BRPI0616879A2 - formulação de vacina sólida - Google Patents

Abstract

FORMULAçãO DE VACINA SóLIDA. A invenção refere-se a uma formulação de vacina sólida adaptada para a administração através da mucosa contendo pelo menos um antigeno como substância ativa, no qual a formulação contém um liofilisato de uma suspensão contendo um saí metálico oxigenado, o (s) antígeno (s) e um ou mais excipientes selecionados dentre (i) sacarídeos, (ii) álcoois de açúcar e (iii) aminoácidos ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÃO DE VACINA SÓLIDA".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a uma formulação de vacina sóli-da adaptada para a administração via mucosa, contendo pelo menos umantígeno na condição de substância ativa, na qual a formulação contém umIiofilisato de uma suspensão contendo um sal metálico oxigenado, o(s) antí-geno(s) e pelo menos um excipiente selecionado dentre (i) sacarídeos, (ii)álcoois de açúcar e (iii) aminoácidos ou sais farmaceuticamente aceitáveisdos mesmos. A invenção também refere-se à utilização de um Iiofilisato con-forme acima descrito para a preparação de uma formulação de vacina sólidapara administração via mucosa e ao uso de tal formulação para a vacinação outratamento de alergia ou para o alívio dos sintomas de alergia em um sujeito.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A trealose é um dissacarídeo não redutor que consiste em doismonômeros de glicose. Ela está presente em um número de organismos,incluindo bactérias, fungos e vertebrados, assim como algumas plantas. Sa-be-se que a trealose estabiliza proteínas.

A US-A-4 578 270 descreve um método de preparo de uma va-cina liofilizada, no qual uma mistura de um antígeno absorvido em um carre-ador insolúvel, tal como o hidróxido de alumínio e o fosfato de alumínio gel, eum agente protetor é submetida à liofilização. O agente protetor pode, porexemplo, ser uma proteína, um polipeptídeo, um polissacarídeo e outros co-loides protetores sintéticos. São utilizados, especificamente, dextrano compeso molecular de 40.000 e uma combinação de dextrano com polissacarí-deos. O agente protetor é utilizado em uma quantidade de 0,5 a 10% da so-lução do antígeno. Durante a aplicação a vacina liofilizada é reconstituídacom um tampão.

A US-A-5 902 565 descreve um método de preparo de uma for-mulação de vacina na forma de partículas microesféricas secas, a qual podesubseqüentemente ser incorporada a uma formulação líquida ou a um péleteou implante sólido. A natureza formadora de gels dos gels de alumínio épreservada inteiramente. Um aspecto da US-A-5 902 565 refere-se a ummétodo de produção de uma vacina de liberação imediata conten-do/formando uma suspensão aquosa de imunógenos adsorvidos em um ad-juvante de sal de alumínio e de secagem por spray da suspensão. Opcio-nalmente, a suspensão contém um estabilizante proteico, tal como açúcarese derivados de açúcares, como, por exemplo, a trealose, a dextrose e a gli-cosamina.

A EP-B1-0 130 619 descreve um método de preparo de umaformulação de vacina Iiofilisada com um antígeno da superfície do vírus dahepatite B purificado e inativado contendo/somado a um alum gelínio e umestabilizante para o antígeno e de liofilização da mistura. O estabilizante po-de ser um aminoácido, uma substância coloidal ou polissacarídeos, tais co-mo monossacarídeos dissacarídeos, como, por exemplo, a lactose, a malto-se e a sacarose, e álcoois de açúcar.

Gribbon et al. (Dev Biol Stand. Basel, Karger, 1996, vol 87, pp.193-199) descrevem um estudo da estabilização de vacinas usando a trea-lose como estabilizante. Uma formulação comercial de uma vacina com an-tígenos para a difteria e tétano adjuvada com alum foi misturada à trealose ea mistura foi submetida à liofilização para se obter um pó seco. O pó foi ar-mazenado a 45°C por mais de 35 semanas, e a atividade do toxoide tetânicoreconstituído foi mensurada. Depois das 35 semanas a atividade recuperadafoi de 94% em comparação a correspondente nos controles úmidos frescos.Mais além, o efeito protetor e estabilizante da trealose foi comparado ao daglicose e da sacarose, tendo sido verificado que a trealose foi mais eficaz.

Maa et al. (Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 92, No.2,fevereiro de 2003) apresentam um estudo sobre a estabilização de uma for-mulação de vacina em pó seco adjuvada com alum contendo antígenos dasuperfície do vírus da hepatite B ou toxoides tetânicos e diftéricos. Foramtestadas várias técnicas de secagem e foi verificado que a secagem por pul-verização a frio foi superior à secagem a frio, à secagem por pulverização eà secagem por ar na prevenção da coagulação do alum gel e na retenção daimunogenicidade. Também foi testado o efeito de uma série de estabilizan-tes na prevenção da coagulação do alum gel, tendo sido verificado que oefeito foi apenas modesto.

Maa et al. (Pharmaceutical Research, Vol. 20, N°. 7, julho de2003) descrevem um processo de secagem por pulverização a frio para aprodução de vacina Iiofilizada de antígenos da superfície do vírus da hepatiteB adsorvida em alum, no qual uma combinação de trealose, manitol e dex-trano, preferencialmente em uma proporção de 3/3/4, é utilizada como estabili-zante. O artigo descreve a imunização por pó de administração epidérmica (EPI- epidermal powder immuization) e não sugere a administração pela mucosa.

O WO 02/101412 descreve um processo para a preparação deum pó, no qual uma solução ou suspensão é pulverizada a frio. A soluçãoaquosa tem um conteúdo sólido de até 20% do peso e contém um ou maisexcipientes selecionados dentre 1) adjuvantes de sais de alumínio ou sais decálcio, 2) excipientes amorfos, como, por exemplo, a trealose, 3) excipientescristalinos, como, por exemplo, o manitol, e 4) polímeros, como, por exem-plo, dextrano. São mencionadas várias composições de antígenos adjuva-dos por alum, incluindo combinações de (a) trealose, manitol e dextrano, e(b) trealose, glicina e dextrano. O pó é descrito como sendo útil para a admi-nistração através de uma seringa sem agulha.

O WO 01/93829 está relacionada a um pó fluido que forma umgel apropriado para o uso em vacinas, o qual é preparado através de seca-gem por pulverização ou secagem por pulverização a frio de uma suspensãoaquosa contendo um antígeno adsorvido à um adjuvante de sal de alumínioou sal de cálcio, um sacarídeo, um aminoácido ou um sal do mesmo, e umasubstância coloidal. Diz-se do pó que é útil para a aplicação transdérmica devacinas utilizando seringas sem agulha.

O WO 95/33488 descreve um método para a redução ou pre-venção da agregação durante a desidratação e reidratação de uma substân-cia, tal como o hidróxido de alumínio e o fosfato de alumínio. O documentoapresenta um estudo do efeito da trealose sobre à agregação do fosfato dealumínio, no qual uma suspensão de fosfato de alumínio na presença ouausência de trealose a 15% é submetida à a.i. secagem a frio. Foi verificadoque, nesta concentração, a trealose preveniu a agregação durante a reidratação.

Formulações de Vacina

A vacinação convencional contra alergias específicas é realizadautilizando múltiplas imunizações subcutâneas aplicadas ao longo de um pe-ríodo prolongado de tempo. O curso é dividido em duas fases, a fase de ele-vação da dose e a de manutenção. Na fase de elevação da dose são aplica-das doses cada vez maiores, tipicamente ao longo de um período de 16 se-manas, começando com doses diminutas. Quando se alcança a dose demanutenção recomendada, esta dose é aplicada ao longo da fase de manu-tenção, tipicamente com injeções de 6 em 6 semanas. Os pacientes devempermanecer sob supervisão médica por 30 minutos depois de cada injeçãodevido ao risco de reações colaterais anafiláticas, as quais, a princípio, embo-ra extremamente raras, podem oferecer risco de vida. Em acréscimo, a clínicadeve estar equipada para oferecer atendimento de emergência. Não há qual-quer dúvida de que uma vacina baseada em uma via diferente de administra-ção eliminaria ou reduziria o risco de reações colaterais alérgicas normais àvacinação subcutânea, assim como facilitaria a maior disseminação de suautilização, possivelmente tornando possível a autovacinação em casa.

Nas vacinas antialérgicas convencionais de administração sub-cutânea, o alérgeno tipicamente está presente em uma suspensão de gel dehidróxido de alumínio servindo como um adjuvante. Os mecanismos por trásdo funcionamento do hidróxido de alumínio como adjuvante não são plena-mente compreendidos, porém acredita-se que o efeito adjuvante do hidróxi-do de alumínio se deva a um efeito "de depósito" consequentemente facili-tando uma liberação prolongada do alérgeno no corpo.

As formulações de vacinas baseadas em hidróxido de alumíniopossuem a disvantagem de requererem refrigeração durante o armazena-mento e transporte. Além disso, o congelamento e a liofilização reduzem apotência e as propriedades físicas, tais como a sedimentação, a velocidadee a fluidez das formulações de vacinas.

O WO 04/047794 descreve uma forma de dosagem para umavacina com alérgenos sólidos não prensados de rápida dissolução adequadapara a administração oromucosal de um alérgeno contendo um alérgenocomo agente ativo e uma matriz composta de um agente formador de matriz,tal como, gelatinas e gomas.

O WO 00/45847 sugere uma vacina para a administração deuma substância imunogênica através de uma membrana mucosa contendopelo menos uma substância imunogênica e um sistema de administração viamucosa contendo um sal metálico oxigenado. Nos exemplos desta aplica-ção, as vacinas são administradas por gavagem oral (diretamente para oestômago) ou intraperitonialmente como soluções. Desta forma, não há e-xemplos descrevendo uma formulação sólida para administração via muco-sa, tal como administração sublinmgual.

A EP 1 516 615 está relacionada a uma formulação sólida naforma de filme ou pastilha mucoadesiva para a administração transmucosaem que a pastilha ou filme e formado a partir de um poliol e um agente tera-pêutico dissolvido ou disperso no mesmo. O poliol pode, por exemplo, ser atrealose, enquanto o agente terapêutico pode ser um antígeno e adjuvantes.Esta aplicação não sugere uma formulação de vacina sólida que contenhaum liofilisato de uma suspensão aquosa de um sal metálico oxigenado, umantígeno e um ou mais excipientes, menos ainda, sugere uma formulação devacina contendo um Iiofilisato de uma suspensão aquosa contendo alérge-nos, hidróxido de alumínio e um ou mais excipientes.

A US 5,591,433 está relacionada a uma formulação oral conten-do alérgenos microencapsulados em uma revestimento entérico.

