JP5875770B2 - 硝酸呼吸能を有する微生物の培養方法 - Google Patents
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第一の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン(NO3 −)を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン(NO2 −)を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液と電解液をイオン交換膜を介して接触させ、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、培養液に作用電極と共に参照電極を接触させ、電解液に対電極を接触させ、作用電極の電位を3電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。
図2に示す電気培養装置1は、密閉構造の容器20を培養槽7とし、容器20に収容可能な密閉構造の小容器21を対電極槽8とし、小容器21は少なくとも一部にイオン交換膜6を備えると共にガス(対電極10から発生するガス)を容器20の外に排出するガス排出管22を備えるものとしている。また、対電極10と定電位設定装置12を結線する配線は、ガス排出管22の中を通過させている。尚、図2に示す電気培養装置1では、対電極10と定電位設定装置12を結線する配線は、ガス排出管22の中を通過させているが、必ずしもこの構成には限定されず、配線をガス排出管22を通さずに定電位設定装置12と結線するようにしてもよい。
図3に示す電気培養装置1は、上方が開放されている容器23をイオン交換膜6で仕切ることにより開放された二つの槽が形成され、培養槽7としての一方の槽の上方開放部がガス不透過膜またはガス不透過部材24により塞がれているものとしている。つまり、図3に示す電気培養装置1は、対電極槽8から発生するガスを培養槽7に漏れ出さないようにする構成以外は、図2と同一の構成としている。したがって、図2に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
図4に示す電気培養装置1は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器25aと25bがイオン交換膜6を介して開口部で連結されてU字型の容器25が形成され、一方の容器25aを密閉構造として培養槽7とし、他方の容器25bを開放して対電極槽8としている。この場合、培養液4と電解液4aがイオン交換膜6を介して接触すると共に、培養槽7の培養液4の液面よりも上部の空間と対電極槽8の電解液4aの液面よりも上部の空間とが容器25自体のU字型構造によって隔てて配置される。そして、一方の容器25aが密閉構造とされていることから、対電極槽8から発生するガスが培養槽7に侵入するのを防ぎながら、培養槽7から発生するガスが培養槽7から漏洩するのを防ぐことができる。したがって、図2に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
図5に示す電気培養装置1は、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器26aと26bがイオン交換膜6を介して開口部で連結されてH字型の容器26が形成され、一方の容器26aを密閉構造として培養槽7とし、他方の容器26bを開放して対電極槽8としている。この場合にも、培養液4と電解液4aがイオン交換膜6を介して接触すると共に、培養槽7の培養液4の液面よりも上部の空間と対電極槽8の電解液4aの液面よりも上部の空間とが容器26自体のH字型構造によって隔てて配置される。そして、H字型容器26の一方の容器26aが密閉構造とされていることから、培養槽7は密閉構造となる。したがって、対電極槽8から発生するガスが培養槽7に侵入するのを防ぎながら、培養槽7から発生するガスが培養槽7から漏洩するのを防ぐことができる。したがって、図2に示す電気培養装置を用いた場合と同様の効果が得られる。
第二の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン(NO3 −)を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン(NO2 −)を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極と参照電極を接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液と対電極とをイオン交換膜を介して接触させ、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、作用電極の電位を3電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。つまり、第一の実施形態における培養方法とは、電解液を用いることなく対電極を直接イオン交換膜に接触させている点のみが異なっている。
