JP5761661B2 - 海洋性腐植土の水溶性抽出液およびフルボ酸とその用途 - Google Patents
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具体的には、本発明は、海洋性腐植土の水溶性抽出液を有効成分とする血栓溶解用組成物に関する。
より具体的には、本発明は、海洋性腐植土の水溶性抽出液またはフルボ酸を有効成分とする血栓溶解用組成物に関する。
海洋性腐植土を、水酸化ナトリウムまたはピロリン酸ナトリウムなどのアルカリを加え処理すると、海洋性腐植土に含まれる海洋性腐植物質の60〜80%を含む濃赤褐色の懸濁液が得られる。
また、アルカリを加えて得られた溶液にpH1〜2程度の酸を加えて酸性にすると黒褐色の綿状の沈殿物を生じる。この酸に不溶な物質を腐植酸(humic acid)という。
腐植酸は分子量300,000程度までの物質であり、腐植物質としての性質はこの腐植酸によるものとされている。
損傷を受けた血管壁では内皮下組織のコラーゲン繊維が露出し、そこに血液中の血小板が粘着、凝集して血小板血栓を形成する。この初期反応を一次止血とよぶ。
血小板血栓は一時的なものであり、安定した血栓になるためにはフィブリン網でしっかりと血小板血栓を包み込む必要がある。このフィブリン血栓を完成させるのが二次止血である。
この反応は、プラスミノーゲンの血中濃度がほぼ一定で劇的に変化することがないので、主にt-PAやu-PAの発現量や活性量の変化で調節される。ただし、t-PAやu-PAの活性はこれらのインヒビターであるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1(plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1))とのバランスによって決定されることが知られている(非特許文献7および8)(図1参照)。
上記の水性溶媒としては、水;希塩酸のような酸性水溶液;水性エタノールのような50%以下の低級アルコールの水溶液を用いることができる。水は、塩素を除去したものが好ましい。塩素を除去する方法としては特に限定されないが、常温で数日間放置する方法、アスコルビン酸などの還元剤を用いる方法、活性炭またはイオン交換樹脂などの吸着剤を用いる方法などが挙げられるが、蒸留水、イオン交換蒸留水またはミリポア水がさらに好ましい。
水性溶媒のpHは特に限定されないが、pH6.0〜8.0の範囲のものが好ましく、より好ましくはpH6.3〜7.5の範囲である。
また、本発明で用いられるフルボ酸としては、例えば、日本腐植物質学会より提供された段戸フルボ酸および佐賀大学総合分析実験センターより提供された筑後川フルボ酸が挙げられる。
(1) 腐植土と水性溶媒との混合物(1:5〜1:10(重量比))を、攪拌および静置を繰り返し工程;
(2)固形物を除去工程;
(3)得られた懸濁液を周囲温度で長期間静置し、上清を得る工程。
次いで、得られた懸濁物を室温で処理する。
本明細書において用いられる「室温」とは、20〜45℃、好ましくは25〜40℃、より好ましくは28〜35℃の室内温度を意味する。
上記の処理は、攪拌および静置を繰り返すことにより行われる。攪拌は、容器の底部に沈殿した腐植土が水性溶媒中に拡散される程度に行えばよく、連続的または断続的のいずれであってもよい。この処理は、1週間以上続けることができる。
デカントにより沈殿物を分離する方法は、懸濁物を25〜35℃で150〜240時間程度静置して腐植土を沈殿させた後に、デカントにより上清だけを取得する。より確実に固形物を除去するために、さらに布などを用いて浮遊物をろ去してもよい。このようにして得られる上清は、pH2.5〜3.0程度である。
上記の方法により得られる腐植土の水性溶媒抽出液は、pH2.0〜3.5、及び電気伝導度が350〜500mVの薄茶色の実質的に無臭の液体である。
すなわち、上記の海洋性腐植土の水性溶媒抽出液を、海洋性腐植土1重量部に対して蒸留水3〜12重量部、好ましくは、4〜8重量部、さらに好ましくは、6重量部を用いて混合し、超音波ホモジナイザーアイラVCX−130(SONICS & MATERIALS Inc,;130Watt、20Khz、30%振幅)にて10分間超音波処理した。この超音波処理液を、1000rpmで5分間遠心分離して、得られた上清を、ステラディスク(0.2μm)を用いてろ過し、得られたろ液(pH2.83)を海洋性腐植土水性溶媒抽出液として用いることができる。
