BR112013005120A2 - produção semiestável de vetores lentivirais - Google Patents

Abstract

PRODUÇÃO SEMIESTÁVEL DE VETORES LENTIVIRAIS. A presente invenção refere-se a uma nova linhagem de células de encapsulação semiestáveis e um método para a produção de vetores lentivirais (LV), usando a linhagem de células de encapsulação semiestáveis. Os métodos novos e as linhas encapsulação da célula da invenção são gerados usando um sistema híbrido do baculo-AAV para expressão estável de proteína lentiviral estruturais e regulamentares, tall sistema que compreende uma cadeia principal baculoviral que contém um cassete da integração flanqueada por AAV ITRs, em combinação com um plasmídio que codifica a proteína do representante. Este sistema reserva para obter uma integração estável Hiv-1 das proteínas estruturais e regulamentares gag/pol e rev. O sistema reserva para obter uma linha da célula incluindo somente as proteínas estruturais e regulamentares gag/pol e rev do HIV, para ser usado para um íon semiestável do produto do LV.

Description

. . Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO SEMIESTÁVEL DE VETORES LENTIVIRAIS". Y Campo da Invenção A presente invenção refere-se à produção de vetores lentivirais (LV) para a terapia de genes. Mais particularmente, a invenção refere-se a linhagens de células de encapsulação lentivirais semiestáveis e aos métodos de fabricação de linhagens de células de encapsulação lentivirais semiestá- veis usando um vetor de vírus baculo-Adeno associado (AAV) híbrido para a integração estável de proteínas lentivirais estruturais e reguladoras. Antecedentes : Desde a primeira de todas as experimentações clínicas de LV da . fase | contra a AIDS em 2001, 38 experimentações da fase |-Il e de duas fases II-Ill que exploram o LV baseado em HIV como veículos da aplicação do gene foram submetidas ao escrutínio das autoridades; três delas estão ainda sendo revisadas. O número maior das experimentações compreende os distúrbios monogênicos, alguns dos quais com uma grande incidência, tal como a grande f-talassemia anemia de Cooley (4 experimentações). Se- guem o câncer e as doenças infecciosas, principalmente a infecção por HIV-

1. Geralmente, o número de pacientes registrados em experimentações da fasel/llé limitado, mas não aquele na fase Ill. Desse modo, as linhagens de células de encapsulação estáveis a 2º geração de LV (baseada com LTR) e a 3º geração de LV (baseada em SIN) são urgentemente necessárias para satisfazer de modo esperançoso a demanda da produção em larga escala de LV para as experimentações da fase Ill que podem ser obtidas no futuro emum número maior. A produção de LV baseada em protocolos transientes é certamente pouco prática para a aplicação global sob um ponto de vista de segurança, de custo e de reprodutibilidade. Um corpo crescente de evidência indica que o LV, os vetores de integração virais mais recentemente desenvolvidos para a terapia de gene, é amplamente aplicável para a transdução de células tanto terminalmente dife- renciadas quanto cíclicas, ideais para sustentar a expressão de transgene a longo prazo e mais seguras do que o que foi temido inicialmente. A experi-

. - ência acumulada em vetores gama-retrovirais (yRV) do vírus de leucemia de murinos Moloney (MoMLV) nas duas últimas décadas guiou o progresso rá- ' pido no sistema de aplicação do LV, cujo desenvolvimento foi originado pela necessidade de superar a inabilidade do retrovírus de transduzir células que — nãode divisão.

Em particular, a geração de vetores de transferência de au- toinativação (SIN) torna o prospecto de um grande uso do LV em experimen- tações clínicas humanas mais exequível' diante da expansão e da otimiza- ção de um processo de fabricação muito eficiente.

No entanto, ao contrário de yRV, que podem ser produzidos por várias linhagens de células de en- capsulação comercialmente disponíveis humanas e de murinos, os LV são produzidos atualmente não somente para o grau de pesquisa, mas também - para o grau de GMP, quase que exclusivamente pela transfecção transiente.

Essa tecnologia é cara, difícil de padronizar e escalonar e requer numerosos testes de validação a jusante.

Além disso, o risco dos lentivírus com compe- tência de replicação (RCL), possivelmente se elevando através da recombi- nação entre sequências virais nos construtos de vetores de encapsulação e transferência, é um evento raro, mas mais provável durante a produção tran-

siente do que a produção estável.

O desenvolvimento de uma linhagem de células de encapsula- ção estável equivalente à retroviral para o LV ficou mais lento e mais difícil porque, ao contrário do retrovírus gama, a expressão de proteínas lentivirais, tais como env, protease, e algumas proteinas acessórias, é tóxica para as células humanas.

Para superar esse problema os genes acessórios, presen- tes nas primeiras versões de células de encapsulação, foram removidos mais tarde nas gerações posteriores.

A primeira geração de linhagens de células de encapsulação baseadas em SIV e em HIV foi obtida a partir do macaco Vero, ou então de células?” aderentes COS, heLa e 293 humanas, desenvolvidas por engenharia genética com os genomas de lentivírus que contêm poucas modificações cruciais tais como a remoção do sinal de en- capsulação.

O gp120 env e a maior parte dos genes acessórios foram de fato mantidos.

O título de LV resultante era muito baixo”, e mais preponde- rantemente a aplicação possível desses vetores foi restringida necessaria-

- - mente às células CD4* T para abordagens da terapia de gene anti-AIDS. Mais tarde, o gp120 env foi substituído pela glicoproteína derivada do vírus À de estomatite vesicular (VSV-G) e todos os genes acessórios foram removi- dos porque provaram ser dispensáveis para uma produção eficiente de LV. Para impedir a toxicidade descrita também para VSV-G, a sua expressão foi induzida condicionalmente por uma variedade de sistemas diferentes, tais como Tet, ecdysone, Rev e a combinação de Tet e cumate*. Similarmente, para reduzir o efeito tóxico da protease viral durante a seleção de clone, a expressão condicional do gene gag-pol pelo Tet e a combinação de drogas de doxiciclina e cumate foram descritas. Em todos estes sistemas de gag- : pol, os genes rev e env foram integrados pela transfecção transiente do DNA - de plasmídio, seguida pela seleção da droga e pela clonagem de célula.

Uma questão crucial para a implementação de uma linhagem de células de encapsulação verdadeiramente estável é a escolha dos melhores veículos virais de aplicação de gene. A maioria dos pesquisadores integrou os genes de gag-pol, rev e env pela transfecção transiente do DNA de plas- mídio, seguida pela seleção da droga e pela clonagem? * de célula. É sabido que essa tecnologia apresenta silenciamento de gene e perda” de gene com o passar do tempo, os quais podem ambos prejudicar a estabilidade a longo prazo do clone de encapsulação.

Veículos alternativos de aplicação de gene foram apresentados particularmente em STAR11 e nas linhagens de células de encapsulação GPRG-TL-20*? mais recentemente desenvolvidas, onde os genes de gap, pol e rev foram integrados em células HEK293T por vetores de transporte MLV. Duas cópias do gene gag-pol recodificado foram integradas de manei- ra estável em STAR, ao passo que nenhuma de tal informação é disponível para GPRG-TL-20"?, Ao contrário de STAR, onde o gene env foi transfecta- do, em GPRG-TL20 todos os genes virais restantes foram introduzidos por SIN-MLV.

Há vários sistemas que permitem a integração estável de geno- ma estranho em células hospedeiras. Palombo et al., 199813 apresentam um vetor de baculovírus-AAV híbrido para a integração específica em células

. - — hospedeiras. Tal vetor parece ser muito eficaz se ele incluir o gene rep no mesmo vetor de baculovírus-AVV híbrido. Não há nenhuma menção nessa Y referência sobre o construto da presente invenção a não ser a sugestão do uso desse tipo de sistema para a produção do LV.

Por quase as duas últimas décadas, foram feitas várias tentati- vas de gerar linhagens de células de encapsulação de LV estáveis. Apesar da tecnologia diferente apresentada, atualmente nenhuma dessas linhagens de células de encapsulação é ainda empregada em experimentações clíni- cas ou cantos no mercado. Portanto, há uma necessidade quanto a sistemas novos para a produção em larga escala de LV que sejam eficazes em ter- : mos da capacidade de produção e sejam seguros, econômicos e reproduzi- - veis.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se ao campo da produção de LV. Vá- rias experimentações clínicas de terapia de gene estão empregando conti- nuamente o LV como um veículo de aplicação de gene. Em todas estas ex- perimentações a produção de |V ainda é baseada em protocolos transien- tes.

