JP5755749B2 - 糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物及び食品組成物 - Google Patents

Description

本発明は、糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用薬学及び食品組成物に関し、より具体的には、南極地衣類であるステレオカウロンアルピヌム（Stereocaulon alpinum）抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物と機能性食品に関する。

地衣類は、高等植物とは異なる独特の二次代謝産物を生産するものとして知られており（Ingolfsdottir, K., Phytochemistry,61:729, 2002）、これらの地衣類が、生産する二次代謝産物の多くはデプシド（depside）、テプシドン（depsidone）及びジベンゾフラン（dibenzofurane）に属し、このような化合物等は、地衣類の低成長率と関連するものと推測される（Kumar, K.C.S. et al., J. Nat. Prod., 62:817, 1999; Huneck, S., Naturwissenschaften, 86:559, 1999）。また、抗生剤、抗マイコバクテリア、抗ウイルス、鎮痛効果及び解熱作用等を含む地衣類代謝産物の多様な生物学的活性が、スクリーニング過程によって確認された（Ingolfsdottir, K., Phytochemistry,61:729, 2002; Kumar, K.C.S. et al., J. Nat. Prod., 62:817, 1999）。従って、地衣類の代謝産物を利用した医薬品開発に対する関心が増加している。

一方、糖尿病は、インスリン作用、インスリン分泌、または両方の欠陥から発生する高血糖をはじめとする代謝障害症候群で、将来血管合併症の可能性が高い疾患であり、大きく１型糖尿病と２型糖尿病に分けられる。１型（インスリン依存性）糖尿病は、免疫による膵島のβ細胞破壊とこれに伴うインスリンの絶対的不足が原因であり、２型（インスリン非依存性）糖尿病は、インスリンが分泌されるものの、量が充分ではないか体が分泌されるインスリンを効果的に活用できないため発生する。体の細胞が効果的な作用が出来ない「インスリン耐性（Insulin resistance）」という状態では、体内のエネルギー源、特に糖分の利用が上手く出来ないため必要なエネルギーが足りなくなり、使用できなかった糖分は、血液中に必要以上多く溜まり、最終的に尿から排出される疾患となり、根本的な治癒はできない慢性退行性疾患の一つである。

世界保健機構（World health organization：ＷＨＯ）と国連（United Nations：ＵＮ）は、２００７年末には全世界の糖尿病患者が約２億４６００万人になり、糖尿病による死亡も毎年増加傾向にあり、糖尿病の発病予防、厳しい血糖調節と合併症の予防が重要であると強調している。それと共に、大韓糖尿病学会と健康保険審査評価院から調査したところ、韓国で２００３年に全体の糖尿病患者が４０１万人であり、２０３０年には糖尿病患者が７２０万人に達して国民７人当り１人になると報告している。特に、急激な医療費増加は、糖尿病患者数の爆発的増加と共に糖尿病による合併症の持続的増加、糖尿病患者の平均寿命増加とも密接な関連性を持っている。急速な経済発展に伴う食生活の変化から平均寿命は延びているのに対して糖尿病等の慢性退行性疾患は増加する傾向を示している。

韓国の糖尿病の特徴は、２型糖尿病が９９％以上を占め、１型糖尿病の発病確率が約１％以下であり、外国から報告された２型糖尿病が９０％程度で、１０％程度の１型糖尿病であるものとは異なる。糖尿病の発病原因は、多様な要因が複合的に絡んでおり、重要な要因としては遺伝（家族歴が約２０％）と環境、年齢（４０〜４９才が約６０％内外）、肥満、身体の抵抗力低下、薬品乱用、及びストレスによる刺激等が挙げられる。糖尿病の発病機序はまだ詳細に明らかにならずにいるが、いくつか特別な糖尿病（例、ＭＯＤＹ等）を除いては、複数の遺伝子的な原因から発病する疾患で、一貫性ある関連遺伝子を探すには限界がある。即ち、糖尿病の発病は種々の遺伝子が複雑に係っており現在も多数の新しい遺伝子が続けて明らかになっている。

糖尿病は、多様な発病機序によって発病するため、その治療法も多様にならざるを得ず、しかも既存の姑息的な治療法だけでは満足できる効果が得られない場合も多いため、新しい治療法が求められている。糖尿病治療剤研究は、糖尿病患者の９０％以上を占める２型糖尿病治療剤を中心に技術開発が活発に行われている（表１、２）。

インスリン分泌促進物質（ピログリリド（pirogliride）、リノグリリド（linogliride）、２，４−ジアミノ−５−シアン−ブロモピリジン、インクレチン（incretin）、レパグリニド（repaglinide）、ナテグリニド（nateglinide））、インスリン作用増強制（トログリタゾン（troglitazone））、インスリン抵抗性改善剤、標的組織でインスリン類似効果を表す薬品（ピログリリド（pirogliride）、リノグリリド（linogliride）、ジクロロアセテート（dichloroacetate）、インシュリンリスプロ（insulin lispro）、インシュリンアスパルト（insulin aspart））、ブドウ糖新合成抑制剤（脂肪分解抑制剤、カルニチン転移酵素抑制剤、β酸化抑制剤）、炭水化物吸収を遅延させる薬剤（食物繊維、αグルコシダーゼ抑制剤）、アミリン類似体（プラムリンチド（pramlintide））に対する多くの研究が行われている。

これらの中の一部は現在市販されているが、その多くはまだ人体に使うには不十分な実験段階にあったり、毒性検査段階にある。特に、生体リズムを考慮した速効性インスリン分泌促進剤とインスリン抵抗性改善剤は、糖尿病治療手段で有効な方法の一つになると予想され、今後このような薬剤開放がより一層活気を帯びると予想される。

また、今までの糖尿病病因に関する研究は、インスリン抵抗性の原因がインスリンレセプターに問題があると推定して、去る１０年間余り研究を続けられて来ており、現在はインスリンの信号伝達体系側に研究方向が転換されている。

肥満型（obese type）及び非肥満型（non-obese type）２型糖尿病を持つ人の脂肪細胞に存在するＰＴＰ−１ｂ（protein tyrosine phosphatase-1b）の活性を調べた結果、正常群と比較して蛋白質の発現は、各々３倍、５．５倍に増加して、活性は７１％、８８％であると報告された。また、最近ＰＴＰ−１ｂをノックアウト（knock-out）させたマウスを用いてインスリンに対する感受性の増加と高脂肪食に対する抵抗性が見られるとの実験結果が報告された。それと共に、最近発表された多数の研究によると、ＰＴＰ−１ｂの活性を抑制する物質が標的細胞でインスリンの感受性を増加させて、インスリン抵抗性を克服できると見られる。韓国内でも韓国化合物銀行でまだ薬品として開発されなかった数万個の化合物からＰＴＰ−１ｂ活性阻害剤開発のために無作為で大量スクリーニングを行っている。

