JP5905446B2 - Ｂｍｐ−４ペプチドおよび使用方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１０年３月２４日に出願された米国仮出願６１／３１７，０７５号の利益を主張する。

発明の背景
本発明は、短縮型成長因子およびその改変体に関する。本発明はまた、短縮型成長因子の製造方法および使用方法に関する。

本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を備えるペプチドを有する、１１５残基以下の単離されたペプチドに関する。

本発明はまた、第２のペプチドに融合させられた、本明細書に記載された本発明のペプチドを備える融合タンパク質に関し、ここで、第２のペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に対して７０％未満同一であるアミノ酸配列を備える。

本発明はまた、細胞を本明細書に記載された本発明のペプチドと接触させることを備える方法を用いて、骨誘導性または軟骨誘導性を促進する方法に関する。

本発明はまた、本明細書に記載された本発明のペプチドをマトリックスに投与する方法に関する。

本発明はまた、本明細書に記載された本発明のペプチドを細胞に投与することを備える、細胞中の骨形成または軟骨形成を増加させる方法に関する。

本発明はまた、少なくとも１種のプロテアーゼおよび配列番号２を備える成長因子を細胞に投与することを備える、細胞成長因子活性を増加させる方法に関する。ある実施形態において、組成物は２種以上のプロテアーゼを備える。

修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養された後のアルカリホスファターゼの筋芽細胞発現を示す。３０ｎｇ／ｍＬの濃度では、修飾ｒｈＢＭＰ４で処理された細胞は、非修飾成熟ｒｈＢＭＰ−４で処理された細胞よりも有意に高いＡＰ活性を発現した。

発明の詳細な説明
本発明は、単離されたポリペプチドに関する。ある実施形態において、単離されたポリペプチドは１１５アミノ酸残基以下である。「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、そのネイティブな環境から完全にまたは部分的に取り出されたポリペプチドを意味することを意図している。例えば、細胞から取り出された、または精製されたポリペプチドは、単離されたと見なされる。加えて、宿主細胞中に含有されている組換え産生されたポリペプチド分子は、本発明の目的のために単離されたと見なされる。さらに、あるペプチドが通常は発現しないか見い出されない細胞、組織、またはマトリックスにおいて見い出される場合、そのペプチドもまた、本発明の目的のために「単離された」と見なされる。同様に、合成されたポリペプチドは単離されたポリペプチドであると見なされる。他方、「精製された」は当該分野において十分に理解されており、一般には、ペプチドが、細胞材料、細胞成分、化学前駆体、または、おそらくは緩衝液または溶媒は別として、他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。「実質的に含まない」は、新規なペプチド以外の他の成分が検出不可能であることを意味することは意図していない。本発明のペプチドは単離されてもよく、または精製されてもよい。

配列番号１のアミノ酸配列は、骨形成タンパク質４（「ＢＭＰ−４」）の全長「プレプロペプチド」を表す。ペプチドのＢＭＰファミリーのメンバーの多くと同様に、ＢＭＰ−４は全長プレプロペプチドとして形成され、これは、通常は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナル配列、プロペプチドドメイン、および「成熟」ペプチドを含有する。ＢＭＰ−４については、シグナル配列は配列番号１のアミノ酸残基１〜１９に存在し、プロペプチドドメインは残基２０〜２９２であり、「成熟」ペプチドは残基２９３〜４０８である。ｈＢＭＰ−４のアミノ酸配列もまた、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１２６４４としてＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｄａｔａｂａｓｅにおいて入手可能であり、この記録の全体が参照により組み込まれる。通常、ＢＭＰ−４は、成長因子のＢＭＰファミリーの他のメンバーと同様に、全長プレプロペプチドに翻訳される。引き続く翻訳後プロセシングによって、シグナルペプチドおよびプロペプチドドメインは、「成熟」型の成長因子として認識されるペプチドの残りの部分を伴って切断される。プロセシング後、「成熟」型のタンパク質は通常は二量体化し、活性ホモ二量体またはさらにはヘテロ二量体の骨形成タンパク質が細胞から分泌され、そしてこの二量体は、一般には、その受容体、例えばＩＡ型ＢＭＰ受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）に結合して、典型的にはＢＭＰ−４活性と関連する細胞シグナル伝達カスケードを開始する。

配列番号２のアミノ酸配列は成熟ＢＭＰ−４の新規な短縮を表し、配列番号１のアミノ酸残基３０３〜４０８に対応する。本明細書で使用される場合、「修飾成長因子」または「短縮型成長因子」とは、任意の型のＢＭＰ−４のこれらの新規な短縮をいい、これには、ＢＭＰ−４の全長プレプロペプチド、プロペプチド（シグナル配列を伴わない全長ペプチド）、および成熟型が含まれる。それゆえに、本発明は、１１５残基以下の単離されたペプチドを提供し、このペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を備える。１つの特定の実施形態において、単離されたペプチドは１１５残基以下であり、かつ配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を備える。さらなる実施形態において、本発明のペプチドは１１５残基以下であり、かつ配列番号２のアミノ酸配列に対して１００％同一であるアミノ酸配列を備える。

なおさらなる実施形態において、単離されたペプチドは、１１５残基以下、１１４残基以下、１１３残基以下、１１２残基以下、１１１残基以下、１１０残基以下、１０９残基以下、１０８残基以下、１０７残基以下、または１０６残基以下であり、各ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を独立して備える。なおさらなる実施形態において、本明細書に記載されたペプチド改変体は、例えば、ＩＡ型ＢＭＰＲ（ＢＭＰＲ１Ａ）、およびより低い程度ではＩＩ型ＢＭＰＲであるがこれらに限定されない、その対応する骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）と少なくとも部分的に特異的に相互作用するそれらのペプチド改変体の能力をなお保持している。さらなる実施形態において、本明細書に記載されたペプチド改変体は、機能的であり、かつ骨誘導の促進、骨芽細胞の増殖の刺激、および／または骨発生の促進が可能である。なおさらなる実施形態において、本発明の修飾成長因子は、非修飾成長因子と比較して、活性が増強している。なおさらなる実施形態において、これらのペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、すなわち、１０６アミノ酸長からなり、配列番号２に対して１００％同一である。

参照アミノ酸配列、例えば配列番号２に対して、少なくとも、例えば約９５％「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照アミノ酸配列の１００アミノ酸あたり約５個までの修飾を含んでもよいこと以外は、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味すると理解される。換言すれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の約５％までが欠失もしくは別のアミノ酸で置換されてもよく、または参照配列中のアミノ酸全体の約５％までの数のアミノ酸が参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの修飾は、参照アミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端の位置において、またはこれらの末端位置の間の任意の場所に存在してもよく、参照配列中のアミノ酸の間に個別に、または参照配列中の１つ以上の連続する基に散在している。

本明細書で使用される場合、「同一性」は、参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、これらの配列は、最も高次の一致が得られるように整列させられる。「同一性」は、本質的に、当該分野で認識される意味を有し、周知の技術を使用して計算することができる。２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」という用語は当業者には周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ（１９８８）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３）。２つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータプログラム法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）、およびＦＡＳＴＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。同一性および類似性を決定するための方法の例は、Ｍｉｃｈａｅｌｓ（２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓにおいて議論されている。

本発明の１つの実施形態において、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。本発明の別の実施形態において、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはＦＡＳＴＤＢであり、これは、Ｂｒｕｔｌａｇ（１９９０）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６，２３７−２４５のアルゴリズムに基づいている。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列と参照配列はアミノ配列である。配列アラインメントの結果は、同一性パーセントである。１つの実施形態において、同一性パーセントを計算するためのアミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて使用してもよいパラメーターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ、いずれか短い方。

内部の付加または欠失によるものではなく、Ｎ末端およびＣ末端の付加または欠失により、問い合わせ配列よりも参照配列が短いかまたは長い場合は、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、同一性パーセントを計算するときに参照配列のＮ末端およびＣ末端の短縮または付加を考慮しないので、手動の修正を行うことができる。参照配列と比べて、Ｎ末端またはＣ末端で短縮している問い合わせ配列については、同一性パーセントは、問い合わせ配列の塩基全体のパーセントとして、一致／整列していない参照配列に対してＮ末端またはＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって修正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果は一致／整列を決定する。次いで、アラインメントのパーセンテージは、特定のパラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから減算され、最終同一性パーセントスコアに到達する。この修正スコアは、アラインメントがいかにして互いに「一致する」かを決定し、ならびに同一性パーセントを決定する目的のために使用できる。以前の問い合わせ配列のＮ末端またはＣ末端を延長する参照配列の残基を、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために考慮してもよい。すなわち、比較配列のＮ末端またはＣ末端と一致／整列させられない残基を、同一性パーセントスコアまたはアラインメント番号付けを手動で調整する際に計数してもよい。

例えば、９０アミノ残基の問い合わせ配列は、同一性パーセントを決定するために１００残基の参照配列と整列させられる。欠失は、問い合わせ配列のＮ末端に存在し、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端の最初の１０残基の一致／アラインメントを示さない。１０個の対合しない残基は参照配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端における残基の数／参照配列中の残基の総数）を表し、従って、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致するならば（１００％アラインメント）、最終的な同一性パーセントは９０％である（１００％アラインメント−１０％不一致突出）。別の例において、欠失が内部欠失である場合を除いて、９０残基の問い合わせ配列は１００個の参照配列と比較される。この場合において、問い合わせと一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端には残基が存在しないので、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは手動で修正されない。さらに別の例において、同一性パーセントを決定するために、１１０アミノ酸問い合わせ配列が１００残基参照配列と整列させられる。問い合わせにおける付加は問い合わせ配列のＮ末端に存在し、それゆえに、ＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端の最初の１０残基の一致／アラインメントを示さないかもしれない。問い合わせ配列の残りの１００アミノ酸残基が、参照配列の全長に対して９５％同一性を有する場合、問い合わせのＮ末端付加は無視され、参照配列に対する問い合わせの同一性パーセントは９５％である。

本明細書で使用される場合、「に対応する」および「に対応している」という用語は、これらが配列アラインメントに関連するとき、参照タンパク質、例えば、野生型ＢＭＰ−４の中の列挙された位置、および参照タンパク質上の位置と整列する修飾ＢＭＰ−４中のこれらの位置を意味することが意図される。従って、対象ＢＭＰ−４のアミノ酸配列が参照ＢＭＰ−４のアミノ酸配列、例えば配列番号２と整列させられるとき、参照配列の特定の列挙された位置「に対応する」対象配列中のアミノ酸は、参照配列、例えば、配列番号２のこれらの位置と整列するが、必ずしも参照配列の正確な数字の位置にはないアミノ酸である。配列間の対応するアミノ酸を決定するために配列を整列させるための方法が、本明細書に記載される。従って、本発明は、その配列が配列番号２の配列に対応する新規なペプチドを提供する。

本発明は、本発明の修飾成長因子に対応するアミノ酸配列を有する他の種、好ましくは哺乳動物のホモログをさらに包含する。種ホモログは「オルトログ」とも称し、一般には、ヒトにおける成長因子と、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。このような対応する配列は、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サルなどの様々な種からのＢＭＰ−４の修飾成長因子を構成している。別の実施形態において、本発明は、その配列が配列番号２の配列に対応し、かつ少なくともある程度の最低限の機能を保持している新規なペプチドを提供する。

−１位にさらなるメチオニン残基を伴う修飾成長因子産物（Ｍｅｔ−１−ペプチド）が、−２位および−１位にさらなるメチオニン残基およびリジン残基を有する改変体（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−ペプチド）と同様に意図される。さらなるＭｅｔ残基、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ残基、またはＬｙｓ残基を有する修飾成長因子の改変体（または一般には１個以上の塩基性残基）が、細菌宿主細胞中での組換えタンパク質産生の増強のために特に有用である。

修飾成長因子をコードするポリヌクレオチドの発現ベクター系への挿入から生じる改変体もまた意図される。例えば、改変体（通常は挿入）は、修飾成長因子のアミノ末端および／またはカルボキシ末端が別のポリペプチドに融合されるときから生じてもよい。

別の態様において、本発明は、修飾成長因子ペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去されている欠失改変体を提供する。欠失は、修飾成長因子ペプチドの一方または両方の末端で、または修飾成長因子ペプチドの１つ以上の非末端アミノ酸残基の除去を伴ってもたらすことができる。それゆえに、欠失変異体は、修飾成長因子ペプチドのすべてのフラグメントを含む。

開示された同一性パーセントの境界内で、本発明はまた、本発明の開示されたポリペプチドの置換改変体に関する。置換改変体としては、短縮成長因子の１つ以上のアミノ酸残基が除去され、別の残基で置き換えられているポリペプチドが挙げられる。１つの態様において、置換は保存的性質を有する；しかし、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。この目的のための保存的置換は、以下の表に提示するように定義することができる。アミノ酸は物理的特性ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与によって分類できる。保存的置換は、当該分野において、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸との置換であると認識されている。例示的な保存的置換を以下に提示する。
表１：保存的置換