A presente invenção apresenta uma estratégia nova para a ge- ração de uma linhagem de células de encapsulação baseada em HIV-1. Tal estratégia é baseada no uso de um vetor híbrido que compreende a cadeia principal baculoviral que contém um cassete de integração flanqueado por repetições de terminais invertidos de AAV (ITRs), o chamado sistema híbrido baculo-AAV, em combinação com um plasmídio que codifica uma proteína rep. Esse sistema permite obter uma integração estável das proteínas estru- turais e reguladoras de HIV-1 gag/pol e rev. O sistema da presente invenção inclui a) um vetor híbrido de baculo-AAV caracterizado por conter dois cas- setes de expressão, um que codifica os genes gag e pol lentivirais e o outro rev lentiviral e um marcador de seleção, e b) um plasmídio que codifica uma proteína rep. O sistema proposto representa uma maneira nova e vantajosa entregar a fim de aplicação de proteínas estruturais e reguladoras de HIV a fim de projetar de maneira estável e eficazmente células hospedeiras com

- - proteínas lentivirais estruturais. Ao usar esse sistema, foi obtido um primeiro intermediário que inclui somente as proteínas estruturais e reguladoras : gag/pol e rev de HIV, para ser usado para uma produção de LV semiestável ou como ponto de partida para obter as linhagens de células de encapsula- çãoda2?eda 3º gerações incluindo opcionalmente a proteína reguladora (Tat) e a proteína de envelope de interesse, bem como linhagens de células produtoras que também incluem o vetor de transferência. O primeiro intermediário contém duas cópias do construto de encapsulação de baculo-AAV recombinante que expressa os genes gag-pol erevde HIV1 em uma configuração tri-cistrônica. Tal intermediário foi de- : nominado PK-7 e é indicado como PK-7 nos exemplos. A integração de ge- . noma do vetor de encapsulação de baculo-AAV foi facilitada pela expressão transiente da proteína AAV Rep78 que é conhecida como necessária para a integração** de um vetor AAV mediado por ITR. Tal primeiro intermediário mostrou ter uma estabilidade genética surpreendente por 1 ano de cultura que provou a produção contínua de LV funcional após a transfecção transi- ente dos elementos genéticos restantes. Além disso, nenhum fenômeno de silenciamento foi observado em tais células. Além disso, ao mapear com precisão o sítio de integração dos dois vetores AAV de encapsulação inte- grados em tandem em uma região transcripcionalmente ativa intergênica de não codificação, foi provido um argumento de segurança contra a possível ativação de genes perigosos cujo MRNA pode ser incorporado no LV e, e- ventualmente, nas células hospedeiras alvo.

O sistema de encapsulação desenvolvido baseado no uso de um —vetorde baculo-AAV híbrido para a expressão estável de gag-pol e ver lenti- viral foi denominado "MolPack". O sistema de expressão usado na presente invenção permite vantajosamente a introdução estável e segura de proteínas estruturais (gag/pol) e reguladoras (ver) de HIV, em somente uma rodada de transfecção e clonagem. A produção de LV empregada atualmente em expe- rimentações clínicas ainda é baseada na transfecção transiente de todas as proteinas requeridas. Por outro lado, o intermediário obtido com o sistema de expressão da presente invenção é estável, não exibe fenômenos de si-

- - —lenciamento, e permite desenvolver uma produção de LV semiestável com grandes vantagens do ponto de vista econômico. De fato, a produção semi- estável requer que um número reduzido de construtos seja transfectado para obter o produto final. Além disso, também foi descoberto de maneira mar- cante que, ao usar a produção semiestável da presente invenção, somente um terço da quantidade de DNA empregado na produção com transfecção transiente é suficiente para obter o LV que tem um título comparável àquele do LV transientemente produzido. Além disso, o número reduzido de cons- trutos a ser transfectado reduz a possibilidade de eventos de recombinação coma formação de RCL, tornando desse modo a produção de partículas : lentivirais mais segura. Portanto, o sistema de expressão, a linhagem de cé- - lulas de encapsulação semiestáveis e o método de produção da presente invenção são muito vantajosos com respeito às ferramentas e aos métodos aplicados atualmente em experimentações clínicas.

Citaçõesda lnvenção De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é provido um sistema para a expressão estável de proteínas estruturais e reguladoras len- tivirais que consiste em: ih. um vetor híbrido que compreende a cadeia principal ba- culoviral contendo um cassete de integração flanqueada por AAV ITRs inclu- indo dois cassetes de expressão, em que o primeiro cassete de expressão codifica os genes gag e pol lentivirais e o segundo um gene rev lentiviral e um marcador de seleção, e, ii. um plasmídio de expressão que contém o Quadro de Leitura Aberto (ORF) de AAV rep sob o controle de um promotor.

De preferência, os dois cassetes de expressão do vetor híbrido são orientados de cauda a cauda e cada um deles é dirigido por um promo- tor constitutivo e um polyA, em que o promotor é selecionado de preferência de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1a SFFV e RSV, e com mais preferência o promotor é um promotor de CMV IE.

O marcador de seleção é selecionado de preferência entre o ge- ne de resistência a higromicina, canamicina, neomicina, zeomicina, e com

- - “mais preferência o marcador de seleção é o gene de resistência a higromici- na. : Com mais preferência, o marcador de seleção é clonado a ju- sante de um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES).

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida uma |li- nhagem de células de encapsulação lentiviral semiestável que consiste em células que expressam de maneira estável gag, pol e rev lentivirais caracte- rizada pelo fato que tais células contêm integrada de maneira estável em seu genoma pelo menos uma cópia de um cassete de integração flanqueado por AAVITRs incluindo dois cassetes de expressão, em que o primeiro cas- õ sete de expressão codifica os genes gag e pol lentivirais e o segundo um - gene rev lentiviral e um marcador de seleção.

De preferência, a célula é uma linhagem de células humanas se- lecionadas de preferência de HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 ou HeLa, e com mais preferência a linhagem de células é HEK293- T.

De preferência, os dois cassetes de expressão são orientados de cauda a cauda e cada um deles é dirigido por um promotor constitutivo e um polyA; o promotor é selecionado de preferência de CMV, CMV IE, PGK, SV40,eFia, SFFV e RSV, e com mais preferência o promotor constitutivo é um promotor de CMV IE.

O marcador de seleção é selecionado de preferência do gene de resistência à higromícina, canamicina, neomicina, e zeomicina; com mais preferência, o marcador de seleção é um gene de resistência à higromíicina.

Com mais preferência, o marcador de seleção é clonado a jusante de um IRES.

A proteína de AAV rev é de preferência selecionada de rep78 ou rep68. Com mais preferência, a proteína de rep é rep78.

De acordo com um outro aspecto, é provido um método de pro- dução de vetores entivirais, o qual compreende: t o cultivo de uma linhagem de células de encapsulação lentivirais semiestável que consiste em células que expressam de maneira

. » estável gag, pol e ver, caracterizado pelo fato que tais células contêm, inte- grada de maneira estável em seu genoma, pelo menos uma cópia de um ' cassete de integração flanqueado por AAV ITRs que incluem dois cassetes de expressão, em que o primeiro cassete de expressão codifica genes gag e —pollentivirais e o segundo um gene rev lentiviral e um marcador de seleção, ii. a inserção, na linhagem de células de encapsulação semiestáveis, de um gene env, Fi. a inserção, na linhagem de células de encapsulação semiestáveis, de um vetor de transferência. : De preferência os dois cassetes de expressão são orientados | cauda a cauda e cada um deles é dirigido por um promotor constitutivo e um . polyA; o promotor é selecionado de preferência de CMV, CMV IE, PGK, SVA40, eF1a, SFFV e RSV, e com mais preferência o promotor constitutivo é um promotor de CMV IE.

O marcador de seleção é selecionado de preferência de genes de resistência a higromíicina, canamicina, neomicina, e zeomicina; com mais preferência, o marcador de seleção é o gene de resistência à higromíicina. Com mais preferência, o marcador de seleção é clonado a jusante de um IRES.

A proteína de envelope pode ser inserida em células hospedei- ras ao usar o vetor de AAV, o vetor retroviral, a integração de plasmídio es- tável ou a recombinação homóloga. O gene env é de preferência inserido, pela transfecção transiente ao usar um plasmídio.

O gene env é selecionado de preferência de VSV-G env, MLV 4070 env, RD114 env, proteína de envelope quimérica Rd114-TR, proteína de envelope quimérica RD114pro, baculovírus GP64 env ou GALV env ou seus derivados, e com mais preferência o gene env é o gene que codifica RD114-TR.

O vetor de transferência é inserido de preferência com um vetor lentiviral de SIN.

