TWI465566B - 具專一性核適體之製備方法及套組 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種核適體之製備方法及套組。
核適體(Aptamer)，又名核酸適體，是一種單股寡核苷酸物質，其可折疊形成特殊三級結構並可辨認特殊蛋白質，有潛力開發為臨床檢測試劑或是標靶藥物。核適體可由受體系統演化指數放大法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)方法製備而得。第一個SELEX方法是由Tuerk及Gold於1990年提出，隨著時間的演進SELEX方法也不斷的被修正及改良，改良的方向分為兩種，第一種是篩選平台：如Cox與Ellington於2001年發表的自動核適體篩選儀器、Hybarger等人於2006年發表的核適體篩選微流體晶片等；第二種為篩選方法：如Tasset等人於1997發表，使用光誘導共價鍵結方式找出具親和力之核適體、Tam等人於2007年發表使用不同正常或病人的細胞株來篩選可專一結合癌細胞的核適體及Chang等人於2009年發表結合免疫沉澱法與SELEX方法篩選出可辨認細胞膜上特定蛋白質的核適體等。但目前核適體篩選技術尚未能有效獲得專一辨識特定結合位之核適體，亦無法確保獲得具功能性之核適體(Yang,Li and Gorenstein,Expert Opin Drug Discov.,2011,6,75-87)。就臨床應用而言，不論是檢測試劑或標靶治療藥物都需具有專一辨識致病抗原並與其緊密結合的特性，目前SELEX方法篩選出的核適體仍無法應用到臨床治療上，因此更有效篩選高專一性及結合力的核適體的SELEX方法仍有待開發當
中。
本發明係關於一種具專一性核適體(Aptamer)之製備方法100
(圖式1)，稱為特定結合位核適體篩選法(Epitope-specific Systematic Evolution of ligands by Exponential Enrichment，簡稱EX-SELEX)，其包含以下步驟：(a)提供一單股DNA群組112
；(b)將該單股DNA群組112
與一標的蛋白質111
混合，使用至少一次蛋白質專一性篩選法110
得到一核適體群組119
；及(c)將該核適體群組119
使用至少一次結合位專一性篩選法120
得到一具專一性核適體129
。
其中該蛋白質專一性篩選法110
步驟與一般SELEX篩選法類似，如圖式1A所示，包含以下步驟：(1)將該單股DNA群組112
與一標的蛋白質111
混合使兩者結合；(2)將單股DNA群組/標的蛋白質複合物113
換置入一純化管柱114
；(3)該純化管柱透過與標的蛋白質結合來固定標的蛋白質單股DNA群組/複合物113
；(4)使用一篩選緩衝液洗滌純化管柱/單股DNA群組/標的蛋白質複合物115
，去除未結合或未完全結合該標的蛋白質之單股DNA116
；(5)將經過洗滌的純化管柱複合物117
以一洗析緩衝溶液進行洗析，並收集可與標的蛋白結合之單股DNA118
；(6)以聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大上述單股DNA118
含量；及
(7)純化該PCR產物得到一核適體群組119
。
其中該結合位專一性篩選法包含以下步驟，如圖1B所示：(I)將該核適體群組119
與該標的蛋白質111
混合使兩者結合，並將核適體/標的蛋白質複合物121
換置入一純化管柱114
；(II)以該篩選緩衝液洗滌步驟(I)混合物122
，去除未結合或未完全結合該標的蛋白質之核適體123
；(III)以蛋白質競爭法去除步驟(II)混合物124
中對標的蛋白質不具專一性之核適體127
；(IV)將步驟(III)混合物126
以該洗析緩衝溶液進行洗析得到一具專一性之核適體128
，並以PCR增加該核適體數量；及(V)純化步驟(IV)之核適體或進一步將純化後的步驟(V)核適體重覆執行(I)~(V)步驟得到一具專一性核適體129
。
上述結合位專一性篩選法，其中該蛋白質競爭法包含以下步驟：(i)混合一非標的蛋白質125
與結合位專一性篩選法中步驟(II)124
混合物，該非標的蛋白質125
與該標的蛋白質111
結合，並使該不具專一性核適體127
與標的蛋白質脫離；及(ii)以該篩選緩衝液洗滌步驟(i)混合物126
，去除該不具專一性之核適體127
。
本發明EX-SELEX中蛋白質專一性篩選法與結合位專一性篩選法重複循環次數可根據對於核適體辨識標的蛋白質的專一性或結合能力的要求更動，重複次數越多，得到的核適體專一性或結合能力越佳。
在本發明之一具體實施例，該結合位專一性篩選法洗析步驟(步驟IV)
中洗析緩衝液可進一步替換為一系列濃度梯度之非標的蛋白質溶液，以進行數次洗析步驟並收集得到核適體，其中該非標的蛋白質溶液的濃度隨著洗析次數增加，而非標的蛋白質溶液濃度梯度或洗析步驟的次數可根據對於核適體辨認標的蛋白質的專一性或結合能力的要求更動，濃度梯度越高或洗析次數越多，得到的核適體專一性或結合能力越佳。