海洋性腐植土は、マリネックス社製有明海産粉末状海洋性腐植土(Lot. No. 08−02)を用いた。また、フルボ酸は、日本腐植物質学会より提供された段戸フルボ酸および佐賀大学総合分析実験センターより提供された筑後川フルボ酸を用いた。
海洋性腐植土の水性溶媒抽出液
海洋性腐植土の水性溶媒抽出液は、株式会社マリネックス社製粉末状海洋性腐植土3.0gに対して蒸留水18.0gを用いて混合し、超音波ホモジナイザーアイラVCX−130(SONICS & MATERIALS Inc,;130Watt、20Khz、30%振幅)にて10分間超音波処理した。この超音波処理液を、1000rpmで5分間遠心分離して、得られた上清11.0gを、ステラディスク(倉敷紡績株式会社製;Lot. No. 180925;0.2μm)を用いてろ過し、得られたpH2.83のろ液10.6gを海洋性腐植土水性溶媒抽出液の試料とした。
海洋性腐植土抽出液が培養血管内皮細胞における線溶系因子のmRNA発現に及ぼす影響
血管内皮細胞
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞由来の樹立化細胞(TKM-33)を使用した。
培養血管内皮細胞におけるt-PA、u-PA、PAI-1およびGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNAsの発現はStepOnePlus(商標) Real-Time PCR System (Applied Biosystems、CA、USA)を用いて行った。培養血管内皮細胞からのmRNAの抽出にはRNeasy(登録商標) Mini Kit (50) (QIAGEN, Tokyo, Japan) を使用した。抽出したmRNAからcDNAへの逆転写は、High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, CA, USA, Lot.No. 0901013)を用いて行った。以下のprimer probeはいずれもApplied Biosysytems(CA, USA)より購入した。GAPDHに対するprimer probeは、GAPDH (Hs 999999_m1, Lot. No. 715871) を用いた。u-PAに対するprimer probeは、PLAU (Hs 00170182_m1, Lot. No. 674275) を用いた。t-PAに対するprimer probeは、PLAT (Hs 00263492_m1, Lot. No. 674699) を用いた。PAI-1に対するprimer probeは、SERPINE (Hs 00167155_m1,Lot. No. 684880) を用いた。
0.8×105 細胞/dishの密度になるように10% ウシ胎仔血清(FBS)を含む(+)RPMI-1640培地で細胞懸濁液を調整し、直径100mmのペトリディッシュ(IWAKI, Chiba, Japan)に播種した。翌日、細胞が定着しているのを確認し、2〜3日後に細胞がサブコンフルエントになった時点で実験を開始した。
培養液中に海洋性腐植土抽出液が1容量%含まれるように培養液を調整した。コントロールとして海洋性腐植土抽出液の代わりに滅菌蒸留水を使用した。
細胞は-80℃にて保存した。
u-PA、t-PA、PAI-1 mRNA発現量はGAPDH mRNA発現量で補正した。蒸留水(コントロール)と海洋性腐植土抽出液を培養液に加えたときのt-PA mRNA発現量は、それぞれ0.863±0.226と1.277±0.339であった。u-PA mRNA発現量はそれぞれ、0.932±0.327と1.059±0.125であった。PAI-1 mRNA発現量はそれぞれ、3.990±0.691と2.536±0.553であった。培養液に海洋性腐植土抽出液を加えた場合、t-PA mRNAの発現量はコントロールに比べて有意に増加していた。u-PA mRNAの発現量にも増加傾向が認められたが、有意差は認められなかった。一方、培養液に海洋性腐植土抽出液を加えた場合、PAI-1 mRNAの発現量はコントロールに比べて有意に減少していた(図3参照)。
以上の結果から海洋性腐植土抽出液は、血栓溶解に係わるt-PAおよびu-PA mRNAを増加し、血栓溶解を抑制するPAI-1を減少させることから血栓溶解促進作用を有することが判った。
海洋性腐植土水抽出物の血管内皮細胞培養液中u-PA活性に及ぼす影響
