JP5897577B2 - レンチウイルスベクターの安定な産生 - Google Patents
レンチウイルスベクターの安定な産生 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5897577B2 JP5897577B2 JP2013526470A JP2013526470A JP5897577B2 JP 5897577 B2 JP5897577 B2 JP 5897577B2 JP 2013526470 A JP2013526470 A JP 2013526470A JP 2013526470 A JP2013526470 A JP 2013526470A JP 5897577 B2 JP5897577 B2 JP 5897577B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- cell line
- cells
- env
- lentiviral
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 114
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 248
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 107
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 85
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 80
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 claims description 39
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 39
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 37
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 37
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 37
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 29
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 26
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 22
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 22
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 claims description 21
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 17
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 15
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 claims description 14
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 12
- 241000713880 Spleen focus-forming virus Species 0.000 claims description 12
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 12
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 12
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 12
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 12
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 12
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 12
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 claims description 10
- 101100118916 Gibbon ape leukemia virus env gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 10
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 10
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 claims description 10
- 101001001300 Human cytomegalovirus (strain Towne) 65 kDa phosphoprotein Proteins 0.000 claims description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 claims description 5
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 claims description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims 4
- 101000802734 Homo sapiens eIF5-mimic protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 102100035859 eIF5-mimic protein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 18
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 13
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 13
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 12
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 9
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 9
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 9
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 9
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 9
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 101150047047 gag-pol gene Proteins 0.000 description 5
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 5
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 4
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 4
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 description 2
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 2
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 2
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 2
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 208000022806 beta-thalassemia major Diseases 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 102000055151 human KITLG Human genes 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 238000013433 optimization analysis Methods 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 1
- 101000645498 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_10220 Proteins 0.000 description 1
