JP5902150B2

JP5902150B2 - 高眼圧症及び緑内障を予防及び治療する方法及び薬物

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Publication number: JP5902150B2
Application number: JP2013508217A
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Inventors: ラム，デニス・シュン・チュイ; ラウ，ジョンソン・ユ・ナム; ヤム，ゲイリー・ヒン・ファイ; パン，チ・プイ; ラング，クリストファー・カイ・シュン; チェン，ハオユー; ラオ，スリニヴァス・カマラカラ; ファン，ドロシー・シュ・ピン
Original assignee: ザ・チャイニーズ・ユニバーシティ・オブ・ホンコン; ラウ，ジョンソン・ユ・ナム
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Description

本発明は、眼疾患、特には高眼圧症及び緑内障の予防及び治療に関する。

緑内障は、世界的に不可逆的失明の主な原因となっている。視神経の進行性の変性と共に視覚機能の喪失は不可避であると考えられる。高齢化と共に患者数は世界的に増加すると予測されている。２０１０年の緑内障患者数は６０５０万人であり、２０２０年までに７９６０万人にまで増加し、そのうち中国での患者数は２１８０万人になると推定されている。高眼圧症及び緑内障を患った患者の大多数が眼圧を最適に制御することができないでいる。このような患者は外科的処置を必要とすることが多いが、望ましくない視覚的転帰に至る場合もある。眼圧を低下させる及び疾患を患う恐れのある個体の眼圧上昇を予防するための新しい薬物が必要とされている。

緑内障の医学的処置の現状は全て眼圧を低下させることを目標としている（非特許文献１４、１３）。現状での眼圧低下薬としては、交感神経刺激薬（エピネフリン等の非選択性刺激薬、アプラクロニジン等のα２刺激薬）、交感神経遮断薬（チモロール、ベフノロール、カルテオロール、ニプラジロール、ベタキソロール、レボブノロール、メチプラノロールを含むβ遮断薬、塩酸ブナゾシン等のα１遮断薬）、副交感神経アゴニスト（ピロカルピン）、炭酸脱水酵素阻害薬（アセタゾラミド、ドルゾラミド）及びプロスタグランジン類似体（イソプロピルウノプロストン、ラタノプロスト、トラボプロスト、ビマトプロスト）がある。これらの薬剤は、眼房水の産生を低下させる又は線維柱帯網及び／若しくはぶどう膜強膜流出チャネルを通しての眼房水流出能を上昇させる。

加齢に伴って、ステロイド外用薬の使用、近視及び家族に緑内障の病歴を持つものがいることは危険因子と見なされ、眼圧（ＩＯＰ）を低下させることは、緑内障連続体における視力喪失の防止に依然として最も有効なアプローチである。緑内障の発生に関する病理学的メカニズムは完全には解明されていないが、ミオシリン遺伝子における変異（非特許文献８、９、１６）（異常なミオシリン遺伝子産物の蓄積につながる可能性がある）は、全緑内障患者の２〜４％を占める小集団における因子かもしれないと示唆されている（非特許文献１、６）。上記のメカニズムが正しい場合、ミオシリンの蓄積を軽減するシャペロンがこの小患者集団には有用であると考えられる。しかしながら、現実には、緑内障を患った患者の殆どが欠陥のあるミオシリン遺伝子を有していないため、このアプローチは役に立たない。

フェニル酪酸ナトリウム（より具体的には、図１Ａに図示の構造を有する４−フェニルブチレート塩）は、尿素回路障害、鎌状赤血球貧血及びβ−サラセミアの治療に臨床使用されている薬物である（非特許文献３、４、５）。

フェニル酪酸ナトリウムは短鎖脂肪酸であり（図１Ｂ）、そのシャペロン効果によってミオシリンのフォールディングが安定化され、細胞内輸送が促進され、その結果、細胞ストレス及び細胞死につながる可能性のある細胞内での異常タンパク質の蓄積が減少することがこれまでに判明している（非特許文献１７）。したがって、変異ミオシリン遺伝子欠陥を有する患者は、フェニル酪酸ナトリウム治療を受けることで有益な効果を得られる可能性がある。フェニル酪酸ナトリウムを経口投与すると、未治療の導入遺伝子マウスと比較すると、上昇した眼圧を正常化することによってＹ４３７Ｈ変異ミオシリン導入遺伝子を発現したマウスにおいて緑内障表現型が救済されるとごく最近判明した（非特許文献１９）。それでもなお、この化合物が正常なミオシリン遺伝子を有する動物又は患者には効果がないと予測する人はいるだろう。しかしながら、以下で示すように効果はあるのである。