TKM-33を0.3×104 細胞/wellの密度になるように10% FBS(+) RPMI-1640培地で調整し、24 well プレートの各wellに500μlずつ播種した。2〜3日間培養して細胞がサブコンフルエントになったのを確認してから実験を開始した。
海洋性腐植土水抽出物は、原液か、蒸留水で1/2、1/4および1/8希釈した各希釈液を試料とした。これを、培養液中にそれぞれ1容量%ずつ添加した。コントロールとして蒸留水を使用した。培養液を除去後、細胞をPBSで洗浄した。その後、各試料を含む培養液に培地換えを行い、37℃、5% CO2下のインキュベーター内に静置した。24時間後、培養液を回収し、−20℃にて保存した。この培養液を試料としてフィブリンエンザイモグラフィーでu-PA活性を測定した。
すなわち、海洋性腐植土水抽出液は、培養血管内皮細胞に作用して、培養血管内皮細胞からのu-PA分泌量を増加することが判った。
フルボ酸の培養血管内皮細胞への影響
フルボ酸試料
日本腐植物質学会より提供された段戸フルボ酸、および佐賀大学総合分析実験センターより提供された筑後川フルボ酸の二種類のフルボ酸を使用した。
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞由来の樹立化細胞(TKM-33)を使用した。
培養液中に前記蒸留水で調整した10 mg/ml、1 mg/ml、0.1 mg/mlのフルボ酸溶液(pH 2)を、培養液中に1容量%ずつそれぞれ添加し、10%FBSを含むRPMI-1640培地を調整し培養液として用いた。コントロールには滅菌蒸留水を使用した。TKM-33を96wellプレートに0.6×103細胞/wellの細胞密度で播種し、調整した培養液で24時間培養した。その後、Premix WST-1(タカラバイオ株式会社, Lot. No. 4401)を各wellに10μl添加し、30分後にMicro Plate Reader (ABI, CA, USA) を用い、波長450nmで吸光度を測定した(図5参照)。
TKM-33を0.3×104 細胞/wellの密度になるように10% FBS(+) RPMI-1640培地で調整し、24 well プレートの各wellに500μlずつ播種した。2〜3日間培養して細胞がサブコンフルエントになったのを確認してから実験を開始した。
段戸フルボ酸および筑後川フルボ酸を培養液に添加した場合と蒸留水を培養液に添加した場合との間で、細胞増殖能に有意差は認められなかった(図7参照)。
このことより、段戸フルボ酸および筑後川フルボ酸のいずれにも細胞毒性がないことが確認された。
血管内皮細胞培養液中u-PA活性に及ぼす段戸フルボ酸および筑後川フルボ酸の影響
培養液に滅菌蒸留水を添加した時のu-PA活性量を100%として、培養液にフルボ酸を添加した時の培養液中u-PA活性量を百分率で求めた。段戸フルボ酸を100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml添加した場合の相対的u-PA活性量(%)はそれぞれ、93.1±11.8%、105.4±18.1%、121.1±20.0%であった。筑後川フルボ酸を100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml添加した場合の相対的u-PA活性量(%)はそれぞれ、96.3±6.1%、99.5±14.4%、114.3±26.4%であった。終濃度1μg/mlのフルボ酸を培養液に添加した場合、相対的u-PA活性量はコントロールに比べて増加傾向であった。特に、培養液に段戸フルボ酸を終濃度1μg/ml添加した場合、相対的u-PA活性量はコントロールに比べて有意に高値であった(図8参照)。
血管内皮細胞培養液中PAI-1抗原量に及ぼす段戸フルボ酸および筑後川フルボ酸の影響
培養液に滅菌蒸留水を添加した時、培養液中PAI-1抗原量は25.075±4.665 ng/mlであった。フルボ酸を最終濃度が100μg/mlとなるように培養液に添加した場合、培養液中PAI-1抗原量は段戸フルボ酸で10.836±1.955 ng/mlであった。また、筑後川フルボ酸では13.462±4.038 ng/mlであった。いずれの場合もPAI-1抗原量は有意に減少していた(図9参照)。
このことから、段戸フルボ酸および筑後川フルボ酸はともに、t-PA活性およびu-PA活性のインヒビターであるPAI-1を減少させ、血栓溶解活性を有すると考えられる。
海洋性腐植土抽出液の生体への効果(ラットを用いた実験)