在本發明之一具體實施例，為減少ES-SELEX步驟中單股DNA或核適體與純化管柱結合而影響得到之核適體含量，蛋白質專一性篩選法與結合位專一性篩選法可進一步加入一反向篩選方法，其包括以下步驟：將蛋白質專一性篩選法與結合位專一性篩選法中洗滌步驟排除之單股DNA(圖式1116
或123
)進一步與該標的蛋白質111
混合培養，再換置入純化管柱重複洗滌步驟。
在本發明之一具體實施例，為減少ES-SELEX蛋白質競爭步驟中單股DNA或核適體與非標的蛋白質結合而影響得到之核適體含量，或為了排除可辨認其他干擾物質之核適體，蛋白質競爭法可進一步加入一第二反向篩選步驟，如下：經過蛋白質競爭法洗滌步驟排除之核適體127
，進一步與非標的蛋白質或其他干擾物質培養，再使用一分離管柱去除結合非標的蛋白質或其他干擾物質之核適體，收集可通過分離管柱之之核適體並將其進行後續PCR增量反應及單股DNA純化步驟。
本發明另提供一種製備具專一性核適體之套組，其包含：(A)一單股DNA群組，用以與至少一蛋白質結合；(B)一標的蛋白質，用以混合該單股DNA群組，其用於初步篩選一核適體群組及/或得到該核適體群組與該標的蛋白質結合之混合
物；及(C)一非標的蛋白質，用以混合該核適體群組與該標的蛋白質結合之混合物，以去除不具專一性之核適體得到該具專一性核適體。
在本發明之一具體實施例中，該套組可進一步包含一聚合酶鍊鎖反應套組，用以增加該具專一性或不具專一性之核適體數量。
在本發明之一具體實施例，其中該標的蛋白質包含然不限於一人類流感血液凝集素(Human influenza hemagglutinin)，其中該非標的蛋白質包含然不限於一胎球蛋白(Fetuin)，其中該其他干擾物質包含然不限於人類血清白蛋白(HSA)。
在本發明之一具體實施例，其中使用ES-SELEX得到之該具專一性核適體可進一步包含一醫藥上可接受之載劑。
本發明更提供一種人類流感血液凝集素核適體，其序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。
以下實施方是僅為本發明專一性核適體篩選方法實施態樣的示範，本發明專一性核適體篩選方法不限於篩選實施方式使用之標的蛋白，且循環次數也不限於實施方式使用的次數。
核適體序列群組及其他血球凝集素(HA)核適體委託台灣百力生物科技股份有限公司進行合成，再使用7M尿素變性聚丙烯醯胺膠純化並確認DNA序列，核適體序列群組含有30個隨機排列核苷酸的區域，其GC含量為48.5%，而該區域的前後以兩段16個合苷酸引子連接，總序列長度約為62個核苷酸，如下所示：5’-TCC CTA CGG CGC TAAC-(N)30
-GCC ACC GTG CTA CAAC-3’(SEQ ID No.6)
該核適體序列群組以不含DNA水解酶之去離子水回溶至濃度為100 μM，本發明EX-SELEX實驗使用之核適體含量為1015
個分子之單股DNA，並於使用前先分裝好實驗用量儲存於-30℃。本發明所使用的單股DNA序列請見下表。
本實例選用Abcam Plc.公司之重組之人類流感H1N1病毒(病毒株：A/New Caledonia/20/99)血球凝集素次單元1(Hemagglutinin subunit 1，以下簡稱HA1)，將HA1(除了單胜肽區域：胺基酸1-17)之C端與6-組氨酸標記接合，並以293細胞合成上述融合HA1蛋白質。純化出的HA1蛋白質以SDS-PAGE及西方墨點法確認，其純度達95%。
本實例以血球凝集素作為標的蛋白範例，另外因胎球蛋白(Fetuin)被發現對於A型及B型人類流感病毒血球凝集素具有親和性，故本實例選擇使用胎球蛋白作為非標的蛋白，並使用本發明之專一性核適體篩選方法篩選出可拮抗血球凝集素之核適體。本實例總共使用九個循環之核適體篩選方法，其中1~6循環為蛋白質專一性篩選方法，用以初步得到可辨識HA1蛋白質之核適體；6~9循環為結合位專一性篩選方法，以胎球蛋白(Fetuin)作為非標的蛋白，利用蛋白質競爭法來去除對HA1不具專一性的核適體，以得到可拮抗血球凝集素之核適體，如圖式1。
在每一個篩選方法開始前，單股DNA需進行量化及預先折疊的步驟，單股DNA的濃度量化步驟為：第一，將單股DNA樣品與標準品以篩選緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.5、100 mM NaCl、4 mM KCl、2.5 mM MgCl2
及1 mM CaCl2
)200倍稀釋；第二，將稀釋過的單股DNA樣品及標準品加入1X Invitrogen Oligreen®
染劑於室溫下染色5分鐘；第三，使用Invitrogen
Qubit®
螢光偵測儀偵測單股DNA標準品並用其數據來推估單股DNA樣品的濃度，每次進行篩選方法使用的單股DNA分子數量應超過1012
。
預先折疊步驟可幫助單股DNA折疊成三級結構，先將單股DNA分子以95℃處理2分鐘使其變性，並使用聚合酶鍊鎖反應(PCR)儀器以0.1℃/秒速率逐漸冷卻至25℃後，立即以該單股DNA分子進行核適體篩選步驟。