- 101100111800 Caenorhabditis elegans best-24 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 101001132313 Clostridium pasteurianum 34.2 kDa protein in rubredoxin operon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 101000618325 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 12.4 kDa protein in mobB-Gp55 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000653284 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 9.4 kDa protein in Gp31-cd intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241001663880 Gammaretrovirus Species 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000283923 Marmota monax Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101000758676 Pyrococcus woesei Uncharacterized 24.7 kDa protein in gap 5'region Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 206010043391 Thalassaemia beta Diseases 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 102000004586 YY1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010042669 YY1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Substances O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940029358 orthoclone okt3 Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 238000013326 plasmid cotransfection Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/866—Baculoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
- C12N15/8673—Special methods for packaging systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14144—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
- C12N2750/14351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/14352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/50—Vectors for producing vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6045—RNA rev transcr viruses
- C12N2810/6054—Retroviridae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Control Of Eletrric Generators (AREA)
Description
本発明の第1の態様によれば、
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAV ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター;および
ii. プロモーターの調節下にあるAAV Repオープンリードフレーム(ORF)を含有する発現プラスミド
から成るレンチウイルスの構造および調節タンパク質を安定発現する系が提供される。
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAV ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター(A)を調製するステップ;および
ii. プロモーターの調節下にあるAAV rep ORFを含有する発現プラスミド(B)を調製するステップ
iii. 細胞を発現プラスミドBでトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクターAに感染させるステップ
iv. 細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップ
v. 安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップ
vi. 細胞にenv遺伝子を組み込むステップ
vii. 細胞を培養してgag、pol、revおよびenvタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップ
を含むものである前記方法である。
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしかつ第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAV ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルス主鎖を含むハイブリッドベクター(A)を調製するステップ;および
ii. プロモーターの調節下にあるAAV rep ORFを含有する発現プラスミド(B)を調製するステップ
iii. 細胞を発現プラスミドBでトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクターAに感染させるステップ
iv. 細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップ
v. 安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップ
vi. かかる細胞にレンチウイルスのtat遺伝子を組み込むステップ
vii. 細胞を培養してgag、pol、revおよびtatタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップ
viii. かかる細胞にenv遺伝子を組み込むステップ
ix. 細胞を培養してgag、pol、rev、tatおよびenvタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップ
を含むものである前記方法である。
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピー
ii. envの少なくとも1つのコピー:
を安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を提供する。
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピー;および
envの少なくとも1つのコピーを安定して含有する安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を培養するステップ;
ii. その安定なパッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップ
を含む前記方法が提供される。
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピー
ii. envの少なくとも1つのコピー:
iii. 導入ベクター
を安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、プロデューサー細胞株が提供される。
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピー
ii. envの少なくとも1つのコピー:
iii. 目的の遺伝子をコードする導入ベクターの少なくとも1つのコピー
を安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、プロデューサー細胞株を培養するステップを含むものである前記方法が提供される。
本発明の好ましい特徴および実施形態の詳細な説明を非限定の例を用いて説明しよう。
本発明はHIV-1-に基づくパッケージング細胞株を作製する新しい戦略を提供する。LV用の産生系の最適化は、LV技法に基づく遺伝子治療薬開発のために解決を要する重要な課題である。この技法を用いる臨床試験数が増加するにも関わらず、LVはかかる試験においてなお一過性トランスフェクションプロトコルを用いて作製されている。この方法では、LVの作製は未だに非常に高価でありかつ多数の患者向けには不満足である。この理由で、LV用の安定パッケージング細胞株を開発する多くの努力がなされてきた。安定なレンチウイルスパッケージング細胞株の開発における重要な課題の1つは宿主細胞を遺伝子操作するための正しいビヒクルの選定である。多くの場合、宿主細胞はプラスミドを用いて遺伝子操作で作られてきたが、かかる場合、ゲノム不安定性および遺伝子サイレンシング現象も観察されている。他の2例ではgag/polおよびrev遺伝子を安定して組み込むために、レトロウイルスベクターが使われている。今まで開発された安定パッケージング細胞株はいずれも臨床試験に用いられていない。
本発明の半-安定パッケージング細胞株は、HIV-1 gag-polおよびrev遺伝子を発現する組換えバキュロ-AAVパッケージング構築物の少なくとも1つのコピーを運ぶ宿主細胞から成る。バキュロ-AAVパッケージングベクターのゲノム組込みは、ITR-介在型AAVベクター組込みを得る目的でAAV repタンパク質の一過性発現により得ている。好ましくは、2つの発現カセットはテール・ツー・テール配向であり、それぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動され;、好ましくは、プロモーターはCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFVおよびRSVから選択される。より好ましくは、構成的プロモーターはCMV IEプロモーターである。