一方、レプチン（Leptin）は、脂肪細胞から血中に放出されて、脳血液膜を通過した後、中枢神経系内のレセプターで作用して、食物の摂取を抑制して体重を減少させて、エネルギー消費を促す。そこで、ＰＴＰ−１ｂがレプチン活性自体を調節するという新しい発見が出てきたため、ＰＴＰ−１ｂがレプチン効能剤と共に用いる時相乗作用をもたらすと期待されている（Koren, S., Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 21:621, 2007）。

従って、肥満及び肥満型糖尿の治療開発において、ＰＴＰ−１ｂに対する抑制剤の重要性が増しており、最近ＨＴＳ（hight throughput screening）を介して発見されたパイオニア物質に対する報告がある。現在まで、ＰＴＰ−１ｂに対する研究とその阻害剤の開発は、臨床的に成功した例はないが、表３に示したように、多くの研究団体と企業が関心を持って、研究を進行中であることが知られている。

しかし、多くのＰＴＰ−１ｂの抑制剤は、陽電荷で充填したＰＴＰ−１ｂの活性部位をターゲットにする非加水分解性ホスホチロシン模倣体として開発されたため、選択性と生物学的利用の可能性に困難があった（Liu, S. et al., J. Am. Chem. Soc., 130:17075, 2008）。

そこで、本発明者等は、糖尿病及び肥満治療に効果的な治療剤を開発するために鋭意努力した結果、南極地衣類であるステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離したロバル酸（Lobaric acid）の塩であるソジウムロバレート（Sodium lobarate）が水溶性として適用が容易なだけでなく、このようなソジウムロバレート以外に新しく合成したロバリン（Lobarin）、ロバスチン（Lobarstin）がロバル酸よりも効果的にＰＴＰ−１ｂを阻害して、蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用して疾患モデル動物投与時抗糖尿効果を示すことを確認して、本発明を完成した。

発明の要約

本発明の目的は、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物及び機能性食品を提供することにある。
本発明の他の目的は、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物を投与する工程を含む、糖尿病若しくは肥満の予防、または治療方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物を投与する工程を含む、ＰＴＰ−１ｂの活性抑制方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物の糖尿病若しくは肥満の予防、または治療のための用途を提供することにある。

課題を達成するための手段

前記目的を達成するために、本発明は下記式（１）で表される化合物を提供する：
ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される。

さらに本発明は、前記式（１）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物を提供する。
さらに本発明は、前記式（１）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品を提供する。

さらに本発明は、下記式（２）で表される化合物を提供する：

本発明はまた、下記の工程を含む前記式（２）で表される化合物の製造方法を提供する：
（ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）または、メタノール水溶液で溶出し、ロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
（ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３またはＮａＨ_２ＰＯ_４を添加して撹はんした後、前記式（２）で表される化合物を取得する工程。

さらに本発明は、前記式（２）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物を提供する。
さらに本発明は、前記式（２）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品を提供する。
さらに本発明は、式（３）で表される化合物を提供する：
ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される。
本発明はまた、前記式（３）で表される化合物、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、前記式（３）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品を提供する。

本発明はまた、下記式（４）で表される化合物を提供する：

本発明はまた、下記の工程を含む前記式（４）で表される化合物の製造方法を提供する：
（ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）、またはメタノール水溶液で溶出させロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
（ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、塩基を添加して撹はんした後、酸性溶液を添加して反応を終結させた後、前記式（４）で表される化合物を取得する工程。

本発明はまた、前記式（４）で表される化合物、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、前記式（４）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品を提供する。

本発明はまた、下記式（５）で表される化合物を提供する：
ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される。
本発明はまた、前記式（５）で表される化合物、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、前記式（５）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品を提供する。

本発明はまた、下記式（６）で表される化合物を提供する：
本発明はまた、下記の工程を含む前記式（６）で表される化合物の製造方法を提供する：
（ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）またはメタノール水溶液で溶出させロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
（ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、水と塩基を添加して撹はんしてから、酸性溶液を添加して反応を終結させた後、前記式（６）で表される化合物を取得する工程。
本発明はまた、前記式（６）で表される化合物またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、前記式（６）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品を提供する。

本発明はまた、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物を投与する工程を含む、糖尿病若しくは肥満の予防、または治療方法を提供する。

本発明はまた、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物の糖尿病若しくは肥満の予防、または治療のための用途を提供する。
本発明はまた、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物を利用したＰＴＰ−１ｂの活性抑制方法を提供する。
本発明はまた、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または、式（６）で表される化合物含有したＰＴＰ−１ｂの活性抑制用組成物を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。

ＨＰＬＣによるソジウムロバレートの精製図を示す。 ソジウムロバレートの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ソジウムロバレートの^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ソジウムロバレートのＨＳＱＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ソジウムロバレートのＨＭＢＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ソジウムロバレートのＰＴＰ−１ｂ阻害活性を示すグラフである。 ＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７、ＰＴＰＮ１３に対する抑制活性を６２０ｎｍで吸光度を測定して示したグラフである。 ソジウムロバレートの腹腔投与後血糖変化を測定したグラフである。 ソジウムロバレートの腹腔投与にともなう６時間空腹後血糖測定結果グラフである。 ソジウムロバレートの腹腔投与２８日後血糖変化を測定したグラフである。 ＨＰＬＣ分析によるロバリンの精製図を示す。 ロバリンのＨＲＥＳＩＭＳ分析結果を示す。 ロバリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバリンの^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバリンのＨＳＱＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバリンのＨＭＢＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバリンのＰＴＰ−１ｂ阻害活性を示すグラフである。 ロバリンのＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７、ＰＴＰＮ１３に対する抑制活性を６２０ｎｍで吸光度を測定して示したグラフである。 ロバリンの腹腔投与後血糖変化を測定したグラフである。 ロバリンの腹腔投与による６時間空腹後血糖測定結果グラフである。 ロバリンの腹腔投与２８日後血糖変化を測定したグラフである。 ＨＰＬＣ分析によるロバスチンの精製図を示す。 ロバスチンのＨＲＥＳＩＭＳ分析結果を示す。 ロバスチンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバスチンの^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバスチンのＣＯＳＹデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバスチンのＨＳＱＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバスチンのＨＭＢＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバスチンのＮＯＥＳＹデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。 ロバスチンのＰＴＰ−１ｂ阻害活性を示すグラフである。 ロバスチンのＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７、ＰＴＰＮ１３に対する抑制活性を６２０ｎｍで吸光度を測定して示したグラフである。 ロバスチンの腹腔投与後血糖変化を測定したグラフである。 ロバスチンの腹腔投与による６時間空腹後血糖測定結果グラフである。 ロバスチンの腹腔投与２８日後ブドウ糖耐性検証グラフである。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明ではステレオカウロンアルピヌムの抽出物から分離したバリクサヌロブトロバル酸の塩である下記式（２）で表されるソジウムロバレートを取得した：