あるいは、保存的アミノ酸は、以下に示すように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ｐｐ．７１−７７に記載されるようにグループ分けできる。
表２：保存的置換

そしてさらに他の代替的な、例示的な保存的置換を以下に示す。
表３：保存的置換

本発明のポリペプチドは、二量体に関与してもよく、関与しなくてもよい。１つの実施形態において、本発明は二量体を提供し、この二量体は、本明細書に記載された少なくとも１つの新規な修飾成長因子を備える。１つの特定の実施形態において、これらの二量体は、新規な修飾成長因子のホモ二量体である。別の実施形態において、これらの二量体は、新規な修飾成長因子の少なくとも１つを備えるヘテロ二量体である。本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体」とは、２つのペプチドの二量体を意味し、ここで、ペプチドのアミノ酸配列は互いに１００％同一であるわけではない。従って、ヘテロ二量体は、同じ成長因子の正常な「成熟」バージョンとともに二量体化された本発明の修飾成長因子ペプチドを含んでもよい。

明細書および特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合、１つ以上の構成要素の列挙に関連する「少なくとも１つ」という語句は、構成要素の列挙における任意の１つ以上の構成要素から選択される少なくとも１つの構成要素を意味するが、構成要素の列挙の中に具体的に列挙された各々のおよびすべての構成要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、かつ構成要素の列挙の中の構成要素の任意の組み合わせを除外しないことが理解されよう。ある実施形態において、少なくとも１つとは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０をいう。

本発明のペプチドまたはポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を保有するポリペプチドを含むことが意図されることが理解されよう。例として、修飾は、共有結合性であってもよく、例えば、ポリマー、脂質、他の有機および無機部分との化学結合を含む。このような誘導体を、ポリペプチドの循環半減期を増加させるように調製してもよく、または所望の細胞、組織、もしくは器官へのポリペプチドの標的化能力を改善するように設計してもよい。同様に、本発明はさらに、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールなどの１種以上の水溶性ポリマー付加物を含むように共有結合的に修飾された修飾成長因子ペプチドを包含する。

修飾成長因子がポリマーに連結されている化学修飾された成長因子組成物は、本発明の範囲内に含まれる。ポリマーは、生理学的環境などの水性環境中でタンパク質の沈殿を妨害するように水溶性であってもよい。適切な水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、およびポリビニルアルコールからなる群より選択することができる。選択されたポリマーは、通常、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾され、その結果、重合度を制御することができる。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分岐状または非分岐状であってもよく、このようなポリマーの混合物もまた使用することができる。化学修飾されたＮｇＲポリマーが治療用途に向けられている場合、薬学的に許容されるポリマーが使用のために選択される。

修飾成長因子ペプチドのｐｅｇ化は、当該分野において公知であるｐｅｇ化反応のいずれかによって実施することができる。好ましくは、ｐｅｇ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。ポリペプチドのｐｅｇ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、例としては二官能性ＰＥＧが挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用された任意の型のＰＥＧ、例えばモノ（Ｃｌ−ＣｌＯ）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを包含することが意図される。

修飾成長因子の化学的誘導体化は、活性化ポリマー分子を有する生物学的に活性な物質と反応するために使用される任意の適切な条件下で実施することができる。ｐｅｇ化修飾成長因子を調製するための方法は、一般に、（ａ）修飾成長因子ポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合されるようになる条件下で、ポリペプチドを、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコールと反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程を備える。既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者には明らかである。

ｐｅｇ化および他のポリマー修飾された成長因子ポリペプチドは、一般に、本明細書に記載された修飾成長因子ポリペプチドの投与によって緩和または調節される可能性がある状態を治療するために使用することができる。しかし、本明細書に開示される、化学的誘導体化されたポリマー：修飾成長因子ポリペプチド分子は、誘導体化されていない分子と比較した場合に、さらなる活性、増強もしくは減少した生物学的活性、または半減期の増加もしくは減少などの他の特性を有してもよい。修飾成長因子ポリペプチド、そのフラグメント、改変体、および誘導体は、単独で、一緒に、または他の薬学的組成物と組み合わせて使用されてもよい。例えば、サイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症剤、および／または化学療法剤は、治療される徴候に適切であるように同時投与されてもよい。

本発明は、本発明の精製ポリペプチドを備えた組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、薬学的ビヒクル、賦形剤、または培地の役目をする、薬学的に許容される（すなわち、滅菌および非毒性の）液体、半固体、または固体の希釈剤を備える。当該分野において公知である任意の希釈剤を使用することができる。例示的な希釈剤としては、水、生理食塩水、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、アルギン酸塩、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセリン、リン酸カルシウム、ミネラルオイル、およびココアバターが挙げられるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、本発明は、少なくとも第１および第２の融合ペプチドを備える融合タンパク質を提供する。融合パートナーは、一般的に言えば、融合ペプチド間の典型的なアミン結合を介して互いに共有結合しており、従って、１つの連続するアミノ酸鎖を作る。１つの特定の実施形態において、融合タンパク質の第１のペプチドは１１５残基以下のペプチドを備え、このペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を備える。１つの特定の実施形態において、第１の融合ペプチドは１１５残基以下であり、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を備える。さらなる実施形態において、第１の融合ペプチドは１１５残基以下であり、配列番号２のアミノ酸配列に対して１００％同一であるアミノ酸配列を備える。なおさらなる実施形態において、第１の融合ペプチドは、１１４、１１３、１１２、１１１、１１０、１０９、１０８、１０７、または１０６残基以下であり、各第１の融合ペプチドは、独立して、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を備える。さらなる実施形態において、第１の融合ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、すなわち、１０６アミノ酸長かつ配列番号２に対して１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

１つの特定の実施形態において、第２の融合ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含まないアミノ酸配列を備える。より特定の実施形態において、本発明の第２の融合ペプチドは、配列番号３に対して、７０％、８０％、９０％、または１００％未満同一であるアミノ酸配列を備える。本発明の融合タンパク質は、配列番号１を含まない。

本発明によって提供される他の型の融合タンパク質としては、分泌シグナルおよび他の異種機能領域との融合物が挙げられるが、これらに限定されない。従って、例えば、さらなるアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域がタンパク質のＮ末端に加えられて、精製の間または引き続く取り扱いおよび貯蔵の間に、宿主細胞中での安定性および持続性を改善してもよい。

さらなる融合タンパク質には、細胞膜を超えたタンパク質の移行を増強するための融合物が含まれる。例えば、Ｔａｔは、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の複製に関与する８６アミノ酸タンパク質である。ＨＩＶ−１ Ｔａｔトランス活性化タンパク質は、細胞によって効率的に取り込まれ、ＨＩＶ−１プロモーターから発現されたレポーター遺伝子をトランス活性化するためには低濃度（ｎＭ）で十分であることが実証されている。外因性Ｔａｔタンパク質は細胞膜を超えて移行することができ、ウイルスゲノムをトランス活性化するために核に到達する。Ｔａｔペプチドが媒介する細胞の取り込みおよび核移行は、いくつかの系において実証されている。いくつかのタンパク質へのＴａｔ誘導ペプチド（Ｔａｔの残基３７〜７２）の化学カップリングは、いくつかの細胞株または組織においてそれらの内在化を生じる（Ｆａｗｅｌｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，６６４−６６８）。

塩基性アミノ酸のクラスターの中心にあるＴａｔタンパク質の領域は、この移行活性の原因であることが周知である。フルオレセインマレイミドに結合したＣ末端のシステイン残基を有する、Ｔａｔ塩基性アミノ酸４８〜６０からなる合成ペプチドは、蛍光顕微鏡法によって決定されるように、細胞核に移行する。加えて、β−ガラクトシダーゼアミノ酸９〜１０２３にＴａｔアミノ酸のアミノ末端により融合したＴａｔアミノ酸４８〜５９からなる融合タンパク質（Ｔａｔ−ＮＬＳ−β−Ｇａｌ）は、ＡＴＰ依存性で細胞質因子非依存性の様式で細胞核に移行する。従って、本発明の融合タンパク質は、Ｔａｔタンパク質塩基性ペプチドモチーフ３７−７２（３７−ＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱ−７２（配列番号４）の任意の連続する残基などの、ＨＩＶ−Ｔａｔのすべてまたは一部を備えてもよい。アミノ酸残基の最小数は、約３から約６までの範囲であり得る。１つの実施形態において、融合タンパク質のＴａｔ部分は、約３個から約５個までの長さの連続するアミノ酸である。別の実施形態において、融合タンパク質のＴａｔ部分は約４アミノ酸長、すなわち、１つのアルファへリックスターンのための最小限の要件である。別の実施形態において、融合タンパク質のＴａｔ部分は、Ｔａｔタンパク質残基４８〜５７（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号５）を備える。

融合タンパク質のさらなる態様において、精製を容易にするための領域が加えられてもよい。例えば、「ヒスチジンタグ」（「ｈｉｓタグ」）または「リジンタグ」（第２の融合ペプチド）が、第１の融合ペプチドに付加されてもよい。ヒスチジンタグの例としては、ヘキサＨ、ヘプタＨ、およびヘキサＨＮが挙げられるが、これらに限定されない。リジンタグの例としては、ペンタＬ、ヘプタＬ、およびＦＬＡＧが挙げられるが、これらに限定されない。このような領域は、タンパク質の最終調製の前に除去されてもよい。第２の融合ペプチドの他の例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。

とりわけ安定性を改善するため、および精製または移行を容易にするためのタンパク質へのペプチド部分の付加は、分泌を生じさせるためであるか排出を生じさせるためであるかに拘わらず、当該分野においてよく知られておりかつ日常的な技術であり、タグを収容するために末端のアミノ酸を修飾することを含んでもよい。例えば、配列番号２において、Ｎ末端アミノ酸は、タグを収容するために、例えばアルギニンおよび／またはセリンに修飾されてもよい。当然、Ｃ末端のアミノ酸残基もまた、タグを収容するために修飾されてもよい。１つの特に有用な融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために使用できる免疫グロブリンからの異種領域を備える。例えば、ＥＰ Ａ０４６４ ５３３は、別のヒトタンパク質またはその一部と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を備える融合タンパク質を開示している。多くの場合において、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断における使用、およびそれによる結果のために、例えば薬物動態学的特性の改善において、非常に有利である（ＥＰ Ａ０２３２ ２６２）。一方、ある用途のために、融合タンパク質が、記載された有利な様式で発現され、検出され、精製された後で、Ｆｃ部分を削除できることが所望される。

本発明の融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製できる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）もまた、精製のために使用することができる。融合タンパク質が単離および／または精製の間に変性されるとき、タンパク質を再フォールディングするための周知の技術を、活性コンホメーションを再生するために使用してもよい。

本発明の融合タンパク質としては、化学合成手順の産物や、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む、原核生物または真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物が挙げられるが、これらに限定されない。組換え産生手順において使用される宿主に応じて、本発明の融合タンパク質は、グリコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくてもよい。加えて、本発明の融合タンパク質はまた、ある場合において、宿主媒介性プロセスの結果として、開始修飾メチオニン残基を含んでもよい。

本発明はまた、単離された核酸、およびこれらの核酸を備える構築物に関する。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡであり得る。核酸分子は二本鎖または一本鎖であり得；一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、コード鎖もしくはセンス鎖、または非コード鎖もしくはアンチセンス鎖であり得る。特に、核酸は、本発明の融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない本発明の任意のポリペプチドをコードしてもよい。例えば、本発明の核酸は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、ポリ−ヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）、ポリ−ＨＮ、ポリ−リジン、ヘマグルチニン、ＨＳＶ−ＴａｇおよびＨＩＶ−Ｔａｔの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む。所望される場合、単離された核酸のヌクレオチド配列は、非コード３’および５’配列などのさらなる非コード配列（例えば、調節配列を含む）を含むことができる。

ある実施形態において、本発明の単離された核酸は、さらに、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも９５％同一である核酸配列からなる核酸に関する。さらなる実施形態において、従って、本発明は、配列番号６の核酸配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列からなる核酸を提供する。