本発明は、安定レンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法を提供する。かかる方法は、2つの発現カセット(すなわち、レンチウイルスのgagおよびpol遺伝子をコードする発現カセットとレンチウイルスのrevおよび選択マーカーをコードする第2の発現カセット)を含有する組込みカセットの少なくとも1つのコピーを安定に組み込むバキュロ-AAVパッケージング構築物の使用に基づく。このカセットの安定な組込みは、宿主細胞におけるITR介在型の安定な組込みを可能にするrepタンパク質の共トランスフェクションによって得ることができる。このように遺伝子操作した宿主細胞を次いで抗生物質の存在のもとで培養し次いでクローニングする。得られる半-安定パッケージング細胞株は第2および第3世代レンチウイルスパッケージング細胞を作製するための出発点である。特に第3世代安定パッケージング細胞株はさらに所望のenvタンパク質を組み込むことによって得られる。第2世代安定パッケージング細胞株は最初にHIV-1 Tatタンパク質、次いで所望のエンベロープを組込むことによって得られる。
i. 上記の安定パッケージング細胞株を培養するステップ
ii. 半-安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップ
を含む、LVを産生する方法を提供する。
プロデューサー細胞株は、目的の遺伝子(GOI)をコードする導入ベクターを安定して組み込むことにより達成することができる。本発明はさらに、かかるプロデューサー細胞株を培養するステップを含む、LVを産生する方法を提供する。
プラスミド
野生型HIV-1 gag、polおよびrev遺伝子を、pCG719-pKLgagpol(以後、簡略化のためにCMV-GPRと呼ぶ)(図1a、模式図13)およびpCG720-pKrev(以後、CMV-Revと呼ぶ)(図1a、模式図9)プラスミドからそれぞれMluI/NarIおよびMluI/NotI消化により切除した[27]。そのウイルス遺伝子を2つの異なる発現カセット(各カセットはCMV IEプロモーターにより駆動され、polyA配列を運ぶ)に入れて、Gateway(登録商標)pENTRTM4シャトルベクター(Invitrogen、Co.、Carlsbad、CA)中にテール・ツー・テール配向で挿入した。第1のカセットはgagとpol遺伝子を発現するが、第2のカセットはrev遺伝子と選択マーカーハイグロマイシン耐性(hygro)遺伝子を発現し;hygroはIRESの下流にクローニングしてバイシストロン(bi-cistronic)翻訳を可能にした。2つの発現ユニットを感染性AAVゲノムを運ぶ組換えpSUB201プラスミドのXbaI部位中に導入した[18]。得られる5'ITR-CMV-GagPol-polyA-polyA-hygro-IRES-Rev-CMV-ITR3'カセットを次いで切除し、Gateway(登録商標)pENTRTM4シャトルベクター中に挿入した。組換えハイブリッドバキュロ-AAVパッケージングベクター(バキュロ-AAV-GPR)(図1a、模式図1)を、2つのカセットを含有するpENTRTM4シャトルエントリーベクターとBaculoDirect直鎖DNA(BaculoDirectTMバキュロウイルス発現系, Invitrogen, Co.)との間のバクテリオファージλ部位-特異的組換え系を用いて得た。相同組換え中に、BaculoDNAのポリヘドリン遺伝子はその際、GPR二重カセットで置換えられた。pABCMV-Rep78発現プラスミド(CMV-AAV-Rep78)は、Recchia et al., 2004[19]に記載の発現ベクターpABS.43のCMV IEプロモーター下のAAV-rep78 ORFをクローニングすることにより得た(図1a、模式図8)。pMD.Gプラスミド(CMV-VSV-G)[20]は小胞性口内炎エンベロープ糖タンパク質(VSV-G)をコードする(図1a、模式図10)。第3世代導入ベクター、pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp(SIN-eGFP)[21]は構成的プロモーターhPGK下のeGFP遺伝子(図 1a、模式図 6)を発現する。抗-HIV-1 Chim3トランスジーンを発現する第2世代PΔN-Chim3導入ベクターはPorcellini ら, 2009 & 2010 [23,24]に記載されている(図1a、模式図7)。SIN-RD114-TRベクター(図1a、模式図3〜5)は次の異なる戦略に従って、ネコ内因性レトロウイルスRD114エンベロープの細胞外および膜貫通ドメインから作られたキメラRD114-TRエンベロープおよびA-MLVenv 4070Aの細胞質テール(TR)をコードするpCMV-RD114-TR(CMV-RD114-TR)(図1a、模式図11)プラスミドから切除したRD114-TR ORFを用いることにより構築した[22]。概略を述べると、CMV-RD114-TR、CMV-RD114-TR-INおよびCMV-RD114-TR-IN-RREカセットをそれぞれSIN-polyMluIベクター(SIN-eGFPベクターの改変バージョンであって、hPGK-eGFPカセットが除去され、EcoRV-MluI-SmaI-MluI-NotI-SacI-BglII-BamHI-SalIポリリンカーで置換された)のMluI部位中にクローニングした。SIN-RD114-TR-INおよびRD114-TR-IN-RRE構築物(それぞれ、図1a、模式図4および5)はCMV-RD114-TRベクター(図1a、模式図11)中に存在するウサギβ-グロビンイントロンを含有する。SIN-RD114-TR-IN-RREにおいて、「PCR分析」の節で記載したPCRで増幅した230-bp RREエレメントをβ-グロビンイントロンエレメントのScaI部位中に組み込んだ。第2世代パッケージングpCMV-ΔR8.74(CMV-GPRT)構築物(図1a、模式図12)はHIV-1gag、pol、revおよびtat遺伝子をコードする[25]。SIN-Tatベクター(図1a、模式図2)は、CMV-GPRTプラスミド(図1a、模式図12)由来のtat遺伝子をpIRESpuro3(Clontech Laboratories Inc., a TakaraBio Company, Mountain View, CA)のEcoRI部位中に挿入することにより、次いでバイシストロンのCMV-Tat-IRES-puroカセットをSIN-polyMluIベクターのMluI中にクローニングすることにより構築した。
Spodoptera frugiperda(Sf9)昆虫細胞(Invitrogen, Co.)は10%FCS(EuroClone Ltd、UK)およびペニシリン-ストレプトマイシンとグルタミン(PSG)の組み合わせを補充したTC-100培地(Invitrogen, Co.)の懸濁液中で27℃にてCO2の非存在のもとで増殖した。ヒト胎児腎293T(HEK293T)細胞およびその誘導体クローン(PK-7およびPK-7誘導体)は10%FCSおよびPSGを補充したDulbecco改変Eagle培地(DMEM)で増殖した。CEM A3.01およびSupT1 T細胞は10%FCSおよびPSGを補充したRPMI 1640中で増殖した。CD34+造血幹細胞(HSC)および新生児白血球は臍帯血(UCB)からFicoll-Hypaque 勾配遠心分離(Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway)で精製した。勾配分離の後、回収したUCB単核細胞環から、CD34マイクロビーズキットおよびMiniMACS分離カラム(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA)を用いてポジティブ選択により、CD34+ HSCを単離した。CD34+細胞純度(>92%)はFACS分析(FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA)およびFlowJoソフトウエア(Tree Star, Inc., Ashland, OR)により、抗-CD34-PEAb(BD PharmingenTM, San Diego, CA)を用いて確立した。CD34+細胞はヒト幹細胞因子(h-SCF)100ng/ml(R&D Systems, Minneapolis, MN)、h-Flt3L 100 ng/ml(Peprotech, Rocky Hill, NJ)、h-IL-620ng/ml(R&D Systems)およびヒトトロンボポエチン(h-Tpo)20ng/ml(Peprotech)を含有する20%血清Iscove改変Dulbecco培地(IMDM)で24時間、前刺激し、形質導入の間、同じ培地中で維持した。新生児白血球は48時間、RPMI中の可溶性抗-ヒトCD3(30ng/ml)(Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK)および組換えヒトIL-2(rhIL-2)50U/ml(Chiron, Emeryville, CA)で刺激し、次いで、10%FCS、PSG、およびrhIL-2を補充したRPMI中に保った。
組換えハイブリッドバキュロ-AAV-GPR DNAゲノムを運ぶバキュロウイルスをGateway(登録商標)適合化バキュロウイルスDNAシステム(Invitrogen、Co.)を用いてBaculoDirect法に従い作製した。組換えバキュロウイルス力価をプラークアッセイにより評価すると、Sf9細胞中の3継代のウイルス増幅後に1×1011 pfu/mlに対応した。1.5×106 HEK293T細胞を4μgのAAV-rep78発現プラスミドでトランスフェクトし、24時間後に組換えバキュロ-AAV-GPRに1,000のMOIにて感染することによりPK-7クローンを得た。細胞をハイグロマイシン無しで4日間維持し、次いで5×105細胞を、ハイグロマイシン(100μg/ml)の連続希釈濃度の存在する22枚の10cmディッシュに播いた。22枚のディッシュをELISAによるp24gag産生についてスクリーニングした。細胞を3.7×104細胞/ディッシュで播いたわずか1枚のディッシュが上清中に十分なp24gagを放出した。このディッシュは40コロニーを含有し、それらを全て拾い上げてスクリーニングした。そのうちの、p24Gag産生に対してポジティブの評価を得た3コロニーをさらに特徴付けた。
