JP5794521B2 - アポトーシス誘導剤 - Google Patents
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Description
本発明は、アポトーシス誘導剤に関する。あるいは、細胞増殖性疾患に対する内照射治療薬に関する。
内照射治療とは、放射性薬剤を体内に投与し、標的部位にターゲティングすることにより、その放射性核種から放出される放射線によって治療を行うことをいう。内照射治療においては、主にβ−線を放出する放射性核種が用いられている。β−線はがん細胞に集積した際に高い治療効果が得られるが、β−線の飛程が長いため集積部位を含めた周囲の正常細胞にも影響を及ぼしてしまうといった問題点がある。そこで、より飛程の短い放射線を用いた正常細胞に影響の少ない治療法が期待されており、オージェ電子を用いた内照射治療用放射性薬剤の開発研究が進められている。
オージェ電子とは、原子核に近い軌道にある電子が電子捕獲によって空いた軌道に、外殻から電子が移動するときに生じる遷移エネルギーを受けることで放出される電子である。オージェ電子には、水中における飛程が数ナノメートルと短い、放出中心から数ナノメートルの球内限定的に強い電離と大規模なＤＮＡ損傷を起こす、細胞基質あるいは細胞外ではオージェエミッタの崩壊による放射性毒性が１０〜１００倍少ない、などの特徴がある。
内照射治療法の研究が進められているオージェ電子放出核種には、１２５Ｉや１１１Ｉｎなどが挙げられる。しかし１２５Ｉは半減期が６０日と長く、副作用が発生したときの対処が困難であると考えられる。また１１１Ｉｎは金属元素のため薬剤設計が難しく、ターゲットとの親和性が低下しやすいなどの問題点が考えられる。
本発明者らは、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（以下、ＢｒｄＵと記載する）を母体化合物とし、このフラノース環４’位の酸素原子を硫黄原子に置換した化合物（５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン（以下、Ｂｒ−ＢＴｄＵと記載する））が、腫瘍の増殖能イメージング剤として利用できることを明らかにしている（非特許文献１および２参照）。しかしながら、Ｂｒ−ＢＴｄＵおよびその放射標識体が、細胞増殖抑制機能やアポトーシス誘導機能を有することや、内照射治療に有用な化合物であることについては、未だ開示されていない。
また、特許文献１には、式
（式中、Ｒ１は水素又はメチル基、Ｒ２は水素、ヒドロキシル又はハロゲン置換基、Ｒ３は水素、Ｒ４は酸素又は硫黄、Ｒ５は放射性ハロゲン置換基である。ただし、Ｒ１が水素であって且つＲ４が酸素である場合を除く）で表される化合物が、組織増殖能の診断や、増殖性疾患の治療に用いられることが開示されている。しかしながら、Ｂｒ−ＢＴｄＵがアポトーシスを誘導することや、Ｂｒ−ＢＴｄＵが細胞増殖性疾患の内照射治療に有用であることについては、記載も示唆もない。
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２ １１６Ｐ（２０１０）
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ３７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２ Ｓ３５８（２０１０）
内照射治療によって細胞増殖性の疾患を治療するために有用な、放射性薬剤が求められている。
７７Ｂｒはオージェ電子を放出する核種であって、半減期が５７時間と短く、ヨウ素よりも安定な化学結合を形成しうる同位体である。したがって、７７Ｂｒを適用することで内照射治療に有用な放射性薬剤を製造できる可能性がある。また７７Ｂｒはβ＋線を放出するため、体内に入った放射性薬剤の分布を、ＰＥＴを用いることによって確認できる可能性がある。
本発明者らは、Ｂｒ−ＢＴｄＵのＢｒを放射性臭素とした化合物およびその誘導体が、癌細胞の細胞増殖を抑制するばかりか、アポトーシスをも誘発することを明らかにした。本発明者らはさらに鋭意研究を行い、本発明を完成した。
本発明者らは、Ｂｒ−ＢＴｄＵのＢｒを放射性臭素とした化合物およびその誘導体が、癌細胞の細胞増殖を抑制するばかりか、アポトーシスをも誘発することを明らかにした。本発明者らはさらに鋭意研究を行い、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
［１］放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンまたはその誘導体を含んでなる、アポトーシス誘導剤；
［２］放射性臭素が、７７Ｂｒである、［１］に記載の剤；
［３］放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンまたはその誘導体、ならびに医薬的に許容し得る担体を含んでなる、細胞増殖性疾患の内照射治療薬；
［４］細胞増殖性疾患が、癌である、［３］に記載の治療薬；
［５］放射性臭素が、７７Ｂｒである、［３］または［４］に記載の治療薬；
などに関する。
［１］放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンまたはその誘導体を含んでなる、アポトーシス誘導剤；
［２］放射性臭素が、７７Ｂｒである、［１］に記載の剤；
［３］放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンまたはその誘導体、ならびに医薬的に許容し得る担体を含んでなる、細胞増殖性疾患の内照射治療薬；
［４］細胞増殖性疾患が、癌である、［３］に記載の治療薬；
［５］放射性臭素が、７７Ｂｒである、［３］または［４］に記載の治療薬；
などに関する。
本発明の化合物は、周辺の正常細胞に影響を与えることなく、増殖速度の速い異常細胞に対して選択的かつ効果的にアポトーシスを誘導する。したがって本発明によって、新たなアポトーシス誘導剤が提供される。また本発明の化合物を含むアポトーシス誘導剤は、細胞増殖性の疾患に対する治療薬としても用いることが可能である。
また本発明により、細胞増殖性の疾患に対する新規かつ極めて有用な内照射治療薬が提供される。これまでの内照射治療では、半減期６０日という長い半減期の１２５Ｉを用いる手法が主流であり、これでは、副作用が判明した際の対処が著しく遅れるといった問題点が考えられた。しかしながら本発明の内照射治療薬は、半減期５７時間の７７Ｂｒを利用しているので、仮に副作用が発生しても次の薬剤投与を行わないという選択が可能となり、臨床的に有利である。このことによって、手術による摘出の難しい癌への新しい治療戦略を提供できると考えられる。
あるいは本発明により、腫瘍のＤＮＡ合成能を評価することが可能となる。ＤＮＡ合成能を直接評価可能となれば、１８Ｆ−ＦＬＴでは正確な評価が出来なかった、抗癌剤あるいは放射線治療時の、ＤＮＡ合成は抑制されるがチミジンキナーゼ１の活性は維持されるような増殖能の評価が難しい状態であっても、腫瘍の評価が可能となる。このことは、腫瘍増殖能の正確な評価が可能であることを示しており、抗癌剤治療が分子標的薬に移行していることを鑑みると、本発明は癌の治療方法を正しく選択することに大きく貢献すると考えられる。
さらに本発明の治療薬は、治療薬自体が放射性臭素で標識されているので、これ自体を核種とした画像診断を行うことも可能である。
本発明の「放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン（以下、「本発明の化合物」、あるいは「放射性ＢＴｄＵ」と記載する）」とは、ＢｒｄＵにおけるフラノース環の４’−ｏｘｏを４’−ｓｕｌｆｕｒに置換し、さらに５位の臭素を放射性臭素に置換した（放射性臭素で標識された）化合物である。
ＢｒｄＵにおける５位の臭素を放射性臭素で置換した場合、生体内において、グリコシド結合の開裂、それに続く脱臭素反応を受けて放射性臭素が脱離することが知られている。しかしながら本発明の化合物は、フラノース環の４’−ｏｘｏを４’−ｓｕｌｆｕｒに置換したことで生体内脱臭素反応に抵抗性を示すので、薬剤の成分として用いることが可能である。
ＢｒｄＵにおける５位の臭素を放射性臭素で置換した場合、生体内において、グリコシド結合の開裂、それに続く脱臭素反応を受けて放射性臭素が脱離することが知られている。しかしながら本発明の化合物は、フラノース環の４’−ｏｘｏを４’−ｓｕｌｆｕｒに置換したことで生体内脱臭素反応に抵抗性を示すので、薬剤の成分として用いることが可能である。
本明細書中、「放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンの誘導体（以下、本発明の誘導体と記載する）」とは、放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンが有する機能を保持する限りにおいて、放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンの構造に基づいて、有機化学分野における通常の技術を用いて修飾された化合物を意味する。
修飾に用いられる置換基としては、当該誘導体が放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンが有する機能を保持する限りにおいて特に限定されず、有機化学分野における公知の置換基を用いることができる。
修飾に用いられる置換基としては、当該誘導体が放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンが有する機能を保持する限りにおいて特に限定されず、有機化学分野における公知の置換基を用いることができる。
このような化合物としては、例えば式（Ｉ）
（式中、Ｒ１は水素又はＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシルまたはハロゲン置換基を示す）で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と記載する）が挙げられる。
化合物（Ｉ）は、本発明の誘導体の好ましい一例を具体的に表したものであり、後述する本発明の化合物と同様の機能を有する。
化合物（Ｉ）は、本発明の誘導体の好ましい一例を具体的に表したものであり、後述する本発明の化合物と同様の機能を有する。