前記式（２）で表されるソジウムロバレートは、好ましくは下記の工程を含む方法によって製造できる：
（ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）または、メタノール水溶液で溶出し、ロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
（ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３またはＮａＨ_２ＰＯ_４を添加して撹はんした後、前記式（２）で表される化合物を取得する工程。

この時、前記工程（ｄ）は、好ましくは前記ロバル酸を含有する分画をアセトンに溶解した後、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３またはＮａＨ_２ＰＯ_４を添加して撹はんした後、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３またはＮａＨ_２ＰＯ_４添加と同時に生成される固体をろ過した後、濃縮して、前記式（２）で表される化合物を取得することを特徴とする。

本発明の一様態において、地衣類ステレオカウロンアルピヌム（Stereocaulon alpinum (Hedw.) G.L. Sm.）は、２００３年１月南極キングジョージ島の世宗（セジョン）基地（Ｓ６２°１３．３'、Ｗ５８°４７．０'）周囲のバートン半島（Barton Peninsular）で採取して用いた。ロバル酸は、乾燥されたステレオカウロンアルピヌムを２４時間メタノールで抽出した後、溶媒を蒸留させて抽出物を取得し、前記抽出物はシリカゲル（Ｃ_１８）が充填されたフラッシュカラムクロマトグラフィー（flash column chromatography、５×２５ｃｍ）にローディングし、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％（ｖ／ｖ）メタノール（ＭｅＯＨ）を順次注入させ、各々の分画を取得した後、前記分画中ＰＴＰ−１ｂ抑制活性が優れた分画を選択して、ＰＴＰ−１ｂ抑制活性が優れた化合物として、式（７）のロバル酸を分離した：

ロバル酸は、ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出して、取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノール水溶液で溶出し、溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出させて取得することができ、ソジウムロバレートは取得したロバル酸をアセトンに溶かし、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３またはＮａＨ_２ＰＯ_４を添加して撹はんすることによって、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３またはＮａＨ_２ＰＯ_４添加と同時に生成される固体をろ過した後、直ちにロータリー・エバポレーター（rotary evaporator）で完全濃縮させることによって、下記式（２）のソジウムロバレートを取得することができる：
前記ソジウムロバレートのＰＴＰ−１ｂの抑制活性度に関して報告されたことはなく、それと共に糖尿及び肥満治療効能も報告されたことがない。
また、前記式（２）のソジウムロバレートロブト一部アルキル基が変形された他の誘導体も本発明の範囲に属するものである。このような観点において、本発明は、下記式（１）で表される化合物に関する：
ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される。

前記アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基は、例えば、炭素数１乃至２０、または１乃至１０であってもよく、前記アルキル基には、置換、又は非置換されたアルキル基、及びシクロアルキル基等を含む。

前記式（２）のソジウムロバレートから、当業界に知られている公示の化合物合成、変形方法を介して、式（１）の化合物を得るのは、当業者には自明である。例えば、式（１）の化合物のＲは、炭素の個数、結合構造の変化によって種々の誘導体を得ることができる。例えば、Ｒ_１及びＲ_２がプロピル鎖（propyl chain）の場合は、ソジウムペンタノエート（sodium pentanoate）との反応で由来したものであり、このソジウムペンタノエートと炭素数が異なるソジウムブチレート（sodium butyrate）、ソジウムプロピオネート（sodium propionate）、ソジウムヘキサノネート（sodium hexanoate）等を利用して炭素数が異なる誘導体の合成が可能である。

本発明では、ステレオカウロンアルピヌムの抽出物から分離したロバル酸の塩であるソジウムロバレートがロバル酸に比べても優秀なＰＴＰ−１ｂの活性抑制能を持っており、糖尿病若しくは肥満の予防または治療に効果的であることを確認した。従って、他の観点において、本発明は、ソジウムロバレートを有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物に関する。また、本発明は、ソジウムロバレートを有効性分として含有する改善用機能性食品を提供することができ、従って、他の観点において、本発明は、ソジウムロバレートを有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品に関する。

また、前記式（２）のソジウムロバレートだけでなく、下記のような一部アルキル基が変形された式（１）の化合物またはその薬剤学的に許容可能な塩も同一乃至は類似の効果を発揮するため、これらを含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物、機能性食品として提供できる。

本発明の一様態において、ソジウムロバレートのＰＴＰ−１ｂに対する抑制活性度をロバル酸と比較分析した結果、ロバル酸のＩＣ_５０が８７０ｎＭであるのに対して、ソジウムロバレートは、ＩＣ_５０が３５０ｎＭであり非常に優れたＰＴＰ−１ｂ抑制効果を示し、そこで、ソジウムロバレートは糖尿病及び肥満に対する薬学的な治療及び予防が可能な物質であることを確認した。

それと共に、本発明の一実施例では、ソジウムロバレートの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べた結果、ＰＴＰ−１ｂはアミノ酸配列及び３Ｄ構造においてＴＣ−ＰＴＰと最も類似し、胚性の致死（embrionic lethal）を誘導し、ＴＣ−ＰＴＰと類似の酵素特性を持って、第２アリールフホスフェート結合部位（2nd aryl-phosphate binding site）を含んだ活性化部位（active site）が類似していることが知らされているＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰＮ２）を含んだ蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用することを確認し、このような実験結果は、本発明に係る化合物であるソジウムロバレートがＰＴＰ−１ｂ阻害剤として糖尿治療に利用可能であることを提示する。

本発明の他の実施例では、ソジウムロバレートを疾患動物モデルであるｄｂ／ｄｂマウスに投与して、血中ブドウ糖濃度、血中インスリン濃度変化を測定することによって、血糖、インスリン抵抗性との相関関係を確認して、抗糖尿効果を検証した。

また、本発明では、ステレオカウロンアルピヌムの抽出物から分離したロバル酸から下記式（４）で表される新規化合物を分離した後、これをロバリンと命名した：

前記式（４）で表される新規化合物ロバリンは、好ましくは下記の工程を含む方法によって製造できる：
（ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）、またはメタノール水溶液で溶出させロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
（ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、塩基を添加して撹はんした後、酸性溶液を添加して反応を終結させた後、前記式（４）で表される化合物を取得する工程。

この時、前記工程（ｄ）で酸性溶液は水溶液を中和させることができる全種類の酸性溶液が使用可能で、好ましくは前記工程（ｄ）で溶媒はアセトンであり、塩基はＮａＯＨまたはＫＯＨであり、酸性溶液はＨＣｌ溶液、Ｈ_２ＳＯ_４溶液またはＨＮＯ_３溶液であってもよく、前記工程（ｄ）の終結した反応液を濃縮した後、メチレンクロライド、クロロホルム、またはエチレンクロライド及び水溶液間の分配を介してメチレンクロライド、クロロホルムまたはエチレンクロライド溶解層を獲得し、濃縮して前記式（４）で表される化合物を取得することを特徴とする。

