JP5925039B2 - 電子顕微鏡観察用染色剤および該染色剤を用いた染色方法 - Google Patents
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Description
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤に含まれる、一般式Aa+ [(15-b)+c(6-d)]/a[Zb+P5W(30-c)M(d)cO110]で表されるリンタングステン酸は、Preyssler型と呼ばれるリンタングステン酸である。Preyssler型リンタングステン酸は、Keggin型とは異なる形でリン酸とタングステン酸とが縮合したヘテロポリ酸の一種である。Preyssler型リンタングステン酸アニオンの一次構造を図2に示す。
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、電子顕微鏡観察用試料の染色に用いることができる。本発明に係る方法によれば、電子顕微鏡観察用試料をより簡便に染色することができる。
(Preyssler型リンタングステン酸の合成)
Preyssler型リンタングステン酸として、既報(Y.Jeanninら,Journal of American Chemical Society,1985,107,2662−2669)に従い、カリウムとナトリウムの混合塩であるK12.5Na1.5[NaP5W30O110]を合成し、単離した。
細菌に感染するウイルスであるT4ファージ(NBRC;NITE Biological Resource Centerより購入、T4(NBRC20004))を二重寒天培養法により37℃で24時間培養し、精製したものを用いた。
Preyssler型リンタングステン酸を蒸留水に溶かし、濃度を0.5質量%とした溶液を用いた。
染色は以下の手順で行った。前記ファージの濃度を約1011PFU/ml(PFU:Plaque forming unit)に調整したファージ溶液(PBS:phosphate buffered saline)5μlを、カーボン蒸着および親水化処理を施したコロジオン膜張りCuグリッド(日新EM社製、製品番号:6511、200メッシュ)上にマイクロピペット3を用いて図4(a)に示すように滴下し、グリッドと3分間接触させた後、余分な溶液を5Cのろ紙で吸い取った。その後、試料に前記染色剤溶液5μlを、マイクロピペットを用いて図4(a)に示すように滴下し、3分間接触させた後、余分な溶液を5Cのろ紙により吸い取った。なお、ろ紙で余分な溶液を吸い取る際には、図4(b)に示すようにグリッド2とろ紙4との角度を30度に保った。その後、室温にて1時間定置乾燥させて観察用試料を得た。
前記観察用試料について電子顕微鏡観察を行った。電子顕微鏡観察は、広島大学自然科学研究支援開発センター遺伝子実験部門所有の透過型電子顕微鏡(JEM−1200EX、日本電子製、加速電圧80kV)を用いて行った。結果を図5(a)に示す。
ファージとして、T7ファージ(NBRC;NITE Biological Resource Centerより購入、T7(NBRC20007))を用いたこと以外は、実施例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図6(a)に示す。
ファージとして、λファージ(NBRC;NITE Biological Resource Centerより購入、λ(NBRC20016))を用いたこと以外は、実施例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図7(a)に示す。
染色剤溶液として、酢酸ウラニルを蒸留水に溶かし、濃度を3質量%とした溶液を用いたこと以外は、実施例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図5(b)に示す。
ファージとして、T7ファージ(NBRC;NITE Biological Resource Centerより購入、T7(NBRC20007))を用いたこと以外は、比較例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図6(b)に示す。
ファージとして、λファージ(NBRC;NITE Biological Resource Centerより購入、λ(NBRC20016))を用いたこと以外は、比較例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図7(b)に示す。
染色剤溶液として、Keggin型リンタングステン酸(TAAB社製)を蒸留水に溶かして濃度を0.5質量%とした後、KOH水溶液によりpHを6に調整した溶液を用いたこと以外は、実施例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図5(c)に示す。
ファージとして、T7ファージ(NBRC;NITE Biological Resource Centerより購入、T7(NBRC20007))を用いたこと以外は、比較例4と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図6(c)に示す。
ファージとして、λファージ(NBRC;NITE Biological Resource Centerより購入、λ(NBRC20016))を用いたこと以外は、比較例4と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図7(c)に示す。
