JP5771626B2 - 鼻内送達のための方法および組成物 - Google Patents

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本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2010年4月15日に提出された米国特許仮出願第61/324,542号の恩典を主張する。

液体として調合されたインフルエンザワクチンは、化学分解、たとえば凝集、変性、加水分解、および酸化を受けて、それによってワクチンの不活化が起こりうる。液体ワクチン製剤はまた、温度に対しても感受性でありうる：高温は、不活化を増加させうるが、凍結温度ではワクチン中の抗原に損傷を与えることができる氷を生じうる。このように、不活化を防止するために、液体ワクチンはしばしば、2から8℃の温度範囲で貯蔵および流通される。そのような貯蔵は、ワクチンの長期間の貯蔵および輸送の双方にとってコストが高く、使用期限によるワクチンの損失という点から見ても費用がかかりうる。室温で安定であるワクチンが生成されれば、貯蔵の観点から節約が得られ、備蓄を容易にするであろう。乾燥粉末ワクチンなどの、室温で安定であるワクチン製剤を生成する手段が必要である。

ワクチンのフリーズドライに関するいくつかの方法が記述されている。たとえば、インフルエンザワクチン溶液の凍結乾燥（フリーズドライ）を用いてワクチン粉末を生成することができる。しかし、この方法によって産生されたインフルエンザワクチン粉末は、ハードケーキでありえて、これでは一貫して信頼できる投与が容易とならない。インフルエンザワクチン溶液のスプレーフリーズドライ（SFD）は、インフルエンザワクチン粉末の微粒子を提供することができる；しかし、SFDはコストの高い方法である。このように、比較的高い流動性および比較的低い吸湿性を有する微粉ワクチンを生成するコストの低い方法が必要である。

ワクチンの投与様式はその効能に役割を果たしうる。1つの投与様式である非経口投与（たとえば、経鼻投与）は、粘膜および全身性の液性および細胞性免疫応答を誘導および促進することができる。粘膜ワクチン接種によって、呼吸器および口腔咽頭領域において分泌型IgA（sIgA）応答の誘導が起こりうる。粘膜sIgA抗体の1つの特色は、それらが抗原的に異なるウイルスに対して交叉防御を提供できる点である；このように、粘膜sIgA応答は、ワクチンの生成に用いられる株から変異しているウイルス株に対する防御を提供する可能性を有する（たとえば、インフルエンザウイルスH1N1はH2N1またはH1N2へと変異することができる）。さらに、sIgAは、粘膜表面でウイルスまたは他の病原体に結合するのを助けることができ、より深部の組織への病原体のアクセスを防止して、および／または進行感染症に至る可能性を減少させることができる。本明細書において、sIgA誘導ワクチン、たとえば非経口投与のための粉末ワクチン製剤を生成するための新規方法を記述する。

本明細書において、以下を含む乾燥ワクチン粉末製剤が開示される：1つまたは複数の抗原、1つまたは複数の糖類、1つまたは複数の緩衝剤；および微結晶性セルロース。本明細書において記述されるワクチン粉末製剤中の抗原は、ウイルス抗原でありうる。ウイルス抗原は、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス(whole inactivated virus)、不活化スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスでありうる。ウイルス抗原は、インフルエンザウイルスでありえて、たとえば抗原は、H1N1、またはH5N1、またはH1N1、H3N2、およびB型インフルエンザの混合物でありうる。本明細書において記述されるワクチン粉末製剤中の抗原は、細菌抗原でありうる。細菌抗原は、全菌体死菌、弱毒化細菌、トキソイド、精製表面タンパク質、または精製組み換え型表面タンパク質でありうる。細菌抗原は、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドでありうる。乾燥ワクチン粉末製剤中の抗原はまた、原生生物でありうる。抗原はまたタンパク質でありうる。用いられる糖類は、トレハロース、マンニトール、またはラクトースでありうる。用いられる糖類は、トレハロースでありうる。用いられる緩衝剤は、リン酸緩衝液でありうる。本明細書において記述されるワクチン粉末製剤は、室温および相対湿度60％で少なくとも12ヶ月間安定でありうる。

本明細書において、以下を含む乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法も同様に提供される：抗原を含む液体製剤を調製する段階；噴霧凍結を含まない、液体製剤を急速に凍結する段階；フリーズドライした試料を1つまたは複数の賦形剤と混和して、乾燥ワクチン粉末製剤を生成する段階。ウイルス抗原は、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス、不活化スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスでありうる。ウイルス抗原は、インフルエンザウイルスでありうる；たとえば、抗原は、H1N1、またはH5N1、またはH1N1、H3N2、およびB型インフルエンザの混合物でありうる。本明細書において記述されるワクチン粉末製剤中の抗原は、細菌抗原でありうる。細菌抗原は、全菌体死菌、弱毒化細菌、トキソイド、精製表面タンパク質、または精製組み換え型表面タンパク質でありうる。細菌抗原は、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドでありうる。乾燥ワクチン粉末製剤中の抗原はまた、原生生物でありうる。抗原はまたタンパク質でありうる。液体製剤の調製は、糖類、たとえばトレハロース、マンニトール、またはラクトースの添加を含みうる。液体製剤の調製はまた、リン酸緩衝液などの緩衝剤の添加を含みうる。粉末は、微粒子を含みうる。粉末は、室温および相対湿度60％で少なくとも12ヶ月間安定でありうる。本明細書において記述される方法において有用な賦形剤は、微結晶性セルロースおよび第三リン酸カルシウムなどの1つまたは複数の経鼻担体を含みうる。賦形剤は、粉末の流動性を改善するおよび／または粉末の吸湿性を低減することができる。本明細書の方法によって産生されるいくつかのワクチン粉末は、アジュバントを含まない。急速に凍結する段階は、液体窒素の使用を含みうる。

本明細書において提供されるもう1つの方法は、乾燥ワクチン粉末製剤を対象に投与する段階を含む、対象において抗原に対するsIgA応答を刺激する方法であって、乾燥粉末製剤が抗原を含み、乾燥粉末製剤が、液体ワクチン製剤を急速に凍結することによって生成され、急速に凍結する段階が噴霧凍結を含まない方法である。いくつかの例において、IgG応答もまた刺激される。sIgA産生は、投与部位および／または投与部位以外の粘膜部位で刺激されうる。投与は、鼻内でありうる。本明細書において記述されるワクチン粉末製剤中の抗原は、ウイルス抗原でありうる。ウイルス抗原は、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス、不活化スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスでありうる。ウイルス抗原はインフルエンザウイルスでありうる；たとえば抗原は、H1N1、またはH5N1、またはH1N1、H3N2、およびB型インフルエンザの混合物でありうる。本明細書において記述されるワクチン粉末製剤中の抗原は、細菌抗原でありうる。細菌抗原は、全菌体死菌、弱毒化細菌、トキソイド、精製表面タンパク質、または精製組み換え型表面タンパク質でありうる。細菌抗原は、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドでありうる。乾燥ワクチン粉末製剤中の抗原はまた、原生生物でありうる。抗原はまたタンパク質でありうる。液体製剤の調製は、糖類、たとえばトレハロース、マンニトール、またはラクトースの添加を含みうる。液体製剤の調製はまた、リン酸緩衝液などの緩衝剤の添加を含みうる。粉末は微粒子を含みうる。粉末は、室温および相対湿度60％で少なくとも12ヶ月間安定でありうる。本明細書において記述される方法において有用な賦形剤は、微結晶性セルロースおよび第三リン酸カルシウムなどの1つまたは複数の経鼻担体を含みうる。賦形剤は、粉末の流動性を改善する、および／または粉末の吸湿性を低減させることができる。

同様に本明細書において、本明細書において開示されるワクチン粉末製剤を投与するための装置が提供される。そのような装置は、1回使用のために構成されうる。
[本発明1001]
以下を含む乾燥ワクチン粉末製剤：
a．1つまたは複数の抗原；
b．1つまたは複数の糖類；および
c．微結晶性セルロース。
[本発明1002]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがウイルス抗原である、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1003]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがインフルエンザウイルス抗原である、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1004]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス(whole inactivated virus)、スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1005]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが不活性全ウイルスである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1006]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが不活性スプリットウイルスである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1007]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがH1N1インフルエンザウイルスである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1008]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、H5N1インフルエンザウイルスである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1009]
1つまたは複数の抗原が、H1N1インフルエンザウイルス、H3N2インフルエンザウイルス、およびB型インフルエンザウイルスを含む、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1010]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが細菌抗原である、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1011]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、全菌体死菌、弱毒化細菌、トキソイド、精製表面タンパク質、または精製組み換え型表面タンパク質である、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1012]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、破傷風トキソイドである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1013]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、ジフテリアトキソイドである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1014]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、原生生物抗原である、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1015]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、タンパク質である、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1016]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つが、トレハロース、マンニトール、またはラクトースである、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1017]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つが、トレハロースである、本発明1016の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1018]
微結晶性セルロースが、10μmから100μmの平均粒子直径を有する、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1019]
微結晶性セルロースが、1.3 m ² /gから20 m ² /gの比表面積を有する、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1020]
微結晶性セルロースが、0.1 g/cm ³ から1.0 g/cm ³ のかさ密度を有する、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1021]
1つまたは複数の緩衝剤をさらに含む、本発明1001の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1022]
1つまたは複数の緩衝剤の少なくとも1つが、リン酸緩衝剤である、本発明1021の乾燥ワクチン粉末製剤。
[本発明1023]
室温および相対湿度60％で少なくとも12ヶ月間安定である、本発明1001のワクチン粉末製剤。
[本発明1024]
以下の段階を含む、乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法：
a．1つまたは複数の抗原を含む液体製剤を調製する段階；
b．液体製剤を急速凍結する段階であって、噴霧凍結することを含まない、段階；
c．フリーズドライした試料を1つまたは複数の賦形剤と混和して、乾燥ワクチン粉末製剤を生成する段階。
[本発明1025]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがウイルス抗原である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがインフルエンザウイルスである、本発明1024の方法。
[本発明1027]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、H1N1インフルエンザウイルスである、本発明1024の方法。
[本発明1028]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、H5N1インフルエンザウイルスである、本発明1024の方法。
[本発明1029]
1つまたは複数の抗原が、H1N1インフルエンザウイルス、H3N2インフルエンザウイルス、およびB型インフルエンザウイルスを含む、本発明1024の方法。
[本発明1030]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス、スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスである、本発明1024の方法。
[本発明1031]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが細菌抗原である、本発明1024の方法。
[本発明1032]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、全菌体死菌、弱毒化細菌、トキソイド、精製表面タンパク質、または精製組み換え型表面タンパク質である、本発明1024の方法。
[本発明1033]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、破傷風トキソイドである、本発明1024の方法。
[本発明1034]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、ジフテリアトキソイドである、本発明1024の方法。
[本発明1035]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、原生生物抗原である、本発明1024の方法。
[本発明1036]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、タンパク質である、本発明1024の方法。
[本発明1037]
液体製剤を調製する段階が、1つまたは複数の糖類の添加をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1038]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがラクトースである、本発明1037の方法。
[本発明1039]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがトレハロースである、本発明1037の方法。
[本発明1040]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがマンニトールである、本発明1037の方法。
[本発明1041]
液体製剤を調製する段階が、1つまたは複数の緩衝剤の添加をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1042]
1つまたは複数の緩衝剤の少なくとも1つが、リン酸緩衝剤である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
粉末が10μmから100μmの平均粒子直径を有する、本発明1024の方法。
[本発明1044]
粉末が室温および相対湿度60％で少なくとも12ヶ月間安定である、本発明1024の方法。
[本発明1045]
1つまたは複数の賦形剤が1つまたは複数の経鼻担体を含む、本発明1024の方法。
[本発明1046]
1つまたは複数の経鼻担体が、微結晶性セルロースまたは第三リン酸カルシウム（TCP）を含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
経鼻担体が10μmから100μmの平均粒子直径を有する、本発明1046の方法。
[本発明1048]
経鼻担体が、1.3 m ² /gから20 m ² /gの比表面積を有する、本発明1046の方法。
[本発明1049]
経鼻担体が、0.1 g/cm ³ から1.0 g/cm ³ のかさ密度を有する、本発明1046の方法。
[本発明1050]
1つまたは複数の賦形剤が流動性を改善する、本発明1024の方法。
[本発明1051]
1つまたは複数の賦形剤が吸湿性を低減させる、本発明1024の方法。
[本発明1052]
ワクチン粉末製剤がアジュバントを含まない、本発明1024の方法。
[本発明1053]
急速凍結する段階が液体窒素を用いることを含む、本発明1024の方法。
[本発明1054]
乾燥ワクチン粉末製剤を対象に投与する段階を含む、対象において抗原に対するsIgA応答を刺激する方法であって、乾燥粉末製剤が1つまたは複数の抗原を含み、かつ乾燥粉末製剤が液体ワクチン製剤を急速凍結する段階によって生成され、急速凍結する段階が噴霧凍結することを含まない方法。
[本発明1055]
IgG応答も同様に刺激される、本発明1054の方法。
[本発明1056]
ワクチン乾燥粉末製剤が、投与部位以外の粘膜部位でsIgA産生を誘導することができる、本発明1054の方法。
[本発明1057]
投与が鼻内投与である、本発明1054の方法。
[本発明1058]
ワクチン粉末製剤がアジュバントを含まない、本発明1054の方法。
[本発明1059]
急速凍結する段階が、液体窒素を用いることを含む、本発明1054の方法。
[本発明1060]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがウイルス抗原である、本発明1054の方法。
[本発明1061]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス、スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスである、本発明1054の方法。
[本発明1062]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがインフルエンザウイルスである、本発明1054の方法。
[本発明1063]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがH1N1インフルエンザウイルスである、本発明1054の方法。
[本発明1064]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがH5N1インフルエンザウイルスである、本発明1054の方法。
[本発明1065]
1つまたは複数の抗原が、H1N1インフルエンザウイルス、H3N2インフルエンザウイルス、およびB型インフルエンザウイルスを含む、本発明1054の方法。
[本発明1066]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが細菌抗原である、本発明1054の方法。
[本発明1067]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、全菌体死菌、弱毒化細菌、トキソイド、精製表面タンパク質、または精製組み換え型表面タンパク質である、本発明1054の方法。
[本発明1068]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、破傷風トキソイドである、本発明1054の方法。
[本発明1069]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、ジフテリアトキソイドである、本発明1054の方法。
[本発明1070]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、原生生物抗原である、本発明1054の方法。
[本発明1071]
1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、タンパク質である、本発明1054の方法。
[本発明1072]
液体製剤が、1つまたは複数の糖類を含む、本発明1054の方法。
[本発明1073]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがラクトースである、本発明1072の方法。
[本発明1074]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがトレハロースである、本発明1072の方法。
[本発明1075]
1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがマンニトールである、本発明1072の方法。
[本発明1076]
液体製剤が1つまたは複数の緩衝剤を含む、本発明1054の方法。
[本発明1077]
1つまたは複数の緩衝剤の少なくとも1つがリン酸緩衝剤である、本発明1076の方法。
[本発明1078]
粉末が10μmから100μmの平均粒子直径を有する、本発明1054の方法。
[本発明1079]
粉末が室温および相対湿度60％で少なくとも12ヶ月間安定である、本発明1054の方法。
[本発明1080]
乾燥ワクチン粉末製剤が1つまたは複数の賦形剤を含む、本発明1054の方法。
[本発明1081]
1つまたは複数の賦形剤が1つまたは複数の経鼻担体を含む、本発明1080の方法。
[本発明1082]
1つまたは複数の経鼻担体が、微結晶性セルロース、または第三リン酸カルシウム（TCP）を含む、本発明1080の方法。
[本発明1083]
経鼻担体が、10μmから100μmの平均粒子直径を有する、本発明1082の方法。
[本発明1084]
経鼻担体が、1.3 m ² /gから20 m ² /gの比表面積を有する、本発明1082の方法。
[本発明1085]
経鼻担体が、0.1 g/cm ³ から1.0 g/cm ³ のかさ密度を有する、本発明1082の方法；1つまたは複数の賦形剤が流動性を改善する、本発明1078の方法。
[本発明1086]
1つまたは複数の賦形剤が吸湿性を低減させる、本発明1080の方法。
[本発明1087]
本発明1024の方法によって生成されるワクチン粉末製剤を含む、ワクチン粉末製剤を投与するための装置。
[本発明1088]
1回使用のために構成される、本発明1087の装置。

参照による組み入れ
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書において、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的および個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲において詳しく記載される。本発明の特色および当初のよりよい理解は、本発明の原理を利用する説明的な態様を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することにより得られるであろう。
トレハロース、マンニトール、およびラクトースと共に、従来のゆっくりとした凍結およびフリーズドライ処理を用いて生成されたインフルエンザワクチン粉末の特性を説明する。 液体窒素による急速凍結によって乾燥経鼻ワクチン粉末製剤を調製するためのプロセスを説明する。経鼻担体の添加の前および後での粉末の例示的な特性も同様に記述する。 提供される本発明の製造プロセスの態様を説明する。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤を試験するための試験計画を説明する。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した血清試料中で測定したHI力価の表である。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した鼻洗浄液試料中で測定したHI力価の表である。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgG抗体力価の表である。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した鼻洗浄液sIgA抗体力価の表である。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に測定したIgGおよびsIgA抗体力価をグラフにより説明する。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した血清および鼻洗浄液試料中で測定したHI力価の表である。 H1N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgGおよび鼻洗浄液sIgA抗体力価の表である。 H5N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤を試験するための試験計画を説明する。 H5N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgG抗体力価の表である。 H5N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した鼻洗浄液sIgA抗体力価の表である。 H5N1経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験の際に測定したIgGおよびsIgA抗体力価をグラフにより説明する。 破傷風トキソイド経鼻ワクチン粉末製剤を試験するための試験計画を説明する。 破傷風トキソイド経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgGの吸光度比の表である。 破傷風トキソイド経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgGの吸光度比をグラフにより説明する。 破傷風トキソイド経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定したIFNγレベルの表である。 ジフテリアトキソイド経鼻ワクチン粉末製剤を試験するための試験計画を説明する。 図17Aは、ジフテリアトキソイド経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgG抗体力価の表である。図17Bは、ジフテリアトキソイド経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgG抗体力価をグラフにより説明する。 ホモジナイズした卵白アルブミン経鼻ワクチン粉末製剤を試験するための試験計画を説明する。 ホモジナイズした卵白アルブミン経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgG抗体力価の表である。 ホモジナイズした卵白アルブミン経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した血清中IgG抗体力価をグラフにより説明する。 ホモジナイズした卵白アルブミン経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した鼻洗浄液sIgA抗体力価の表である。 ホモジナイズした卵白アルブミン経鼻ワクチン粉末製剤の試験の際に採取した試料中で測定した鼻洗浄液sIgA抗体力価をグラフにより説明する。