HEK293T細胞から産生される偽型LVは、次のプラスミド:パッケージング構築物CMV-GPR(第3世代)[またはCMV-GPRT(第2世代)]、VSV-GまたはRD114-TRエンベロープ構築物、および第3世代SIN-eGFP[26]または第2世代PΔN-Chim3[23]もしくはPΔN-eGFP導入ベクターの一過性共トランスフェクションにより得た。パッケージング:エンベロープ:導入ベクターの比は、特に断らない限り、6.5:3.5:10μg DNAであった。PK-7クローンからのLVはenv発現プラスミドと導入ベクターを共トランスフェクトすることにより作製したが、PK-7-RDおよびPK-7-Tat7-RDクローンから産生したLVは適当な導入ベクターだけをトランスフェクトすることにより得た。一過性トランスフェクションは標準Ca++-リン酸法またはFugene6(登録商標)系を用いて製造業者の取扱説明書(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)に従って実施し、類似の結果を得た。上清をトランスフェクション後48時間に収穫し、0.45μmフィルターを通して濾過した。力価を、SupT1、CEMA3.01、一次活性化末梢血液単核細胞(PBMC)および臍帯血由来のCD34+ HSCについて、実験の型に応じて計算した。概要を説明すると、SupT1と一次活性化末梢血液単核細胞細胞はポリブレン(8μg/ml)(Sigma-Aldrich, StLouis, MO)の存在のもとで2サイクルのスピノキュレーション(1,240×g、1時間)により形質導入し、一晩静置して相を分離し;CD34+ HSCは24時間レトロネクチンをコーティングしたプレート(Takara Bio、Otsu、Japan)上でポリブレン無しで形質導入した。形質導入効率はeGFP発現(SIN-eGFP)のフローサイトメトリー分析(FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA)またはPorcellini et al., 2009および2010[23,24]に記載のFlowJoソフトウエア(Tree Star, Inc., Ashland, OR)を用いるΔLNFGR発現(PΔN-Chim3)によってモニターした。5〜20%ポジティブ細胞の範囲の形質導入値だけを用いて、次式:
TU=[細胞数×(%GFP/100)]/vol sup(mlで)に従って各LV調製物の力価を計算した。
選択を促進するために、本発明者らは全てのPK-7誘導体サブクローンをその上清のLV力価を計算することによりスクリーニングした。本発明者らは、LVを作製するためのCa++-リン酸に基づく小規模の1または2プラスミドの共トランスフェクションを設定し、その効力を次いで小規模形質導入プロトコルによるSupT1細胞について計算した。概略を説明すると、6×104/ウエルPK-7誘導体細胞を48-ウエルプレートに播いて、24時間後、機能的LVを得るために必要な残りのプラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、200μlの培養上清を用いて、7.5×104/mlの濃度で播いた3×104/ウエルSupT1細胞を形質導入した。力価閾値スコアは≧1×102 TU/mlを課した。
ノーザンアッセイ
全RNAをTrizol試薬(Life TechnologiesTM Inc., Gaithersburg, MD)により製造業者の取扱説明書に従って抽出した。5μg/サンプルを0.8%アガロース-ホルムアルデヒドゲル上に流し、キャピラリートランスファーによりHybond-N 膜上に移し、最後にPerfectHyb PLUSハイブリダイゼーションバッファー中の1×106 dpm/mlの32P-標識550-bp RD114-TR プローブ(Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO)で探索した。徹底的に洗浄した後、メンブランをX線フィルムに-70℃にて曝した。
ゲノムDNA(gDNA)をQIAamp Miniキット(QIAGEN GmbH、Germany)により製造業者の取扱説明書に従って単離した。バキュロウイルスDNAをウイルス粒子からQIAamp DNAマイクロキット(QIAGEN)により抽出した。示した制限酵素を用いて一晩消化後、10 μgのgDNAを0.8%アガロースゲルに流し、サザンキャピラリートランスファーによりナイロン膜上にブロットし(Duralon, Stratagene, TX, USA)、次いでPerfectHyb PLUSハイブリダイゼーションバッファー中の1×106 dpm/mlの32P-ランダムプライムド標識した600-bp CMVまたは11-kb GPRカセット、250-bp tat、600-bp Chim3、および 500-bp RD114-TR 特異的プローブとハイブリダイズさせた。徹底的に洗浄した後、メンブランをX線フィルムに-70℃にてまたはホスホイメージャー(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)に曝した。
1ng SIN-eGFPベクターをDNAテンプレートとして、およびプライマーのセット: RRE-フォワード: 5'-AGT ACT GGA GCT TTG TTC CTT GGG-3'; RRE-リバース: 5'-AGT ACT AAA TCC CCA GGA GCT G-3'を、次のPCR条件:98℃にて7分間、30サイクルの94℃にて30秒間、50℃にて30秒間、および72℃にて30秒間で用いることにより、230-bp RREアンプリコンを得た。
培養上清中の物理的LV産生をAlliance HIV-1 p24抗原ELISAキット(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc. Waltham, MA)により製造業者取扱説明書に従い、1pg p24gagが1×104 物理的粒子に対応すると仮定して測定した。
PK-7細胞から誘導した全細胞および核抽出物ならびに単離された細胞を含まないVLPまたはLV由来のウイルスタンパク質を先に記載のように調製した[23,24]。タンパク質をSDS-PAGEによりサイズ分画し、Hybond ECLニトロセルロース膜(GE Healthcare、Life Sciences、UK Ltd、UK)にエレクトロブロットした。膜を5%低脂肪ドライミルクでブロックし、次いで適当な一次Abとインキュベートした。AIDS患者から得た抗-HIV-1血清を1:2,000希釈で用い;タンパク質の外部ドメイン中の2つの15量体ペプチド(aa95-109、QNRRGLDLLTAEQGGおよびaa65-79、SGIVRNKIRTLQEEL)を認識する抗-RD114-TRウサギ血清[22]を1:500希釈で用い;そしてHIV-1revMoAb(Rev-6, sc-69730)およびアフィニティ精製したウサギポリクローナル抗-YY1Ab(C-20, sc-281)(S. Cruz Biotechnology, Inc., S. Cruz, CA)およびマウス抗-p24gag(Acris Antibodies, Germany)をそれぞれ1:200、1:1,000および1:500希釈で用いた。Ab結合を強化化学発光系ECL(ECL, Amersham)により、製造業者の取扱説明書に従って可視化した。
組み込まれたベクターのベクターコピー数(VCN)をABI Prism 7,900 FAST 計器(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いる定量TaqMan PCRにより確認し、SDS 2.3ソフトウエア(Applied Biosystems)により分析した。PCR条件は次の通りである:50℃にて2分間および95℃にて5分間、次いで40サイクルの95℃にて15秒間および60℃(GAG標的配列については0.1℃/サイクルの増分で)にて15秒間。gDNAは次のプライマーとプローブを用いて増幅した。
ゲノムDNAをPK-7細胞からQIAamp DNA Miniキット(QIAGEN)により製造業者の取扱説明書に従って抽出し、そしてBglIIおよびBamHIを用いて37℃にて一晩消化した。5'-GATC-3'粘着末端と適合しうるアダプター76-bpオリゴヌクレオチドリンカーのライゲーションを標準条件で実施した。LM-PCRは次のネスト化プライマーのカップルを用いて行った:ITRフォワード:16s:5'-GTA GCA TGG CGG GTT AAT CA-3'、および17s/ロングネスト化:5'-TTA ACT ACA AGG AAC CCC タグ TGA TGG-3';リンカーリバースプライマー:リンカー-1:5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3'およびリンカー-2ネスト化:5'-AGG GCT CCG CTT AAG GGA C-3'。リンカー配列は5'-GAT CGT CCC TTA AGC GGA GCC CTA タグ TGA GTC GTA TTA CCA GGG AAT TCG CCT CGG GAT ATC ACT CAG CAT AAT G-3'に対応する。2ラウンドのLM-PCRをAmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ (Applied Biosystems)を用いて行い、それぞれ30サイクルから成った(95℃にて30秒間、52℃にて30秒間、72℃にて2分間)。PCRアンプリコンをTOPO(登録商標)クローニングキット(Invitrogen、Co.)を用いてクローニングし、そしておよそ100〜200bpのインサートを運ぶプラスミドコロニーを選択し、配列決定を行った。配列相同性はBLASTサーチ、NCBIにより同定した。