本発明の裏付けとしてであってそれに先立つ行為ではないが、発明者は、フェニル酪酸ナトリウムが、正常なウサギのステロイド誘発性緑内障動物モデルにおける眼圧上昇の予防及び治療に有効であることを発見した（図２Ａ、２Ｂ、３）。このような動物モデルは、緑内障研究で一般的に使用されている。

更に、フェニル酪酸ナトリウムがそのシャペロン効果をウサギにおける眼圧上昇の予防及び治療に利用しているならば、他のシャペロンも眼圧を低下させる役割を果たすかもしれないと予測する人だっているだろう。この仮説を調べるために、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）を、同じウサギのステロイド誘発性緑内障モデルを利用して試験した。ＴＭＡＯはよく知られた別の小分子シャペロンであり（非特許文献７、１０、１２）であり、タンパク質のフォールディングを安定化し、また圧力阻害からリガンドの結合及び重合を保護するタンパク質安定化剤として作用することができる天然のオスモライトである。ＴＭＡＯは様々なタンパク質のフォールディング及び会合を改善する。驚くべきことに、発明者は、ＴＭＡＯが、フェニル酪酸ナトリウムの場合で見られるような眼圧の低下に全く効果がないことを発見した。具体的には、図４は、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）のデキサメタゾン誘発性の眼圧変化に対する負の作用を示している。１４羽のニュージーランドアルビノウサギ（生後７週間の雄）を５つのグループに分けた。右目には外用デキサメタゾンを１日４回投与し、続いて外用ＴＭＡＯ（２ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ）を１日４回投与し、左目には外用デキサメタゾンを１日４回投与し、続いて平衡塩類溶液（コントロールとしての生理食塩水）を１日４回投与した。外用ＴＭＡＯは、１８日間にわたる全研究期間中、デキサメタゾン誘発性の眼圧上昇を予防も治療もしなかった（図４）。両目の眼圧に大きな違いはなかった。これは、フェニル酪酸ナトリウムによるステロイド誘発性の眼圧上昇の予防及び治療が化学的シャペロンの活性に関係していない可能性を示唆している。この発見は実に驚くべきことである。

以下の参考文献は本開示に関するものである。

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本発明により、有効用量の薬学的に許容可能なフェニルブチレート塩、特にはフェニル酪酸ナトリウムを適当な溶液又は担体中に含む、疾患の治療に使用するための薬物（点眼液、膏薬、クリーム等）を提供する。使用時、溶液又は担体を眼組織に局所適用する。あるいは、眼窩周囲から（結膜下、テノン嚢下、眼球周囲、球後及び前部強膜近傍デポー製剤を含む）又は眼内に（前房内、硝子体内）又は全身的な摂取によって（経口摂取、非経口注入）又は放出制御若しくは持続放出法により又は他の手段により投与され、ヒトにおける高眼圧症を予防し、また緑内障を治療し、これは既存の緑内障治療薬とは異なるメカニズムでもって眼圧を低下させる新しい医学療法につながる。この化合物を、ステロイド誘発性の高眼圧症及び緑内障を予防及び治療するために、ステロイド系抗炎症薬、ステロイドプロドラッグ、異なる処方のコルチゾール誘導化合物及び／又は現在入手可能な他の緑内障治療薬と組み合わせて製剤又は改変することができる。

フェニル酪酸ナトリウムによるステロイド誘発性の眼圧上昇の予防及び治療はその化学的シャペロンの活性に恐らく関係していないと示したものの、発明者はその正確なメカニズムをわかってはいない。ヒストンアセチル化（アセチル化）、転写及びタンパク質のプレニル化に対するその作用を含むフェニル酪酸ナトリウムの他の活性並びに窒素スカベンジャー活性が、本明細書で報告する眼圧低下作用に関与している可能性がある。

実験では更に４つの驚くべき発見があった。

第１に、フェニル酪酸ナトリウムは、ステロイド誘発性の眼圧上昇の予防に有用であると判明した（図２）。

第２に、フェニル酪酸ナトリウムは、ステロイド誘発性緑内障において眼圧を低下させるのに有効であった（図３）。

第３に、ステロイド誘発性の眼圧上昇を軽減するのに有効かつ有用な用量が極めて少量であり、驚くべきことに、シャペロン効果が治療メカニズムであると考えられている尿素回路障害の治療で使用する量よりはるかに少ないことが判明した。動物実験において、１日２〜５回適用する場合、濃度０．０１〜１５ｍＭもの低いフェニル酪酸ナトリウムレベルで有効であると判明した（図５、６）。

第４に、薬力学的作用が極めて長時間にわたって持続することが判明し、これは予想外であった。発明者は、外用フェニル酪酸ナトリウムが、フェニル酪酸ナトリウム点眼薬の投与をやめた後も最大１８日間にわたって眼圧上昇を抑制できることを発見した（図７）。