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６で直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基を意味し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。
本明細書中、「ハロゲン置換基」としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基が挙げられる。
化合物（Ｉ）におけるＲ１として好ましくは、水素であり、Ｒ３として好ましくは、水素である。
好ましい化合物（Ｉ）としては、Ｒ１が水素またはアルキル基を示し、Ｒ２が水素、ヒドロキシルまたはハロゲン置換基を示し、Ｒ３が水素を示す化合物である。より好ましい化合物（Ｉ）としては、Ｒ１が水素を示し、Ｒ２が水素またはヒドロキシル基を示し、Ｒ３が水素を示す化合物である。さらに好ましい化合物としては、Ｒ１が水素を示し、Ｒ２がヒドロキシル基を示し、Ｒ３が水素を示す化合物である。
好ましい化合物（Ｉ）としては、Ｒ１が水素またはアルキル基を示し、Ｒ２が水素、ヒドロキシルまたはハロゲン置換基を示し、Ｒ３が水素を示す化合物である。より好ましい化合物（Ｉ）としては、Ｒ１が水素を示し、Ｒ２が水素またはヒドロキシル基を示し、Ｒ３が水素を示す化合物である。さらに好ましい化合物としては、Ｒ１が水素を示し、Ｒ２がヒドロキシル基を示し、Ｒ３が水素を示す化合物である。
本発明の化合物の５位における「放射性臭素」とは、臭素の放射性同位体を意味する。本発明の化合物は、ＢＴｄＵを放射性臭素で標識することによって、強い細胞増殖抑制機能を有する。
本発明の化合物における放射性臭素として好ましくは、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒであり、より好ましくは７７Ｂｒである。
７７Ｂｒはオージェ電子を放出する核種であって、半減期が５７時間と短く、安定な化学結合を形成しうる同位体である。また７７Ｂｒはβ＋線を放出するため、体内に入った本発明の化合物分布を、ＰＥＴを用いることによっても確認できる可能性がある。ところで、内照射治療法の研究が進められているオージェ電子放出核種には、１２５Ｉなどの同じ放射性ハロゲン元素も挙げられる。しかしながら、１２５Ｉは半減期が６０日と長く、副作用が発生したときの対処が困難であることが考えられる。したがって、放射性臭素を選択した、中でも７７Ｂｒを選択した本発明の化合物は、内放射治療において非常に有用である。
本発明の化合物における放射性臭素として好ましくは、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒであり、より好ましくは７７Ｂｒである。
７７Ｂｒはオージェ電子を放出する核種であって、半減期が５７時間と短く、安定な化学結合を形成しうる同位体である。また７７Ｂｒはβ＋線を放出するため、体内に入った本発明の化合物分布を、ＰＥＴを用いることによっても確認できる可能性がある。ところで、内照射治療法の研究が進められているオージェ電子放出核種には、１２５Ｉなどの同じ放射性ハロゲン元素も挙げられる。しかしながら、１２５Ｉは半減期が６０日と長く、副作用が発生したときの対処が困難であることが考えられる。したがって、放射性臭素を選択した、中でも７７Ｂｒを選択した本発明の化合物は、内放射治療において非常に有用である。
あるいは本発明の誘導体は、置換可能な位置において、さらなる放射性臭素、もしくは放射性臭素以外の他の放射性同位体によって修飾されていてもよい。さらなる修飾に用いられる他の放射性同位体としては、例えば３６Ｃｌ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔが挙げられる。これらの放射性同位体による修飾は、当業者であれば自体公知の方法によって行うことができる。
本発明の化合物またはその誘導体は、増殖能の高い細胞に取り込まれ、その細胞増殖を抑制する機能を有する。特に本発明の化合物またはその誘導体は、生体内において安定で、チミジンキナーゼによって細胞内に取り込まれるか、あるいはＤＮＡに組み込まれてＤＮＡ合成活性を反映する。したがって本発明の化合物またはその誘導体は、増殖能の高い細胞のＤＮＡに集積することで、その細胞増殖を抑制する機能を発揮すると考えられる。
なお、当該機能は非放射性臭素を有する５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン（以下、非放射性ＢＴｄＵと記載する）も有する機能であるが、本発明の化合物は、放射性臭素を有することによって、非放射性ＢＴｄＵよりも高い細胞増殖抑制機能を有する。放射性臭素単独ではこのような細胞増殖抑制効果は発揮し得ない（本願実験例１、図１Ｂ参照）ので、本発明の化合物が有する細胞増殖抑制機能は、放射性臭素とＢＴｄＵが組み合わされたことによる相乗的な効果によるものであるといえる。
あるいは本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞により取り込まれ、その細胞のアポトーシスを誘導する機能を有する。この場合、放射性臭素としてオージェ電子を放出する７７Ｂｒを適用することが望ましい。放射性臭素として７７Ｂｒを用いることで、７７Ｂｒの内照射効果によって増殖能の高い細胞特異的なアポトーシスを誘導することができる。
本発明の化合物またはその誘導体は、その医薬的に許容し得る塩の形態で提供されるものであってもよい。
本明細書中、「医薬的に許容し得る塩」とは、医薬上許容できる無毒の塩基または酸から調製される塩を意味する。そのような塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、または硝酸塩のような無機酸の塩、あるいは、有機スルホン酸塩若しくは有機カルボン酸塩のような有機酸の塩が挙げられる。上記有機スルホン酸塩としては、例えば、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられ、有機カルボン酸塩としては、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩、マンデル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩等が挙げられる。
本明細書中、「医薬的に許容し得る塩」とは、医薬上許容できる無毒の塩基または酸から調製される塩を意味する。そのような塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、または硝酸塩のような無機酸の塩、あるいは、有機スルホン酸塩若しくは有機カルボン酸塩のような有機酸の塩が挙げられる。上記有機スルホン酸塩としては、例えば、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられ、有機カルボン酸塩としては、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、アスコルビン酸塩、マンデル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩等が挙げられる。
本発明の化合物またはその誘導体は、プロドラッグの形であってもよい。
本明細書中、「プロドラッグ」とは、生体内において（例えばｐＨの変化による）自発的な化学変化によりまたは生体内に通常存在する酵素によって、あるいは生体内に導入ないし操作された酵素によって活性体となる、医薬的に不活性の化合物を意味する。当該技術分野において様々な形のプロドラッグ、例えば、生体内加水分解性エステルまたはエーテル等が知られている。このようなプロドラッグは、試験中の化合物を、例えば試験動物に静脈内投与した後、試験動物の体液を調べることによって同定することができる。
生体内加水分解性エステルとしては無機酸エステルおよび有機酸エステルが挙げられ、無機酸エステルとしては、リン酸エステル等が挙げられ、有機酸エステルには、脂肪族カルボン酸エステル、芳香族カルボン酸エステル、カルバミン酸エステル等が挙げられる。エーテルとしては、アセトキシメチルエーテル、及びピバロイルオキシメシルエーテル等のアシルオキシアルキルエーテル等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、「プロドラッグ」とは、生体内において（例えばｐＨの変化による）自発的な化学変化によりまたは生体内に通常存在する酵素によって、あるいは生体内に導入ないし操作された酵素によって活性体となる、医薬的に不活性の化合物を意味する。当該技術分野において様々な形のプロドラッグ、例えば、生体内加水分解性エステルまたはエーテル等が知られている。このようなプロドラッグは、試験中の化合物を、例えば試験動物に静脈内投与した後、試験動物の体液を調べることによって同定することができる。
生体内加水分解性エステルとしては無機酸エステルおよび有機酸エステルが挙げられ、無機酸エステルとしては、リン酸エステル等が挙げられ、有機酸エステルには、脂肪族カルボン酸エステル、芳香族カルボン酸エステル、カルバミン酸エステル等が挙げられる。エーテルとしては、アセトキシメチルエーテル、及びピバロイルオキシメシルエーテル等のアシルオキシアルキルエーテル等が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、本発明の化合物またはその誘導体は、溶媒和物（例えば水和物）の形で存在していてもよい。さらに、互変異性体などの各種異性体も本発明の化合物またはその誘導体に含まれる。
本発明の化合物またはその誘導体の製造方法は、自体公知の方法であれば特に限定されない。また、市販品が存在すればそれを利用してもよい。本発明の化合物またはその誘導体の製造方法としては、特許第４２１０１１８号公報に記載の方法が挙げられる。
化学合成によって本発明の化合物を製造する場合、母体化合物としては、例えば細胞増殖マーカーとして用いられているＢｒｄＵにおける、フラノース環の４’−ｏｘｏを４’−ｓｕｌｆｕｒに置換した化合物を選択すればよい。このような母体化合物を選択することによって、得られる本発明の化合物が生体内脱臭素反応に抵抗性を示すので、薬剤として生体内に投与することが可能になる。