O objetivo da presente invenção é oferecer uma formulação a-perfeiçoada de vacina sólida para a administração via mucosa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma formulação de vacina sóli-da contendo um Iiofilisato de uma suspensão contendo um sal metálico oxi-genado, pelo menos um antígeno e pelo menos um excipiente selecionadodentre (i) sacarídeos, (ii) álcoois de açúcares e (iii) aminoácidos ou sais far-maceuticamente aceitáveis dos mesmos.A invenção também refere-se ao uso de um Iiofilisato de umasuspensão contendo um sal metálico oxigenado, pelo menos um antígeno epelo menos um excipiente selecionado dentre (i) sacarídeos, (ii) álcoois deaçúcares e (iii) aminoácidos ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mes-mos, para a preparação de uma formulação de vacina sólida para a adminis-tração via mucosa.

Em um aspecto ulterior, a invenção refere-se a um método paraa vacinação de um indivíduo envolvendo a administação via mucosa de umaquantidade eficaz de uma formulação sólida conforme acima.

A invenção refere-se particularmente a um método para o trata-mento de alergias ou mitigação dos sintomas de alergias envolvendo a ad-ministração via mucosa de uma quantidade eficaz de uma formulação sólidaconforme acima contendo pelo menos um alérgeno.

A presente invenção se baseia no reconhecimento de que seriadesejável incluir um adjuvante em uma formulação de vacina sólida para aadministração via mucosa, e também de que seria desejável caso o adjuvan-te possuísse propriedades muco-aderentes. Mais além, chega-se a conclu-são de que os sais metálicos oxigenados, tais como, o hidróxido de alumínio,possuem tanto propriedades adjuvantes quanto muco-aderentes, desta for-ma, fazendo com tais substâncias sejam ideais para o uso em formulaçõessólidas de vacina para administração via mucosa.

A invenção se baseia no achado de que a trealose, a sacarose,e certos outros excipientes têm propriedades altamente excepcionais comrelação à proteção do hidróxido de alumínio e os correspondentes sais metá-Iicos oxigenados contra os efeitos prejudiciais da secagem a frio e que, con-sequentemente, matérias sólidas contendo hidróxido de alumínio obtidasatravés da secagem a frio de uma suspensão de hidróxido de alumínio etrealose, sacarose e certos outros excipientes podem ser prontamente re-hidratadas a fim de se obter um alum gelínio com propriedades que, em umgrau surpreendente, não são afetadas pelo processo de secagem a frio.

A presente invenção se baseia ulteriormente no reconhecimentode que as surpreendentes funcionalidades acima mencionadas da trealose,sacarose e certos outros excipientes podem ser utilizadas para o preparo deuma formulação de vacina sólida, tal como um comprimido de rápida disso-lução, desenhado para se re-hidratar quando em contato com a mucosa, quecontenha como adjuvante um sal metálico oxigenado, tal como o hidróxidode alumínio.

Desta forma, a presente invenção ofereceu uma possibilidade depreparo para uma formulação de vacina sólida para a administração via mu-cosa contendo como adjuvante, um sal metálico oxigenado, tal como o hi-dróxido de alumínio.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra o grau de inibição da ligação da IgE Der p-específica aos Der ρ biotinilados por várias formulações inibidoras.

A figura 2 mostra o grau de inibição da ligação da IgE Der p-específica aos Der ρ biotinilados por várias formulações inibidoras.

A figura 3 mostra uma comparação das estimativas de potênciade três pares de formulações testados.

A figura 4 mostra o nível da IgG Phl p-específica em camundon-gos imunizados três vezes com as diferentes formulações de Phl p.

A figura 5 mostra o nível de IgG Der ρ 1-específica em camun-dongos imunizados duas vezes (painel superior) e cinco vezes (painel supe-rior) com diferentes formulações de Der p.

A figura 6 ilustra o desenvolvimento temporal da IgG Der ρ 1-específica durante o curso do programa de imunização.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção oferece uma formulação de vacina sólidacontendo um Iiofilisato de uma suspensão contendo um sal metálico oxige-nado, pelo menos um antígeno e pelo menos um excipiente selecionado dogrupo consistindo em (i)sacarídeos, (ii) álcoois de açúcar e (iii) aminoácidosou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

A invenção também refere-se ao uso de um Iiofilisato de umasuspensão contendo um sal metálico oxigenado, pelo menos um antígeno epelo menos um excipiente selecionado do grupo consistindo em (i)sacarídeos,(ii) álcoois de açúcar e (iii) aminoácidos ou sais farmaceuticamente aceitáveisdos mesmos para o preparo de uma formulação de vacina sólida.

A suspensão é apropriadamente uma suspensão aquosa.

Em uma modalidade da invenção, a suspensão contém um exci-piente selecionado a partir de sacarídeos.

Em outra modalidade, a suspensão contém um excipiente sele-cionado a partir de álcoois de açúcar.

Ainda em outra modalidade, a suspensão contém um excipienteselecionado a partir de aminoácidos e sais farmaceuticamente aceitáveisdos mesmos.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém um excipienteselecionado a partir de sacarídeos e um excipiente selecionado a partir deálcoois de açúcar.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém um excipienteselecionado a partir de sacarídeos e um excipiente selecionado a partir deaminoácidos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém um excipienteselecionado a partir de álcoois de açúcar e um excipiente selecionado a partirde aminoácidos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Em uma modalidade conforme acima, a suspensão contém umexcipiente selecionado a partir de sacarídeos, um excipiente selecionado apartir de álcoois de açúcar e um excipiente selecionado a partir de aminoáci-dos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Conforme citado aqui, sacarídeos significa monossacarídeos,dissacarídeos e oligossacarídeos.

O sacarídeo é selecionado conforme apropriado dentre a dextro-se, a sacarose, a lactose, a trealose, a celobiose, a rafinose, a isomaltose eas ciclodextrinas.

O sacarídeo é preferencialmente selecionado do grupo consis-tindo da trealose e da sacarose.

Conforme citado aqui, um álcool de açúcar significa uma formahidrogenada de um sacarídeo (apropriadamente de um monossacarídeo) emque um grupo carbonila do sacarídeo é reduzido a um grupo hidroxila primá-rio ou secundário.

O álcool de açúcar é selecionado conforme apropriado dentreum grupo consistindo em manitol, sorbitol, xilitol, glicerol, eritritol, arabitol ealitol, sendo o álcool de açúcar preferencialmente o manitol.

O aminoácido é selecionado conforme apropriado dentre a glici-na, alanina, glutamina, arginina, lisina, prolina, serina e histidina, assim comosais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. O aminoácido é preferenci-almente a glicina.

Os sais dos aminoácidos podem ser sais alcalinos ou alcalino-terrosos, tais como os sais de sódio, potássio ou magnésio ou sais com ou-tros aminoácidos, tal como os sais de glutamato ou aspartato.

Em uma outra expressão, a suspensão contém um excipienteadicional que é um polímero. O polímero pode ser selecionado dentre o dex-trano, maltodextran, goma, celulose, gelatina, agarose, polivinilpirrolidona(PVP), álcool polivinílico (PVA), e polietilenoglicol (PEG). Preferencialmenteo polímero dextrano.

Assim, em uma modalidade, a suspensão contém um excipienteselecionado dentre sacarídeos como, por exemplo, a trealose e a sacarose,um excipiente selecionado dentre álcoois de açúcar como, por exemplo, omanitol, e um excipiente que seja um polímero como, por exemplo, o dextra-no.

Em uma expressão adicional da invenção, a suspensão contémum excipiente selecionado dentre sacarídeos como, por exemplo, a trealosee a sacarose, um excipiente selecionado dentre aminoácidos e sais farma-ceuticamente aceitáveis dos mesmos e um excipiente que é um polímerocomo, por exemplo, o dextrano.

Em uma expressão adicional da invenção, a suspensão contémum excipiente selecionado dentre álcoois de açúcar como, por exemplo, omanitol, e um excipiente selecionado dentre aminoácidos e sais farmaceuti-camente aceitáveis dos mesmos e um excipiente que é um polímero como,por exemplo, o dextrano.Em uma outra modalidade, a suspensão contém um excipienteselecionado dentre sacarídeos como, por exemplo, a trealose e a sacarose,e um excipiente que é um polímero como, por exemplo, o dextrano.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém um excipienteselecionado dentre álcoois de açúcar como, por exemplo, o manitol, e umexcipiente que é um polímero como, por exemplo, o dextrano.

Em uma expressão adicional da invenção, a suspensão contémum excipiente selecionado dentre aminoácidos e sais farmaceuticamenteaceitáveis dos mesmos como, por exemplo, a glicina, e um excipiente que éum polímero como, por exemplo, o dextrano.

Há disponíveis várias graduações de dextrano, sendo que umdextrano apropriado tem um peso molecular de mais de 10.000, por exem-plo, com um peso molecular médio variando entre 10.000 e 200.000. Prefe-rencialmente o dextrano tem peso molecular de 40.000, 60.000 ou 70.000Dáltons.

De acordo com uma modalidade, a suspensão contém uma mis-tura de sacarose e manitol.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura desacarose, glicina e dextrano.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura detrealose e manitol.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura desacarose, manitol e dextrano.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura detrealose, glicina e dextrano.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura detrealose, manitol e dextrano.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura detrealose e glicina.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura desacarose e glicina.

Em uma outra modalidade, a suspensão contém uma mistura deglicina e manitol.

Uma combinação preferida de excipientes para a utilização napresente invenção é a combinação de um sacarídeo, um álcool de açúcar ouum aminoácido ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um po-límero.

Quando uma suspensão contém sacarose e manitol a razão dopeso da sacarose para o do manitol varia conforme apropriado de 1:4 a 4:1,ou de 1:2 a 2:1, como, por exemplo, 1:4, 3:2, 2:3, 4:1, 2:1, 1:2 ou 1:1, sendoa razão preferencialmente de 1:1.

Quando uma suspensão contém sacarose, glicina e dextrano, arazão entre os pesos da sacarose, da glicina e do dextrano é selecionadaconforme apropriado dentre 5:4:1, 4:5:1, 3:5:2, 2:5:3, 4:4:2, 3:4:3, 2:4:4,6:3:1, 7:2:1, e 8:1:1, sendo a razão entre os pesos da sacarose, da glicina edo dextrano preferencialmente de 5:4:1.

Quando uma suspensão contém trealose e manitol, a razão dopeso da trealose para o peso do manitol varia conforme apropriado de 1:4 a4:1, ou de 1:2 a 2:1, como, por exemplo, 1:4, 3:2, 2:3, 4:1, 2:1, 1:2 ou 1:1,sendo a razão preferencialmente de 1:1.

Quando uma suspensão contém sacarose, manitol e dextrano, arazão entre os pesos da sacarose, do manitol e do dextrano é selecionada con-forme apropriado dentre 5:4:1, 4:5:1, 3:5:2, 2:5:3, 4:4:2, 3:4:3, 2:4:4, 6:3:1, 7:2:1e 8:1:1, sendo a razão entre os pesos preferencialmente de 3:5:2.