本實例第1~5循環之蛋白質專一性篩選方法包含標的蛋白/單股DNA結合、洗滌去除未結合之DNA及洗析步驟。
將1 mg HA1蛋白質與單股DNA分子與篩選緩衝液於25℃培養30分鐘。將上述混合物換置到Sigma His-Select®
離心管柱(Ni-NTA標記管柱)，該蛋白質/單股DNA複合物可被該Ni-NTA標記管柱吸附，使用2900 rpm離心2分鐘將管柱中之液體排除，未結合之單股DNA分子會隨著該液體排出管柱。
洗滌步驟是為了去除未結合或低結合力之單股DNA分子，加入600 μl篩選緩衝液到上步驟Ni-NTA標記管柱中並以2900 rpm離心2分鐘。洗滌步驟在SELEX方法之第1~3循環中重複2次，而在第4~6循環中重複3次。
核適體群組可使用咪唑競爭法洗析而得。洗析步驟重複兩次以50 μl洗析緩衝液(篩選緩衝液含500 mM咪唑)加入Ni-NTA標記管柱與其中蛋白質/單股DNA複合物混合，並以2900 rpm離心2分鐘得到洗析出該單股DNA
得到洗析產物。
因咪唑類似物會抑制PCR酵素活性，因此為了執行接下來的PCR反應，需去除洗析產物中的洗析緩衝液。將800 μl篩選緩衝液注入一膠體過濾管柱室溫下靜置30分鐘後，以3000 rpm離心2分鐘去除管柱中溶液，並加入100 μl洗析產物到管柱中即可完成緩衝液換置得到核適體群組。
為了得到具高親合力之核適體第6~9循環採用結合位專一性篩選法，基本上結合位專一性篩選與蛋白質專一性篩選皆含標的蛋白質/受體結合及洗滌步驟。將白質專一性篩選法得到之核適體群組執上述步驟並將洗滌步驟增加至6次，洗滌完成後再加入以篩選溶液配製之20.6 μM Fetuin進行蛋白質競爭，Fetuin與HA1唾液酸結合位結合，而專一性較低的核適體會因Fetuin競爭該結合位而脫離HA1蛋白質，因此以1600 rpm離心2分鐘即可去除脫離HA1蛋白質之核適體，接著以洗析步驟得到具專一性之核適體，並使用YM-10管柱收集及濃縮上述核適體。在本篩選法的最後一個循環，洗析步驟改以五次增加濃度梯度之Fetuin溶液(33、165、824、4120及20600 nM)將核適體洗析而出，收集並以qPCR量化五次析出液體中的核適體。
本實例使用兩種反向篩選法去除辨認Ni-NTA標記管柱及非標的蛋白質(Fetuin及人類血清白蛋白HSA)之單股DNA。
在本實例第3、8及9循環，在單股DNA分子加入Ni-NTA標記管柱以2900 rpm離心2分鐘後，收集未結合的單股DNA分子並將其重新與HA1
溶液混合培養，執行上述標的蛋白質/受體結合步驟。
將第7循環執行蛋白質競爭法後洗析的產物加入Fetuin(48.5 kD)及HSA(66 kD)各100 μg混合培養30分鐘，並使用50 kD分子量截除管柱(MWCO)分離與Fetuin、HAS結合之單股DNA及未結合之單股DNA，收集可通過50 kD-MWCO管柱的溶液(含有未結合單股DNA分子)，並以其進行後續DNA增量及單股DNA純化步驟。
進一步使用qPCR量化及使用PCR增量蛋白質專一性篩選法或結合位專一性篩選法的洗析產物中之單股DNA。
每循環產生之洗析產物都需以qPCR量化單股DNA含量。首先配置qPCR反應混合物(25 μl)，其含有1×SYBR Green Master mix®
、200 nM引子對(R9F及R9R)及以200倍稀釋之單股DNA。上述混合物以95℃加熱10分中活化Taq聚合酶並執行35次熱循環處理(95℃ 15秒及60℃ 1分鐘)。
除了使用qPCR量化外，每循環產生之洗析產物也進一步使用R9F及含生物素之R9R引子以PCR增量單股DNA含量。PCR反應混合物含有0.2 μM R9F及含生物素之R9R引子、50 mM Tris-HCl,pH9.1、16 mM(NH4
)2
SO4
、10 mM三甲基甘氨酸、1% DMSO、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各200 mM、3.5 mM MgCl2
、150 μg/ml BSA、2 U KlenTaq
DNA聚合
酶及5 μl洗析獲得之單股DNA。由qPCR量化結果決定PCR熱循環次數，將上述混合物以95℃ 30秒、60℃ 30℃秒及72℃ 20秒之熱循環增加單股DNA含量，並使用3%瓊脂膠片以電泳確認PCR增量產物。
將Streptavidin包覆之磁珠以10×生理食鹽水-檸檬酸納(SSC)緩衝液洗滌10分鐘後，將其與PCR增量產物混合於10×SSC緩衝液中緩慢搖晃處理1小時。PCR增量之雙股DNA會與磁珠上的Streptavidin結合，以10×SSC緩衝液洗滌兩次後，加入100 mM NaOH使雙股DNA分開成為單股，正向單股DNA可以利用磁珠將其分離出來，並以膠體過濾管柱純化該正向單股DNA。
在最後循環第五次洗析產物純化出的單股DNA即是核適體群組，使用T4 DNA接合酶將核適體群組嵌入pGEM-T載體，並將該載體轉型到勝任細胞中(E.coli