Descrição Detalhada da Invenção Uma descrição detalhada das características e de modalidades

- - "preferidas da invenção será descrita a título de exemplo não limitador.

A invenção pode ser colocada em prática por um elemento ver- ' sado na técnica que irá empregar, a menos que esteja indicado de alguma outra maneira, técnicas convencionais de química, biologia molecular, mi- —crobiologia, DNA recombinante e imunologia.

Todas tais técnicas são apre- sentadas e explicadas na literatura publicada.

Consultar, por exemplo, J.

Sambrook, E.

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Fritsch, and T.

Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Proto- colsin Molecular Biology, cap. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, : N.Y.); Current Protocols in Immunology, cap. 12, John Wiley & Sons, New : York, N.Y.); B.

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Todas essas publicações são aqui incorporadas a título de referência.

Sistema híbrido de Baculo-AAV A presente invenção apresenta uma estratégia nova para a ge- ração de uma linhagem de células de encapsulação baseada em HIV-1. A otimização do sistema de produção para o LV é uma das questões críticas que precisam ser resolvidas para o desenvolvimento da medicina de terapia de gene baseada na tecnologia de LV.

Apesar do número crescente de ex- perimentações clínicas que empregam essa tecnologia, o LV ainda é produ- zido, em tais experimentações, ao usar protocolos de transfecção transiente.

Desta maneira, a produção do LV ainda é muito cara e insatisfatória para um número maior de pacientes.

Por esta razão, muitos esforços foram feitos no sentido de desenvolver linhagens de células de encapsulação estáveis para o LV.

Uma das questões críticas no desenvolvimento de uma linhagem de células de encapsulação lentiviral estável é a escolha do veículo correto para

- * a engenharia genética de célula hospedeira.

Em muitos casos as células hospedeiras foram desenvolvidas por engenharia genética ao usar plasmí- ' dios, mas nesses casos a instabilidade do genoma e os fenômenos de silen- ciamento de gene também foram observados.

Os vetores retrovirais foram usados para integrar de maneira estável os genes gag/pol e rev em dois ou- tros casos.

Nenhuma das linhagens de células de encapsulação estáveis desenvolvidas até o presente foi empregada em clínica.

A estratégia da presente invenção é baseada no uso de um sis- tema para a expressão estável de proteínas de HIV estruturais e reguladoras lentivirais que consistem em um vetor híbrido que compreende uma cadeia principal baculoviral que contém um cassete de integração flanqueado por .- AAV ITRs que incluem dois cassetes de expressão, em que o primeiro cas- sete de expressão codifica genes gag e pol lentivirais e o segundo um gene rev lentiviral e um marcador de seleção; junto com um plasmídio de expres- são que contém o AAV rep ORF sob o controle de um promotor.

A presença da cadeia principal baculoviral permite hospedar um cassete de integração grande e complexo que inclui dois cassetes de expressão que codificam vá- rias proteínas diferentes.

O vetor de encapsulação de baculo-AAV resultante permite o desenvolvimento por engenharia genética de células hospedeiras anfitrião com proteínas virais que são necessárias para produzir de maneira estável e eficazmente o LV, através de somente evento de infecção.

A integração do genoma do vetor de encapsulação de baculo- AAV foi obtida pela expressão transiente da proteína de AAV rep.

Esse sis- tema permitiu obter à integração de vetores de AAV em uma região trans- cripcionalmente ativa intergênica de não codificação, desse modo excluindo a ativação dos genes perigosos cujo MRNA pode ser incorporado no LV e eventualmente nas células hospedeiras alvo.

O sistema proposto representa uma maneira nova e vantajosa de desenvolver por engenharia genética de maneira estável e eficazmente a célula hospedeira com proteínas lentivirais estruturais e reguladoras.

Em uma modalidade preferida, os dois cassetes de expressão incluídos no construto de encapsulação de baculo-AAV são orientados cau-

- - da a cauda e cada um deles é dirigido por um promotor constitutivo e um polyA, em que o promotor é selecionado de preferência de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eFi1a, SFFV, e RSV, e com mais preferência o promotor é um promotor de CMV IE. De acordo com um aspecto preferido da invenção, o marcador de seleção incluído no vetor de encapsulação de AAV é selecio- nado de genes de resistência à higromicina, canamícina, neomicina, e zeo- micina; de preferência, o marcador é um gene de resistência à higromicina; e com mais preferência o marcador de seleção é clonado a jusante de um |- RES.

A integração do genoma do vetor de encapsulação de baculo- : AAV foi obtida pela expressão transiente da proteína de AAV rep para uma : integração de vetor de AAV mediada por ITR. Em uma modalidade preferida, a proteína de rep é selecionada de rep78 e rep68, e com mais preferência a proteína é rep78.

Ao usar este sistema, foi possível obter as células desenvolvidas por engenharia genética para expressar de maneira estável as proteínas gag/pol e ver de HIV-1, e tais células são denominadas linhagens de células de células de encapsulação semiestáveis. Em particular, a presente inven- ção apresenta e reivindica tais células submetidas à engenharia genética e seuuso para uma produção semiestável do LV.

Linhagem de células de encapsulação semiestáveis A linhagem de células de encapsulação semiestáveis da presen- te invenção consiste em células hospedeiras que contêm pelo menos uma cópia do construto de encapsulação de baculo-AAV recombinante que ex- pressa os genes gag-pol e ver de HIV-1. A integração do genoma do vetor de encapsulação de baculo-AAV foi obtida pela expressão transiente da pro- teina de AAV rep a fim de obter a integração do vetor de AAV mediada por ITR. De preferência, os dois cassetes de expressão são orientados cauda a cauda e cada um deles é dirigido por um promotor constitutivo e um polyA, e o promotor é selecionado de preferência de CMV, CMV IE, PGK, SVA40, eFla, SFFV e RSV. Com mais preferência, o promotor constitutivo é um promotor de CMV IE.

- : De acordo com um aspecto preferido da invenção o marcador de seleção é selecionado de genes de resistência à higromicina, canamicina, À neomicina, e zeomicina; de preferência, o marcador de seleção é um gene de resistência à higromicina, e com mais preferência o marcador de seleção é clonado ajusante de um IRES.

A proteína de AAV rep é selecionada de preferência de rep78 e rep68. Com mais preferência, a proteína de rep é rep78. As linhagens de células hospedeiras que podem ser desenvolvidas por engenharia genética para obter a linhagem de células de encapsulação semiestáveis são linha- gensde células humanas selecionadas de HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, ! TE671, HT1080 ou HeLa, e com mais preferência a linhagem de células é - HEK293-T.

Tal linhagem de células de encapsulação semiestáveis é apro- priada para a obtenção de uma variedade potencialmente grande de LV, com vetores de env diferentes e vetores de transferência diferentes em um sistema de produção semiestável. Portanto, ela representa uma grande van- tagem para uma produção mais eficaz de LV, uma vez que permite a redu- ção de custos, não requer o uso do DNA do plasmídio de grau GMP que co- difica gag-pol e rev, e o risco da formação de RCL secundária aos eventos de recombinação entre os plasmídios durante a transfecção transiente é re- duzido. A linhagem de células de encapsulação semiestáveis é uma ferra- menta versátil, e é mais segura e economicamente mais vantajosa do que outras ferramentas empregadas atualmente em experimentações clínicas para a produção de LV.

A linhagem de células de encapsulação semiestáveis da presen- te invenção mostrou ter uma estabilidade genética surpreendente por 1 ano da cultura que provou a produção contínua de LV funcional após a transfec- ção transiente dos elementos genéticos restantes. Além disso, nenhum fe- nômeno de silenciamento foi observado de fato, tanto na titulação quanto na infectividade de LV obtido ao usar esse intermediário que permaneceu não afetado após 1 ano. Tais dados foram confirmados na presença ou na au- sência de pressão seletiva. De modo marcante, nenhum dado comparável a

- - respeito da estabilidade da integração de um cassete mediado por AAV-ITR está disponível na literatura. A única informação relacionada é que uma |i- À nhagem de células do tipo fibroblasto (células Detroit 6 de Ruddle) derivada de medula de osso humano infectada com sorotipo 2 AAV do tipo selvagem (AVV-2) manteve as sequências virais em um estado latente por pelo menos 47 e 118 passagens. Tal como mostrado nos exemplos, a linhagem de célu- las de encapsulação semiestáveis da presente invenção sobreviveu por pelo menos 102 passagens.

Portanto, a presente invenção apresenta um método de produ- çãodelLV,oqualcompreende: | i. o cultivo de uma linhagem de células de encapsulação semies- .- táveis tal como descrito acima, ii. a inserção, na linhagem de células de encapsulação semies- táveis, de um gene env, iii. a inserção, na linhagem de células de encapsulação semies- táveis, de um vetor de transferência.