本発明の核酸分子は「単離される」ことができる。本明細書で使用される場合、「単離された」核酸分子またはヌクレオチド配列は、遺伝子もしくはヌクレオチド配列に通常は隣接しているヌクレオチド配列によって隣接されないか（ゲノム配列中の場合）および／またはそのネイティブな環境（例えば、細胞、組織）から完全にもしくは部分的に取り出されている、核酸分子またはヌクレオチド配列を意味することが意図される。例えば、細胞から取り出された、または精製された核酸分子は、単離されたものと見なされる。ある例において、単離された物質は、組成物（例えば、他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝系、または混合試薬の一部を形成する。他の状況において、材料は、例えば、ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーによって決定されるように、ほぼ均質になるまで精製されてもよい。従って、単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を使用して、または任意の他の適切な方法を使用して化学的に合成された核酸分子またはヌクレオチド配列を含むことができる。明確に述べると、ベクター中に含有される核酸は、本明細書で使用されるような「単離された」の定義に含まれる。また、単離されたヌクレオチド配列には、異種生物中での組換え核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ならびに溶液中の部分的または実質的に精製された核酸が含まれる。一方、「精製された」は、当該分野において十分に理解されており、一般には、核酸分子が、おそらくは緩衝液または溶媒は別として、細胞材料、細胞成分、化学前駆体、または他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。「実質的に含まない」は、新規な核酸分子以外の他の成分が検出できないことを意味することを意図するのではない。本発明の核酸分子は、単離または精製されてもよい。本発明のＤＮＡ分子のインビボとインビトロの両方のＲＮＡ転写物もまた、「単離された」ヌクレオチド配列に包含される。

本発明はまた、上記のようなポリペプチドの機能的フラグメントまたは改変体をコードする配列などの、本発明のヌクレオチド配列のバリエーションを包含する。このような改変体は、天然に存在するか、または天然に存在しないものであり得、例えば、様々な変異原および変異原性プロセスによって誘導される改変体などである。意図されるバリエーションとしては、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、および置換が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、付加および欠失を含む保存的または非保存的アミノ酸変化を生じ得る。

本明細書に記載された発明はまた、本明細書に記載された単離された核酸分子のフラグメントに関する。「フラグメント」という用語は、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチドから少なくとも約５０個以上連続するヌクレオチドの長さである、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の一部を包含することを意図する。このようなフラグメントは、プローブおよびプライマーとして有用である可能性がある。特に、プライマーおよびプローブは、本明細書に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズしてもよい。例えば、以下に記載するように、活性を保持するポリペプチドをコードするフラグメントが特に有用である。

本発明はまた、本明細書に記載されたヌクレオチド配列に対して、例えば、選択的ハイブリダイゼーションのために、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子も提供する（例えば、本明細書に記載されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、かつ修飾成長因子をコードする核酸分子）。ハイブリダイゼーションプローブとしては、核酸の相補鎖に対して、塩基特異的な様式で結合する合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。

このような核酸分子は、特異的ハイブリダイゼーションによって、例えば、高ストリンジェンシー条件下で、検出および／または単離できる。ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェンシー条件」は、特定の核酸の第２の核酸へのハイブリダイゼーションを許容する、インキュベーションおよび洗浄の条件、例えば、温度および緩衝液濃度の条件をいう当該分野の用語であり；第１の核酸が第２の核酸に対して完全に相補的、すなわち１００％であってもよく、または第１の核酸および第２の核酸は、完全未満、例えば６０％、７５％、８５％、９５％以上である、ある程度の相補性を共有してもよい。例えば、完全に相補的な核酸をより低い相補性の核酸から区別する、特定の高ストリンジェンシー条件が使用できる。

核酸ハイブリダイゼーションのための「高ストリンジェンシー条件」、「中程度のストリンジェンシー条件」および「低ストリンジェンシー条件」は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓの中で説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、洗浄緩衝液のイオン強度、例えば０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、温度、例えば室温、４２℃、６８℃など、およびホルムアミドなどの不安定化剤またはＳＤＳなどの変性剤の濃度のみならず、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチパーセント、および他の同一でない配列の中のその配列のサブセットの存在の頻度などの因子にも依存する。従って、高、中程度、または低ストリンジェンシー条件は、経験的に決定してもよい。

ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーのレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまでハイブリダイゼーション条件を変化させることによって、所定の配列がサンプル中の最も類似の配列とハイブリダイズすることを許容する条件が決定できる。例示的な条件は、Ｋｒａｕｓｅ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２００：５４６−５５６に記載されている。洗浄は、ハイブリッドの相補性の最低レベルを決定するために条件が通常設定される工程である。一般に、ＳＳＣ濃度を一定に保持しながら、相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度から開始して、最終洗浄温度が１度（℃）低下するごとに、ハイブリダイズする配列間でのミスマッチの最大範囲が１％増加する。一般に、ＳＳＣの濃度を２倍にすると、Ｔｍが増加する。これらのガイドラインを使用して、洗浄温度は、求めるミスマッチのレベルに応じて、高、中程度、または低ストリンジェンシーについて経験的に決定できる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、３７℃での５０％ ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および６０℃での０．１×ＳＳＣでの洗浄が挙げられるが、これに限定されない。次第に高くなるストリンジェンシー条件の例としては、ハイブリダイゼーション後、ほぼ室温での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳでの洗浄（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳでの洗浄（中程度ストリンジェンシー条件）；ならびに約６８℃での０．１×ＳＳＣでの洗浄（高ストリンジェンシー条件）が挙げられる。洗浄は、これらの条件の１つのみ、例えば、高ストリンジェンシー条件のみを使用して実施でき、洗浄は、ストリンジェンシーが低い方から順に２つ以上のストリンジェンシー条件を包含してもよい。最適条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変動し、経験的に決定できる。

等価な条件は、当該分野において公知であるように、標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブとの間の同一性または類似性の類似の程度を維持しながら、１つの例として与えられたパラメーターのうち１つ以上を変化させることによて決定できる。ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、例えば、本発明の核酸を備える生物の同定のため、および／または本発明の核酸を単離するためのプローブおよびプライマーとして有用である。「プライマー」という用語は、当該分野におけるのと同様に本明細書で使用され、適切な緩衝液中および適切な温度で適切な条件下で、鋳型によって方向付けられるＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さはプライマーの意図する用途に応じて決まるが、典型的には、約１５〜約３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般に、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を要求する。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。「プライマー部位」という用語は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域をいう。「プライマー対」という用語は、増幅されるＤＮＡ配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマー、および増幅される配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含むプライマーのセットをいう。

本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のタンパク質の産生に関する。

本発明のこの態様に従って、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖ファージベクター、または一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクターであってもよい。このようなベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するための周知の技術によって、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡとして細胞に導入されてもよい。ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であってもよい。後者の場合において、ウイルス伝播は、一般に、宿主細胞を相補する際にのみ起こる。

ある点において、使用されるベクターは、本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質の発現のためのものである。一般に、このようなベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主における発現のために有効であるシス作用性制御領域を備える。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され、相補ベクターによって供給され、または宿主への導入の際にベクターそれ自体によって供給される。

非常に多様な発現ベクターが、本発明のタンパク質を発現するために使用できる。このようなベクターとしては、染色体、エピソーム、およびウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来ベクター、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにこれらの組み合わせに由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメントに由来するベクター、例えばコスミドおよびファージミドが挙げられる。すべてを本発明のこの態様に従う発現のために使用することができる。一般に、宿主中でポリヌクレオチドまたはタンパク質を維持、増殖、または発現させるために適切な任意のベクターを、この点において発現のために使用することができる。

発現ベクター中のＤＮＡ配列は、例えばｍＲＮＡ転写を方向付けるためのプロモーターを含む、適切な発現制御配列に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表としては、周知のプロモーターのほんのいくつかの例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＨＩＶプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、発現構築物は、転写、開始、および終結のための部位、ならびに転写領域の中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分には、翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳を開始するＡＵＧ、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）が含まれる。

加えて、構築物は、発現を調節するとともに発現を生じさせる制御領域を含有してもよい。一般に、このような領域は、転写を制御することによって作動し、例えば、とりわけリプレッサー結合部位およびエンハンサーである。

増殖および発現のためのベクターは、一般に、選択可能マーカーを含む。このようなマーカーは増幅のためにもまた適切であってもよく、またはベクターはこの目的のためのさらなるマーカーを含有してもよい。この点に関して、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための１つ以上の選択可能マーカーを含有してもよい。好ましいマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌を培養するためのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター、および他の適切な制御配列を含有するベクターは、所望のポリペプチドの宿主中での発現のために適切な様々な周知の技術を使用して、適切な宿主に導入されてもよい。適切な宿主の代表的な例としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞であるがこれらに限定されない細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。非常に様々な発現構築物のための宿主が周知であり、当業者は、本開示によって本発明のタンパク質のうちの１つを発現するために適切な宿主を選択することができる。

融合タンパク質のために有用であり得るベクターの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。しばしば、融合物発現ベクターにおいて、タンパク質分解的切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されることにより、融合タンパク質の精製に続いて融合部分からの組換えタンパク質の分離が可能になる。このような酵素およびこれらの同種認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。

酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６，２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０，９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４，１１５−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。

あるいは、修飾成長因子は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために使用可能であるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６ ２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０，３１−３９）が挙げられる。

なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９，８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６，１８７ １９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用されるとき、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供されることが多い。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、２型アデノウイルス、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０から誘導される。原核細胞と真核細胞の両方のための他の適切な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。

別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型の中で優先的に、核酸の発現を方向付けることが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸を発現するために使用される）。組織特異的調節エレメントは当該分野において公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、ほんのいくつか例を挙げると、肝臓特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）、例えば、Ｔ細胞受容体および免疫グロブリンであるがこれらに限定されないリンパ系特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター）、膵臓特異的プロモーター、乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター）、骨特異的プロモーター（例えば、オステオカルチン、オステオポンチン、または骨シアロプロテイン、プロモーター領域）、軟骨特異的プロモーター（例えば、ＷＡＲＰ）、および筋肉特異的プロモーター（デスミン、ミオグロビンなど）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３７４ ３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３，５３７ ５４６）である。

本発明はまた、上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞であり得、あるいは宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であり得る。宿主細胞は、構築物で安定にまたは一過性にトランスフェクトできる。ポリヌクレオチドは、単独でまたは他のポリヌクレオチドとともに導入されてもよい。このような他のポリヌクレオチドは、独立して導入され、同時導入され、または本発明のポリヌクレオチドに結合させて導入されてもよい。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、通常は本発明のヌクレオチドのいずれも含有せず、本発明のヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含有する細胞である。従って、本明細書で使用される場合、宿主細胞は培養環境の中にある細胞であり得、または宿主細胞は、宿主細胞が生物、器官、または組織の一部である生物環境の中にあり得る。

本発明のポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母、および真核生物が挙げられるが、これらに限定されない。原核生物発現ベクターが使用される場合、適切な宿主細胞は、クローニングされた配列を発現可能である任意の原核細胞である。適切な原核細胞としてには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の細菌が挙げられるが、これらに限定されない。

真核生物発現ベクターが使用される場合、適切な宿主細胞は、クローニングされた配列を発現可能である任意の真核細胞である。１つの実施形態において、真核細胞は高等真核生物の細胞である、適切な真核細胞としては、非ヒト哺乳動物組織培養細胞およびヒト組織培養細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の宿主細胞としては、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒト２９３細胞、およびマウス３Ｔ３線維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

加えて、酵母細胞を宿主細胞として使用することができる。酵母細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、酵母宿主は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミドからの複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有してもよい。酵母とＥ．ｃｏｌｉの両方における複製のためのシャトルベクターもまた、本発明に含まれる。

宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって行うことができる。

哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞のほんの少量のみがそれらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般に、関心対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。様々な選択可能マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択可能マーカーをコードする核酸は、修飾成長因子をコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入でき、または別個のベクター上で導入できる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定できる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するのに対して、他の細胞は死滅する）。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現される。

上記のように調製される修飾成長因子発現ベクターは、リン酸カルシウム法およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない任意の公知の方法によって、ＣＨＯ細胞に導入される。

発現ベクターを有する形質転換体は、上述の選択可能マーカーに基づいて選択される。選択可能マーカーを使用する形質転換体の反復クローン選択により、修飾成長因子構築物を発現する安定な細胞株の選択が可能になる。選択培地の濃度の増加により、所望の修飾成長因子の遺伝子発現およびより高い発現が可能になる。組換え修飾成長因子を含有する宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞は、修飾成長因子構築物を構成的に発現する、修飾成長因子発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞を培養することによって産生できる。

従って、本発明はまた、修飾成長因子が発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および上記タンパク質を回収することを備える、修飾成長因子を製造する方法に関する。本発明のタンパク質を発現するために要求される培養条件は、本発明のポリヌクレオチドを保有している宿主細胞に応じて決まる。各々の細胞型についての培養条件は当該分野において周知であり、必要な場合、容易に最適化できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸を備える構築物は、核酸が本明細書に記載されたような１つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結されるように、選択された宿主細胞に対して適切な方法、例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染によって適切な宿主細胞に導入できる。宿主細胞は、インビトロまたはインビボでの発現のために適切な条件下で維持でき、それによって、コードされたポリペプチドが産生される。例えば、宿主細胞は、タンパク質発現を容易にし得る、インデューサー、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補助剤などを補充した適切な培地の存在下で維持することができる。さらなる実施形態において、本発明の修飾成長因子は、化学合成によって、または任意の他の適切な方法によって、修飾成長因子をコードする核酸のインビトロ翻訳によって産生できる。所望される場合、修飾成長因子は、宿主細胞、またはタンパク質が産生もしくは分泌される他の環境から単離できる。それゆえに、修飾成長因子を産生する方法は、トランスジェニック動物または植物の宿主細胞中でのポリペプチドの発現を包含することが理解されよう。米国特許第６，０１３，８５７号、同第５，９９０３８５号、および同第５，９９４，６１６号を参照のこと。

