JP5895053B2 - 胃腸管運動障害予防及び改善用の薬学組成物並びに食品組成物 - Google Patents

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Description

本発明は胃腸管運動障害予防及び改善用の薬学組成物並びに食品組成物に係り、さらに詳しくは、ヒノキ抽出物を用いて胃腸管運動障害疾患の予防及び治療に効果的な薬学組成物と食品として利用可能な食品組成物に関する。
胃腸管運動調節剤は、機能性消化不良や便秘、過敏性大腸症状だけではなく、糖尿病性胃腸運動障害、化学療法による胃腸運動障害、消化管運動障害による腸閉塞、筋強直性ジストロフィー(myotonic dystrophy)患者の胃腸管運動障害などに使用できる。
胃腸管の運動は、交感神経, 副交感神経などのような外因性神経系、胃腸管自体内因性神経系、自体内因性因子及び薬物などによって調節される。その他、胃腸管自体の自律的な要素、すなわち胃腸管平滑筋の自発的活動度とカハル間質細胞(interstitial cells of Cajal; ICC)が関与する。
去る１０年間、動物モデルを中心とした集中的な研究を通じて、胃腸、小腸、それから大腸で典型的な運動様相(phasic movement)を表す平滑筋におけるペースメーカー(pacemaker)の役割は、カハル間質細胞から起源するとの事実が明らかになった(Huizinga JD, Zarate N, Farrugia G. Physiology, injury, and recovery of interstitial cells of Cajal: basic and clinical science. Gastroenterology. 2009 Nov;137(5):1548-56)。
カハル間質細胞は胃腸管運動を調節する主細胞であって、生理学的機能は、１）平滑筋の自発的収縮を引き起こす電気的現象である徐波を誘発し、２)胃腸管の一部位から起源した徐波の伝播(propagation)を担い、３）神経の末端と平滑筋との間に存在することによって神経伝達(neurotransmission)に関与し、４)伸展受容器 (stretch receptor)のように感覚刺激の調節体(modulator)としての役割があることと知られている。
カハル間質細胞は、がん原遺伝子(proto-oncogene)であるｃ-kit遺伝子を発現していて、免疫組織化学検査を通して組織内でＩＣＣを確認するのに利用される。また、c-kitのリガンド(ligand)である幹細胞因子(stem cell factor, SCF)がカハル間質細胞の発達に必須であることと知られている。
現在、カハル間質細胞に関する研究は殆ど形態学的方法を用いて行っている。この方法を通して、臨床的に腸閉塞(intestinal obstruction)、食道弛緩不能症(achalasia)、ヒルシュスプルング病(Hirschsprung's disease)、慢性便秘、及び糖尿病性胃腸管障害などでカハル間質細胞の数的減少及び形態学的変化が観察され、胃腸管運動性疾患などによって発生する運動異常の症状がカハル間質細胞と密接な関係があることを示唆している(Ohlsson B,Veress B,Lindgren S,Sundkvist G.Enteric ganglioneuritis and abnormal interstitial cells of Cajal:features of inflammatory bowel disease.Inflamm Bowel Dis.2007 Jun;13(6):721-6./Ordog T.Interstitial cells of Cajal in diabetic gastroenteropathy.Neurogastroenterol Motil.2008Jan;20(1):8-18.)。
本発明は前述した従来の問題点を解決するために案出されたもので、その目的はヒノキ抽出物を用いて胃腸管運動障害疾患の予防及び改善に効率的な薬学組成物と食品組成物を提供し、カハル間質細胞の電気的活動度を変わらせて胃腸管運動性を調節できることを確認しようとするところにある。
前述した課題を解決するために、本発明に係る胃腸管運動障害予防及び改善用の薬学組成物は、ヒノキ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