A proteína de envelope pode ser inserida em células hospedei- ras ao usar o vetor de AAV, o vetor retroviral, a integração de plasmídio es- tável ou a recombinação homóloga. O gene env é de preferência inserido pelatransfecção transiente ao usar um plasmídio.

O gene env é selecionado de preferência de VSV-G env, MLV 4070 env, RD114 env, proteína de envelope quimérica RD114-TR, proteína de envelope quimérica RD114pro, baculovírus GP64 env ou GALV env ou seus derivados. Com mais preferência, a presente invenção faz uso da pro- teínade envelope quimérica RD114-TR env em que a cauda citoplásmica de RD114 foi substituída por aquela do envelope de MLV. O vetor de transfe- rência é de preferência inserido com um SIN-LV.

A linhagem de células de encapsulação semiestáveis da presen- te invenção pode produzir um LV que em termos de infectividade é "qualitati- vamente" igual àqueles produzidos pela transfecção transiente. Uma ques- tão muito importante a ser considerada para a aplicação da produção de LV semiestável! é que a linhagem de células de encapsulação semiestáveis não

- - perca a capacidade de ser facilmente transfectável. De fato, as células PK-7 são transfectadas ao mesmo nível da linhagem de células parentais õ HEK293T. Esta característica é bastante comumente perdida após a modifi- cação e a clonagem genética das células HEK293 com construto de encap- sulação. Por outro lado, o sistema de expressão empregado na presente invenção para a integração estável de gag/pol e rev não causa nenhum pro- blema para a transfectabilidade da linhagem de células de encapsulação semiestáveis. Além disso, a linhagem de células de encapsulação semiestá- : 10 veiseseuusono método de produção para o LV têm vantagens importantes para os custos de produção. Em particular, somente três construtos adicio- - nais, por exemplo, plasmídios, (cada um deles codificando tat, env e vetor de transferência) são necessários para a produção de LV da 2º geração, ou dois construtos (cada um deles codificando tat, env e vetor de transferência) paraa produção de LV da 3º geração. Por outro lado, os métodos de GMP empregados atualmente em experimentações clínicas requerem o uso de dois construtos adicionais, codificando gag/pol e ver, respectivamente, além daqueles usados com a linhagem de células de encapsulação semiestáveis da presente invenção.

Além disso, o número reduzido de construtos a ser transfectados com os métodos e as ferramentas da presente invenção também representa uma vantagem adicional para a segurança do LV tal como descrito acima.

Além disso, também foi verificado de modo marcante que, ao usar a produção semiestável da presente invenção, somente um terço da quantidade total de DNA empregada na produção pela transfecção transien- te é suficiente para obter os lentivírus que têm um título comparável àquele de lentivírus produzidos de modo transiente. Portanto, o sistema de expres- são, a linhagem de células de encapsulação semiestáveis e o método de produção da presente invenção são muito vantajosos com respeito às ferra- mentase aos métodos aplicados atualmente em clínica.

Descrição das Figuras Figura 1 - Esquemas de desenvolvimento de RD-MolPack.

- * (a) Representação esquemática dos plasmídios do DNA usados no estudo. pPohl, promotor de poli-hedrina; attB1, ligação B1; ITR, repetição de terminal ' invertido; CMV, promotor de citomegalovírus; In, íntron; RRE, elemento res- ponsivo a rev; A, sequência de polyA; IRES, sítio de entrada de ribossoma interno; SD, doador de emenda SA, aceptor de emenda; Y%, sinal de encap- sulação; WPRE, elemento regulador pós-transcripcional da hepatite de marmota; PPT, trato de polipurina central; hPGK, promotor de quinase de fosfoglicerato humano. (b) Desenho da integração genômica mediada por Rep78 do vetor de AAV-GPR. AAV Rep78 promove a excisão do cassete de AAV-GPR flanqueado por ITR e facilita a sua integração em cromossomas À humanos. (c) Fluxograma da produção pela linhagem de células de encap- . sulação semiestáveis. GOI, gene de interesse. Figura 2 - Caracterização dos clones PK. (a) Análise de trans- ferência Southern da integração do vetor de AAV-GPR. Para estabelecer o número de cópias e da integridade do cassete, um DNA genômico (10 ug) derivado de clones PK foi digerido com duas enzimas de restrição diferentes, BamHlI e SnaBl, respectivamente. (b) A análise de transferência Western das proteínas virais produzidas a partir do cassete de GPR. Painel da es- querda, extratos de células (50 ug/pista) obtidos a partir de clones PK foram hibridizados a um soro anti-HIV humano que reconhece as proteínas de HIV-

1. A membrana foi hibridizada sequencialmente com um Ab específico anti- rev. Painel da direita, 30 ng de equivalente de p24gag de partículas do tipo viral (VLP) produzidas a partir de clones PK foram processados de modo idêntico aos extratos celulares. (c) Mapeamento esquemático da integração de GPR-cassete pela técnica de LM-PCR que identificou o ponto de ruptura do DNA no braço longo do cromossoma 2 na posição 2932.1. (d) Colocali- zação do cassete de AAV-GPR e do gene Hox4 humano no cromossoma 2. A hibridização in situ de cromossomas de metafase de PK-7 foi feita ao usar uma sonda específica de gag (verde) e específica de Hox-4 (vermelha), res- —pectivamente. (e) A representação esquemática do rearranjo dos dois casse- tes integrados de GPR no clone PK-7 e a sua orientação da cauda à cabeça. Figura 3 — Experimentos de controle relativo à possível inte-

- - gração de Baculo-AAV-GPR e Rep78. (a) Análise de transferência Sou- thern do DNA de baculovírus-AAV recombinante.

O DNA foi extraído de par- À tículas de baculovírus, digerido durante toda a noite com a enzima de restri- ção Mlul e, após a transferência, sondada com a sonda específica do casse- tedeGPRde11kb.

O plasmídio de entrada-GPR (1 pg) e o DNA vazio de baculovírus (100 ng) foram carregados como controle positivo e negativo, respectivamente. (b) Detecção da integração do DNA de plasmídio de rep78 residual putativo em células PK-7. Uma PCR específica de rep78 foi realiza- da ao usar o DNA genômico de PK-7 como molde de amostra e o plasmídio CMV-rep78 (1 pg)como controle positivo.

Exemplos Exemplo |: Métodos gerais . Plasmídios Genes gag, pol e ver de HIV-1 do tipo selvagem foram excisados por digestões de Mlul/Narl e Mlul/Notl dos plasmídiose pCG719-pKLgagpol (indicado daqui por diante como CMV-GPR para fins de simplificação) (Figu- ra 1a, esquema 9) e pCG720-pKrev (CMV-Rev) (Figura 1a, esquema 5), respectivamente? Os genes virais foram inseridos no vetor de transporte Gateway? pENTR”4 (Invitrogen, Co., Carlisbad, CA) em dois cassetes de expressão distintos orientado cauda a cauda, em que na cada cassete é di- rigido um promotor de CMV IE e contém uma sequência de polyA.

O primei- ro cassete expressa os genes gag e pol, ao passo que o segundo expressa Oo gene rev e o gene de resistência à higromicina marcador de seleção (hy- gro); o hygro foi clonado a jusante de um IRES para permitir a translação do bi-cistrônica.

As duas unidades de expressão foram introduzidas no sítio —Xbal do plasmídio pSUB201 recombinante que contém um genoma"? de AAV infecioso.