DH5α)進行培養。本實例收集了96個菌落，進一步使用T7及SP6引子以PCR確認載體中是否帶有核適體序列後，將核酸內切酶及蝦鹼性磷酸酶與PCR產物混合於37℃培養80分鐘以去除PCR產物中的引子及dNTP，並委託中央研究院生物醫學研究所進行核適體核酸定序得到96個核適體序列(SEQ ID NO.1~5及10~100)。
本實例進一步分析血球凝集素核適體之結合能力、功能及結構資訊。
將核適體群組序列稀釋(從97.7 pM到50 nM)並與HA1蛋白質(150 nM)混合培養30分鐘後，將核適體/HA1蛋白質複合物注入30 kDa-MWCO管柱，以7000 rpm離心並使用篩選緩衝液洗滌管柱5次，收集並使用qPCR量化留在管柱中之核適體，記錄所有核適體樣本在qPCR第20次循環的SYBR Green訊號，以下列公式計算解離常數(KD
)
Bmax代表結合訊號強度之最大值、Y代表訊號及X代表濃度。
將SPR晶片以11-巰基十一酸(11-HUA)溶液(0.225 mg/ml於酒精中)浸置隔夜，使HUA可主動於晶片表面形成一單層包覆。使用碳二醯亞胺化學方法將HA1蛋白質固定於HUA包覆之晶片上：首先以1-乙基-3(3二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺(EDC，400 mM)及氮-羫丁二醯亞胺(NHS，100mM)活化HUA包覆之晶片300秒；第二，將晶片浸入HA1蛋白質溶液(1 μM配置於10 mM醋酸鈉緩衝液pH6)900秒，HA1蛋白質會與EDC交聯固定於晶片上；最後再使用1M乙醇胺覆蓋晶片表面600秒。
本實例選擇其中5個核適體(CP9P526，SEQ ID No.1、CP9P528，SEQ ID No.2、CP9P536，SEQ ID No.4、CP9P554，SEQ ID No.3及CP9P596，SEQ ID No.5)，將上述核適體配置成200 nM濃度並與HA1-HUA-SPR晶片共同
培養900秒，接著使用上述晶片監控核適體於篩選溶液中的解離情形300秒及核適體於10 mM NaOH中的復原情形120秒，並使用Langmuir 1：1模式測量各個核適體之解離常數。
本實例使用之血球凝集素抑制能力測試流程是根據Spackman 2008年發表之WHO標準流程稍做修改，本實例使用人類O型紅血球，以0.1 M PBS緩衝液短暫洗滌、以2000 rpm離心10分鐘三次後收集沉澱的紅血球，並將其稀釋到濃度為0.75%。
全長的HA蛋白質樣品(配製於4 HAU活化溶液)與2 μM核適體(CP9P526、CP9P528、CP9P536、CP9P554及CP9P596)共同培養於0.1 M PBS緩衝液30分鐘，然後換置該HA/核適體複合物(50 μl)到一U型微盤中加入50 μl的0.5%紅血球培養1小時，以目測觀測核適體抑制血球凝集素能力。
以一光徑為0.1 cm石英管使用圓二色光譜儀測量圓二色光譜，以350~210 nm波長偵測濃度為10 μM核適體樣本三次，將所得之數值取平均值並減去背景值得到該CD光譜。
血球凝集素核適體的結合位可利用微晶片來辨識，單鹼基位移實驗設計
通常用來解旋全長核適體序列訊息。使用上述方法將全長核適體分成25~40個鹼基長度(核示體探針)，每個核適體探針於3’端皆含有20個寡去氧腺嘌呤核苷酸區域，使用Agilent 2×105k客製化微晶片以原位合成法複製所有核適體探針，步驟為：使用胎牛血清白蛋白(BSA)溶液(0.1 mg/ml BSA、0.1% SDS配製於5X SSC緩衝液中)42℃浸覆含有核適體探針之微晶片1小時候，使用稀釋的Coming Prunto溶液室溫下洗滌微晶片3次，將微晶片浸泡於篩選緩衝液中並輕微搖晃30分鐘。上述步驟完成後，將微晶片與Cy3標定之血球凝集素或病毒抗原(總量2 μg配製成染劑：蛋白質=3：1之比例)於室溫下培養隔夜，接著使用篩選緩衝液(含有0.05% tween-20)洗滌微晶片3次，並使用微晶片掃描儀進行掃描(光電倍增管(PMT)設定為650V)。
在蛋白質專一性篩選法第1~5循環，以單股DNA與做為控制組、以與HA1共同培養之單股DNA做為實驗組，將上述兩組樣品個別換置到Ni-NTA管柱中執行蛋白質專一性篩選步驟，將PCR產物使用3%瓊脂膠片觀察DNA含量(圖式2A)並使用qPCR量化PCR產物(圖式2 B)，實驗結果發現在篩選初期有非專一性單股DNA與Ni-NTA管柱結合的現象，由圖式1B循環1可觀察到控制組得到之單股DNA分子含量為實驗組的4倍，該現象是由於單股DNA與管柱間靜電反應而產生的非專一性產物。為此，在第2循環中本實例加入反向篩選法來去除上述產物，因此第3循環觀察到控制組的非專一性DNA含量減少且實驗組中與HA1結合之單股DNA增加(圖式2 A)。另外，由圖式2 B可看到實驗組核適體產出效率為2.99%，是
控制組的32倍，證實了蛋白質專一性篩選法可篩選出且明顯增加與HA1結合之單股DNA的含量。