染色剤溶液中のPreyssler型リンタングステン酸の濃度を0.3質量%としたこと以外は、実施例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図8(a)に示す。
染色剤溶液中のPreyssler型リンタングステン酸の濃度を2.0質量%としたこと以外は、実施例1と同様にして観察用試料を作製し、TEM観察を行った。結果を図8(b)に示す。
(Ca2+交換Preyssler型リンタングステン酸の合成)
実施例1と同様な方法で調製したK12.5Na1.5[NaP5W30O110]・15H2Oを純水に溶解し、1.2当量の塩化カルシウム(CaCl2、和光純薬製)を加え、既報(M.T.Popeら,Inorganic Chemistry,1993,32,1573−1578)に従って160℃で2日間反応させることにより、K13[CaP5W30O110]を合成し、単離した。元素分析(Mikroanalytisches Labor Pascher社により分析、所在地:An der Pulvermuhle 1,D−53424,Remagen−Bndorf,Germany)により、質量%での実測値(計算値)として、K:5.78(5.94)、Ca:0.48(0.46)、P:1.84(1.84)、W:65.4(65.4)、H:0.59(0.60)が得られ、本化合物がK13[CaP5W30O110]・25H2Oであることを確認した。また、実施例1と同様な方法で31P−NMRを測定し、−9.0および−11.1ppmに[CaP5W30O110]13-アニオン由来のシグナルが確認された。
染色剤としてK13[CaP5W30O110]を用いたこと以外は、実施例1と同様な方法で行った。結果を図9に示す。
(Y3+交換Preyssler型リンタングステン酸の合成)
塩化カルシウムの代わりに1.2当量の硝酸イットリウム・6水和物(Y(NO3)3・6H2O、アルドリッチ製)を用いたこと以外は、実施例6と同様にして、K12[YP5W30O110]を合成し、単離した。実施例6と同様な方法で元素分析と31P−NMRを測定した。元素分析により、質量%での実測値(計算値)として、K:5.78(5.74)、Y:1.05(1.04)、P:1.84(1.84)、W:65.4(65.4)、H:0.59(0.55)が得られ、本化合物がK12[YP5W30O110]・25H2Oであることを確認した。31P−NMRにおいて、−10.1ppmに[YP5W30O110]12-アニオン由来のシグナルが確認された。
染色剤としてK12[YP5W30O110]を用いたこと以外は、実施例6と同様な方法で行った。結果を図10に示す。
(Ce3+交換Preyssler型リンタングステン酸の合成)
溶媒として0.1mol/lの硝酸(HNO3)水溶液を用いたこと、塩化カルシウムの代わりに3当量の硝酸アンモニウムセリウム(IV)((NH4)2[Ce(NO3)6]、和光純薬製)を用いたことおよび反応温度を180℃としたこと以外は、実施例6と同様にして、K12[CeP5W30O110]を合成し、単離した。実施例6と同様な方法で元素分析と31P−NMRを測定した。元素分析により、質量%での実測値(計算値)として、K:5.74(5.78)、Ce:1.65(1.63)、P:1.83(1.81)、W:65.0(64.7)、H:0.59(0.60)が得られ、得られた化合物がK12[CeP5W30O110]・25H2Oであることを確認した。31P−NMRにおいて、−15.9ppmに[CeP5W30O110]12-アニオン由来のシグナルが確認された。
染色剤としてK12[CeP5W30O110]を用いたこと以外は、実施例6と同様な方法で行った。結果を図11に示す。
(Eu3+交換Preyssler型リンタングステン酸の合成)
塩化カルシウムの代わりに1.2当量の硝酸ユウロピウム(III)・6水和物(Eu(NO3)3・6H2O、和光純薬製)を用いたこと以外は、実施例6と同様にして、K12[EuP5W30O110]を合成し、単離した。実施例6と同様な方法で元素分析と31P−NMRを測定した。元素分析により、質量%での実測値(計算値)として、K:5.74(5.80)、Eu:1.79(1.81)、P:1.82(1.82)、W:64.9(64.8)、H:0.59(0.53)が得られ、本化合物がK12[EuP5W30O110]・25H2Oであることを確認した。31P−NMRにおいて、0.6ppmに[EuP5W30O110]12-アニオン由来のシグナルが確認された。
染色剤としてK12[EuP5W30O110]を用いたこと以外は、実施例6と同様な方法で行った。結果を図12に示す。
(Bi3+交換Preyssler型リンタングステン酸の合成)
溶媒として0.1mol/lのHCl水溶液を用いたこと、塩化カルシウムの代わりに2当量の塩化ビスマス(III)(BiCl3、和光純薬製)を用いたこと以外は、実施例6と同様にして、K12[BiP5W30O110]を合成し、単離した。実施例6と同様な方法で元素分析と31P−NMRを測定した。元素分析により、質量%での実測値(計算値)として、K:5.70(5.73)、Bi:2.44(2.41)、P:1.81(1.80)、W:64.5(64.6)、H:0.58(0.54)が得られ、本化合物がK12[BiP5W30O110]・25H2Oであることを確認した。31P−NMRにおいて、−8.2ppmに[BiP5W30O110]12-アニオン由来のシグナルが確認された。