態様の説明
発明の詳細な説明
I．概要
室温から-40℃まで24時間かけて冷却するような、液体インフルエンザワクチン製剤の従来のフリーズドライプロセスでは、粒子特性が最適下となるか、または抗原性（たとえば、インフルエンザ赤血球凝集（HA））効力の喪失が起こりうる（図1）。たとえば、トレハロースを有する液体インフルエンザワクチン製剤を従来のフリーズドライプロセスに供すると、部分的にケーキ状の粉末を形成しうる（図1）。マンニトールを有する液体インフルエンザワクチン製剤を従来のフリーズドライプロセスに供すると、HA効力が低減されうる（図1）。ラクトースを有する液体インフルエンザワクチン製剤を従来のフリーズドライプロセスに供すると、部分的にケーキ状の粉末を形成して、HA効力が低減されうる（図1）。

本開示は、これまでのフリーズドライ法の限界を克服して、それによって高い流動性を有する高い効力の粉末ワクチンが得られる乾燥ワクチン粉末製剤を生成するための急速凍結段階を含む方法（たとえば、図2および3を参照されたい）を提供する。方法は、1つまたは複数の物質（たとえば、糖類および／または緩衝剤、たとえばリン酸緩衝液）と共に、病原体またはその成分（たとえば、不活化全インフルエンザウイルス）などの1つまたは複数の抗原を含有する液体製剤を生成するための段階を含みうる。液体ワクチン製剤をフリーズドライして（たとえば、液体窒素中での急速凍結を含む）、粉末（たとえば、ワクチン粉末）を生成することができる。粉末は微粒子を含みえて、室温で安定でありうる。抗原がインフルエンザウイルスである場合、粉末は、高いHA効力を有しうる（たとえば、少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）。フリーズドライ後、粉末を1つまたは複数の賦形剤（たとえば、経鼻担体および／または流動性物質）と混和して（たとえば、ボルテックスミキサーで撹拌することによって）、乾燥ワクチン粉末製剤を形成することができる。

本明細書において記述される乾燥ワクチン粉末製剤は、室温で安定でありうる。これは、室温では不安定であり、冷蔵条件での費用のかかる貯蔵および流通（たとえば、コールドチェーンでの流通）を必要としうる液体インフルエンザワクチンに対して進歩である。いくつかのワクチン調製物において、二糖類、たとえばトレハロースまたはラクトースを含有する液体製剤を調製する。そのような添加剤は一般的に、乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤のHA効力を維持させる。そのような成分糖類を用いることは公知であるが、本明細書において記述される方法は、これらの糖類成分を用いてハードケーキを形成しない乾燥ワクチン剤形を提供することができる。ハードケーキングは、緩衝剤および本明細書において記述される急速凍結技術を用いて回避することができる。次に、急速凍結および乾燥抗原調製物から産生された粉末を、経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および／または流動性物質（たとえば、第三リン酸カルシウム）などの1つまたは複数の賦形剤と共に混合することができる。本発明の製剤によって、室温および加速条件下で安定でありうる経鼻送達にとって適した乾燥粉末ワクチンを得ることができる。本明細書において提供される乾燥ワクチン粉末製剤は、経鼻送達装置からの完全で一貫した送達を与えることができ、それによってワクチンが向けられる抗原／病原体に対するレシピエントの免疫応答の刺激が起こりうる。

本明細書において提供される方法は、本明細書において提供される乾燥ワクチン粉末製剤の吸湿性の低減、および流動性の改善を可能にしうる。方法は、乾燥ワクチン粉末製剤の吸湿性を低減させて流動性を改善するために、粉末製剤に生理的に許容される物質（たとえば、微結晶性セルロース）の添加を含むことができる。

本明細書において提供される方法は、ワクチンの効能の改善を可能にしうる。方法は、局所免疫応答、たとえば粘膜免疫応答（たとえば、粘膜sIgAを伴う）を刺激することができる乾燥ワクチン粉末組成物を生成するための段階を含みうる。sIgAは、変異したインフルエンザウイルス（たとえば、乾燥ワクチン粉末製剤をパンデミックインフルエンザワクチンとして用いることができる）および／または遺伝的浮動を受けているウイルスに対する交叉防御を提供することができる。乾燥ワクチン粉末製剤、たとえば乾燥経鼻インフルエンザ粉末製剤は、遠位粘膜部位において防御を誘導することができる。たとえば、鼻粘膜に本開示のワクチンを導入すると、防御が起こりうる（たとえば、上気道、下気道、消化管、および膣におけるsIgA産生）。乾燥ワクチン粉末製剤は、全身性免疫応答を刺激することができる（たとえば、血清中IgGの産生）。乾燥ワクチン粉末組成物は、微結晶性セルロースを含みうる。いくつかの態様において、乾燥ワクチン粉末製剤は、アジュバントを含まない。

II．粉末製剤を生成するために用いるための液体製剤
乾燥ワクチン粉末製剤を生成するために、液体製剤を最初に生成することができる。液体製剤は、1つまたは複数の抗原（たとえば、1つまたは複数の病原体または病原体の成分）、1つまたは複数の糖類、1つまたは複数の緩衝剤、および1つまたは複数の他の成分を含みうる。典型的に、液体製剤を、急速凍結（たとえば、液体窒素中に浸すことによって）およびフリーズドライに供した後、乾燥ワクチン粉末製剤を産生する。

液体製剤の容積は、約0.1 mL、1.0 mL、10 mL、25 mL、50 mL、100 mL、250 mL、500 mL、1 L、10 L、50 L、100 L、250 L、500 L、または1000 Lでありうる。液体製剤の容積は、約0.1 mL、1.0 mL、10 mL、25 mL、50 mL、100 mL、250 mL、500 mL、1 L、10 L、50 L、100 L、250 L、500 L、または1000 Lより上でありうる。液体製剤の容積は、約0.01〜1 mL、約1〜10 mL、約10〜50 mL、約50〜100 mL、約1〜1000 mL、約100〜1000 mL、約1〜10 L、約10〜50 L、約50〜100 L、約100〜500 L、約100〜1000 L、または約1〜1000 Lでありうる。フリーズドライ後、産生された乾燥ワクチンの量は、約0.05 mgから500 mg、約0.0.05 mgから約1 mg、約1 mgから約100 mg、または約100 mgから約500 mgのあいだでありうる。

A．ウイルスワクチン成分
本明細書において記述される乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法を用いて、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス、スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスを有するワクチンを産生することができる。

本明細書において記述される乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法を用いて、弱毒化生ウイルスを有するワクチンを産生することができる。弱毒化生ワクチンは、たとえばヒト二倍体細胞（たとえば、胎児肺組織、他の線維芽細胞）、サル腎細胞、およびニワトリ胚を含む培養細胞での数回継代に由来しうる。培養細胞において生育するようウイルスを適応させることは、天然の宿主に対するビルレンスを徐々に喪失することを伴いうる。無ビルレンスは、たとえば点突然変異の蓄積によって付与されうる。遺伝子操作を用いて、たとえば温度感受性変異体を生成することによって、欠失変異体を生成することによって、部位特異的変異誘発によって、または組み換え型生ウイルスを生成することによって、ウイルスの弱毒化を達成することができる。

本明細書において記述される乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法を用いて、不活化全ウイルスを有するワクチンを産生することができる。不活化ウイルスは、たとえば紫外光、低pH（たとえば、酸、たとえばカプリル酸）、低温殺菌、溶媒／洗浄剤、チオシアン酸ナトリウム、ホルマリン、β-プロピオラクトン、またはエチレンイミンを用いることによって生成することができる。UV光線は、遺伝子材料の複製を防止することによりウイルスを不活化することができる核酸二量体の作製を通して、DNAに損傷を与えることができる。いくつかのウイルスは、低pH溶液に曝露されると変性する。この方法は、エンベロープを有するウイルスを使用する場合、特に有効でありうる。低温殺菌は、温度誘発変性によってウイルスを不活化することができる。溶媒／洗浄剤不活化は、脂質コートに包まれているウイルスに限って有効である。用いられる洗浄剤は典型的に、Triton X-100である。チオシアン酸ナトリウムは、ウイルスのタンパク質コートを変性させることができ、それによってウイルスを不活化する。ホルマリンは、ウイルスコートの表面タンパク質を化学修飾することができ、感染症を予防することができる。エチレンイミンおよびβ-プロピオラクトンは、タンパク質コートをほとんど修飾することなく、ウイルスの核酸に作用することができる。不活化は、ウイルスの免疫原性を維持しながら、ウイルスの感染性を破壊することができる。不活化ウイルスの複数回の適用を対象に投与することができる。

本明細書において記述される乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法を用いて、1つまたは複数の病原体からの1つまたは複数の抗原性タンパク質（ワクチンタンパク質）を有するワクチンを生成することができる。抗原性タンパク質は、それに対してワクチンが産生される任意の病原体に由来しうる。たとえば、ワクチンがインフルエンザウイルスを標的とする場合、抗原性タンパク質は、赤血球凝集素（HA）および／またはノイラミニダーゼ（NA）でありうる。赤血球凝集素は、抗原性の糖タンパク質であり、A型インフルエンザウイルスの主要な表面タンパク質である。これは、細胞表面上のシアル酸含有受容体に結合することによって、インフルエンザウイルスと、感染される細胞とのあいだの結合を媒介する。細胞表面に結合したウイルス粒子は、エンドソームに取り込まれる。エンドソーム内部で、HAは、ウイルス膜とエンドソーム膜との融合を媒介して、ウイルスゲノムを細胞内に放出する。構造的に、HAは、らせん状のコイルに構築される3つの同一の単量体からなる。機能遮断抗体は、HAの細胞結合または膜融合機能のいずれかを阻害することができるであろう。ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスの表面上に見いだされるもう1つの糖タンパク質である。NAは、糖タンパク質からシアル酸基を切断することによって機能する酵素である。この切断は、2つの機能、すなわちウイルスの凝集を防止すること、および細胞表面から子孫ウイルスを放出させること、を果たすように思われる。

少なくとも16個の公知のHAサブタイプが存在する。ワクチン抗原は、HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15、またはHA16でありうる。公知のNAサブタイプは9個存在する。ワクチン抗原は、NA1、NA2、NA3、NA4、NA5、NA6、NA7、NA8、またはNA9でありうる。HAおよび／またはNAサブタイプから調製されたワクチンを、個々にまたは任意の組み合わせで用いることができる。たとえば、様々なHAおよびNA抗原の2つまたはそれより多くを、乾燥ワクチン粉末製剤の製造の際に混合することができ、または個々のHAおよびNA抗原の乾燥粉末製剤を混合することができる。抗原性タンパク質は、病原体からの表面タンパク質でありうる。抗原性タンパク質は、組み換えによって産生されうる。たとえば、関心対象抗原をコードする核酸を、原核細胞（たとえば、細菌）、真核細胞（たとえば、酵母細胞および昆虫細胞）に導入することができ、タンパク質を発現させて、細胞から精製することができる。病原体がウイルスである場合、ビリオンの非必須成分を除去することができる（たとえば、エーテルおよび洗浄剤を用いて）。

本明細書において記述される乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法を用いて、ウィロゾームワクチンを産生することができる。ウィロゾームワクチンは、本来のウイルスの遺伝材料を有することなく、再構成されたウイルスエンベロープのウイルス様粒子を含む。インフルエンザウィロゾームは、HAおよびNAタンパク質がインターカレートしたユニラメラリン脂質二重層からなる小胞である。それらは遺伝材料を有しないことから、ウィロゾームは感染性ではない。

液体ワクチン製剤中のワクチンタンパク質（たとえば、抗原または抗原含有成分）の濃度は、約0.05 mg/mLから10 mg/mL、約0.1 mg/mLから約10 mg/mL、約0.1 mg/mLから約5 mg/mL、約0.1 mg/mLから約2.5 mg/mL、約0.1 mg/mLから約1 mg/mL、約0.1 mg/mLから約0.5 mg/mL、約0.5 mg/mLから約1 mg/mL、約0.05 mg/mLから1 mg/mL、または約0.05 mg/mLから2.5 mg/mLでありうる。液体ワクチン製剤中のワクチンタンパク質（たとえば、抗原または抗原含有成分）の濃度は、約0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、3.5 mg/mL、4 mg/mL、4.5 mg/mL、5 mg/mL、5.5 mg/mL、6 mg/mL、6.5 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、8.5 mg/mL、9 mg/mL、または10 mg/mLでありうる。液体ワクチン製剤中のワクチンタンパク質（たとえば抗原または抗原含有成分）の濃度は、約0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、3.5 mg/mL、4 mg/mL、4.5 mg/mL、5 mg/mL、5.5 mg/mL、6 mg/mL、6.5 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、8.5 mg/mL、9 mg/mL、または10 mg/mLより上でありうる。

乾燥ワクチン粉末製剤は、1つまたは複数のインフルエンザウイルスによる感染症を予防および／または処置するために用いられうる。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のウイルスに属し、これは5つの属を含む：A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、イサウイルス、およびトゴトウイルス。ドーリウイルスは、トゴトウイルス属の種である。インフルエンザウイルスは、ヒトおよび他の種に感染することができる。A型インフルエンザウイルスは、ヒト、トリ、ブタ、ウマ、アザラシ、および他の動物に感染することができる。野生のトリは、これらのウイルスの天然の宿主でありうる。A型インフルエンザウイルスは、ウイルスの表面上の2つのタンパク質(赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）)に基づいてサブタイプに分けられ、名前をつけられている。たとえば、「H7N2ウイルス」は、HA7タンパク質とNA2タンパク質とを有するA型インフルエンザサブタイプを示す。同様に、「H5N1」ウイルスは、HA5タンパク質とNA1タンパク質とを有する。16個の公知のHAサブタイプおよび9個の公知のNAサブタイプが存在する。HAとNAタンパク質の異なる多くの組み合わせが可能である。任意の数の公知のHAサブタイプ（HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15、およびHA16）を、任意の数の公知のNAサブタイプ（NA1、NA2、NA3、NA4、NA5、NA6、NA7、NA8、およびNA9）と組み合わせて、感染症を予防または処置するためのワクチンを産生することができる。HAおよびNAサブタイプはまた、感染症を予防または処置するためにワクチンにおいて個々に用いることができる。異なるサブタイプワクチンを、感染症を予防または処置するために、使用時に連続的または同時に混合することができる。いくつかのA型インフルエンザサブタイプ（たとえば、H1N1、H1N2、およびH3N2）が現在、人々のあいだで一般的に広がっている。他のサブタイプは、他の動物種において見いだされうる。たとえば、H7N7およびH3N8ウイルスはウマにおいて病気を引き起こしうるが、最近、H3N8はまた、イヌにおいても病気を引き起こすことが示されている（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses）。

抗ウイルス剤は、高リスク群（たとえば、入院患者、高齢者介護施設の入所者、または免疫抑制患者）を保護するために用いることができる。抗ウイルス剤の可能性がある使用は、たとえばトリH5N1またはもう1つの株のインフルエンザウイルス（たとえば、H1N1）によって引き起こされるか否かによらず、今後のパンデミックの広がりまたは重症度を制限することである。H5N1、H7N7、およびH7N3ウイルスを含むA型トリインフルエンザウイルスのサブタイプH5およびH7は、高い病原性に関連しており、これらのウイルスによるヒトの感染症は、軽度（たとえば、H7N3、H7N7）から重度および致死性疾患（たとえば、H7N7、H5N1）に及ぶ。非常に軽度の症状（たとえば、結膜炎）からインフルエンザ様の病気を含む、低病原性ウイルスの感染症によるヒトの病気が報告されている。ヒトに感染する低病原性ウイルスの例には、H7N7、H9N2、およびH7N2が挙げられる（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses）。

B型インフルエンザウイルスはヒトにおいて見いだされうるが、アザラシにも感染しうる。A型インフルエンザウイルスとは異なり、これらのウイルスは、サブタイプに従って分類されない。B型インフルエンザウイルスは、ヒトにおいて病的状態および死亡を引き起こしうるが、一般的にA型インフルエンザウイルスほど重度の流行には関連しない。B型インフルエンザウイルスは、ヒトでの流行を引き起こしうるが、それらはパンデミックを引き起こしたことはない（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses）。

C型インフルエンザウイルスは、ヒトにおいて軽度の病気を引き起こしうるが、流行またはパンデミックを引き起こさない。これらのウイルスもまた、イヌおよびブタに感染することができる。これらのウイルスはサブタイプに従って分類されない（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses）。