在核適體篩選第6~9循環採用結合位專一性篩選法來增進核適體抑制HA凝血功能之專一性。由於Fetuin是人體本身含有的HA拮抗劑，因此本發明選用Fetuin以飽和濃度(~20.6 μM配製於篩選緩衝液)與核適體競爭HA唾液酸結合位並去除不具專一性核適體得到具有高度專一性之核適體。使用3%瓊脂膠片來觀察第6~9循環PCR產物的DNA含量(圖式3)，可發現第8循環在經過Fetuin競爭後只有超過25%的單股DNA分子被析出，代表大部份之抗HA核適體皆辨識HA的唾液酸結合位。另外，由圖式3可觀察到第6~8循環產出的核適體含量增加，而在第8循環後有66.5%之抗HA核適體會被Fetuin析出，且實驗組之洗析效率比起控制組約高出512倍。
但蛋白質競爭步驟中，若核適體與Fetuin結合也會造成核適體被析出情形，因此在第7循環結束，本實例加入反向篩選步驟來改善上述情形。另外為了增進核適體未來應用到臨床治療的潛力，本實例也針對人體含量最多的干擾蛋白：人類血清白蛋白(HAS)進行反向篩選以去除辨認Fetuin及HSA之單股DNA。在第9循環中以五次梯度濃度之Fetuin洗析個別得到之核適體分別帶有不同的HA1結合能力，圖式4A及B顯示第9循環實驗組及控制組的PCR及qPCR量化結果，第4次洗析產物是以4.12 μM Fetuin進行洗析而得，核適體分子約為篩選前核適體分子的22.7%，KD
值為8 μM
界於Fetuin與HA1之間(圖式5)。第5次洗析得到的核適體分子約為篩選前核適體分子的17.8%，實驗組比控制組產物高出72.1倍。因核適體結抗能力會隨著梯度洗析次數增加，因此本實例選擇第9循環之第5次洗析產物(簡稱CP9P5)中96個核適體進行定序及後續測試。
圖式6顯示了核適體的增量趨勢，在第1次循環篩選出可結合HA的核適體僅為原單股DNA的0.04%，但經過9次循環後抗HA核適體含量逐漸增加，第9次循環得到之抗HA核適體為原單股DNA的17.8%，且對於HA唾液酸結合位具有高度專一性及結合力。
CP9P5中96個核適體定序結果如圖式7所示，使用C.P.Woodbury's發表的計算方法(Woodbury C.P.,2008.Introduction to macromolecular binding equilibria.CRC Press,Boca Raton.)換算抗HA核適體之結合能力，公式如下：
其中K D,fetuin
為解離常數、IC 50,fetuin
為Fetuin抑制50%血液凝集素濃度及[Aptamer]為Aptamer濃度。根據Sriwilaijaroen等人2009年發表之論文(Sriwilaijaroen,N.,et al.,2009.Virology Journal,6)HA1解離常數為8μM及
Fituin之IC 50
為18.8 μM，本實例第9循環核適體濃度為3.05 nM，因此CP9P5平均解離常數為2.3 nM。圖式8為CP9P5之結合平衡試驗結果，假設CP9P5所有核適體皆與HA受體結合位結合，則得到的實驗數據符合單向全體結合模式，解離常數平均值為1.161(±0.1963)nM與使用Woodbury's計算方法算出之解離常數理論值相符。另外，與Gopinath et al.2006年發表論文數據比較(Gopinath et al.,2006,J Biochem,139,837-846)本發明CP9P5更可有效地辨認HA，證明本案方法可有效地得到兼具功能性與高結合力之核適體。
CP9P5中的96個核適體包含不同或者部分一致的序列片段，使用序列校準法依序將其分成五個組別，分類如圖式7所示，第1~5組分別含有33.3%、16.7%、24%、12.5%及13.5%的核適體。進一步計算核適體Gibb自由能數據，將GC含量(GC%)及自由能整理於下表，可發現抗HA核適體序列帶有高GC含量及低自由能。
CP9P526、CP9P528、CP9P536、CP9P554及CP9P596為五個自由能最低的核適體，其2級結構及自由能如圖式9所示，根據其個別之2級結構，可進一步分類成三種：第一、帶有三方向螺旋交聯(3-way helix junction)結
構，如CP9P526及CP9P536；第二、帶有主要環狀結構(loop)及旁支主幹-圈環(stem-loop)結構，如CP9P554；第三、帶有多主幹-圈環(stem-loop)結構，如CP9P528及CP9P596。其中第二種結構之主要環狀結構可能進一步折疊成G-四重折疊結構(g-quadruplex)。
本實例使用SPR測試檢驗核適體抗HA的能力。將重組HA1蛋白(1μ
g)固定於HUA-SPR晶片上，接著將HA1-HUA-SPR晶片個別與200 nM配置於篩選緩衝液之CP9P526、CP9P528、CP9P536、CP9P554及CP9P596核適體培養。測試結果如圖式10所示，可發現CP9P596辨識HA1蛋白能力最佳，兩者結合時SPR角度偏移到25.97 m°，其他核適體也顯示可有效地辨識HA1蛋白質。將核適體結合平衡能力納入考量，造成SPR最大偏移角度只有少部分(<35%)是由這5個核適體所造成的，其大部分可能是由晶片與蛋白質方向的表面障礙所造成的。