修飾ＢＭＰ−４が主として細胞内で見い出される状況において、細胞内材料（グラム陰性細菌の封入体を含む）は、当業者に公知である任意の標準的な技術を使用して、宿主細胞から抽出できる。このような方法としては、例としてではあるが限定としてではなく、フレンチプレスによってペリプラスム／細胞質の内容物を放出させるために宿主細胞を溶解すること、均質化、および／または超音波処理、その後の遠心分離が挙げられる。

修飾ＢＭＰ−４が細胞質ゾル中で封入体を形成した場合、このような封入体は、しばしば内側および／または外側の細胞膜に結合し得る。遠心分離の際に、封入体は、主としてペレット材料中に見い出される。次いで、ペレット材料は、封入体を放出し、ばらばらにし、可溶化するために、極端なｐＨで、または洗剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体などの１種以上のカオトロピック剤を用いて、アルカリｐＨでのジチオスレイトールなどの還元剤、または酸性ｐＨでのトリス−カルボキシエチルホスフィンの存在下で処理できる。一旦可溶化されると、修飾成長因子ペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈殿などを使用して分析できる。修飾成長因子ペプチドを単離する様々な方法が当業者に明白であり、例えば、単離は、下記およびＭａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２、２６４−２７５に示される方法のような標準的な方法を使用して達成することができる。

使用された単離手順後に、修飾成長因子ペプチドが生物学的に活性ではない場合、ポリペプチドをその三次元構造に「再フォールディング」または転換するため、およびジスルフィド結合を生成するための様々な方法が、生物学的活性を回復するために使用できる。当業者に公知である方法としては、可溶化ポリペプチドのｐＨを特定のｐＨ、通常は７より高いｐＨに調整すること、および特定濃度のカオトロープの存在が挙げられる。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用される選択に非常に似ているが、通常はより低い濃度であり、必ずしも可溶化のために使用されるのと同じカオトロープではない。タンパク質のシステイン架橋の形成の間に、ジスルフィドシャッフリングを可能にする特定の酸化還元ポテンシャルを生成するために、還元剤、または特定の比率の還元剤プラスその酸化型を使用することが必要である場合がある。一般に使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／システイン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。再フォールディングの効率を上昇させるために、様々な分子量のグリセリン、ポリエチレングリコールなどの共溶媒およびアルギニンを使用することが必要である場合がある。

本発明の修飾成長因子を調製するための他の方法としては、１つの型のＢＭＰ−４をプロテアーゼと接触させることが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、これらの方法は、成熟型のＢＭＰ−４をプロテアーゼと接触させて、本発明の修飾成長因子を産生することを備える。１つの実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはグルタミン酸プロテアーゼである。このようなプロテアーゼの例は当該分野において周知であり、これらとしては真核生物と原核生物の両方の供給源からのプロテアーゼが挙げられる。セリンプロテアーゼの例としては、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、スブチリシン、およびアルファ／ベータヒドロラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。システインプロテアーゼの例としては、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、いくつかのカテプシン、クロストリパイン、およびパパインが挙げられるが、これらに限定されない。アスパラギン酸プロテアーゼの例としては、いくつかのカテプシン、キモシン、レニン、ペプシン、およびＨＩＶ−１プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。メタロプロテイナーゼの例としては、いくつか例を挙げると、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１８、および膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＭＭＰの多くは当該分野において他の名前で知られており、当業者は、様々な酵素の異名に詳しい。例えば、「コラゲナーゼ」のいくつかはＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１８、およびディスパーゼであり、「ゼラチナーゼ」のいくつかはＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１２であり；「ストロメリシン」のいくつかはＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、およびＭＭＰ−１１であり、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼのいくつかはＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−２４、およびＭＭＰ−２５である。コラゲナーゼは、ネイティブなコラーゲンまたはゼラチンを分解するメタロプロテイナーゼの例である。多様な微生物および多くの様々な型の動物細胞がコラゲナーゼを産生する。細菌コラゲナーゼは、組織を消化し、個々の細胞を単離するために実験室内で使用されることが多い。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）によって産生されるコラゲナーゼは、様々な型のコラーゲンおよびゼラチンを分解する亜鉛メタロプロテイナーゼである。メタロプロテイナーゼのさらなる例は、例えば、アスタシン、トロイド、キソロイド、哺乳動物トロイド様（ｍＴＬＬ）、ＢＭＰ−１、メプリンＡおよびＢ、ならびにマトリライシンなどであるがこれらに限定されないアスタシンファミリーのメタロプロテイナーゼ、ならびにＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−２、ＡＤＡＭＴＳ−３、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５などであるがこれらに限定されないアグリカナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）ファミリーのメタロプロテイナーゼである。

当然、これらの方法は、連続的にまたは同時に、１つの型のＢＭＰ−４を１種より多くのプロテアーゼと接触させることを含む。加えて、本明細書で使用されるプロテアーゼは、組換え体であり得るか、または様々な供給源から単離され得る。本明細書で使用されるプロテアーゼは、成熟型ＢＭＰ−４と同じ細胞または動物の供給源から単離される必要はない。例えば、多くのプロテアーゼは、原核生物中でのみ見い出されるが、それでもこれらのプロテアーゼは、真核生物からのタンパク質に対して機能的である。酵素活性に影響を与える因子としては、緩衝液の塩濃度、ｐＨ、および温度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、使用される酵素に基づいて、ペプチド切断を促進するために必要な条件を容易に理解する。

ある実施形態において、プロテアーゼの量対成長因子の量の比率は、プロテアーゼ約１モル：成長因子１０００モル〜約１０００モル：１モル、プロテアーゼ約１モル：成長因子１００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１０モル：１モル、または約１モル：１モル〜約１０モル：１モルであってもよい。さらなる実施形態において、コラゲナーゼの量対成長因子の量の比率は、コラゲナーゼ約１モル：成長因子１００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１００モル：１モル、または約１モル：１モル〜約１０モル：１モルであってもよい。トリプシンの量対成長因子の量の比率は、トリプシン約１モル：成長因子１０００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１００モル：１モル、または約１モル：１０モル〜約１０モル：１モルであってもよい。クロストリパインの量対成長因子の量の比率は、クロストリパイン約１モル：成長因子１０００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１００モル：１モル、または約１モル：１モル〜約１０モル：１モルであってもよい。ディスパーゼの量対成長因子の量の比率は、ディスパーゼ約１モル：成長因子１０００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１００モル〜約１０００モル：１モル、約１モル：１０モル〜約１００モル：１モル、または約１モル：１０モル〜約１０モル：１モルであってもよい。

ある実施形態において、プロテアーゼを用いての成長因子の処理は、約０℃〜約４０℃、約４℃〜約４０℃、または約３７℃以下の温度で実施してよい。特定の実施形態において、成長因子を、約３０分間〜３日間の間、約１時間〜約４８時間の間、約２時間〜約４８時間の間、または約２時間〜約２４時間の間、コラゲナーゼで処理してもよい。成長因子を、約５分間〜３日間の間、約１５分間〜約４８時間の間、約１５分間〜約２４時間の間、または約３０分間〜約１８時間の間、トリプシンまたはクロストリパインで処理してもよい。成長因子を、約５分間〜２日間の間、約１５分間〜約２４時間の間、約１５分間〜約１８時間の間、または約１５分間〜約８時間の間、ディスパーゼで処理してもよい。すべてのこれらの条件は、処理混合物中での余分のタンパク質またはペプチド基質を計算に入れていない。処理は、混合および／またはインキュベーションを含んでもよい。インキュベーションは、静的または動的な条件下で実施されてもよく、例えば、かき混ぜ、振盪、撹拌、混合、水平運動、揺らし、およびその他を用いる。

ある実施形態において、プロテアーゼは組換えタンパク質またはペプチドフラグメント、化学合成したタンパク質またはペプチドフラグメントであってもよく、あるいはプロテアーゼは、天然の供給源から抽出され、任意に、例えば、切断、熱不活化、化学修飾、または他の方法によって修飾されてもよい。他の実施形態において、プロテアーゼの酵素活性の特定の態様は、阻害または変更されてもよく、変更した活性を有するプロテアーゼを、成長因子の生物学的活性を変化させるために、１種以上の成長因子に加えてもよい。

さらなる実施形態において、プロテアーゼの活性を、少なくとも１種の成長因子のプロテアーゼでの処理の前、その間、またはその後に調節してもよい。例えば、コラゲナーゼのプロテアーゼ活性は、成長因子を処理するために使用される前に顕著に減少させてもよい。別の例において、プロテアーゼの活性を、細胞への投与の前、その間、またはその後に調節してもよい。特定の実施形態において、プロテアーゼの活性を、とりわけ、熱不活化、放射線不活化、、プロテアーゼ基質中和、または化学阻害を備える方法によって調節してもよい。メタロプロテイナーゼの活性を調節するために使用される化学阻害剤は、ＥＤＴＡなどの金属キレート剤；Ｎ−エチルマレイミド、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、およびロイペプチンなどのシステインおよびセリンプロテアーゼ阻害剤；ホスホラミドンおよびベスタチンなどの古典的メタロプロテイナーゼ阻害剤；α２−マクログロブリンなどの一般的なタンパク質阻害剤、または、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４などの天然もしくは合成のメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）；ならびに他の阻害剤から選択してよい。

これらの方法において使用されるＢＭＰ−４の型は組換え体でもあり得、または種々の細胞もしくは動物の供給源から単離できる。本発明の１つの実施形態において、少なくとも１種のプロテアーゼと接触させられる任意の型のＢＭＰ−４は、組換えＢＭＰ−４である。１つの特定の実施形態において、組換えＢＭＰ−４はメタロプロテイナーゼと接触させられて、新規な短縮型の本発明のＢＭＰ−４ペプチドを生成する。より特定の実施形態において、組換えＢＭＰ−４はコラゲナーゼと接触させられて、新規な短縮型の本発明のＢＭＰ−４ペプチドを生成する。さらにより特定の実施形態において、コラゲナーゼと接触させられる組換えＢＭＰ−４は、組換え成熟型のＢＭＰ−４である。なおより特定の実施形態において、組換え成熟ＢＭＰ−４はコラゲナーゼおよび／またはクロストリパインと接触させられて、新規な短縮型の本発明のＢＭＰ−４ペプチドを生成する。別の特定の実施形態において、組換え成熟ＢＭＰ−４はトリプシンまたはディスパーゼと接触させられて、新規な短縮型の本発明のＢＭＰ−４ペプチドを生成する。

一旦、少なくとも１種のプロテアーゼで処理されると、ある実施形態において、生じるペプチドは、当該分野における日常的な方法を使用して単離および精製される。精製方法の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、ウェスタンブロッティングおよび引き続く膜の処理が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態において、プロテアーゼ処理後に精製される得られるペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を備える。他の実施形態において、プロテアーゼで処理された後で、得られるペプチドは単離または精製されず、プロテアーゼの存在下で細胞に投与される。別の実施形態において、得られるペプチドは単離または精製され、次いでプロテアーゼとともに細胞に投与される。さらに別の実施形態において、プロテアーゼでの処理後、単離および精製せずに、得られるペプチドはプロテアーゼの存在下で細胞に投与され、次いで別のプロテアーゼが一緒に投与される。

本発明の修飾成長因子ペプチドはまた、固相合成技術を使用する合成方法によって調製されてもよい。合成されたポリペプチドは、適切な条件下で正確なフォールディングパターンに再生されてもよく、適切な緩衝液および条件を使用して生物活性二量体が単量体から誘導できる。正確にフォールディングした二量体は、適切なカラムを使用して単量体からさらに分離されて、機能的生物活性因子の収率を増大させてもよい。

調製の方法が、組換え的であるか、酵素的であるか、合成的であるかに拘わらず、単量体または二量体としての新規な修飾成長因子は、組成物として調製することができる。１つの実施形態において、この組成物は薬学的組成物である。例えば、１種以上のコファクターを本発明の短縮型成熟生物活性因子に加えて組成物を形成してもよい。加えてもよいコファクターとしては、ヘパリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、アルブミン、プロテオグリカン、コラーゲン、ゼラチン、二価カチオン、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはリン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、タンパク質またはタンパク質フラグメントを、本発明の修飾成長因子ペプチドに対するコファクターとして加えてもよい。