第三の実施形態にかかる培養方法は、硝酸イオン(NO3 −)を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン(NO2 −)を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、培養液に作用電極と対電極と参照電極とを接触させ、作用電極と対電極と参照電極とを定電位設定装置に結線し、培養液に硝酸イオンを含有させて微生物に硝酸呼吸をさせ、作用電極の電位を3電極方式で制御して、微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うようにしている。つまり、第三の実施形態にかかる培養方法においては、イオン交換膜と電解液を用いることなく、培養液に全ての電極を接触させている点において第一の実施形態及び第二の実施形態と異なる。
図22に示す電気培養装置1aは、密閉構造の容器20を培養槽7とし、培養槽7に収容された培養液4に作用電極9と対電極10と参照電極11とが浸され、作用電極9と対電極10と参照電極11とが定電位設定装置12に結線されている。つまり、第三の実施形態Aは、第一の実施形態Aから小容器21(イオン交換膜6)及びガス排出管22を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Aと同様の構成を有している。したがって、図22に示す電気培養装置1aにより微生物を培養することで、イオン交換膜6を設けない場合の上記効果が奏される。
図23に示す電気培養装置1aは、容器5内に作用電極9と参照電極11が配置され、容器5内に培養液4を収容し、容器5の培養液4の液面よりも下部に穴を設けておき、この穴を対電極10で塞いで、容器5を密閉構造としている。そして、作用電極9と対電極10と参照電極11とが定電位設定装置12に結線されている。つまり、第三の実施形態Bは、第二の実施形態からイオン交換膜6を削除したこと以外は、実質的には第二の実施形態と同様の構成を有している。したがって、図23に示す電気培養装置1aにより微生物を培養することで、イオン交換膜6を設けない場合の上記効果が奏される。
図24に示す電気培養装置1aは、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器25aと25bが開口部で連結されてU字型の容器25が形成され、容器25内に培養液4を収容し、容器25a側を培養槽7とし、容器25b側を対電極槽としている。そして、作用電極9と参照電極11を容器25a側の培養液4に浸し、対電極を容器25b側の培養液4に浸し、容器25a側の培養液4の液面よりも上部のヘッドスペースは密閉構造とし、容器25b側の培養液4の液面よりも上部のヘッドスペースは開放構造としている。つまり、第三の実施形態Cは、第一の実施形態Cからイオン交換膜6を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Cと同様の形態を有している。したがって、図24に示す電気培養装置1aにより微生物を培養することで、イオン交換膜6を設けない場合の上記効果が奏される。
図25に示す電気培養装置1aは、収容される液体の液面よりも下部に開口部を備える二つの容器26aと26bが開口部で連結されてH字型の容器26が形成され、一方の容器26aを密閉構造として培養槽7とし、他方の容器26bを開放して対電極槽8としている。つまり、第三の実施形態Dは、第一の実施形態Dからイオン交換膜6を削除したこと以外は、実質的には第一の実施形態Dと同様の形態を有している。したがって、図25に示す電気培養装置1aにより微生物を培養することで、イオン交換膜6を設けない場合の上記効果が奏される。
図26に示す電気培養装置1aは、容器23に培養液4を収容し、培養液4に作用電極9と対電極10と参照電極11とを浸し、これらの電極を定電位設定装置12に結線し、容器23に収容された培養液4の液面よりも上部のヘッドスペースを二層に区画し、一方の区画23cに対電極10から発生するガスを滞留させ、もう一方の区画23dにこのガスが移行するのを抑制するようにしている。したがって、図26に示す電気培養装置1aにより微生物を培養することで、イオン交換膜6を設けない場合の上記効果が奏される。
大腸菌を用いて、硝酸呼吸を利用した培養について検討した。
[培養液の組成(L−1)]
・乳酸ナトリウム: 4.72g
・KH2PO4: 4.2g
・NH4Cl: 0.6g
・MgCl2・7H2O: 0.08g
・カザミノ酸: 5.0g
・微量元素溶液: 1mL
[微量元素溶液の組成(L−1)]
・FeSO4・7H2O: 0.2g
・CuSO4・5H2O: 1.0g
・NaMoO4・2H2O: 0.034g
・CaCl2・2H2O: 0.015g
・Na2SeO4: 0.5g
培養液に電極を接触させて、硝酸呼吸によって生じた亜硝酸イオンを酸化させながら大腸菌を培養することについて検討した。