本實例進一步使用血球凝集反應及抑制血球凝集反應試驗來測量核適體抗HA蛋白質功能。首先測試HA蛋白質促進血球凝集的能力，將重組全長HA、HA1、HA胞外區塊、Lectin(正控制組)及PBS緩衝液(負控制組)個別與5%人類紅血球(A型)於96孔U型盤中溫和混合1小時，結果顯示於圖式11，因HA1蛋白質中缺乏HA2次單元，而HA2功能為膜融合與連結血球凝集素成為四元體，故造成HA1蛋白質無法促使紅血球凝集(圖式11 A)，而HA胞外區塊也同樣無法促使紅血球凝集(圖式11 A及B)。
使用HAI測試檢測CP9P526、CP9P528、CP9P536、CP9P554及CP9P596核適體抑制血球凝集反應功能。將上述核適體(2μ
m配置於PBS緩衝液)分別與1μ
g全長HA蛋白質(配置於0.1 M PBS緩衝液)共同培養30分鐘。將核適體/HA蛋白質複合物與5%人類紅血球混合，並目測觀察HA造成之血球凝集反應。測試結果如圖式12 A所示，CP9P536可抑制HA造成之血球凝集反應。其他核適體測試結果如圖式12 B所示，CP9P526、CP9P526及CP9P596都具有抑制血球凝集反應的活性，證明本發明可篩選出具有功能之核適體。
由於HAI測試使用的0.1M PBS緩衝液不含二價陽離子(Mg2+
及Ca2+
)因此核適體可正確折疊成四級結構。本實例進一步以CP9P536為例進行以下測試，將CP9P536配置於篩選緩衝液，以兩倍序列稀釋配置CP9P536從濃度為1μ
M到62.5 nM，並分別與全長HA(配置於4HAU溶液，總體積25μ
l)溫和搖晃混合30分鐘，並取50μ
l核適體/HA複合物到96孔U型盤中與0.75%人類紅血球(O型)混合。HAI測試結果如圖式13所示，CP9P536於62.5 nM的低濃度即可完全抑制HA(含4HAU)活性。將CP9P536核適體結抗HA活性與前人文獻中之核適體或抗體進行比較(Jeon,S.H.et al.,2004,J Biol Chem 279,48410-48419；Cheng,C.S.et al.,2008,Biochem Bioph Res Co 366,670-674及Schwahn,A.B.et al.,2009,J Immunoass Immunoch 30,245-261)，如下表；
CP9P536的拮抗活性為抗H3核適體A22的兩倍以上，與抗HA抗體1.B.408比較，其於100~1.95 nM濃度仍無法產生抑制血球凝集反應的活性(圖式14 A)。為了排除儲存抗體使用之40% glycerol可能產生之偽陰性結果，本實例進一步加入一組glycerol空白測試組，如圖式14 B，結果顯示glycerol並不影響HAI測試結果。另外，使用抗體IVC102進行HAI測試也無法產生抑制血球凝集反應的活性，上述抗體測試結果可能是因實驗批次間差異所造成的結果。由HAI測試結果證明CP9P536有潛力做為預防流感病毒製劑。
本實例使用免疫沉澱法測試CP9P536之專一性。將HA1蛋白質(1μ
g)以1：50、1：500及1：5000比例加入人類全血清蛋白中(human serum total protein,STP)。將連接CP9P536之圓珠與HA1/STP混合物室溫培養30分鐘，
接著將上述圓珠洗滌4次並將圓珠上的蛋白質使用PAGE樣品緩衝液(5% 2-巰基乙醇配置於SDS溶液)洗析下來，使用SDS-PAGE及西方墨點法分析蛋白質成分，結果如圖式15A所示，CP9P536在STP中可專一辨識HA1蛋白質，在高比例HA1/STP(>1：500)於30-32kD分子量可發現其他蛋白質條帶，其可能是因HA1與其他蛋白質結合所造成的。
本實例更進一步測試CP9P536對於病毒抗原的專一性。將病毒抗原(3μg)與連接CP9P536之圓珠共同培養，以PAGE樣品緩衝液進行洗析並使用西方墨點法分析，結果如圖15B所示。雖然圓珠與病毒合蛋白有非專一結合產物，但仍可觀察到CP9P536專一辨識病毒抗原中的血球凝集素，且對於病毒核蛋白與基質蛋白具有低結合活性。
使用核適體微晶片分析CP9P536之結合位
圖式16顯示血球凝集素核適體之微晶片分析結果，平均CP9P536核適體探針的訊號/雜訊比為20.9，表示CP9P536核適體探針適合進行微晶片分析，分析結果發現CP9P536核適體探針螢光強度皆高於全長CP9P536核適體，並發現序列：CGA TAG GTG TAG CGT GGG GCA CAT GTT CGC GC可能為很重要的蛋白質結合區域。而微晶片分析結果也證明了CP9P536核適體確實含有G-四重折疊結構。
100
‧‧‧具專一性核適體(Aptamer)之製備方法，ES-SELEX
110
‧‧‧蛋白質專一性篩選法
111
‧‧‧標的蛋白質
112
‧‧‧單股DNA群組
113
‧‧‧單股DNA群組/標的蛋白質複合物
114
‧‧‧純化管柱
115
‧‧‧純化管柱/單股DNA群組/標的蛋白質複合物