分裂中期染色体はPK-7細胞をコルヒチン(10μg/ml)(Sigma#C9754)で37℃にて2時間処理することによって得た。リン酸バッファー生理食塩水(PBS)で洗浄した後、細胞を低浸透圧溶液(75mM KCl)中に室温にて6分間保持し、メタノール/酢酸(3:1)で4回洗浄して固定し、次いで清浄なガラススライド上に延ばした。細胞遺伝子サンプルを70%ホルムアミド溶液中で2分間72℃にて変性し、冷温の70%、85%、および95%エタノールの連続洗浄により脱水し次いで空気乾燥した。特異的プローブを次の通り調製した:GPRカセットを含有する13-kbプラスミドDNAはランダムプライムドDNA標識キット(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を用いてSpectrumOrangeTM-dUTP (Vysis、Inc.、Downers Grove、IL)で標識したが、ヒトhox4遺伝子を含有する対照30-kbコスミドDNAはFISHBrightTM核酸標識キット(Kreatech Biotechnology、Amsterdam、The Netherlands)を用いて標識した。ハイブリダイゼーションは、5ng/μlの各プローブを含む250μlの50%ホルムアミド、2×SSC、および10%硫酸デキストランおよび50ng/μlのヒトC0T-1 DNAハイブリダイゼーションバッファー(Invitrogen)をインキュベートすることにより実施した。サンプルを変性したプローブで10分間75℃にてコートし、Parafilm(登録商標)Mで覆い、そして一晩37℃にて加湿室でインキュベートした。サンプルを1回、0.4×SSC中で、pH=7、72℃にて2分間;1回、4×0.0025% Tween-20を含有するSSC中で、pH=7、RTにて30秒間;ならびに2回、PBS 1×RTにて1分間洗浄した。スライドを0.02μg/μlの49,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Sigma)で対比染色した。可視化と写真撮影はNikon 80i正立顕微鏡(Nikon Instruments S.p.A.、Italy)で、(FITC)およびスペクトルオレンジ色(スペクトルオレンジ色)フィルター照明を用いて行った。画像はGenikonソフトウエア(Nikon)で処理した。
第2または第3世代LVの連続産生用のRD-MolPackパッケージング細胞株を得るために、いくつかのHEK293T由来の中間体クローンを開発した。最初のものは、PK-7と名付けられ、組換えハイブリッドバキュロ-AAVベクター(rhバキュロ-AAV-GPR)(図1a、模式図1)を使ってHIV-1 gag、polおよびrev遺伝子を安定して組み込むことにより得た。この送達系は、一過性で与えられるAAV-rep78タンパク質のインテグラーゼ活性を利用し、AAV ITR-隣接組込みカセットを切除してヒト染色体中に組み込む(図1b)。rh-バキュロ-AAVベクターはBaculoDirect Linear DNAとITR-隣接GPRカセットを含有するGateway(登録商標)pENTRTM4エントリープラスミドの間の相同組換えにより作製した(図1a、模式図1)。Sf9昆虫細胞における3サイクル(p3)の組換えバキュロウイルス増幅の後、ハイブリッドバキュロ-AAV DNAの力価と潜在的組換え事象をプラークアッセイおよびウイルスのゲノムDNAサザンブロットによりそれぞれチェックした。p3における力価は6×1010pfu/mlに対応し、サザンブロット分析は単一の鋭いバンドを現し、ウイルス増幅プロセス中に組換え事象が無いことを示した(図5)。
第2世代RD-MolPack(図1c)の開発に向けた次のステップは、SIN-LV送達を用いる、HIV-1調節因子TatのPK-7細胞中への安定な組込みにある(図1、模式図2)。細胞を2サイクルのスピノキュレーションにより形質導入し次いでピューロマイシン選択後の限定希釈によりクローニングした。11個の増殖クローンを拾い上げ、p24gag産生に基づく第1スクリーニング後に、Tat発現を、≧5ng p24gag/1×106細胞価を示す5個のクローンから得た核抽出物を用いてウェスタンブロットにより確立した。PK-7-Tat5とPK-7-Tat7クローンだけが高レベルのtat(図3a)およびp24gag(図3b)を提示した。従って、これらの2つのクローンだけを、TaqMan PCRにより確立することにより、PK-7-Tat5は12個のおよびPK-7-Tat7は6個の遺伝子を含有することを特徴付けた;LV効力も残るVSV-GエンベローププラスミドおよびPΔN-eGFP第2世代導入ベクターを共トランスフェクトすることにより測定した。両方のクローンの力価は対照細胞より2対数値低かったが、感染性は1対数値だけ低かった(表 3)。これに基づいて、PK-7-Tat7を中間体クローンとして選択し、続いてこのクローンにRD114-TRエンベロープを組込んだ。
RD114-TRエンベロープをSIN-LV送達によりPK-7およびPK-7-Tat7クローン中に加える数多くの試みのうちの第1は、SIN-RD114-TRベクター(図1a、模式図3)の構築であった。この目的のために、SIN-eGFPベクター(図1a、模式図6)のPGK-eGFPカセットをCMV-RD114-TRカセットで置換したが、このカセットは元来のCMV-RD114-TRプラスミド(図1a、模式図11)中に存在するβ-グロビンイントロンを含有しなかった。SINベクターのパッケージングシグナル上流に位置する強いスプライスドナー(SD)のcPPTエレメント上流に位置するスプライスアクセプター(SA)とだけでなくさらにβ-グロビンイントロンのSAとにより駆動される多重スプライシング事象を恐れて、β-グロビンイントロンを最初に構築物から排除したのである。後者の場合、実際、スプライシングはCMVプロモーターをベクター(図1、模式図6)のゲノムDNAから除去しうる。驚いたことに、このSIN-ベクターおよび同じ発現カセット立体配置をもつ全ての中間体プラスミドはRD114-TRタンパク質を産生しなかった。実際、SIN-RD114-TRを用いてトランスフェクション(TF)または形質導入(TD)した細胞から得た細胞抽出物をウェスタンブロットにより分析すると、RD114-TRタンパク質のレベルはCMV-RD114-TR対照プラスミドから得たものと比較して、不検出であった(図4a、レーン1〜3)。ノーザンブロット分析は、プラスミドのPK-7細胞中へのトランスフェクション後に作製されるSIN-RD114-TR-特異的転写物は全長(FL)および単一スプライス転写物に対応するが、内部CMV-RD114-TRカセットのそれに対応しないことを示し(図6、レーン1および2)、効率的なRD114-TR転写物蓄積にはβ-グロビンイントロンが必要である可能性を示唆した。
以上提示した結果に基づいて、RD114-TRエンベロープをPK-7-Tat7およびPK-7 クローンの両方に、VSV-G偽型SIN-RD114-TR-IN-RRE LV送達により安定して組込んだ。PK-7-Tat7細胞をスピノキュレートし、限定希釈によりクローニングした。次に、第2世代PΔN-eGFP導入ベクター(表4)の形質導入後に産生したLVの力価を計算することにより、9つのクローンをスクリーニングした;RD114-TRのレベルはウェスタンブロットにより調節しそしてTaqMan PCRだけによりこれらのクローン、すなわち、PK-7-Tat7-RD3、PK-7-Tat7-RD12、およびPK-7-Tat7-RD19クローン(図4b)に組み込まれたコピー数は力価≧1×105 TU/mlを示した。PK-7-Tat7-RD19クローンを選択したが、その理由は、これが最高の力価およびSIN-RD114-TR-IN-RRE LV組込みコピー数(図4b、括弧内の数字)について良い量のRD114-TRを産生したからである。
最後の第2世代RD-MolPackパッケージング細胞を得るために、抗-HIV/AIDS遺伝子治療の関係で詳しく特徴付けられている治療遺伝子Chim3の導入ベクターPΔN-Chim3[23、24](図1a、模式図7)をPK-7-Tat7-RD19細胞に組込んだ。標準スクリーニングプロトコルの後に、3つのクローンPK-7-Tat7-RD19-Chim3.2、PK-7-Tat7-RD19-Chim3.3およびPK-7-Tat7-RD19-Chim3.14(表6)を選んでさらに特徴付けを行った。
Claims (30)
- 安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法であって、
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgag遺伝子およびpol遺伝子をそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrev遺伝子および抗生物質耐性遺伝子である選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むAAV ITRに隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクター(A)を調製するステップ;および
ii. プロモーターの調節下にあるAAV Repタンパク質オープンリーディングフレーム(ORF)を含有する発現プラスミド(B)を調製するステップ
iii. 細胞を発現プラスミド(B)でトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクター(A)に感染させるステップ
iv. 細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップ
v. 安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップ
vi. 細胞にenv遺伝子を組み込むステップ
vii. 細胞を培養してgag、pol、revおよびenvタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップ
を含むものである前記方法。 - 安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を得る方法であって、