図8に示す電気培養装置を用いて実験を行った。培養槽7としての容器20は250mL容のガラスバイアル瓶(Duran製)とした。培養液4は容器20の八分目程度まで入れた。容器20には蓋30をした。蓋30の上面30aにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器20の密閉性を確保した。また、シリコーンゴム栓を設けることにより注射針の突き刺しを可能とし、且つ注射針の差し込みにより生じた孔が注射針を抜いた際に塞がるようにした。
[培養液の組成(L−1)]
・乳酸ナトリウム: 4.72g
・KH2PO4: 4.2g
・NH4Cl: 0.6g
・MgCl2・7H2O: 0.08g
・カザミノ酸: 5.0g
・微量元素溶液: 1mL
[微量元素溶液の組成(L−1)]
・FeSO4・7H2O: 0.2g
・CuSO4・5H2O: 1.0g
・NaMoO4・2H2O: 0.034g
・CaCl2・2H2O: 0.015g
・Na2SeO4: 0.5g
培養液4に亜硝酸イオンとしてNaNO2を0.85g/L添加し、作用電極9を炭素電極(BAS社製)とし、対電極10を白金棒電極(自作)として上記電気培養装置を用いてサイクリックボルタンメトリーにより酸化還元特性を測定した。結果を図10に示す。図10に示される結果から、亜硝酸イオンは、電気化学的に酸化されるが、還元されない性質を有することが明らかとなった。
培養液4には、硝酸イオン源として、硝酸ナトリウム(NaNO3)を0.85g/L添加した。また、大腸菌(E.coli JM109)を初期菌体密度1.0×107cells/mLになるように添加した。
各種電極電位における菌数の経時変化を図15に示す。+0.8Vでは通電無しの場合との差が見られなかったが、+0.9Vとすることで通電無しの場合と比較して対数増殖期が大幅に延長されて最終菌体密度が大幅に向上する効果が見られ、+1.0Vとすることでこの効果がより顕著に見られることが確認された。また、+1.2Vとした場合にも、通電無しの場合と比較して対数増殖期が大幅に延長されて最終菌体密度が大幅に向上する効果が見られたが、その効果は+1.0Vの場合ほどではなかった。
作用電極9と炭素電極とし、イオン交換膜6(ナフィオンN117、デュポン製)により作製した袋状の小容器21の上部の開口部をシリコン接着剤32で塞ぐことなく開放しておき、また、ガス排出管22を備えずに対電極10から発生したガスが培養槽7のヘッドスペースに移行するようにして、上記と同様の培養試験を実施し、培養期間中に培養槽7から発生したガスと対電極槽8から発生したガスを容器20の上部に設置したフッ化ビニル樹脂製サンプリングバッグ(アズワン製、商品名:テドラーバッグ、1L)に回収し、回収したガスの量と組成を分析した。作用電極9の電極電位は+1.0Vとした。ガスの量は水上置換法により分析し、ガスの組成はガスクロマトグラフィー(VARIAN、CR4900)で分析した。また、比較試験として、通電を行わなかった場合と、大腸菌を入れずに通電を行った場合について、ガスの発生量と組成を分析した。
作用電極:O2 + 4H+ + 4e- = 2H2O、 E0= 1.229V ・・・・(a)
対電極 :2H+ + 2e- = H2、E0= 0.000V ・・・・(b)
硝酸呼吸:C3H6O3 + 2NO3 - → C2H4O2 + CO2 + 2NO2 - + 2H2O ・・・・(c)
亜硝酸酸化反応:NO3 - + 2H+ + 2e- = NO2 - + H2O、E0= 0.835V ・・・・(d)
遺伝子組換え大腸菌を用いて、通電無しの場合と電極電位を+1.0Vとした場合について、実施例1の(1)の電気培養装置を用いて、実施例1と同様の方法で培養試験を実施した。
袋状の小容器21の密閉性と大腸菌の生育の関係について検討した。
実施例1の(1)の電気培養装置を用い、作用電極9と対電極10を共に炭素電極として、実施例1と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り(+1.0V)と通電無しで実施した。
実施例1の(5)の電気培養装置を用い、作用電極9と対電極10を共に炭素電極として、実施例1と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り(+1.0V)と通電無しで実施した。
実施例1の(5)の電気培養装置を用い、作用電極9と対電極10を共に炭素電極とし、サンプリングバッグをフッ化ビニル樹脂製からアルミニウム製(ジーエルサイエンス製、商品名:アルミニウムバッグ、1L)に変更して、実施例1と同様の方法で大腸菌の培養試験を実施した。培養試験は、通電有り(+1.0V)と通電無しで実施した。
1.実験条件
以下の4条件(A)〜(D)により培養試験を実施した。
実施例3の条件3にて使用した電気培養装置と同様の装置を用い、通電を行うことなく培養試験を実施した。
条件(A)について、作用電極9の電極電位を+1.0Vとして培養試験を実施した。作用電極9と対電極10は共に炭素電極(BAS社製)とした。
袋状の小容器21とガス排出管22を備えずに、対電極10を直接培養液4に浸した以外は、条件(A)と同様の電気培養装置を用い、作用電極9の電極電位を+1.0Vとして培養試験を実施した。作用電極9と対電極10は共に炭素電極(BAS社製)とした。