以下の詳細な説明を添付の図面と共に参照することによって、本発明をより深く理解することができる。

図１Ａ−１Ｂは、４−フェニルブチレート及び４−フェニルブチレートのナトリウム塩の構造を示す図である。４−フェニルブチレートのナトリウム塩は、目的とする薬物としてのその処方は新規であるもの既知の化合物である。図２Ａ−２Ｂは、ウサギのステロイド誘発性緑内障モデルにおける眼圧上昇予防に対する外用フェニル酪酸ナトリウム（１ｍＭ、５ｍＭ、１５ｍＭ）の効果を示す一連のグラフである。ウサギのステロイド誘発性の眼圧（ＩＯＰ）上昇を軽減することにおける１ｍＭの外用フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）の効果を示す図である。ウサギのステロイド誘発性の眼圧（ＩＯＰ）上昇量を低下させることに効果がない、化学的シャペロンであるトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）を示す一連のグラフである。ステロイド誘発性のＩＯＰ上昇の予防に有効なフェニル酪酸ナトリウム濃度を示すグラフである。ステロイド誘発性のＩＯＰ上昇の予防に対する外用フェニル酪酸ナトリウムの適用頻度の効果を示すグラフである。ウサギへの局所適用をやめた後の、ステロイド誘発性のＩＯＰ上昇の予防に対するフェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）の持続性の薬力学的効果を示す図である。ウサギの角膜内皮細胞数に対する外用フェニル酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。培養したヒト線維柱帯網細胞に対するフェニル酪酸ナトリウムの効果を示す棒グラフである。図１０Ａ−１０Ｄは、フェニル酪酸ナトリウムがステロイド誘発性の線維柱帯網細胞喪失を軽減したことを示す一連の組織写真及び棒グラフである。図１１Ａ−１１Ｃは、フェニル酪酸ナトリウムが線維柱帯網におけるステロイドによって引き起こされる細胞外マトリクスの沈着を減少させたことを示す一連の組織写真である。図１２Ａ−１２Ｆは、線維柱帯網におけるフェニル酪酸ナトリウムの効果を示す一連の電子顕微鏡写真である。

フェニルブチレートの薬学的に許容可能な塩、特にはフェニル酪酸ナトリウムは、目の異常を治療するための薬物としての使用に適している。適当な溶液又は不活性な担体に配合したものを非経口又は経口製剤として投与し得て、例えば眼科製剤、注射剤（静注又は眼／眼窩周囲、硝子体内、結膜下、テノン嚢下、眼球周囲、球後及び前房内注射のいずれかによって）、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、溶液等の形態で調製することができる。これらの製剤は、適切に既知の担体を添加することによって既知の技法で調製することができる。なかでも好ましくは眼科製剤として、特に好ましくは点眼剤として使用され、このような眼科製剤は、水性点眼薬、非水性点眼薬、懸濁点眼薬、エマルション点眼薬、眼軟膏等になり得る。この製剤は、薬理学的に許容可能な担体（等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、酸化防止剤、可溶化剤、増粘剤等）を必要に応じて添加することによって、剤形に適した組成物として当業者に既知の調製方法で製造することができる。

眼科製剤を、例えば、上記の化合物の所望の原料を水性溶媒（滅菌精製水、生理食塩水等）又は非水性溶媒（綿実油、ダイズ油、ゴマ油、ピーナッツ油を含む植物油等）に既定の浸透圧で溶解又は懸濁させ、この溶液又は懸濁液を滅菌（濾過滅菌等）に供することによって調製する。膏薬又は眼軟膏を調製する場合、軟膏の基剤を上記の様々な原料に追加して添加することができる。上記の軟膏基剤は特に限定されず、その好ましい例には油性の基剤（黄色ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレン等）、油相と水相とを界面活性剤等を使用して乳化して得られるエマルション基剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールを含む水性基剤等が含まれる。

ウサギからヒトへのアロステリック変換（血漿濃度及び計算に基づく）は１．９倍であることが知られている。外用点眼薬、ローション、クリームその他を含めた応用例がアロステリック変換に従わない場合、動物モデルで有効であると確認された濃度がヒトの患者でも有効となる。アロステリック変換に従う場合は、経口薬、皮膚パッチ剤又は注射剤（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）等の全身的投与の場合と同様に、計算濃度を、血漿レベルに関して１．９倍に調節する必要がある可能性がある。血漿レベルがターゲット組織のレベルと同じだと仮定すると、逆変換係数（ｒｅｖｅｒｓｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｆａｃｔｏｒ）を、ヒトに適用可能な計算用量に適用し得る。