当該母体化合物は、当業者であれば自体公知の方法やそれに準じた方法で製造することができるし、市販品が存在すればそれを利用してもよい。このような方法としては、特許第４２１０１１８号公報に記載の方法や、以下の合成スキーム
当該母体化合物は、当業者であれば自体公知の方法やそれに準じた方法で製造することができるし、市販品が存在すればそれを利用してもよい。このような方法としては、特許第４２１０１１８号公報に記載の方法や、以下の合成スキーム
で表される方法が挙げられる。当該合成スキームの各反応における化合物の量や反応条件などは、当業者が適宜決定することが可能である。
本発明の化合物の合成スキームのうち、放射性臭素の標識工程は、以下の式（ＩＩ）で表される。
本工程は、ピリミジン環の５位にトリブチルスタンニル基を有する母体化合物をハロゲン化（放射性臭素化）して、本発明の化合物を得る工程である。当該母体化合物は、例えばＮｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５ ６７−７４（２００８）に記載の方法によって合成することができる。
本工程は、本発明の誘導体を得る目的にも適用することが可能である。またその場合の反応条件は、当業者であれば適宜設定することが可能である。
本工程は、本発明の誘導体を得る目的にも適用することが可能である。またその場合の反応条件は、当業者であれば適宜設定することが可能である。
本発明は、本発明の化合物またはその誘導体を含んでなる、細胞増殖抑制剤を提供する。
本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞により取り込まれやすく、周囲の正常細胞（相対的に増殖速度が遅い細胞）には相対的に取り込まれにくいという性質を有する。したがって、対象とする異常細胞特異的に、細胞増殖を抑制することが可能である。あるいは前述のとおり、オージェ電子を放出する７７Ｂｒを放射性臭素として適用することによって、内照射効果により効果的に細胞増殖抑制機能を発揮することが可能である。
本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞により取り込まれやすく、周囲の正常細胞（相対的に増殖速度が遅い細胞）には相対的に取り込まれにくいという性質を有する。したがって、対象とする異常細胞特異的に、細胞増殖を抑制することが可能である。あるいは前述のとおり、オージェ電子を放出する７７Ｂｒを放射性臭素として適用することによって、内照射効果により効果的に細胞増殖抑制機能を発揮することが可能である。
本発明は、本発明の化合物またはその誘導体を含んでなる、アポトーシス誘導剤を提供する。
本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞により取り込まれやすく、周囲の正常細胞（相対的に増殖速度が遅い細胞）には相対的に取り込まれにくいという性質を有する。したがって、対象とする異常細胞特異的に、その細胞のアポトーシスを誘導する機能を有する。あるいは前述のとおり、オージェ電子を放出する７７Ｂｒを放射性臭素として適用することによって、内照射効果により選択的かつ効果的にアポトーシスを誘導することができる。
本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞により取り込まれやすく、周囲の正常細胞（相対的に増殖速度が遅い細胞）には相対的に取り込まれにくいという性質を有する。したがって、対象とする異常細胞特異的に、その細胞のアポトーシスを誘導する機能を有する。あるいは前述のとおり、オージェ電子を放出する７７Ｂｒを放射性臭素として適用することによって、内照射効果により選択的かつ効果的にアポトーシスを誘導することができる。
本明細書における「アポトーシス誘導」とは、生体における細胞、生体由来の細胞および株化された細胞など、あらゆる細胞のアポトーシスを誘導することをいう。本発明においてアポトーシスが誘導される細胞は、周辺の細胞集団が有するホメオスタシスを逸脱して増殖する細胞（異常細胞）であることが好ましく、このような細胞としては、癌細胞が挙げられる。
また、本明細書における「細胞増殖抑制」とは、生体における細胞、生体由来の細胞および株化された細胞など、あらゆる細胞の細胞分裂による増殖を抑制することをいう。
また、本明細書における「細胞増殖抑制」とは、生体における細胞、生体由来の細胞および株化された細胞など、あらゆる細胞の細胞分裂による増殖を抑制することをいう。
本明細書中、本発明のアポトーシス誘導剤を「本発明の剤」と記載する場合がある。
本発明の剤は、本発明の剤が有する効果を損なわない限りにおいて、他の成分の添加を制限するものではない。すなわち、本発明のアポトーシス誘導剤のアポトーシス誘導機能を失わせたり、異なる機能に改変したりすることがなければ、他にどのような成分が添加されていてもよい。
例えば賦形剤を添加する場合は、従来公知の賦形剤から適宜選択することができ、スクロース、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、デキストラン等の糖、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、プロリン等のアミノ酸が例示される。さらに、界面活性剤や機能性物質（例、タンパク質、核酸など）を添加してもよい。
例えば賦形剤を添加する場合は、従来公知の賦形剤から適宜選択することができ、スクロース、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、デキストラン等の糖、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、プロリン等のアミノ酸が例示される。さらに、界面活性剤や機能性物質（例、タンパク質、核酸など）を添加してもよい。
本発明の剤は、自体公知の細胞増殖抑制剤や、アポトーシス誘導剤を含んでいてもよいし、あるいは本発明の剤が有するアポトーシス誘導効果を損なわない限りにおいて、本発明の剤に異なる効果を付け加える目的や、相乗効果を与える目的で、上記細胞増殖抑制剤や、アポトーシス誘導剤以外の自体公知の剤が含まれていてもよい。あるいは、これらの剤は本発明の剤と併用してもよい。
このような剤は、当業者であれば適宜選択することが可能である。
このような剤は、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の剤の製造方法としては特に限定されず、製造する剤型に適した製造方法が適用される。このような製造方法は、当業者に公知である。
本発明の剤における本発明の化合物またはその誘導体の量は特に限定されず、用途に応じて、例えば０．０１〜１００重量％の間で、適宜選択すればよい。
本発明の剤における本発明の化合物またはその誘導体の量は特に限定されず、用途に応じて、例えば０．０１〜１００重量％の間で、適宜選択すればよい。
本発明は、放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンまたはその誘導体、ならびに医薬的に許容しうる担体を含んでなる、細胞増殖性疾患の治療薬（以下、「本発明の治療薬」と記載する場合がある）を提供する。
本発明の治療薬に含まれる「放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン」および「その誘導体」については、前記したとおりである。
本発明の治療薬に含まれる「放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン」および「その誘導体」については、前記したとおりである。
本明細書中、「細胞増殖性疾患」とは、生体内の細胞の異常増殖に起因する疾患全般のことをいい、このような疾患としては、前立腺増生症、子宮内膜増生症（嚢胞性腺増生症・子宮腺筋症・子宮筋腫）、卵巣腫瘍（嚢胞腺腫）、乳腺（乳腺症・乳腺繊維腺腫）、下垂体腺腫、頭蓋咽頭腫、甲状腺腺腫、副腎皮質腺腫・クロム親和性細胞腫などの良性腫瘍；悪性リンパ腫（ホジキン病・非ホジキンリンパ腫）、咽頭癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵臓癌、腎臓腫瘍（腎臓癌・腎芽細胞腫）、膀胱腫瘍、前立腺癌、精巣腫瘍、子宮癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍（原発性脳腫瘍・転移性脳腫瘍）、横紋筋肉腫、骨腫瘍（骨肉種・転移性骨腫瘍）、カポジ肉腫、悪性黒色腫などの悪性腫瘍；単純ヘルペスウイルスやヒト免疫不全ウイルスなどによるウイルス感染症；あるいは、乾癬等の増殖性皮膚疾患などが挙げられるが、特に好ましくは癌である。すなわち本発明は、癌の治療薬を提供する。
本発明の治療薬は、治療を必要としている対象に単剤として、あるいは他の抗癌剤と組み合わせて、上記各種癌の治療の一部として使用し得る。
本発明の治療薬は、治療を必要としている対象に単剤として、あるいは他の抗癌剤と組み合わせて、上記各種癌の治療の一部として使用し得る。
本発明の治療薬に含まれる「医薬的に許容し得る担体」とは、液体または固体の賦形剤、希釈液、潤滑剤、または物質をカプセル化する溶媒のような、医薬的に許容し得る物質、組成物または媒体を意味する。各担体は、前記製剤の他の成分との適合性があり、また投与対象に対して傷害性でないという意味において「許容し得る」ものでなければならない。
医薬的に許容し得る担体の具体的な例としては、例えば、ラクトース、グルコース、ショ糖などの糖；コーンスターチ、ジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、セルロース酢酸塩などのセルロース；トラガカント；麦芽；ゼラチン；滑石；カカオバター、坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；アルギン酸；生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；ポリエステル、ポリカーボネートなどのポリ無水物類、などが挙げられるが、特に限定されない。当業者であれば、適宜これらの担体を選択することが可能である。