核酸分子またはポリペプチドを備える組成物または薬学的組成物は、典型的には、核酸分子またはタンパク質、および薬学的に許容されるキャリアを備える。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」または「薬学的キャリア」は、薬学的投与と適合可能である溶媒、分散媒、コーティング、抗微生物剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのすべてを含むことが意図される。薬学的キャリアまたは他の成分の性質は、具体的な投与経路および投与される本発明の特定の実施形態によって決まる。この状況において有用である技術およびプロトコルの例は、特に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０１０），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて見い出される。このような薬学的なキャリアまたは希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム、および固定油などの非水性ビヒクルもまた使用してよい。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または剤が活性化合物と適合可能でない場合を除き、組成物中でのその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。

本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合可能であるように製剤化される。投与経路の例としては、経口および非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸投与）が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液としては、注射用の水などの滅菌希釈液、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節するための剤を挙げることができるが、これらに限定されない。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整できる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアルの中に封入できる。

注射用途のために適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および注射可能な滅菌溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために適切な薬学的キャリアとしては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は滅菌状態でなければならず、容易にシリンジを通過する程度の流動性を有するべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。薬学的キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。適度な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合において、糖類などの等張剤、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどのポリアルコールを組成物中に含めることが所望され得る。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。

滅菌注射溶液は、活性化合物（例えば、修飾成長因子）を、要求される量で、上記に列挙した成分の１つまたはその組み合わせとともに適切な溶媒に導入することによって、そして要求される場合、その後のろ過滅菌によって調製できる。一般に、分散液は、上記に列挙したものの中からの基本分散媒および要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を導入することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、以前に滅菌ろ過したその溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末が生じる。

経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食の薬学的キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入したり、錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに導入することができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの剤形で使用できる。経口組成物は、マウスウォッシュとしての使用のために液体薬学的キャリアを使用してもまた調製でき、ここで、液体薬学的キャリア中の化合物は、経口的に適用され、口をすすいだ後にはき出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、類似の性質の以下の成分または化合物のいずれかを含有してもよく、これらは、例えば、微結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味料、あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの香料であるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、活性化合物は、移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、身体からの迅速な排出から化合物を保護する薬学的キャリアを用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生物分解性の生物適合性ポリマーが使用できる。このような製剤の調製のための方法は当業者には明白である。これらの材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からも市販されている。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されているリポソームを含む）も、薬学的に許容されるキャリアとして使用できる。これらの組成物は、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知である方法に従って調製できる。投与の容易さおよび投薬の均一性のために、単位剤形で経口または非経口組成物を製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される場合、単位剤形とは、治療される被験体のための単位剤形として適している物理的に別個の単位をいい；各単位が、要求される薬学的キャリアと関連して所望の治療効果を生じるように計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有する。本発明の投薬量単位剤形の詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療効果によって、これらに直接的に依存して決まる。

薬学的組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサーの中に含めることができる。

ＢＭＰ−４ペプチドの投薬量は、治療される疾患の状態または症状、ならびにヒトまたは動物の体重および状態などの他の臨床的因子、ならびに化合物の投与経路によって決まる。ヒトまたは動物を治療するために、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の化合物が投与できる。治療は、典型的には、これより低い用量で投与でき、所望の治療結果が観察されるまで継続される。

患者に投与される化合物の投薬量および生物に化合物を投与する様式を決定する方法は、例えば、ＷＯ ９６／２２９７６に開示されている。当業者は、このような説明が本発明に適用可能であり、本発明に容易に適合させることができることを理解している。

適切な投薬量は、治療される疾患の種類、使用される特定の組成物、および患者のサイズおよび生理学的状態などの様々な因子によって決まる。本明細書に記載された化合物の治療的に有効な用量は、最初は細胞培養物および動物モデルから見積もることができる。例えば、細胞培養アッセイにおいて決定されるＩＣ５０を最初に考慮に入れた循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおける用量を製剤化できる。動物モデルデータは、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用できる。

本発明はまた、細胞を本発明のペプチドのうち少なくとも１種と接触させることを備える、細胞の細胞内シグナル伝達を変化させる方法に関し、ここで、細胞は、本発明の修飾成長因子に特異的に結合する受容体を保有する。これらの方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型であり得る。修飾成長因子のその受容体への特異的結合は、次には、通常は非修飾型の成長因子と関連する細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。例えば、「成熟」型のＢＭＰ−４は、通常、そのＩ型および／またはＩＩ型受容体、例えばＢＭＰＲ１Ａに結合する。これらの受容体は、Ｓｍａｄタンパク質ファミリーを含む細胞質標的をリン酸化する。Ｓｍａｄは、ＴＧＦ−β分泌ポリペプチドスーパーファミリーについての細胞内シグナル伝達エフェクターとして機能するタンパク質のクラスである。活性化Ｉ型ＢＭＰ受容体は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ ５、および／またはＳｍａｄ ８をリン酸化する。リン酸化されたＳｍａｄ １、５、および８タンパク質は、次には、Ｓｍａｄ ４と複合体を形成し、次いで核に移行し、標的遺伝子の発現を調節する転写因子と相互作用する。

従って、本発明は、細胞と少なくとも１種の本発明の修飾成長因子とを接触させることを備える、細胞中でのＳｍａｄ １、Ｓｍａｄ ５および／またはＳｍａｄ ８のリン酸化を刺激する方法を提供する。これらの方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型であり得る。Ｓｍａｄタンパク質をリン酸化することに関する新規なペプチドの活性は、正常な成熟成長因子と比べて、変更されてもよいしされなくてもよい。例えば、新規な修飾成長因子は、正常な成熟成長因子の受容体結合と比較して、Ｓｍａｄ １、５、および／または８のリン酸化を増加または減少させてよい。別の例として、新規な修飾成長因子は、正常な成熟成長因子の受容体結合と比較して、その受容体に対して、より強固にまたはより緩やかに結合してもよい（より低いＫｄ）。当業者は、レポーター遺伝子の転写、ＥＬＩＳＡアッセイなどの周知の技術を使用して、特定のタンパク質が対照群と比較してより高度にリン酸化されるかリン酸化の程度が低いかを容易に決定できる。本発明のさらなる方法は、細胞を本発明の新規なペプチドと接触させる前と後の両方で、Ｓｍａｄ、例えば、Ｓｍａｄ １、Ｓｍａｄ ５、またはＳｍａｄ ８のリン酸化のレベルを評価すること、および本発明の新規なペプチドに応答したＳｍａｄリン酸化の増加または減少を決定することを備える。

別の実施形態において、本発明は、細胞または細胞の集団におけるプロモーター活性を刺激する方法を提供し、ここで、プロモーターは、活性化されたＳｍａｄ複合体に対して応答性であり、これらの方法は、細胞を少なくとも１種の本発明の修飾成長因子ペプチドと接触させることを備える。これらの方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、ヘテロ二量体型であり得る。当業者は、活性化されたＳｍａｄ複合体に応答するプロモーターを知っている。例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ（２０００）Ｃｅｌｌ，１０３：２９５−３０９を参照のこと。Ｓｍａｄ応答性プロモーターを刺激することに関する新規なペプチドの活性は、正常な成熟成長因子と比較して変更されてもよいしされなくてもよい。例えば、新規な修飾成長因子は、正常な成熟成長因子の受容体結合と比較して、Ｓｍａｄ応答性プロモーターの活性化をを増加または減少させてもよい。当業者は、レポーター遺伝子の転写、ＥＬＩＳＡアッセイなどの周知の技術を使用して、プロモーターが対照群と比較してより高度に活性化されるか活性化の程度が低いかを容易に決定できる。本発明のさらなる方法は、細胞を本発明の新規なペプチドと接触させる前と後の両方で、Ｓｍａｄ応答性プロモーターの活性を評価すること、および本発明の新規なペプチドに応答したプロモーターの増加または減少を決定することを備える。

本明細書で使用される場合、「接触させること」は、本発明の方法との関連で使用される場合、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型の新規なペプチドを標的細胞の近傍に持って行き、その結果、特異的結合事象または生物学的効果が可能になることを意味する。このように、接触させることは、培養培地中に新規なペプチドを加えること、および培養中の細胞に培養培地を適用することを含むことができる。接触させることはまた、本明細書に記載された少なくとも１種のベクターで細胞をトランスフェクトすること、および細胞が修飾成長因子を産生することを可能にすることを包含する。当然、接触させることはまた、インタクトな生物中の細胞への、本発明の修飾成長因子ペプチド、またはその薬学的組成物の投与を含む。本発明の新規なペプチドを投与するための組成物を、本明細書に記載した。

本明細書で使用される場合、「投与すること」および「投与する」は、少なくとも１種の新規な修飾成長因子ペプチドを備える化合物を被験体に導入することを意味するために使用される。投与方法において使用されるペプチドは、単量体型、ホモ二量体型、またはヘテロ二量体型であり得る。投与が治療の目的のためであるとき、この物質は、治療の必要がある徴候または状態の発症の際に、またはその後に提供される。この物質の治療的投与は、任意の徴候を軽減するため、またはさらなる徴候が生じることを予防するために役立つ。投与が状態の発生を予防する目的のためであるとき（「予防的投与」）、この物質は、任意の目に見えるかまたは検出可能な徴候の前に提供される。この物質の予防的投与は、引き続いて生じる徴候を軽減するため、または徴候が生じることを完全に予防するために役立つ。化合物の投与経路としては、本明細書で先に開示したように、局所、経皮、鼻内、膣内、直腸、経口、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、腹腔内、硬膜外、およびくも膜下が挙げられるが、これらに限定されない。

さらに、これらの方法はまた、本発明の新規なペプチドに加えて、１種以上の物質を同時投与することを含む。「同時投与する」という用語は、生物学的活性または効果のそれぞれの期間が重複している時間枠の間に、少なくとも２種の化合物の各々が投与されることを示す。このように、この用語は、本発明の化合物の連続的ならびに同時期の投与を含む。そして化合物を投与することと同様に、２種以上の物質の同時投与は、治療目的および／または予防目的のためであり得る。２種以上の物質が同時投与される場合、２種以上の物質の投与経路は同じである必要はない。

本発明はまた、骨誘導性を促進する方法に関し、これらの方法は、細胞を１種以上の本発明の修飾成長因子ペプチドまたは本明細書に記載された組成物と接触させることを備える。本明細書で使用される場合、「骨誘導性」とは、細胞を、表現型がより骨芽細胞様である細胞に分化させることをいうことがあり、またはこの用語は、骨芽細胞の増殖を増加させることをいうことがあり、またはその両方である。本発明の修飾成長因子ペプチドとの接触前には、これらの細胞は、未分化細胞または部分的に未分化の細胞であってもよい。これらの細胞は、培養物中、または組織、器官、もしくはその一部の中、または生物の中に存在してもよい。新規なペプチドの骨誘導活性は、正常な成熟成長因子と比べて、変更されてもよいしされなくてもよく、変更としては活性の増強が含まれるがこれに限定されない。

本発明はまた、軟骨誘導性を促進する方法に関し、これらの方法は、細胞を１種以上の本発明の修飾成長因子ペプチドまたは本明細書に記載された組成物と接触させることを備える。本明細書で使用される場合、「軟骨誘導性」とは、細胞を、表現型がより軟骨細胞様である細胞に分化させることをいうことがあり、またはこの用語は、軟骨細胞の増殖を増加させることをいうことがあり、またはその両方である。本発明の修飾成長因子ペプチドとの接触前には、これらの細胞は、未分化細胞または部分的に未分化の細胞であってもよい。これらの細胞は、培養物中、または組織、器官、もしくはその一部の中、または生物の中に存在してもよい。新規なペプチドの軟骨誘導活性は、正常な成熟成長因子と比べて、変更されてもよいしされなくてもよく、変更としては活性の増強が含まれるがこれに限定されない。

例えば、本発明は、本明細書に記載された１種以上の修飾成長因子ペプチドまたは組成物の存在下で、細胞を増殖および／または培養することを提供する。「の存在下で、細胞を増殖および／または培養すること」は、伝統的な細胞培養方法、ならびに天然または合成のマトリックスまたは組織中などの任意の環境にある修飾成長因子の存在下に細胞を配置することを含む。細胞は哺乳動物細胞であってもよく、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、その他のものであってよいが、これらに限定されない。ある実施形態において、細胞は、脂肪細胞由来幹細胞、胚性幹細胞、前駆細胞、分化細胞、未分化細胞、および／または誘導多能性幹細胞などの間葉系幹細胞であってもよい。適切な細胞としては、外胚葉系統の細胞、中胚葉系統の細胞、および内胚葉系統の細胞も挙げられ得るが、これらに限定されない。外胚葉系統の細胞の例としては、ケラチノサイト、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞が挙げられるが、これらに限定されない。中胚葉系統の細胞の例としては、筋芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、内皮細胞、または間質細胞が挙げられるが、これらに限定されない。外胚葉系統の細胞としては、耳管、気管、気管支、および肺胞などの気道、胃腸管、膀胱の上皮細胞、ならびにすべての腺の内側の上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞はまた、組織または器官から誘導された初代細胞であり得る。本発明において使用される適切な細胞株としては、間葉細胞株、前骨芽細胞株、骨芽細胞株、および軟骨芽細胞株が挙げられ得るが、これらに限定されない。修飾成長因子ペプチドが投与された細胞は、組織、生物、または骨マトリックスが挙げられるがこれに限定されないマトリックスなどの他の環境に直接的に配置されてもよい。