ウサギのステロイド誘発性緑内障動物モデルを使用した発明者自身の実験から収集した実験データがあり、これらのデータは、特定の塩であるフェニル酪酸ナトリウムが眼圧上昇の予防及び上昇した眼圧の治療において安全かつ有効であることを示している。一般に使用されるステロイドであるデキサメタゾンを全ての実験において使用した。具体的には、図２Ａ及び２Ｂは、ステロイド誘発性緑内障モデルにおける眼圧（ＩＯＰ）上昇の予防に対するフェニル酪酸ナトリウムの効果を示すグラフである。実験では、９羽の生後７週間の雄のニュージーランドアルビノウサギを無作為に３つのグループに分け、各ウサギの両目に１日５回、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（０．１％のＤｅｘを含有するＭａｘｉＤｅｘ、Ａｌｃｏｎ社）を投与した。加えて、外用フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）（ＴｒｉｐｌｅＣｒｏｗｎＡｍｅｒｉｃａ／ＴｒｉＢｕｔｙｒａｔｅ社、パーカシー、ペンシルバニア州）を濃度１ｍＭ、５ｍＭ又は１５ｍＭでウサギの右目に１日５回投与し、緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）（コントロールとしての生理食塩水）を左目に１日５回投与した。マスクを着用した技術者が、眼圧（ＩＯＰ）を１週間に２回、３、４日の間隔をあけて測定した。図２Ａ：外用Ｄｅｘを左目に投与した後、眼圧の上昇が観察された（◆線：Ｄｅｘ＋ＢＳＳ）。データ分析のために３つのタイムポイント（１４日目、３７日目、５３日目）を選択した。タイムポイント１（１４日目）は、ステロイド誘発性の著しいＩＯＰ上昇を得るために一般的に採用されるタイムポイントであった。タイムポイント２（３７日目）はＩＯＰ上昇の最大低下を示し、タイムポイント３（５３日目）は、研究終了時であった。平均ベースライン眼圧（ＩＯＰ）は両目とも１１．５ｍｍＨｇであった。ＰＢによるＩＯＰ上昇における低下率を、「Ｄｅｘ＋ＢＳＳを投与した目における平均ＩＯＰ上昇量−Ｄｅｘ＋ＰＢを投与した目における平均ＩＯＰ上昇量」を「Ｄｅｘ＋ＢＳＳを投与した目における平均ＩＯＰ上昇量」で割って１００％を掛けたものとして定義した。

図２Ａを参照すると、１日５回のフェニルブチレート（ＰＢ）点眼薬の適用は、その濃度に関わらずＤｅｘ誘発性のＩＯＰ上昇の軽減に役立った。ＩＯＰ上昇の低下量は３つのＰＢ用量全てにおいて同様であり（それぞれ■、▲、〇の線）、データを１つのグループとしてまとめて分析した。ＩＯＰ上昇における平均低下率は、１４日目、３７日目及び５３日目の３つのタイムポイントでそれぞれ４５．０％、８４．７％及び５０．０％であった。図２Ｂのグラフは、Ｄｅｘ＋ＢＳＳ（左目。◆線）及びＤｅｘ＋ＰＢ（右目、■線）を投与された個々のウサギのＩＯＰ測定値の時系列プロファイルを示す。シャペロンはタンパク質の輸送を促進しかつ異常タンパク質の細胞内での蓄積を軽減するのに効果的ではあるものの、全てのウサギは正常なミオシリン遺伝子を有するため、フェニル酪酸ナトリウムのＩＯＰ低下作用を、変異ミオシリン遺伝子産物の輸送強化に関連づけるべきではない。この驚くべき結果は、フェニル酪酸ナトリウムの治療効果の更なる調査及び特徴づけにつながった。

実験のフェーズＩＩが始まる５６日目に、緩衝塩類溶液の代わりに外用フェニル酪酸ナトリウム（１ｍＭ）を５羽のウサギの左目に適用した（図３）。ＩＯＰは５６日目の２０．５ｍｍＨｇから６７日目の１６．６ｍｍＨｇに低下し（図３、茶色線）、１１日間の処置期間中にＩＯＰが１９％低下したことを表している。更に、１６．６ｍｍＨｇのＩＯＰレベルは、研究の両フェーズを通して濃度１ｍＭのＰＢで処置した目の６７日目の平均ＩＯＰレベルである１５．４ｍｍＨｇ（図３、灰色線）に極めて近かった。以下の観察結果を得られたことは驚きである。（１）図２Ａ、２Ｂに示されるように、フェニル酪酸ナトリウムは、ステロイド点眼薬の使用に関連したＩＯＰ上昇の予防に有効である（フェーズＩ。フェニル酪酸ナトリウムでの処置対コントロールである緩衝塩類溶液での処置）。（２）図３に示されるように、フェニル酪酸ナトリウムは、チェックポイントＡからの脱線によって例証されるように、ＩＯＰの低下に有効である（図３、茶色線）。