株式会社マリネックスより提供された海洋性腐植土を使用した。腐植土(有明海産、Lot.No. 08-02)と蒸留水が重量比で1:6の割合で溶解になるように混合し、超音波ホモジナイザーアイラVCX-130 (SONICS & MATERIALS) (130Watt, 20Khz, 30%振幅) にて10分間処理した。その後、1000 rpm、5分間遠心分離を行い、得られた上清をフィルター濾過 (ステラディスク0.2μm) し、海洋性腐植土抽出液の試料(pH 2.83) とした。この海洋性腐植土抽出液試料を蒸留水で希釈して3%(容量%)の海洋性腐植土抽出液溶液(pH 3.99)を作製した。
ラットは雄性 Wistar 系 6 週齢ラットを日本クレア(株)より購入して用いた。
飼料としてオリエンタル酵母のMFを用いた。温度は24±1℃、明暗サイクルは12時間の明暗サイクル(午前7時〜午後7時の明期と午後7時〜午前7時の暗期)の環境下で飼育した。
なお、ラットを用いた動物実験は近畿大学動物実験委員会の承認を得て、近畿大学動物実験規定に従って実施した。
ラットの体重、飲水量および飼料摂食量を1日おきに測定した。3週間の実験飼育が終了後、10%のネンブタール(1ml/100g)を腹腔内投与して麻酔し、腹部大動脈よりクエン酸採血(全血:3.8%クエン酸ナトリウム=9:1となるように採血)を行った。脳、腎臓、肝臓は摘出後、直ちに重量を測定した。
クエン酸採血した血液を4℃、4,000rpm、15分間遠心分離して血漿を調整した。血漿 0.5mlに0.01%酢酸を9.5ml加えて数回転倒混和し、15分間氷中で静置して白色沈殿を析出させた。その後、4℃、3,000rpm、5分間遠心分離して管底に沈査を得た。管底の沈査をガラス棒でかき混ぜてペースト状とし400μlのバルビタールbufferで溶解したものを、ユーグロブリン分画とした。ユーグロブリン分画中の線溶活性はフィブリンエンザイモグラフィーにて評価した。
クエン酸採血した血液を4℃、1,000rpm、10分間遠心分離し、採取した上清を多血小板血漿(PRP:Platelet Rich Plasma)とした。その後、4℃、4,000rpm、15分間遠心分離した上清を乏血小板血漿(PPP:Platelet Poor Plasma)として採取し、血小板凝集能の測定に用いた。
血小板凝集は東京光電社製アグリゴメーター(TPA-4C)を用いて観察した。200μlのPRPに、終濃度が0.01、0.05、0.1μMになるように0.1、0.5、1μM のADPを22μlずつ添加して、血小板凝集を惹起した。測定温度は37℃、測定時間は10分間とした。
実験の開始から1日おきに体重および飼料摂取量を測定したが、蒸留水を摂取した対照群の体重および飼料摂取量と、海洋性腐植土抽出液を摂取した腐植土群の体重および飼料摂取量との間に有意差は認められなかった(図11および12参照)。
また、実験飼育後の肝臓、脳および腎臓の重量にも有意差は認められなかった。
したがって、海洋性腐植土抽出液を摂取してもラットの体重、臓器に対する影響は何ら認められなかった。
血液中の線溶活性(ユーグロブリン分画中の線溶活性)
3週間の実験飼育終了後に調整したユーグロブリン分画中のu-PA活性は対照群に比べて腐植土群において有意に増強していた(図14参照)。
血小板凝集能
ADPをPRPに添加し、10分間の測定時間内に最も強く凝集した時の凝集率を最大凝集率(%)とした。終濃度0.01μMのADPをPRPに添加して血小板の最大凝集率を比較した場合、腐植土群の最大凝集率は対照群の最大凝集率よりも有意に低下していた(図16参照)。
Claims (6)
- 有効成分が、海洋性腐植土の水性溶媒抽出液または海洋性腐植土由来のフルボ酸であることを特徴とする血栓溶解用組成物。
- 前記海洋性腐植土が、有明海産の海洋性腐植土である請求項1に記載の組成物。
- 前記フルボ酸が、段戸フルボ酸または筑後川フルボ酸である請求項1または2に記載の組成物。
- 前記水性溶媒が、0〜50%の低級アルコール水溶液である請求項1〜3のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記水性溶媒が、0〜20%の低級アルコール水溶液である請求項1〜4のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記水性溶媒が、水である請求項1〜5のいずれか1つに記載の組成物。
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