染色剤としてK12[BiP5W30O110]を用いたこと以外は、実施例6と同様な方法で行った。結果を図13に示す。
(観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察)
実施例9の染色剤を用いたこと以外は、実施例2と同様な方法で行った。結果を図14に示す。
(観察対象、染色剤溶液、染色方法および電子顕微鏡観察)
実施例3の観察対象を用いたこと以外は、実施例11と同様な方法で行った。結果を図15に示す。
(Preyssler型リンタングステン酸NH4塩の合成)
実施例1記載の既報に従って合成したK12.5Na1.5[NaP5W30O110]を原料とし、H14[NaP5W30O110]を経由して(NH4)14[NaP5W30O110]を合成した。具体的には、20gのK12.5Na1.5[NaP5W30O110]・15H2Oを300mlの純水に溶解し、50gのDowex50W×8(プロトン型陽イオン交換樹脂、和光純薬製)をつめたカラム(カラム内径:約15mm)にこの溶液を流通させることでH14[NaP5W30O110]へ変換した。得られた溶液をロータリーエバポレーター(32mbar、45℃)を用いて濃縮、乾燥し、固体を得た。実施例6と同様な方法で元素分析と31P−NMRを測定し、実施例1と同様な方法で183W−NMRを測定した。元素分析により、質量%での実測値(計算値)として、K:<0.0002(0.00)、Na:0.26(0.28)、P:1.72(1.88)、W:67.02(66.77)、H:1.10(1.24)が得られ、本化合物がH14[NaP5W30O110]・44H2Oであることを確認した。31P−NMRにより、−9.4ppmに[NaP5W30O110]14-アニオン由来のシグナルが確認された。183W−NMRにより、−207.8、−209.7、−275.9および−288.3ppmに[NaP5W30O110]14-アニオン由来のシグナルが確認された。
(NH4)14[NaP5W30O110]を染色剤として用いたこと以外は、実施例1と同様な方法で行った。結果を図16に示す。
(Preyssler型リンタングステン酸K塩の合成)
実施例1記載の既報に従い、K14[NaP5W30O110]を合成した。具体的には、タングステン酸ナトリウム・2水和物(Na2WO4・2H2O、和光純薬製)99gを純水90mlに溶解し、85質量%リン酸(85質量%H3PO4、和光純薬製)79.5mlを添加した。この溶液を、テフロン(登録商標)内筒型密閉容器(TAF−SR型、内容積300ml、耐圧硝子工業製)に入れて密閉後、120℃の水熱条件下で一晩静置した。容器を室温まで放冷して容器を開放し、純水45mlをゆっくりと添加、引き続いて塩化カリウム(和光純薬製)30gを添加した。生じた沈澱は、吸引ろ過によりろ別し、2mol/lの酢酸カリウム(和光純薬製)水溶液(150ml)およびメタノール(和光純薬製)(150ml)で洗浄した。吸引条件下で乾燥すると薄い黄白色固体が得られた(約60g)。得られた黄白色固体(約60g)を100度の熱水70mlに溶解し、静置してゆっくり室温まで放冷し、再結晶した。吸引ろ過して白色固体を得た(約25g)。この得られた白色固体(約25g)を100度の熱水20mlに溶解し、静置して室温までゆっくり放冷し、再結晶した。析出した固体を吸引ろ過して、白色固体を得た(約20g)。実施例6と同様な方法で元素分析と31P−NMRを測定した。元素分析により、質量%での実測値(計算値)として、K:6.31(6.50)、Na:0.28(0.27)、P:1.83(1.84)、W:65.5(65.5)、H:0.54(0.55)が得られ、本化合物がK14[NaP5W30O110]・23H2Oであることを確認した。31P−NMRにより、−9.4ppmに[NaP5W30O110]14-アニオン由来のシグナルが確認された。
K14[NaP5W30O110]を染色剤として用いたこと以外は、実施例1と同様な方法で行った。結果を図17に示す。
2 グリッド
3 マイクロピペット
4 ろ紙
Claims (3)
- 一般式Aa+ [(15-b)+c(6-d)]/a[Zb+P5W(30-c)M(d)cO110]
(式中、P、WおよびOは、それぞれリン、タングステンおよび酸素を示す。Aa+はa価のカチオン、Zb+はb価のカチオン、M(d)はd価の元素を示す。0<a、0<b、0≦c<30、0<d≦6である。)
で表されるリンタングステン酸を含む電子顕微鏡観察用染色剤。 - 前記一般式において、Aa+がH+、Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+、Be2+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、NH4 +、ピリジニウムカチオンおよび第4級アンモニウムカチオンからなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであり、Zb+がNa+、Ca2+、Sr2+、Bi3+、Y3+、La3+、Ce3+、Eu3+、Gd3+、Lu3+、Am3+、Th4+およびU4+からなる群より選ばれる少なくとも一つのカチオンであり、M(d)がW(VI)、Mo(VI)およびV(IV)からなる群より選ばれる少なくとも一つの元素である請求項1に記載の電子顕微鏡観察用染色剤。
- 請求項1または2に記載の電子顕微鏡観察用染色剤を用いる電子顕微鏡観察用試料の染色方法。
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