図４は、ウサギのステロイド誘発性眼圧（ＩＯＰ）上昇を低下させることにおける、化学的シャペロンであるトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）の負の結果を示す。１４羽の生後７週間の雄のニュージーランドアルビノウサギの両目に１日４回、外用デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（０．１％のＤｅｘを含有するＭａｘｉＤｅｘ、Ａｌｃｏｎ社）を投与した。濃度２〜３００ｍＭの外用トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）を右目に投与し、緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）（コントロールとしての生理食塩水）を左目に１日４回投与した。全てのウサギが、１４日目にベースライン（０日目）と比較して最高６ｍｍＨｇの眼圧（ＩＯＰ）上昇を示した。ＴＭＡＯは、１８日間の全研究期間中にＤｅｘ誘発性のＩＯＰ上昇を防止しなかった。Ｄｅｘ＋ＢＳＳ（左目、青線）及びＤｅｘ＋ＴＭＡＯ（右目、マゼンタ線）でそれぞれ処置した両目のＩＯＰは、大きな違いを見せなかった。これは、フェニルブチレートによるステロイド誘発性ＩＯＰ上昇の防止が、化学的シャペロンの活性にはおそらく関係していないことを示唆している。

図５は、ステロイド誘発性の眼圧（ＩＯＰ）上昇の防止におけるフェニル酪酸ナトリウムの有効濃度を示す。１８羽のウサギの右目（１４日目にベースラインからの＞３０％のステロイド誘発性の眼圧（ＩＯＰ）上昇を示したことから強反応者と特徴づけされた）に外用デキサメタゾン（Ｄｅｘ、ＭａｘｉＤｅｘ、Ａｌｃｏｎ社）及びフェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）（０．０１、０．１、０．５、１、５及び１５ｍＭ）点眼薬をそれぞれ１日５回投与した。左目は、Ｄｅｘ＋ＢＳＳで処置した。ＩＯＰを１週間に２回測定した。ＰＢによるＩＯＰ上昇の低下率を、段落〔００２５〕で定義した式に基づいて計算した。図は、異なるＰＢ用量（ｘ軸）に関しての１４日目のＩＯＰ上昇（◆）における低下率を示した。異なるＰＢ用量グループ内でのＩＯＰ上昇の平均低下率を水平線で表わした。ＰＢによるステロイド誘発性ＩＯＰ上昇における用量依存性の低下が観察された。０．１〜１ｍＭの用量で投与されたＰＢに関し、ステロイド誘発性ＩＯＰ上昇における低下率は５９．７〜７４．９％の間であった。他の試験用量は、約５０％の低下を示した。

図６は、ステロイド誘発性の眼圧（ＩＯＰ）上昇を低下させることに対する外用フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）の頻度依存性の効果を示す。４３羽のウサギの右目に１日１〜６回、外用Ｄｅｘ＋ＰＢ（０．５ｍＭ）を投与した。左目にはＤｅｘ＋ＢＳＳを投与した。ＩＯＰを週２回、測定した。１４日目に、Ｄｅｘ＋ＰＢで処置した個々の目の低下したＩＯＰを、Ｄｅｘ＋ＢＳＳで処置した反対側の目のＩＯＰと比較することによって、ＩＯＰ低下率（◆）及び水平線で表わされるグループ内でのＩＯＰ平均低下率を得た。ＩＯＰ平均低下率を、段落〔００２６〕で定義したものと全く同じ式に基づいて計算した。ＩＯＰ上昇における平均低下率は、ＰＢを１日５回投与した目で最も高いと判明した（７４．９％）。ＰＢ点眼薬を１日４回、２回及び１回投与した目では、対応する低下率はそれぞれ５７．９％、５４．４％及び１３．２％であった。