本明細書において記述される方法および組成物は、たとえばアベルソン白血病ウイルス、アベルソンネズミ白血病ウイルス、アベルソンウイルス、急性喉頭気管気管支炎ウイルス、アデレード川ウイルス、アデノ随伴ウイルス群、アデノウイルス、アフリカウマ病ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、AIDSウイルス、アリューシャンミンク病パルボウイルス、アルファレトロウイルス、アルファウイルス、ALV関連ウイルス、アマパリウイルス、アフトウイルス、アクアレオウイルス、アルボウイルス、アルボウイルスC、A群アルボウイルス、B群アルボウイルス、アレナウイルス群、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、アーテリウイルス、アストロウイルス、アテリネヘルペスウイルス群、オジェッキー病ウイルス、オーラウイルス、オースダック病ウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、トリアデノウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ感染性気管支炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリリンパ腫症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリパラミクソウイルス、トリ気脳炎ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、トリC型レトロウイルス群、トリヘパドナウイルス、トリ痘ウイルス、Bウイルス、B19ウイルス、ババンキウイルス、ヒヒヘルペスウイルス、バキュロウイルス、バーマー森林ウイルス、ベバルウイルス、ベリマーウイルス、ベータレトロウイルス、バーナウイルス、ビトナーウイルス、BKウイルス、ブラッククリーク運河ウイルス、ブルータングウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ボマ病ウイルス、ヒツジボーダー病ウイルス、ボルナウイルス、ウシアルファヘルペスウイルス1型、ウシアルファヘルペスウイルス2型、ウシコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ乳頭炎ウイルス、ウシパピローマウイルス、ウシ丘疹口内炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ合胞体ウイルス、ウシC型オンコウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、バギークリークウイルス、弾丸形ウイルス群、ブニヤムウェラウイルス超群、ブニヤウイルス、バーキットリンパ腫ウイルス、ブワンバ熱、CAウイルス、カリシウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌ微小ウイルス、イヌパルボウイルス、カノデルガディトウイルス、ヤギ関節炎ウイルス、ヤギ脳炎ウイルス、ヤギヘルペスウイルス、ヤギ痘ウイルス、カルジオウイルス、カビド（caviid）ヘルペスウイルス1型、オナガザルヘルペスウイルス1型、オナガザルヘルペスウイルス1型、オナガザルヘルペスウイルス2型、チャンジプラウイルス、チャンギノラウイルス、ブチナマズウイルス、シャルルビルウイルス、鶏痘ウイルス、チクングンヤウイルス、チンパンジーヘルペスウイルス、チャブレオウイルス、シロザケウイルス、コカルウイルス、ギンザケレオウイルス、媾疹ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、コルチウイルス、コロンビアSKウイルス、風邪ウイルス、感染性膿瘡ウイルス、感染性膿疱性皮膚炎ウイルス、コロナウイルス、コリパルタウイルス、鼻風邪ウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、CPV（細胞質多角体病ウイルス）、コオロギ麻痺ウイルス、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、クループ関連ウイルス、クリプトウイルス、サイポウイルス、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス群、細胞質多角体病ウイルス、シカパピローマウイルス、デルタレトロウイルス、デングウイルス、デンソウイルス、デペンドウイルス、ドーリウイルス、ディプロルナウイルス、ショウジョウバエCウイルス、カモB型肝炎ウイルス、カモ肝炎ウイルス1型、カモ肝炎ウイルス2型、デュオウイルス、デュベンヘージウイルス、羽変形病ウイルスDWV、東部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、EBウイルス、エボラウイルス、エボラ様ウイルス、エコーウイルス、エコーウイルス、エコーウイルス10、エコーウイルス28、エコーウイルス9、欠肢症ウイルス、EEEウイルス、EIAウイルス、EIAウイルス、脳炎ウイルス、脳心筋炎ウイルス群、脳心筋炎ウイルス、エンテロウイルス、酵素上昇ウイルス、酵素上昇ウイルス（LDH）、流行性出血熱ウイルス、流行性出血病ウイルス、エプスタイン-バーウイルス、ウマアルファヘルペスウイルス1型、ウマアルファヘルペスウイルス4型、ウマヘルペスウイルス2型、ウマ流産ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ脳症ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ウマ麻疹ウイルス、ウマ鼻肺炎ウイルス、ウマライノウイルス、ユーベナングウイルス、ヨーロッパエルクパピローマウイルス、ヨーロッパブタ熱ウイルス、エバーグレイズウイルス、ヤッチウイルス、ネコヘルペスウイルス1型、ネコカリシウイルス、ネコ線維肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ白血病／肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ合胞体ウイルス、フィロウイルス、フランダーズウイルス、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、フォートモーガンウイルス、フォーコーナーズハンタウイルス、家禽アデノウイルス1型、家禽痘ウイルス、フレンドウイルス、ガンマレトロウイルス、GB肝炎ウイルス、GBウイルス、ドイツ麻疹ウイルス、ゲタウイルス、テナガザル白血病ウイルス、腺熱ウイルス、ヤギ痘ウイルス、ゴールデンシンナーウイルス、ゴノメタウイルス、ガチョウパルボウイルス、顆粒病ウイルス、グロスウイルス、ジリスB型肝炎ウイルス、A群アルボウイルス、グアナリトウイルス、モルモットサイトメガロウイルス、モルモットC型ウイルス、ハンターンウイルス、ハンタウイルス、ホンビノスガイレオウイルス、野ウサギ線維腫ウイルス、HCMV（ヒトサイトメガロウイルス）、赤血球吸着ウイルス2型、日本の赤血球凝集ウイルス、出血熱ウイルス、ヘンドラウイルス、ヘニパウイルス、ヘパドナウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス群、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、F型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス、非A非B肝炎ウイルス、肝炎ウイルス、肝炎ウイルス（非ヒト）、肝脳脊髄炎レオウイルス3型、ヘパトウイルス、ヘロンB型肝炎ウイルス、ヘルペスBウイルス、単純ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルス7型、クモザルヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヘルペスウイルス感染、リスザルヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、水痘ヘルペスウイルス、ハイランドJウイルス、ヒラメラブドウイルス、ブタコレラウイルス、ヒトアデノウイルス2型、ヒトアルファヘルペスウイルス1型、ヒトアルファヘルペスウイルス2型、ヒトアルファヘルペスウイルス3型、ヒトBリンパ球向性ウイルス、ヒトベータヘルペスウイルス5型、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス群、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトガンマヘルペスウイルス4型、ヒトガンマヘルペスウイルス6型、ヒトA型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス1群、ヒトヘルペスウイルス2群、ヒトヘルペスウイルス3群、ヒトヘルペスウイルス4群、ヒトヘルペスウイルス6型、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス1型、ヒト免疫不全ウイルス2型、ヒトパピローマウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルスI型、ヒトT細胞白血病ウイルスII型、ヒトT細胞白血病ウイルスIII型、ヒトT細胞リンパ腫ウイルスI型、ヒトT細胞リンパ腫ウイルスII型、1型ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス、2型ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型、ヒトTリンパ球向性ウイルスII型、ヒトTリンパ球向性ウイルスIII型、生痕ウイルス、新生児胃腸炎ウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、感染性造血壊死ウイルス、感染性膵臓壊死ウイルス、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、C型インフルエンザウイルス、D型インフルエンザウイルス、インフルエンザウイルスpr8、昆虫虹色ウイルス、昆虫ウイルス、イリドウイルス、日本Bウイルス、日本脳炎ウイルス、JCウイルス、フニンウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ケメロボウイルス、キラムラットウイルス、クラマスウイルス、コロンゴウイルス、韓国出血熱ウイルス、クンバウイルス、キサヌール森林病ウイルス、クィズールアガッシュ（Kyzylagach）ウイルス、ラクロスウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ラングールウイルス、ウサギパルボウイルス、ラッサ熱ウイルス、ラッサウイルス、ラット潜伏性ウイルス、LCMウイルス、リーキーウイルス、レンチウイルス、ウサギ痘ウイルス、白血病ウイルス、白血病ウイルス、ランピースキン病ウイルス、リンパ節症関連ウイルス、リンフォクリプトウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、リンパ増殖ウイルス群、マシュポウイルス、マッドイッチウイルス、哺乳動物B型オンコウイルス群、哺乳動物B型レトロウイルス、哺乳動物C型レトロウイルス群、哺乳動物D型レトロウイルス、乳癌ウイルス、マプエラウイルス、マールブルグウイルス、マールブルグ様ウイルス、メイソンファイザーサルウイルス、マストアデノウイルス、マヤロウイルス、MEウイルス、麻疹ウイルス、メナングルウイルス、メンゴウイルス、メンゴウイルス、ミデルブルグウイルス、乳牛結節ウイルス、ミンク腸炎ウイルス、マウスの微小ウイルス、MLV関連ウイルス、MMウイルス、モコラウイルス、軟体動物痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サルBウイルス、サル痘ウイルス、モノネガウイルス目、麻疹ウイルス、マウントエルゴンコウモリウイルス、マウスサイトメガロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウスKウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス微小ウイルス、マウス肺炎ウイルス、マウス灰白髄炎ウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス痘ウイルス、モザンビークウイルス、ムカンボウイルス、粘膜病ウイルス、ムンプスウイルス、ネズミベータヘルペスウイルス1型、ネズミサイトメガロウイルス2型、ネズミサイトメガロウイルス群、ネズミ脳脊髄炎ウイルス、ネズミ肝炎ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ネズミ結節誘発ウイルス、ネズミポリオーマウイルス、ネズミ肉腫ウイルス、ムーロメガロウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、粘液腫ウイルス、ミクソウイルス、多形性ミクソウイルス、ミクソウイルス・パロチチディス、ナイロビヒツジ病ウイルス、ナイロウイルス、ナニルナウイルス、ナリバウイルス、デュモウイルス、ニースリングウイルス、ネルソン湾ウイルス、神経向性ウイルス、新世界アレナウイルス、新生児肺炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、非細胞変性ウイルス、ノーウォークウイルス、核多角体病ウイルス（NPV）、ニップルネックウイルス、オニョンニョンウイルス、オッケルボウイルス、発癌性ウイルス、発癌性ウイルス様粒子、オンコルナウイルス、オルビウイルス、オルフウイルス、オロポーシェウイルス、オルトヘパドナウイルス、オルトミクソウイルス、オルトポックスウイルス、オルトレオウイルス、オルンゴ、ヒツジパピローマウイルス、ウシカタル熱ウイルス、ヨザルヘルペスウイルス、パリアムウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス・シルビラギ（sylvilagi）、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、パラインフルエンザウイルス4型、パラミクソウイルス、パラポックスウイルス、パラワクシニアウイルス、パルボウイルス、パルボウイルスB19、パルボウイルス群、ペスチウイルス、フレボウイルス、アザラシジステンパーウイルス、ピコドナウイルス、ピコルナウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ハト痘ウイルス、ピリーウイルス、ピクスナウイルス、マウスの肺炎ウイルス、肺炎ウイルス、灰白髄炎ウイルス、ポリオウイルス、ポリドナウイルス、多角体病ウイ
ルス、ポリオーマウイルス、ポリオーマウイルス、ウシポリオーマウイルス、オナガザルポリオーマウイルス、ヒトポリオーマウイルス2型、マカカエ（maccacae）ポリオーマウイルス1型、ネズミポリオーマウイルス1型、ネズミポリオーマウイルス2型、ヒヒポリオーマウイルス1型、ヒヒポリオーマウイルス2型、ポリオーマウイルス・シルビラギ、ポンギンヘルペスウイルス1型、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタC型ウイルス、ポックスウイルス、ポックスウイルス、天然痘ポックスウイルス、プロスペクトヒルウイルス、プロウイルス、偽牛痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、ウサギ腎臓空胞化ウイルス、ウサギパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、アライグマパルボウイルス、アライグマ痘ウイルス、ラニケートウイルス、ラットサイトメガロウイルス、ラットパルボウイルス、ラットウイルス、ラウシャーウイルス、組換え型ワクシニアウイルス、組換え型ウイルス、レオウイルス、レオウイルス1型、レオウイルス2型、レオウイルス3型、爬虫類C型ウイルス、呼吸器感染ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、呼吸器ウイルス、細網内皮症ウイルス、ラブドウイルス、ラブドウイルス・カルピア、ラジノウイルス、ライノウイルス、リジディオウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ライリーウイルス、牛疫ウイルス、RNA腫瘍ウイルス、ロス川ウイルス、ロタウイルス、ルージョールウイルス、ラウス肉腫ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、ルビウイルス、ロシア秋脳炎ウイルス、SA11シミアンウイルス、SA2ウイルス、サビアウイルス、サギヤマウイルス、サイミリンヘルペスウイルス1型、唾液腺ウイルス、サシチョウバエ熱ウイルス群、サンジンバウイルス、SARSウイルス、SDAV（唾液腺涙腺炎ウイルス）、アザラシ痘ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ソウルウイルス、ヒツジ痘ウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ショープパピローマウイルス、サル泡沫状ウイルス、サルA型肝炎ウイルス、サルヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、サルT細胞リンパ球向性ウイルス、シミアンウイルス、シミアンウイルス40、単純ウイルス、シンノンブレウイルス、シンドビスウイルス、天然痘ウイルス、南アメリカ出血熱ウイルス、スズメ痘ウイルス、スプマウイルス、リス線維腫ウイルス、リスザルレトロウイルス、SSV1ウイルス群、STLV（サルTリンパ球向性ウイルス）I型、STLV（サルTリンパ球向性ウイルス）II型、STLV（サルTリンパ球向性ウイルス）III型、口内炎丘疹ウイルス、下顎ウイルス、ブタアルファヘルペスウイルス1型、ブタヘルペスウイルス2型、スイポックスウイルス、沼地熱ウイルス、ブタ痘ウイルス、スイスマウス白血病ウイルス、TACウイルス、タカリベウイルス群、タカリベウイルス、タナポックスウイルス、タテラポックスウイルス、テンチレオウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、タイラーウイルス、トゴトウイルス、トッタパラヤム（Thottapalayam）ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、チオマンウイルス、トガウイルス、トロウイルス、腫瘍ウイルス、ツパイアウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、シチメンチョウ痘ウイルス、C型レトロウイルス、D型オンコウイルス、D型レトロウイルス群、潰瘍性疾患ラブドウイルス、ウナウイルス、ウクニエミウイルス群、ワクシニアウイルス、空胞化ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、バリコラ（Varicola）ウイルス、大痘瘡ウイルス、天然痘ウイルス、ウアシン・ギシュー病ウイルス、VEEウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ベシクロウイルス、ビリュイスクウイルス、毒ヘビレトロウイルス、ウイルス出血性敗血症ウイルス、ビスナマエディウイルス、ビスナウイルス、ハタネズミ痘ウイルス、VSV（水疱性口内炎ウイルス）、ウォーラルウイルス、ウォリゴウイルス、いぼウイルス、WEEウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロアウイルス、冬季嘔吐症ウイルス、ウッドチャックB型肝炎ウイルス、ウーリーモンキー肉腫ウイルス、創傷腫瘍ウイルス、WRSVウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバウイルス、ヤタポックスウイルス、黄熱ウイルス、およびヤグボダノバックウイルスを含む任意のウイルスによる感染症を予防および／または処置するために有用でありうる。

B．非ウイルス病原体ワクチン成分
本明細書において記述されるワクチンは、細菌、真菌、または原生生物細胞またはその成分を含みうる。たとえば、細菌病原体に対するワクチンは、死菌またはその精製抗原決定基を含みうる。弱毒化細菌もまた、抗原として用いることができる。いくつかの例において、不活化毒素（トキソイド）を、本明細書において記述されるワクチン成分の1つまたは複数と混合することによって、細胞病原体によって産生された毒素（たとえば、コレラ毒素）に対するワクチンを産生することができる。標的病原体からの抗原性ペプチドを、起源病原体から精製するか、および／または組み換えによって産生した後に、ワクチンの成分の1つまたは複数と混合することができる。コンジュゲート抗原も同様に用いることができる。コンジュゲート抗原の場合、細菌病原体の抗原性の低い多糖類外皮を、免疫応答を刺激することができる毒性タンパク質に付着させる。典型的に、非ウイルス病原体に対するワクチンは、粘膜表面に影響を及ぼすまたは粘膜表面を介して体へのアクセスを獲得する病原体に対して免疫応答（たとえば、sIgA産生）を産生するように計画されるであろう。そのような病原体の非制限的な例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、赤痢菌種（Shigella）、腸チフス菌（Salmonella typhi）、パラチフス菌（Sa. paratyphi）、腸毒素性大腸菌（Escherischia coli）、ペスト菌（Yersinia pestis）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウレアプラズマ・ウレアリチクム（Ureaplasma urealyticum）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）種、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、レプトスピラ・キルシュネリ（Leptospira kirschneri）、レプトスピラ・ノグチ（Leptospira noguchii）、レプトスピラ・アレクサンデリ（Leptospira alexanderi）、レプトスピラ・ウェイリイ（Leptospira weilii）、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ（Leptospira borgpetersenii）、レプトスピラ・サンタロサイ（Leptospira santarosai）、レプトスピラ・メチイ（Leptospira kmetyi）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、イヌ流産菌（Brucella canis）、ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア肺炎病原体（Chlamydia pneumoniae）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、クラミドフィラ・シタッシ（Chlamydophila psittaci）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）、野兎病菌（Francisella tularensis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インテロガンス、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、らい菌（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・アルセランス（Mycobacterium ulcerans）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア（Rickettsia rickettsii）、腸チフス菌、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ゾンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、ストレプトコッカス・サプロフィチクス（Streptococcus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、クリプトコッカス・ガチイ（Cryptococcus gattii）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ニューモシスチス・ジロベシイ（Pneumocystis jirovecii）、スタキボトリス・チャータルム（Stachybotrys chartarum）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）等が挙げられる。

C．抗原性成分の調製
病原体のタンパク質または他の細胞成分の抗原性機能を保存するために、本開示は、抗原性成分（たとえば、ウイルス、タンパク質）の三次元立体配置のいくつかまたは全てを保存することができるワクチンを調製する方法を提供する。このように、本明細書において提供される方法は、病原体またはその成分上の抗原性決定基が無傷の状態で保存されるワクチンの産生を可能にすることができる。たとえば、ワクチンにおけるタンパク質の三次元構造を保持すれば、それに対する免疫応答を誘発することができる「コンフォメーショナル」エピトープの保持を可能にすることができる。「コンフォメーショナル」エピトープは、タンパク質のフォールディングに依存して、一般的に直鎖状のアミノ酸（たとえば、消化されたまたは直鎖状のタンパク質）を全く含まないエピトープである。さらに、本明細書において提供されるワクチン産生法によって、所定の量のワクチンに対する反応における免疫応答のレベルが、病原体または他の天然に存在する抗原起源に対する曝露と比較して、少なくとも約100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、または50％であるように、抗原性効力（すなわち、免疫応答の誘導能）の保持が起こりうる。加えて、本明細書において提供される方法によって、本明細書において記述される急速凍結法に供される総抗原性タンパク質の抗原能の高レベル（たとえば、少なくとも約100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、または50％）を特定の抗原が保持するワクチンの産生を可能にすることができる。