ある実施形態において、細胞は、自系または同種異系の供給源から誘導されてもよい。これらの細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、および骨膜細胞などの分化した細胞であってもよい。加えて、これらの細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、前駆細胞幹細胞、または成体体性幹細胞であってもよい。幹細胞は、胚、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、月経血、乳歯、髄核、脳、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、筋肉から誘導されてもよい。これらの幹細胞は、骨格筋、平滑筋、および心筋から誘導されてもよい。幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの成熟細胞の遺伝的再プログラミングから誘導されてもよい。

本明細書に記載された任意の細胞を、特定の実施形態において、本明細書に記載された１種以上の修飾成長因子または組成物とともに、約１５分間〜約４週間、約２時間〜約２週間、約２時間〜約１週間、約２時間〜約７２時間、約２４時間〜約７２時間、または約２４時間〜約９６時間の間、約２０℃〜約４０℃または約３０℃〜約３７℃で、約１％ＣＯ_２〜約１０％ＣＯ_２または約４％ＣＯ_２〜約６％ＣＯ_２を含有する雰囲気中で培養してもよい。本発明のある実施形態において、細胞を、１種以上の修飾成長因子、および（１）組織もしくは器官、（２）マトリックス、または（３）これらの組み合わせの存在下で培養してもよい。細胞培養培地中の１種以上の修飾成長因子の存在下で培養された細胞を、特定の実施形態において、引き続き、マトリックス、組織、器官、またはこれらの組み合わせに適用してもよい。

ある実施形態において、処理された細胞は凍結保存される。特定の実施形態において、処理された細胞を保存するために凍結保存剤を使用してもよい。ある実施形態において、処理された細胞はマトリックスに播種され、細胞を播種されたマトリックスを、少なくとも１種の凍結保存剤を使用して保存してもよい。ある実施形態において、少なくとも１種のコファクターを処理された細胞に加えてもよい。任意に使用されてもよいコファクターは、とりわけヘパリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、プロテオグリカン、コラーゲン、またはゼラチンである。特定の実施形態において、二価カチオン、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、またはリン酸ナトリウムを、処理された細胞にコファクターとして加えてもよい。ある実施形態において、タンパク質またはタンパク質フラグメントが、処理された細胞に加えられるコファクターであってもよい。さらなる実施形態において、本明細書に記載されたプロテアーゼが、処理された細胞に加えられるコファクターであってもよい。

特定の実施形態において、凍結保存された処理された細胞は、組織もしくは器官の欠陥、組織、器官、マトリックス、またはこれらの２つ以上の混合物に適用される前に、約１０℃〜約３７℃の温度で任意に復活させられる。特定の実施形態において、処理された細胞は、これらの細胞が組織または器官の欠陥を治療するために使用される前に、１種以上の体液、例えば、とりわけ血液、多血小板血漿、血漿、骨髄、および臍帯血、ならびに等張溶液、低張溶液、または高張溶液、例えば生理食塩水、または乳酸加リンガー液、およびその他と合わせられてもよい。ある実施形態において、処理された細胞は、組織もしくは器官の間に細胞を注入もしくは挿入することによって、または欠陥の上に細胞を配置することによって、組織または器官の欠陥に適用されてもよい。ある実施形態において、修飾成長因子は、インビトロ、インビボ、またはインサイチュで細胞に投与されてもよい。ある実施形態において、修飾成長因子は、組織または器官から単離された、組織または器官の中にある細胞に投与されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１種の修飾成長因子または組成物は、（１）細胞培養培地、（２）組織または器官、（３）マトリックス、または（４）これらの２つ以上の組み合わせの中の細胞に投与されてもよい。

骨誘導性または軟骨誘導性をそれぞれ評価するために測定できる、種々の骨芽細胞または軟骨細胞の分化マーカーが存在している。例えば、細胞は、骨芽細胞株に向かう分化の初期段階の間、アルカリホスファターゼを発現する。それゆえに、インビトロアルカリホスファターゼアッセイを、本発明の修飾成長因子ペプチドと接触させられた細胞中の骨誘導性を評価するために使用することができる。筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）などのアルカリホスファターゼ発現がなければ非骨形成細胞の中でアルカリホスファターゼ発現を刺激または誘導する、本発明の修飾成長因子ペプチドの能力は、本発明の修飾成長因子ペプチドが骨誘導活性を有することを示す。これらのアッセイにおいて、いかなる種の成長因子も加えずに、本発明の修飾成長因子ペプチドを加えずに培養された細胞は、非骨形成細胞上でのベースラインアルカリホスファターゼ発現を示すためのネガティブ対照として使用される。ネガティブ対照における骨芽細胞マーカーのベースラインはゼロである必要はなく、これは、ネガティブ対照群の細胞が少なくともある程度のレベルの骨芽細胞と関連する表現型マーカーを有する可能性があることを意味する。従って、本発明の「骨誘導性」ペプチドは、対照に対して実験細胞中で所定の骨芽細胞マーカーの増加をはっきりと引き起こす。同様に、いくつか例を挙げると、Ｘ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、Ｓｏｘ ９、アグリカン、マトリリン−１、およびＣＥＰ−６８が挙げられるが、これらに限定されない軟骨細胞マーカーは、軟骨誘導性の能力を評価するために使用できる。

さらに、骨誘導性および／または軟骨誘導性は、本発明の修飾成長因子ペプチドが、初代細胞、細胞株、または移植片などの培養細胞中で骨芽細胞表現型または軟骨細胞表現型を分化または誘導する能力を調べることによって、組織培養物中で決定されてもよい。例えば、細胞は、アルカリホスファターゼなどの骨芽細胞および／または軟骨細胞のマーカー特性の産生の増加を示す可能性がある。例えば、修飾成長因子の骨誘導性または軟骨誘導性の能力は、非修飾成長因子と比較して、修飾成長因子について０．２倍、０．４倍、０．６倍、０．８倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍よりも大きい可能性がある。別の例において、修飾成長因子の骨誘導性または軟骨誘導性の能力は、非修飾成長因子と比較して、修飾成長因子について１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、５００倍、またはさらには１０００倍よりも大きい可能性がある。当然、このことは、同じ効果を達成するために必要な非修飾成長因子と比較して、修飾成長因子の濃度が低いことを示す。

筋肉などの場所における本発明の修飾成長因子ペプチドによって誘導される骨または軟骨形成能を評価するために、骨誘導性または軟骨誘導性を、適切な動物モデルを使用して評価してもよい。例えば、齧歯動物への筋肉内移植は、生物活性因子の骨誘導活性を評価するためのモデルとして使用されてきた。

本発明はまた、骨芽細胞および／または軟骨細胞および／または本明細書に開示される任意の細胞型の増殖を促進し、または分化状態を維持する方法に関し、これらの方法は、骨芽細胞または軟骨細胞に、本明細書に記載された修飾成長因子ペプチドまたは組成物を投与することを備える。新規なペプチドの増殖活性は、変更されてもされなくてもよく、これには、正常な成熟成長因子と比べて増強した活性が挙げられるが、これに限定されない。

マイトジェン活性は、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイ、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）、アッセイなどの代謝活性を測定する様々なインビトロアッセイを使用して、修飾成長因子ペプチドによって誘導される細胞増殖を調べることによって評価することができる。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイは、細胞代謝活性を測定するために、非細胞傷害性還元−酸化指標を使用し、これを修飾成長因子のマイトジェン活性を評価するための非破壊的アッセイにする。増殖はまた、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ＤＮＡアッセイの使用などによるＤＮＡ定量化、［３Ｈ］チミジン標識またはＢｒｄＵ取り込みなどのＤＮＡ合成の放射性標識を測定することによってもまた評価できる。増殖はまた、トリパンブルー血球計の使用などの手動細胞計数によっても評価できる。

本発明はまた、少なくとも１種のプロテアーゼおよび成長因子を細胞に投与することを備える、細胞成長因子活性を増加させる方法に関する。プロテアーゼは本明細書に記載されたプロテアーゼであり、コラゲナーゼ、クロストリパイン、ディスパーゼ、トリプシン、ＢＭＰ−１、ＭＭＰ−１３、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、成長因子は本明細書に記載された修飾成長因子を備える。細胞は本明細書に記載された細胞であり、分化細胞、成体幹細胞、前駆細胞、および誘導多能性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。先に記載したように、本明細書に開示されるような成長因子の修飾はまた、ＢＭＰ−４の活性を増強する。特定の実施形態において、本明細書に記載された修飾成長因子と一緒にプロテアーゼを投与することは、骨誘導活性または軟骨誘導活性などの修飾成長因子の活性をさらに増強する。

ある実施形態において、組成物中への本明細書に記載されたプロテアーゼの添加は、同じ組成物中での成長因子の安定性を増強する。先に記載したように、本明細書に開示されるような成長因子の修飾もまた、成長因子の安定性を増強する。特定の実施形態において、修飾成長因子を備える組成物へのプロテアーゼの添加は、修飾成長因子の安定性をさらに増強する。

さらなる実施形態において、細胞成長因子活性を増加させる際に細胞に投与される組成物は、２種以上のプロテアーゼを備える。ある実施形態において、第２のプロテアーゼがプロテアーゼおよび成長因子を備える組成物に混合でき、またはプロテアーゼおよび成長因子を備える組成物とは別個に投与できる。

本発明はさらに、少なくとも１種の修飾成長因子ペプチド、ならびに組織、器官、マトリックス、および／またはこれらの２種以上の混合物を備えた、組織または器官の修復または再生組成物に関する。この組織または器官の修復組成物は、脱灰骨および均質化した結合組織を備えてもよい。

本明細書に記載された組成物を用いる使用のための移植可能生体適合マトリックスは、修飾成長因子ペプチドに適切な送達または支持系として機能できる。生体適合性マトリックスは、非毒性で、重篤な炎症性応答または免疫拒絶を誘発または刺激せず、移植部位において他の望ましくない反応を起こさないべきである。適切なマトリックスはまた、例えば、移植部位において、長時間にわたってゆっくりとした持続性の放出を促進するように、修飾成長因子ペプチドの放出を提供してもよい。１つの実施形態において、マトリックスは、骨マトリックスまたは軟骨である。その一般的な通常の意味に加えて、「マトリックスに投与すること」は、少なくとも１種の修飾成長因子ペプチドを産生可能である宿主細胞を、１つまたは複数のマトリックスに埋め込むことを含む。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される少なくとも１種の修飾成長因子ペプチドまたは組成物で細胞を処理する方法、および骨マトリックスまたは軟骨などであるがこれらに限定されないマトリックスにこれらの処理された細胞を移植する方法を提供する。

適切なマトリックスとしては、骨細胞または前駆細胞が移動してもよい多孔質足場が挙げられるが、これらに限定されない。骨形成細胞または軟骨形成細胞、すなわち、それぞれ、新たな骨材料または軟骨材料の沈着のプロセスに関与する細胞は、しばしば、このような多孔性マトリックスに結合でき、次いで、これらは、骨および軟骨組織の成長のための足場として役立つことができる。特定の適用のために、マトリックスは、その三次元構造を維持するために十分な機械的強度を有し、一体化されるか一緒に移植される骨セグメントの固定化の支持を補助するべきである。組織成長のための足場を提供する多孔性マトリックスは、新たな骨の沈着または骨成長の速度を加速でき、「骨伝導性」であると言われる。骨伝導性マトリックスは、本明細書に記載された薬学的組成物中でとりわけ有用である。組織成長のための足場を提供する多孔性マトリックスは、新たな軟骨の沈着または軟骨成長の速度を加速でき、「軟骨伝導性」であると言われる。骨伝導性マトリックスは、本明細書に記載された薬学的組成物中でとりわけ有用である。軟骨伝導性マトリックスは、本明細書に記載された薬学的組成物中でとりわけ有用である。新規なペプチドの骨誘導活性または軟骨誘導活性は、変更されてもされなくてもよく、これには、正常な成熟成長因子と比べて増強した活性が挙げられるが、これに限定されない。このように、本発明の処理されたマトリックスの骨伝導活性または軟骨伝導活性は、修飾成長因子で処理されていないマトリックスと比較して、増強している可能性がある。当然、マトリックス中の細胞が、より多くの骨芽細胞様または軟骨細胞様の外見または機能の細胞に分化し始める場合、マトリックスは、それぞれ、骨伝導性または軟骨伝導性と見なされる。