医薬的に許容し得る担体の具体的な例としては、例えば、ラクトース、グルコース、ショ糖などの糖；コーンスターチ、ジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、セルロース酢酸塩などのセルロース；トラガカント；麦芽；ゼラチン；滑石；カカオバター、坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；アルギン酸；生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；ポリエステル、ポリカーボネートなどのポリ無水物類、などが挙げられるが、特に限定されない。当業者であれば、適宜これらの担体を選択することが可能である。
本発明の治療薬を、上記疾患の治療を目的として対象に投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、液剤などとして経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。このような投与剤型の選択および製造は、当業者であれば自体公知の方法を利用して適宜行うことができる。
あるいは、本発明の化合物またはその誘導体の有効量を、その剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることもできる。例えば注射剤として製剤化する場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とすればよい。
あるいは、本発明の化合物またはその誘導体の有効量を、その剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることもできる。例えば注射剤として製剤化する場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とすればよい。
本発明の治療薬の投与対象としては特に限定されず、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウシなどが挙げられるが、好ましくはヒトである。
本発明の治療薬は、特に内照射療法に用いられることが望ましい。
本明細書中、「内照射療法」または「内照射治療」とは、生体内に投与した放射性物質が発する放射線によって疾患を治療することをいう。特に本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞、例えば癌細胞特異的に取り込まれるため、癌細胞の内照射治療に有用である。
なかでも本発明の化合物またはその誘導体が、放射性臭素として７７Ｂｒを有する場合、放出されたオージェ電子によって異常細胞（例えば、癌細胞）の細胞増殖は速やかに抑制され、かつ異常細胞のアポトーシスが誘導されるので、特に細胞増殖性の疾患に対する内照射治療に有用である。
本明細書中、「内照射療法」または「内照射治療」とは、生体内に投与した放射性物質が発する放射線によって疾患を治療することをいう。特に本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞、例えば癌細胞特異的に取り込まれるため、癌細胞の内照射治療に有用である。
なかでも本発明の化合物またはその誘導体が、放射性臭素として７７Ｂｒを有する場合、放出されたオージェ電子によって異常細胞（例えば、癌細胞）の細胞増殖は速やかに抑制され、かつ異常細胞のアポトーシスが誘導されるので、特に細胞増殖性の疾患に対する内照射治療に有用である。
本発明の治療薬の投与方法としては特に限定されず、投与対象の細胞増殖性疾患の状態や剤型などに応じて、適当な自体公知の投与方法を選択することができる。しかしながら、本発明の治療薬は好ましくは内照射治療用として用いられるため、その場合は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与などにより生体内に直接投与する投与方法が望ましい。
本発明の剤および治療薬は、好ましくはオージェ電子を放出する７７Ｂｒのような核種を採用する。オージェ電子放出核種によって標識された本発明の化合物またはその誘導体は、増殖速度の速い異常細胞に取り込まれ、かつＤＮＡの近傍へ集積することによって、より効率的に抗腫瘍効果を発揮することができる。したがって、本発明の化合物またはその誘導体が有するこれらの機能により、本発明の剤および治療薬の抗腫瘍効果、内放射治療効果が発揮される。
また、併せて３６Ｃｌや１３１Ｉのようなβ線放出核種も採用することができる。これらの核種は、その飛程に応じて直径１ｃｍ以上の大きな腫瘍に対して縮小効果が期待される。
また、併せて２１１Ａｔのようなα線放出核種も採用することができる。これらの核種は直径０．１ｍｍ以内の微小な病変に対してβ線放出核種よりも大きな治療効果が得られることから、これらの核種を併用することによって全身の微小転移巣への治療効果も期待される。
また、併せて３６Ｃｌや１３１Ｉのようなβ線放出核種も採用することができる。これらの核種は、その飛程に応じて直径１ｃｍ以上の大きな腫瘍に対して縮小効果が期待される。
また、併せて２１１Ａｔのようなα線放出核種も採用することができる。これらの核種は直径０．１ｍｍ以内の微小な病変に対してβ線放出核種よりも大きな治療効果が得られることから、これらの核種を併用することによって全身の微小転移巣への治療効果も期待される。
一方、局所投与による治療に関して、７７Ｂｒのようなオージェ電子放出核種で標識した本発明の化合物またはその誘導体は、放出放射線の特性上、ホメオスタシスを逸脱して増殖している異常細胞以外には障害を与えないことから、手術による完全切除が困難な脳腫瘍、悪性黒色腫瘍の残存腫瘍、機能温存の観点から乳癌、直腸癌、前立腺癌、口腔の悪性腫瘍への適用が特に有用である。局所投与の手技としては、例えば、大腸癌などの体腔部の患部に内視鏡を介して投与する方法、脳腫瘍の開頭術中に直接患部に投与する方法、肝臓癌などにおいてその臓器の支配動脈中にカテーテルを介して投与する方法などがある。
本発明の治療薬の投与量は、疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、体重などによっても異なるが、例えば成人男性（体重６０ｋｇ）の場合、１回投与量として、１ＭＢｑ〜１００００ＭＢｑ、好ましくは２００ＭＢｑ〜４０００ＭＢｑの放射能を投与するように投与する。投与間隔としても特に限定されず、放射性臭素の半減期を考慮して当業者であれば適宜設定することができるが、放射性臭素として７７Ｂｒ（半減期約５７時間）を選択した場合、およそ３日〜２週間程度の投与間隔で上記１回投与量を投与する。
本発明の治療薬は、通常は静脈内に投与するが、場合により動脈内や腹腔内または直接腫瘍等の患部内に投与するなど、静脈内以外の投与経路を選択してもよい。さらに上記投与量を適切な投与間隔で複数回投与することも可能である。
本発明の治療薬は、通常は静脈内に投与するが、場合により動脈内や腹腔内または直接腫瘍等の患部内に投与するなど、静脈内以外の投与経路を選択してもよい。さらに上記投与量を適切な投与間隔で複数回投与することも可能である。
別の実施形態において、本発明の治療薬は、放射線療法（外照射療法）または他の抗癌化学療法剤による治療と組み合わせて使用することもできる。
他の化学療法剤としては、ゲムシタビン、メトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、プレドニゾロン、デキサメサゾン、シタラビン、カンパセシン類、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどが挙げられる。
また放射線療法に用いられる装置としては、例えば、リニアック（ノバリス、サイバーナイフなど）、コバルト照射装置（ガンマナイフなど）、医療用サイクロトロンなどが挙げられる。
さらに本発明は、細胞増殖性疾患の治療の必要がある対象に対し、治療上有効量の本発明の化合物またはその誘導体を投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療方法も提供する。
また本発明は、細胞のＤＮＡ合成能の評価方法を提供する。
本発明の化合物または誘導体は、細胞のＤＮＡに取り込まれるため、核種から放出される放射線を測定することで、細胞、特に腫瘍細胞のＤＮＡ合成能を直接的に評価することが可能となる。これにより、１８Ｆ−ＦＬＴでは正確な評価が出来なかった、抗癌剤あるいは放射線治療時の、ＤＮＡ合成は抑制されるがチミジンキナーゼ１の活性は維持されるような増殖能の評価が難しい状態であっても、腫瘍の評価が可能となる。
本発明の化合物または誘導体は、細胞のＤＮＡに取り込まれるため、核種から放出される放射線を測定することで、細胞、特に腫瘍細胞のＤＮＡ合成能を直接的に評価することが可能となる。これにより、１８Ｆ−ＦＬＴでは正確な評価が出来なかった、抗癌剤あるいは放射線治療時の、ＤＮＡ合成は抑制されるがチミジンキナーゼ１の活性は維持されるような増殖能の評価が難しい状態であっても、腫瘍の評価が可能となる。
以下に合成例、実施例および実験例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。なお以下の合成例、実施例および実験例は本願発明の一例を挙げるに過ぎず、本発明をこの範囲に限定するものではない。
合成例１：非放射性ＢＴｄＵおよび５−トリブチルスズ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンの製造
（１）工程１および２
２−デオキシ−Ｄ−エリスロ−ペントース ５０ｍｇ（３７３ｍｍｏｌ）、乾燥メタノール８００ｍｌおよび０．５Ｍ ＨＣｌ／メタノール（１．８％）５６ｍｌ（２８ｍｍｏｌ）を仕込み、室温で６０分乾燥させた後、炭酸銀１０ｇを少しずつ投入した。濾過した後炭酸銀を除き、減圧濃縮した。さらに乾燥ＴＨＦ１００ｍｌを加え、減圧濃縮した。窒素気流下、反応物を乾燥ＴＨＦ４２０ｍｌに溶解して氷上で冷却し、テトラｔ−ブチルアンモニウムヨウ素３０ｇ（８１ｍｍｏｌ）を加え、更に６０％水酸化ナトリウム水溶液４０ｇ（１Ｍ）を少しずつ加え、スラリーを得た。１５℃でベンジルブロミド１４０ｇ（８２０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で２〜３日反応させた後、減圧濃縮した。さらにジクロロメタンを加え、ジクロロメタン溶液を氷水に加え、攪拌し、分層し、水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、４：１）にて精製して、目的物（メチル ３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントサイド）１１８ｇを得た。