この方法論の1つの態様を図2に示す。本実施例において、抗原（白丸として示す）を安定化剤（トレハロース）および緩衝剤（リン酸緩衝液）と混合する。成分を混合してフリーズドライする（たとえば、液体窒素中に浸すことによって）。産生された乾燥ワクチン成分は、抗原または複数の抗原がなおも免疫応答を誘発することができ、および室温で安定である微粒子を含む。次に、ワクチン成分を経鼻投与にとって適した担体（たとえば、微結晶性セルロース）と混合することができる。本明細書において開示されるワクチンの成分の非制限的な例を以下に提供する。

ある機能を行うために液体製剤の成分を選択することができる。たとえば、1つの成分を利用して、それに対してワクチンを開発する抗原の安定性を提供することができる。主に、そのような成分は、その後の凍結プロセスの際の抗原の分解を防止することができる。これらの成分は、任意の安定化分子または化合物、たとえば糖、アミノ酸、および／またはポリマーを含むことができる。1つまたは複数のそのような抗原安定化物質を製剤において用いることができる。典型的に、抗原安定化物質は、全体的または部分的に水溶性であろう。好ましい抗原安定化剤は、本明細書において記述されるプロセスにおいてハードケーキを生じないであろう。液体ワクチン製剤を産生するために用いることができる例示的な糖には、トレハロース、マンニトール、スクロース、ラクトース、イヌリン、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、スタキオース、ソルビトール、グリセロール、フルクトース、マンノース、マルトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、L-グルコネート、および／またはその他が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。利用することができる例示的なアミノ酸には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタメート、およびリジンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。例示的なポリマーは、ポリエチレングリコール（PEG）であるが、利用することができる他のポリマーには、デキストラン、ヒト血清アルブミン（HSA）、非加水分解ゼラチン、メチルセルロース、キサンタンゴム、カラゲニン、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、シアル化多糖類、アクチン、ミオシン、微小管、ダイニン、キネチン、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン、および／またはその他が挙げられる。界面活性剤は、たとえば、ポリエチレングリコール、モノラウリン酸ソルビタン（Tween 20）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Tween 80）、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマー（Pluronic）、および／またはその他でありうる。

そのような抗原安定化剤はワクチン調製物において利用されているが、本発明の方法においてこれらの安定化剤の1つまたは複数を用いることによって、乾燥時にハードケーキを形成しない凍結ワクチン製剤を得ることができる。たとえば、トレハロースを用いることは、凍結時にタンパク質に対する保護を提供することが知られているが、物質を噴霧凍結しなければケーキングを引き起こす（たとえば、Chefson et al., J. Biotechnol.2007 Jul 15; 130(4):436-40を参照されたい）。しかし、本明細書において提供される1つの態様は、タンパク質様抗原、リン酸緩衝液、および急速凍結法（たとえば、液体窒素に対する曝露）とトレハロースとの組み合わせである。そのような方法によって、ハードケーキを形成することなく、タンパク質が活性（たとえば、抗原能）を保持する微粉末を産生することができる。ハードケーキをすりつぶす段階は、ワクチン調製プロセスにおける余分の段階であり、熱および／または機械的力によりハードケーキ中の抗原性タンパク質の低い回収率および分解が起こりうることから、微粉末であることは進歩である。

抗原対安定化剤の比率は、たとえば約1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19、1：20、1：21、1：22、1：23、1：24、1：25、1：26、1：27、1：28、1：29、1：30、1：31、1：32、1：33、1：34、1：35、1：36、1：37、1：38、1：39、1：40、1：41、1：42、1：43、1：44、1：45、1：46、1：47、1：48、1：49、1：50、1：51、1：52、1：53、1：54、1：55、1：56、1：57、1：58、1：59、1：60、1：61、1：62、1：63、1：64、1：65、1：66、1：67、1：68、1：69、1：70、1：71、1：72、1：73、1：74、1：75、1：76、1：77、1：78、1：79、1：80、1：81、1：82、1：83、1：84、1：85、1：86、1：87、1：88、1：89、1：90、1：91、1：92、1：93、1：94、1：95、1：96、1：97、1：98、1：99、または1：100でありうる。抗原対安定化剤の比率は、たとえば、約1：110、1：120、1：130、1：140、1：150、1：160、1：170、1：180、1：190、1：200、1：210、1：220、1：230、1：240、1：250、1：260、1：270、1：280、1：290、1：300、1：310、1：320、1：330、1：340、1：350、1：360、1：370、1：380、1：390、1：400、1：410、1：420、1：430、1：440、1：450、1：460、1：470、1：480、1：490、1：500、1：510、1：520、1：530、1：540、1：550、1：560、1：570、1：580、1：590、1：600、1：610、1：620、1：630、1：640、1：650、1：660、1：670、1：680、1：690、1：700、1：710、1：720、1：730、1：740、1：750、1：760、1：770、1：780、1：790、1：800、1：810、1：820、1：830、1：840、1：850、1：860、1：870、1：880、1：890、1：900、1：910、1：920、1：930、1：940、1：950、1：960、1：970、1：980、1：990、または1：1000でありうる。フリーズドライ段階で用いられるワクチン液体製剤は、1つまたは複数のpH緩衝剤を含みうる（図2および3）。pH緩衝剤は、たとえば、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヒスチジン、HEPES、ACES、ADA、ADA二ナトリウム塩、ADA一ナトリウム塩、AMPSO、2-アミノエタノール、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、3-アミノ-1-プロパンスルホン酸ナトリウム塩、BES、ビシン、ビス-トリス、ビス-トリスHCl、ビス-トリスプロパン、CAPS、CAPSO、CHES、DIPSO、DIPSOナトリウム塩、グリシンアミドHCl、グリシン、HEPPS、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、TAPS、TAPSO、TES、トリシン、トリエタノールアミン、イミダゾール、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、および／またはカーボネートでありうる。緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩液でありうる。pHは、約pH 3から約pH 8、約pH 4から8、約pH 5から8、約pH 6から8、または約pH 6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、または8.0で維持されうる。液体製剤は、1つまたは複数の抗原および1つまたは複数の緩衝剤を含みうる、本質的にそれらからなりうる、またはそれらからなりうる。液体製剤は、1つまたは複数の抗原、1つまたは複数の安定化剤、および1つまたは複数の緩衝液を含みうる、本質的にそれらからなりうる、またはそれらからなりうる。

本明細書において記述される方法によって粉末製剤を生成するために用いられる液体製剤は、1つまたは複数の他の薬物、増量剤、および／または徐放性ポリマーを含有しうる。本発明の組成物において有用な他の薬物には、たとえば浸透補助剤、うっ血除去剤、気管支拡張剤、去痰剤、鎮痛剤およびその他が挙げられる。増量剤には、たとえば、ラクトース、マンニトール、および／またはヒドロキシエチルデンプン（HES）が含まれうる。組成物の徐放性半透過性ポリマーマトリクスには、たとえばポリ乳酸、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、またはリポソームを挙げることができる。

本明細書において記述されるワクチンは、アジュバントを含めることなく作製されうる。このように、最終的なワクチンを、病原体／抗原、安定化剤、および緩衝剤のみを用いて産生することができ、その後これをフリーズドライする。フリーズドライ後、アジュバントを添加する必要なく、ワクチンを担体と混合して、最終的なワクチン製品を産生することができる。または、製剤は、アジュバント、すなわちワクチンの免疫応答を改善するためにワクチンに添加される物質を含むことができる。アジュバントは、フリーズドライの前または後に添加することができる。アジュバントの例には、無機塩、たとえば水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムゲル、オイルエマルション、および界面活性剤に基づく製剤、たとえばMF59（微小流動化洗浄剤安定化水中油型エマルション）、QS21（精製サポニン）、AS02（[SBAS2]（水中油型＋MPL＋WS-21））、Montanide ISA-51およびISA-720（安定化油中水型エマルション）、微粒子アジュバント（たとえば、ウィロゾーム（インフルエンザ赤血球凝集素を組み入れたユニラメラリポソーム媒体））、AS04（[SBAS4]MPLを伴うAl塩）、ISCOMS（サポニンと脂質の構造複合体）、ポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー（PLG）、微生物誘導体（天然および合成）、たとえばモノホスホリルリピッドA（MPL）、Detox（MPL＋M.フレイ（M. phlei）細胞壁骨格）、AGP[RC-529]（合成アシル化単糖類）、DC_Chol（リポソームへと自己構築することができるリポイド免疫抑制剤）、OM-174（リピッドA誘導体）、CpGモチーフ（免疫刺激CpGモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド）、改変LTおよびCT（非毒性のアジュバント効果を提供するための遺伝子改変細菌毒素）、内因性のヒト免疫調整剤、たとえばhGM-CSFまたはhIL-12（タンパク質またはコードされるプラスミドのいずれかとして投与されうるサイトカイン）、Immudaptin（C3dタンデムアレイ）、金粒子などの不活性媒体、およびスクアレンが挙げられる。液体製剤および最終的な乾燥ワクチン粉末製剤は、アジュバントを有しないことがありうる。

III．フリーズドライ
液体製剤をフリーズドライによって粉末に変換することができる。フリーズドライは、材料を凍結した後昇華による水の除去によって乾燥させるプロセスである。急速凍結は、たとえば噴霧液滴（噴霧フリーズドライ）を液体窒素中または低温気体の流れの中に直ちに浸すことによって達成されうる。急速凍結はまた、噴霧凍結段階を含まないプロセスによっても達成されうる。急速凍結は、液体ワクチン製剤を液体窒素（-196℃）に接触させることによって達成されうる。急速凍結は、液体ワクチン製剤を、もう1つの化学物質と混合した液体窒素、たとえばヘキサン／液体窒素（-94℃）、メタノール／液体窒素（-98℃）、およびペンタン／液体窒素（-131℃）に接触させることによって達成されうる（Gordon AJ and Ford RA " The Chemist's Companion. Wiley, New York 1972）。急速凍結は、液体ワクチン製剤を、ドライアイス／有機溶媒（たとえば、エタノール、メタノール、エチレングリコール、四塩化炭素、アセトニトリル、イソプロピルアルコール、またはアセトン）浴、たとえば四塩化炭素／ドライアイス（-23℃）、アセトニトリル／ドライアイス（-42℃）、またはアセトンもしくはイソプロピルアルコール／ドライアイス浴（-78℃）に接触させることによって達成されうる（Gordon、前記）。急速凍結は、-40℃に到達しうる氷と無機塩（たとえば、NaClまたはCaCl₂）とのスラリー中に液体ワクチン製剤を浸すことによって達成されうる。液体ワクチン製剤を凍結することができる温度は、約0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、-85℃、-90℃、-95℃、-100℃、-105℃、-110℃、-115℃、-120℃、-125℃、-130℃、-135℃、-140℃、-145℃、-150℃、-155℃、-160℃、-165℃、-170℃、-175℃、-180℃、-185℃、-90℃、-195℃、-200℃、-205℃、または-210℃未満でありうる。液体ワクチン製剤を凍結することができる温度は、約0℃から-210℃、-50℃から約-210℃、-100℃から約-210℃、または-150℃から約-200℃でありうる。液体ワクチン製剤を凍結することができる温度は、約0℃、-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、-85℃、-90℃、-95℃、-100℃、-105℃、-110℃、-115℃、-120℃、-125℃、-130℃、-135℃、-140℃、-145℃、-150℃、-155℃、-160℃、-165℃、-170℃、-175℃、-180℃、-185℃、-190℃、-195℃、-200℃、-205℃、または-210℃でありうる。凍結方法により、液体ワクチン製剤中での抗原の三次元形状の喪失を防止することができる。

本明細書において開示されるいくつかの抗原含有溶液は、炭水化物を含有することができる。たとえば、抗原含有溶液は、トレハロース、マンニトール、スクロース、ラクトース、またはイヌリンが挙げられるがこれらに限定されない糖を含有することができる。そのような糖は、様々な目的のために、たとえば溶液のタンパク質様成分が凍結の際に失われないようまたは抗原能が減少しないよう保護するために利用される。たとえば、トレハロースを溶液に添加すると、タンパク質を含有する液体製剤（たとえば、液体ワクチン液体製剤）中のインフルエンザの赤血球凝集素（HA）などのタンパク質の抗原性の喪失を防止することができる。しかし、トレハロースおよび他の糖を添加する場合、噴霧凍結を利用しなければ、ワクチン調製物においてハードケーキの形成が起こりうる。本明細書において開示される新規方法は、噴霧凍結を必要とせず、しかもハードケーキの形成が起こらない急速凍結法においてそのような糖を用いることを可能にする。ハードケーキの粉砕によって、成分である生物学的分子の抗原性の喪失が起こるうることから、このことは、そのような処置を必要とするこれまでのアプローチに対して進歩である。抗原含有溶液中で本明細書において開示される緩衝剤と糖とを混合することにより、そのような結果が可能となる。本明細書において開示される糖含有溶液の急速凍結によって、粉末の生成が起こりうる。

液体ワクチン製剤は、低温の液体、たとえば液体窒素中に約30秒間から5分間、1分間から60分間、1分間から50分間、1から40分間、1から30分間、1から20分間、1から10分間、または1から5分間曝露されうる。液体ワクチン製剤は、低温の液体、たとえば液体窒素中に約30秒間、1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、6分間、7分間、8分間、9分間、10分間、11分間、12分間、13分間、14分間、15分間、16分間、17分間、18分間、19分間、20分間、25分間、30分間、35分間、40分間、45分間、50分間、55分間、または60分間曝露されうる。液体ワクチン製剤は、低温の液体、たとえば液体窒素中に、約30秒間、1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、6分間、7分間、8分間、9分間、10分間、11分間、12分間、13分間、14分間、15分間、16分間、17分間、18分間、19分間、20分間、25分間、30分間、35分間、40分間、45分間、50分間、55分間、または60分間より長く曝露されうる。液体ワクチン製剤を容器に入れて、内容物を低温の液体（たとえば、液体窒素）中に浸すことによって、液体ワクチン製剤を低温の液体に曝露することができる。液体ワクチン製剤は、低温の液体（たとえば、液体窒素）中に液体ワクチン製剤を直接導入することによって、低温の液体に曝露されうる。液体ワクチン製剤は、液体ワクチン製剤の上に低温の液体（たとえば、液体窒素）を注ぐことによって低温の液体に曝露されうる。

乾燥
たとえば液体窒素中での急速凍結後、凍結した製剤をフリーズドライヤーにおいてフリーズドライすることができる。フリーズドライは、1つまたは複数の段階（たとえば、同じ圧力で異なる温度）で起こりうる。フリーズドライは、たとえば約-210℃、-205℃、-200℃、-195℃、-190℃、-185℃、-180℃、-175℃、-170℃、-165℃、-160℃、-155℃、-150℃、-145℃、-140℃、-135℃、-130℃、-125℃、-120℃、-115℃、-110℃、-105℃、-100℃、-95℃、-90℃、-85℃、-80℃、-75℃、-70℃、-65℃、-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、または30℃で起こりうる。フリーズドライは、たとえば約-210℃、-205℃、-200℃、-195℃、-190℃、-185℃、-180℃、-175℃、-170℃、-165℃、-160℃、-155℃、-150℃、-145℃、-140℃、-135℃、-130℃、-125℃、-120℃、-115℃、-110℃、-105℃、-100℃、-95℃、-90℃、-85℃、-80℃、-75℃、-70℃、-65℃、-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、または30℃より上で起こりうる。フリーズドライは、たとえば約-80℃から30℃、約-50℃から25℃、または約-40℃から20℃で起こりうる。フリーズドライは、1つの温度、異なる2つの温度、異なる3つの温度、異なる4つの温度、異なる5つの温度、異なる6つの温度、異なる7つの温度、異なる8つの温度、異なる9つの温度、または異なる10の温度で起こりうる。

フリーズドライは、1つまたは複数の異なる圧力で行われうる。圧力は、たとえば約10 mtorrから300 mtorr、約25 mtorrから300 mtorr、約50 mtorrから250 mtorr、または約50 mtorrから200 mtorrでありうる。フリーズドライは、約10 mtorr、20 mtorr、30 mtorr、40 mtorr、50 mtorr、60 mtorr、70 mtorr、80 mtorr、90 mtorr、100 mtorr、110 mtorr、120 mtorr、130 mtorr、140 mtorr、150 mtorr、160 mtorr、170 mtorr、180 mtorr、190 mtorr、200 mtorr、210 mtorr、220 mtorr、230 mtorr、240 mtorr、250 mtorr、260 mtorr、270 mtorr、280 mtorr、290 mtorr、または300 mtorrで行われうる。フリーズドライは、約10 mtorr、20 mtorr、30 mtorr、40 mtorr、50 mtorr、60 mtorr、70 mtorr、80 mtorr、90 mtorr、100 mtorr、110 mtorr、120 mtorr、130 mtorr、140 mtorr、150 mtorr、160 mtorr、170 mtorr、180 mtorr、190 mtorr、200 mtorr、210 mtorr、220 mtorr、230 mtorr、240 mtorr、250 mtorr、260 mtorr、270 mtorr、280 mtorr、290 mtorr、または300 mtorrより上で行われうる。

各フリーズドライ段階の期間は、約1時間から48時間、約1時間から36時間、約1時間から24時間、約4時間から24時間、約6時間から24時間、または約8時間から24時間でありうる。各フリーズドライ段階の期間は、約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、25時間、26時間、27時間、28時間、29時間、30時間、31時間、32時間、33時間、34時間、35時間、36時間、37時間、38時間、39時間、40時間、41時間、42時間、43時間、4時間、45時間、46時間、47時間、または48時間でありうる。各フリーズドライ段階の期間は、約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、25時間、26時間、27時間、28時間、29時間、30時間、31時間、32時間、33時間、34時間、35時間、36時間、37時間、38時間、39時間、40時間、41時間、42時間、43時間、44時間、45時間、46時間、47時間、または48時間より長い時間でありうる。