マトリックスは天然の供給源から誘導でき、またはマトリックスは合成であり得、またはその両方の混合物である。天然の供給源からのマトリックスは、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アルブミン、フィブリノーゲン−フィブリン、キトサン、エラシン、ラミニン、結合組織、皮質骨または海綿骨、脱灰骨または石灰化骨、大腿筋膜、真皮、筋肉、靱帯、腱、これらの混合物、および再構成された組織の混合物が挙げられるがこれらに限定されない天然のポリマーもまた含んでもよい。合成供給源からのマトリックスは、生物によって産生されない任意の材料をいい、これらとしては、有機成分、無機成分、またはそれらの混合物から作られる合成材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。ある実施形態において、合成マトリックスは、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）、およびその他などの有機合成ポリマーを備えてもよい。ある実施形態において、アルギン酸塩、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、およびプロテオグリカンのうち少なくとも１つを含む組織、器官、またはマトリックスを使用してもよい。特定の実施形態において、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウム、リン酸オクタカルシウム、リン酸カルシウム、マクロ多孔質メタリン酸カルシウムセラミック、β−トリカルシウムホスフェート、金属、金属合金、およびその他などの無機成分を備えるマトリックスを使用してもよい。本発明の特定の実施形態において使用されるマトリックスは、組織または器官の脱灰化、脱細胞化、または活力除去によって調製されてもよく、細胞がマトリックスに播種されてもよい。

ある実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１種の修飾成長因子または組成物はマトリックスに適用されてもよく、処理されたマトリックスの生成を可能にする条件でインキュベートされてもよい。ある実施形態において、インキュベーションは、約４０℃以下、または約１０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約３７℃の間で実施してよい。特定の実施形態において、インキュベーションを、少なくとも約２分間〜約１２０分間、約３分間〜約１００分間、約４分間〜約８０分間、約５分間〜約６０分間、および約５分間〜約３０分間実施してもよい。インキュベーションは、静的または動的な条件下で実施してよく、例えば、かき混ぜ、振盪、撹拌、混合、水平運動、揺らし、およびその他を用いる。

本発明のある実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１種の修飾成長因子または組成物がマトリックスに投与される前に、マトリックスを凍結乾燥してもよい。特定の実施形態において、１種以上の修飾成長因子をマトリックスに投与してもよく、処理されたマトリックスは、引き続き凍結乾燥されてもよい。次いで、凍結乾燥された処理されたマトリックスは、使用される前に水を加えて元にもどすことができる。さらに、細胞を、移植前にマトリックスに播種することができる。

適切な骨伝導性または軟骨伝導性マトリックスの例としては、コラーゲン（ウシ皮膚コラーゲン）、フィブリン、リン酸カルシウムセラミックス（例えば、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウム）、硫酸カルシウム、グアニジン抽出した同種異系骨、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、および線維状コラーゲンの混合物であるＣｏｌｌｏｇｒａｆｔ（商標）（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ならびに海のサンゴ炭酸カルシウムの結晶性ヒドロキシアパタイトへの変換によって形成されたヒドロキシアパタイトバイオマトリックスであるＩｎｔｅｒｐｏｒｅ（商標）（Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）などの多数の適切なマトリックスが市販されている。

多数の合成生物分解性ポリマーが、持続放出特性を有する骨伝導性または軟骨伝導性マトリックスとして役立ち得る。これらのポリマーの記載は、Ｂｅｈｒａｖｅｓｈ（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３６７，Ｓ１１８およびＬｕ（２０００）Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ，Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｍｒｓｎｙ ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙに見い出され得る。これらのポリマーの例としては、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ホモポリマーおよびコポリマー、ポリホスファゼン（ＰＰＨＯＳ）、ポリ無水物、およびポリ（プロピレンフマレート）などのポリα−ヒドロキシエステルが挙げられる。

ポリ乳酸／ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）ホモおよびコポリマーは、持続放出ビヒクルとして当該分野において周知である。放出の速度は、ポリ乳酸対ポリグリコール酸の比率の変更およびポリマーの分子量によって当業者が調整できる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２８：５を参照のこと）。微粒子マトリックスを形成するためのブレンドとしてのポリマーへのＰＥＧの組み込みによって、活性成分の放出プロフィールのさらなる変更が可能になる（Ｃｌｅｅｋ（１９９７）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ４８，２５９を参照のこと）。リン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのセラミックスもまた、機械的品質を改善するために製剤に組み込んでよい。

１つの実施形態において、本発明の組成物および方法において使用されるマトリックスは骨マトリックスである。本明細書で使用される場合、骨マトリックスは、天然の骨の成分に由来するか、またはそれを含むマトリックスである。ある実施形態において、天然の骨は、石灰化骨、部分的に脱灰した骨、脱灰骨、海綿骨、皮質骨、または皮質・海綿骨である。本明細書で使用される骨マトリックスは、骨組織において典型的には見い出されないさらなる合成成分を含んでもよいし、含まなくてもよい。他の実施形態としては、軟骨、真皮などの他の軟組織、結合組織、筋膜、小腸粘膜下層、漿膜、心膜、腱、靱帯、筋肉、脂肪組織、ミエリン、血管、基底膜、羊膜、およびその他から誘導されたマトリックスを使用する組成物および方法が挙げられる。ある実施形態において、硝子軟骨、線維軟骨、または弾性軟骨から調製されたマトリックスを使用できる。マトリックスは、関節丘、脛骨プラトー、大腿骨頭、上腕頭、肋軟骨にある硝子軟骨、椎間板にある線維軟骨、または喉頭蓋もしくは耳にある弾性軟骨から調製されてもよい。特定の実施形態において、任意に洗浄され、消毒され、化学修飾され、脱細胞化され、粒子化され、均質化され、凍結乾燥され、ガンマ腺照射され、および／または可塑化された天然の供給源から誘導されたマトリックスが使用されてもよい。本明細書で使用される任意のマトリックスは、このような組織中では典型的には見い出されないさらなる合成成分を含んでもよいし、含まなくてもよい。

１つの特定の実施形態において、骨マトリックスまたは軟骨マトリックスは、それぞれ、脱灰されるか、脱細胞化されてもよい。脱灰されたマトリックスの例および作成方法は、米国特許第６，１８９，５３７号および同第６，３０５，３７９号に記載されている。

本発明の特定の実施形態において使用されるマトリックス、組織、または器官は、とりわけ、粉末、粒子、シート、繊維、ゲル、パテ、ペースト、ブロック、円筒、スポンジ、メッシュ、フィルム、スライス、カール、フレーク、またはくさびの形態であってもよい。本発明の特定の実施形態において、修飾成長因子ペプチドを備えるマトリックス、組織、または器官は、粉末、繊維、パテ、またはスポンジの形態であってもよい。さらなる実施形態において、スポンジとしては、例えば、２００９年８月７日に出願された、同時継続中の同一出願人による「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ａ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｉｍｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」という標題の特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／０４５５６に開示されているスポンジ様構造を有する移植物が挙げられ得る。処理されたマトリックスは、本発明のいずれの方法においても使用できる。

本発明はまた、細胞中の骨形成または軟骨形成を増加または促進する方法に関する。これらの方法は、本明細書に記載された少なくとも１種の修飾成長因子ペプチドまたは組成物で、マトリックス中の細胞を処理することを包含してもよい。本明細書で使用される場合、「骨形成」は、新たな骨材料の沈着または新たな骨の形成であり、膜内骨形成および軟骨内骨形成が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「軟骨形成」は、新たな軟骨材料の沈着または新たな軟骨の形成である。新規なペプチドの骨形成または軟骨形成を誘導する活性は、変更されてもされなくてもよく、これには、正常な成熟成長因子と比べて増強した活性が挙げられるが、これに限定されない。修飾成長因子が投与されてもよい細胞としては、骨または軟骨形成が所望される任意の組織中の細胞が挙げられ、例えば骨、軟骨、靱帯、筋肉などであるが、これらに限定されない。

本発明はまた、組織または器官の欠陥または損傷、例えば動物の筋骨格、歯、または軟組織の欠陥または損傷を治療する方法に関し、この方法は、（１）本明細書に記載の１種以上の修飾成長因子もしくは組成物の存在下で培養した細胞、および／または（２）本明細書に記載の１種以上の修飾成長因子もしくは組成物をその組織または器官の欠陥に投与することを備える。

本発明はさらに、組織または器官の欠陥または損傷、例えば動物の筋骨格、歯、または軟組織の欠陥に処理したマトリックスを適用することによって、この欠陥を治療する方法に関し、欠陥への適用は、処理したマトリックスを欠陥に注入すること、組織もしくは器官の間に処理したマトリックスを挿入すること、または欠陥の上に処理したマトリックスを配置することによって達成されてもよい。本発明はまた、同様の様式で、器官における欠陥または損傷を治療することに関する。ある実施形態において、少なくとも１種のコファクターを、修飾成長因子を備えたマトリックスなどの処理されたマトリックスに加えてもよい。

なお別の実施形態において、細胞は、処理されたマトリックスに播種されてもよい。処理されたマトリックスに播種された細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、前駆細胞、および本明細書に開示されるか、当該分野において公知である幹細胞などであるがこれらに限定されない任意の細胞であり得る。播種された細胞は、増殖させられ、おそらくマトリックスに結合させられ得る。コラーゲンなどのマトリックスに細胞を播種する方法は、当該分野において周知である。あるいは、細胞は、最初に、本明細書に記載された少なくとも１種の修飾成長因子または組成物で処理されてもよく、次いで処理された細胞は、処理されたかまたは処理されていないマトリックスに播種されてもよい。

本発明の方法のいずれも、インビボ、エキソビボ、インサイチュ、またはインビトロ環境などの実質的に任意の環境で実施できる。例えば、細胞中で骨形成を促進する方法は、細胞培養物中で実施されてもよく、またはインタクトな生物中で実施されてもよい。さらに、本明細書に記載された任意の実施形態のうち任意の２つ以上の任意の組み合わせが意図される。

本発明を、様々な具体的な材料、手順、および例に言及して記載および例証してきたが、本発明は、その目的のために選択された材料および手順の特定の組み合わせに限定されないことが理解される。当業者によって認識されるように、このような詳細の多数のバリエーションが、当然意図され得る。明細書および実施例は単なる例示と見なされ、本発明の真の範囲および技術思想は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。本願において引用されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それらの全体が参照により組み込まれる。

以下の実施例は例示であり、本明細書に記載された本発明の範囲を限定することを意図しない。

実施例１−修飾ＢＭＰ−４の調製および配列決定

コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をセファロースビーズに連結し、結合していないコラゲナーゼを広範な洗浄によって除去した。コラゲナーゼ連結されたセファロースビーズを使用して、穏やかに混合しながら、３７℃で一晩のインキュベーションによって成熟ｒｈＢＭＰ−４を処理した。処理された成熟ｒｈＢＭＰ−４を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離し、続いてＰＶＤＦメンブレンへのタンパク質転写を行った。ＰＶＤＦメンブレン上のタンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーによって染色し、関連するバンドを、Ｅｄｍａｎ分解化学を使用し、ＡＢＩ Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４シークエンサーを用いるＮ末端配列決定のために切断した。ＰＶＤＦメンブレン上のタンパク質をまた、ｒｈＢＭＰ−４のＣ末端に対する抗体を使用して、ウェスタンブロットによって検出した。

コラゲナーゼ処理された成熟ｒｈＢＭＰ−４バンドを未処理成熟ｒｈＢＭＰ−４対照バンドと比較することによって、１７〜２２ｋＤａ周辺の余分なバンドをＮ末端配列決定のために切断した。コラゲナーゼ処理された成熟ｒｈＢＭＰ−４のＮ末端の１０アミノ酸を、Ｅｄｍａｎ分解化学を使用し、ＡＢＩ Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）４９４シークエンサーを用いて検出した。処理されたｒｈＢＭＰ−４のＮ末端の推定アミノ酸配列は、ＫＫＮＫＮＣＲＲＨＳ（配列番号７）であった。処理されたｒｈＢＭＰ−４のＮ末端は、未処理の成熟ｒｈＢＭＰ−４配列と一致し、このことは、コラゲナーゼが、最初の１０アミノ酸の後で成熟ＢＭＰ−４を切断したことを示している。ウェスタンブロットによって、コラゲナーゼ処理されたｒｈＢＭＰ−４群のバンドが検出され、これは、未処理成熟ｒｈＢＭＰ−４のバンドよりも約１〜２ｋＤａ小さい。