本発明の一様態において、ロバリンは、ロバル酸をアセトン（acetone）に溶解した後、ＮａＯＨを添加して常温で撹はんし、ＨＣｌ溶液を添加して反応を終了させた後、反応混合物は濃縮した後、塩化メチレン（Methylene chloride）及び水溶液（ｐＨ＝２）との間の分配を介して塩化メチレン溶解層を獲得して、下記式（４）のロバリンを取得することができる：

また、前記式（４）のロバリンから一部アルキル基が変形された他の誘導体も本発明の範囲に属する。このような観点において、本発明は、下記式（３）で表される化合物に関する：
ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される。

前記アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基は、例えば、炭素数１乃至２０、または１乃至１０であってもよく、前記アルキル基には、置換、又は非置換されたアルキル基、及びシクロアルキル基等を含む。

前記式（４）のロバリンから、当業界に周知の公知の化合物合成、変形方法を介して、式（３）の化合物を得ることは、当業者には自明である。例えば、式（３）の化合物のＲは炭素の個数、結合構造の変化により種々の誘導体が得られる。Ｒ１及びＲ２がプロピル鎖の場合は、ソジウムペンタノエートとの反応から由来したもので、このソジウムペンタノエートと炭素素が異なるソジウムブチレート、ソジウムプロピオネート、ソジウムヘキサノネート等を利用して炭素数が異なる誘導体の合成が可能である。

本発明では、ステレオカウロンアルピヌムの抽出物から分離したロバル酸の新規誘導体であるロバリンが、非常に優れたＰＴＰ−１ｂの活性抑制能を持っており、糖尿病若しくは肥満の予防、または治療に効果的であることを確認した。従って、さらに他の観点において、本発明は、前記式（４）のロバリン、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物に関する。また、本発明は、ロバリンを有効性分として含有する機能性食品を提供することができ、従って、さらに他の観点において、本発明は、ロバリンを有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品に関する。

また、前記式（４）のロバリンだけでなく、下記のような一部アルキル基が変形された式（３）の化合物またはその薬剤学的に許容可能な塩も同一乃至は類似の効果を発揮するため、これらを含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物、機能性食品として提供できる。

本発明の一様態において、ロバリンのＰＴＰ−１ｂに対する抑制活性度を測定した結果、ロバリンは、ＩＣ_５０が３５０ｎＭであり非常に優れたＰＴＰ−１ｂ抑制効果を示し、そこで、新規化合物ロバリンは糖尿病及び肥満に対する薬学的な治療及び予防が可能な物質であることを確認した。

それと共に、本発明の一実施例では、ロバリンの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べた結果、アミノ酸配列及び３Ｄ構造においてＰＴＰ−１ｂと最も類似し、胚性の致死であり、ＰＴＰ−１ｂと類似の酵素特性を持って、第２アリールフホスフェート結合部位を含んだ活性化部位が類似すると知らされているＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰＮ２）を含んだ蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用するということを示すことを確認し、このような実験結果は、本発明に係る化合物であるロバリンがＰＴＰ−１ｂ阻害剤として糖尿治療に利用可能であることを提示する。

本発明の他の実施例では、ロバリンを疾患動物モデルであるｄｂ／ｄｂマウスに投与して、血中ブドウ糖濃度、血中インスリン濃度変化を測定することによって、血糖、インスリン抵抗性との相関関係を確認して、抗糖尿効果を検証した。

一方、本発明で利用される前記式（４）のロバリンは、薬剤学的に許される塩の形態であってもよい。本発明における薬剤学的に許容可能な塩は当該技術分野において通常の方法によって製造できるもので、例えば、塩酸、臭化水素、硫酸、硫酸水素ナトリウム、リン酸、炭酸等の無機酸との塩、または、ギ酸、酢酸、シュウ酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、クルコン酸、ゲスチス酸、フマル酸、ラクトビオン酸、サリチル酸、またはアセチルサリチル酸（アスピリン）のような有機酸と共に薬剤学的に許容可能な酸の塩を形成したり、またはソジウム、ポタシウム等のアルカリ金属イオンと反応してこれらの金属塩を形成したり、またはアンモニウムイオンと反応して他の形態の薬剤学的に許容可能な塩を形成することができる。

また、本発明では、ステレオカウロンアルピヌムの抽出物から分離したロバル酸から下記式（６）で表される新規化合物を分離した後、これをロバスチンと命名した：

前記式（６）で表される新規化合物ロバスチンは、好ましくは下記の工程を含む方法によって製造できる：
（ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）またはメタノール水溶液で溶出させロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
（ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、水と塩基を添加して撹はんしてから、酸性溶液を添加して反応を終結させた後、前記式（６）で表される化合物を取得する工程。

この時、前記工程（ｄ）で酸性溶液は水溶液を中和させることができる全種類の酸性溶液が使用可能で、好ましくは前記工程（ｄ）で溶媒はアセトンであり、塩基はＮａＯＨまたはＫＯＨであり、酸性溶液はＨＣｌ溶液、Ｈ_２ＳＯ_４溶液またはＨＮＯ_３溶液であってもよく、前記工程（ｄ）の終結した反応液を濃縮した後、メチレンクロライド、クロロホルム、またはエチレンクロライド及び水溶液間の分配を介してメチレンクロライド、クロロホルムまたはエチレンクロライド溶解層を獲得し、濃縮して前記式（６）で表される化合物を取得することを特徴とする。

本発明の一様態において、ロバスチンは、ロバル酸をアセトンに溶解した後、ＮａＯＨを添加して常温で撹はんし、ＨＣｌ溶液を添加して反応を終了させた後、反応混合物は濃縮した後、塩化メチレン及び水溶液（ｐＨ＝２）との間の分配を介して塩化メチレン溶解層を獲得して、下記式（６）のロバリンを取得することができる：

また、前記式（６）のロバスチンから一部アルキル基が変形された他の誘導体も本発明の範囲に属する。このような観点において、本発明は、下記式（５）で表される化合物に関する：
ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される。

前記アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基は、例えば、炭素数１乃至２０、または１乃至１０であってもよく、前記アルキル基には、置換、又は非置換されたアルキル基、及びシクロアルキル基等を含む。

前記式（６）のロバスチンから、当業界に周知の公知の化合物合成、変形方法を介して、式（５）の化合物を得ることは、当業者には自明である。例えば、式（５）の化合物のＲは炭素の個数、結合構造の変化により種々の誘導体が得られる。Ｒ１及びＲ２がプロピル鎖の場合は、ソジウムペンタノエートとの反応から由来したもので、このソジウムペンタノエートと炭素素が異なるソジウムブチレート、ソジウムプロピオネート、ソジウムヘキサノネート等を利用して炭素数が異なる誘導体の合成が可能である。