1つまたは複数の乾燥段階を、本明細書において開示される方法において利用することができる。凍結試料の一次乾燥は、任意の関連する方法論、たとえば凍結乾燥によって行われうる。二次乾燥は、たとえば真空チャンバー中で高温での持続的フリーズドライ、温度制御表面との接触曝露、または温度／湿度制御気体の撹拌もしくは流動床での粒子の浮遊によって行われうる。乾燥粉末粒子産物は、たとえば、プロセス容器から、またはプロセス気体流から粒子の分粒および沈降によって回収されうる。

他の乾燥プロセスには、たとえば空気乾燥、窒素パージでの脱水（すりつぶしおよび篩い分けを含む）、フリーズドライ（粉砕および篩い分けを含む）、および超臨界流体乾燥（SCF）が挙げられる。乾燥プロセスは、抗原の三次元構造を保存することができる。たとえば、プロセスは、インフルエンザHA抗原の構造を保存して、高いHA効力を提供することができる。

フリーズドライ後、粉末を約4から25℃の温度で貯蔵（保存）することができる。保存条件の相対湿度は、約0％から70％、約0％から60％、約0％から50％、約0％から40％、約0％から30％、約0％から20％、約0％から10％、または約0％から5％でありうる。保存の相対湿度は、約80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、24％、23％、22％、21％、60％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％未満でありうる。

フリーズドライ後の粉末の水分含有量は、約12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、または0.1％でありうる。フリーズドライ後の粉末の水分含有量は、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、または0.01％未満でありうる。

フリーズドライ後に生成された粉末の平均粒子直径は、約5から100μm、約5から60μm、または約5から30μmでありうる。フリーズドライ後に生成された粉末の平均粒子直径は、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95μm未満でありうる。

IV．担体
本明細書に記述されるフリーズドライ法によって産生された粉末を、1つまたは複数の追加の成分と混和して、乾燥ワクチン粉末製剤を生成することができる。そのような成分は、薬学的に許容される担体、たとえば粘膜投与にとって適切な担体を含む。粘膜投与にとって適した担体は、微結晶性セルロースなどの生理学的に許容される物質でありうる。微結晶性セルロースは、より大きい比表面積を有する特定の微結晶性セルロースでありうる。任意の微結晶性セルロースを利用することができるが、いくつかの態様において、本出願のワクチンを産生するために用いられる微結晶性セルロースは、Ceolus（登録商標）PH-F20JPまたはAvicel（登録商標）PH-105でありうる。

担体または完全なワクチンの粉末化粒子を定義する1つの様式は、平均粒子径に基づく。微結晶性セルロースおよび／またはワクチン粒子の平均粒子径は、当技術分野において任意の公知の手段、たとえば選別、篩い分け、またはレーザー回折によって測定されうる。担体（たとえば、微結晶性セルロース）および／またはワクチンの平均粒子径は、たとえば約10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、36μm、37μm、38μm、39μm、40μm、41μm、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm、55μm、56μm、57μm、58μm、59μm、60μm、61μm、62μm、63μm、64μm、65μm、66μm、67μm、68μm、69μm、70μm、71μm、72μm、73μm、74μm、75μm、76μm、77μm、78μm、79μm、80μm、81μm、82μm、83μm、84μm、85μm、86μm、87μm、88μm、89μm、90μm、91μm、92μm、93μm、94μm、95μm、96μm、97μm、98μm、99μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、または200μmでありうる。いくつかの態様において、本明細書において記述されるワクチン組成物の担体として用いられる微結晶性セルロースは、たとえばレーザー回折、篩い分け、または選別によって測定した場合に、25μm、39μm、または57μmの平均粒子径を有しうる。

担体（たとえば、微結晶性セルロース）および／またはワクチン粉末は、有用な粒子径分布を有するように調製されうる。担体および／またはワクチンの調製物は、たとえば10〜200μm、20〜200μm、30〜200μm、40〜200μm、50〜200μm、60〜200μm、70〜200μm、80〜200μm、90〜200μm、100〜200μm、110〜200μm、120〜200μm、130〜200μm、140〜200μm、150〜200μm、160〜200μm、170〜200μm、180〜200μm、190〜200μm、または含まれる任意の小範囲の粒子径分布を有しうる。本明細書において記述される粉末は、追加の粒子径分布を有する粒子径、たとえば10〜100μm、20〜100μm、30〜100μm、40〜100μm、50〜100μm、60〜100μm、70〜100μm、80〜100μm、90〜100μm、10〜50μm、10〜60μM、20〜60μm、30〜70μm、40〜80μm、50〜90μm、60〜100μm、70〜110μm、80〜120μm、90〜130μm、100〜140μm、110〜150μm、120〜160μm、130〜170μm、140〜180μm、150〜190μm、160〜200μm、または含まれる任意の小範囲の粒子径を有しうる。担体および／またはワクチンは、たとえば10〜50μm、11〜50μm、12〜50μm、13〜50μm、14〜50μm、15〜50μm、16〜50μm、17〜50μm、18〜50μm、19〜50μm、20〜50μm、21〜50μm、22〜50μm、23〜50μm、24〜50μm、25〜50μm、26〜50μm、27〜50μm、28〜50μm、29〜50μm、30〜50μm、または含まれる任意の小範囲の粒子径分布を有しうる。特定の態様において、担体および／またはワクチンは、19〜60μmの粒子径分布、または19〜50μmの粒子径分布を有しうる。

本明細書において記述されるワクチンの調製にとって有用な微結晶性セルロース粉末または他の担体化合物は、特定の物理的局面に関して明記されうる、または明記されなくてもよい。たとえば、微結晶性セルロース粉末は、肺を保護することができる、より大きい粒子を有するように明記されうる。微結晶性セルロース粉末は、免疫応答を増強することができる、より小さい粒子を有するように明記されうる。粉末の物理的特徴は、篩い分けによって明記されうるか、またはそうでなければ、たとえば約10μm未満、約20μm未満、約30μm未満、約40μm未満、約50μm未満、約60μm未満、約70μm未満、約80μm未満、約90μm未満、約100μm未満である粒子の存在を最小限にするように、および／または約20μmより大きい、約30μmより大きい、約40μmより大きい、約50μmより大きい、約60μmより大きい、約70μmより大きい、約80μmより大きい、約90μmより大きい、約100μmより大きい、約110μmより大きい、約120μmより大きい、約130μmより大きい、約140μmより大きい、約150μmより大きい、約160μmより大きい、約170μmより大きい、約180μmより大きい、約190μmより大きい、または約200μmより大きい粒子を最小限にするように処理されうる。

本明細書において記述される所望の結果（たとえば、免疫原性の増強）を達成するために変化させることができる粉末組成物の追加のパラメータは、粉末の比表面積である。たとえば、粉末組成物は、担体（たとえば、微結晶性セルロース）および／またはワクチンの比表面積が、1.0 m²/g、1.1 m²/g、1.2 m²/g、1.3 m²/g、1.4 m²/g、1.5 m²/g、1.6 m²/g、1.7 m²/g、1.8 m²/g、1.9 m²/g、2.0 m²/g、2.1 m²/g、2.2 m²/g、2.3 m²/g、2.4 m²/g、2.5 m²/g、2.6 m²/g、2.7 m²/g、2.8 m²/g、2.9 m²/g、3.0 m²/g、3.1 m²/g、3.2 m²/g、3.3 m²/g、3.4 m²/g、3.5 m²/g、3.6 m²/g、3.7 m²/g、3.8 m²/g、3.9 m²/g、4.0 m²/g、4.1 m²/g、4.2 m²/g、4.3 m²/g、4.4 m²/g、4.5 m²/g、4.6 m²/g、4.7 m²/g、4.8 m²/g、4.9 m²/g、5.0 m²/g、5.1 m²/g、5.2 m²/g、5.3 m²/g、5.4 m²/g、5.5 m²/g、5.6 m²/g、5.7 m²/g、5.8 m²/g、5.9 m²/g、6.0 m²/g、6.1 m²/g、6.2 m²/g、6.3 m²/g、6.4 m²/g、6.5 m²/g、6.6 m²/g、6.7 m²/g、6.8 m²/g、6.9 m²/g、7.0 m²/g、7.1 m²/g、7.2 m²/g、7.3 m²/g、7.4 m²/g、7.5 m²/g、7.6 m²/g、7.7 m²/g、7.8 m²/g、7.9 m²/g、8.0 m²/g、8.1 m²/g、8.2 m²/g、8.3 m²/g、8.4 m²/g、8.5 m²/g、8.6 m²/g、8.7 m²/g、8.8 m²/g、8.9 m²/g、9.0 m²/g、9.1 m²/g、9.2 m²/g、9.3 m²/g、9.4 m²/g、9.5 m²/g、9.6 m²/g、9.7 m²/g、9.8 m²/g、9.9 m²/g、10.0 m²/g、10.1 m²/g、10.2 m²/g、10.3 m²/g、10.4 m²/g、10.5 m²/g、10.6 m²/g、10.7 m²/g、10.8 m²/g、10.9 m²/g、11.0 m²/g、11.1 m²/g、11.2 m²/g、11.3 m²/g、11.4 m²/g、11.5 m²/g、11.6 m²/g、11.7 m²/g、11.8 m²/g、11.9 m²/g、12.0 m²/g、12.1 m²/g、12.2 m²/g、12.3 m²/g、12.4 m²/g、12.5 m²/g、12.6 m²/g、12.7 m²/g、12.8 m²/g、12.9 m²/g、13.0 m²/g、13.1 m²/g、13.2 m²/g、13.3 m²/g、13.4 m²/g、13.5 m²/g、13.6 m²/g、13.7 m²/g、13.8 m²/g、13.9 m²/g、14.0 m²/g、14.1 m²/g、14.2 m²/g、14.3 m²/g、14.4 m²/g、14.5 m²/g、14.6 m²/g、14.7 m²/g、14.8 m²/g、14.9 m²/g、15.0 m²/g、15.1 m²/g、15.2m²/g、15.3m²/g、15.4m²/g、15.5m²/g、15.6 m²/g、15.7 m²/g、15.8 m²/g、15.9 m²/g、16.0 m²/g、16.1 m²/g、16.2 m²/g、16.3 m²/g、16.4 m²/g、16.5 m²/g、16.6 m²/g、16.7 m²/g、16.8 m²/g、16.9 m²/g、17.0 m²/g、17.1 m²/g、17.2 m²/g、17.3 m²/g、17.4 m²/g、17.5 m²/g、17.6 m²/g、17.7 m²/g、17.8 m²/g、17.9 m²/g、18.0 m²/g、18.1 m²/g、18.2 m²/g、18.3 m²/g、18.4 m²/g、18.5 m²/g、18.6 m²/g、18.7 m²/g、18.8 m²/g、18.9 m²/g、19.0 m²/g、19.1 m²/g、19.2 m²/g、19.3 m²/g、19.4 m²/g、19.5 m²/g、19.6 m²/g、19.7 m²/g、19.8 m²/g、19.9 m²/g、または20.0 m²/gであるように調製されうる。粉末の比表面積は、たとえば約21 m²/g、22 m²/g、23 m²/g、24 m²/g、25 m²/g、26 m²/g、27 m²/g、28 m²/g、29 m²/g、30 m²/g、31 m²/g、32 m²/g、33 m²/g、34 m²/g、35 m²/g、36 m²/g、37 m²/g、38 m²/g、39 m²/g、40 m²/g、41 m²/g、42 m²/g、43 m²/g、44 m²/g、45 m²/g、46 m²/g、47 m²/g、48 m²/g、49 m²/g、または50 m²/gでありうる。特定の態様において、担体（たとえば、微結晶性セルロース）および／またはワクチン粉末の比表面積は、1.3 m²/gに等しいかもしくはそれ未満、1.3 m²/gに等しいかもしくはそれより上、または約2.3 m²/gでありうる。

粉末組成物（担体および／またはワクチン）を記述することができるさらにもう1つのパラメータは、かさ密度である。いくつかの態様において、用いられる粉末は、かさ密度範囲を有しうる。本発明の粉末は、たとえば0.10〜1.00 g/cm³、0.10〜0.90 g/cm³、0.10〜0.80 g/cm³、0.10〜0.70 g/cm³、0.10〜0.60 g/cm³、0.10〜0.50 g/cm³、0.10〜0.40 g/cm³、0.10〜0.30 g/cm³、0.20〜1.00 g/cm³、0.20〜0.90 g/cm³、0.20〜0.80 g/cm³、0.20〜0.70 g/cm³、0.20〜0.60 g/cm³、0.20〜0.50 g/cm³、0.20〜0.40 g/cm³、0.20〜0.30 g/cm³、0.30〜1.00 g/cm³、0.30〜0.90 g/cm³、0.30〜0.80 g/cm³、0.30〜0.70 g/cm³、0.30〜0.60 g/cm³、0.30〜0.50 g/cm³、0.30〜0.40 g/cm³、0.40〜1.00 g/cm³、0.40〜0.90 g/cm³、0.40〜0.80 g/cm³、0.40〜0.70 g/cm³、0.40〜0.60 g/cm³、0.40〜0.50 g/cm³、0.50〜1.00 g/cm³、0.50〜0.90 g/cm³、0.50〜0.80 g/cm³、0.50〜0.70 g/cm³、0.50〜0.60 g/cm³、0.60〜1.00 g/cm³、0.60〜0.90 g/cm³、0.60〜0.80 g/cm³、0.60〜0.70 g/cm³、0.70〜1.00 g/cm³、0.70〜0.90 g/cm³、0.70〜0.80 g/cm³、0.80〜1.00 g/cm³、0.80〜0.90 g/cm³、0.9〜1.0 g/cm³、または含まれる任意の小範囲のかさ密度を有しうる。特定の態様において、0.13〜2.9 g/cm³、または0.26〜0.48 g/cm³のかさ密度を有する担体（たとえば、微結晶性セルロース）および／またはワクチン粉末を用いることができる。他の態様において、粉末は、たとえば0.10 g/cm³、0.11 g/cm³、0.12 g/cm³、0.13 g/cm³、0.14 g/cm³、0.15 g/cm³、0.16 g/cm³、0.17 g/cm³、0.18 g/cm³、0.19 g/cm³、0.20 g/cm³、0.21 g/cm³、0.22 g/cm³、0.23 g/cm³、0.24 g/cm³、0.25 g/cm³、0.26 g/cm³、0.27 g/cm³、0.28 g/cm³、0.29 g/cm³、0.30 g/cm³、0.31 g/cm³、0.32 g/cm³、0.33 g/cm³、0.34 g/cm³、0.35 g/cm³、0.36 g/cm³、0.37 g/cm³、0.38 g/cm³、0.39 g/cm³、0.40 g/cm³、0.41 g/cm³、0.42 g/cm³、0.43 g/cm³、0.44 g/cm³、0.45 g/cm³、0.46 g/cm³、0.47 g/cm³、0.48 g/cm³、0.49 g/cm³、0.50 g/cm³、0.51 g/cm³、0.52 g/cm³、0.53 g/cm³、0.54 g/cm³、0.55 g/cm³、0.56 g/cm³、0.57 g/cm³、0.58 g/cm³、0.59 g/cm³、0.60 g/cm³、0.61 g/cm³、0.62 g/cm³、0.63 g/cm³、0.64 g/cm³、0.65 g/cm³、0.66 g/cm³、0.67 g/cm³、0.68 g/cm³、0.69 g/cm³、0.70 g/cm³、0.71 g/cm³、0.72 g/cm³、0.73 g/cm³、0.74 g/cm³、0.75 g/cm³、0.76 g/cm³、0.77 g/cm³、0.78 g/cm³、0.79 g/cm³、0.80 g/cm³、0.81 g/cm³、0.82 g/cm³、0.83 g/cm³、0.84 g/cm³、0.85 g/cm³、0.86 g/cm³、0.87 g/cm³、0.88 g/cm³、0.89 g/cm³、0.90 g/cm³、0.91 g/cm³、0.92 g/cm³、0.93 g/cm³、0.94 g/cm³、0.95 g/cm³、0.96 g/cm³、0.97 g/cm³、0.98 g/cm³、0.99 g/cm³、または1.00 g/cm³の特定のかさ密度を有しうる。いくつかの態様において、担体（たとえば、微結晶性セルロース）および／またはワクチン粉末は、0.23 g/cm³または0.41 g/cm³のかさ密度を有しうる。

微結晶性セルロースなどの担体は、乾燥ワクチン粉末製剤の質量の約25％から約98％を含みうる。いくつかの態様において、担体は、乾燥ワクチン粉末製剤のわずか約98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、または25％を含みうる。

本発明のワクチンにおいて有用であるもう1つの担体は、第三リン酸カルシウム（TCP）でありうる。TCPは、乾燥ワクチン粉末製剤の約0.5％から約5％を含みうる。TCPは、乾燥ワクチン粉末製剤のわずか約0.5％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、4％、または5％を含みうる。

担体は、混和することによって、たとえばボルテックスミキサーで混和することによって添加されうる。混和、たとえばボルテックスミキサーで混和する期間は、約30秒間から120分間、約30秒間から2分間、約30秒間から7.5分間、約20秒間から15分間、約30秒間から30分間、約30秒間から45分間、約30秒間から60分間、約30秒間から75分間、約30秒間から90分間、約30秒間から120分間でありうる。混和、たとえばボルテックスミキサーで混和する期間は、約30秒間、1分間、2分間、4分間、8分間、10分間、15分間、20分間、30分間、45分間、60分間、90分間、または120分間より長い時間でありうる。混和、たとえばボルテックスミキサーで混和する期間は、約30秒間、1分間、5分間、10分間、15分間、30分間、45分間、60分間、75分間、90分間、または120分間でありうる。