前記胃腸管運動調節は、カハル間質細胞の電気的活動度を変わらせて行われることを特徴とする。
前記ヒノキ抽出物は、ヒノキ葉及び幹、枝の中から少なくともいずれか一つを超臨界流体抽出法または熱水抽出法を用いて抽出したことを特徴とする。
前記超臨界流体抽出法は、超臨界流体として二酸化炭素を、温度３５℃ないし４５℃、圧力１００ないし５００barで加えて、３０ないし２４０分間抽出することを特徴とする。
そして、前述した目的を達成するための本発明の胃腸管運動障害予防及び改善用の食品組成物はヒノキ抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
以上説明したように本発明によれば、機能性消化不良や便秘、過敏性大腸症状、糖尿病性胃腸運動障害、化学療法による胃腸運動障害、消化管運動障害による腸閉塞、筋強直性 ジストロフィーなどのように胃腸管運動障害によって発生する疾患を予防し治療することができる。
特に、本発明は胃腸管運動に関与するカハル間質細胞の電気的活動度を変わらせて胃腸管運動性を効率よく調節することができる。
本発明の一実施の形態に係るヒノキ抽出物をＧＣ/ＭＳ分析した結果を示したグラフ。 本発明の一実施の形態に係るヒノキ抽出物をＧＣ/ＭＳ分析した結果を示したグラフ。 本発明の一実施の形態に係るヒノキ抽出物をＧＣ/ＭＳ分析した結果を示したグラフ。 本発明の一実施の形態に係るヒノキ抽出物をＧＣ/ＭＳ分析した結果を示したグラフ。 本発明の一実施形態に係るヒノキ抽出物をカハル間質細胞に処理した時の電気的活動度の変化を示したグラフ。
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施の形態に係る胃腸管運動障害予防及び改善用の薬学組成物並びに食品組成物についてさらに具体的に説明する。
本発明の一実施の形態に係る胃腸管運動障害予防及び改善用薬学組成物はヒノキ抽出物を有効成分として含有する。
ヒノキ抽出物は多様な方法により抽出が可能である。かりに、ヒノキ葉または幹、枝などに抽出溶媒を加えて熱水抽出、冷浸または温浸抽出することができる。この場合、ヒノキに対して抽出溶媒を重量比で２ないし２０倍を加えて混合した後、１０ないし１５０℃で１ないし２４時間抽出する。ここで、抽出溶媒として、水、炭素数１ないし４の低級アルコール、多価アルコールまたはこれらの混合物から選択された少なくともいずれか一つを用いることができる。炭素数１ないし４の低級アルコールとして、メタノール、エタノールなどが用いられ、多価アルコールとして、ブチレングリコール及びプロピレングリコール、ペンチレングリコールなどを用いることができる。そして、混合物としては、水及び低級アルコールの混合物、水及び多価アルコールの混合物、低級アルコール及び多価アルコールの混合物、または水及び低級アルコール並びに多価アルコールの混合物を用いることができる。
また、ヒノキ抽出物は、還流冷却抽出、超音波抽出法、超臨界流体抽出法などを用いて収得することができる。また、前述した抽出方法だけではなく、通常の精製過程を経た抽出物も含む。例えば、一定した分子量カット-オフ値を有する限外濾過膜を用いた分離、多様なクロマトグラフィによる分離など、さらに施された多様な精製方法を通して得られた活性分画も抽出物に含まれる。
本発明における望ましいヒノキ抽出法は、ヒノキ葉及び幹、枝の中から少なくともいずれか一つを熱水抽出法または超臨界流体抽出法を用いて抽出するものである。特に、超臨界流体抽出法を用いて抽出するのが望ましい。
熱水抽出の一例として、ヒノキに水を重量比で５ないし１５倍を加えた後、８０ないし１２０℃で５ないし２０時間抽出することができる。
そして、超臨界流体抽出法(Supercritical Fluid Extraction)は、超臨界流体の粘度が小さくて試料への浸透性に優れて抽出効率が高く、拡散係数(diffusion coefficient)が大きくて抽出速度が速い。また、超臨界流体抽出法は割合に低温で抽出することによって熱による損傷を避けることができ、試料と超臨界流体との密度差が大きくて抽出残留物と溶媒の分離が容易な長所を有する。
超臨界流体とは、超臨界対象物質、すなわち、二酸化炭素、水、アルコール、ヘリウムなどの物質に臨界圧力、臨界温度を加えて高温高圧状態に保たれる流体を意味する。この超臨界流体は密度が液体に似た値を有し、粘度は気体に近く、拡散係数は液体より約１００倍ほどに大きい。この超臨界流体を抽出対象に浸透させれば、高純度の内容物を抽出できる。