本発明では、ステレオカウロンアルピヌムの抽出物から分離したロバル酸の新規誘導体であるロバスチンが、非常に優れたＰＴＰ−１ｂの活性抑制能を持っており、糖尿病若しくは肥満の予防、または治療に効果的であることを確認した。従って、さらに他の観点において、本発明は、前記式（６）のロバスチン、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物に関する。また、本発明は、ロバスチンを有効性分として含有する機能性食品を提供することができ、従って、さらに他の観点において、本発明は、ロバスチンを有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品に関する。

また、前記式（６）のロバスチンだけでなく、下記のような一部アルキル基が変形された式（５）の化合物またはその薬剤学的に許容可能な塩も同一乃至は類似の効果を発揮するため、これらを含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物、機能性食品として提供できる。

本発明の一様態において、ロバスチンのＰＴＰ−１ｂに対する抑制活性度を測定した結果、ロバリンは、ＩＣ_５０が１５４.６ｎＭであり非常に優れたＰＴＰ−１ｂ抑制効果を示し、そこで、新規化合物ロバスチンは糖尿病及び肥満に対する薬学的な治療及び予防が可能な物質であることを確認した。

それと共に、本発明の一実施例では、ロバリンの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べた結果、アミノ酸配列及び３Ｄ構造においてＰＴＰ−１ｂと最も類似し、胚性の致死であり、ＰＴＰ−１ｂと類似の酵素特性を持って、第２アリールフホスフェート結合部位を含んだ活性化部位が類似すると知らされているＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰＮ２）を含んだ蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用するということを示すことを確認し、このような実験結果は、本発明に係る化合物であるロバリンがＰＴＰ−１ｂ阻害剤として糖尿治療に利用可能であることを提示する。

本発明の他の実施例では、ロバスチンを疾患動物モデルであるｄｂ／ｄｂマウスに投与して、血中ブドウ糖濃度、血中インスリン濃度変化を測定することによって、血糖、インスリン抵抗性との相関関係を確認して、抗糖尿効果を検証した。

一方、本発明で利用される前記式（６）のロバスチンは、薬剤学的に許される塩の形態であってもよい。本発明における薬剤学的に許容可能な塩は当該技術分野において通常の方法によって製造できるもので、例えば、塩酸、臭化水素、硫酸、硫酸水素ナトリウム、リン酸、炭酸等の無機酸との塩、または、ギ酸、酢酸、シュウ酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、クルコン酸、ゲスチス酸、フマル酸、ラクトビオン酸、サリチル酸、またはアセチルサリチル酸（アスピリン）のような有機酸と共に薬剤学的に許容可能な酸の塩を形成したり、またはソジウム、ポタシウム等のアルカリ金属イオンと反応してこれらの金属塩を形成したり、またはアンモニウムイオンと反応して他の形態の薬剤学的に許容可能な塩を形成することができる。

本発明に係る化合物を含む医薬組成物は、各々通常の方法により剤形化できるが、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾール等の剤形、外用剤、座薬及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して用いられる。組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としてはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

製剤化する場合には通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤、または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（calcium carbonate）、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチン等を混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味制、芳香剤、保存剤等が含まれる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６０、カカオ脂、ラウリン脂、クリセロゼラチン等が用いられる。

本発明の機能性食品は、例えば、各種食品類、キャンディー、チョコレート、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、サプリメント等があって、粉末、顆粒、精製、カプセル、または飲料の形態で用いられる。

本発明の化合物は、糖尿及び肥満予防を目的に、食品または飲料に添加できる。この時、食品または、飲料中の前記化合物の量は、一般的に本発明のサプリメント組成物は、全食品重量の０．０１乃至５０重量％、好ましくは０．１乃至２０重量％に加えられ、健康飲料組成物は１００ｍＬを基準に０．０２乃至１０ｇ、好ましくは０．３乃至１ｇの割合で加えられる。

本発明の健康飲料組成物は、指示された割合で必須成分として本発明の化合物を含有する他には、液体成分には特別な制限はなく、通常の飲料のように種々の香味剤または天然炭水化物等を追加成分として含有してもよい。天然炭水化物の例としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖等、二糖類、例えばマルトース、スクロース等、多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリン等のような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリチルリチン）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム等）が有利に用いられる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍＬ当一般的に約１乃至２０ｇ、好ましくは約５乃至１２ｇである。前記の他に本発明の機能性食品は種々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び充鎮剤（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤等を含有してもよい。その他に本発明の機能性食品は、天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて用いられる。このような添加剤の比率は、さほど重要なことではないが、一般的に本発明の組成物１００重量部当たり０乃至約２０重量部の範囲で選択される。

さらに他の観点において、本発明は、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物を投与する工程を含む、糖尿病若しくは肥満の予防、または治療方法に関する。

本発明の新規化合物の式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、または式（６）で表される化合物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、病気の程度、薬品形態、投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適宜選択される。しかし、好ましい効果を得るために、本発明の化合物は、１日０．１〜１０００μｇ／ｋｇで、好ましくは１〜１００μｇ／ｋｇで投与した方が良い。投与は一日一回投与してもよく、数回に分けて経口投与してもよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。

さらに他の観点において、本発明は、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物の糖尿病若しくは肥満の予防、または治療のための用途に関する。

本発明において、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成したソジウムロバレート、ロバリン、ロバスチンは、優れたＰＴＰ−１ｂ活性抑制効能を示しており、これを利用したＰＴＰ−１ｂの活性抑制方法に関する。具体的に、本発明は、新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または式（６）で表される化合物を利用したＰＴＰ−１ｂの活性抑制方法に関する。
本発明は、ステレオカウロンアルピヌム抽出物から分離した化合物から合成した新規化合物である式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）または、式（６）で表される化合物含有したＰＴＰ−１ｂの活性抑制用組成物に関する。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

［実施例１］
地衣類ステレオカウロンアルピヌム抽出物からロバル酸の製造
１−１：地衣類ステレオカウロンアルピヌム抽出物の製造
地衣類ステレオカウロンアルピヌム（Stereocaulon alpinum (Hedw.) G.L. Sm.）は、２００３年１月南極キングジョージ島の世宗基地（Ｓ６２°１３．３'、Ｗ５８°４７．０'）周囲のバートン半島で採取し、バートン半島で容易に採取できる地衣類である。

乾燥されたステレオカウロンアルピヌム５０ｇを２４時間メタノール１Ｌで２回抽出して、メタノール抽出物３．６ｇを取得した。前記取得した抽出物をシリカゲル（Ｃ_１８）が充填されたフラッシュカラムクロマトグラフィー（５×２５ｃｍ）にローディングし、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％（ｖ／ｖ）メタノール（ＭｅＯＨ）で階段式で濃度勾配を与えて、各々の分画を取得した。