Quando uma suspensão contém trealose, manitol e dextrano, arazão entre os pesos da trealose, do manitol e do dextrano é selecionadaconforme apropriado dentre 5:4:1, 4:5:1, 3:5:2, 2:5:3, 4:4:2, 3:4:3, 2:4:4,6:3:1, 7:2:1 ou 8:1:1.

Quando uma suspensão contém trealose, glicina e dextrano, arazão entre os pesos da trealose, do glicina e do dextrano é conforme apro-priado de 5:4:1, 4:5:1, 3:5:2, 2:5:3, 4:4:2, 3:4:3, 2:4:4, 6:3:1, 7:2:1 e 8:1:1.

Quando uma suspensão contém trealose e glicina, a razão dopeso da trealose para o da glicina varia conforme apropriado de 1:4 a 4:1, oude 1:2 a 2:1, como, por exemplo, 1:4, 3:2, 2:3, 4:1, 2:1, 1:2 ou 1:1, sendo arazão entre os pesos preferencialmente de 1:1.

Quando uma suspensão contém sacarose e glicina, a razão dopeso da sacarose para o da glicina varia conforme apropriado de 1:4 a 4:1,ou de 1:2 a 2:1, como, por exemplo, 1:4, 3:2, 2:3, 4:1, 2:1, 1:2 ou 1:1, sendoa razão entre os pesos preferencialmente de 1:1.

Quando uma suspensão contém manitol e glicina, a razão dopeso do manitol para o da glicina varia conforme apropriado de 1:4 a 4:1, oude 1:2 a 2:1, como, por exemplo, 1:4, 3:2, 2:3, 4:1, 2:1, 1:2 ou 1:1, sendo arazão entre os pesos preferencialmente de 1:1.

As suspensões acima mencionadas podem em acréscimo conterde 0,1 a 5% do seu peso de um surfactante como, por exemplo, o monolau-rato de sorbitano polietilenoglicol (Tween 20), um monooleato de polioxietile-no sorbitano (Tween 80), um copolímero em bloco de polietileno e polipropi-lenoglicol (Pluronic).

De acordo com uma expressão, a formulação em conformidadecom a invenção é um comprimido.

O comprimido pode ser um comprimido não prensado (por e-xemplo, um comprimido de rápida dissolução).

De acordo com uma outra modalidade, o comprimido é um com-primido prensado.

Quaisquer comprimidos conforme acima podem ser destinados àadministração sublingual.

A formulação em conformidade com a invenção também pode

ser um pó.

Em uma expressão adicional da invenção, a formulação está naforma de partículas.

A formulação também pode ser um granulado.

Em uma outra expressão, a formulação é uma cápsula contendoo liofilisato. O Iiofilisato contido na cápsula pode estar na forma de um pó, departículas ou de um granulado. Em uma expressão, a cápsula contém mi-cropartículas revestidas conforme abaixo descrito.AntígenoA formulação sólida em conformidade com a invenção pode con-ter um antígeno ou, alternativamente, mais de um antígeno.

Alérgenos

Em uma expressão particular da invenção, o antígeno é um a-lérgeno. O alérgeno pode ser qualquer proteína de ocorrência natural daqual haja relato quanto à propriedade alergênica, por exemplo, reações me-diadas pela IgE durante a sua repetida exposição a um indivíduo. Exemplosde alérgenos de ocorrência natural incluem os alérgenos de pólen (alérgenodo pólen de árvores, arbustos, ervas e gramíneas), alérgenos de inseto (a-lérgenos inalantes, salivares e venenosos, por exemplo, alérgenos de acari-nos, alérgenos de baratas e mosquitos e alérgenos venenosos de himenóp-teros), alérgenos de caspas e pelos de animais (como, por exemplo, cachor-ros, gatos, cavalos, ratos, camundongos e etc.) e alérgenos alimentícios.

São importantes alérgenos de pólen de árvores, gramíneas e ervas aquelesoriginados das ordens taxonômicas das Fagágeas, Oleáceas, Pináceas eplatanaceae, incluindo, por exemplo, o vidoeiro (Bétula), o amieiro (Alnus), anogueira (Corylus), a carpa (Carpinus) e a oliva (Olea); cedro (Cryptomeria eJuniperus), plátano (Platanus); a ordem das Poales, incluindo, por exemplo,as gramíneas dos gêneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus,Phalaris, Secale, e Sorghum; as ordens das Asterales e das Urticales inclu-indo, por exemplo, as ervas do gênero Ambrosia, Artemisia e Parietaria. Ou-tros importantes alérgenos inalantes são aqueles provindos de acarinos en-contrados na poeira de casa do gênero dos Dermatophagoides e dos Euro-glyphus, acarinos de armazém como, por exemplo, os Lepidoglyphys, Glycy-phagus e Tyrophagus; aqueles provindos de baratas, mosquitos e pulgas,como, por exemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus e Ctenocepphalides; eaqueles provindos de mamíferos como gatos, cachorros e cavalos; alérge-nos venenosos, incluindo aqueles de picadas ou mordidas de insetos comaqueles da ordens taxonômica dos Himenópteros, incluindo abelhas (super-família Apidae), vespas (superfamília Vespidea), e formigas (superfamíliaFormicoidae). Importantes alérgenos inalantes provindos de fungos são, porexemplo, aqueles provindos dos gêneros Alternaria e Cladosporium.Em uma expressão preferida da invenção, o alérgeno é Bet ν 1,Aln g 1, Cor a 1 e Car b 1, Que a 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Jun a1, Jun a 2, jun a 3, Ole e 1, Lig ν 1, Pla 11, Pla a 2, Amb a 1, Amb a 2, Amb t5, Art ν 1, Art ν 2 Par j 1, Par j 2, Par j 3, Sal k 1, Ave e 1, Cyn d 1, Cyn d 7,Dac g 1, Fes ρ 1, Hol I 1, Lol ρ 1 e 5, Pha a 1, Pas η 1, Phl ρ 1, Phl ρ 5, Phl ρ6, Poa ρ 1, Poa ρ 5, Sec c 1, Sec c 5, Sor h 1, Der f 1, Der f 2, Der ρ 1, Der ρ2, Der ρ 7, Der m 1, Eur m 2, Gly d 1, Lep d 2, Blo t 1, Tyr ρ 2, Bla g 1, Bla g2, Per a 1, Fel d 1, Can f 1, Can f 2, Bos d 2, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Musm 1, Rat η 1, Apis m 1, Api m 2, Ves ν 1, Ves ν 2, Ves ν 5, Dol m 1, Dil m 2,Dol m 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Sol i 1, Sol i 2, Sol i 3 e Sol i 4, Alt a 1, Clah 1, Asp f 1, Bos d 4, Mal d 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Ara h 1, Ara h 2,Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5 ou híbridos aleatórios resultados de cruzamentosmoleculares entre quaisquer destes.

Na mais preferida modalidade, o alérgeno é um alérgeno de pó-Ien de gramínea ou um alérgeno de acarinos de poeira ou um alérgeno deerva-de-santiago ou um alérgeno de pólen de cedro ou um alérgeno de gatoou alérgeno de vidoeiro.

O alérgeno de pólen de gramíneas é selecionado conforme a-propriado dentre o Phl ρ 1, o Phl ρ 5 e o Phl p.

Os alérgenos de pólen de vidoeiro são selecionados dentre o Artν 1 e o Art v 2.

Em ainda uma outra modalidade, a formulação de vacina sólidacontém pelo menos dois tipos diferentes de alérgenos originados da mesmafonte alergênica ou de diferentes fontes alergênicas, como, por exemplo,alérgenos do grupo 1 de gramíneas e do grupo 5 das gramíneas ou alérge-nos do grupo 1 de acarinos e do grupo 2 de diferentes espécies de acarinose gramíneas, respectivamente, antígenos herbáceos como alérgenos da er-va-de-santiago gigante e curta, alérgenos de diferentes fungos como os alérge-nos de alternaria e cladosporium, alérgenos de árvores como os alérgenos devidoeiro, nogueira, carpa, carvalho e amieiro, alérgenos alimentícios como osalérgenos de amendoim, grãos de soja e leite.

O (s) alérgeno (s) incorporados à formulação de vacina sólidapode estar presente na forma de um extrato, misturas de extratos, um alér-geno purificado, um alérgeno modificado, um alérgeno recombinante ou umamutação de um alérgeno recombinante. Um extrato alergênico pode conternaturalmente uma ou mais isoformas de um mesmo alérgeno, ao passo queum alérgeno recombinante representa tipicamente apenas uma isoforma deum alérgeno. Em uma expressão preferencial, o alérgeno está na forma deum extrato. Em uma outra expressão preferencial, o alérgeno está na formade um alérgeno recombinante. Em uma expressão preferencial adicional, oalérgeno é uma mutação de baixa conectividade com a IgE de ocorrêncianatural ou uma mutação recombinante de baixa conectividade com a IgE.

Por alérgeno recombinante se quer dizer um alérgeno produzidopor técnicas de recombinação utilizando sistemas de expressão.

Os alérgenos podem estar presentes em quantidades equi-molares ou a razão entre os alérgenos presentes pode preferencialmentevariar até 1:20.

Em uma expressão adicional da invenção o alérgeno de baixaconectividade com a IgE é um alérgeno em conformidade com os WO99/47680, W002/40676 ou WO 03/096869.

Agentes microbianos

Particularmente, em uma outra modalidade, o alérgeno é umagente microbiano. O agente microbiano é, em particular, um vírus, umabactéria, um fungo, um parasita ou qualquer parte do mesmo.

São exemplos de agentes microbianos: espécies de Vibrio, es-pécies de Salmonella, espécies de Bordetella, espécies de Haemophilus,Toxoplasmosis gondii, Cytomegalovirus, espécies de Chlamydia, espéciesestreptocócicas, Vírus de Norwalk, Escherischia coli, Helicobacter pylori, He-Iicobacter felis, Rotavirus, Neisseria gonorrhae, Neisseria meningiditis, Ade-novirus, vírus Epstein Barr, vírus da encefalite japonesa, Pneumocystis cari-ni, Herpes simplex, espécies de Clostridia, vírus respiratório sincicial, espé-cies de Klebsielia, espécies de Shigellal Pseudomonas aeruginosa, Parvoví-rus, espécies de Campylobacter, espécies de Rickettsia, Varicella zoster,espécies de Yersinia, vírus do rio Ross, vírus J. C., Rhodococcus equi, Mo-raxella catarrhalis, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, poliovírus,vírus influenza, Vibrio cholerae e Salmonella enterica serovar Typhi.

São outros exemplos de agentes microbianos aqueles que pre-vinem ou reduzem os sintomas das seguintes doenças: gripe, tuberculose,meningite, hepatite, coqueluche, póliomielite, tétano, difteria, malária, cólera,herpes, tifo, HIV, AIDS, sarampo, doença de Lyme, gastroenterite, hepatiteA, B e C, Otite média, dengue, raiva, parainfluenza, rubéola, febre amarela,disenteria, legionelose, toxoplasmose, febre-Q, febre hemorrágica, febrehemorrágica Argentina, cáries, mal de chagas, infecção do trato urináriocausada pela E. coli, doença pneumocócica, cachumba e chikungunya.