O cassete 5'I'TR-CMV-gagpol-polyA-polyA-hygro-IRES-rev- CMV-ITR3' resultante foi então excisado e inserido no vetor de transporte Gateway? peENTR'Y4 (Invitrogen, Co., Carisbad, CA). O vetor de encapsula- ção de baculo-AAV híbrido recombinante (Baculo-AAV-GPR) (Figura 1a, esquema 1) foi obtido por meio do sistema de recombinação específico de sítio lâmbda bacteriófago entre o vetor de entrada de transporte pENTR”'4, contendo os dois cassetes, e o DNA BaculoDirect Linear (BaculoDirect” Ba-

- « culovírus Expression Systems, Invitrogen, Co.). Durante a recombinação homóloga, o gene de polihedrina do DNA de baculo foi substituído desse : modo pelo cassete duplo de GPR. O plasmídio de expressão pABCMV- rep78 (CMV-AAV-rep78) foi obtido ao clonar o AAV-rep78 ORF sob o promo- tordeCMVIE do vetor de expressão pABS.43 tal como descrito em Recchia et al., 200418 (Figura 1a, esquema 4). O plasmídio de pMD.G (CMV-VSV- G)"º, codifica a glicoproteina de envelope da estomatite vesicular (VSV-G) (Figura 1a, esquema 6). O vetor de transferência da 3º geração, pCCL- sin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN-eGFP)?º expressa o gene de eGFP sobo promotor constitutivo hPGK (Figura 1a, esquema 2). O vetor de trans- ferência PAN-Chim3 de 2º geração que expressa o transgene Chim3 anti- : HIV-1 foi descrito em Porcellini et al., 2009 e 20102? (Figura 1a, esquema 3). O plasmídio pCMV-RD114-TR (CMV-RDd114-TR) (Figura 1a, esquema 7) codifica o envelope RD114-TR quimérico, feito dos domínios extracelular edetrans-membrana do envelope RD114 de retrovírus endógeno de felino e da cauda citoplásmica (TR) do A-MLVenv 4070A?. O construto de encapsu- lação de 2º geração pCMV-AR8.74 (CMV-GPRT) (Figura 1a, esquema 8) codifica os genes'* gag, pol, rev e tat de HIV-1.

Células Células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) (Invitrogen, Co.) foram cultivados em suspensão no meio TC-100 (Invitrogen, Co.) suplemen- tado com 10% de FCS (EuroClone Ltd, Reino Unido) e uma combinação de penicilina-estreptomicina e glutamina (PSG) a 27ºC na ausência de CO,. Células do 293T (HEK293T) de rim de embrião humano e seu clone deriva- — do (PK-7) foram propagadas no Meio Eagle Modificado Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FCS e PSG. Células linfoblastoides CEM A3.01 e SupT1 T foram cultivadas em RPM! 1640 suplementado com 10% de FCS e PSG. Células tronco hemopoiéticas CD34+ (HSC) e leucócitos neonatais foram purificados da purificação de sangue do cordão umbilical (UCB) em um gradiente de Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega). Após a separação do gradiente, as células CD34+ HSC foram isoladas do anel de células mononucleadas UCB coletadas pela seleção po-

- - sitiva ao usar o kit CD34 MicroBeads e colunas MiniMACS Separator (Mil- tenyi Biotec, Sunnyvale, CA). A pureza das células CD34+ (> 92%) foi esta- f belecida pela análise de FACS (FACSCAalibur BD Bioscience, San Jose, CA) e pelo software FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR), ao usar anti-CD34-PE —Ab(BD Pharmingen"", San Diego, CA). As células CD34+ foram previamen- te estimuladas por 24 horas no Meio Dulbecco Modificado da Iscove (IMDM) com 20% de soro que contém o fator de célula-tronco humana (h-SCF) 100 ngm! (R&D Systems, Minneapolis, MN), h-Fltal 100 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ), h-IL-6 20 ng/ml (R&D Systems) e trombopoietina humana (h- Tpo)20 ng/ml (Peprotech), e mantidos no mesmo meio durante a transdu- ção. Os leucócitos neonatais foram estimulados por 48 horas com CD3 anti- - humano solúvel (30 ng/ml) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, Reino Unido) e IL-2 humano recombinante2 (rhlL-2) 50 U/ml (Chiron, Emeryville, CA) em RPMI e então mantidos em RPMI suplementado com 10% de FCS, PSG, e

15. rhil2. Produção de baculovírus e infecção de células HEK293T por baculo-GPR Baculovírus, contendo o genoma de DNA de Baculo-AAV-GPR híbrido recombinante, foi produzido ao seguir o método BaculoDirect usando o sistema de DNA de Baculovírus adaptado Gatewayº (Invitrogen, Co.). O títuo de Baculovírus recombinante foi avaliado pelo ensaio de placa e cor- respondia a 1 x 10 pfu/íml depois de três passagens de amplificação viral em células Sf9. O clone PK-7 foi obtido ao transfectar 1,5 x 10º células HEK293T com 4 ug do plasmídio da expressão AAV-rep78 e das 24 horas mais tarde infectado com Baculo-AAV-GPR recombinante a uma MOI de

1.000. As células foram mantidas sem higromiícina por 4 dias e 5 x 10º célu- las foram semeadas então em 22 placas de 10 cm na presença do higromi- cina (100 pg/ml) a concentrações diluídas em série. As 22 placas foram se- lecionadas para a produção de p24gag por ELISA. Somente uma placa, na qual as células foram semeadas a 3,7 x 10º células, liberou p24gag suficien- tenosobrenadante. A placa continha 40 colônias, todas as quais foram cole- tadas e selecionadas. Três delas, classificadas como positivas para a produ- ção de p24gag, foram caracterizadas ainda mais.

. * "Produção e titulação do vetor lentiviral (LV) LVs do tipo pseudo produzidos a partir de células HEK293T fo- ram obtidos pela cotransfecção transiente dos seguintes plasmídios: os construtos de encapsulação CMV-GPR (3º geração) [ou CMV-GPRT (2º ge- ração), os construtos de envelope VSV-G ou Rd114-tr, e o vetor”' de trans- ferência SIN-eGFP?* de 3º geração e PAN-Chim3 de 2º geração.

A relação de vetor de encapsulação:envelope:transfeência era de 6,5:3,5:10 ug de DNA, a menos que esteja indicado de alguma outra maneira.

O LV do clone PK-7 foi gerado pela cotransfecção do plasmídio de expressão de env e do : 10 vetor de transferência.

As transfecções transientes foram executadas com o método padrão de Ca**-fosfato ou o sistema Fugene""6 ao seguir as instru- . ções do fabricante (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para se obter resultados similares.

Os sobrenadantes foram colhidos 48 horas após a transfecção e filtrados através de um filtro de 0,45 um.

O título foi calcula- doem SupT1, CEM A3.01, células mononucleadas de sangue periférico ati- vadas primárias (PBMC) e CD34+ HSC derivado de sangue do cordão umbi- lical dependendo do tipo de experimentos.

Em resumo, células SupT1 e mo- nonucleadas primárias ativadas foram transduzidas por dois ciclos de espi- noculação (1.240 * g por 1 hora) na presença de polibreno (8 ug/ml) (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) separados por uma fase de repouso à noite; células CD34+ HSCs foram transduzidas por 24 horas em placas revestidas com retronectina (Takara Bio, Otsu, Japão) sem polibreno.

A eficiência da trans- dução foi monitorada pela análise de citometria de fluxo (FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA) de expressão eGFP (sIN-eGFP-eGFP) ou de ex- pressão ALNFGR (PAN-Chim3), tal como descrito em Porcellini et al., 2009 e 2010?" ?, ao usar o software FlowJo (TRee Star, Inc., Ashland, OR). Somen- te os valores da transdução que variam de 5 a 22% de células positivas fo- ram usados para calcular o título de cada preparado de LV de acordo com a seguinte fórmula: TU = [número de células x (% de GFP/100)])/vol sup (em mm). Ensaio de transferência Southern O DNA genômico (gDNA) foi isolado pelo mini kit QIAamp Mini

. - (QIAGEN GmbH, Alemanha) de acordo com instruções do fabricante. O DNA de Baculovírus foi extraído das partículas viral pelo micro kit DNA QIA- amp (QIAGEN). Após a digestão durante a noite com as enzimas de restri- ção indicadas, 10 ug do gDNA foram colocado em 0,8% de gel de agarose, tingidos pela transferência capilar de Southern em membranas de nylon (Du- ralon, Stratagene, TX, USA) e então hibridizados até 1 x 10º dpm/ml de cas- sete de CMV de 600 bp ou GPR de 11 kb etiquetado com iniciador de *?P- randômico. Análise de PCR analítica A análise de PCR para a seleção da integração residual do plasmídio AAV-Rep78 nas células PK-7 foi executada em 300 ng de gDNAs . genômicos ao usar o jogo de iniciadores: AAV-Rep78 de avanço: 5-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3', AAV-Rep78 reverso: 5-:ATG CCG GGG TTT TAC GAG ATT GTG-3' e as seguintes condições de PCR: 98ºC por 7 minutos, 30 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 66ºC por 30 segundos, e 72ºC por 1,5 minuto.

Para estabelecer a orientação dos dois cassetes de GPR, a am- plificação de PCR foi executada em 300 ng de gDNAs ao usar o jogo de ini- ciadores: reverso avanço: 5-CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3'; beta- globina reverso: 5-CCC TGT TAC TTC TCC CCT TCC-3'; reverso avanço aninhado: 5- TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3'; beta-giobina reverso a- ninhado: 5-TTA ACC ATA GAA AAG AAG GGG-3' e as seguintes condi- ções: 94ºC por 2 minutos, 35 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 52ºC por 30 segundos, e 72ºC por 1,5 minuto.