化合物中の局所的に使用するフェニル酪酸ナトリウムの有効濃度は０．０１〜１５ｍＭｚ（図２Ａ、２Ｂ、５）であり、１日２〜５回、局所適用すべきである（図６）。

図７は、ウサギへの局所適用をやめた後のステロイド誘発性のＩＯＰ上昇に対するフェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）の持続性薬力学的防止作用を示す。この実験では８羽のウサギについて研究を行った。ウサギの全ての左目にＤｅｘ＋ＢＳＳを１日５回、０日目から実験が終了する６０日目まで投与した（フェーズＩ及びＩＩの両方とも■線）。最初の１０日間で著しいＩＯＰ上昇が観察され、１０日目から６０日目までの平均ＩＯＰは２０〜２２ｍｍＨｇのレベルに維持された。無作為に抽出した３羽のウサギの右目に１日５回、Ｄｅｘ＋ＰＢ点眼薬（フェニル酪酸ナトリウム、０．５ｍＭ）を０〜４２日目まで投与した。ＩＯＰ測定によってＤｅｘ誘発性のＩＯＰ上昇（フェーズＩの茶色の実線）が低下したことが示され、それまでの観察結果と同様であった。ＩＯＰは最初の１０日間でゆっくりと上昇し、１０〜４２日目に、平均ＩＯＰは１４〜１６ｍｍＨｇの低レベルで安定した。４３日目に、３羽のウサギの右目の処置をＤｅｘ＋ＰＢから外用Ｄｅｘ＋ＢＳＳに変更した。その後も、Ｄｅｘ＋ＢＳＳ点眼薬を１日５回、実験が終了する６０日目まで投与した（フェーズＩＩの茶色の破線）。外用ＰＢの投与を中止したら、ＩＯＰが大きく上昇してＰＢを投与していない左目のＩＯＰレベル（■線）に約１０日で追い付くのではないかと最初は予測されたが、驚くべきことに、２ｍｍＨｇ未満の極めて緩やかなＩＯＰ上昇しか観察されず、平均ＩＯＯＰレベルは約１６．５ｍｍＨｇに留まった。実験が終了し、Ｄｅｘを１８日間にわたって投与し終わった６０日目に、ＩＯＰは１６．６ｍｍＨｇのレベルで安定した。

ウサギの目へのフェニル酪酸ナトリウムの投与に関し、目又は全身に悪影響は見られなかった。具体的には、フェニル酪酸ナトリウムの局所適用後に、結膜充血、角膜上皮びらん及び／又は内皮細胞の喪失の証拠は見られなかった。雄のウサギの成獣（ｎ＝１３）の両目に１日４回、外用フェニル酪酸ナトリウム（１ｍＭ、５ｍＭ）を投与した。ウサギを１日３回診察したが、７日間にわたる処置後研究期間中に下痢、麻痺、痙攣／発作、出血及び／又は死亡を示したウサギはいなかった。７日目及び１４日目に眼科医がウサギの目を診察した。その際、ウサギにはケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（７．５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射して麻酔をかけた。ＰＢでの処置後、眼表面（結膜及び角膜）疾患、例えば充血、腫れ、炎症、潰瘍又は出血は認められなかった。フルオレセイン染色を伴う細隙灯顕微鏡検査で、結膜又は角膜に異常はなかった。図は、スペキュラーマイクロスコープで測定したが、ＰＢが角膜内皮細胞密度に大きな違いをもたらさなかったことを示す（図８）。

フェニル酪酸ナトリウム（０．５ｍＭ、１ｍＭ）の培養したヒト線維柱帯網（ＴＭ）に対する細胞障害性作用は認められなかった（図９）。これらの試験においては、培養したヒトＴＭ細胞（７０００細胞／ｍｌ）を、１０００ｍｇ／ｍＬのグルコース、２％のチャコール処理ウシ胎仔血清及び抗生物質を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の各ウェルに蒔いた。細胞を、フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）（０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（１００ｎＭ、５００ｎＭ）及びこの２つの組み合わせで５日間にわたって処理した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド染料（ＭＴＴ）による細胞生存率／増殖アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を利用して、ホルマザン呈色強度をマルチプレートリーダーを使用して励起波長５９５ｎｍ及び発光波長６１０ｎｍで測定した。平均シグナル強度を百分率で表わし、処理物間で未処理のコントロールと比較した。濃度０．５ｍＭ及び１ｍＭのＰＢが線維柱帯網細胞に対して細胞障害性ではないことが判明した。同様の結果が、濃度１００ｎＭ及び５００ｎＭのＤｅｘに関して判明した。

図１０および図１１は線維柱帯網（ＴＭ）の構造及び解剖学的変化を示し、なぜフェニル酪酸ナトリウムがＩＯＰ上昇を治療及び予防できるかの考えられ得る説明をもたらす。高ＩＯＰは緑内障の重要な特徴であり、ＴＭにおける眼房水流出の部分的な遮断が主な原因である。眼房水流出が排出開口部を通って起きる場合、その領域のＴＭ細胞は、そのままだと経路を閉塞してＩＯＰ上昇に至る壊死組織片／沈着を一掃するスカベンジャーとして働く。ステロイドがＴＭ細胞を損傷し（図１０Ｄ）、その結果、ＩＯＰ上昇につながるＴＭ内の眼房水排出経路における沈着を増加させる（図１１Ｂ）ことは判明しているが、ＰＢは、発明者の実験において、ＴＭ細胞の喪失を軽減し（図１０Ｄ）、また眼房水排出用のより詰まりのない経路を保つ（図１１Ｃ）ことが判明している。

