを生じる）、緩衝液のみの中で洗浄し、次いでアプタマーの非存在下で１ｍＭ ＤＳを添加することにより評価した。これらの条件の下で、非特異的な核の染色のほとんどが数秒の内に失われ（図２０Ａ）；小さな割合（全体の１０％未満）の残存する核の蛍光は３０〜６０分間かけてよりゆっくりと減衰し、これはその非特異的な結合が少なくとも２種類の区画で起こっていることを示している。
[00352] 第２の実験において、ＨＥＲ２＋乳癌凍結切片をＤＳの存在下で蛍光ＨＥＲ２アプタマーと共に保温し（図１７Ａにおいて見られるような染色パターンを生じる）、緩衝液のみの中で洗浄し、次いで１ｍＭ ＤＳ＋１００ｎＭ非蛍光ＨＥＲ２アプタマーを添加した。特異的な膜の染色は、過剰な非蛍光アプタマーが解離した蛍光アプタマーに置き換わるにつれて、３０〜４５分間かけて失われた（図２０Ｂ）。膜におけるアプタマーのそれの標的からの解離速度は、核における非特異的結合部位からの解離速度よりも約１００倍遅かった。この実験および前の実験の両方において、組織の自己蛍光が、測定されるシグナルがゼロまで減衰するのを妨げた。
実施例１０．上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−１）に対する高親和性ＢｎｄＵアプタマーの生成および組織学的適用
[00353] Ａ．候補混合物の調製
[00354] 実施例５で記述したように、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する候補混合物を調製し、精製した。
[00355] Ｂ．標的タンパク質の固定化
[00356] ＥＧＦＲのＦｃ融合物を、実施例２で記述したようにビオチンでタグ化し、ストレプトアビジンビーズで捕捉した。
[00357] Ｃ．遅いオフ速度の濃縮を用いたアプタマー選択
[00358] 実施例５で記述したように、アプタマー選択を行った。
[00359] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00360] 実施例５で記述したように、増幅および精製を行った。
[00361] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00362] 実施例５で記述したように、選択のストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00363] Ｆ．アプタマーの特性
[00364] アプタマー３１３８−４９のその標的タンパク質に対する平衡結合定数（Ｋｄ）は１．３．×１０−９Ｍであり、アプタマー３１５９−１のＫｄは１．４×１０−１０Ｍであった。
[00365] ＥＧＦＲアプタマーを、図１６に示したようにビオチンおよびＣｙ３を含む５’修飾を含めて合成し、凍結されたヒトの皮膚組織切片においてＥＧＦＲタンパク質を染色するそれの能力に関して試験した。組織の調製および染色は、乳癌組織の代わりに凍結された皮膚組織を用いたこと以外は実施例９で記述した通りであった。ＥＧＦＲに対するアプタマーはＨＥＲ２アプタマーと類似して振る舞い、ＤＳの非存在下で適用された場合には凍結された正常ヒト上皮において核に結合する（示していない）が、ＤＳと一緒に
保温した（図２１）、または後でＤＳを用いて保温した（示していない）場合は、予想された主に基底上皮の膜のパターンで結合する。Ｃｙ３標識アプタマーを用いたＥＧＦＲの直接蛍光検出（図２１ＡおよびＢ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼを用いた比色検出（図２１Ｃ）の両方を示した。ＥＧＦＲアプタマーは、ＥＧＦＲ発現を欠いていることが既知である様々な組織では染色を示さなかった（示していない）。
実施例１１．前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に対する高親和性ＢｎｄＵアプタマーの生成および組織学的適用
[00366] Ａ．候補混合物の調製
[00367] 実施例５で記述したように、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＢｎｄＵＴＰを含有する候補混合物を調製し、精製した。
[00368] Ｂ．標的タンパク質の固定化
[00369] 精液から精製された天然のＰＳＡを、実施例２で記述したようにビオチンでタグ化し、ストレプトアビジンビーズで捕捉した。
[00370] Ｃ．遅いオフ速度の濃縮を用いたアプタマー選択
[00371] 実施例５で記述したように、アプタマー選択を行った。
[00372] Ｄ．アプタマーの増幅および精製
[00373] 実施例５で記述したように、増幅および精製を行った。
[00374] Ｅ．選択のストリンジェンシーおよびフィードバック
[00375] 実施例５で記述したように、選択のストリンジェンシーおよびフィードバックを行った。
[00376] Ｆ．アプタマーの特性
[00377] ＰＳＡアプタマーのその標的タンパク質に対する平衡結合定数（Ｋｄ）は１．×１０−９Ｍであった。
[00378] ＰＳＡアプタマーを、図１６に示したようにビオチンおよびＣｙ３を含む５’修飾を含めて合成した。アプタマー−Ｑｄｏｔ ６０５ストレプトアビジンを、ＨＢＳ−Ｔ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液中で２０ｎＭの最終的なアプタマーの濃度でコンジュゲートさせ、アプタマー−ナノ粒子標識比率は４０：１であった。その混合物を、６５０ｒｐｍで振とうしながら２２℃で６０分間保温した。Ｑｄｏｔ複合体に対して２００μｇ／ｍｌのｄ−ビオチンを用いて反応を停止させた（２０〜３０分間）。過剰なビオチンを限外濾過により除去した。凍結された前立腺組織のアプタマー染色を、正に荷電したガラススライド上の、凍結薄切されたＯＣＴ包理された凍結組織の厚さ５μｍの切片に対して行った。その薄切された組織スライドを使用までアセトン（あるいは無水エタノール）中で４℃で保管し、組織を空気乾燥させないように注意した。その組織切片スライドをＤＩ水中で数分間すすいでＯＣＴ包理媒体を除去した。ペーパータオルを用いて切片の周囲を乾燥させ、次いでスライドアッセイの体積を最小限にするためにＶｅｃｔｏｒＬａｂ ＩｍｍＥｄｇｅ疎水性バリアペンを用いてその組織切片の周りに境界線を引いた。アプタマー−Ｑｄｏｔ ６０５コンジュゲート（２０ｎＭアプタマー−Ｑｄｏｔ、１ｍＭデキストラン硫酸）をスライド上の組織切片に６０分間直接添加した。次いでそのスライドを、アプタマー染色溶液を吸い取った後それぞれのスライドをＨＢＳ−Ｔ中に２分間手短に浸すことにより、連続的に洗浄した。染色されたスライドを、１０ｍＭ