ELISAdep24gag A produção física do LV foi medida em sobrenadantes de cultura pelo kit ELISA de Antígeno de HIV-1 p24 Aloliance (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc. Waltham, MA) ao seguir as instruções do fabrican- te, com a suposição que 1 pg de p24gag corresponde a 1 x 10º partículas físicas.

Análise de transferência Western Extratos de células integrais e nucleares derivados de células

- - PK-7 e de proteínas virais derivadas de VLP ou LV isentos de células isola- dos foram preparados tal como descrito?” ?? previamente. As proteínas foram 7 fracionadas no tamanho por SDS-PAGE, e eletrotransferidas às membranas de nitrocelulose Hybond ECL (GE Healthcare, Life Sciences, UK Ltd, Reino Unido). As membranas foram bloqueadas em leite seco com baixo teor de gordura de 5%, e incubadas então com o Ab primário apropriado. O soro Anti-HIV, obtido de um paciente de AIDS, foi usado a uma diluição de 1:2.000; Hiv-1 rev MoAb (Rev-6, sc-69730 S. Cruz Biotechnology, Inc., S. Cruz, CA) a uma diluição de 1:200. A ligação de Ab foi visualizada pelo sis- tema de quimioluminescência intensificada ECL (ECL, Amersham) ao seguir õ as instruções do fabricante. .: Quantificação do número de cópias do DNA de LV por PCR TaaMan em tempo real O número de cópias do vetor de GPR integrado foi estabelecido por PCR TaqgMan quantitativa ao usar um instrumento ABI Prism 7.900 FAST (Applied Biosystems, Foster City, CA) e analisado pelo software SDS

2.3 (Applied Biosystems). O DNA genômico (gDNA) foi amplificado com os seguintes iniciadores e sondas derivados do gene gag: de avanço: 5-ACA TCA AGC AGC CAT GCA AAT-3'; reverso: 5-ATC TGG CCT GGT GCA ATA GG-3'; sonda: FAM 5-CAT CAA TGA GGA AGC TGC AGA ATG GGA TAG A-3' TAMRA. As condições de PCR eram as seguintes: 2 minutos a 50ºC e 5 minutos a 95ºC, seguidos por 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e de 15 segundos a 60ºC, com um incremento de 0,1ºC/ciclo. (LM)-PCR mediada por ligação O DNA genômico foi extraído das células PK-7 pelo mini kit QIA- amp DNA (QIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante e digerido com Ball! e BamHI a 37ºC durante toda a noite. A ligação de um ligante de oligonucleotídeo de 76-bp adaptador compatível com as extremidades pega- josas 5-GATC-3 foi executada sob condições padrão. A LM-PCR foi realiza- daaousaros seguintes pares de iniciadores aninhados: os ITR de avanço: 16s: 5-GTA GCA TGG CGG GTT AAT C-3', e aninhados de 17s/de exten- são: 5-TTA ACT ACA AGG AAC CCC TAG TGA TGG-3'; os iniciadores re-

. -« versos do ligante: Ligante-1: 5-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3' e Ligante-2 aninhado: 5-AGG GCT CCG CTT AAG GGA C-3'. As sequências : de ligante correspondiam a 5-GAT CGT CCC TTA AGC GGA GCC CTA

TAG TGA GTC GTA TTA CCA GGG AAT TCG CCT CGG GAT ATC ACT CAG CAT AAT G-3'. Duas rodadas de LM-PCR foram realizadas ao usar polimerase de DNA AmpliTaq Gold (Biosystems aplicados), cada uma delas compreendendo 30 ciclos (95ºC por 30 segundos, 52ºC por 30 segundos, 72ºC por 2 minutos). Os amplicons de PCR foram clonados ao usar o kit de clonagem TOPO? (Invitrogen, Co.) e colônias de plasmídios que contêm inser- çõesde cerca de 100-200-bp foram selecionadas para o arranjo em sequência.

| As homologias de sequências foram identificadas pela busca BLAST, NCBI.

- Fluorescência na hibridização in situ (FISH) Os cromossomas de metáfase foram obtidos ao tratar células PK-7 com colchicina (10 pug/ml) (Sigma * C9754) por 2 horas a 37ºC. Após a lavagem com solução salina de tampão de fosfato (PBS), as células foram mantidas em uma solução hipotônica (75 mM de KCI) por 6 minutos à tempe- ratura ambiente (RT), fixadas com 4 lavagens de metanol/ácido acético (3:1) e então espalhadas sobre um slide de vidro limpo. As amostras citogenéticas foram desnaturadas em uma solução de formamida a 70% por 2 minutos a 72ºC, desidratadas por meio de lavagens consecutivas em etanol a 70%, 85% e 95% frio e então secadas a ar. As sondas específicas foram prepara- das tal como segue: o DNA do plasmídio de 13 kb que contém o cassete de GPR foi etiquetado ao usar o kit de etiquetar Random Primed DNA (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) com SpectrumOrange""-dUTP (Vysis, Inc, Downers Grove, IL), ao passo que o DNA do cosmídio de 30 kb de con- trole que contém o gene hox4 humano foi etiquetado ao usar o kit de etique- tar de ácido nucleico FISHBright” (Kreatech Biotechnology, Amsterdam, Ho- landa). A hibridização foi executada ao incubar 5 ng/ul de cada sonda em 250 ul de formamida a 50%, 2 x SSC, e 10% de sulfato de dextrana e 50 —ng/ulde tampão de hibridização de DNA CoT-1 humano (Invitrogen). As a- mostras foram revestidas com sondas desnaturadas por 10 minutos a 75ºC, cobertas com ParafilmºM, e incubadas durante toda a noite a 37ºC em uma

” -» câmara úmida.

As amostras foram lavadas uma vez em 0,4 x SSC, pH=7a 72ºC por 2 minutos, uma vez em 4 x SSC, pH = 7 contendo 0,0025% de : Tween-20 por 30 segundos à RT, e duas vezes em PBS 1 x por 1 minuto à RT.

Os slides foram contratingidos com 0,02 ug/u! de 49,6-diamidino-2-fenil indol (DAPI) (Sigma). A visualização e as imagens fotográficas foram feitas com um microscópio vertical Nikon 80i (Nikon Instruments S.p.A., Itália) ao usar a iluminação com filtro verde (FITC) e laranja do espectro (espec- tro laranja). As imagens foram processadas com o software Genikon (Ni- kon). Exemplo ll: Geração do primeiro clone PK-7 intermediário ' Para obter a linhagem de células de encapsulação RD-MolPack : para a produção contínua de LV da 2º geração ou da 3º geração, vários clo- nes intermediários derivados de HEK293T foram obtidos.

O primeiro foi de- nominado PK-7 e obtido pela integração estável dos genes gag, pol e rev de HIV por meio do vetor de baculo-AAV híbrido recombinante (rhBaculo- AAV-GPR) (Figura 1a, esquema 1). Esse sistema de aplicação explora a atividade de integrase da proteína AAV-rep78, provida de maneira transien- te, para excisar e integrar os cassetes de integração flanqueados com AAV ITR aos cromossomas humanos (Figura 1b). O vetor de rh-baculo-AAV foi gerado pela recombinação homóloga entre o DNA linear BaculoDirect e o plasmídio de entrada Gatewayº pENTR"'4 que contém os cassetes de GPR flanqueados com ITR (Figura 1a, esquema 1). Depois de 3 ciclos (p3) de amplificação de baculovírus recombinante em células de insetos Sf9, o título e os eventos de recombinação potencial do DNA de baculo-AAV híbrido fo- ram verificados pelo ensaio de placa e pela transferência Southern de DNA genômico viral, respectivamente.

O título em p3 correspondeu a 6 x 10º pfu/ml, e a análise de transferência Southern revelou uma única faixa aguda, não demonstrando nenhum evento de recombinação durante o processo de amplificação de vírus (Figura 3). Em seguida, o dose e o tempo de transfecção de plasmídio A- AV-Rep78 e da infecção de rh-baculo-AAV e as condições de clonagem de células HEK293T infectadas foram definidos com cuidado (Figura 1c). De

- - fato, a escolha desses ajustes experimentais ficou crítica.

Desse modo, de- pois de ter testado uma ampla gama de condições, foi estabelecido eventu- ' almente que uma única dose do DNA de plasmídio AAV-rep78 transfectou 24 horas antes da infecção de rh-baculo-AAV à MOI de 1.000 correspondeu aomelhor projeto experimental.