条件(C)について、対電極10を炭素電極から白金電極(BAS社製)に代えて培養試験を実施した。
<菌体密度>
条件(A)、(B)、(D)について、菌体密度(OD660)の経時変化を図27に示す。図27に示される結果から、条件(A)と比較して、条件(B)及び(D)の方が対数増殖期が長期化して定常期の菌数が増加しその傾向は、条件(B)よりも条件(D)の方が顕著であった。
条件(B)〜(D)について、作用電極9と対電極10との間の極間電圧の経時変化を図28に示す。イオン交換膜6を設けていない条件(C)及び(D)において、イオン交換膜6を設けた条件(B)よりも、極間電圧が低下する傾向が見られた。このことから、イオン交換膜6を設けずに本発明の培養方法を実施することで、極間電圧を低下させてエネルギーロスを低減する効果が奏されることが確認できた。
条件(B)〜(D)について、作用電極9と対電極10との間の電流値の経時変化を図29に示す。条件(B)及び条件(D)において、培養対象微生物とした大腸菌の対数増殖期に対応する時期に電流値の大幅な増大が見られ、増殖の定常期に向かうにしたがって電流値が低下し、その後一定になる傾向が見られた。電流値の大きさは、イオン交換膜を設けていない条件(D)の方が大きかった。このことから、条件(B)及び(D)のいずれにおいても、微生物の増殖の過程で電子の授受が生じており、特にイオン交換膜を設けない場合において、電子の授受が活発に起こっていることが示唆された。尚、条件(C)においては、条件(B)及び(D)で見られた対数増殖期における電流値の増大が見られなかったことから、対電極10として使用した炭素電極が電極として十分に機能しなくなっていたものと考えられた。
条件(A)〜(D)について、水素発生量を図30に示す。尚、条件(C)については、上記の通り、対電極10の炭素電極が腐食して電極として機能していなかったものと考えられることから、条件(C)の実験結果は除外して検討を行った。図30に示される結果から、通電を行うことで、水素が大量に発生し、イオン交換膜6を設けずに培養を行うことで、水素発生量が顕著に増加することが明らかとなった。
条件(A)、(B)、(D)について、培養試験終了後の培養液4の乳酸、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、ピルビン酸濃度を図31に示す。図31では、各有機酸毎に左から条件(A)、(B)及び(D)の順でグラフを並べている。尚、炭素源として初期投入した培養液4の乳酸濃度は20mMである。図31に示される結果から、イオン交換膜6を設けた場合には、プロピオン酸とギ酸を蓄積させずに培養できることが確認され、イオン交換膜6を設けずに培養を行った場合には、プロピオン酸とギ酸に加えて、酢酸とピルビン酸についても蓄積させずに培養できることが確認された。
実施例4の条件(A)、(B)及び(D)について、大腸菌の炭素源(栄養源)を乳酸からグルコースに代えて、同様の培養試験を実施した。
4 培養液
9 電極(作用電極)
Claims (7)
- 硝酸イオン(NO3 −)を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン(NO2 −)を生成する硝酸呼吸能を有する微生物を培養するに際し、
前記培養液に硝酸イオンを含有させて前記微生物に硝酸呼吸をさせ、
前記培養液に電極を接触させ、
前記培養液の溶液電位を制御し易くするための酸化還元物質を前記培養液に添加することなく、あるいは亜硝酸イオンよりも酸化されにくい前記酸化還元物質を前記培養液に添加して、
前記電極に亜硝酸イオンを硝酸イオンに酸化可能な電位を与えて、前記微生物の硝酸呼吸により生じる亜硝酸イオンを酸化させながら培養を行うことを特徴とする電気培養方法。 - 前記微生物は、大腸菌(Escherichia coli)である請求項1に記載の培養方法。
- 前記大腸菌は、遺伝子組換え大腸菌である請求項2に記載の培養方法。
- 前記電極を炭素電極とし、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で+0.9V〜+1.2Vに制御して培養を行う請求項2または3に記載の培養方法。
- 前記電極を白金電極とし、前記電極の電位を銀・塩化銀電極電位基準で+0.8〜+1.2Vに制御して培養を行う請求項2または3に記載の培養方法。
- 硝酸イオン(NO3 −)を最終電子受容体として硝酸呼吸を行うことにより亜硝酸イオン(NO2 −)を生成する硝酸呼吸能と共に物質生産能を有する微生物を培養対象微生物とし、前記微生物により物質を生産するために必要な原料を培養液に添加して請求項1〜5のいずれか一つに記載の培養方法を実施し、培養過程において前記微生物により生産される前記物質を回収することを特徴とする物質生産方法。
- 前記微生物は、物質生産能を有する遺伝子組換え大腸菌である請求項6に記載の物質生産方法。
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