（１）工程１および２
２−デオキシ−Ｄ−エリスロ−ペントース ５０ｍｇ（３７３ｍｍｏｌ）、乾燥メタノール８００ｍｌおよび０．５Ｍ ＨＣｌ／メタノール（１．８％）５６ｍｌ（２８ｍｍｏｌ）を仕込み、室温で６０分乾燥させた後、炭酸銀１０ｇを少しずつ投入した。濾過した後炭酸銀を除き、減圧濃縮した。さらに乾燥ＴＨＦ１００ｍｌを加え、減圧濃縮した。窒素気流下、反応物を乾燥ＴＨＦ４２０ｍｌに溶解して氷上で冷却し、テトラｔ−ブチルアンモニウムヨウ素３０ｇ（８１ｍｍｏｌ）を加え、更に６０％水酸化ナトリウム水溶液４０ｇ（１Ｍ）を少しずつ加え、スラリーを得た。１５℃でベンジルブロミド１４０ｇ（８２０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で２〜３日反応させた後、減圧濃縮した。さらにジクロロメタンを加え、ジクロロメタン溶液を氷水に加え、攪拌し、分層し、水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、４：１）にて精製して、目的物（メチル ３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントサイド）１１８ｇを得た。
（２）工程３
（１）で得られたメチル ３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントサイド１１８ｇ（０．３６ｍｏｌ）およびトルエンチオール２２４ｇ（１．８１ｍｏｌ）の混合液に、濃塩酸を少しずつ加えた。４０℃で終夜反応後、クロロホルムおよび水を加え、さらに炭酸ソーダを少しずつ加えた。分層し、水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、４：１）にて精製して、目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｄ−エリスロ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。本工程を数回繰り返した。
（１）で得られたメチル ３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントサイド１１８ｇ（０．３６ｍｏｌ）およびトルエンチオール２２４ｇ（１．８１ｍｏｌ）の混合液に、濃塩酸を少しずつ加えた。４０℃で終夜反応後、クロロホルムおよび水を加え、さらに炭酸ソーダを少しずつ加えた。分層し、水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、４：１）にて精製して、目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｄ−エリスロ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。本工程を数回繰り返した。
（３）工程４
（２）で得られた３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｄ−エリスロ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール１６５ｇ（０．３０３ｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ２．２Ｌに溶解し、トリフェニルホスフィン１１９ｇ（０．４５５ｍｏｌ）、安息香酸５５．５ｇ（０．４５５ｍｏｌ）を加え、反応液を攪拌しながら、ジエチルアゾジカルボキシレート７９．３ｇ（０．４５５ｍｏｌ）を含む２．２ｍｏｌ／Ｌトルエン溶液２０７ｍＬ／乾燥ＴＨＦ３９０ｍＬ溶液を２時間かけて滴下した。終夜室温で反応させた後、減圧濃縮した。室温で２日間静置した後、析出物を濾取し、濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、８５：１５）にて分離した。目的物を含むフラクションをヘキサン−酢酸エチル（１０：１）液でリスラリーして、目的物（４−Ｏ−ベンゾイル−３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。
（２）で得られた３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｄ−エリスロ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール１６５ｇ（０．３０３ｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ２．２Ｌに溶解し、トリフェニルホスフィン１１９ｇ（０．４５５ｍｏｌ）、安息香酸５５．５ｇ（０．４５５ｍｏｌ）を加え、反応液を攪拌しながら、ジエチルアゾジカルボキシレート７９．３ｇ（０．４５５ｍｏｌ）を含む２．２ｍｏｌ／Ｌトルエン溶液２０７ｍＬ／乾燥ＴＨＦ３９０ｍＬ溶液を２時間かけて滴下した。終夜室温で反応させた後、減圧濃縮した。室温で２日間静置した後、析出物を濾取し、濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、８５：１５）にて分離した。目的物を含むフラクションをヘキサン−酢酸エチル（１０：１）液でリスラリーして、目的物（４−Ｏ−ベンゾイル−３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。
（４）工程５
（３）で得られた４−Ｏ−ベンゾイル−３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール８０ｇ（１２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン４５０ｍＬに溶解し、氷で冷却しながらソジウムメチラート１０ｇ（１８５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１８０ｍＬ）を少しずつ加えた。さらに室温で２時間攪拌した。反応液を１．２Ｌの５％リン酸二水素ナトリウム水溶液に加えて分層させ、ジクロロメタンで抽出し、５％炭酸ソーダで洗浄し、水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。これをカラムでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、４：１）にて精製して、目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。
（３）で得られた４−Ｏ−ベンゾイル−３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール８０ｇ（１２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン４５０ｍＬに溶解し、氷で冷却しながらソジウムメチラート１０ｇ（１８５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１８０ｍＬ）を少しずつ加えた。さらに室温で２時間攪拌した。反応液を１．２Ｌの５％リン酸二水素ナトリウム水溶液に加えて分層させ、ジクロロメタンで抽出し、５％炭酸ソーダで洗浄し、水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。これをカラムでシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、４：１）にて精製して、目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。
（５）工程６
（４）で得られた３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール６９ｇ（１２６ｍｍｏｌ）をピリジン６９０ｍＬに溶解し、氷／食塩水で冷却した後、これをメタンスルホニルクロリド２１．８ｇ（１９０ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２００ｍＬ）に４０分かけて滴下した。次いで室温で終夜攪拌し、減圧濃縮した。さらに反応液をジクロロメタン６００ｍＬ／２規定ＨＣｌ ６００ｍＬで分配し、水洗し、重曹水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。少量の酢酸エチルで流動化し、ヘキサンを滴下して結晶化して目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−４−Ｏ−メタンスルホニル−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。
（４）で得られた３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール６９ｇ（１２６ｍｍｏｌ）をピリジン６９０ｍＬに溶解し、氷／食塩水で冷却した後、これをメタンスルホニルクロリド２１．８ｇ（１９０ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２００ｍＬ）に４０分かけて滴下した。次いで室温で終夜攪拌し、減圧濃縮した。さらに反応液をジクロロメタン６００ｍＬ／２規定ＨＣｌ ６００ｍＬで分配し、水洗し、重曹水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。少量の酢酸エチルで流動化し、ヘキサンを滴下して結晶化して目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−４−Ｏ−メタンスルホニル−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール）を得た。
（６）工程７