図１０に関し、フェニル酪酸ナトリウムは、デキサメタゾン誘発性のＴＭ細胞喪失を軽減できると判明した。ＴＭ眼房水流出領域における細胞密度を、Ｄｅｘ及びＤｅｘ＋ＰＢで処置したウサギの目で調査した。１４日間にわたるフェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）の局所適用後、ウサギを屠殺した。試料をパラフィン加工し、ヘマトキシリン・エオシン組織化学検査のために厚さ５μｍで連続的に切片にした。（Ａ）未処置のコントロール、（Ｂ）０．１％のＤｅｘで１４日間にわたって処置したもの及び（Ｃ）濃度０．５ｍＭのＤｅｘ＋ＰＢで１４日間にわたって処置したものの切片を示す。ＴＭ領域内の細胞数を数え、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を使用して面積を測定した。（Ｄ）細胞密度（平均±標準偏差）をコントロール及び処置グループ間で比較し、Ｐ値を独立スチューデントｔ検定で計算した。静脈の強膜神経叢下のＴＭ領域において、５３％の細胞密度の低下がＤｅｘでの処置後に認められた。このような細胞喪失は、処置過程における外用ＰＢの追加によって減少した。用量依存性の補正が濃度０．０２〜０．５ｍＭで見られた。細胞喪失の割合は濃度０．０２ｍＭのＰＢで３９％、濃度０．１ｍＭのＰＢで３１％、濃度０．５ｍＭのＰＢで２６％であった。これらの結果は、ＰＢが、ステロイド（この研究では０．１％のＤｅｘ）によって誘発されたＴＭ細胞の密度低下を軽減できたことを示す。ＴＭ細胞の喪失の度合いが低いと、ＴＭ眼房水流出領域がより詰まりのない状態に維持され、結果的にステロイド誘発性の眼圧上昇を予防又は軽減することになる。

図１１Ａ〜１１Ｃは、フェニル酪酸ナトリウムが線維柱帯網の眼房水流出チャネルにおける細胞外マトリクスの沈着を軽減できることを示す。ステロイド誘発性の眼圧（ＩＯＰ）上昇は、線維柱帯網の細胞外マトリクスにおけるグリコーゲン、コラーゲン等の物質の蓄積及び／又は沈着によって生じる眼房水流出抵抗の上昇に続発する。実験は、フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢ）が線維柱帯網の細胞外マトリクス内に蓄積されるグリコーゲン及びコラーゲンの量を低下させられるかを突き止めるために行われた。ＴＭ眼房水流出領域のパラフィン切片に沈着した細胞外タンパク質及びコラーゲン基質を、特殊な過ヨウ素酸シッフ及びマッソン三色組織化学染色によってＤｅｘで処置したウサギの目及びＤｅｘ＋ＰＢで処置したウサギの目で調査した。ウサギの目をパラフィン加工し、組織化学的検査のために厚さ５μｍで連続的な切片にした。（Ａ）未処置のコントロール、（Ｂ）Ｄｅｘ（０．１％）で１４日間にわたって処置したもの及び（Ｃ）Ｄｅｘ（０．１％）＋ＰＢ（０．５ｍＭ）で１４日間にわたって処置したものの切片を示す。過ヨウ素酸シッフ組織化学染色（図１１、中央）は、外用デキサメタゾンをフェニル酪酸ナトリウム（１ｍＭ）と共に又は伴うことなく１４日間にわたって投与したウサギの目のパラフィン切片において、デキサメタゾンで処置した線維柱帯網の細胞間隙へのグリコーゲンのより多い沈着（紫／マゼンタ色）が見られることを実証した（図１１Ｂ、中央）。一方、デキサメタゾン及びフェニル酪酸ナトリウム（１ｍＭ、１４日）で処置した目ではグリコーゲンの沈着が大幅に減少した（図１１Ｃ、中央）。この低下した沈着レベルは、未処置のコントロールの目で見られたものと同様であった（図１１Ａ、中央）。マッソン三色組織化学染色を施した切片（図１１、右）に関しては、コラーゲンの沈着（緑色で出現）は、未処置のコントロール（１１Ａ、右）と比較するとデキサメタゾンで処置した線維柱帯網領域（図１１Ｂ、右）で大きく増加した。これは、ステロイド誘発性の眼圧上昇につながる恐れがある眼房水流出遮断の可能性を示す。デキサメタゾン及びフェニル酪酸ナトリウムで処置した線維柱帯網領域ではコラーゲン染色の減弱が注目された（図１１Ｃ、右）。ＰＢで処置した目において細胞外マトリクス沈着の量が少ないと眼房水の排出が良好となり、結果的にＩＯＰが低下する。