i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgag遺伝子およびpol遺伝子をそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrev遺伝子および抗生物質耐性遺伝子である選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含むアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)に隣接した組込みカセットを含有するバキュロウイルスの主鎖を含むハイブリッドベクター(A)を調製するステップ;および
ii. プロモーターの調節下にあるAAV Repタンパク質ORFを含有する発現プラスミド(B)を調製するステップ
iii. 細胞を発現プラスミド(B)でトランスフェクトし、続いて細胞をハイブリッドベクター(A)に感染させるステップ
iv. 細胞を選択用の抗生物質の存在のもとで培養するステップ
v. 安定してgag、polおよびrevタンパク質を発現する細胞を得るステップ
vi. かかる細胞にレンチウイルスtat遺伝子を組み込むステップ
vii. 細胞を培養してgag、pol、revおよびtatタンパク質を安定して発現する細胞株を得るステップ
viii. かかる細胞にenv遺伝子を組み込むステップ
ix. 細胞を培養して安定してgag、pol、rev、tatおよびenvタンパク質を発現する細胞株を得るステップ
を含むものである前記方法。 - ハイブリッドベクターの2つの発現カセットがテール・ツー・テール配向でありかつそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項1または2に記載の方法。
- プロモーターがCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV、およびRSVから選択される、請求項3に記載の方法。
- プロモーターがCMV IEである、請求項4に記載の方法。
- 選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンまたはゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 選択マーカーがハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項6に記載の方法。
- 選択マーカーがIRES下流にクローニングされる、請求項1または7に記載の方法。
- AAV Repタンパク質がRep78である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- env遺伝子がMLV4070 env遺伝子、RD114 env遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-proをコードする遺伝子、バキュロウイルスGP64 env遺伝子またはGALV env遺伝子から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- env遺伝子がキメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子である、請求項10に記載の方法。
- RD114-TRを、5'から3'末端へCMVプロモーター、その配列中にRREエレメントを含有するβ-グロビンイントロン、およびRD114-TR ORFを含有する発現カセットを含むSINレンチウイルスベクターを用いて組み込む、請求項11に記載の方法。
- i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgag遺伝子およびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrev遺伝子および抗生物質耐性遺伝子である選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピー
ii. env遺伝子の少なくとも1つのコピー:
を安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。 - 細胞が安定してゲノム中に組み込まれたHIV-1 tat遺伝子をさらに含有する、請求項13に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。
- 細胞がHEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株である、請求項13または14に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。
- 組込みカセットの2つの発現カセットがテール・ツー・テール配向でありそれぞれが構成的なプロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。
- プロモーターがCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV、およびRSVから選択される、請求項13〜16のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。
- 選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンまたはゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項13〜17のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。
- env遺伝子がMLV4070 env遺伝子、RD114 env遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-proをコードする遺伝子、バキュロウイルスGP64 env遺伝子またはGALV env遺伝子から選択される、請求項13〜18のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。
- env遺伝子がキメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株。
- i. 請求項13〜20のいずれか一項に記載の安定なレンチウイルスパッケージング細胞株を培養するステップ;
ii. 安定パッケージング細胞株に導入ベクターを挿入するステップ
を含むレンチウイルスベクターを産生する方法。 - i. 第1の発現カセットがレンチウイルスのgag遺伝子およびpol遺伝子をコードしそして第2の発現カセットがレンチウイルスのrev遺伝子および抗生物質耐性遺伝子である選択マーカーをコードする2つの発現カセットを含む、AAV ITRに隣接した組込みカセットの少なくとも1つのコピー
ii. env遺伝子の少なくとも1つのコピー:
iii. 導入ベクター
を安定してそのゲノム中に組み込んで含有する、プロデューサー細胞株。 - 細胞がさらに、安定してそのゲノム中に組込まれたレンチウイルスのtat遺伝子の少なくとも1つのコピーを含有する、請求項22に記載のプロデューサー細胞株。
- 細胞がHEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080またはHeLaから選択されるヒト細胞株である、請求項22または23に記載のプロデューサー細胞株。
- ハイブリッドベクターの2つの発現カセットがテール・ツー・テール配向でありそれぞれが構成的プロモーターおよびポリAにより駆動される、請求項22〜24のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。
- プロモーターがCMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV、およびRSVから選択される、請求項22〜25のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。
- 選択マーカーがハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンまたはゼオマイシン耐性遺伝子から選択される、請求項22〜26のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。
- env遺伝子がMLV 4070 env遺伝子、RD114 env遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子、キメラエンベロープタンパク質RD114-proをコードする遺伝子、バキュロウイルスGP64 env遺伝子またはGALV env遺伝子から選択される、請求項22〜27のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。
- env遺伝子がキメラエンベロープタンパク質RD114-TRをコードする遺伝子である、請求項22〜28のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株。
- 請求項22〜29のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞株を培養するステップを含む、レンチウイルスベクターを産生する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10175088 | 2010-09-02 | ||
EP10175088.3 | 2010-09-02 | ||
PCT/EP2011/065090 WO2012028681A1 (en) | 2010-09-02 | 2011-09-01 | Stable production of lentiviral vectors |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013537801A JP2013537801A (ja) | 2013-10-07 |