Sais metálicos oxigenados

São exemplos de sais metálicos oxigenados aqueles cujo cátioné selecionado dentre os seguintes elementos: Al1 K, Ca, Mg, Zn, Ba, Na, Li,B, Be, Fe, Si, Co, Cu, Ni, Ag, Au e Cr.

O ânion do composto oxigenado pode ser um ânion orgânico ouinorgânico, ou uma combinação de ânions orgânicos e inorgânicos. São e-xemplos de sais metálicos oxigenados aqueles cujo ânion é selecionadodentre os seguintes: sulfatos, hidróxidos, fosfatos, nitratos, iodatos, broma-tos, carbonatos, hidratos, acetatos, citratos, oxalatos e tartáratos, assim co-mo formas mistas dos mesmos. Os sais metálicos oxigenados ainda contêmcomplexos de coordenação. Uma definição de "complexos de coordenação"é dada, por exemplo, no "The Handbook of Chemistry and Physics" 56° Ed.,Seção B, Capítulo 7 (1975-76).

No presente contexto, a expressão "formas mistas" inclui ascombinações dos ânions assim como as combinações com, por exemplo,cloretos e sulfetos.

Embora a formulação de vacina sólida contenha um sal metálicooxigenado, contempla-se que o oxigênio possa ser substituído por outro á-tomo do grupo Vl-A como o S, o Se ou o Te.

O sal metálico oxigenado a ser utilizado em conformidade com ainvenção pode ser qualquer sal metálico oxigenado oferecendo o efeito de-sejado quando formulado com um sistema de administração via mucosa.São exemplo de tais substâncias contendo oxigênio: hidróxido de alumínio,fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, sulfato de potássio alumínio, fosfatode cálcio, Maalox (uma mistura de hidróxido de alumínio e hidróxido demagnésio), hidróxido de berílio, hidróxido de zinco, carbonato de zinco, clo-reto de zinco e sulfato de bário. São sais metálicos oxigenado preferenciaiso hidróxido de alumínio, o fosfato de alumínio e o fosfato de cálcio. O salmetálico oxigenado mais preferível é o hidróxido de alumínio.A Preparação do Liofilisato

O Iiofilisato de uma suspensão de um sal metálico contendo oxi-gênio, excipiente (s) e antígeno pode ser preparada através do preparo inici-al de uma suspensão de um sal metálico oxigenado, excipientes, antígeno e,opcionalmente, um agente formador de matriz e/ou outros agentes. Tais a-gentes formadores de matriz e/ou outros agentes selecionados devidamenteem relação ao tipo de formulação a ser feita, confira abaixo. A suspensão épreferencialmente uma suspensão aquosa.

Quando usando, por exemplo, o hidróxido de alumínio como salmetálico oxigenado, a concentração de hidróxido de alumínio (em mg deAl/ml) na suspensão líquida é preferivelmente de 0,35-1.000 mg/ml, maispreferivelmente de 0,10-100 mg/ml e, sobretudo, preferivelmente de 2-30mg/ml. Para os outros sais metálicos oxigenados, a concentração do sal me-tálico (em mg do cátion/ml) é preferivelmente de 0,035-1.000 mg/ml, maispreferivelmente de 0,35-100 mg/ml, mais preferivelmente de 0,7-75 mg/ml e,sobretudo, preferivelmente de 1,5-50 mg/ml.

Quando o antígeno é um alérgeno, a concentração do alérgenona suspensão é preferivelmente de 0,01-100 mg/ml e mais preferivelmentede 0,1-10 mg/ml. A razão entre o peso do sal metálico oxigenado e do alér-geno é preferivelmente de 0,1 para 100 e mais preferivelmente de 1 para 20.O grau de alérgeno adsorvido no sal metálico oxigenado tipicamente variade 5 a 99% e mais preferivelmente de 10 a 99% da quantidade acrescenta-da. A adsorção do alérgeno ao sal metálico oxigenado depende do sistematampão e das condições de reação, incluindo a temperatura e o tempo dereação, nos quais acontece a adsorção.O pl dos sais metálicos de oxigênio varia tipicamente de 2 a 11.

O pl das proteínas alergênicas varia tipicamente de 4 a 9. Preferivelmente, oalérgeno e o sal metálico oxigenado são escolhidos de forma que o pl doalérgeno seja inferior ao pl do sal metálico oxigenado.

A concentração total dos excipientes na suspensão é preferivel-mente de 0,1 mM a 1,2 M, mais preferivelmente de 0,5 mM a 800 mM e, so-bretudo, preferivelmente de 100 a 500 mM.

A suspensão contém preferivelmente de 5 a 25% do seu pesode excipientes (quantidade total) ou mais preferivelmente de 10 a 15% doseu peso de excipientes (quantidade total).

A suspensão é posteriormente submetida à liofilização. A tecno-logia e o método de liofilização são devidamente selecionados em função dotipo de formulação sólida a ser preparada, por exemplo, um pó, partículas ouum granulado.

Em uma modalidade, a suspensão é dividida em gotas e conge-lada para se obter criogotas que subseqüentemente são submetidas à liofili-zação para se obter grânulos. Em uma outra modalidade, um volume apro-priado da suspensão é colocado em um receptáculo e Iiofilizado para obterum bolo de resíduos, que depois é moído a fim de formar partículas ou umpó de partículas tendo o tamanho desejado.

Em ainda uma outra modalidade, a suspensão é despejada nasdepressões de uma folha de blisters laminada com várias camadas e a folhacarregada é submetida à secagem a frio a fim de formar comprimidos nãoprensados. Posteriormente a folha é opcionalmente selada.

Em ainda uma outra expressão, a suspensão é submetida a se-cagem por pulverização a frio conforme descrito na US 2003/0202978, utili-zando opcionalmente concentrações de sólidos mais baixas na suspensão,ou conforme descrito na US 2005/0266021.

Formulações de Vacina Sólidas para a Administração via Mucosa

A formulação de vacina sólida da invenção pode ser administra-da através de qualquer mucosa, incluindo as mucosas oral (através das mu-cosas do sistema digestivo como, por exemplo, a mucosa gastrointestinal),nasal, vaginal, sublingual, ocular, retal, uretral, intramamária, pulmonar, oto-lar (ou seja, através da orelha), bucal ou oromucosal, preferivelmente atra-vés da mucosa bucal ou sublingual, ou da gastrointestinal.

Tem se especulado que na administração via mucosa de umavacina seja preferível a administração através da mucosa que está sujeita àexposição natural ao antígeno. Desta forma, nas alergias a antígenos trans-portados pelo ar às mucosas, pode ser preferível a utilização da administra-ção através da mucosa do sistema respiratório, preferivelmente uma admi-nistração bucal ou sublingual. Correspondentemente, nas alergias a agentesda mucosa, que entrem em contato com a mucosa do sistema digestivo, po-de ser preferível a utilização de administração oral.

A formulação de vacina sólida da invenção pode ter qualquerforma sólida apropriada à administração via mucosa, que consista ou conte-nha um liofilisato, incluindo formulações selecionadas dentre o grupo consis-tindo em pós, partículas, grânulos, comprimidos prensados, comprimidosnão prensados, implantes, cápsulas com uma única parede contendo umliofilisato como, por exemplo, na forma de um pó, partículas ou grânulos; emicropartículas com um agente encapsulador aderente e um liofilisato naforma de um pó, partículas ou grânulos aderidos ao mesmo. A formulaçãotambém pode ser uma cápsula (por exemplo, uma cápsula de gelatina) con-tendo o liofilisato na forma de pó, granulado, partículas ou na forma de mi-cropartículas encapsuladas conforme acima.

Comprimidos Prensados

O liofilisato, por exemplo, na forma de um pó, partículas ou grâ-nulos pode ser utilizado no preparo de um comprimido prensado. O compri-mido prensado pode incluir qualquer agente ou excipiente convencional naformação de comprimidos. O comprimido pode também conter o liofilisato naforma de micropartículas com um agente encapsulador aderente.

Comprimidos não prensados

Em uma expressão em particular da invenção, a formulação devacina sólida é um comprimido não prensado de rápida dissolução apropria-do para a administração sublingual ou bucal. São exemplos de comprimidosnão prensados aqueles revelados à US-A-5,648,093, no WO 00/51568, noWO 02/13858, no W099/21579, no WO 00/44351, na US-A-4,371,516, naEP-278 877, no WO 2004/047794 e no WO 2004/075875. Os comprimidosnão prensados de rápida dissolução preferidos são aqueles produzidos atra-vés da secagem a frio. Os agentes formadores de matriz preferidos são agelatina de peixe e amido modificado.

O comprimido não prensado pode conter, em adição ao Iiofilisa-to, qualquer excipiente ou agente convencional para a formação de compri-midos, tais como, adjuvantes, anti-ácidos, diluentes, realçadores, agentesmucoadesivos, agentes flavorizantes, agentes maquiadores de sabor, con-servantes, antioxidantes, tensoativos, acentuadores de viscosidade, coran-tes, modificadores de pH, adoçantes e etc. estes excipientes são todos sele-cionados em conformidade com a prática farmacêutica convencional de for-ma compreensível para as pessoas versadas na arte da formulação de vaci-nas de alérgenos.

Em uma expressão preferida da invenção, o comprimido contémum agente estabilizante proteico. São exemplos de agentes estabilizantesproteicos os polietilenoglicóis (PEG) como, por exemplo, o PEG300,PEG400, PEG600, PEG1000, PEG1500, PEG3000, PEG3050, PEG4000,PEH6000, PEG20000 e PEG35000; os aminoácidos como a glicina, a alani-na, a arginina; os mono-, di e trissacarídeos como a trealose e a sacarose; oálcool polivinílico (PVA); os ésteres de ácidos graxos de polietileno sorbitano(polissorbatos, Tweens ou Spans); a albumina sérica humana (ASH); a al-bumina sérica bovina (ASB). Preferivelmente se utiliza o PEG como agenteestabilizante proteico. Acredita-se que, além de ser um estabilizante protei-co, o PEG confira a propriedade da elasticidade à matriz da forma de dosagem.

Os corantes apropriados incluem os óxidos de ferro amarelos,pretos e vermelhos e as pigmentações FD & C tais como a FD & C azul N°.2 e a FD & C vermelho N°. 40. Os agentes flavorizantes apropriados incluemos sabores de menta, framboesa, laranja, limão, baunilha, caramelo, cereja,uva, pomelo e alcaçuz, assim como combinações dos mesmos. Os modifi-cadores de pH apropriados incluem o ácido citrico, o ácido tartárico, o ácidofosfórico, o ácido clorídrico e o ácido maleico. Os adoçantes apropriadosincluem o aspartame, o acesulfame Kea taumatina. Os agentes maquiado-res de sabor apropriados incluem o bicarbonato de sódio, as resinas de trocaiônica, os compostos de inclusão da ciclodextrina, adsorbatos ou ativos mi-croencapsulados.