Ｍｇ２＋および１５ｍＭ 没食子酸ｎ−プロピル退色防止試薬を補ったＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇと共にカバーガラスで覆った。比較対象（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として、
前立腺組織の免疫蛍光法（ＩＦ）を、ＰＳＡ特異的蛍光抗体を用いて行った（図２２Ａ）。Ｑｄｏｔ−コンジュゲートＰＳＡアプタマーを用いた染色（図２２Ｂ、Ｃ）は、ＩＨＣを用いて見られた染色パターンと比較可能な染色パターンを与えた。染色は細胞質ゾル性であり（図２２Ｄ、Ｅ）、予想されるＰＳＡの細胞内局在と一致していた。
[00379] 単語“含む”（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”、および“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）は、排他的にではなく包括的に解釈されるべきである。

Claims (13)

  1. 組織試料における１以上の可能性のある標的を検出するために、組織試料の細胞学的または組織学的評価をするための方法であって、以下の工程：
    ａ）組織試料から調製された第１の組織切片を、標的に対するアプタマーを含む溶液と接触させ；
    ｂ）第１の組織切片とアプタマーを含む溶液とを少なくとも１５分インキュベートして、アプタマー−標的複合体を形成させ；
    ｃ）（ｉ）未結合のアプタマーと非特異的複合体を形成することができる競合剤分子を添加する、（ｉｉ）希釈剤を添加する、および（ｉｉｉ）未結合のアプタマーと非特異的複合体を形成することができる競合剤分子を添加し、かつ希釈剤を添加する、から選択される速度論的負荷を適用し；
    ｄ）アプタマーを標的の存否を示すものとして検出する
    ことを含み、
    ここで標的は細胞膜中にあり；そして
    アプタマーは、５位ピリミジン修飾を含み、
    ５位修飾ピリミジンが以下の構造をもつピリミジンの群から選択され；
    またはベンジルカルボキシアミド、ナフチルメチルカルボキシアミド、トリプタミノカルボキシアミドおよびイソブチルカルボキシアミドから選ばれる置換基によるＣ−５位におけるデオキシウリジンの置換を含む、
    前記方法。
  2. 得られた組織試料を複数の組織切片に分ける工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
  3. ５位ピリミジン修飾が、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−(Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、または５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンから選択される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
  4. 工程ｃ）で得られた結果を、第２の組織切片を前記のアプタマーを欠いた工程ｃ）におけるような溶液と反応させることにより調製された陰性対照と比較することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 速度論的負荷が、未結合のアプタマーと非特異的複合体を形成することができる競合剤分子を添加することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 競合剤分子が、ポリアニオン、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、デキストラン硫酸、ポリデキストラン、脱塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、ピロホスフェート、ポリカチオン、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、ポリアルギニン、アミノ酸、アルギニン、リジンまたはその組み合わせを含む、請求項５記載の方法。
  7. 速度論的負荷がアプタマーの希釈を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 希釈度が２×、３×、４×、５×、またはより大きい希釈度である、請求項７記載の方法。
  9. 速度論的負荷が競合剤分子の添加とアプタマーの希釈を含み、希釈と競合剤分子の導入が同時に起こる、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 標的分子が特定の疾患状態を示す、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 標的分子が腫瘍のタイプおよび起源を示す、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. アプタマーが検出可能部分を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 以下の工程：
    ｉ）試料切片を固定することによって組織切片を調製する；
    ｉｉ）固定された組織切片を脱水する；
    ｉｉｉ）脱水された組織切片を透徹（ｃｌｅａｒｉｎｇ）する；
    ｉｖ）透徹された組織切片を顕微鏡スライド上で固定化する；
    ｖ）固定化された組織切片を洗浄する；そして
    ｖｉ）洗浄された組織切片をブロッキングする、
    を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
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