混和する際に、フリーズドライした抗原含有粉末と担体とを含む乾燥ワクチン製剤の粒子径は、関心対象の解剖学的部位に乾燥粉末ワクチンを送達するために適切な任意の大きさでありうる。加えて、粒子の大きさは異なる送達装置に合うように調整されうる。このように、本明細書の方法によって生成されたフリーズドライ抗原（たとえば、インフルエンザ）と担体（たとえば微結晶性セルロース）とを含有する乾燥粉末ワクチン製剤の平均粒子直径は、約10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm、31μm、32μm、33μm、34μm、35μm、36μm、37μm、38μm、39μm、40μm、41μm、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm、55μm、56μm、57μm、58μm、59μm、60μm、61μm、62μm、63μm、64μm、65μm、66μm、67μm、68μm、69μm、70μm、71μm、72μm、73μm、74μm、75μm、76μm、77μm、78μm、79μm、80μm、81μm、82μm、83μm、84μm、85μm、86μm、87μm、88μm、89μm、90μm、91μm、92μm、93μm、94μm、95μm、96μm、97μm、98μm、99μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、または200μm未満でありうる。

フリーズドライした抗原含有粉末と担体とを含む乾燥ワクチン製剤は、たとえば、10〜200μm、20〜200μm、30〜200μm、40〜200μm、50〜200μm、60〜200μm、70〜200μm、80〜200μm、90〜200μm、100〜200μm、110〜200μm、120〜200μm、130〜200μm、140〜200μm、150〜200μm、160〜200μm、170〜200μm、180〜200μm、190〜200μmの範囲の粒子径、または含まれる任意の小範囲の粒子径を有しうる。フリーズドライした抗原含有粉末と担体とを含む乾燥ワクチン製剤は、たとえば、10〜100μm、20〜100μm、30〜100μm、40〜100μm、50〜100μm、60〜100μm、70〜100μm、80〜100μm、90〜100μm、10〜50μm、20〜60μm、30〜70μm、40〜80μm、50〜90μm、60〜100μm、70〜110μm、80〜120μm、90〜130μm、100〜140μm、110〜150μm、120〜160μm、130〜170μm、140〜180μm、150〜190μm、160〜200μmの範囲の粒子径、または含まれる任意の小範囲の粒子径を有しうる。

フリーズドライした抗原含有粉末と担体とを含む乾燥ワクチン製剤は、篩い分けによって明記されうるか、またはそうでなければ、たとえば約10μm未満、約20μm未満、約30μm未満、約40μm未満、約50μm未満、約60μm未満、約70μm未満、約80μm未満、約90μm未満、約100μm未満である粒子を最小限にするように、および／または約20μmより大きい、約30μmより大きい、約40μmより大きい、約50μmより大きい、約60μmより大きい、約70μmより大きい、約80μmより大きい、約90μmより大きい、約100μmより大きい、約110μmより大きい、約120μmより大きい、約130μmより大きい、約140μmより大きい、約150μmより大きい、約160μmより大きい、約170μmより大きい、約180μmより大きい、約190μmより大きい、もしくは約200μmより大きい粒子を最小限にするように処理されうる。

V．安定性および吸湿性
本明細書において記述されるように調製した乾燥ワクチン粉末製剤は、室温（25℃で相対湿度60％）で少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36ヶ月間安定でありうる。乾燥ワクチン粉末製剤の安定性はまた、加速条件（45℃で相対湿度75％）でも長期間安定でありうる。加速条件では、乾燥ワクチン粉末製剤は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36ヶ月間安定でありうる。本明細書において記述されるように調製した乾燥ワクチン粉末製剤は、他の温度（たとえば、-20℃から55℃）および相対湿度（0％から100％）で安定でありうる。

本明細書において用いられる安定性は、貯蔵条件での乾燥ワクチン粉末のいくつかの局面を指しうる。そのような1つの局面は、ワクチンの効力、すなわちワクチンの抗原性成分の抗原性の保持である。たとえば、HAを含む乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤の安定性のこの局面は、HA抗原性を測定することによって決定されうる。ワクチン粉末は、特定の条件下で特定の時間（たとえば、加速条件で18ヶ月）の後、50％より大きい（最初の効力と比較して）抗原性を保持すれば安定であると見なされる。

または、安定性は、貯蔵条件下で乾燥粉末が環境水の取り込みに耐える能力を指すことができる。そのような水の取り込みによって、凝集塊の増加が起こりえて、それによって流動性の減少および生物学的利用率の減少などの望ましくない特性が起こりうる。

本明細書において記述される乾燥ワクチン粉末製剤は、低い吸湿性を有しうる。乾燥ワクチン粉末製剤の吸湿性は、乾燥ワクチン粉末製剤の重量を測定することによって経時的に測定することができる。重量の増加は、水の獲得を示している。吸湿性は、粉末を気密容器、非気密容器、または開放系で貯蔵した場合に、本発明の乾燥ワクチン粉末が吸収した水の量によって決定されうる。

VI．投与経路および投与手段
いくつかの態様において、装置は、対象の鼻孔に乾燥ワクチン粉末治療製剤の1回量の実質的な分画を送達するように構成されうる。いくつかの例において、装置を、装置内に存在する乾燥ワクチン粉末治療製剤のある量の実質的な分画を対象の鼻孔に送達するように構成してもよい。いくつかの例において、乾燥ワクチン粉末治療製剤またはその実質的な分画を、装置の1回作動後に送達してもよい。いくつかの例において、粉末治療製剤またはその実質的な分画は、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回作動などの装置の複数回の作動後に送達されうる。いくつかの例において、装置の複数回の作動が、装置の1回使用を構成してもよい。本明細書において記述される方法、装置、および組成物に従って、装置によって送達される乾燥ワクチン粉末治療製剤の実質的な分画は、1回量または装置に存在する量などの、乾燥粉末治療薬の量の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.9％、99.95％または100％を包含する。

提供される本発明の方法によって生成される乾燥ワクチン粉末製剤と共に用いるために適切な経鼻アプリケータは、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、係属中の米国特許出願第61/260,367号に記述されている。

VII．免疫に及ぼす乾燥粉末製剤の効果
提供される本発明の方法および組成物は、局所免疫応答を刺激するために用いられうる。局所免疫応答は、末梢リンパ組織での応答でありうる。たとえば、ワクチン乾燥粉末製剤を、粘膜免疫において役割を果たしうる粘膜隣接リンパ組織（MALT）を刺激するために鼻内に投与することができる。粘膜の例には、頬粘膜、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、鼻粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、気管支粘膜、子宮粘膜、内膜（子宮の粘膜）、および陰茎粘膜が挙げられる。特に、鼻咽頭隣接リンパ組織（NALT）を標的とすることができる。NALTはTヘルパー1およびTヘルパー2細胞、ならびにIgA前駆B細胞の生成において役割を果たすことができる。鼻内免疫によって、粘膜および全身の免疫区画の双方において抗原特異的防御免疫を誘導することができる。

提供される本発明の方法および組成物を用いて、粘膜免疫系の主な抗体である分泌型IgA（sIgA）の産生を刺激することができる（図6、7、9、11、12、および20）。sIgAは、2つまたは4つの単量体、J-鎖ポリペプチド、および分泌成分と呼ばれるポリペプチド鎖で構成される二量体または四量体である。J鎖ポリペプチドは、血清および分泌型IgAの双方の重合化を容易にすることができる。分泌成分は、粘膜の上皮細胞によって産生される70 kDaポリペプチドであり、粘膜分泌物中のタンパク質分解酵素に対するsIgAの感受性をより低くすることによって、sIgAを保護することができる。sIgAは、抗原試料採取のために計画される構築された粘膜リンパ臓器において最初に刺激された前駆体に由来する粘膜プラスマ細胞によって局所的に産生されうる。初回誘発後、前駆体細胞は、局所リンパ節、リンパ、および血液の中を通過して、粘膜部位に広く播種して、それによって投与部位（たとえば、経鼻投与）以外の粘膜部位での防御が起こる。局所プラスマ細胞から分泌された後、sIgAは上皮細胞表面受容体に結合することができ、複合体は、上皮細胞の中を分泌物まで通過することができ、そこで抗原の取り込みを阻害するための非催炎性の免疫学的障壁として役立ちうる。

粘膜（すなわち、sIgA）応答の刺激に加えて、本明細書において開示される乾燥粉末製剤はまた、IgG応答も刺激することができる（図6、7、9、11、12、14、17、および19）。そのような刺激によって、たとえば本明細書において開示されるワクチンによって誘導されるsIgAによって提供される防御を逃れるまたは回避する病原体に反応するように液性応答をプライミングすることによって、追加の防御層を得ることができる。このように、1つの態様において、本明細書において開示されるワクチンは、粘膜および液性抗体応答の双方を誘導することができる。

実施例1：不活性全H1N1乾燥ワクチン粉末製剤の調製および試験
本実施例において、季節性インフルエンザワクチン（H1N1）の様々な乾燥粉末製剤を生成して試験する。本発明の好ましい態様をまた、季節性インフルエンザワクチンの従来の液体経鼻製剤および注射製剤と比較して試験する。

実施例1A：非急速凍結技術を用いたインフルエンザワクチン（H1N1）粉末の調製
本実験において、様々な抗原安定化剤を、従来のフリーズドライプロセスにおいて用いてワクチン粉末を生成し、これをコンシステンシーおよび安定性に関して調べる。10 mLボトルにおいて、不活性全インフルエンザ（H1N1、A/Brisbane/59/2007株、The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute）の1.6 mg/mL溶液0.4 mLを、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩液（PBS、またはリン酸緩衝液）0.4 mL中で安定化剤（13.6 mg）と混合して、最終的な抗原対安定化剤比1：21を得る。混合物を-40℃で5時間かけて徐々に凍結する。凍結した組成物を4段階でフリーズドライする：-40℃、140 mtorr未満で24時間；-30℃、130 mtorr未満で24時間；-10℃、100 mtorr未満で4時間；および20C、50 mtorr未満で4時間。得られた凍結乾燥粉末は、インフルエンザワクチン粉末1 mgあたりインフルエンザワクチンタンパク質29μgを含有する。インフルエンザワクチン粉末を、比表面積が1.3 m²/gより大きい経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および第三リン酸カルシウム（TCP）（Ca₃(PO₄)₂）と混合（混和）する。インフルエンザワクチン粉末（49.3 mg、インフルエンザワクチンタンパク質1.44 mgを含む）を、Ceolus（登録商標）PH-F20JP微結晶性セルロース（平均粒子径：57μm；かさ密度：0.23 g/cm³；比表面積2.3 m²/g）309.1 mg、Ceolus（登録商標）PH-301微結晶性セルロース（平均粒子径：39μm；かさ密度：0.41 g/cm³）40.0 mg、およびTCP 1.6 mgと10 mLガラスボトル中で混和して、ボルテックスミキサーを用いて成分を1分間混和する。得られた乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤は、乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤25 mgあたりインフルエンザワクチンタンパク質90μgを含有する。1つの例において、トレハロースを安定化剤として用いると、部分的にケーキを形成するが安定なHA効力を有するインフルエンザワクチン粉末が生成される。もう1つの例において、マンニトールを安定化剤として用いると、微粒子を含むが不安定なHA効力を有するインフルエンザワクチン粉末が生成される。なおもう1つの例において、ラクトースを安定化剤として用いると、部分的にケーキを形成するが安定なHA効力を有するインフルエンザワクチン粉末が生成される（図1）。本実施例において、安定性は、フリーズドライ後に50％より大きいHA効力を保持するとして定義される；不安定とは、フリーズドライ後での50％に等しいまたはそれ未満のHA効力であり；結果を表1に要約する。製剤は、完全なHA効力および良好な流動性の双方を欠如することから、そのようなアプローチは、有効で完全に送達可能な経鼻ワクチンを産生するためには改善を必要とする。

（表１）非急速凍結技術によって生成されたインフルエンザ（H1N1）ワクチン粉末

実施例1B：急速凍結プロセスを用いる経鼻インフルエンザ（H1N1）ワクチン粉末の調製
本実験において、様々な安定化剤を急速凍結および乾燥プロセスにおいて用いてワクチン粉末を生成し、これをコンシステンシーおよび安定性に関して調べる。全般的製造プロセスを図2および3に概要する；H1N1経鼻ワクチン製剤の生成に関する具体的詳細を以下に提供する。10 mLボトルにおいて、不活性全インフルエンザ（H1N1、A/Brisbane/59/2007株）の1.6 mg/mL溶液0.4 mLを、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩液（PBS、またはリン酸緩衝液）0.4 mL中で安定化剤（13.6 mg）と混合して、最終的な抗原対安定化剤比1：21を得る。混合物を液体窒素中で10分間急速凍結して、インフルエンザ粉末を、4段階のフリーズドライプロセスによって生成する：-40℃、140 mtorr未満で24時間；-30℃、130 mtorr未満で24時間；-10℃、100 mtorr未満で4時間；および20C、50 mtorr未満で4時間。インフルエンザワクチン粉末1 mgあたりインフルエンザワクチンタンパク質29μgを含有する粉末は、微粒子を含み、室温で安定であるが、この場合、安定性は50％より大きいHA効力を保持するとして定義される（表2）。インフルエンザワクチン粉末を、比表面積が1.3 m²/gより大きい経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および第三リン酸カルシウム（TCP）（Ca₃(PO₄)₂）と混合（混和）する。インフルエンザワクチン粉末（49.3 mg、インフルエンザワクチンタンパク質1.44 mgおよびトレハロース30.60 mgを含む）を、Ceolus（登録商標）PH-F20JP微結晶性セルロース（平均粒子径：57μm；かさ密度：0.23 g/cm³；比表面積2.3 m²/g）309.1 mg、Ceolus（登録商標）PH-301微結晶性セルロース（平均粒子径：39μm；かさ密度：0.41 g/cm³）40.0 mg、およびTCP 1.6 mgと10 mLガラスボトル中で混合して、ボルテックスミキサーを用いて成分を1分間混和する。得られた乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤は、乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤25 mgあたりインフルエンザワクチンタンパク質90μgを含有する。1つの例において、トレハロースを抗原安定化剤として用いると、安定なHA効力および微粒子サイズを有する製剤が得られた。もう1つの例において、ラクトースを抗原安定化剤として用いると、同様に微粒子サイズからなる安定な製剤を生じた。マンニトールは、H1N1ワクチン粉末に関する抗原安定化剤として試験しなかった。

（表２）急速凍結技術によって生成されたインフルエンザ（H1N1）ワクチン粉末

実施例1C：経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験計画および結果
本実験において、乾燥粉末H1N1ワクチンが免疫応答を誘発できるか否かを試験して、従来の経鼻および注射液体製剤と比較する。急速凍結プロセスを用いてワクチンを調製して、前記で説明したように、微結晶性セルロース担体と混和する。各々の条件において、インフルエンザワクチンタンパク質（H1N1、A/Brisbane/59/2007株、不活性全インフルエンザワクチン）0.09 mgを、カニクイザルの4つの群に投与した。カニクイザルは、ヒトと類似の鼻腔の解剖学的構造および類似の免疫応答を有する。1群に、前記で概要した急速凍結プロセスによって調製し、インフルエンザワクチンタンパク質0.09 mg、トレハロース1.91 mg、Ceolus（登録商標）PH-F20JP 19.28 mg、Ceolus（登録商標）PH-301 2.50 mg、およびTCP 0.10 mgを含有する経鼻インフルエンザ（H1N1）ワクチン粉末製剤25 mgを投与した；2群には、インフルエンザワクチンタンパク質0.09 mgを含有する経鼻インフルエンザワクチン溶液0.1 mlを投与した；3群には、インフルエンザワクチンタンパク質0.09 mg、Tween 80 0.5μLと共にアジュバントα-ガラクトシルセラミド0.02 mgを含有する経鼻インフルエンザワクチン溶液0.1 mlを投与した；ならびに4群には、インフルエンザワクチンタンパク質0.09 mgを含有するSCインフルエンザワクチン溶液0.5 mLを投与した。図4に記述されるように、ワクチンを投与して、試料を採取した。抗体レベルを赤血球凝集阻害（HI）および酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって決定した。

血清および鼻洗浄液試料中の赤血球凝集阻害（HI）抗体力価を、以下のように決定した。試料を受容体破壊酵素（RDE、Denka Seiken Co. Ltd, Tokyo, Japan）によって、37℃で15〜18時間処置した後、56℃で1時間熱不活化した。試料の連続2倍希釈液を調製して、4赤血球凝集単位/ウェルの濃度でH1N1（A/Brisbane/59/2007株）HA抗原（Denka Seiken）と混合して、室温で1時間インキュベートした。各ウェルに、0.5％ニワトリ赤血球細胞浮遊液50μLを添加して、赤血球凝集を1時間後に評価した。赤血球凝集を阻害する試料の最高希釈が試料のHIタイトル（title）である。

この試験において採取した試料のHI試験の結果を図5AおよびBに示し、これらの表は、不活性全H1N1ウイルス（A/Brisbane/59/2007株）ワクチンの異なる製剤に曝露されたサルによって産生されたHI力価の表を含む。血清試料中で測定したHI力価を5Aに示す：鼻洗浄液試料中で測定したHI力価を5Bに示す。皮下注射ワクチン（4群）は、血清試料において最高のHI力価を生じた；しかし、鼻洗浄液試料ではHI力価の増加は検出されなかった。経鼻調製物の中で、不活性全経鼻インフルエンザ（H1N1、A/Brisbane/59/2007株）ワクチン粉末製剤は、血清および鼻洗浄液試料のいずれにおいても最高の力価を生じ、液体製剤に対して明確な改善を証明した。併せて考慮すると、これらの結果は、血清および鼻洗浄液HI力価の双方が試験群1において上昇したことを証明する。

血清および鼻洗浄液試料中での酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）抗体力価を、以下のように決定した。ELISAプレートに抗原を4℃で17時間コーティングして、洗浄し、ブロッキング溶液（リン酸緩衝液中での0.5％ウシ血清アルブミン）100μLによって室温で1時間ブロックした。洗浄後、試験試料の2倍連続希釈を0.5％BSAおよびPBS中で行って、希釈液をELISAプレートのウェルに加えた。37℃で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートヤギ抗サルIgGまたはHRPコンジュゲートヒツジ抗サル分泌成分検出抗血清と共に37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄して、o-フェニレンジアミン（OPD）と共に37℃で15分間インキュベートして、1 M硫酸（H₂SO₄）100μLの添加によって呈色反応を停止させた。試料を、ELISAリーダーにおいてOD492によって測定した。