Os adjuvantes são normalmente utilizados para acentuar a ab-sorção do antígeno (por exemplo, um alérgeno), assim como para acentuaras propriedades imunoestimulantes do antígeno (por exemplo, um alérgeno).

Em uma modalidade, incorpora-se ao comprimido da invençãopelo menos um adjuvante em adição ao sal metálico oxigenado. São exem-plos de adjuvantes apropriados a enterotoxina termolábil (LT), a toxina docólera (CT) (e frações detoxificadas da mesma), a toxina B do cólera (CTB),Iipossomos polimerizados, toxinas mutantes como, por exemplo, a LTK63 ea LTR72; microcápsulas, fragmentos bacterianos não tóxicos, citocinas, qui-tosana, homólogos termolábeis da E. coli (e frações detoxificadas dos mes-mos), saponinas, produtos bacterianos tais como os lipopolissacarídeos(LPS) e o muramil dipeptídeo (MDP); lipossomas, CpG (seqüências imuno-estimulantes de DNA), homo lactídeos/glicosídeos (copolímeros na forma depolímeros microparticulares) e etc. O uso dos adjuvantes nas vacinas comalérgenos fundamenta-se comumente no fato de que os alérgenos em ques-tão não são capazes de penetrar a barreira a ser passada. Os adjuvantes,portanto, podem servir como agentes de estimulação da absorção ou podemagir como imunoestimulantes.

O comprimido não prensado de rápida dissolução da invençãopode, por si só, ser até certo ponto mucoaderente; entretanto, em uma ex-pressão preferida da invenção, pode ser desejável que se adicione mais ex-cipientes mucoadesivos à dita forma de dosagem em ordem de aumentar otempo de contato da forma de dosagem com a mucosa da cavidade oral.

São excipientes mucoadesivos apropriados os polímeros de poliacrílico taiscomo o carbômero e os derivados do carbômero, os derivados da celulosetais como a hidroxipropilmetilcelulose, a hidróxi-etilcelulose, a hidroxipropil-celulose e a carboximetilcelulose de sódio; polímeros naturais tais como ge-latina, o alginato de sódio, a pectina e o glicerol.

Micropartículas

As placas de Peyer são agregados dos nódulos Iinfoides Iocali-zados na parede do intestino delgado, do intestino grosso e do apêndice,representando uma importante parte da defesa do corpo contra a aderênciae penetração de agentes infecciosos e outras substâncias estranhas ao cor-po. As placas de Peyer também são conhecidas como folículos linfáticosagregados. Folículos linfáticos agregados similares podem ser achados notrato respiratório, no reto, na cavidade nasal, na cavidade oral, na faringe, notrato geniturinário, no intestino grosso e em outras mucosas do corpo. Épossível se referir aos tecidos citados em geral como tecidos Iinfoides asso-ciados à mucosa (MALT).

Foi demonstrado que substâncias farmaceuticamente ativasformuladas como micropartículas tendo um determinado tamanho e proprie-dades físico-químicas adequadas podem ser tomadas de forma eficaz atra-vés das placas de Peyer e dos MALT.

O uso de micropartículas envolve a vantagem de se proteger asubstância farmaceuticamente ativa da degradação, tanto durante a produ-ção quanto durante o armazenamento das formas de dosagem, assim comono processo de administração da substância ativa ao paciente. Isto é particu-larmente importante quando a substância ativa é um alérgeno. A utilizaçãodo microencapsulamento para a proteção de substâncias bioativas sensíveiscontra à degradação se tornou bem conhecida. Tipicamente, uma substânciabioativa é encapsulada em uma série de vários materiais isolantes, comu-mente de natureza polimérica. A quantidade de substâncias dentro das mi-cropartículas pode variar conforme desejado, variando desde uma pequenaquantidade a até 95% ou mais da composição das micropartículas. O diâme-tro das micropartículas é preferivelmente inferior a 20 μιτι, sendo mais prefe-rivelmente inferior a 15 μιτι, mais preferivelmente inferior a 10 pm e preferi-velmente, sobretudo, estando entre 1 e 10 μηι.

O agente encapsulante pode ser qualquer agente biodegradável,sendo preferível mente um agente polimérico. O agente encapsulante é sele-cionado preferencialmente dentre o grupo consistindo em polilactídeo, poli-lactídeo-poli(etileno glicol), poli(DL-lactídeo-co-glicosídeo), poli(glícosídeo),copolioxalatos, policaprolactona, poli(lactídeo-co-caprolactona), po-li(esteramidas, poliortoesteres e poli(8-ácido hidroxibutírico), e polianidridos,mais preferivelmente poli(DL-lactídeo-co-glicosideo). São outros exemplosde agentes encapsulantes o poli(butil-2-cianoacrilato), poli(3-hidroxibutirato)e copolímeros polianidridos de ácido fumárico fumarico e sebácico, po-li(AF:AS). Os agentes encapsulantes adequados para utilização em confor-midade com a presente invenção também incluem aqueles derivados de pro-teínas animais ou vegetais, tais como as gelatinas, de proteína da sementedo plantago ovata e do trigo, de dextrinas e de soja; gomas como a de acá-cia, a guar, a ágar e a xantano; polissacarídeos; amido e amido modificado,alginatos; carboximetilcelulose; carrageninas; dextranos; pectinas; polímerossintéticos como a polivinilpirrolidona; e complexos de polissacarídeos ou po-lipeptídeo/proteína como os complexos de gelatina-acácia. Em uma modali-dade dois ou mais agentes encapsulantes são utilizados. Preferencialmente,o agente encapsulante é selecionado de forma a tornar a micropartícula hi-drofóbica. Acredita-se que mícropartículas hidrofóbicas são mais facilmenteabsorvidas pelos MALT ou mais prováveis de eliciar seus efeitos através dosMALT.

Em uma expressão, o agente encapsulante utilizado é um reves-timento entérico feito de copolímero de ácido metacrílico etilacrilato, succina-to acetato de hidroxipropilmetilcelulose outro revestimento entérico; veja, porexemplo, a patente dos EUA de n° 5,591,433.

Cápsulas

As cápsulas da invenção podem ser qualquer tipo convencionalde cápsula. Em uma expressão particular da invenção, a parede da cápsulaé composta de gelatina. A cápsula pode ser, particularmente, adaptada paraa administração oral. A parede da cápsula pode ser composta de ou revesti-da com quaisquer dos agentes encapsulantes mencionados acima em cone-xão com as micropartículas.De acordo com a invenção, as cápsulas podem conter o Iiofilisa-to de uma suspensão contendo antígeno, sal metálico oxigenado e excipien-tes, na forma de um pó, grânulos ou partículas. A cápsula pode conter, alter-nativamente, as micropartículas descritas acima.

Tratamento Bucal ou Sublingual

A formulação de vacina sólida pode ser utilizada em um protoco-lo de vacinação envolvendo administrações diárias da vacina. Um outro pro-tocolo de vacinação envolve a administração da vacina a cada dois dias, acada três dias ou a cada quatro dias. Por exemplo, o protocolo de vacinaçãoenvolve a administração da vacina por um período de mais de quatro sema-nas, preferivelmente por um período de mais de 8 semanas, mais preferi-velmente por mais de 12 semanas, mais preferivelmente por mais de 16 se-manas, mais preferivelmente por mais de 20 semanas, mais preferivelmentepor mais de 24 semanas, mais preferivelmente por mais de 30 semanas epreferivelmente, sobretudo, por um período de mais de 36 semanas.

O período de administração pode ser um período continuo. Al-ternativamente, o período de administração é um período descontínuo, inter-rompido por um ou mais períodos de não administração. Preferivelmente, operíodo (total) de não administração é mais curto que o período (total) deadministração.

A vacina pode ser administrada para o indivíduo testado umavez ao dia. Alternativamente, a vacina é administrada ao indivíduo testadoduas vezes ao dia. A vacina pode ser uma vacina unidose. Alternativamente,a vacina é uma vacina multidose.

O tratamento clássico de dessensibilização com o escalonamen-to da dose, no qual a dose do alérgeno na forma de uma formulação sólida éelevada até atingir certo máximo, alivia os sintomas da alergia. A potênciapreferida para uma dose unitária do comprimido varia de 150 - 1.000.000SQ-u/comprimido, a potência mais preferida varia de 500 - 500.000 SQ-u/comprimido e a potência varia mais preferivelmente de 1.000 - 250.000SQ-u/comprimido, a potência ainda mais preferível varia de 1.500-125.000SQ-u/comprimido e a potência, sobretudo, varia preferivelmente de 1.500-75.000 SQ-u/comprimido.

Em uma outra modalidade, o comprimido é uma monodose repe-tida, preferivelmente dentro da faixa de 1.500-75.000 SQ-u/comprimido.

DEFINIÇÕES

As seguintes definições são utilizadas em conexão com a pre-sente invenção:

Os termos "liofilização" e "secagem a frio" são utilizadas inter-cambiavelmente.

O termo "liofilisato" significa qualquer forma de resídou sólidoresultante de um processo de liofilização, como, por exemplo, na forma deum bolo ou granulado ou de um pó.

O termo "oromucosal" expressa relatividade às mucosas da ca-vidade oral, da faringe e sublingual.

O termo "bucal" expressa relatividade à cavidade oral.

O termo "sublingual" expressa relatividade à posição abaixo dalíngua na cavidade oral.

O termo "SQ" significa unidade-SQ: A unidade-SQ é determina-da em conformidade com o método de padronização da "biopotência SQ" deALK-Abelló A/S, em que 100.000 unidades SQ eqüivalem à dose de manu-tenção subcutânea padrão. Normalmente, 1 mg de extrato contem de100.000 a 1.000.000 de unidades SQ, dependendo da fonte da qual o alér-geno se origina e do processo de fabricação utilizado. A quantidade precisade alérgeno pode ser determinada através de imuno-ensaios como, por e-xemplo, os de conteúdo total de alérgenos maiores e atividade total do alér-geno.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Pulverização a frio de uma suspensão contendo hidróxido dealumínio e vários excipientes

A composição das suspensões submetidas ao processo de se-cagem por pulverização a frio(SFD) foi conforme mostrada na tabela 1.<table>table see original document page 27</column></row><table>

Tabela 1: Formulações para secagem por pulverização a frio. O pM para odextrano é de 70.000 daltons.