１−２：地衣類ステレオカウロンアルピヌム抽出物からロバル酸の製造
実施例１−１で取得した８０％メタノールで溶出して得た分画２０４．６ｍｇを再びシリカゲル（Ｃ_１８）が充填されたフラッシュカラムクロマトグラフィー（２．５×３０ｃｍ）にローディングして、ＴＬＣ分析によって取得した８個の主要な分画を取得するために、各々２００ｍＬの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％及び１０％のメタノール（ｉｎ ＣＨ_２Ｃｌ_２）溶液及び１００％（ｖ／ｖ）メタノールを注入させて、各々の分画を取得した。

９％メタノールで溶出した分画５９ｍｇをまた半分取逆相（semi-preparative reverse-phase）ＨＰＬＣに注入した後、０．１％ギ酸（formic acid）を含有するアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液を７５乃至８３％の濃度勾配を与えながら３０分以上溶出させて、式７のロバル酸を分離した（２２．９ｍｇ；ｔ_Ｒ＝３９分）：

［実施例２］
ソジウムロバレートの合成
２−１：ロバル酸からソジウムロバレートの製造
実施例１−２で取得したロバル酸１０ｍｇ（２２ｕｍｏｌ）をアセトン３ｍＬに溶かして、１Ｍ ＮａＨＣＯ_３５０ｕｌを添加した後、１〜２分間撹はんした。ＮａＨＣＯ_３添加と同時に生成される固体をろ過した後、直ちにロータリー・エバポレーターで完全濃縮させた。濃縮が終了されると、白色固体のソジウムロバレート（＜１０ｍｇ）が得られる。次に、余分の塩を取り除いて純度を高めるために、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、米国）を用いて逆相（reverse phase）ＨＰＬＣで分析した。用いられた溶媒システムは、０．１％ギ酸が混ざった水（Ａ Ｌｉｎｅ）と０.１％ギ酸が混ざったアセトニトリル（Ｂ ｌｉｎｅ）を用いた。開始は、アセトニトリル４０％から５０％まで５分、５０％から８０％まで１５分、８０％から９０％まで１０分で分析を進行し、最終純度は９２．１％であった（図１）。取得されたソジウムロバレートは、１００％水に溶解して水溶性を確保した：

２−２：ソジウムロバレートの構造分析
ソジウムロバレートの構造は、化合物のＮＭＲデータをロバル酸のＮＭＲデータと比較することによって確認した。各ＮＭＲデータは、試料をＤＭＳＯ−ｄ_６溶媒に溶解した後、ＪＥＯＬ ＥＣＰ−４００ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＥＯＬ、日本）を用いて測定し、化学的移動値は、溶媒として用いたＤＭＳＯ−ｄ_６の化学的移動値（ｄＣ／ｄＨ＝４０．０／２．５０ｐｐｍ）を基準に表示した。ＨＭＱＣ（1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence）の場合、１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚに設定して測定し、ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple-Bond Coherence）実験は、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚに設定した後実行した：
１：ロバル酸、２：ソジウムロバレート
ロバル酸とソジウムロバレートのＮＭＲデータは表４のようになる。

比較の結果、特にＣ−７'の作用基が、カルボン酸（carboxylic acid）でカルボン酸陰イオン（carboxylate anion）に変わることに伴った化学的移動値の変化及びその周辺炭素の化学的移動値の変化が観察され、これは化合物２（ソジウムロバレート）の構造を糾明する重要な資料である。図２乃至５は、各々ソジウムロバレートの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）、ＨＳＱＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）及びＨＭＢＣデータ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）を示す。

［実施例３］
ソジウムロバレートのＰＴＰ−１ｂ抑制活性分析
ＰＴＰ−１ｂ抑制活性を分析するために、分光学的に酵素活性を測定した。
即ち、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＴＰ−１ｂ（バイオニア、韓国）、ＰＴＰ−１ｂ緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０％グリセロール）にソジウムロバレート０、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎＭと基質[ｐＴｙＲ１１４６]インシュリン受容体（Insulin Receptor：１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加した後、常温で１０〜３０分反応させた後、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加して、常温で１０分間反応させて、ＰＴＰ−１ｂ、ソジウムロバレート及び基質との反応を終了させた後、６２０ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、図６に示したように、ソジウムロバレートのＰＴＰ−１ｂに対する抑制活性度を分析した結果、ＩＣ_５０＝３５０ｎＭであり、優れたＰＴＰ−１ｂ抑制効果を示し、濃度依存的に阻害率が増加することを確認した。

一方、対照群として、ロバル酸のＰＴＰ−１ｂ抑制活性を測定して比較した。ＰＴＰ−１ｂは、ＢＩＯＭＯＬ（米国）社が製造した製品を購入して実験に用い、分光学的に酵素活性を測定するために、約０．２μｇ／ｍＬ濃度のＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰ−１ｂ緩衝溶液（５０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）、ロバル酸、４ｍＭ ｐＮＰＰを添加して軽く振った後、３０分間３７℃で反応させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定し、ＩＣ_５０＝０．８７μＭ、即ち、８７０ｎｍであることを確認した。

これにより、本発明に係るソジウムロバレートの場合、ＰＴＰ−１ｂ抑制効果がより優れることが確認でき、このようなソジウムロバレートは、糖尿病及び肥満に対する薬学的な治療及び予防が可能な物質であることを確認した。

［実施例４］
ソジウムロバレートの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性分析
ソジウムロバレートの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べるために、ＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７、ＰＴＰＮ１３に対する抑制活性を分光学的に酵素活性を測定を介して調べた。
まず、０．５／濃度のＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７、ＰＴＰＮ１３（バイオニア、韓国）と蛋白質チロシン 脱リン酸酵素緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０％グリセロール）にソジウムロバレート０、５０、１００、２００ｎＭと基質［ｐＴｙＲ１１４６]インシュリン受容体（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加した後、常温で１０〜３０分間反応させた後、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加して、常温で１０分間反応させて、基質との反応を終了させた後、６２０ｎｍで吸光度を測定した。

ソジウムロバレートの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べた結果、図７に示したように、ソジウムロバレートは、ＰＴＰ−１ｂに対するＩＣ_５０＝２００ｕＭで阻害率は５０.０％であったのに対して、特にＰＴＰ−１ｂと最も類似のリン酸化酵素として知られているＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰＮ２）に対する阻害率は８３．７％であることを確認することができた。

アミノ酸配列及び３Ｄ構造でＰＴＰ−１ｂと最も類似のリン酸化酵素として知られているＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰＮ２）は、胚性の致死であり、ＰＴＰ−１ｂと類似の酵素特性を持って、第２アリールフホスフェート結合部位を含んだ活性化部位が類似すると言われている。従って、７５７個の物質が、ＰＴＰ−１ｂをターゲットと登録されているが、ＰＴＰ−１ｂを主ターゲットとして臨床に進入した化合物は一つもなく、ＰＴＰ−１ｂを含んで多くのターゲットに作用する植物抽出物だけが発売されたか臨床治験中である。