JP2013537801A5 JP2013537801A5 (ja) | 2014-10-16 |
JP5897577B2 true JP5897577B2 (ja) | 2016-03-30 |
Family
ID=44534436
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013526470A Expired - Fee Related JP5897577B2 (ja) | 2010-09-02 | 2011-09-01 | レンチウイルスベクターの安定な産生 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9441245B2 (ja) |
EP (1) | EP2480678B1 (ja) |
JP (1) | JP5897577B2 (ja) |
KR (1) | KR101990068B1 (ja) |
CN (1) | CN103228790B (ja) |
AU (1) | AU2011298333B2 (ja) |
BR (2) | BR112013005139A2 (ja) |
CA (1) | CA2809453C (ja) |
CY (1) | CY1115053T1 (ja) |
DK (2) | DK2480678T3 (ja) |
ES (2) | ES2537184T3 (ja) |
HK (2) | HK1184822A1 (ja) |
HR (1) | HRP20140392T1 (ja) |
IL (2) | IL224520A (ja) |
NZ (2) | NZ607686A (ja) |
PL (1) | PL2480678T3 (ja) |
PT (2) | PT2480677E (ja) |
RS (1) | RS53344B (ja) |
RU (2) | RU2577979C2 (ja) |
SI (1) | SI2480678T1 (ja) |
SM (1) | SMT201400058B (ja) |
WO (1) | WO2012028681A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201300998B (ja) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103228790B (zh) * | 2010-09-02 | 2015-08-19 | 莫尔梅德股份有限公司 | 慢病毒载体的稳定生产 |
CA2809447C (en) | 2010-09-02 | 2019-12-03 | Molmed S.P.A. | Semi-stable production of lentiviral vectors |
CA2848939A1 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-11 | Molmed Spa | Viral vectors purification system |
PT2956477T (pt) | 2013-02-15 | 2021-02-05 | Bioverativ Therapeutics Inc | Gene do fator viii otimizado |
EP3302556A4 (en) * | 2015-05-29 | 2018-12-05 | Clark Atlanta University | Human cell lines mutant for zic2 |
US10450574B2 (en) | 2015-11-24 | 2019-10-22 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Transient transfection method for retroviral production |
KR102091957B1 (ko) * | 2015-11-24 | 2020-03-20 | 글락소스미스클라인 인털렉츄얼 프로퍼티 디벨로프먼트 리미티드 | 레트로바이러스 생산을 위한 안정한 세포주 |
EP3394271B1 (en) * | 2015-12-21 | 2020-05-20 | MolMed SpA | Stable integration of sin lentiviral transfer vectors |
EP3452102B1 (en) * | 2016-04-15 | 2024-06-12 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Gene therapy for treating hemophilia a |
CN105950664B (zh) * | 2016-05-17 | 2019-03-29 | 上海优卡迪生物医药科技有限公司 | 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用 |
CN105950663B (zh) * | 2016-05-17 | 2019-04-02 | 上海优卡迪生物医药科技有限公司 | 一种靶向cd30的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用 |
CN105950662B (zh) * | 2016-05-17 | 2019-04-30 | 上海优卡迪生物医药科技有限公司 | 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用 |
CN105969805B (zh) * | 2016-05-17 | 2019-03-29 | 上海优卡迪生物医药科技有限公司 | 一种靶向Mesothelin的复制缺陷性重组慢病毒CAR-T转基因载体及其构建方法和应用 |
GB201706121D0 (en) * | 2017-04-18 | 2017-05-31 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Stable cell lines for retroviral production |
GB201715052D0 (en) | 2017-09-19 | 2017-11-01 | Oxford Genetics Ltd | Vectors |
EP3696272A1 (en) * | 2017-12-22 | 2020-08-19 | Oxford BioMedica (UK) Limited | Retroviral vector |
WO2019134866A1 (en) | 2018-01-03 | 2019-07-11 | Molmed Spa | Chimeric antigen receptors containing optimal spacer region |
EP3802796A1 (en) | 2018-05-30 | 2021-04-14 | Glycostem Therapeutics B.V. | Car nk cells |
EP3854879A4 (en) * | 2018-09-20 | 2022-06-22 | National University Corporation Tokyo Medical and Dental University | METHOD OF INCREASING THE PRODUCTION OF LENTIVIRUS VECTORS |
CN110184300A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-30 | 安徽环球基因科技有限公司 | 一种利用稳定细胞株生产膜蛋白的方法 |
CN110982842B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-04-18 | 山西大学 | 一种慢病毒表达载体的设计及应用 |
KR20230056669A (ko) | 2020-07-27 | 2023-04-27 | 안자리움 바이오사이언시스 아게 | Dna 분자의 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법 |
AU2022371427A1 (en) * | 2021-10-19 | 2024-03-14 | Amgen Inc. | Composition and methods for recombinant lentiviral production |
GB202213936D0 (en) * | 2022-09-23 | 2022-11-09 | Imperial College Innovations Ltd | Introns |
CN116731974A (zh) * | 2023-05-23 | 2023-09-12 | 杭州荣谷生物科技有限公司 | 病毒的制备方法和应用 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6013516A (en) * | 1995-10-06 | 2000-01-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells |
IT1291135B1 (it) * | 1997-04-08 | 1998-12-29 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica |
CA2344208A1 (en) * | 2001-04-30 | 2002-10-30 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Method |
RU2312896C2 (ru) * | 2001-09-20 | 2007-12-20 | Глаксо Груп Лимитед | Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок gag вич-1, способ получения указанной последовательности, вектор, содержащий ее, белок, кодируемый ею, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики и/или лечения вич-инфекции и спида |