２Ｌフラスコに（５）で得られた３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−４−Ｏ−メタンスルホニル−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール２８ｇ（６１ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム ９７ｇ、炭酸バリウム １９４ｇおよび乾燥ＤＭＦ １Ｌを加えて、１００℃で３時間反応させた。放冷した後ろ過し、濾液を減圧濃縮した。これに酢酸エチル２Ｌおよび水１Ｌを加えて攪拌し、分層し、有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。さらにこれをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、９：１）にて精製して、目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１，４−ジチオ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノサイド）を得た。
２Ｌフラスコに（５）で得られた３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−４−Ｏ−メタンスルホニル−Ｌ−スレオ−ペントース ジベンジル ジチオアセタール２８ｇ（６１ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム ９７ｇ、炭酸バリウム １９４ｇおよび乾燥ＤＭＦ １Ｌを加えて、１００℃で３時間反応させた。放冷した後ろ過し、濾液を減圧濃縮した。これに酢酸エチル２Ｌおよび水１Ｌを加えて攪拌し、分層し、有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。さらにこれをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、９：１）にて精製して、目的物（３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１，４−ジチオ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノサイド）を得た。
（７）工程８および９
５−ブロモウラシル６．６ｇ（３５ｍｍｏｌ）／乾燥アセトニトリルのスラリーに、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド１５ｍＬ（６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。さらに窒素気流下において、モレキュラーシーブ４Ａ １５ｇを加えた。続いて（６）で得た３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１，４−ジチオ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノサイド１５ｇ（３４．４ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル溶液（オレンジ色スラリー）１００ｍＬを加え、さらにＮ−ヨードスクシンイミド７．７ｇの乾燥アセトニトリル溶液１００ｍＬを加えて溶液が黒くなることを確認した。室温で終夜攪拌した後、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を１００ｍＬ加えて過剰のヨウ素を脱色した。反応液をろ過し、濾液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶解し、重曹水で洗浄した。さらにこれを水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、酢酸エチル濃度０〜５０％のグラジエント溶出）にて精製して、３’，５’−ジ−Ｏ−ベンジル−５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンのβ体を得た。
５−ブロモウラシル６．６ｇ（３５ｍｍｏｌ）／乾燥アセトニトリルのスラリーに、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド１５ｍＬ（６８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。さらに窒素気流下において、モレキュラーシーブ４Ａ １５ｇを加えた。続いて（６）で得た３，５−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１，４−ジチオ−α，β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノサイド１５ｇ（３４．４ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル溶液（オレンジ色スラリー）１００ｍＬを加え、さらにＮ−ヨードスクシンイミド７．７ｇの乾燥アセトニトリル溶液１００ｍＬを加えて溶液が黒くなることを確認した。室温で終夜攪拌した後、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を１００ｍＬ加えて過剰のヨウ素を脱色した。反応液をろ過し、濾液を減圧濃縮し、残渣をジクロロメタンに溶解し、重曹水で洗浄した。さらにこれを水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、酢酸エチル濃度０〜５０％のグラジエント溶出）にて精製して、３’，５’−ジ−Ｏ−ベンジル−５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンのβ体を得た。
（８）工程１０
（７）で得られた３’，５’−ジ−Ｏ−ベンジル−５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン８．９ｇ（１７．７ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン６５ｍＬに溶解し、これに四塩化チタン５．６２ｍＬと乾燥トルエン２３ｍＬを２０分かけて滴下した。反応液を９０分間室温で攪拌した後、冷却し、メチルエチルケトン６２ｍＬを滴下した。反応液に、クエン酸水溶液を滴下し、不溶物を濾過し、メチルエチルケトンで洗浄した。さらに濾液を分層し、水層に２８％アンモニア水２５ｍＬを加えて中和し、メチルエチルケトンで抽出した。抽出物をメタノールで洗浄して、目的物（５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン）を得た。これを以下の実施例および実験例における非放射性ＢＴｄＵとして用いた。
（７）で得られた３’，５’−ジ−Ｏ−ベンジル−５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン８．９ｇ（１７．７ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン６５ｍＬに溶解し、これに四塩化チタン５．６２ｍＬと乾燥トルエン２３ｍＬを２０分かけて滴下した。反応液を９０分間室温で攪拌した後、冷却し、メチルエチルケトン６２ｍＬを滴下した。反応液に、クエン酸水溶液を滴下し、不溶物を濾過し、メチルエチルケトンで洗浄した。さらに濾液を分層し、水層に２８％アンモニア水２５ｍＬを加えて中和し、メチルエチルケトンで抽出した。抽出物をメタノールで洗浄して、目的物（５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン）を得た。これを以下の実施例および実験例における非放射性ＢＴｄＵとして用いた。
（９）工程１１
窒素気流下、（８）で得られた５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン０．８ｇ（２．４８ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（８０ｍＬ）に６０℃で溶解し、放冷した後、ビス（トリブチルチン）２．８ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）０．３２ｇを加えて、９５℃で終夜還流させた。ジオキサンを減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール、６：１）で分離して目的物（５−トリブチルスズ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン）を得た。
窒素気流下、（８）で得られた５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン０．８ｇ（２．４８ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（８０ｍＬ）に６０℃で溶解し、放冷した後、ビス（トリブチルチン）２．８ｍＬ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）０．３２ｇを加えて、９５℃で終夜還流させた。ジオキサンを減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール、６：１）で分離して目的物（５−トリブチルスズ−４’−チオ−２’−デオキシウリジン）を得た。
実施例１： ７７ Ｂｒ−ＢＴｄＵの製造
７７Ｂｒは、高エネルギー医学研究センターの医療用小型サイクロトロンを用いて６３Ｃｕ２ ７７Ｓｅディスクターゲットにプロトンを照射し、７７Ｓｅ（ｐ，ｎ）７７Ｂｒ反応を行うことで製造した。そして、該ディスクターゲットをＡｒガス（３０ｍｌ／ｍｉｎ）気流下、１０７０℃で９０分間加熱し、冷却後、超純水を用いて７７Ｂｒの抽出を行った。