Além disso, foi observado que a semeadura de um total de 5 x 10º células distribuídas em 22 placas de petri de 90 mm, cada placa semeada a uma concentração diferente e a adição de higromici- na a 100 ug/ml depois de 4 dias da semeadura era a melhor condição para coletar o número maior de clones de células.

Somente três dos 360 clones contados, PK-7, PK-17 e PK-18, expressaram p24gag acima do limite esta- belecido de 100 pg/ml.

A análise de transferência Southern dos clones reve- . lou que cada clone contém duas cópias do vetor correto no tamanho (Figura 2a). Para excluir a possível integração do DNA residual do plasmídio AAV- rep78, PCR específico de rep78 no gDNA de PK-7 foi executado, não detec- tando nenhum sinal positivo (Figura 3b). O padrão da expressão da proteína de HIV-1 derivada do cassete de GPR foi monitorado por transferência Wes- tern dos três clones PK e as suas partículas do tipo viral (VLP) compatíveis liberadas no meio.

Todas as proteínas virais foram processadas corretamen- te, corretas no tamanho e na proporção relativa correta (Figura 2b). O futuro clone PK operante foi selecionado ao calcular nas células SupT1 a potência do LV produzido a partir dos três clones depois de ser cotransfectado com o plasmídio de VSV-G e o vetor de transferência de 3º geração SIN-eGFP (Tabela 1). Deve-ser digno de nota, embora o título do controle HEK293T LV produzido pela transfecção transiente fosse 5 vezes maior do que aquele de Pk7edePk18LV,a sua infectividade era quase idêntico àquela de PK LV, sugerindo que os clones PK geram um LV que, sob um ponto de vista de "qualidade", é comparável àqueles produzidos por métodos convencionais (Tabela 1). Embora a potência de Pk-7 e de Pk-18 LV fosse similar, o clo- ne PK-7 foi selecionado para uma manipulação genética adicional porque a sua morfologia, crescimento, viabilidade e valores de produção de p24gag tiveram uma classificação melhor do que aqueles do clone PK-18

(Tabela 1).

. - Tabela 1. Potência de LV de pseudo tipo VSV-G produzido a partir de clones PK Clones Título (TU/ml)º PK-7 1,1x10 r PK-17 5,4 x 10º PK-18 1,0x 107 HEK-293T 5,8 x 107 DT F2áGag (ngm PK-7 406 PK-17 636 PK-18 326 HEK-293T 1.694 Infectividade (TU/ng p24Gag) PK-7 2,7x10 PK-17 8,4 x 10º PK-18 30x 10º . HEK-293T 3,4 x 10º O título foi calculado em células SupT1 três dias depois da transdução. As : células foram transfectadas com os plasmídios VSV-G e SIN-eGFP. As le- tras em negrito indicam o clone selecionado.

Em seguida, a integração do cassete de GPR flanqueado com ITR foi caracterizada em profundidade no clone PK-7 por meio de LM-PCR quantitativa, TagMan PCR (Figura 2c) e pelas técnicas FISH (Figura 2d). Para mapear com precisão o sítio de integração, foram realizados estudos de LM-PCR, os quais foram focalizados no ponto de ruptura no cromossoma 2,20932.1 (Figura 2c). Este resultado foi confirmado pela hibridização in situ com a sonda específica de GPR que revelou um único ponto no cromosso- ma 2 baseado no comprimento do braço e na posição do centrômero (Figura 2d). Para confirmar essa atribuição de localização, a sonda HOXA foi usada, a qual é sabida para mapear no cromossoma 2931.2. Uma vez que as célu- las HEK293T são triploides, HOXA4 foi detectado corretamente em todos os três cromossomas 2 (Figura 2d). Por fim, foi confirmado por TagMan PCR quantitativa que duas cópias foram integradas e por PCR aninhado com um projeto apropriado dos iniciadors (Figura 2e) que as duas cópias estavam na orientação em tandem, da cauda à cabeça. A orientação da cauda à cabeça é a configuração natural observada também para a integração de AAV do tipo selvagem e a maior parte dos concatâmeros do vetor de rAAV no geno- ma da célula hospedeira. A análise de sequência do amplicon que engloba a junção Ca cauda à cabeça revelou que um fragmento de 910 bp que com-

. + preende 303 bp do promotor de 3' CMV do primeiro cassete junto com ITRs do primeiro e segundo cassetes e do promotor inteiro de 5' CMV do segundo ! cassete foram perdidos (Figura 2e, caixa vermelha). A maior parte dos even- tos de vetor-recombinação celular ocorre de fato dentro das sequências de ITRdo vetor. Esse rearranjo causou nas células PK-7 a falta de transcrição do gene de gag-pol do segundo cassete e provavelmente a falta da transcri- ção dos genes de rev e hygro do primeiro cassete. No entanto, vale a pena mencionar que a região de 285 bp à esquerda do promotor CMV suprimido (Figura 2e, triângulo cinzento no centro do esquema) ainda contém a caixa TATA que pode ser suficiente para dirigir a transcrição dos genes rev e hy- : gro. Em conclusão, PK-7 contém dois cassetes integrados, os quais trans- . crevem coletivamente um gene de gag-pol e um ou dois genes de rev e hygro. Para demonstrar a estabilidade do clone PK-7 com o passar do tempo, as células foram cultivadas na presença ou na ausência de higromi- cina por 350 dias, o que corresponde a cerca de 410 duplicações de células, e foi medida a produção de p24gag em uma base por célula (Tabela 2). A produção média na presença de higromicina corresponde a 15,34 + 8,47 ng de p24gag/1 x 1 Oº células, ao passo que na ausência do antibiótico é de 6,70 + 3,51 SD ng de p24gag/1 x 10º células (Tabela 2).

Essa diferença deriva provavelmente do fato que a pressão da droga de higromicina mantém em um estado "ativado" a transcrição do gene de resistência a higromicina e desse modo também à cromatina. Isso pode favorecer a transcrição mais elevada dos genes de gag-pol. Para avaliar se os VLP gerados do clone PK-7 eram funcionais mesmo depois de centenas de duplicações, as células PK-7 foram cotransfectadas em p60 e p102 com vetor de envelope VSV-G e de transferência sIN-eGFP e foi calculada a po- tência do LV nas células SupT1. De modo marcante, o título e a infectividade do LV produzido tanto na presença quanto na ausência da droga de seleção persistiu até o nível normal ainda depois de tal tempo prolongado (Tabela 2).

Esses dados não demonstram nenhuma instabilidade genética do cassete de GPR independente da presença ou da ausência de pressão da droga e permitiu evitar o uso de higromicina na caracterização futura. Nenhum dado

. - "comparável a respeito da estabilidade da integração de um cassete mediado com AAV-ITR é disponível na literatura.

A única informação relacionada é ' que uma linhagem de células do tipo fibroblasto (células Detroit 6 de Ruddle) derivadas de medula de osso humano infectadas com sorotipo 2 de AAV do tipo selvagem (AVV-2) manteve as sequências virais em um estado latente por pelo menos 47 passagens e 118 passagens”? ??. De modo marcante, as células PK-7 sobreviveram por pelo menos 102 passagens.

Tabela 2. Estabilidade de clone PK-7 com o passar do tempo Higromicina Sem higromicina Passagem p240Gag ng/10 p240Gag ng/10' 2 P2 10,00 8,10 xr P6 7,00 4,80 P10 11,40 4,00 P16 5,00 4,80 Y P20 9,30 5,20 P24 7,20 6,50 P28 9,20 4,40 P32 6,20 8,80 P36 11,00 9,60 P40 18,00 10,00 P44 4,30 8,40 P48 37,50 3,80 P52 7,00 3,20 PS56 11,00 6,70 P60 19,00 4,40 P64 22,00 18,70 P68 15,20 8,00 PT2 16,50 4,90 P76 17,80 7,60 P80 30,00 11,00 P84 27,00 8,40 P88 23,20 3,50 P92 23,00 7,50 P98 16,70 1,36 P102 19,00 3,85 Média + SD 15,34 + 8,47 6,70 + 3,51 Título (TUMmI)b P6O 3,210 2,0 x 10 P102 2,7 x10º 1,8x10º P24Gag (ng/ml) P6O 86 38 P102 80 13 Infectividade (TU/ng p24G ag)” P60 4,2x10 5,2 x 10 P102 S3x10 1,0 x 10º

. » º p24Gag nível expresso como ng/1 x 10º células: ? valores de potência de VSV-G pseudotipo LV produzidos após transfecção : de células PK-7 com plasmídios SIN-eGFP e VSV-G testados sobre células SupT1 3 dias após transdução —Exemplo!lll:Usodo clone PK-7 para a produção de LV semiestável Para estabelecer melhor se a produção de LV semiestável a par- tir do clone PK-7 era globalmente comparável àquela da produção transiente do LV a partir de células HEK293T, ambos os tipos de célula foram transfec- tados com a mesma quantidade de plasmídios necessários e foi medida a “x 10 porcentagem de transfecção e a potência de seus respectivos LVs em célu- las alvo diferentes (Tabela 3). Nessa condição, a média da porcentagem de . uma transfecção de 11 experimentos com células HEK293T era de 90,54 + 3,6 SEM e aquela de 12 experimentos com células PK-7 era de 91 + 5,3 SEM, indicando que as células PK-7 mantêm a sua capacidade de transfec- çãode alto nível.