As formulações foram pulverizadas a frio utilizando o sistema:Freeze granulator LS 2 (PowderPro AB) e foram secas utilizando um seca-dor a frio Lyovac GT-2 (PowderPro) ou um secador a frio Usifroid (FRD0001em ALK-Abelló). O sistema expõe um bocal bifluídico seguro acima de umfrasco de vidro sobre um agitador magnético. A fim de reduzir a perda denitrogênio líquido, coloca-se uma cobertura sobre o frasco de vidro. O frascofoi cheio de nitrogênio líquido até aproximadamente sua metade. Foi permiti-da uma pausa de 2 a 3 minutos para a estabilização da superfície do nitro-gênio líquido. A formulação foi pulverizada no nitrogênio líquido usando umataxa de alimentação de 4 1/hora (para a maioria das formulações) controladapor uma bomba peristáltica. Durante a pulverização se utilizou uma pressãodo ar na faixa de 15 KPa - 30 KPa (0,15 bar- 0,3 bar). A dispersão de partí-culas congeladas produzida foi mexida continuamente e transferida parabandejas de secagem a frio cobertas com nitrogênio líquido. A secagem noPowderPro foi realizada em um secador a frio Lyovac GT-2 na menor pres-são possível (correspondente a aproximadamente - 33°C). A secagem noALK-Abelló foi realizada em um secador a frio Usifroid (FRD0001) utilizandoas configurações listadas na tabela 2.<table>table see original document page 28</column></row><table>

Tabela 2: Configurações do secador a frio Usifroid (FRD0001)

O controle dos pós consistiu na inspeção visual, flutuabilidade,reconstituição e densidade da carga. As características do Alhidrogel forammensuradas através de teste de sedimentação e análise microscópica (luzóptica e polarizada). Foram preparados pós aceitáveis utilizando todas ascomposições de excipientes na tabela 1, embora alguns pós tendessem aabsorver umidade, resultando em viscosidade/ aglomerados de partículasgrandes. Na presença dos excipientes listados, o processo de secagem porpulverização a frio não foi prejudicial para o Alhidrogel. Foram observadaspequenas alterações dos padrões de sedimentação, contudo, na análise mi-croscópica, não foi observada coagulação em larga escala.

EXEMPLO 2: Liofilização de uma formulação de vacina à base de hidróxidode alumínio

Contexto e Objetivo

As formulações de vacina à base de hidróxido de alumínio(AI(0H)3) devem ser armazenadas sob refrigeração e em condições de nãocongelamento caso se deseje que as preparações mantenham sua potênciae propriedades. Mais além, a liofilização de uma formulação de vacina reduztanto a potência quanto as características gerais (velocidade de sedimenta-ção, fluidez) da vacina após a reconstituição.

A trealose é um hidrato de carbono diglicose, que tem sido utili-zado como aditivo para estabilizar uma série de compostos durante a liofili-zação e armazenamento.

O objetivo das presentes investigações foi determiner os efeitosda trealose, em particular durante a liofilização, sobre uma formulação devacina na forma de uma mistura de uma suspensão aquosa de hidróxido dealumínio e o extrato de um alérgeno Der ρ ou Phl p, em particular os efeitossobre as propriedades físicas e químicas, a atividade/ potência e a imunoge-nicidade da vacina.

Métodos

Preparação da amostra

Em todas as analyses realizadas com o hidróxido de alumínioseparadamente, foram utilizados Alhidrogel® 20%, 1,3% obtido do Brenntag(conteúdo do resíduo da combustão (AI203): 1,3% w/w; conteúdo corres-pondente do AI(OH)3: 1,99% w/w; conteúdo de alumínio: 6,25 mg Al/ml ±-5%).

Adsorção

As formulações líquidas foram preparadas através da mistura aolongo da noite de 10% de alérgeno a 4-8 °C, 1.000.000 SQ/ml com 20% deAlhidrogel ® 1,3% obtido da Brenntag (conteúdo do resíduo da combustão(AI203): 1,3% w/w; conteúdo correspondente do AI(OH)3: 1,99% w/w; con-teúdo de alumínio: 6,25 mg Al/ml ± 5%). Foram acrescentados 70% de tam-pão de Coca adicional com ou sem trealose. Em um caso foi utilizado o ex-trato de Phl ρ marcado com FITC.

Liofilização

Amostras de 1 mL (1,2 mL para o protocolo de imunização decamundongo) foram aliquotadas em ampolas de vidro. As amostras foramentão congeladas a -80°C por 5 minutos e então Iiofilizadas ao longo da noi-te. O pó Iiofilizado foi estudado antes das amostras seres redissolvidas em 1mL de água MilliQ.Análise microscópica

As amostras foram analisadas utilizando um Leica TCSSP2/Leica DC500 para ambas as fases de análise microscópica por contras-te e análise microscópica por fluorescência. As amostras também foram ana-lisadas com um microscópio de polarização (Olympus SZ 60).RIE por imunoeletroforese RocketA RIE foi realizada de acordo com o protocolo descrito em Axel-sen et al. 1973 [1]. Na RIE1 a amostrai é separada eletroforeticamente emuma dimensão em um gel de agarose. A identificação da proteína na RIE sedá por um precipitato em forma de foguete. Para a vacina com Phl p, foi rea-lizada uma RIE com anti-Phl ρ e anti-Phl ρ 6 elevados contra o sobrenadan-tes das amostras. Para a vacina com Der p, foi realizada a RIE com anti-Derp, anti-Der ρ 1 e anti-Der ρ 2 elevados contra o sobrenadante das amostras.

Experimentos da Inibição da IgE

Os experimentos da inibição da IgE foram realizados no sistemaAdvia Centaur. Uma amostra de soro (25 pL do soro obtido da mistura dequantidades equivalentes do soro de indivíduos alérgicos aos acarinos dapoeira caseira) foi misturada com uma fase sólida (partículas paramagnéti-cas) de anticorpos anti IgE imobilizados. Após a incubação e a lavagem, di-luições em série do inibidor (extrato, vacina ou vacina Iiofilizada e re-dissolvida) foram misturadas com uma quantidade constante de Der ρ bioti-nilada. A quantidade de Der ρ biotinilado ligado aos anticorpos anti IgE ad-sorvidos à fase sólida foi estimada de acordo com a quantidade de luz emiti-da (RLU) após a adição de Streptavidina marcada com éster de acridínium,a incubação e a lavagem.

Os valores de RLU medidos foram transformados no grau deconectividade (DoB) de acordo com a equação 1.

<formula>formula see original document page 30</formula>

em que RLUi é a leitura obtida na presença do inibidor i em uma dose espe-cífica; RLUBasePool é o sinal de fundo e RLUi=O é o sinal obtido quandoutilizando o tampão como inibidor (inibição de 0%). Todos os valores de RLUforam determinados como medidas dependentes tríplices, tendo a médiadestas sido usada nos cálculos.

Os conjuntos de dados de (log 10 Dose, DoB) para cada prepara-ção inibitória testada foram enquadrados (GrapPad Prism v. 4.03) a umafunção logística de acordo com a equação 2.<formula>formula see original document page 31</formula>

Equação 2,

em que Β, Τ, logEC50 e HS são parâmetros determinados a partir do en-quadre não linear. B é o "fundo" da assíntota da curva em S, T é o "pico" daassíntota da curva em S, EC50 é a dose necessária para se obter 50% deinibição e HS (declive da curva) é o indicador do quão "íngreme" ou inclinada éa curva em S. Os valores de HS foram comparados diretamente no procedi-mento de enquadro e caso os declives das curvas comparadas fossem estatis-ticamente indistinguíveis, calculava-se os valores de logEC50 de acordo comuma estimativa comum de declive, utilizando-os na comparação das potências.

Todas as computações estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism v.4.03.

O experimento de inibição foi realizado em dois dias à parte e osdados foram agrupados antes da análise.

Imunização de camundongos com formulações contendo trealo-se -Protocolo de Imunização

Os camundongos foram imunizados i.p. (intraperitonialmente) acada duas semanas por um total de 6 vezes com 100 μΙ de formulação líqui-da com uma das seguintes composições:

1. Phl ρ (extrato de Phleum pratense) combinado a Alhidrogel(PhIpAIum).

2. Phl ρ combinado a Alhidrogel, seco a frio e redissolvido imedi-atamente antes do uso (FD Phl ρ Alum).

3. Phl ρ + 100 mM de trealose combinados a Alhidrogel (Phl ρTH100).

4. Phl ρ + 200 mM de trealose combinados a Alhidrogel (Phl ρTH200).

5. Phl ρ + 300 mM de trealose combinados a Alhidrogel (Phl ρTH300).

6. Phl ρ + 100 mM de trealose combinados a Alhidrogel, secos afrio e redissolvidos imediatamente antes do uso (FD Phl ρ TH100).

7. Phl ρ + 200 mM de trealose combinados a Alhidrogel, secos afrio e redissolvidos imediatamente antes do uso (FD Phl ρ ΤΉ200).

8. Phl ρ + 300 mM de trealose combinados a Alhidrogel, secos afrio e redissolvidos imediatamente antes do uso (FD Phl ρ TH300).

9. Der ρ (extrato de Dermatophagoides pteronyssinus) combina-do a Alhidrogel (Der ρ Alum).

10. Der ρ combinado a Alhidrogel, seco a frio e redissolvido ime-diatamente antes do uso (FD Der ρ Alum).

11. Der ρ + 100 mM de trealose combinados a Alhidrogel (Der ρTH100).

12. Der ρ + 200 mM de trealose combinados a Alhidrogel (Der ρTH200).

13. Der ρ + 300 mM de trealose combinados aAlhidrogel (Der ρTH300).

14. Der ρ + 100 mM de trealose combinados aAlhidrogel, secosa frio e redissolvidos imediatamente antes do uso (FD Der ρ TH100).

15. Der ρ + 200 mM trealose combinados aAlhidrogel, secos afrio e redissolvidos imediatamente antes do uso (FD Der ρ TH200).

16. Der ρ + 300 mM trealose combinados aAlhidrogel, secos afrio e redissolvidos imediatamente antes do uso (FD Der ρ TH300),

Cada grupo continha de 7 a 8 camundongos e foram usadoscamundongos Balb c/A nos grupos de 1 a 8 e SJL nos grupos de 9 a 16.

As formulações líquidas foram preparadas através da mistura aolongo da noite a 4-8°C de 10% de alérgeno a 4-8 0C, 1.000.000 SQ/ml com20% de Alhidrogel ® 1,3% obtido da Brenntag (conteúdo do resíduo dacombustão (AI203): 1,3% w/w; conteúdo correspondente do AI(OH)3: 1,99%w/w; conteúdo de alumínio: 6,25 mg Al/ml ± 5%). Foi acrescentado 70% detampão de Coca adicional com ou sem trealose. Parte de cada formulaçãofoi Iiofilizada conforme descrito acima nos métodos de liofilização. As amos-tras Iiofilizadas foram armazenadas em um freezer e redissolvidas anterior-mente a cada imunização.