次に７７Ｂｒ水を、バイアル中、窒素雰囲気下、１２０℃で加熱して水を蒸発させ、ここに合成例１で得られた５−トリブチルスズ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンのメタノール溶液（４ｍｇ／ｍｌ、２５μｌ）およびクロラミンＴの酢酸溶液（４ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）を加え、酢酸でｐＨを４．５に調整し、７０℃で１時間反応させた。反応液に飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１０μｌ）を加えて反応を停止し、さらに水２００μｌを加えた。７７Ｂｒ−ＢＴｄＵが合成されたことは、ＨＰＬＣ（Ｔ−Ｆｌｏｗ：１，Ｐ−Ｍａｘ：２００，ＵＶ：２５４，Ｏｖｅｎ：４０℃，カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ ４．６×１５０，移動相−アセトニトリル（トリフルオロ酢酸０．１％）：水（トリフルオロ酢酸０．１％）＝１：９）、ＴＬＣ（溶媒−クロロホルム：メタノール＝８：２、酢酸エチル）で確認し、その結果を合成例１で得られた非放射性ＢＴｄＵの結果と比較・検討することで評価した。
７７Ｂｒは、高エネルギー医学研究センターの医療用小型サイクロトロンを用いて６３Ｃｕ２ ７７Ｓｅディスクターゲットにプロトンを照射し、７７Ｓｅ（ｐ，ｎ）７７Ｂｒ反応を行うことで製造した。そして、該ディスクターゲットをＡｒガス（３０ｍｌ／ｍｉｎ）気流下、１０７０℃で９０分間加熱し、冷却後、超純水を用いて７７Ｂｒの抽出を行った。
次に７７Ｂｒ水を、バイアル中、窒素雰囲気下、１２０℃で加熱して水を蒸発させ、ここに合成例１で得られた５−トリブチルスズ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンのメタノール溶液（４ｍｇ／ｍｌ、２５μｌ）およびクロラミンＴの酢酸溶液（４ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）を加え、酢酸でｐＨを４．５に調整し、７０℃で１時間反応させた。反応液に飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１０μｌ）を加えて反応を停止し、さらに水２００μｌを加えた。７７Ｂｒ−ＢＴｄＵが合成されたことは、ＨＰＬＣ（Ｔ−Ｆｌｏｗ：１，Ｐ−Ｍａｘ：２００，ＵＶ：２５４，Ｏｖｅｎ：４０℃，カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ ４．６×１５０，移動相−アセトニトリル（トリフルオロ酢酸０．１％）：水（トリフルオロ酢酸０．１％）＝１：９）、ＴＬＣ（溶媒−クロロホルム：メタノール＝８：２、酢酸エチル）で確認し、その結果を合成例１で得られた非放射性ＢＴｄＵの結果と比較・検討することで評価した。
実験例１：細胞への取り込み実験
マウス肺癌細胞であるＬＬ／２細胞株、マウス線維芽細胞であるＬ−Ｍ細胞株、Ｌ−Ｍのチミジンキナーゼ（ＴＫ）が欠損しているＬ−Ｍ ＴＫ（−）細胞株を使用した。細胞の増殖速度はＬＬ／２が最も速く、Ｌ−ＭとＬ−Ｍ ＴＫ（−）はＬＬ／２よりも遅かった。実験の２４時間前に、各細胞を２４穴培養プレートに２×１０５個播種し、培地を交換後３０分間３７℃でインキュベートした。その後７７Ｂｒ−ＢＴｄＵまたは７７Ｂｒ入りの培地に交換し、一定時間インキュベートした後、ＰＢＳを用いて洗浄し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムにて細胞を溶解した。ガンマカウンターを用いて溶解した細胞の放射能を計測した後、タンパク定量を行って細胞への取り込み量を補正した。
その結果、ＬＬ−２への取り込み量が最も多く、次にＬ−Ｍへの取り込み量が多く、Ｌ−Ｍ ＴＫ（−）においてはほとんど取り込みがないことが確認できた（図１Ａ）。また７７Ｂｒ単独では細胞への取り込みは認められなかった（図１Ｂ）。したがって、細胞への取り込みは７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの機能であり、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵは細胞の増殖速度に応じて細胞内に取り込まれることが示唆された。さらに、その取り込みにはＴＫが必要であることも示唆された。
マウス肺癌細胞であるＬＬ／２細胞株、マウス線維芽細胞であるＬ−Ｍ細胞株、Ｌ−Ｍのチミジンキナーゼ（ＴＫ）が欠損しているＬ−Ｍ ＴＫ（−）細胞株を使用した。細胞の増殖速度はＬＬ／２が最も速く、Ｌ−ＭとＬ−Ｍ ＴＫ（−）はＬＬ／２よりも遅かった。実験の２４時間前に、各細胞を２４穴培養プレートに２×１０５個播種し、培地を交換後３０分間３７℃でインキュベートした。その後７７Ｂｒ−ＢＴｄＵまたは７７Ｂｒ入りの培地に交換し、一定時間インキュベートした後、ＰＢＳを用いて洗浄し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムにて細胞を溶解した。ガンマカウンターを用いて溶解した細胞の放射能を計測した後、タンパク定量を行って細胞への取り込み量を補正した。
その結果、ＬＬ−２への取り込み量が最も多く、次にＬ−Ｍへの取り込み量が多く、Ｌ−Ｍ ＴＫ（−）においてはほとんど取り込みがないことが確認できた（図１Ａ）。また７７Ｂｒ単独では細胞への取り込みは認められなかった（図１Ｂ）。したがって、細胞への取り込みは７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの機能であり、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵは細胞の増殖速度に応じて細胞内に取り込まれることが示唆された。さらに、その取り込みにはＴＫが必要であることも示唆された。
実験例２：細胞における局在
Ｌ−ＭとＬ−Ｍ ＴＫ（−）を用いて、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵが細胞内でどのように分布しているかの比較を行った。実験２４時間前に、各細胞を１０ｃｍ培養ディッシュにそれぞれ６×１０６個ずつ播種し、培養した。その後７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ入りの培地に交換し、３７℃で一定時間インキュベートした。その後、酸可溶性画分（ＡＳＦ）、ＲＮＡ画分、ＤＮＡ画分、タンパクおよび脂質画分をそれぞれ採取し、ガンマカウンターを用いて放射能を計測し、タンパク定量で取り込み量の補正を行った。
Ｌ−Ｍでは、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ添加後１２０分以降の時間帯で、９０％以上がＤＮＡ画分に存在していることを確認した（図２）。一方、Ｌ−Ｍ ＴＫ（−）ではＤＮＡ画分への取り込みが少ないことが確認できた。
以上の結果から、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵはＴＫを介してＤＮＡに組み込まれていることが示唆された。
Ｌ−ＭとＬ−Ｍ ＴＫ（−）を用いて、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵが細胞内でどのように分布しているかの比較を行った。実験２４時間前に、各細胞を１０ｃｍ培養ディッシュにそれぞれ６×１０６個ずつ播種し、培養した。その後７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ入りの培地に交換し、３７℃で一定時間インキュベートした。その後、酸可溶性画分（ＡＳＦ）、ＲＮＡ画分、ＤＮＡ画分、タンパクおよび脂質画分をそれぞれ採取し、ガンマカウンターを用いて放射能を計測し、タンパク定量で取り込み量の補正を行った。
Ｌ−Ｍでは、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ添加後１２０分以降の時間帯で、９０％以上がＤＮＡ画分に存在していることを確認した（図２）。一方、Ｌ−Ｍ ＴＫ（−）ではＤＮＡ画分への取り込みが少ないことが確認できた。
以上の結果から、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵはＴＫを介してＤＮＡに組み込まれていることが示唆された。
実験例３：正常マウスにおける取り込み
ｄｄｙ系雄性マウス（６週齢）に７７Ｂｒ−ＢＴｄＵを尾静脈より投与し、一定時間後、解剖し各臓器を摘出した。その後、各臓器の重量測定し、ガンマカウンターを用いて放射能を計測した。取り込み量の比較には％ＩＤ／ｇを用いた。
脾臓や小腸などの細胞増殖が活発である臓器での７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの取り込みが多いことが確認できた。逆に脳、肝臓、筋肉などの細胞増殖が活発でない臓器での取り込みは少ないことが確認できた（図３）。これらの結果から、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵは、細胞増殖の活発な臓器への取り込みが多いことが示された。
ｄｄｙ系雄性マウス（６週齢）に７７Ｂｒ−ＢＴｄＵを尾静脈より投与し、一定時間後、解剖し各臓器を摘出した。その後、各臓器の重量測定し、ガンマカウンターを用いて放射能を計測した。取り込み量の比較には％ＩＤ／ｇを用いた。
脾臓や小腸などの細胞増殖が活発である臓器での７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの取り込みが多いことが確認できた。逆に脳、肝臓、筋肉などの細胞増殖が活発でない臓器での取り込みは少ないことが確認できた（図３）。これらの結果から、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵは、細胞増殖の活発な臓器への取り込みが多いことが示された。
実験例４：腫瘍移植モデルマウスにおける取り込み
ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６週齢）の右肩にＬ−Ｍ、左肩にＬ−Ｍ ＴＫ（−）をそれぞれ１×１０６個移植し１０日間飼育した。その後、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵを尾静脈より投与し、一定時間後各臓器を取り出した。放射能の計測にはガンマカウンターを使用し、正常マウスの実験と同様に、％ＩＤ／ｇで取り込み量を比較した。