Então, o título do LV foi calculado nas células SupT1, uma vez que o presente tipo de célula de referência padrão, CD34+ HSC de san- gue do cordão e anti-CD3/IL-2ativadas, ativou células mononucleadas do sangue do cordão (indicadas como linfa T na Tabela 3) (Tabela 3). Tabela 3. Potência de LV de 2º e 3º geração de pseudo tipo de VSV-G pro- duzidoa partir de clone PK-7 calculado em diferentes tipos de células alvo Es A A na entar Vetor Produtor Título (TU/ml) "INGFP —PRT BSxio 24xX10 23x10 HEK-293Tº 5,6x 10 30x 10º 1,3x10º p24Gag (ng/ml) PK-7 45 45 23 HEK-293T 350 350 279 Infectividade (TU/ng p24Gag) PK-7 —NoNiI0O saxio T10xX10 HEK-293T 1,6x 10º 86x 10º 4,6x10º SupT1 CcD34* CEM A3.01 PAN-Chim3 Título (TU/ml) Per TT 2x6 14xX10 Sf7x1i HEK-293T? 5,8x 10º 1,6 x 10º 8,8x10º p24Gag (ng/ml)

o PF "pp OO “Oo HEK-293T 114 114 114 Infectividade (TU/ng p24Gag) : PK7 OStxto sSixio 198x15 HEK-293T 5,0 x 10º 1,4 x 10? 7,7 x 10º * VSV-G pseudotipo LV foram produzidos após transfecção de células PK-7 com outros plasmídios SIN-eEGFP ou PAN-Chim3 e VSV-G envelope ? VSV-G pseudotipo LV foram produzidos após transfecção de células HEK- 293T com plasmídios SIN-eGFP (ou PAN-Chim3), CMV-GPR e VSV-G en- velope . LV foram testados sobre células-alvo após 3-5 dias de transdução.

De modo marcante, a infectividade do LV de 3º geração, sIN- . eGFP, gerado a partir de células PK-7 era cerca de 1 log menor do que e quase igual àquela do LV de controle quando o título foi calculado em célu- las SupT1 e CD34+, respectivamente, ao passo que era 2 log maior em lin- fócitos T ativados.

A infectividade do LV da 2º geração, PAN-Chim3, gerado a partir de células PK-7 era quase igual àquela do LV de controle quando o título foi calculado em células SupT1 ou em células CD34+ ou CEM A3.01. Coletivamente, essas descobertas indicam que o clone PK-7 produz um LV "qualitativamente" igual àqueles produzidos de modo por células HEK293T transfectadas de modo transiente.

Uma questão muito importante a ser con- siderada para a aplicação de PK-7 na produção de LV semiestável é que o clone PK-7 não perdeu a capacidade de ser facilmente transfectável.

Essa característica é bastante comumente perdida após a modificação genética e clonagem de 293 células com construto de encapsulação.

Os experimentos de titulação foram realizados para estabelecer a dose do DNA total do plasmídio de envelope e para transferir o vetor a ser usado para a produção ideal de LV a partir de células PK-7. De modo mar- cante, ficou estabelecido que até mesmo menos de um terço de uma quanti- dade total de DNA (0,3 mg) era suficiente para gerar LV com um título com- parável àquele do LV produzido com a quantidade padrão de DNA (1 mg) em linhagens de células SupT1 e CEM A3.01. Portanto, o uso de PK-7 para a produção semiestável do LV em vez de células HEK293T irá cortar drasti-

- » —“camente o custo elevado do DNA de plasmídio de grau GMP. Tabela 4. Redução da quantidade total de DNA de plasmídio (pequena escala) . DNA de 0,3 mg 0,6 mg 1mg plasmídio SupT1 CEM SupT1 CEM SupT1 CEM A3.01 A3.01 A3.01 Título A2X10" AORIO 11X10 35X%10 LOXIO 41X o (TUMI)* P24Gag 11 111 105 105 85 85 (ng/ml) Infectividade 1,0x10º 44x10º 1,0x10º 33x10* 1,1x10º 48x10º (TU/p24Gag) Título de LVS produzido após a transfecção de células PK-7 com o vetor : PAN-eGFP e o envelope VSV-G.

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Claims (19)

1. "a REIVINDICAÇÕES õ 1. Sistema para a expressão estável de proteínas estruturais e ) reguladoras lentivirais, caracterizado pelo fato de que consiste em: i. um vetor híbrido que compreende a cadeia principal baculoviral que contém uma cassete da integração flanqueada por AAV ITRs incluindo dois cassetes de expressão, em que a primeira cassete da expressão codifi- ca genes lentiviral da mordaça e do pol e o segundo um rev lentiviral e um marcador de seleção e, ii. um plasmídio da expressão que contém o quadro aberto da
2. 2. 10 leiturado representante de AAV (ORF) sob o controle de um promotor, a 2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo Do fato de que os dois cassetes de expressão do vetor híbrido são orientados de cauda a cauda e cada um deles é dirigido por um promotor constitutivo e . um polyA.
3. 3. Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado de CMV, CMV E, PGK, SV40, eFla, SFFV e RSV.
4. 4. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de CMV IE.
5. 5. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o marcador de seleção é selecionado de genes de resistência a higromícina, canamicina, neomicina e zeomicina.
6. 6. Sistema de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o marcador de seleção é um gene de resistência à higromícina.
7. 7. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o marcador de seleção é clonado a jusante de um sítio de entrada de ribossoma (IRES).
8. 8. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a proteina de rep é rep78.
9. 9. Linhagem de células de encapsulação lentivirais semiestáveis que expressam de maneira estável gag pol e ver, caracterizada pelo fato de que tais células contêm, estavelmente integrada em seu genoma pelo me-

   * « nosuma cópia de um cassete de integração flanqueado por AAV ITR que =. inclui dois cassetes de expressão, em que o primeiro cassete de expressão Í codifica genes gag e pol lentivirais e o segundo um gene rev lentiviral e um * marcador de seleção.
10. 10. Linhagem de células de encapsulação lentivirais semiestá- veis de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula é uma linhagem de células humanas selecionadas de HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 ou HeLa.
11. 11. Linhagem de células de encapsulação lentivirais semiestá- 1 10 veisde acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que 1 os dois cassetes de expressão são orientados de cauda a cauda e cada um O deles é dirigido por um promotor constitutivo e um polyA.
12. 12. Linhagem de células de encapsulação semiestáveis de acor- do com a reivindicação 9 ou 11, caracterizada pelo fato de que o promotor é selecionado de CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1a, SFFV e RSV.
13. 13. Linhagem de células de encapsulação semiestáveis de acor- do com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor de CMV IE.
14. 14. Linhagem de células de encapsulação semiestáveis de acor- do com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizada pelo fato de que o marcador de seleção é selecionado de genes de resistência a higro- micina, canamíicina, neomicina e zeomíicina.
15. 15. Linhagem de células de encapsulação semiestáveis de acor- do com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o marcador de seleçãoé um gene de resistência à higromicina.
16. 16. Linhagem de células de encapsulação semiestáveis de acor- do com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizada pelo fato de que o marcador de seleção é clonado a jusante de um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES).
17. 17. Método para a produção de vetores lentivirais, caracterizado pelo fato de que compreende: i. cultivar uma linhagem de células de encapsulação semiestá-

    * « veis comodefinida em qualquer um das reivindicações 9 a 16, . ' ii. introduzir na linha de empacotamento semiestável da célula í um gene do env, iii. introduzir na linha de empacotamento semiestável da célula um vetorde transferência.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que o gene de env é selecionado de VSV-G env, MLV 4070 env, RD114 env, proteína de envelope quimérica RD114-TR, proteína de envelo- pe quimérica RD114-pro, baculovírus GP64 env ou GALV env ou seus deri- 22 10 vados. 1
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracteri- a zado pelo fato de que gene de env é o gene que codifica a proteína de enve- lope quimérica RD114-TR.