本発明において超臨界流体として二酸化炭素が使用可能であり、抽出条件として温度３５℃ないし４５℃、圧力１００ないし５００bar、３０ないし２４０分間抽出することが望ましい。圧力が増加するほど抽出収率は高くなるが、フィトンチッド成分の含量は低くなる。 従って、低分子量のフィトンチッド成分の含量をアップできる望ましい圧力条件は１５０ないし２００barである。
超臨界抽出のための前処理工程として、ヒノキを洗浄、乾燥、粉砕させる工程を行うことができる。前処理工程のうち乾燥工程は、ヒノキからフィトンチッド成分が揮発することを防止するために、低温冷風乾燥または凍結乾燥するのが望ましい。
超臨界抽出時、超臨界流体である二酸化炭素にさらに共溶媒を混合した混合流体を使って行える。前記共溶媒はエタノール、メタノール、水、エチルアセテート、ヘキサン及びジエチルエーテルのうち一つ以上を使用でき、望ましくは８０％ないし１００％エタノールである。
本発明に係る胃腸管運動調節用薬学組成物は、総重量においてヒノキ抽出物を０.０１ないし９９重量％含有することができる。望ましくは、０.０５ないし５０重量％である。
本発明に係る薬学組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤のような経口製剤、注射剤、吸入剤、座剤、パッチ剤などの形態に剤形化して使用できる。
本発明に係る薬学組成物は、所望の製剤形態によって、薬学的に許容しうる適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含有しうる。
經口投与用として製造する場合、例えば結合剤(例:予備ゼラチン化したトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充?剤(例:ラクトース、微細結晶性セルロース、燐酸カルシウムなど);潤滑剤(例:マグネシウムステアレート、滑石、シリカなど)、崩解剤(例：ジャガイモでん粉、ナトリウム澱粉、グリコレートなど);または湿潤剤(例：ナトリウムラウリルスルフェートなど)のような薬剤学的に許容しうる賦形剤を含んで製造可能である。代表的には、固体投与型である顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤などの形態であり、錠剤またはカプセル剤は本技術分野において公知の方法によりコーティングできる。
經口投与用液体製剤は、例えば溶液、シロップ、エマルジョン、または懸濁液などの形態を取ることができ、使用前に水または他の適切なビヒクルと共に構成されるための乾式生成物として存在しうる。
この液体製剤は、任意に薬剤学的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤(例:ソルビトールシロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、水素化食用性脂肪など);乳化剤(例: レシチン、アラビアガムなど);非水性ビヒクル(例: アルモンドオイル、オイル性エステル、エチルアルコールなど); 防腐剤(例: メチルまたはプロピルｐ-ヒドロキシベンゾエート、ソルビン酸など)をさらに含むことができる。藥剤学的に許容される甘味料は、望ましくは少なくとも一つの甘味料、例えばサッカリン、サッカリンナトリウム、サッカリンカルシウム、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、ナトリウムサイクラメート、アリタム、ジヒドロカルコン甘味料、モネリン、ステビオシドまたはスクラロース(4,1',6'-トリクロロ-4,1',6'-トリデオキシガラクトスクロース)、任意のバルク甘味料(例:ソルビトール、マンニトール、フルクトース、スクロース、マルトース、イソマルト、グルコース、水素化グルコースシロップ、キシリトール、カラメルまたは蜜など)などを含むことができる。
非経口投與のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使える。座剤の基剤としては、ウィテップゾール(witepsol)、マクロゴール、ツイン(tween)６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどが使用できる。