各臓器での取り込み量は正常マウスでの取り込み量と大きな変化はなかったが、腫瘍における取り込み量が、２４時間後において他臓器と比較して最も多いことが確認できた。Ｌ−Ｍの取り込み量は、Ｌ−Ｍ ＴＫ（−）の取り込み量の２倍〜５倍であった（図４Ａ）。また腫瘍周辺の筋肉と腫瘍とを比較すると、Ｌ−Ｍにおいて１０倍〜２０倍取り込み量が多いということが確認できた（図４Ｂ）。これらの結果から、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵは、腫瘍への取り込みが多いことが示された。
ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（６週齢）の右肩にＬ−Ｍ、左肩にＬ−Ｍ ＴＫ（−）をそれぞれ１×１０６個移植し１０日間飼育した。その後、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵを尾静脈より投与し、一定時間後各臓器を取り出した。放射能の計測にはガンマカウンターを使用し、正常マウスの実験と同様に、％ＩＤ／ｇで取り込み量を比較した。
各臓器での取り込み量は正常マウスでの取り込み量と大きな変化はなかったが、腫瘍における取り込み量が、２４時間後において他臓器と比較して最も多いことが確認できた。Ｌ−Ｍの取り込み量は、Ｌ−Ｍ ＴＫ（−）の取り込み量の２倍〜５倍であった（図４Ａ）。また腫瘍周辺の筋肉と腫瘍とを比較すると、Ｌ−Ｍにおいて１０倍〜２０倍取り込み量が多いということが確認できた（図４Ｂ）。これらの結果から、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵは、腫瘍への取り込みが多いことが示された。
実験例５：内照射治療効果の検討
ＬＬ／２を２４穴培養プレートに１×１０４個／ｗｅｌｌで播種し、治療群では、様々な放射線量（７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ量）の７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ入りの培地で２４〜４８時間培養し、非放射性の培地で更に２４時間培養した。コントロール群に関しては、全て非放射性の培地で培養した。培養後、トリパンブルー染色液を用いて死滅した細胞を染色し、細胞数の計測を行って７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの治療効果を検討した。
その結果、治療群において細胞増殖を有意に抑制できていることが確認できた。また治療群における細胞数は、放射能量依存的に減少した（図５）。さらに、治療群の細胞を観察すると巨大化しており形態に変化がおきていることを認めた。
ＬＬ／２を２４穴培養プレートに１×１０４個／ｗｅｌｌで播種し、治療群では、様々な放射線量（７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ量）の７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ入りの培地で２４〜４８時間培養し、非放射性の培地で更に２４時間培養した。コントロール群に関しては、全て非放射性の培地で培養した。培養後、トリパンブルー染色液を用いて死滅した細胞を染色し、細胞数の計測を行って７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの治療効果を検討した。
その結果、治療群において細胞増殖を有意に抑制できていることが確認できた。また治療群における細胞数は、放射能量依存的に減少した（図５）。さらに、治療群の細胞を観察すると巨大化しており形態に変化がおきていることを認めた。
実験例６：内照射治療効果のメカニズム
ＬＬ／２細胞を９６穴培養プレートに１×１０４個／ｗｅｌｌで播腫し、２４時間培養した。各濃度の７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ入り培地に入れ替え４８時間培養した（コントロールは放射能の入っていない通常の培地で培養した）。
ＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ Ｔｒｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＶｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ試薬を２０μｌずつ加え、オービタルシェイカーを用いて混合（３００−５００ｒｐｍ、３０秒）し、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて蛍光を測定した（４００Ｅｘ／５０５Ｅｍ（細胞生存性）；４８５Ｅｘ／５２０Ｅｍ（細胞毒性））。
また、ＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ Ｔｒｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７試薬を１００μｌずつ加え、オービタルシェイカーを用いて混合（３００−５００ｒｐｍ、３０秒）し、さらに室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５を用いて発光を測定した。細胞生存性の結果を図６Ａ、細胞毒性の結果を図６Ｂ、アポトーシスの結果を図６Ｃに示す。
その結果、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの放射能量増加とともに細胞生存性が減少し、細胞毒性とアポトーシスの増加が認められた。これにより７７Ｂｒ−ＢＴｄＵはアポトーシスを誘発していることが確認できた。また、いずれのアッセイでも１８５０Ｂｑ／ｗｅｌｌ以降で有意差がみられた。
ＬＬ／２細胞を９６穴培養プレートに１×１０４個／ｗｅｌｌで播腫し、２４時間培養した。各濃度の７７Ｂｒ−ＢＴｄＵ入り培地に入れ替え４８時間培養した（コントロールは放射能の入っていない通常の培地で培養した）。
ＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ Ｔｒｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＶｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ試薬を２０μｌずつ加え、オービタルシェイカーを用いて混合（３００−５００ｒｐｍ、３０秒）し、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて蛍光を測定した（４００Ｅｘ／５０５Ｅｍ（細胞生存性）；４８５Ｅｘ／５２０Ｅｍ（細胞毒性））。
また、ＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ Ｔｒｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７試薬を１００μｌずつ加え、オービタルシェイカーを用いて混合（３００−５００ｒｐｍ、３０秒）し、さらに室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５を用いて発光を測定した。細胞生存性の結果を図６Ａ、細胞毒性の結果を図６Ｂ、アポトーシスの結果を図６Ｃに示す。
その結果、７７Ｂｒ−ＢＴｄＵの放射能量増加とともに細胞生存性が減少し、細胞毒性とアポトーシスの増加が認められた。これにより７７Ｂｒ−ＢＴｄＵはアポトーシスを誘発していることが確認できた。また、いずれのアッセイでも１８５０Ｂｑ／ｗｅｌｌ以降で有意差がみられた。
本発明の細胞増殖抑制剤、あるいはアポトーシス誘導剤は、周辺の正常細胞に影響を与えることなく、増殖速度の速い異常細胞に対して選択的かつ効果的に作用する。したがって本発明によって、新たな細胞増殖抑制剤、あるいはアポトーシス誘導剤が提供される。
またこれらの剤は、細胞増殖性の疾患に対する治療薬としても用いることが可能である。
またこれらの剤は、細胞増殖性の疾患に対する治療薬としても用いることが可能である。
また本発明により、細胞増殖性の疾患に対する新規かつ極めて有用な内照射治療薬が提供される。これまでの内照射治療では、半減期６０日という長い半減期の１２５Ｉが主流であり、副作用が判明した際の対処が著しく遅れるといった問題点が考えられる。しかしながら本発明の内照射治療薬は、半減期５７時間の７７Ｂｒを利用しているので、仮に副作用が発生しても、次の薬剤投与を行わないという選択が可能となり、臨床的に有利である。このことによって、手術による摘出の難しい癌への新しい治療戦略を提供できると考えられる。
あるいは本発明により、腫瘍のＤＮＡ合成能を評価することが可能となる。ＤＮＡ合成能を直接評価可能となれば、１８Ｆ−ＦＬＴでは正確な評価が出来なかった、抗癌剤あるいは放射線治療時の、ＤＮＡ合成は抑制されるがチミジンキナーゼ１の活性は維持されるような増殖能の評価が難しい状態であっても、腫瘍の評価が可能となる。このことは、腫瘍増殖能の正確な評価が可能であることを示しており、抗癌剤治療が分子標的薬に移行していることを鑑みると、本発明は癌の治療方法を正しく選択することに大きく貢献すると考えられる。
さらに本発明の治療薬は、治療薬自体が放射性臭素で標識されているので、それ自体を核種とした画像診断を行うことも可能である。
Claims (3)
- 放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンまたは式（Ｉ）で表される化合物を含んでなる、アポトーシス誘導剤であって、放射性臭素が、 ７７ Ｂｒであるアポトーシス誘導剤：
（式中、Ｒ １ は水素又はＣ １−６ アルキル基を示し、Ｒ ２ およびＲ ３ は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシルまたはハロゲン置換基、 ＊ Ｂｒは ７７ Ｂｒを示す）。 - 放射性臭素標識５−ブロモ−４’−チオ−２’−デオキシウリジンまたは式（Ｉ）で表される化合物、ならびに医薬的に許容し得る担体を含んでなる、細胞増殖性疾患の内照射治療薬であって、放射性臭素が、 ７７ Ｂｒである内照射治療薬：
（式中、Ｒ １ は水素又はＣ １−６ アルキル基を示し、Ｒ ２ およびＲ ３ は、それぞれ独立して水素、ヒドロキシルまたはハロゲン置換基、 ＊ Ｂｒは ７７ Ｂｒを示す）。 - 細胞増殖性疾患が、癌である、請求項２に記載の治療薬。
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