Na linha de base e após a 2o, 3o, 5o e 6o imunizações, foram ti-radas amostras de sangue, coletado o soro e determinados os níveis de a-lérgeno IgG específico através do seguinte ensaio.Ensaio IgG

A IgG Phl p, Der ρ 1 ou Der ρ 2 específica foi determinada nosgrupos 1 a8e9a 16, respectivamente, através de um teste ELISA direto. OELISA foi realizado pelo revestimento, bloqueio e incubação do alérgenocom soro e detecção pela IgG anticamundongo marcada com HRP, seguidopor TMB e ácido acídico para interrrupção da reação. A absorção foi medidaem um leitor ELISA. Cada passo foi separado por uma lavagem.Resultados e Discussão

Análise Microscópica e RIE

Primeiro foi testado o efeito da trealose sobre o hidróxido de a-lumínio sem antígeno.

Imagens de contraste de fases do hidróxido de alumínio não tra-tado armazenada a 5°C sem trealose e com 300mM de trealose, e de hidró-xido de alumínio Iiofilizado e redissolvido sem trealose e com 300 mM detrealose mostram que a trealose não parece afetar as partículas de hidróxidode alumínio quando a amostra é armazenada a 5°C. Quando o hidróxido dealumínio é liofilizado, são formados cristais "platelet" mesmo depois da re-dissolução da amostra. Também é verificado que o hidróxido de alumínioliofilizado e redissolvido com 300 mM de trealose parece ter mantido a mes-ma estrutura em gel que as amostras de referência armazenadas a 5°C.

As imagens do microscópio de polarização do hidróxido de alu-mínio liofilizado e redissolvido sem tralose e com 300 mM de trealose mos-tram claramente que são formados cristais no hidróxido de alumínio Iiofiliza-do e redissolvido sem trealose, mas que nenhum cristal é visível quando ohidróxido de alumínio é liofilizado na presença da trealose.

As imagens de contraste de fases do hidróxido de alumínio Phl ρmarcado com FITC armazenadas a 5°C com concentrações de trealose de0, 50, 100, 150, 200 e 300 mM, e de hidróxido de alumínio Phl ρ marcadocom FITC liofilizado e redissolvido com concentrações de trealose de 0, 50,100, 150, 200 e 300 mM, mostram que, com o aumento das concentraçõesde trealose, as estruturas das partículas de gel nas amostras redissolvidasmantiveram de forma progressivamente maior a estrutura de gel das amos-tras de referência. A partir das imagens de contraste de fases, parece queuma concentração de trealose de 150-200 mM é suficiente para manter aestrutura de gel.

As imagens do microscópio de polarização do hidróxido de alu-mínio Phl ρ armazenado a 5°C com concentrações de trealose de 0, 50, 100,150, 200 e 300 mM, e do hidróxido de alumínio Phl ρ Iiofilizado e redissolvidocom concentrações de trealose de 0, 50, 100, 150, 200 e 300 mM, mostramque, para previnir a formação de cristais, basta 50 mM para Iiofilizar o hidró-xido de alumínio Phl p.

A partir da RIE realizada com A) amostras de teste na forma desupenatante de hidróxido de alumínio Phl ρ i) Iiofilizado e redissolvido e ii)armazenada a 5°C, para concentrações de trealose de 0 e 300 mM, precipi-tadas por anticorpos anti-Phl ρ de coelho; B)amostras de teste na forma desoluções padrão de Phl ρ contendo 25.000 SQ e 50.000 SQ precipitadas poranticorpos anti-Phl ρ 6 de coelho; C) amostras de teste na forma de sobre-nadante de hidróxido de alumínio Phl ρ armazenado a 5°C com concentra-ções de trealose de 0, 50, 100, 150, 200 e 300 mM, precipitadas por anticor-pos anti-Phl ρ 6 de coelho; e D) amostras de teste na forma de sobrenadantede hidróxido de alumínio Phl ρ Iiofilizado e redissolvido com concentraçõesde trealose de 0, 50, 100, 150, 200 e 300 mM, precipitadas por anticorposanti-Phl ρ 6, mostra que a presença da trealose aumenta a quantidade dePhl ρ e Phl ρ 6 no sobrenadante, significando que a presença da trealosedessorve um pouco de Phl p/ Phl p6. Também é observado que a dessorçãodo Phl ρ 6 aumenta apenas levemente quando as concentrações de trealoseaumentam de 50 mM para 300 mM.

O hidróxido de alumínio Phl ρ marcado com FITC foi Iiofilizado eredissolvido sem trealose e com 300 mM de trealose para se verificar se oextrato de Phl ρ é adsorvido pelas partículas de gel de hidróxido de alumíniovisualizadas através de microscopia de contraste de fases. As amostras fo-ram analisadas tanto por microscopia de contraste de fase quanto por mi-croscopia de fluorescência depois do que foi formada uma superposição dasduas imagens. Parece que a fluorescência detectada no rótulo de FITC tema mesma posição que as partículas de gel de hidróxido de alumínio paraambas as amostras Iiofilizadas sem trealose e com 300 mM de trealose, in-dicando que o extrato de Phl ρ é adsorvido pelas partículas de gel de hidró-xido de alumínio. Mais além, parece que, se comparadas às partículas degel Iiofilizadas na ausência da trealose, aquelas Iiofilizadas na presença datrealose são muito menores, distribuídas mais homogeneamente e lembrammais as partículas de gel não submetidas à liofilização.

A partir das imagens da microscopia de contraste de fase do hi-dróxido de alumínio Der ρ sem tratamento armazenado a 5°C sem trealose ecom 300 mM de trealose, e do hidróxido de alumínio Der ρ Iiofilizado e redis-solvido sem trealose e com 300mM de trealose, parece que a presença datrealose parece não afetar as partículas de gel de hidróxido de alumínio ar-mazenadas a 5°C, porém a trealose claramente estabiliza o hidróxido dealumínio Der ρ durante a liofilização uma vez que as partículas de gel man-têm a mesma estrutura da formulação de referência armazenad a 5°C.

As imagens da microscopia de polarização do hidróxido de alu-mínio Der ρ não tratado armazenado a 5°C na ausência da trealose e com300 mM de trealose; e do hidróxido de alumínio Der ρ Iiofilizado e redissolvi-do sem trealose e com 300mM de trealose também mostram claramente quese formam cristais quando o hidróxido de alumínio Der ρ é Iiofilizado sem atrealose, não sendo visualisado nenhum cristal quando o hidróxido de alumí-nio Der ρ é Iiofilizado na presença de 300mM de trealose.

A partir da RIE realizada com A) amostras de teste na forma desupenatante de hidróxido de alumínio Der ρ i) Iiofilizado e redissolvido e ii)armazenada a 5°C, para concentrações de trealose de 0 e 300 mM, precipi-tadas por anticorpos anti-Der ρ de coelho; B)amostras de teste na forma desoluções padrão de Der ρ 1 contendo 33.000 SQ, 100.000 SQ e 300.000 SQe supernantante de hidróxido de alumínio Der ρ i) Iiofilizado e redissolvido eii) armazenada a 5°C, para concentrações de trealose de Ò e 300 mM, preci-pitadas por anticorpos anti-Der ρ 1 de coelho; C) amostras de teste na formade soluções padrão de Der ρ 1 contendo 33.000 SQ1 100.000 SQ e 300.000SQ e sobrenadante de hidróxido de alumínio Der p, i) Iiofilizado e redissolvi-do e ii) armazenada a 5°C, para concentrações de trealose de O e 300 mM,precipitadas por anticorpos anti-Der ρ 2 de coelho; parece que a presençada trealose não parece induzir qualquer dessorção.

Experimentos de inibição da IqE

As formulações de vacina contendo hidróxido de alumínio comoadjuvante devem ser mantidas acima do ponto de congelamento em ordemde prevenir danos irreversíveis à formulação, não sendo possível Iiofilizar aspreparações de vacina sem comprometer seriamente sua atividade. Sabe-seque a trealose possui propriedades de estabilização protéica e, conformedemonstrado abaixo, este composto pode estabilizar formulações de hidró-xido de alumínio sob condições de secagem a frio.

A figura 1 mostra o grau de inibição da ligação da IgE Der ρ es-pecífica ao Der ρ biotinilado por uma série de inibidores, viz. Solução de ex-trato de Der ρ (Der ρ IMP 7331_23,240205), hidróxido de alumínio Der ρ(Dp_Alu-TH_5C_230205), hidróxido de alumínio Der ρ com 300 mM trealose(Dp_Alu+TH_5C_230205), sobrenadante de hidróxido de alumínio Der ρ(Dp_Sup-TH_5C_230205), e sobrenadante de hidróxido de alumínio Der ρcom 300 mM trealose (Dp_Sup+TH_5C_230205). A figura 1 ilustra que aTrealose (300 mM) pode ser misturada com uma formulação de hidróxido dealumínio sem que ocorram quaisquer alterações detectáveis na atividade davacina, e sem que qualquer atividade possa ser detectada no sobrenadante,indicando que a trealose não eluiu qualquer uma das proteínas Iiga-das/adsorvidas no hidróxido de alumínio.

A figura 2 mostra o grau de inibição da ligação da IgE Der ρ es-pecífica a Der ρ biotinilados por uma série de inibidores, viz. Solução de ex-trato de Der ρ (Der ρ IMP 7331_23,240205), hidróxido de alumínio Der ρ Iiofi-lizado (Dp_Alu-TH_Lyo_230205), hidróxido de alumínio Der ρ com 300 mMde trealose (Dp_Alu+TH_Lyo_230205), sobrenadante de hidróxido de alumí-nio Der ρ (Dp_Sup-TH_LyoSup_230205), e sobrenadante de hidróxido dealumínio Der ρ com 300 mM de trealose (Dp_Sup+TH_LyoSup_230205).

A figura 2 mostra que a trealose pode manter a potência de for-mulações de vacina à base de hidróxido de alumínio após sua liofilização ereconstituição em tampão. Caso a trealose seja omitida no processo de liofi-lização, a vacina perde cerca de 85% da sua potência anterior.

A figura 3 mostra uma comparação das estimativas de potênciapara três pares de formulações testadas, viz. i) Dp_Alu-TH_Lyo vs.Dp_Alu+TH_Lyo, ii) IMP vs. Dp_Alu+TH_Lyo, e iii) IMP vs. Dp_Alu-TH_Lyoutilizando as denominações usadas acima. A diferença dos valores de Lo-gEC50, incluindo o limite de confiança (CL) de 95%, são plotados para osvários pares testados. Caso o CL dom par testado inclua O, os valores sãoestatisticamente indestinguíveis, e caso não incluaO, os valores são estatisti-camente diferentes significativamente. Conforme mostrado na figura 3, apreparação Iiofilizada e re-dissolvida de hidróxido de alumínio contendo trea-lose é estatisticamente indistinguível da preparação de referência não trata-da, ao passo que a preparação Iiofilizada sem o agente estabilizante perdepotência de forma significativa.