116
‧‧‧未結合或未完全結合該標的蛋白質之單股DNA
117
‧‧‧經過洗滌的純化管柱/單股DNA群組/標的蛋白質複合物
118
‧‧‧可與標的蛋白結合之單股DNA
119
‧‧‧核適體群組
120
‧‧‧結合位專一性篩選法
121
‧‧‧核適體/標的蛋白質複合物
122
‧‧‧純化管柱/核適體/標的蛋白質複合物
123
‧‧‧未結合或未完全結合該標的蛋白質之核適體
124
‧‧‧經過洗滌的純化管柱/核適體/標的蛋白質複合物
125
‧‧‧非標的蛋白質
126
‧‧‧經過蛋白質競爭步驟的純化管柱/核適體/標的蛋白質複合物
127
‧‧‧不具專一性之核適體
128
‧‧‧具專一性之核適體
129
‧‧‧純化之具專一性核適體
圖式1係具專一性核適體(Aptamer)之製備方法，ES-SELEX。
圖式2(A)顯示第1~5循環蛋白質專一性篩選法PCR產物含量，(B)為使用qPCR量化第1及第5循環PCR產物之結果，其中M為25bp DNA標記、NT為非目標控制組、N為單股DNA培養於篩選液液組及P為單股DNA培養於HA1蛋白質組。
圖式3顯示第6~8循環蛋白質專一性篩選法及反向篩選法PCR產物含量，其中M為25bp DNA標記、NT為非目標控制組、N為單股DNA培養於篩選溶液組及P為單股DNA培養於HA1蛋白質組。
圖式4(A)顯示第9循環實驗組及控制組五次梯度洗析產物PCR量化結果，(B)顯示其qPCR量化結果，其中圓圈表示實驗組第五次洗析產物數據。
圖式5為SPR晶片測試數據，其顯示核適體分子KD
值介於Fetuin與HA1之間。
圖式6顯示核適體的增量趨勢。
圖式7係CP9P5中96個核適體定序結果。
圖式8係CP9P5之結合平衡試驗結果
圖式9顯示核適體編號CP9P526、CP9P528、CP9P536、CP9P554及CP9P596之2級結構及其自由能。
圖式10顯示使用SPR測試檢驗核適體抗HA能力的結果。
圖式11(A)顯示全長HA、HA1、Lectin(正控制組)及PBS緩衝液(負控制組)之HAI實驗結果，(B)顯示全長HA、HA胞外區塊、Lectin(正控制組)及PBS緩衝液(負控制組)之HAI實驗結果。
圖式12(A)顯示核適體編號CP9P526、CP9P528、CP9P536、CP9P554及CP9P596 HAI實驗結果，其中圓圈為CP9P536核適體數據，並將其放大圖為最右圖，其中w/o HA表示不含HA之控制組，w/HA 10μg/ml表示含10μg/ml HA之實驗組，及(B)顯示重複測試結果，其中PC表示正控制組及NC表示負控制組。
圖式13顯示核適體編號CP9P536之HAI測試結果。
圖式14(A)顯示抗HA抗體1.B.408之HAI測試結果，及(B)glycerol空白測試組之HAI測試結果。
圖式15(A)顯示使用免疫沉澱法(Pull-down assay)測試CP9P536辨認HA1蛋白質之專一性之實驗數據，其中方框為HA1蛋白質，及(B)顯示CP9P536可專一辨認病毒抗原中的HA蛋白質。
圖式16顯示CP9P536之核適體微晶片分析結果。
SEQUENCE LISTING
<110> 國立台灣大學
<120> 具專一性核適體之製備方法及套組
<130> 1708-NTU-TW
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP9P570 aptamer
<400> 100
100
‧‧‧具專一性核適體(Aptamer)之製備方法，ES-SELEX
110
‧‧‧蛋白質專一性篩選法
111
‧‧‧標的蛋白質
112
‧‧‧單股DNA群組
113
‧‧‧單股DNA群組/標的蛋白質複合物
114
‧‧‧純化管柱
115
‧‧‧純化管柱/單股DNA群組/標的蛋白質複合物
116
‧‧‧未結合或未完全結合該標的蛋白質之單股DNA
117
‧‧‧經過洗滌的純化管柱/單股DNA群組/標的蛋白質複合物
118
‧‧‧可與標的蛋白結合之單股DNA
119
‧‧‧核適體群組
120
‧‧‧結合位專一性篩選法
121
‧‧‧核適體/標的蛋白質複合物
122
‧‧‧純化管柱/核適體/標的蛋白質複合物
123
‧‧‧未結合或未完全結合該標的蛋白質之核適體
124
‧‧‧經過洗滌的純化管柱/核適體/標的蛋白質複合物
125
‧‧‧非標的蛋白質
126
‧‧‧經過蛋白質競爭步驟的純化管柱/核適體/標的蛋白質複合物
127
‧‧‧不具專一性之核適體
128
‧‧‧具專一性之核適體
129
‧‧‧純化之具專一性核適體
Claims (8)
- 一種具結合位專一性核適體(Aptamer)之製備方法，其包含以下步驟：(a)提供一單股DNA群組；(b)將該單股DNA群組與一標的蛋白質混合，使用至少一次蛋白質專一性篩選法得到一核適體群組；及(c)將該核適體群組使用至少一次結合位專一性篩選法得到一具結合位專一性核適體，其中該結合位專一性篩選法包含以下步驟：(A)將該核適體群組與該標的蛋白質混合使兩者結合；(B)以該緩衝液洗滌步驟(A)混合物，去除未結合或未完全結合該標的蛋白質之核適體；(C)以一蛋白質結合位競爭法去除步驟(B)混合物中對標的蛋白質不具結合位專一性之核適體；(D)將步驟(C)得到之具結合位專一性之核適體與該標的蛋白質分離，並以聚合酶鏈鎖反應增加該核適體數量；及(E)純化步驟(D)之核適體或進一步將純化後的步驟(E)核適體重覆執行(A)~(E)步驟得到一結合位具專一性之核適體。