図１２Ａ〜１２Ｆは、ウサギの目の線維柱帯網（ＴＭ）の電子顕微鏡写真である。ウサギの線維柱帯網（ＴＭ）組織の超微形態を、透過型電子顕微鏡法によって未処置のコントロールの目、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（０．１％）で処置した目及びＤｅｘ＋ＰＢ（１ｍＭ）で処置した目で調査した。コントロールのＴＭ領域において、開放眼房水流出チャネルにおいて詰まりのない細胞外マトリクス領域が観察された。正常なウサギの線維柱帯網を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。線維柱帯網は線維柱帯細胞の細い線維（弾性繊維及びコラーゲン線維）の束から成る（図１２Ａ）。極めて稀に、細胞外マトリクスのプラークがこの領域で観察された。より高倍率でも様々な細胞内小器官（核、粗面小胞体、ミトコンドリアを含む）は正常に見え、形態学的な異常は見られなかった（図１２Ｂ）。外用０．１％デキサメタゾンで４２日間にわたって処置したウサギの目の線維柱帯網においては、高電子密度物質の沈着があった（図１２Ｃ）。より高倍率にすると細胞は拡大した粗面小胞体槽を含み、細胞間隙内には基底膜様物質の外筒があった（図１２Ｄ）。一部の核はより多くのヘテロクロマチンを有しているようで、低細胞活性を示している。１ｍＭのフェニル酪酸ナトリウムを４８日間にわたって同時に局所適用した場合は沈着が明白ではなかった（図１２Ｅ）。線維柱帯線維束中の細胞外マトリクスプラークの減少が観察された。流出チャネルに詰まりはなく、コントロールの目における流出チャネルと同様であった。より高倍率にしても粗面小胞体は正常に見え、拡張は見られなかった（図１２Ｆ）。他の小器官（ミトコンドリア、核等）も正常に見えた。

本発明を、目の異常（すなわち高眼圧症、原発性緑内障）を、眼圧の上昇を妨げる及び／又は緑内障を治療するのに十分な４−フェニルブチレートを含有する薬学的に許容可能な化合物で予防及び治療する方法として特徴づけることができる。より具体的には、高眼圧症及び続発性緑内障の患者の眼圧を低下させ、またステロイド誘発性の眼圧上昇及び続発性緑内障の状態に使用することができる。

本方法は、この化合物を、点眼薬、洗眼剤及びアイクリームの１つを介して目に局所適用して投与することを含む。あるいは、化合物を、結膜下、テノン嚢下、前眼房及び硝子体内注射の１つを通じて投与する。あるいは、化合物を、経口薬、皮膚パッチ剤を介して及び注入により全身的にのいずれかで投与する。

化合物中の局所的に使用するフェニル酪酸ナトリウム濃度は０．０１〜１５ｍＭであり、局所適用頻度は１日１〜５回である。

化合物はフェニル酪酸ナトリウムの代謝産物であってもよく、以下に限定するものではないがフェニルアセテート及びアセチルグルタミン又はフェニル酪酸ナトリウムのプロドラッグ又はフェニルブチレートの同様の塩が含まれる。化合物で使用するフェニルブチレート塩のいずれの代謝産物の濃度も、フェニルブチレート塩の濃度と同等である。

フェニルブチレート塩は、より投薬が簡便な放出制御又は持続放出用に製剤することができる。

フェニルブチレート塩、特にフェニル酪酸ナトリウムは、交感神経刺激薬（エピネフリン等の非選択性刺激薬及びアプラクロニジン等のα２刺激薬）、交感神経遮断薬（チモロール、ベフノロール、カルテオロール、ニプラジロール、ベタキソロール、レボブノロール、メチプラノロールを含むβ遮断薬、塩酸ブナゾシン等のα１遮断薬）、副交感神経アゴニスト（ピロカルピン）、炭酸脱水酵素阻害薬（アセタゾラミド、ドルゾラミド）、プロスタグランジン類似体（イソプロピルウノプロストン、ラタノプロスト、トラボプロスト、ビマトプロスト）及びコルチゾール誘導化合物等と共に眼圧上昇を軽減することにおいてその生物学的活性を発揮する。

フェニルブチレート塩、その代謝産物又はプロドラッグを、抗炎症性ステロイドと共に、点眼薬、注射剤又は放出制御若しくは持続放出法（放出が緩慢な体内埋め込み錠等）に製剤する又は分解性の材料フォーマットに含浸させる（結膜下、テノン嚢下、前房内（目の前房に注入）又は硝子体内）ことによってステロイド誘発性の眼圧上昇を予防及び治療することができる。

本発明を、具体的な実施形態に言及しながら説明してきた。他の実施形態は当業者に明らかである。したがって、添付の請求項で指示する場合を除いて、本発明を限定することを意図してはない。

Claims

ステロイド誘発性の眼圧上昇の治療又は予防のための医薬組成物であって、点眼薬、洗眼剤又はアイクリームであり、そして、（１）担体、及び（２）０．０１〜０．１ｍＭの濃度範囲の４−フェニル酪酸ナトリウムを含む、医薬組成物。
ステロイド系抗炎症薬をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
点眼薬である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
洗眼剤である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
アイクリームである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。