従って、蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用することを示す前記実験結果は、本発明に係る化合物であるソジウムロバレートがＰＴＰ−１ｂ阻害剤として糖尿治療に利用可能であることを提示する。

［実施例５］
疾患モデル動物に対するソジウムロバレートの効能検証
５−１：ソジウムロバレートを腹腔投与した後、血糖変化観察
ソジウムロバレートに対する予備実験、効力実験、毒性実験、資料を基に投与量（実験物質（ｍｇ）／実験動物の体重（Ｋｇ）で表示する）を定めた。７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用いて、対照群にＰＢＳ２００μＬを、実験群にＰＴＰ−１ｂ活性抑制物質のソジウムロバレート１０ｍｇ／ｋｇを毎日腹腔投与して、一週間に二回ずつ血糖を測定した。

７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）にＰＴＰ−１ｂ活性抑制物質ソジウムロバレートの腹腔注射による血糖変化を測定した結果、図８に示したように、ソジウムロバレート１０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した実験群（ｎ＝６）においては、平均０日２６７ｍｇ／ｄＬ、３日２７６ｍｇ／ｄＬ、７日３７８ｍｇ／ｄＬ、１０日３７８ｍｇ／ｄＬ、１４日４０７ｍｇ／ｄＬ、１７日４１５ｍｇ／ｄＬ、２１日４５９ｍｇ／ｄＬとなり、対照群に比べて低い血糖増加現象が現れることを確認できた。

５−２：ソジウムロバレートを腹腔投与してから６時間空腹後、血糖変化観察
ソジウムロバレートに対するより正確な抗糖尿効果測定のために、７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用い、対照群にＰＢＳ２００μＬを、実験群にソジウムロバレート１０ｍｇ／ｋｇを毎日腹腔注射後、一週間に二回ずつ血糖を測定した。この時、腹腔注射後６時間断食させた後、血糖を測定した。
その結果、図９に示したように、ソジウムロバレート１０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した実験群（ｎ＝６）においては、平均０日１４１ｍｇ／ｄＬ、３日１４２ｍｇ／ｄＬ、７日１８５ｍｇ／ｄＬ、１０日２０６ｍｇ／ｄＬ、１４日２３２ｍｇ／ｄＬ、１７日２３６ｍｇ／ｄＬ、２１日３１３ｍｇ／ｄＬとなり、実施例４−１と同様に対照群に比べて低い血糖増加現象を示した。

５−３：ソジウムロバレートの腹腔投与２８日後、ブドウ糖耐性検査（ＩＰＧＴＴ）検証
ソジウムロバレートの動物モデルにおける腹腔内ブドウ糖耐性検査（ＩＰＧＴＴ、Intraperitoneal glucose tolerance test）するために、下記のような実験を行った。
７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用い、対照群に生理食塩水を、実験群にソジウムロバレート１０ｍｇ／ｋｇを毎日２８日間腹腔注射後、生理食塩水及びソジウムロバレートを各々投与しなかった状態で１６時間空腹後、ブドウ糖（５００ｍｇ／ｍＬ、投与体積２００μＬ）を腹腔注射の方法で注入した後、０、１５、３０、６０、９０、１２０分に尾静脈から採取した血液サンプルで血糖変化を観察した。
２型糖尿動物においてグルコース皮下投与によるブドウ糖耐性変化を測定した結果、図１０に示したように、対照群（生理食塩水注射）の場合、ブドウ糖投与後、０分３４１ｍｇ／ｄＬ、１５分５７９ｍｇ／ｄＬ、３０分５５７ｍｇ／ｄＬ、６０分５８９ｍｇ／ｄＬ、９０分６００ｍｇ／ｄＬ、１２０分５５５ｍｇ／ｄＬを示し、急激に血糖が増加傾向及び非常に遅い血糖降下挙動を示すのに対して、ソジウムロバレート１０ｍｇ／ｋｇを２８日間腹腔投与した実験群においては、各々０分１５３ｍｇ／ｄＬ、１５分２９１ｍｇ／ｄＬ、３０分３６１ｍｇ／ｄＬ、６０分３８５ｍｇ／ｄＬ、９０分３３５ｍｇ／ｄＬ、１２０分２９０ｍｇ／ｄＬとなり、薬品濃度依存性として低い血糖増加及び速い血糖降下に伴う血糖正常化を確認することができた。
このような実施例５の１乃至３の結果は、本発明に係るソジウムロバレートが非常優れた抗糖尿効果を持っていることを示す。

［実施例６］
ロバル酸から新規化合物ロバリンの製造
実施例１−２のロバル酸５０ｍｇを５ｍＬのアセトンに溶解した後、０．５Ｎ ＮａＯＨを１ｍＬ添加して、常温で５分間撹はんして、０．５ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液を添加して反応を終結させた。反応混合物は、濃縮後、塩化メチレン及び水溶液（ｐＨ＝２）間の分配を介して、塩化メチレン溶解層を獲得し、濃縮して下記式で表れる新規化合物を５０ｍｇを取得した後、これを「ロバリン」と命名した：
一方、純度を高めるために、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、米国）を用いて逆相ＨＰＬＣで分析した。用いられた溶媒システムは、０．１％ギ酸が混ざった水（Ａ ｌｉｎｅ）と０．１％ギ酸が混ざったアセトニトリル（Ｂ ｌｉｎｅ）を用いた。開始は、アセトニトリル４０％から５０％まで５分、５０％から８０％まで１５分、８０％から９０％まで１０分で分析を進行して、最終純度は９６．１％であった（図１１）。

［実施例７］
新規化合物ロバリンの構造分析
実施例６で合成されたロバリンの分子構造は、高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ）及びＮＭＲ分光分析を介して解析した。
ＨＲＥＳＩＭＳの陰イオン分析は、Ｑ−ＴＯＦ ｍｉｃｒｏ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いて測定し、図１２に示したように、ロバリンは、ｍ／z４７３．１７７４の分子イオンピークを示し、これはロバリンの分子式がＣ_２５Ｈ_３０Ｏ_９であることを提示する。

ロバリンのＮＭＲスペクトル（NMR spectra）は、ロバリンをＤＭＳＯ−ｄ_６溶媒に溶解した後、ＪＥＯＬ ＥＣＰ−４００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＥＯＬ、日本）を用いて測定し、化学的移動値は、溶媒として用いたＤＭＳＯ−ｄ_６の化学的移動値（δＣ／δＨ＝４０．０／２．５０ｐｐｍ）を基準に表示した。ＨＭＱＣの場合、１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚに設定して測定し、ＨＭＢＣ実験は、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚに設定した後実行した。質量分析は、Ｑ−ＴＯＦ ｍｉｃｒｏ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。