Imunização dos Camundonqos

A figura 4 mostra o nível de IgG Phl ρ específica em camundon-gos imunizados três vezes com diferentes formulações de Phl p, nas quais aIgG Phl ρ específica é representada como o valor de DO relativa (o valor deDO relativa da amostra de soro na diluição de 1:64.000 corrigido com o valorde DO para uma amostra de referência em diluição de 1:40.000) com cadaponto representando o soro de um camundongo. "Phl ρ alum" significa hi-dróxido de alumínio Phl p, FD significa Iiofilizado e TH 100, 200 e 300 signifi-cam trealose 100, 200 e 300 mM, respectivamente. Os resultados revelamque a trealose não inibe por si só a resposta imune contra o Phl ρ em quais-quer das concentrações utilizadas. Conforme esperado, não é observadaqualquer redução significativa da resposta imune para o hidróxido de alumí-nio Phl ρ Iiofilizado na ausência da trealose.

A figura 5 mostra o nível de IgG Der ρ 1 específica em camun-dongos imunizados duas vezes (painel superior) e cinco vezes (painel supe-rior) com diferentes formulações de Der p, nas quais a IgG Der ρ específicaé representada como o valor de DO relativa (o valor de DO relativa da amos-tra de soro na diluição de 1:15.000 corrigido com o valor de DO para umaamostra de referência em diluição de 1:45.000), com cada ponto represen-tando o soro de um camundongo.

Os resultados para os ratos imunizados com diferentes formula-ções de Der ρ também mostram, em consistência com os dados para asformulações de Phl p, que a trealose não inibe a resposta imune específicacontra o alérgeno (figura 5, ambos painéis). Uma formulação Iiofilizada deDer ρ sem trealose apresenta uma resposta retardade e prejudicada emcomparação a uma formulação não Iiofilizada (figura 5, painel superior e infe-rior), enquanto a adição da trealose à formulação a protege durante a Iiofili-zação, uma vez que o nível de IgG Der ρ específica nas formulações Iiofili-zadas com trealose são comparáveis as daquelas do hidróxido de alumínioDer ρ não Iiofilizado (figura 5, painel inferior). O mesmo nível de benefícioprotetivo é obtido para as concentrações de trealose examinadas.

A figura 6 ilustra o desenvolvimento temporal da IgG Der ρ 1 es-pecífica durante o curso de um programa de imunização. Conforme mencio-nado anteriormente, o prenúncio da resposta imune para a formulação dehidróxido de alumínio Der ρ Iiofilizada é bem retardado em comparação à-quele para o hidróxido de alumínio Der ρ não sujeito à liofilização. A adiçãode trealose antes da liofilização aproxima o desenvolvimento da resposta daIgG ao da formulação não liofilizada, sendo preferível a formulação com 300mM de trealose.

Conclusão

Microscopia e Imunoeletroforese Rocket (RIE)

As análises do hidróxido de alumínio Phl ρ e do hidróxido de a-lumínio Der ρ mostram:

1. A trealose não parece influenciar as partículas de gel quando as a-mostras são armazenada a 5°C.

2. A presença da trealose durante a liofilização previne a formação decristais já com a adição de 50 mM de trealose.

3. As imagens de contraste de fase mostram que as partículas de geldas formulações Iiofilizadas e redissolvidas na presença de concentraçõesde trealose superiores a 150 mM mantêm uma estrutura similar a das formu-lações de referência não submetidas à liofilização.

A RIE do sobrenadante das amostras de hidróxido de alumínioPhl ρ mostra que a presença da trealose induz a dessorção de Phl ρ e Phl ρ6. Contudo, a microscopia do hidróxido de alumínio Phl ρ marcado com FITCmostrou que o Phl ρ está associado às partículas de gel.

A análise da RIE das amostras de hidróxido de alumínio Der ρmostrou que não houve dessorção detectável da Der p, Der ρ 1 e Der ρ 2.

Experimentos de Inibição da IqE

1. A trealose protege a vacina Alutard de Der ρ durante a liofilização,sendo a vacina reconstituída comparável a uma preparação referência nãosubmetida à liofilização no que refere-se à potência e à composição.

2. A trealose não elúe as proteínas da formulação de vacina.

3. As vacinas com hidróxido de alumínio liofilizadas sem trealose namistura perdem 85% da sua potência quando reconstituídas em tampão.

Imunização de Camundonqos

1. Tanto para as formulações de hidróxido de alumínio Phl ρ quanto Derp, é mostrado que a trealose por sis ó não inibe a resposta immune.

2. O prenúncio da resposta immune com as formulações de hidróxido dealumínio Der ρ Iiofilizadas é bem retardade em comparação com aquelas dehidróxido de alumínio Der ρ não submetidas à liofilização. A adição de trea-lose antes da liofilização aproxima o desenvolvimento da resposta de IgG aode uma formulação não liofilizada, sendo a formulação preferível com 300mM de trealose.

Referências

Axelsen N H, Krell J e Weeke B; 1973; A Manual of Quantitative Immunoe-lectrophoresis-Methods and Applications; Scandinavian Journal of Immu-nology; "Um Manual de Imunoeletroforese Quantitativa - Métodos e Aplica-ções"; "Jornal Escandinavo de Imunologia"; vol. 2; suplemento N°. 1.

Claims (43)

1. Uso de um Iiofilisato de uma suspensão contendo um sal me-tálico oxigenado, pelo menos um antígeno e pelo menos um excipiente sele-cionado dentre (i) sacarídeos, (ii) álcoois de açúcar e (iii) aminoácidos ousais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos para o preparo de uma for-mulação de vacina sólida para a administração via mucosa caracterizadapela rehidratação da formulação de vacina sólida quando em contato com amucosa.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, no qual a suspensãocontém um sacarídeo selecionado do grupo consistindo em dextrose, saca-rose, lactose, trealose, celobiose, rafinose, isomaltose e ciclodextrinas.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, no qual o sacarídeo éselecionado do grupo consistindo em trealose e sacarose.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, noqual a suspensão contém um álcool de açúcar.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, no qual a suspensãocontém um álcool de açúcar selecionado dentre um grupo consistindo emmanitol, sorbitol e alitol.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, noqual a suspensão contém um aminoácido selecionado dentre glicina, alani-na, glutamina, prolina, serina, arginina, Iisina e histidina e sais farmaceuti-camente aceitáveis dos mesmos.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, noqual a suspensão contém um excipiente adicional que seja um polímero,preferivelmente o dextrano.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, noqual a suspensão contém uma mistura de:(a) sacarose e manitol,(b) sacarose, glicina e dextrano,(c) trealose e manitol,(d) sacarose, manitol e dextrano,(e) trealose, manitol e dextrano,(f) trealose, glicina e dextrano,(g) trealose e glicina,(h) sacarose e glicina, ou(i) glicina e manitol.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, noqual o antígeno seja um alérgeno.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, noqual o sal metálico oxigenado é um hidróxido de alumínio.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10,no qual a formulação é um comprimido.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, no qual o comprimidoé um comprimido não prensado.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12, no qual o comprimidonão prensado é um comprimido de rápida dissolução.

14. Uso de acordo com a reivindicação 11, no qual o comprimidoé um comprimido prensado.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-14,no qual o comprimido destina-se à administração sublingual.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10,no qual a formulação é um pó.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10,no qual a formulação está na forma de partículas.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10,no qual a formulação está na forma de um granulado.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10,no qual a formulação é uma cápsula contendo o liofilisato.

20. Formulação de vacina sólida adaptada para a administraçãovia mucosa, contendo pelo menos um antígeno na condição de substânciaativa, na qual a formulação contém um liofilisato de uma suspensão conten-do um sal metálico oxigenado, o(s) antígeno(s) e pelo menos um excipienteselecionado dentre (i) sacarídeos, (ii) álcoois de açúcar e (iii) aminoácidos ousais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e na qual a formulação devacina sólida seja desenhada para se rehidratar quando em contato comalguma mucosa.

21. Formulação de acordo com a reivindicação 20, na qual asuspensão contém um sacarídeo selecionado dentre um grupo consistindoem dextrose, sacarose, lactose, trealose, celobiose, rafinose, isomaltose eciclodextrinas.

22. Formulação de acordo com a reivindicação 21, na qual o sa-carídeo seja selecionado dentre o grupo consistindo em trealose e sacarose.

23. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações- 20-22, na qual a suspensão contém um álcool de açúcar.

24. Formulação de acordo com a reivindicação 23, na qual asuspensão contém um álcool de açúcar selecionado dentre um grupo con-sistindo em manitol, sorbitol e alitol.

25. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações- 20-24, na qual a suspensão contém um aminoácido selecionado dentre glici-na, alanina, glutamina, prolina, serina, arginina, Iisina e histidina e sais far-maceuticamente aceitáveis dos mesmos.

26. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações- 20-25, na qual a suspensão contém um excipiente adicional que seja umpolímero, preferivelmente o dextrano.

27. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações- 20-26, na qual a suspensão contém uma mistura de:(a) sacarose e manitol,(b) sacarose, glicina e dextrano,(c) trealose e manitol,(d) sacarose, manitol e dextrano,(e) trealose, glicina e dextrano,(f) trealose, manitol e dextrano,(g) trealose e glicina,(h) sacarose e glicina, ou(i) manitol e glicina.

28. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-20-27, na qual o antígeno é um alérgeno.

29. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-20-28, na qual o sal metálico oxigenado é o hidróxido de alumínio.

30. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-20-29, na qual a formulação é um comprimido.

31. Formulação de acordo com a reivindicação 30, na qual ocomprimido é um comprimido não prensado.

32. Formulação de acordo com a reivindicação 31, na qual ocomprimido não prensado é um comprimido de rápida dissolução.

33. Formulação de acordo com a reivindicação 30, na qual ocomprimido é um comprimido prensado.

34. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-30-33, na qual o comprimido destina-se à administração sublingual.

35. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-20-29, na qual a formulação é um pó.

36. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-20-29, na qual a formulação está na forma de partículas.

37. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-20-29, na qual a formulação está na forma de um granulado.

38. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações-20-29, na qual a formulação é uma cápsula contendo o liofilisato.

39. Método para a vacinação de indivíduos envolvendo a admi-nistração via mucosa de uma quantidade eficaz de uma formulação sólidacomo definida nas reivindicações 20-38, no qual a administração via mucosase caracteriza pela re-hidratação da formulação de vacina sólida quando emcontato com a mucosa.

40. Método para o tratamento de alergias ou mitigação dos sin-tomas de alergia envolvendo a administração via mucosa de uma quantida-de eficaz de uma formulação sólida como definida nas reivindicações 20-38,no qual a administração via mucosa se caracteriza pela re-hidratação daformulação de vacina sólida quando em contato com a mucosa.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39ou 40, no qual a administração se dá através da mucosa oromucosal.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, no qual a admi-nistração se dá através da mucosa sublingual.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39--40, no qual a administração é oral e se dá através da membrana da mucosagastrointestinal.