本試験において採取した試料中で測定したELISA抗体力価の結果を図6および7に示す。図6AおよびBは、異なるインフルエンザワクチン製剤に曝露されたサルによって産生されたsIgA（5B）およびIgG（5A）抗体力価の表である。図7は、データのグラフ表示を提供し、試験した各動物（異なる動物を異なる線で示す）からの類似の結果を示している。SCインフルエンザワクチン溶液は、全ての試験物質の中で最も多くのIgGを産生した。経鼻インフルエンザ（H1N1、A/Brisbane/59/2007株）ワクチン粉末製剤は、全ての経鼻調製物の中で最も多くのIgGを産生した。経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤は、全ての試験物質の中で最も多くのsIgAを産生した。SC注射インフルエンザワクチンは、全ての試験物質の中で最も少ないsIgAを産生した。アジュバントを有する経鼻インフルエンザワクチン溶液は、アジュバントを添加したにもかかわらず、全ての経鼻調製物の中で最も少ないsIgAを産生した。

実施例1D：回復期でのHI、IgG、およびsIgA力価
実施例1Cから動物のサブセットを実験の終了後にモニターして、上昇した抗体力価が保持されるか否かを決定した。血清および鼻洗浄液試料を80日目（最後のワクチン接種後31日目）、101日目（ワクチン接種52日目）、および115日目（ワクチン接種後66日目）に得た。結果を図8および9に示す。図8は、HI力価の表を含む；図9は、IgGおよびsIgA力価の表を含む。抗体力価レベルは経鼻粉末製剤によって処置した動物において高レベルで保持された（図8および9、1群）。抗体力価レベルは、経鼻液体製剤によって処置した動物において、アジュバントを添加しなくとも（2群）またはアジュバントを添加しても（3群）、より低いレベルで保持された。液体製剤を注射した動物（4群）におけるIgGおよびHI力価レベルは、回復期間を通して顕著に減少した；sIgA抗体レベルは、ワクチン製剤の注射によって処置した動物では有意に上昇しなかった。

実施例1E：生存能／チャレンジ試験
本実施例において、インフルエンザワクチンがその後のチャレンジから動物を防御できるか否かを決定する。先の実験においてワクチン接種したサルの鼻へのチャレンジを、最後の免疫後3週間目に行う。動物に、胚含有鶏卵生育イヌインフルエンザ（A/Brisbane/59/2007 IVR-148）ウイルスをチャレンジする。各動物に、全体でウイルスおよそ10⁷ TCID₅₀を容積2 ml中で与える。偽チャレンジに関して、サルに、ウイルスを含まない尿膜液2 mlをチャレンジする。さらなる対照として、非ワクチン接種サル3匹に、ウイルス10⁷ TCID₅₀を曝露するか、またはウイルスを含まない尿膜液2 mlをチャレンジする。

各群からの動物を、体重、低体温、全身外観、および臨床症状に関して毎日モニターする。サルをインフルエンザ関連臨床徴候に関してチャレンジ後28日間観察する。サルには全て、標準飼料を与えて、水を自由に与える。調べた各群に関して、鼻スワブおよび血液試料を、初回チャレンジ後-7日目、3日目、7日目、14日目、および28日目に採取する。抗体力価（sIgAおよびIgG）を各動物に関して決定する。

実施例1F：乾燥ワクチン粉末製剤の安定性および吸湿性の決定
本実施例において、乾燥ワクチン粉末製剤の安定性および吸湿性を調べる。乾燥不活性全H1N1インフルエンザワクチン粉末製剤を、提供される本発明の方法によって生成する。ワクチン粉末製剤の安定性を45℃および20℃から25℃で試験する。試験される乾燥ワクチン粉末製剤を、密封ボトルおよび非密封容器の双方に貯蔵する。HA抗原性を決定することによって、安定性を測定する。

乾燥ワクチン粉末製剤の吸湿性は、試料の質量を経時的に決定することによって測定される。乾燥ワクチン粉末の吸湿安定性に及ぼす異なる環境条件の効果を決定するために、ワクチン粉末50 mgを様々な条件下で貯蔵する。乾燥ワクチン粉末の試料を気密条件下、密封容器中、および開放容器中で貯蔵する。試料の重量を月1回の間隔で6ヶ月間測定する。重量の増加は、水の獲得を示している。

6ヶ月より長く貯蔵したワクチン粉末製剤を、経鼻送達装置において試験する。装置から送達されるワクチン粉末製剤の百分率を決定して、新たに作製したワクチン粉末製剤の百分率と比較する。

実施例2：不活性全H5N1乾燥ワクチン粉末製剤の調製および試験
本実施例において、トリインフルエンザワクチン（H5N1）の様々な乾燥粉末製剤を生成して試験する。本発明の好ましい態様をまた、トリインフルエンザワクチンの従来の液体経鼻製剤および注射製剤と比較して試験する。

実施例2A：急速凍結プロセスを用いる経鼻インフルエンザ（H5N1）ワクチン粉末の調製
本実施例は、H5N1経鼻ワクチン粉末を生成するために急速凍結および乾燥プロセスにおいて用いるための最適な抗原安定化剤、および抗原対安定化剤の比率を決定するために行った。全般的製造プロセスを図2および3に概要する：H5N1経鼻ワクチン製剤の生成に関連する具体的詳細を以下に提供する。4つの抗原対安定化剤比を試験した（1：11、1：21、1：49、および1：101）；以下に引用した数値は、1：49比の製剤に対応する。10 mLボトルにおいて、不活性全H5N1ウイルス（A/Vietnam/1194/2004株、Sinovac Biotsch Ltd）を含有する0.526 mg/mL抗原溶液0.4 mLを、pH 7.2のリン酸緩衝液0.4 mL中で安定化剤（トレハロース、マンニトール、またはラクトース）10.4 mgと混合して、最終的な抗原対安定化剤比1：49を得た。混合物を液体窒素中で10分間急速に凍結して、インフルエンザ粉末を4段階のフリーズドライプロセスによって生成する：-40℃、140 mtorr未満で24時間；-30℃、130 mtorr未満で36時間；-10℃、100 mtorr未満で4時間；および20℃、50 mtorr未満で4時間。得られた粉末は、粉末1 mgあたり抗原11.2μgを含有する。インフルエンザワクチン粉末を、比表面積が1.3 m²/gより大きい経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および第三リン酸カルシウム（TCP）（Ca₃(PO₄)₂）と混合（混和）する。インフルエンザワクチン粉末（104 mg、インフルエンザワクチンタンパク質1.2 mgを含む）を、Ceolus（登録商標）PH-F20JP微結晶性セルロース（平均粒子径：57μm；かさ密度：0.23 g/cm³；比表面積2.3 m²/g）254.4 mg、Ceolus（登録商標）PH-301微結晶性セルロース（平均粒子径：39μm；かさ密度：0.41 g/cm³）40.0 mg、およびTCP 1.6 mgと10 mLガラスボトル中で混和して、ボルテックスミキサーを用いて成分を1分間混和する。得られた乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤は、乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤20 mgあたりインフルエンザワクチンタンパク質58.9μgを含有する。トレハロース、マンニトール、およびラクトースを安定化剤として用いると、1：21および1：49の抗原対安定化剤比で微粒子からなる安定な粉末を生じる。抗原対安定化剤比が1：101である場合、トレハロースおよびラクトース含有製剤はいずれもケーキを生じたが、安定な粉末を産生した；マンニトールは、抗原対安定化剤比1：101で微粒子からなる安定な粉末を生じた。トレハロース、マンニトール、およびラクトースを用いると、抗原対安定化剤比1：11では不安定な製剤を生じた。結果を表3に要約する。

（表３）急速凍結技術によって生成したインフルエンザ（H5N1）ワクチン粉末

実施例2B：経鼻インフルエンザワクチン粉末製剤の試験計画および結果
本実験において、乾燥粉末ワクチンがカニクイザルにおいて免疫応答を誘発できるか否かを調べて、従来の経鼻および注射液体製剤と比較した。カニクイザルは、ヒトと類似の鼻腔の解剖学的構造および類似の免疫応答を有する。乾燥粉末ワクチンを、急速凍結後のフリーズドライプロセスを用いて、不活化全H5N1（A/Vietnam/1194/2004株）抗原から調製し、前記の微結晶性セルロース担体と混和した。経鼻インフルエンザ（H5N1）ワクチン粉末製剤20 mg毎に、不活性全H5N1ウイルス58.9μgを、トレハロース2.9 mg、Ceolus（登録商標）PH-F20JP 12.7 mg、Ceolus（登録商標）PH-301 2.0 mg、および第三リン酸カルシウム0.08 mgと共に送達する。各条件において、H5N1抗原30μgを投与した。1群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末20 mgを投与した（総抗原30μg）；2群には、各鼻孔に経鼻インフルエンザスプレー0.15 mLを投与した（総抗原30μg）；および3群には、液体ワクチン0.3 mLを筋肉内注射（IM）によって投与した。ワクチンを投与して、図10のスケジュールに従って試料を採取した。試料を、実施例1に概要した方法に従って、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって試験した。

本試験において採取した試料中で測定したELISA抗体力価の結果を図11および12に示す。図11は、異なるインフルエンザワクチン製剤に曝露されたサルによって産生されたsIgA（11B）およびIgG（11A）の力価を提供する。図12は、異なる線によって示される異なる動物に関するデータのグラフ表示を提供する。液体製剤の注射にはよってワクチン接種した動物（3群）は、その試験における最高のIgG力価を生じた；しかし、この同じ群はほぼ検出不可能なsIgA抗体レベルを生じた。経鼻液体製剤を用いてワクチン接種した動物（2群）は、この実験において最低レベルのIgG抗体を産生した；この群はまた、低レベルのsIgA抗体を産生した。経鼻粉末製剤によってワクチン接種した動物（1群）は、経鼻ワクチンのIgG抗体の最高レベルを産生した；経鼻粉末製剤はまた、sIgA抗体レベルによって測定した場合に最高レベルの免疫応答を誘発した。これらの結果は、H5N1経鼻粉末ワクチン製剤によって処置した動物において、sIgAおよびIgG抗体力価の双方の上昇に成功したことを示している。

実施例2C：ストレス条件下での安定性試験の試験方法および結果
本実験において、実施例2Aに記述されるように調製した乾燥粉末H5N1ワクチン製剤の安定性を、ストレス条件に供して、H5N1経鼻インフルエンザスプレー製剤と比較する。カプセル化H5N1インフルエンザワクチン粉末を、60℃および相対湿度0％で貯蔵して、2および3週間の時点で調べた。2週間目では、粉末は微粒子からなった；しかし、3週間目では、粉末の部分的凝集が観察された。別の試験において、H5N1インフルエンザワクチン粉末を1回使用送達装置（Shin Nippon Biomedical Laboratory, LTD）に充填して、酸素および水分吸収乾燥剤（PharmaKeep KC-20, Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.）と共にアルミニウムキャニスター中で60℃および相対湿度75％で2週間貯蔵したところ、その後でも粉末はなおも微粒子からなった。なおもう1つの試験において、H5N1インフルエンザワクチン粉末をボトルに入れて、60℃および相対湿度0％で貯蔵して、HA効力を2および3週目の時点で調べた。いずれの時点においても、H5N1経鼻ワクチン粉末のHA効力は安定であった。HA効力のもう1つの試験において、H5N1インフルエンザワクチン粉末をボトルに入れて、酸素および水分吸収乾燥剤（PharmaKeep KC-20, Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.）と共に60℃および相対湿度75％で2週間貯蔵したところ、その後のHA効力は安定であると決定された。これらの結果を表4に要約する。H5N1経鼻粉末ワクチンとは対照的に、ポリプロピレンマイクロチューブに貯蔵したH5N1経鼻スプレーワクチンは、60℃で2週間後全てのHA効力を失った。このことは、経鼻粉末製剤では、上昇した温度での安定性の増加が達成されることを証明している。

（表４）H5N1インフルエンザワクチン粉末ストレス試験の結果

実施例3：3つのHAスプリット不活化株乾燥ワクチン粉末製剤の混合物の調製および試験
本実施例において、3つのスプリット不活化株の混合物（H1N1 A/California/7/2009、H3N2 A/Victoria/210/2009、およびB/Brisbane/60/2008−集合的に「三価HAインフルエンザ」）を含む経鼻粉末ワクチンの様々な乾燥粉末製剤を生成して試験する。

実施例3A：急速凍結プロセスを用いる三価HAインフルエンザワクチン粉末の調製
本実験は、三価のHAインフルエンザ経鼻ワクチン粉末を生成するために、急速凍結および乾燥プロセスにおいて用いるための最適な抗原安定化剤および抗原対安定化剤比を決定するために行った。全般的製造プロセスを図2および3に概要する；三価HAインフルエンザ経鼻ワクチン製剤の生成に関する具体的詳細を以下に提供する。4つの抗原対安定化剤比を試験した（1：26、1：56、1：111、および1：222）；以下に引用した数値は、1：111比の製剤に対応する。10 mLボトルにおいて、三価HAインフルエンザ（H1N1 A/California/7/2009、H3N2 A/Victoria/210/2009、およびB/Brisbane/60/2008、Denka Seiken Co Ltd）を含有する>0.09 mg/mLの抗原溶液0.6 mLを、超純水0.2 mL中で安定化剤（トレハロース、マンニトール、またはラクトース）6 mgと混合して、最終的な抗原対安定化剤比1：111を生じる。混合物を液体窒素中で10分間急速凍結して、インフルエンザ粉末を4段階フリーズドライプロセスによって生成する：-40℃、140 mtorr未満で24時間；-30℃、130 mtorr未満で36時間；-10℃、100 mtorr未満で4時間；および20℃、50 mtorr未満で4時間。得られた粉末は、粉末1 mgあたり4.6μgより多くの抗原を含有する。インフルエンザワクチン粉末を、比表面積が1.3 m²/gより大きい経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および第三リン酸カルシウム（TCP）（Ca₃(PO₄)₂）と混合（混和）する。インフルエンザワクチン粉末（97.75 mg、インフルエンザワクチンタンパク質0.45 mgを含む）を、Ceolus（登録商標）PH-F20JP微結晶性セルロース（平均粒子径：57μm；かさ密度：0.23 g/cm³；比表面積2.3 m²/g）350.2 mg、Ceolus（登録商標）PH-301微結晶性セルロース（平均粒子径：39μm；かさ密度：0.41 g/cm³）50.0 mg、およびTCP 2.0 mgと10 mLガラスボトル中で混和して、ボルテックスミキサーを用いて成分を1分間混和する。得られた乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤は、乾燥インフルエンザワクチン粉末製剤25 mgあたり45μgより多くのインフルエンザワクチンタンパク質を含有する。トレハロース、マンニトール、およびラクトースを抗原対安定化剤比1：26で用いる調製物は、微粒子からなる不安定な粉末を生じた。トレハロースおよびラクトース含有製剤はいずれも、抗原対安定化剤比1：56および1：111で微粒子サイズの安定な粉末を生じた；これらの比率では、安定化剤としてマンニトールを用いると、微粒子サイズの不安定なHA効力を生じた。抗原対安定化剤比1：222では、トレハロースおよびラクトース含有製剤はいずれも、安定なHA効力を有するケーキ状粉末を生じた；同じ比率で、マンニトール含有製剤は、微粒子からなる安定な粉末を産生した。結果を表5に要約する。

（表５）急速凍結技術によって生成された三価HAインフルエンザワクチン粉末

実施例3B：ストレス条件下での安定性試験の試験法および結果
本実験において、急速凍結プロセスを用いて調製して、微結晶性セルロース担体と混和した乾燥粉末三価HAインフルエンザワクチン製剤の安定性を、ストレス条件下で試験して、経鼻スプレー三価HAインフルエンザワクチン製剤と比較する。カプセル化三価HAインフルエンザワクチン粉末を60℃および相対湿度0％で貯蔵して、2および3週間の時点で調べた。2週間目では、粉末は微粒子からなった；しかし、3週間目では、粉末の部分的凝集が観察された。なおもう1つの試験において、三価HAインフルエンザワクチン粉末をボトルに入れて60℃および相対湿度0％で貯蔵して、2および3週間の時点でHA効力に関して調べた。いずれの時点においても、三価HA経鼻ワクチン粉末のHA効力は安定であった。これらの結果を表6に要約する。三価HA経鼻粉末ワクチンとは対照的に、ポリプロピレンマイクロチューブにおいて貯蔵した経鼻スプレー三価HA経鼻スプレーワクチンは、60℃で2週間後に全てのHA効力を失った。このことは、経鼻粉末製剤では、上昇した温度での安定性の増加が達成されることを証明している。

（表６）ボトル詰めした三価HAインフルエンザおよび粉末ワクチンのストレス試験の結果

実施例4：破傷風トキソイド（TTx）乾燥ワクチン粉末製剤の調製および試験
本実施例において、破傷風トキソイド（TTx）ワクチンの様々な乾燥粉末製剤を生成して試験する。本発明の好ましい態様をまた、TTxワクチンの従来の液体注射製剤と比較して試験する。