本発明の薬学組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度, 薬物の形態、投与経路及び期間によって違ってくるが、当業者にとって適宜選択可能である。仮に、１日０.０００１ないし１００ｍｇ/ｋｇであって、好ましくは０.００１ないし１００ｍｇ/ｋｇを投与できる。投与は一日１回投与することも、数回分けて投与することもできる。
本発明に係る薬学組成物は、家畜、人間などを含む哺乳動物に多様な経路で投与でき、経口、直腸、靜脈、筋肉、皮下、子宮内、硬膜または脳血管内注射などによって投与可能である。
一方、本発明の他の実施形態として、前述したヒノキ抽出物を有効成分として含有して胃腸管運動調節効果を有する食品組成物を提供する。本発明の食品組成物は、ヒノキ抽出物を食品組成物の総重量において０.０１ないし６０重量％で含有することができる。
前記食品組成物は、人の日常生活において摂取する食べ物を意味するものであって、食べ飲み物の総称である。従って、本発明において食品組成物の形態は別に制限されない。公知の副材料、食品添加物などを混合して飲料、顆粒、錠剤、粉末、丸、カプセル、焦がし、麺類、お菓子類、肉類、魚類、浸し物、鍋料理類、またはご飯類などを含む多様な形態に製造することができる。好ましくは、飲料、顆粒、錠剤、粉末、丸、カプセルの中から選択されたいずれか一つの剤形に形成される。この剤形の食品組成物は携帯し易く、いつどこでも頻繁に摂取が容易である。
食品添加物として、例えば単糖類、二糖類, 多糖類、糖アルコールなどの糖類と、タウマチン、ステビア抽出物、サッカリン、アスパルテームなどの香味剤と、栄養剤、ビタミン、食用電解質、風味剤、着色剤、増進剤(例えば、チーズ、チョコレートなど)、ペクト酸、アルギン酸、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤などが利用できる。
飲料の一例として、ヒノキ抽出物０.０１ないし６０重量％、精製水５ないし７０重量％、タウリン０.１ないし５重量％、クエン酸０.１ないし５重量％、ビタミンＡ ０.１ないし５重量％、ビタミンＢ ０.１ないし５重量％、炭水化物１０ないし２０量％を含有する。前記炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、 マルトース、スクロースのようなジサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライドなどの通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどである。
その他、通常の飲料のように、色々の香味剤が追加成分として含有されうる。 香味剤として、タウマチン、ステビア抽出物などの天然香味剤及びサッカリン、アスパルテームなどの合成香味剤を使用できる。その他、飲料は天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。この成分は独立的にまたは組み合わせて使用できる。
顆粒、錠剤、粉末、丸、カプセルなどの固体剤形はヒノキ抽出物０.０１ないし６０重量％を含有し、その他粘着剤、香味料、ビタミン、炭水化物などをさらに含有できる。
以下、本発明を理解し易くするために実施例を提示しているが、下記の実施例は本発明を例示することに過ぎず、本発明の範囲が下記の実施例に限定されることではない。
<抽出実験>
１. 試料の採集及び前処理
本実験に使われた樹種は韓国の長城地域で生育しているもので、長城ヒノキ木林ゴウル営農組合法人で２０１０年１０月に採取したヒノキを購入して実験に使用した。
分離したヒノキ葉は水で洗浄して異物を除去してから、ポリエチレンビニール袋に入れてから４℃の冷蔵室に保管して試料として使用した。乾燥は低温冷風乾燥法を用いたし、低温冷風乾燥機(GCT-0615、(株）グリーンクールテック)を使用して３５℃で約２４時間乾燥を行った。乾燥されたヒノキ葉はミキサで粉砕して、早速超臨界流体抽出装備で抽出した。
２. 抽出工程条件
前処理されたヒノキ試料(粉砕過程まで終えたヒノキ葉)は超臨界流体抽出(CO2 Supercritical Fluid Extraction(0.5L))装備(SCFE-0500、（株）日新オートクレーブ)を用いて抽出した。
ヒノキ試料を結晶化槽に注入する前に結晶化槽の温度を４０℃に予熱した。結晶化槽の温度が４０℃に安定化すれば、高圧ポンプを用いてヒノキ試料を結晶化槽内に注入し、上部ラインを通じて逆溶剤（anti-solvent(CO2)）を実験圧力(100〜500bar)に到達するまで一定量を注入した。ガスを注入する途中に結晶化槽の圧力が時間が経つにつれて直線的に変化するようにバルブを調節した。ガスを注入してから一定時間(３０〜２４０分) 経った後に結晶化槽の下部のバルブを開けてゆっくり排気させると同時に、上部から純粋なＣＯ2ガスを注入して、排気中に結晶化槽の内部の圧力が一定に維持されるようにした。純粋なＣＯ2ガスを注入した後減圧してヒノキ抽出物を収得した。
３. ヒノキ抽出物の抽出收率
抽出条件によるヒノキ抽出物の抽出收率を確かめるために 抽出温度(４０℃)が固定した状態において各抽出圧力で時間による抽出收率を下記の表１に示した。抽出収率(%)は(抽出量(ｇ)/注入試料量(ｇ))×１００で計算したし、抽出量(ｇ)は注入試料量-抽出後試料量として計算した。
Figure 0005895053
前記表１を参照すれば、同じ圧力下で時間が経つにつれ抽出効率は増加することと現れた。一般的に、熱水抽出の場合収率が５％未満であることに比べ、超臨界流体抽出法による抽出の場合、収率が極めて高いことと確認された。
４. ヒノキ抽出物の成分分析
抽出されたヒノキ抽出物をヘキサンに十分に攪拌して遠心分離機を用いて浮遊物を除去し、マイクロフィルタ(０.４５?)で濾過して用意した。成分分析はＧＣ/ＭＳ装備(240-MS,Varian)を用いて、次のような条件下で進めた。カラムはＶＦ-５ms(30mm×0.25mm×0.25mm)、キャリアガス（Carrier gas）としてはHe(1mL/min)、注入温度は２５０℃、オーブン温度は５０℃〜３００℃/３℃昇温、注入量は１?、注入モードは分割比(Split ratio)１０:１条件下で成分分析を行ったし、ＭＤＳ(Mass Selective D injection mode detector)において質量飛程(mass range)２８〜５５０、収集モード(acquisition mode)はスキャンモード(scan mode)条件で成分を定量した。
まず、抽出条件として４０℃、１５０bar、１８０分で抽出されたヒノキ抽出物の構成成分の遅延時間を図１のＧＣ/ＭＳグラフに示した。それから、フィトンチッド成分のうち代表的な３３種の標準物質の遅延時間と比較してヒノキ抽出物の定性分析結果を下記の表２に示した。
Figure 0005895053
図１及び前記表１を参照すれば、ヒノキ抽出物の主要成分はフィトンチッド成分と同一であることを確認できる。そして、ヒノキ抽出物に含有されたフィトンチッド成分は殆ど４０分以内のピーク(peak)を示した。
そして、抽出時圧力が高くなるほど４０分以後にも多くのピークが現れたことを確認したが、これは圧力が高くなるほどヒノキ葉内の分子量が大きい成分まで抽出された結果として見られる。従って、分子量が割合的に小さく(１００〜３００)、揮発性に強いフィトンチッド成分の含量を高めるためには、割合的に低い圧力、すなわち２００bar以下の条件下で抽出するのが好ましいと思われる。
次いで、前処理工程である乾燥方法によってヒノキ抽出物成分の含量の差を説明する。乾燥過程において揮發性に強いフィトンチッド成分の揮發が予想され、２種類の乾燥法(低温冷風乾燥、凍結乾燥)を用いた。前述した低温冷風乾燥法で乾燥されたヒノキ試料から抽出(４０℃、１５０bar、１８０分)したヒノキ抽出物と、凍結乾燥法で乾燥されたヒノキ試料から抽出(４０℃、１５０bar、１８０分)したヒノキ抽出物とを比較して、図２のＧＣ/ＭＳグラフに示した。そして、主要成分の含量を下記の表３に示した。前記凍結乾燥は凍結乾燥機(OPR-FDT-8650, OPERON)を使って、約７２時間ヒノキ葉を乾燥して行った。
Figure 0005895053
図２及び前記表３を参照すれば、乾燥法によって各成分の揮発された程度は異なるものの、全成分の含量は低温冷風乾燥時凍結乾燥より１％高いことと現れた。従って、乾燥法によるフィトンチッド成分の含量の差はさほど出ないことと確認されたが、低温冷風乾燥方式が含量面においてやや有利なものであると解される。
次いで、ヒノキ抽出物に含有されたフィトンチッド成分の揮発性とその残留程度を調べるために、低温冷風乾燥法を用いたヒノキ試料から抽出(４０℃、１５０bar、１８０分)されたヒノキ抽出物を一定量取って、一つは空気中に放置したし、もう一つは密封して保管した。３日後、各試料をヘキサン(hexane)に溶解させて成分を分析した結果を図３のＧＣ/ＭＳグラフに示した。そして、主要成分の含量を下記の表４に示した。
Figure 0005895053
図３及び前記表４を参照すれば、ヒノキ抽出物を空気中に３日間放置した結果、２０分以前にピークが見出されなかった。２０分以前にピークが現れる成分のうち９５％以上が揮発されたことと確認された。２０分以内にピークが現れる成分は相対的に低分子量の成分であることから３日内に殆ど揮発された一方、４０分以後にピークが現れる成分は高分子量であることから揮発されずに殆ど残されていた。この結果は、密封して３日間保管した結果と比較する際、２０分以内のピークで著しく差が出た。
そして、空気中に３日間放置したが、密封して３日間保管した結果に比べて、かえってさらに多量が残されている成分(シス-ネロリドール（cis-nerolidol）,ネロリドール-トランス（nerolidol-trans）,セドロール（cedrol）など)が存在した。これは、低分子量成分は揮発され、高分子量成分が濃縮したことと判断される。
前述した実験結果を通じて超臨界流体抽出法を用いてフィトンチッド成分の含量の高いヒノキ抽出物を得るための大量抽出条件は、温度４０℃、圧力１５０ないし２００barが最適であると現れた。そして、抽出時間は３０ないし２４０分が適当であるが、収率を考慮する際１８０ないし２４０分が望ましい。
一方、前記最適抽出条件のうち低温冷風乾燥法で乾燥されたヒノキ試料を、４０℃、１５０bar、１８０分の条件下で抽出時、抽出回数による成分の変化を観察した。このため、１回抽出して取得したヒノキ抽出物(１回抽出物)と、同じ条件下で連続２回抽出して収得したヒノキ抽出物(２回抽出物)に対する成分を分析した結果を、図４のＧＣ/ＭＳグラフに示した。そして、主要成分の含量を下記の表５に示した。
Figure 0005895053
図４及び前記表５を参照すれば、１回抽出時約２３.６％のフィトンチッド成分を抽出したし、２回抽出時約４５.５％のフィトンチッド成分を抽出することができた。従って、再抽出時高純度のフィトンチッド成分が得られることが確認できた。
<胃腸管運動調節実験>
胃腸管の運動は、交感神経、副交感神経などのような外因性神経系、内因性神経系、内因性因子及び薬物の他、胃腸管平滑筋の自発的活動度とカハル間質細胞(ICC)が関与する。従って、ヒノキ抽出物がカハル間質細胞の電気的活動度を変わらせて胃腸管運動性を調節できることを確認しようとする。
１.カハル間質細胞分離
生後１０〜１５日目のBalb/Cマウスを雌雄区別なしで実験動物として使用した。エーテルで麻酔させた後、頸椎部位を脱臼させて犠牲させた。開腹して大腸部位を摘出した。室温下クレブス-リンガー重炭酸塩（Krebs-Ringer bicarbonate）溶液を満たした容器中で切開して内容物を除去した。ピンで組織を固定した後、顕微鏡下で微細ハサミを用いて粘膜層を除去し輪状筋を露出させた。
分離された筋組織をコラゲナーゼ(Worthington Biochemical Co., Lakewood, USA)０.１％、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)）０.１％、トリップシン抑制剤（trypsin inhibitor、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)０.１％を含有しＣa2+が入っていないハンクス（Hank’s ）溶液に移してから、３７℃で１３分間恒温消化させた。消化させた後、再びＣa2+が入っていないハンクス（Hank’s）溶液に取り替えて、先が鈍いガラスピペットを使って注意深く振盪させて細胞を分離した。
２.カハル間質細胞の培養
分離された細胞を３５ｍｍ培養容器内に、マウスコラーゲン（murine collagen(2.5 g/ml,Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)）でコーティングされた滅菌カバーガラス上に分注した。１０分後に幹細胞因子（stem cell factor(SCF,5ng/ml,Sigma)）と２％抗生物質／抗真菌剤（antibiotic/antimycotic(Gibco-BRL)）が入っているSmGm(平滑筋増殖培地（smooth muscle growth medium, Clonetics Corp.,San Diego,CA,USA）)溶液を分注した後、３７℃、９５％ Ｏ2-５％ ＣＯ2培養器で培養させた。培養された翌日、前日培養された溶液で２％抗生物質／抗真菌剤（antibiotic/antimycotic）だけを除いて栄養液を取り替えした。 実験は培養２日から施した。培養されたカハル間質細胞の確認はＫＩＴ蛋白による抗体(ACK2,Gibco-BRL)を使用したし、Alexa Fluor 488(分子プローブ（Molecular Probes,Eugene,OR,USA）)で免疫蛍光染色を施した。染色が終わった後、共焦点レーザ走査顕微鏡（confocal laser scanning microscopy;FV300,Olympus,Japan)を用いて観察した。
３. 細胞膜電圧及び電流の記録
培養された容器を倒立顕微鏡上に設けられている恒温調節計に移してから、１分当たり２〜３ｍｌ速度で細胞外溶液を灌流させた。細胞膜電圧固定法(Whole-cell patch clamp)を施して、電流固定状態(current-clamping mode)で細胞膜電圧と電圧固定状態(voltage-clamping mode)で細胞膜電流を記録した。パッチクランプ増幅器(Axopatch 1-D, Axon Instruments, Foster, CA, USA)を通じて出てくる信号はデジタルオシロスコープ、生理的記録機を通じて観察したし、固定電圧と刺激電圧の調整及び電流の記録はｐクランプ（pClamp(version, 6.0,Axon Instruments)）とIBM互換機（IBM-compatible computer）を使った。細胞膜電流は-８０ｍＶの維持電圧に固定して記録した。全ての実験は２９℃で行った。
４.結果
電流固定状態においてカハル間質細胞で測定された膜電圧は−５７±５ｍＶであり、ペースメーカー活動度の頻度数は５±２cycles/minであった。
低温冷風乾燥法を用いたヒノキ試料から抽出(４０℃、１５０bar、１８０分)されたヒノキ抽出物を水に希釈して濃度を０.０５％に調節した試料をカハル間質細胞に投与した実験の結果、図４の (Ａ)グラフに示したように、カハル間質細胞のペースメーカー電圧の発生頻度が増加した。そして、図５の(Ｂ)グラフに示したように、ヒノキ抽出物の濃度を０.１％に増加させた場合、膜電圧が低分極しつつペースメーカー電圧の発生頻度を増やした。
このように、前述した実験結果を通じて、ヒノキ抽出物は胃腸管ペースメーカー細胞であるカハル間質細胞の電気的活動度を変わらせて胃腸管運動性を調節しうることが確認できる。
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる例に限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到しうることは明らかであり、これらについても、当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
本発明は、機能性消化不良や便秘、過敏性大腸症状、糖尿病性胃腸運動障害、化学療法による胃腸運動障害、消化管運動障害による腸閉塞、筋強直性ジストロフィーなどのように胃腸管運動障害によって発生する疾患を予防し治療できる薬物または食品として有効に活用可能である。

Claims (2)

  1. ヒノキ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする胃腸管運動障害予防及び改善用の薬学組成物の製造方法であって、
    前記腸管運動障害予防及び改善は、カハル間質細胞の電気的活動度を変わらせて行われ、
    前記ヒノキ抽出物は、ヒノキ葉及び幹、枝のうち少なくともいずれか一つを超臨界流体抽出法を用いて抽出し、
    前記超臨界流体抽出法は、超臨界流体として二酸化炭素を温度３５℃ないし４５℃、圧力１００ないし５００barで加えて３０ないし２４０分間抽出することを特徴とする胃腸管運動障害予防及び改善用の薬学組成物の製造方法。
  2. 請求項１に記載の薬学組成物の製造方法を含む食品組成物の製造方法。
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