- 根據申請專利範圍1所述之方法，其中該蛋白質結合位競爭法包含以下步驟：(i)混合一結合位競爭蛋白質與申請專利範圍2方法中步驟(B)混合物，該結合位競爭蛋白質與該標的蛋白質結合，並使該不具結合位專一性之核適體與標的蛋白質脫離；及(ii)去除該不具結合位專一性之核適體。
- 根據申請專利範圍1所述之方法，其中該標的蛋白質係一人類流感血液凝集素(Human influenza hemagglutinin)。
- 根據申請專利範圍2所述之方法，其中該結合位競爭蛋白質係一胎球蛋白(Fetuin)。
- 一種製備具結合位專一性核適體之套組，其包含：(I)一單股DNA群組，用以與至少一蛋白質結合；(II)一標的蛋白質，用以混合該單股DNA群組，其用於初步篩選一核 適體群組及/或得到該核適體群組與該標的蛋白質結合之混合物；及(III)一結合位競爭蛋白質，用以混合該核適體群組與該標的蛋白質結合之混合物，以去除不具結合位專一性之核適體得到該具結合位專一性核適體。
- 根據申請專利範圍5所述之套組，其可進一步包含一聚合酶鏈鎖反應套組，用以增加該具結合位專一性或不具結合位專一性之核適體數量。
- 根據申請專利範圍5所述之套組，其中該標的蛋白質係一人類流感血液凝集素(Human influenza hemagglutinin)。
- 根據申請專利範圍5所述之套組，其中該結合位競爭蛋白質係一胎球蛋白(Fetuin)。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| TW101120521A TWI465566B (zh) | 2012-06-07 | 2012-06-07 | 具專一性核適體之製備方法及套組 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101120521A TWI465566B (zh) | 2012-06-07 | 2012-06-07 | 具專一性核適體之製備方法及套組 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201350576A TW201350576A (zh) | 2013-12-16 |
| TWI465566B true TWI465566B (zh) | 2014-12-21 |
Family
ID=50157869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW101120521A TWI465566B (zh) | 2012-06-07 | 2012-06-07 | 具專一性核適體之製備方法及套組 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI465566B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011006075A1 (en) * | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
-
2012
- 2012-06-07 TW TW101120521A patent/TWI465566B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011006075A1 (en) * | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| S. C.B. Gopinath et al., "An Efficient RNA Aptamer against Human influenza B Virus Hemagglutinin", J. Biochem., 2006, Vol. 139, p.837~846. H. Hasegawa et al., "Selection of DNA aptamers against VEGF 165 using a protein competitor and the aptamer blotting method", Biotechnol. Lett., 2008, Vol. 30, p.829~834. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201350576A (zh) | 2013-12-16 |
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