実施例4A：急速凍結プロセスを用いる破傷風トキソイドワクチン粉末の調製
本実験は、破傷風トキソイド経鼻ワクチン粉末を生成するため、急速凍結および乾燥プロセスにおいて用いるための最適な抗原安定化剤および抗原対安定化剤比を決定するために行った。全般的製造プロセスを図2および3に概要する；破傷風トキソイド経鼻ワクチン製剤の作製に関する具体的詳細を以下に提供する。5つの抗原対安定化剤比（1：26、1：53、1：111、1：231、および1：420より上）を試験した；以下に引用する数値は1：53比の製剤に対応する。10 mLボトルにおいて、0.08 mg/mL未満の吸着破傷風トキソイド抗原溶液（Denka Seken Co LTD）0.5 mLを、超純水0.3 mL中で安定化剤（トレハロース、マンニトール、またはラクトース）2.1 mgと混合して、最終的な抗原対安定化剤比1：53を生じた。混合物を液体窒素中で10分間急速に凍結して、抗原粉末を4段階フリーズドライプロセスによって生成する：-40℃、140 mtorr未満で24時間；-30℃、130 mtorr未満で36時間；-10℃、100 mtorr未満で4時間；および20℃、50 mtorr未満で4時間。得られた粉末は、粉末1 mgあたり抗原4.7μg未満を含有する。破傷風トキソイドワクチン粉末を、比表面積が1.3 m²/gより大きい経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および第三リン酸カルシウム（TCP）（Ca₃(PO₄)₂）と混合（混和）する。破傷風トキソイドワクチン粉末（8.54 mg未満、抗原タンパク質0.04 mg未満を含む）を、Ceolus（登録商標）PH-F20JP微結晶性セルロース（平均粒子径：57μm；かさ密度：0.23 g/cm³；比表面積2.3 m²/g）35.46 mg、Ceolus（登録商標）PH-301微結晶性セルロース（平均粒子径：39μm；かさ密度：0.41 g/cm³）5 mg、およびTCP 0.2 mgと10 mLガラスボトル中で混和して、ボルテックスミキサーを用いて成分を1分間混和する。得られた乾燥破傷風トキソイドワクチン粉末製剤は、総粉末25 mgあたり抗原タンパク質20μg未満を含有する。トレハロース、マンニトール、およびラクトースを用いると、抗原対安定化剤比1：26、1：53、1：105、および1：210で微粒子からなる抗原粉末を産生した。抗原対安定化剤比1：420では、3つ全ての安定化剤（トレハロース、マンニトール、およびラクトース）は、ケーキ状粉末を生じた。結果を表7に要約する。

（表７）急速凍結技術によって生成された破傷風トキソイドワクチン粉末

実施例4B：経鼻破傷風トキソイドワクチン粉末製剤の試験計画および結果
本実験において、破傷風トキソイド経鼻粉末ワクチンがカニクイザルにおいて免疫応答を誘発できるか否かを試験して、従来の注射液体製剤と比較する。カニクイザルは、ヒトと類似の鼻腔の解剖学的構造および類似の免疫応答を有する。急速凍結後のフリーズドライプロセスを用いて、吸着破傷風トキソイド抗原から乾燥粉末ワクチンを調製して、これを実施例4Aに記述される微結晶性セルロース担体と混和する。経鼻破傷風トキソイドワクチン粉末製剤25 mgあたり、吸着破傷風トキソイド抗原2.5 Lfをトレハロース1.1 mg、Ceolus（登録商標）PH-F20JP 17.9 mg、Ceolus（登録商標）PH-301 2.6 mg、および第三リン酸カルシウム0.1 mgと共に送達する。複数の投与レベルを比較する。1群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末25 mgを投与する（5 Lf用量）；2群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末25 mgを2回投与する（10 Lf用量）；3群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末25 mgを4回投与する（20 Lf用量）；および4群には、液体ワクチン2.0 mLを皮下注射によって投与する（10 Lf用量）。ワクチンを投与して、試料を図13のスケジュールに従って採取する。試料を、実施例1に概要される方法に従って、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）および酵素結合免疫吸着スポット（ELISpot）によって試験する。

ELISpotアッセイを以下のように行った。非コンジュゲートマウス抗ヒト／サルインターフェロン-γ（IFN-γ）モノクローナル抗体、クローンGZ-4（15μg/mL、MabTech, Sweden）をマルチスクリーンプレート（Millipore, USA）に加えて、4℃で終夜インキュベートした。翌日、プレートをAIM-V（Life Technologies, USA）完全培地によってブロックした。サル全血から分離した末梢血単核球細胞（PBMC）4×10⁵個および吸収破傷風トキソイド25 mLを加えて、プレートを37℃で24時間インキュベートした。ウェルをPBSによって洗浄して、1μg/mLビオチニル化マウス抗ヒトIFN-γモノクローナル抗体、クローン7-B6-1（MabTech）を加えた。室温で2時間インキュベートした後、ウェルをPBSによって洗浄した。1：1000倍希釈したストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（MabTech）を加えた。室温で1時間インキュベートした後、ウェルをPBSによって洗浄した。染色は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT-plus基質）（Moss, USA）を用いて行った。プレートを乾燥させて、各ウェルにおけるスポット数を-から++の尺度で評価した。

本試験において採取した試料中で測定した抗体力価を図14および15に示す。図14Aは、異なるインフルエンザワクチン製剤に曝露されたサルによって産生された血清中IgGの吸光度比を提供する；図14Bは、それらの同じ結果のグラフ表示である。図15は、採取した血清試料のELISpot試験の結果を表にしている。図15でのスコアは以下のとおりである：（-）は、陰性対象レベルを示し、（+/-）は低レベルを示し、（+）は中等度のレベルを示し、および（++）は高レベルを示す。ELISAおよびELISpot試験の双方において、TTxワクチンの注射液体製剤は、最大の免疫応答を生じた。経鼻粉末の20 Lf用量は、ELISAによって測定した場合に試験のあいだのIgG抗体力価の検出可能な増加を誘導した。ELISpot測定は、TTx経鼻粉末ワクチンの3つ全ての用量が、用量依存的な免疫応答を生じることができることを示した。

実施例5：ジフテリアトキソイド（DTx）乾燥ワクチン粉末製剤の調製および試験
本実施例において、ジフテリアトキソイドワクチンの様々な乾燥粉末製剤を生成して、試験する。本発明の好ましい態様をまた、ジフテリアトキソイドワクチンの従来の液体注射製剤と比較して試験する。処理の際のジフテリアトキソイド抗原の安定性を試験するために、前記で詳述した急速凍結およびフリーズドライプロセスによって産生された抗原粉末を、液体製剤中で再水和した。この製剤を、以下で再構成粉末と呼ぶ。

実施例5A：急速凍結プロセスを用いるジフテリアトキソイドワクチン粉末の調製
本実験は、ジフテリアトキソイド経鼻ワクチン粉末を作製するために、急速凍結および乾燥プロセスにおいて用いるための最適な抗原安定化剤、および抗原対安定化剤比を決定するために行った。全般的製造プロセスを図2および3に概要し；ジフテリアトキソイド経鼻ワクチン製剤の生成に関する具体的詳細を以下に提供する。5つの抗原対安定化剤比（2.5 Lf：1.1 mg、2.5 Lf：2.1 mg、2.5 Lf：4.2 mg、2.5 Lf：8.4 mg；および2.5 Lf：16.8 mg）を試験した；以下に引用される数値は2.5 Lf：2.1 mg比の製剤に対応する。10 mLボトルにおいて、5 Lf/mL吸着ジフテリアトキソイド抗原溶液（DTx,Research Institute for Microbial Disease, Osaka University）を、超純水0.3 mL中で安定化剤（トレハロース、マンニトール、またはラクトース）2.1 mgと混合して、最終的な抗原対安定化剤比2.5 Lf：2.1 mgを生じる。混合物を液体窒素中で10分間急速凍結して、抗原粉末を4段階のフリーズドライプロセスによって生成する：-40℃、140 mtorr未満で24時間；-30℃、130 mtorr未満で36時間；-10℃、100 mtorr未満で4時間；および20℃、50 mtorr未満で4時間。得られた粉末は、粉末1 mgあたり抗原0.28 Lf未満を含有する。ジフテリアトキソイドワクチン粉末を、比表面積が1.3 m²/gより大きい経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および第三リン酸カルシウム（TCP）（Ca₃(PO₄)₂）と混合（混和）する。ジフテリアトキソイドワクチン粉末（1 mg、抗原タンパク質0.28 Lf未満を含む）を、Ceolus（登録商標）PH-F20JP微結晶性セルロース（平均粒子径：57μm；かさ密度：0.23 g/cm³；比表面積2.3 m²/g）35.96 mg、Ceolus（登録商標）PH-301微結晶性セルロース（平均粒子径：39μm；かさ密度：0.41 g/cm³）5 mg、およびTCP 0.2 mgと10 mLガラスボトル中で混和して、ボルテックスミキサーを用いて成分を1分間混和する。得られた乾燥ジフテリアワクチン粉末製剤は、総粉末25 mgあたり抗原タンパク質1.25 Lf未満を含有する。結果を表8に要約する。トレハロース、マンニトール、またはラクトースを用いると、抗原対安定化剤比2.5 Lf：1.1 mg、2.5 Lf：2.1 mg、2.5 Lf：4.2 mg、および2.5 Lf：8.4 mgで微粒子からなる粉末を生成した。抗原対安定化剤比2.5 Lf：16.8 mgでは、用いた3つ全ての安定化剤が、このプロセスを用いてケーキ状粉末を生成した。

（表８）急速凍結技術によって生成されたジフテリアトキソイドワクチン粉末

実施例5B：経鼻ジフテリアトキソイドワクチン粉末製剤の試験計画および結果
本実験において、ジフテリアトキソイド経鼻粉末ワクチンがカニクイザルにおいて免疫応答を誘発できるか否かを調べて、従来の注射液体製剤および再構成粉末製剤と比較する。カニクイザルは、ヒトと類似の鼻腔の解剖学的構造および類似の免疫応答を有する。急速凍結後のフリーズドライプロセスを用いて、吸着ジフテリアトキソイド抗原から乾燥粉末ワクチンを調製して、これを前記の微結晶性セルロース担体と混和した。経鼻ジフテリアトキソイドワクチン粉末製剤25 mgあたり、ジフテリアトキソイド抗原1.25 Lfを、トレハロース1.1 mg、Ceolus（登録商標）PH-F20JP 21.3 mg、Ceolus（登録商標）PH-301 3.0 mg、および第三リン酸カルシウム0.12 mgと共に送達する。1群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末25 mg（2.5 Lf用量）を投与した；2群には、液体ワクチン1.0 mL（5 Lf用量）を皮下注射によって投与した；および3群には、再構成した粉末ワクチン1.0 mL（5 Lf用量）を皮下注射によって投与した。ワクチンを投与して、試料を図16のスケジュールに従って採取する。試料を、実施例1に概要される方法に従って、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって試験した。

本実験において測定した抗体力価を図17に示す。図17Aは、血清中IgGの吸光度比の表である；17Bは、17Aのデータの棒グラフ（上段）および折れ線グラフ（下段）である。再構成した粉末製剤および従来の注射液体製剤は、血清中IgGレベルの増加の誘導に成功した。経鼻粉末製剤もまた、注射製剤の用量の半分を投与したにもかかわらず、IgG抗体力価の増加に成功した。併せて考慮すると、これらの結果は、本明細書において開示される急速フリーズドライ方法論が、動物においてジフテリアトキソイドワクチンの効力を保存することを示している。

実施例6：卵白アルブミン乾燥ワクチン粉末製剤の調製および試験
本実施例において、卵白アルブミン（OVA、SIGMA A5503-IG）の乾燥粉末製剤を生成して、カニクイザルにおいて免疫応答を誘発できるか否かを試験する。経鼻投与乾燥ワクチン粉末製剤を従来の経鼻製剤および注射液体製剤と比較する。結果は、本明細書において記述される製剤を用いる例示的なタンパク質抗原の経鼻投与が動物において免疫応答を誘発できることを証明している。

実施例6A：卵白アルブミン乾燥ワクチン粉末の調製
ホモジナイズした卵白アルブミン（hOVA）経鼻粉末の3つの製剤を、異なる量のhOVAを、比表面積が1.3 m²/gより大きい経鼻担体（たとえば、微結晶性セルロース）および第三リン酸カルシウム（TCP）（Ca₃(PO₄)₂）と混和することによって生成する。hOVAは粉末型で提供されることから、急速凍結後のフリーズドライ段階は必要でなかった。製剤1において、hOVA粉末13.3 mgを、Ceolus PH-F20JP 354.1 mg、Ceolus PH-301 40 mg、および第三リン酸カルシウム（TCP）1.6 mgと10 mLボトル中で混合して、ボルテックスミキサーを用いて1分間混和する。得られた混合物は、粉末製剤30 mgあたり抗原1 mgを含有する。製剤2において、hOVA粉末66.7 mgを、Ceolus PH-F20JP 291.7 mg、Ceolus PH-301 40 mg、および第三リン酸カルシウム（TCP）1.6 mgと10 mLボトル中で混合して、ボルテックスミキサーを用いて1分間混和する。得られた混合物は、粉末製剤30 mgあたり抗原5 mgを含有する。製剤3において、hOVA粉末200 mgを、Ceolus PH-F20JP 158.4 mg、Ceolus PH-301 40 mg、および第三リン酸カルシウム（TCP）1.6 mgと10 mLボトル中で混合して、ボルテックスミキサーを用いて1分間混和する。得られた混合物は、粉末製剤30 mgあたり抗原15 mgを含有する。

実施例6B：経鼻卵白アルブミンワクチン粉末製剤の試験計画および結果
本実験において、卵白アルブミン経鼻粉末ワクチンがカニクイザルにおいて免疫応答を誘発できるか否かを試験して、hOVAをリン酸緩衝液に溶解する従来の注射および経鼻液体製剤と比較する。カニクイザルは、ヒトと類似の鼻腔の解剖学的構造および類似の免疫応答を有する。乾燥粉末ワクチンを、ホモジナイズした卵白アルブミン粉末から調製して、これを前記の賦形剤と混和した。1群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末製剤1の30 mg（2 mg用量）を投与した；2群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末製剤2の30 mg（10 mg用量）を投与した；3群には、各鼻孔に経鼻ワクチン粉末製剤3の30 mg（30 mg用量）を投与した；4群には、各鼻孔に液体ワクチン0.1 mL（20 mg用量）を投与した；5群には、各鼻孔に液体ワクチン0.1 mL（30 mg用量）を投与した；6群には、液体ワクチン1.0 mL（20 mg用量）を皮下注射によって投与した；および7群には、液体ワクチン1.0 mL（30 mg用量）を皮下注射によって投与した。ワクチンを投与して、試料を図18のスケジュールに従って採取した。試料を、実施例1に概要した方法に従って、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によって試験した。

本実験の際に採取した血清試料中で測定したIgG抗体力価を図19に示す。図19Aは、IgG抗体力価の表である；19Bは、19Aのデータの棒グラフ（上段）および折れ線グラフ（下段）表示である。経鼻粉末製剤および注射液体製剤はいずれも、類似の高レベルまで免疫応答を誘発することが可能であった；しかし、最高力価は、経鼻粉末製剤によって処置した動物においてより初期の時点で検出された。経鼻液体製剤は、IgG抗体力価によって測定した場合に検出可能な免疫応答を誘発することができなかった。本実験の際に採取したこの血清試料中で測定したsIgA抗体力価を図20に示す。図20Aは、sIgA抗体力価の表であり；20Bは20Aのデータの棒グラフ（上段）および折れ線グラフ（下段）表示である。sIgA抗体力価によって測定した場合、経鼻粉末製剤のみが検出可能な免疫応答を誘発することができた。sIgA力価の増加は、経鼻液体または注射液体製剤のいずれをワクチン接種した動物においても検出されなかった。併せると、これらの結果は、本明細書において記述される経鼻粉末製剤が、例示的なタンパク質抗原を用いて動物において粘膜および全身免疫原性の双方を誘発できることを示唆している。

本発明の好ましい態様を、本明細書において示して記述してきたが、そのような態様は、単なる例として提供されるに過ぎないことは当業者に明らかであろう。多数の変更、変化、および置換が当業者に想起されるが、それらも本発明に含まれるであろう。本明細書において記述される本発明の態様に対する様々な代替を、本発明の実践において使用してもよいと理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義して、これらの特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造がそれによって範囲に含まれると意図される。

Claims (18)

1. 以下の段階を含む、鼻内乾燥ワクチン粉末製剤を生成する方法：
   a．1つまたは複数の抗原および1つまたは複数の糖類を含む液体製剤を調製する段階；
   b．液体製剤を急速凍結して、粉砕工程なしで５〜１００μｍの平均粒子直径を有するフリーズドライした粉末を形成する段階であって、急速凍結が噴霧凍結することを含まない、段階；
   c．フリーズドライした粉末を1つまたは複数の賦形剤と混和して、鼻内乾燥ワクチン粉末製剤を生成する段階。
2. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがウイルス抗原である、請求項1記載の方法。
3. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つがインフルエンザウイルスである、請求項1記載の方法。
4. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、H1N1インフルエンザウイルスである、請求項1記載の方法。
5. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、H5N1インフルエンザウイルスである、請求項1記載の方法。
6. 1つまたは複数の抗原の少なくとも一つが、H1N1インフルエンザウイルス、H3N2インフルエンザウイルス、またはB型インフルエンザウイルスを含む、請求項1記載の方法。
7. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、弱毒化生ウイルス、不活化全ウイルス、スプリットウイルス、サブユニット抗原、ウィロゾーム、または低温馴化生インフルエンザウイルスである、請求項1記載の方法。
8. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが細菌抗原である、請求項1記載の方法。
9. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、全菌体死菌、弱毒化細菌、トキソイド、精製表面タンパク質、または精製組み換え型表面タンパク質である、請求項1記載の方法。
10. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、破傷風トキソイドである、請求項1記載の方法。
11. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、ジフテリアトキソイドである、請求項1記載の方法。
12. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、原生生物抗原である、請求項1記載の方法。
13. 1つまたは複数の抗原の少なくとも1つが、タンパク質である、請求項1記載の方法。
14. 1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがラクトースである、請求項１記載の方法。
15. 1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがトレハロースである、請求項１記載の方法。
16. 1つまたは複数の糖類の少なくとも1つがマンニトールである、請求項１記載の方法。
17. 液体製剤を調製する段階が、1つまたは複数の緩衝剤を添加する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
18. 1つまたは複数の緩衝剤の少なくとも1つが、リン酸緩衝剤である、請求項17記載の方法。

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