GB0220467D0 (en) * | 2002-09-03 | 2002-10-09 | Oxford Biomedica Ltd | Composition |
US7090837B2 (en) * | 2003-01-21 | 2006-08-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Compositions and methods for tissue specific targeting of lentivirus vectors |
WO2005072364A2 (en) * | 2004-01-27 | 2005-08-11 | University Of Florida | A modified baculovirus expression system for production of pseudotyped raav vector |
WO2009104964A1 (en) * | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. | Optimisation of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells |
CA2809447C (en) | 2010-09-02 | 2019-12-03 | Molmed S.P.A. | Semi-stable production of lentiviral vectors |
CN103228790B (zh) * | 2010-09-02 | 2015-08-19 | 莫尔梅德股份有限公司 | 慢病毒载体的稳定生产 |
CA2848939A1 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-11 | Molmed Spa | Viral vectors purification system |
-
2011
- 2011-09-01 CN CN201180042473.2A patent/CN103228790B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-01 BR BR112013005139A patent/BR112013005139A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-09-01 KR KR1020137008387A patent/KR101990068B1/ko active IP Right Grant
- 2011-09-01 WO PCT/EP2011/065090 patent/WO2012028681A1/en active Application Filing
- 2011-09-01 BR BR112013005120-5A patent/BR112013005120A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-09-01 NZ NZ607686A patent/NZ607686A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-09-01 PT PT117498493T patent/PT2480677E/pt unknown
- 2011-09-01 NZ NZ607690A patent/NZ607690A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-09-01 RU RU2013114444/10A patent/RU2577979C2/ru active
- 2011-09-01 PL PL11752530T patent/PL2480678T3/pl unknown
- 2011-09-01 ES ES11749849.3T patent/ES2537184T3/es active Active
- 2011-09-01 RS RS20140236A patent/RS53344B/en unknown
- 2011-09-01 DK DK11752530.3T patent/DK2480678T3/da active
- 2011-09-01 JP JP2013526470A patent/JP5897577B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-01 SI SI201130152T patent/SI2480678T1/sl unknown
- 2011-09-01 ES ES11752530.3T patent/ES2460947T3/es active Active
- 2011-09-01 US US13/819,991 patent/US9441245B2/en active Active
- 2011-09-01 PT PT117525303T patent/PT2480678E/pt unknown
- 2011-09-01 EP EP11752530.3A patent/EP2480678B1/en active Active
- 2011-09-01 CA CA2809453A patent/CA2809453C/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-01 RU RU2013114445/10A patent/RU2577982C2/ru active
- 2011-09-01 AU AU2011298333A patent/AU2011298333B2/en not_active Ceased
- 2011-09-01 DK DK11749849.3T patent/DK2480677T3/en active
-
2013
- 2013-01-31 IL IL224520A patent/IL224520A/en active IP Right Grant
- 2013-01-31 IL IL224521A patent/IL224521A/en active IP Right Grant
- 2013-02-06 ZA ZA2013/00998A patent/ZA201300998B/en unknown
- 2013-10-29 HK HK13112180.0A patent/HK1184822A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-01-29 HK HK14100990.4A patent/HK1187953A1/zh not_active IP Right Cessation
- 2014-04-30 HR HRP20140392AT patent/HRP20140392T1/hr unknown
- 2014-05-06 CY CY20141100321T patent/CY1115053T1/el unknown
- 2014-05-07 SM SM201400058T patent/SMT201400058B/xx unknown
-
2016
- 2016-08-02 US US15/226,762 patent/US10144937B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-10-22 US US16/166,459 patent/US20190284574A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5897577B2 (ja) | レンチウイルスベクターの安定な産生 | |
Stornaiuolo et al. | RD2-MolPack-Chim3, a packaging cell line for stable production of lentiviral vectors for anti-HIV gene therapy | |
Howarth et al. | Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells) | |
JP5897576B2 (ja) | レンチウイルスベクターの半−安定産生 | |
JP7384457B2 (ja) | ウイルスベクターを調製するための組成物および方法 | |
WO2020059848A1 (ja) | レンチウイルスベクター産生の増強方法 | |
van Heuvel | Optimization of retroviral packaging cells for scale-up of vector production | |
Ruggieri et al. | SIV vectors | |
Yasemin van Heuvel | Optimization of retroviral packaging cells for scale-up of vector production | |
Smith et al. | Viral Vectors for HIV Gene Therapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20140828 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140828 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151013 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160125 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160223 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160302 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5897577 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |