JP5889305B2 - 組換え神経毒ポリペプチドの選択的製造 - Google Patents
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Description
a)本発明のプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドと、精製マトリックスとを、該プロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの精製マトリックスへの結合を可能にするのに十分な条件下、および時間にわたって接触させるステップ;
b)精製マトリックスに結合したプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断し、プロセッシングされた、および部分的にプロセッシングされた、および/またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドをもたらすことができるプロテアーゼとを接触させるステップ;ならびに
c)精製マトリックスから、遊離したプロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ
を含む前記方法を包含する。
a)本発明の神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させるステップ;
b)ステップa)で得られたプロセッシングされた、プロセッシングされていない、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドと、精製マトリックスとを、精製マトリックスへの前記プロセッシングされていないか、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドの結合を可能にするのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップ;ならびに
c)精製マトリックスから、遊離した、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ
を含む、前記方法に関する。
a)本発明の神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させるステップ;
b)ステップa)で得られたプロセッシングされた、プロセッシングされていない、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドを、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドからの部分的にプロセッシングされたか、またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの物理的分離を可能にするのに十分な時間にわたって物理的条件に供するステップ;ならびに
c)前記物理的分離後にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ
を含む前記方法を意図する。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)軽鎖、リンカーおよび重鎖を含む神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該リンカーが、該ポリペプチドに対して少なくとも一つの物理化学的特性を付与する異種アミノ酸配列を含む改変リンカーであり、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドからの、部分的にプロセッシングされたか、またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの分離を可能にし、前記異種アミノ酸配列がプロテアーゼ認識および切断部位によってNおよびC末端にフランキングされている、前記ポリヌクレオチド。
(2)前記異種アミノ酸配列が、精製マトリックスに高い親和性で結合する、(1)に記載のポリヌクレオチド。
(3)精製マトリックスに高い親和性で結合する前記異種アミノ酸配列が精製タグを含む、(1)または(2)に記載のポリヌクレオチド。
(4)部分的にプロセッシングされたか、および/またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドを、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドから物理的に分離することができるように、前記異種アミノ酸配列が神経毒ポリペプチドの分子量を増加させる、(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)精製マトリックスに高い親和性で結合する前記異種アミノ酸配列が、(i)精製マトリックスへの高親和性結合を付与する少なくとも1個のアミノ酸ドメインならびに(ii)軽鎖と重鎖の間に分子内ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を近くにもっていくか、および/または該異種アミノ酸配列による軽鎖と重鎖の間の適切なジスルフィド結合の形成の干渉を防止する少なくとも1個のアミノ酸ドメインを含む、(1)、(2)または(4)のいずれか1に記載のポリヌクレオチド。
(6)精製マトリックスへの高親和性結合を付与する前記少なくとも1個のドメインが、精製タグを含む、(5)に記載のポリヌクレオチド。
(7)異種アミノ酸配列による軽鎖と重鎖の間の適切なジスルフィド結合の形成の干渉を防止する前記少なくとも1個のアミノ酸ドメインが、軽鎖と重鎖の間に分子内ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を物理的に近いところにもっていく三次元構造を形成する、(5)または(6)に記載のポリヌクレオチド。
(8)異種アミノ酸配列のCおよびN末端アミノ酸により形成される前記三次元構造が、逆平行コイルドコイル構造または逆平行βシート構造である、(7)に記載のポリヌクレオチド。
(9)精製マトリックスに高い親和性で結合する前記異種アミノ酸配列が、少なくとも1つの検出可能なマーカーアミノ酸配列をさらに含む、(5)〜(8)のいずれか1に記載のポリヌクレオチド。
(10)前記検出可能なマーカーアミノ酸配列が、蛍光タンパク質のアミノ酸配列、検出可能なシグナルを生成することができる酵素のアミノ酸配列、および検出可能なタグのアミノ酸配列からなる群より選択される、(9)に記載のポリヌクレオチド。
(11)前記精製タグがHisタグ、Mycタグ、FLAGタグ、strepタグ、MBPタグ、NusAタグ、GSTタグ、ストレプトアビジンおよびアビジンからなる群より選択される、(3)または(6)〜(9)のいずれか1に記載のポリヌクレオチド。
(12)前記プロテアーゼ認識および切断部位が、SNAP25に由来する神経毒軽鎖プロテアーゼ認識および切断部位、大腸菌プロテアーゼに由来する認識および切断部位、トロンビン認識および切断部位、第X因子認識および切断部位、トリプシン認識および切断部位、エンテロキナーゼ認識および切断部位、TEVプロテアーゼ認識および切断部位、HRV 3c認識および切断部位、ならびにPreScission(登録商標)プロテアーゼ認識および切断部位からなる群より選択される、(1)〜(11)のいずれか1に記載のポリヌクレオチド。
(13)神経毒ポリペプチドの前記軽鎖および重鎖が、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTからなる群より選択される神経毒の軽鎖および重鎖である、(1)〜(12)のいずれか1に記載のポリヌクレオチド。
(14)(1)〜(13)のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(15)(1)〜(13)のいずれか1に記載のポリヌクレオチドまたは(14)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(16)前記宿主細胞が細菌細胞である、(15)に記載の宿主細胞。
(17)(1)〜(13)のいずれか1に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
(18)プロセッシングされた神経毒ポリペプチドの製造方法であって、
a)(17)に記載のプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドと、精製マトリックスとを、精製マトリックスへの前記プロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの結合を可能にするのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップ;
b)精製マトリックスに結合したプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させて、プロセッシングされた、および部分的にプロセッシングされた、および/またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドを得るステップ;ならびに
c)精製マトリックスから、遊離した、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ、
を含む、前記方法。
(19)プロセッシングされた神経毒ポリペプチドの製造方法であって、
a)(17)に記載の神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させるステップ;
b)ステップa)で得られたプロセッシングされた、プロセッシングされていない、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドと、精製マトリックスとを、精製マトリックスへの前記プロセッシングされていないか、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドの結合を可能にするのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップ;ならびに
c)精製マトリックスから、遊離した、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ、
を含む、前記方法。
(20)ステップa)が、(1)〜(13)のいずれか1に記載のポリヌクレオチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを発現する宿主細胞またはその溶解物中で実行される、(19)に記載の方法。
(21)プロセッシングされた神経毒ポリペプチドの製造方法であって、
a)(17)に記載の神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させるステップ;
b)ステップa)で得られたプロセッシングされた、プロセッシングされていない、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドを、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドからの、部分的にプロセッシングされたか、またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの物理的分離を可能にするのに十分な時間にわたって物理的条件に供するステップ;ならびに
c)前記物理的分離後にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ、
を含む、前記方法。
Claims (21)
- 軽鎖、リンカーおよび重鎖を含む神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該リンカーが、該神経毒ポリペプチドにおいて該軽鎖と該重鎖との間に配置されており、且つ該ポリペプチドに対して少なくとも一つの物理化学的特性を付与する異種アミノ酸配列を含む改変リンカーであり、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドからの、部分的にプロセッシングされたか、またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの分離を可能にし、前記異種アミノ酸配列がプロテアーゼ認識および切断部位によってNおよびC末端にフランキングされている、前記ポリヌクレオチド。
- 前記異種アミノ酸配列が、精製マトリックスに高い親和性で結合する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 精製マトリックスに高い親和性で結合する前記異種アミノ酸配列が精製タグを含む、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- 部分的にプロセッシングされたか、および/またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドを、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドから物理的に分離することができるように、前記異種アミノ酸配列が神経毒ポリペプチドの分子量を増加させる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 精製マトリックスに高い親和性で結合する前記異種アミノ酸配列が、(i)精製マトリックスへの高親和性結合を付与する少なくとも1個のアミノ酸ドメインならびに(ii)軽鎖と重鎖の間に分子内ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を近くにもっていくか、および/または該異種アミノ酸配列による軽鎖と重鎖の間の適切なジスルフィド結合の形成の干渉を防止する少なくとも1個のアミノ酸ドメインを含む、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 精製マトリックスへの高親和性結合を付与する前記少なくとも1個のドメインが、精製タグを含む、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 異種アミノ酸配列による軽鎖と重鎖の間の適切なジスルフィド結合の形成の干渉を防止する前記少なくとも1個のアミノ酸ドメインが、軽鎖と重鎖の間に分子内ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を物理的に近いところにもっていく三次元構造を形成する、請求項5または6に記載のポリヌクレオチド。
- 異種アミノ酸配列のCおよびN末端アミノ酸により形成される前記三次元構造が、逆平行コイルドコイル構造または逆平行βシート構造である、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
- 精製マトリックスに高い親和性で結合する前記異種アミノ酸配列が、少なくとも1つの検出可能なマーカーアミノ酸配列をさらに含む、請求項5〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記検出可能なマーカーアミノ酸配列が、蛍光タンパク質のアミノ酸配列、検出可能なシグナルを生成することができる酵素のアミノ酸配列、および検出可能なタグのアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- 前記精製タグがHisタグ、Mycタグ、FLAGタグ、strepタグ、MBPタグ、NusAタグ、GSTタグ、ストレプトアビジンおよびアビジンからなる群より選択される、請求項3または請求項6〜9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロテアーゼ認識および切断部位が、SNAP25に由来する神経毒軽鎖プロテアーゼ認識および切断部位、大腸菌プロテアーゼに由来する認識および切断部位、トロンビン認識および切断部位、第X因子認識および切断部位、トリプシン認識および切断部位、エンテロキナーゼ認識および切断部位、TEVプロテアーゼ認識および切断部位、HRV 3c認識および切断部位、ならびにPreScission(登録商標)プロテアーゼ認識および切断部位からなる群より選択される、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 神経毒ポリペプチドの前記軽鎖および重鎖が、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNTからなる群より選択される神経毒の軽鎖および重鎖である、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
- プロセッシングされた神経毒ポリペプチドの製造方法であって、
a)請求項17に記載のプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドと、精製マトリックスとを、精製マトリックスへの前記プロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの結合を可能にするのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップ;
b)精製マトリックスに結合したプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させて、プロセッシングされた、および部分的にプロセッシングされた、および/またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドを得るステップ;ならびに
c)精製マトリックスから、遊離した、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ、
を含む、前記方法。 - プロセッシングされた神経毒ポリペプチドの製造方法であって、
a)請求項17に記載の神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させるステップ;
b)ステップa)で得られたプロセッシングされた、プロセッシングされていない、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドと、精製マトリックスとを、精製マトリックスへの前記プロセッシングされていないか、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドの結合を可能にするのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップ;ならびに
c)精製マトリックスから、遊離した、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ、
を含む、前記方法。 - ステップa)が、請求項1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを発現する宿主細胞またはその溶解物中で実行される、請求項19に記載の方法。
- プロセッシングされた神経毒ポリペプチドの製造方法であって、
a)請求項17に記載の神経毒ポリペプチドと、プロテアーゼ認識および切断部位で神経毒ポリペプチドを切断することができるプロテアーゼとを接触させるステップ;
b)ステップa)で得られたプロセッシングされた、プロセッシングされていない、および/または部分的にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドを、プロセッシングされた神経毒ポリペプチドからの、部分的にプロセッシングされたか、またはプロセッシングされていない神経毒ポリペプチドの物理的分離を可能にするのに十分な時間にわたって物理的条件に供するステップ;ならびに
c)前記物理的分離後にプロセッシングされた神経毒ポリペプチドを取り出すステップ、
を含む、前記方法。
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