実施例２−修飾ｒｈＢＭＰ−４の骨誘導能

アルカリホスファターゼは、骨誘導性の生物学的または生物学的に由来するはっきりとした指標の１つである。ＡＰアッセイは、基質パラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）の細胞溶解物との３７℃で６０分間のインキュベーション後に、４０５ｎｍの波長で生成物パラ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）を測定する。１日目に、Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７２）を、２４ウェルプレートに、約２５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。コラゲナーゼと様々な濃度の成熟ｒｈＢＭＰ−４とを、約１：１０〜約１０００：１のモル濃度比で微量遠心チューブの中で混合し、３７℃で一晩インキュベートした。２日目に、コラゲナーゼ処理されたｒｈＢＭＰ−４または未処理のｒｈＢＭＰ−４を、２４ウェルプレートに播種されたＣ２Ｃ１２細胞の各ウェルに導入した。ｒｈＢＭＰ−４の最終濃度は、１、５、１０、および３０ｎｇ／ｍＬであった。３７℃および５％ ＣＯ_２での３日間のインキュベーション後、細胞を培養プレートから収集し、ＡＰアッセイおよびＢＣＡ総タンパク質アッセイのために細胞溶解物を調製した。

インビトロＡＰアッセイの結果を図１に示す。１０ｎｇ／ｍＬ以下の濃度の処理されたまたは未処理の成熟ｒｈＢＭＰ−４とともに細胞を培養した場合、アルカリホスファターゼ活性の違いは無視できた。３０ｎｇ／ｍＬの濃度では、コラゲナーゼ処理されたｒｈＢＭＰ−４で処理された細胞は、未処理の成熟ｒｈＢＭＰ−４で処理された細胞よりも有意に高いＡＰ活性を発現した。

実施例３−プロテアーゼを伴うかまたは伴わない修飾ｒｈＢＭＰ−４の骨誘導能

１日目に、マウス筋芽細胞株由来であるＣ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７２）を、２４ウェルプレートに２５，０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種する。コラゲナーゼとｒｈＢＭＰ−４とを、約１：１０〜約１００：１のモル濃度比で微量遠心チューブ中で混合し、３７℃で一晩インキュベートする。処理された成熟ｒｈＢＭＰ−４を、上記のＨＰＬＣ精製をさらに伴うかまたは伴わずに、アリコートに小分けする。さらなるＨＰＬＣ精製を伴うアリコート（精製修飾ＢＭＰ−４）をＥＬＩＳＡによって定量する。さらなるＨＰＬＣ精製を伴わないアリコート（非精製修飾ＢＭＰ−４）はアリコート中にコラゲナーゼを保持していた。これらのアリコートは、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の骨形成能に対する処理した成熟ｒｈＢＭＰ−４の効果を試験するために使用される。

同じ濃度のｒｈＢＭＰ−４対照、および精製修飾ｒｈＢＭＰ−４、および非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４の各々を、Ｃ２Ｃ１２細胞が播種された２４ウェルプレートのウェルに導入する。培地中で単独で培養されたＣ２Ｃ１２細胞（ｒｈＢＭＰ−４または修飾ｒｈＢＭＰ−４の添加なし）を、ネガティブ対照として使用する。

３７℃、５％ＣＯ_２での３日間のインキュベーション後、上述したＡＰアッセイを実施する。精製修飾ｒｈＢＭＰ−４または非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養された細胞のアルカリホスファターゼ活性は、未処理ｒｈＢＭＰ−４対照とともに培養した細胞のそれよりも有意に高い。非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養された細胞のアルカリホスファターゼ活性もまた、精製修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養された細胞のそれよりも有意に高い。これらの結果は、精製修飾ｒｈＢＭＰ−４を投与することと比較して、非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４を投与することによる、アルカリホスファターゼ活性の有意な増加を実証する。

さらに、上記のように培養されたＣ２Ｃ１２細胞の別のセットを用いて、精製修飾ｒｈＢＭＰ−４を、１３８ｎｇ／ｍＬの活性ディスパーゼもしくは不活性ディスパーゼ、または１００μｇ／ｍＬのコラゲナーゼもしくは不活性コラゲナーゼとともにＣ２Ｃ１２細胞のウェルに導入する。上記のようにＡＰアッセイを実施し、その結果は、精製修飾ｒｈＢＭＰ−４サンプルへの活性または不活性ディスパーゼまたはコラゲナーゼを加えることもまた、アルカリホスファターゼ活性を増加させることを示す。

加えて、クロストリパイン、ディスパーゼ、およびこれらの混合物によって処理された、さらなる精製を伴わないｒｈＢＭＰ−４もまた、非修飾ｒｈＢＭＰ−４対照と比較して、アルカリホスファターゼ活性を増加させる。加えて、ＢＭＰ１またはＭＭＰ１３によって処理され、さらなる精製を伴わないｒｈＢＭＰ−４もまた、非修飾ｒｈＢＭＰ−４対照と比較して、アルカリホスファターゼ活性を増加させる。

実施例４−プロテアーゼを伴う修飾ｒｈＢＭＰ−４の骨誘導能

Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７７２）を上記のように培養する。コラゲナーゼとｒｈＢＭＰ−４とを、約１：１０〜約１００：１のモル濃度比で微量遠心チューブ中で混合し、撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートする。処理された成熟ｒｈＢＭＰ−４をアリコートに小分けし、アリコートを、以下のようにＣ２Ｃ１２筋芽細胞の骨形成能に対する処理された成熟ｒｈＢＭＰ−４の効果を試験するために使用する。

骨誘導能の評価のために、１％ ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ−グリセロホスフェートを含有するＤＭＥＭの基本培地を対照群として使用する。５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−４の添加を伴う基本培地対照を、ＢＭＰ−４ポジティブ対照群として使用する。５０ｎｇ／ｍＬの修飾ｒｈＢＭＰ−４の添加を伴う精製なしの基本培地対照を試験群として使用する。培地を、チャンバースライド上に播種されたＣ２Ｃ１２細胞に加え、３〜４日毎に交換する。

３７℃、５％ ＣＯ_２での数日間のインキュベーション後、各群における細胞培養物について写真も撮影する。Ｃ２Ｃ１２細胞の結節形成は、修飾ｒｈＢＭＰ−４群においてのみ見られるが、他の２つの対照群には見られない。インキュベーション日数がさらに経過した後、培地をチャンバースライドから除去し、スライドをＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓで染色する。Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓを培養物または組織切片において細胞によるカルシウムが豊富な沈着物を同定するために使用し、これは、細胞の骨形成能に対する骨誘導性物質の効果を示す。

基本培地対照群については、試験のどの時点でもポジティブなＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ染色は見い出されない。ｒｈＢＭＰ−４対照群については、ある程度のＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓ染色がインキュベーションの６または１２日後に検出される。修飾ｒｈＢＭＰ−４群については、６日間のインキュベーション後、有意な量の結節がＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓによってポジティブに染色される。１２日間のインキュベーション後、非修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養されたＣ２Ｃ１２細胞におけるよりも、修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養されたＣ２Ｃ１２細胞において、より大きなサイズのより多くのＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ Ｓでポジティブに染色された結節が観察される。このデータは、修飾ｒｈＢＭＰ−４が、非修飾成熟ｒｈＢＭＰ−４対照と比較した場合に、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の骨形成能に対して有意により高い能力を有することを示唆する。

実施例５−細胞培養物中にプロテアーゼを伴うかまたは伴わない修飾ｒｈＢＭＰ−４の安定性

Ｃ２Ｃ１２細胞を培養し、精製し、非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４を上記の実施例３に記載されるように調製する。２日目に、同じ濃度の精製修飾ｒｈＢＭＰ−４、非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４、または未処理成熟ｒｈＢＭＰ−４を、Ｃ２Ｃ１２細胞が播種された２４ウェルプレートの各ウェルに導入する。ｒｈＢＭＰ−４または修飾ｒｈＢＭＰ−４の添加を伴わずに培養されたＣ２Ｃ１２細胞をネガティブ対照として使用する。様々な期間（２４時間、４８時間、または７２時間）の間の３７℃、５％ ＣＯ_２でインキュベーション後、使用済みの培養培地をこれらの元の２４ウェルプレートから収集し、前日に播種された新鮮なＣ２Ｃ１２細胞を含有する新たな２４ウェルプレートに移し、新たな２４ウェルプレートを、さらに３日間、３７℃、５％ ＣＯ_２でインキュベートする。元の２４ウェルプレートおよび新たな２４ウェルプレートからの細胞を、各培養期間の最後に収集し、細胞溶解物を、ＡＰアッセイおよびＢＣＡ総タンパク質アッセイのために調製する。

２４時間後、４８時間後、および７２時間後に収集された未処理ｒｈＢＭＰ−４使用済み培地中でＣ２Ｃ１２細胞を３日間培養する対照群については、アルカリホスファターゼ活性は、新鮮なｒｈＢＭＰ−４培地で３日間培養した細胞のそれと比較して減少している。２４時間後、４８時間後、および７２時間後に収集された精製修飾ｒｈＢＭＰ−４使用済み培地中でＣ２Ｃ１２細胞を３日間培養する実験群についても、アルカリホスファターゼ活性は減少し、対照群よりも低かった。しかし、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に収集された非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４使用済み培地中でＣ２Ｃ１２細胞を３日間培養する実験群については、アルカリホスファターゼ活性は、新鮮な非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４培地で３日間培養した細胞のそれと比較して、同様またはより高いレベルに維持される。このことは、プロテアーゼの存在が、培養培地中の修飾ＢＭＰ−４の安定性をさらに増強できることを実証する。

実施例６−プロテアーゼを伴うかまたは伴わない修飾ｒｈＢＭＰ−４の保存安定性

精製および非精製の修飾ｒｈＢＭＰ−４を上記の実施例３に記載されるように調製する。同じ量および濃度の精製および非精製の修飾ｒｈＢＭＰ−４のアリコートを様々な期間の間（２日間から２週間）３７℃でインキュベートする。各時点の後で、各群からの１つのアリコートを、最後の時点が完了するまで−２０℃のフリーザーに移す。異なる時点からの精製修飾ｒｈＢＭＰ−４または非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４のアリコートを、上記のように培養されたＣ２Ｃ１２細胞の各ウェルに導入する。ｒｈＢＭＰ−４またはコラゲナーゼの添加なしで培養されたＣ２Ｃ１２細胞をネガティブ対照として使用する。３７℃、５％ ＣＯ_２での３日間のインキュベーション後、上記のようなＡＰアッセイを実施する。

７日間または１４日間棚の上で（３７℃）精製修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養した細胞のアルカリホスファターゼ活性は、２日間棚の上で（３７℃）精製修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養した細胞のそれと比較して減少している。７日間または１４日間棚の上で（３７℃）非精製修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養した細胞のアルカリホスファターゼ活性は、精製修飾ｒｈＢＭＰ−４とともに培養された細胞のそれより少なく減少する。このことは、プロテアーゼの存在が、修飾ＢＭＰ−４の保存安定性をさらに増強できることを実証する。

Claims (22)

1. 骨誘導活性または軟骨誘導活性を有し、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を備える、１１５残基以下のペプチドと、
   コラゲナーゼと、
   を含む組成物。
2. 前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列に対して１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の組成物。
4. 融合タンパク質とコラゲナーゼとを含み、前記融合タンパク質が第１のペプチドと第２のペプチドを含み、
   前記第１のペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、１１５残基以下のペプチドであり、
   前記第２のペプチドが、精製タグをコードするペプチドまたは核移行シグナルをコードするペプチドである、
   組成物。
5. 前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列に対して１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
6. 前記ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の組成物。
7. 骨芽細胞または軟骨細胞への細胞の分化を促進するために用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記細胞が前駆細胞または成体幹細胞である、請求項７に記載の組成物。
9. 前記前駆細胞または前記成体幹細胞が、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、月経血、乳歯、髄核、脳、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、または筋肉から誘導される、請求項８に記載の組成物。
10. 前記細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項７に記載の組成物。
11. 組織中の細胞の骨形成を促進するために用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記組成物で処理された組織中の細胞の骨形成活性が、未処理組織中の細胞の骨形成活性よりも高い、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記組織が骨組織または結合組織である、請求項１１または１２に記載の組成物。
14. 細胞の成長因子活性を増加させるために用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
15. 少なくとも１種の別のプロテアーゼをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記少なくとも１種の別のプロテアーゼが、クロストリパイン、ディスパーゼ、トリプシン、ＢＭＰ−１（骨形成タンパク質−１）、ＭＭＰ−１３（マトリックスメタロプロテイナーゼ−１３）、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記細胞が前駆細胞または成体幹細胞である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. 前記前駆細胞または前記成体幹細胞が、胎盤、骨髄、脂肪組織、血管、羊水、滑液、滑膜、心膜、骨膜、硬膜、末梢血、臍帯血、月経血、乳歯、髄核、脳、皮膚、毛包、腸陰窩、神経組織、または筋肉から誘導される、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
20. タンパク質切断を促進する条件下で、成熟ＢＭＰ−４をコラゲナーゼと接触させること、およびペプチドを収集することを備え、
    前記ペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、１１５残基以下のペプチドである、ペプチドを作製する方法。
21. 前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列に対して１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項２０または２１に記載の方法。

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