先ず、^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル結果を見ると、図１３及び図１４に示したように、ロバリンの^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ロバル酸のＮＭＲスペクトルと非常に類似する様子を示す。従って、ロバリンの構造は、ロバル酸と非常に類似の構造を持って、分子量の差が１８ダルトン（dalton）であることを勘案すると、ロバル酸から水和反応を介して生成された化合物であることを予測することができた。ロバル酸のＮＭＲデータとロバリンのＮＭＲデータを比較すると、特に^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでロバル酸で観察されたケトン（ketone）作用基に該当する^１３Ｃピークが消えて、代わりに１０６．３ｐｐｍで^１３Ｃピークが観察され、^１Ｈ ＮＭＲでＯＨ作用基の陽性子に該当するピーク（７．６５ｐｐｍ）が観察された。このようなＮＭＲデータの差を基に、ロバリンの構造は式（７）に表れたとおり、ロバル酸のケトン作用基がヒドロキシ基の求核性攻撃によって酸素陰イオンに変わって、これは連続的に隣り合ったエステル作用基に求核性添加反応が発生しながらエステル基が分解された化合物と予測された。予測された構造は、追加的な二次元ＮＭＲ分光分析法であるＨＭＱＣ及びＨＭＢＣの分析を介して確定された（表５）。

ＨＭＱＣデータ（図１５）及びＨＭＢＣデータ（図１６）の分析を介して、ロバリンの各炭素及び水素に該当するピークの位置を確認し、このような資料はロバル酸のＮＭＲ測定値と類似することが分かった。また、ＯＨ作用基の陽性子に該当するピーク（７．６５ｐｐｍ）からＣ−６、Ｃ−７、及びＣ−８位置に該当する^１３Ｃ ＮＭＲピークにおけるＨＭＢＣ相関（correlation）は、提示されたロバリンの構造を解析する重要な資料を提供した。

［実施例８］
ロバリンのＰＴＰ−１ｂ抑制活性分析
ロバリンの蛋白質ＰＴＰ−１ｂに対する抑制活性を分析するために、分光学的に酵素活性を測定した。
即ち、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＴＰ−１ｂ（バイオニア、韓国）、ＰＴＰ−１ｂ緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０％グリセロール）にロバリン０、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎＭと基質［ｐＴｙＲ１１４６］インシュリン受容体（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加した後、常温で１０〜３０分間反応させた後、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して、常温で１０分間反応させて、ＰＴＰ−１ｂ、ロバリン及び基質との反応を終了させた後、６２０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図１７に示したように、ロバリンのＰＴＰ−１ｂに対する抑制活性度を分析した結果、ＩＣ_５０＝１４９ｎＭとなり優れたＰＴＰ−１ｂ抑制効果を示し、濃度依存的に阻害率が増加することを確認して、糖尿病及び肥満に対する薬学的な治療及び予防が可能な物質であることを確認した。

［実施例９］
ロバリンの蛋白質チロシンリン酸化酵素族に対する選択性分析
ロバリンの蛋白質チロシンリン酸化酵素族に対する選択性を調べるために、ＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７及びＰＴＰＮ１３に対する抑制活性を分光学的に酵素活性測定を介して調べた。
先ず、０.５／濃度のＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７、ＰＴＰＮ１３（バイオニア、韓国）と蛋白質チロシン脱リン酸酵素緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、０．７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０％グリセロール）にロバリン０、５０、１００、２００ｎｍと基質［ｐＴｙＲ１１４６］インシュリン受容体（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加した後、常温で１０〜３０分間反応させた後、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シグマ、米国）を添加して、常温で１０分間反応させて、基質との反応を終了させた後、６２０ｎｍで吸光度を測定した。

ロバリンの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べた結果、図１８に示したように、ロバリンはＰＴＰ−１ｂに対するＩＣ_５０＝２００ｎＭで阻害率は５２.２％であり、特にＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰＮ２）を含んだ他の蛋白質チロシンリン酸化酵素族に対する阻害活性はないことが分かった。
これにより、蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用することを示す前記実験結果は、本発明に係る化合物であるロバリンがＰＴＰ−１ｂ阻害剤で糖尿治療に利用可能であることを提示する。

［実施例１０］
疾患モデル動物に対するロバリンの効能検証
１０−１：ロバリンを腹腔投与した後、血糖変化観察
ロバリンに対する予備実験、効力実験、毒性実験、資料を基に、投与量（実験物質（ｍｇ）／実験動物の体重（Ｋｇ）で表す）を決めた。７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用いて、対照群にＰＢＳ２００μＬを、実験群にロバリン１０ｍｇ／ｋｇを毎日腹腔投与して、一週間に二回ずつ血糖を測定した。
７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）にロバリンの腹腔注射による血糖変化を測定した結果、図１９に示したように、対照群（ｎ＝６）においては、平均０日２６８ｍｇ／ｄＬ、３日３８１ｍｇ／ｄＬ、７日４０４ｍｇ／ｄＬ、１０日４３２ｍｇ／ｄＬ、１４日４５４ｍｇ／ｄＬ、１７日４７９ｍｇ／ｄＬ、２１日４８２ｍｇ／ｄＬとなり、急激に血糖が増加現象が現れたが、ロバリン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した実験群（ｎ＝６）においては、平均０日２６７ｍｇ／ｄＬ、３日２７８ｍｇ／ｄＬ、７日２９８ｍｇ／ｄＬ、１０日３１５ｍｇ／ｄＬ、１４日３５２ｍｇ／ｄＬ、１７日３７９ｍｇ／ｄＬ、２１日４２５ｍｇ／ｄＬとなり、対照群に比べて低い血糖増加現象が現れることを確認することができた。

１０−２：ロバリンを腹腔投与してから６時間空腹後、血糖変化観察
ロバリンに対するより正確な抗糖尿効果測定のために、７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用いて、対照群にＰＢＳ２００μＬを、実験群にロバリンを１０ｍｇ／ｋｇずつ毎日腹腔注射後、一週間に二回ずつ血糖を測定した。この時、腹腔注射してから６時間断食させた後、血糖を測定した。
その結果、図２０に示したように、対照群（ｎ＝６）においては、平均０日１５１ｍｇ／ｄＬ、３日１９９ｍｇ／ｄＬ、７日２６２ｍｇ／ｄＬ、１０日２９１ｍｇ／ｄＬ、１４日３９７ｍｇ／ｄＬ、１７日４５５ｍｇ／ｄＬ、２１日４８３ｍｇ／ｄＬとなり、急激に血糖が増加したが、ロバリン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した実験群（ｎ＝６）においては、平均０日１５２ｍｇ／ｄＬ、３日１４１ｍｇ／ｄＬ、７日１５５ｍｇ／ｄＬ、１０日１９８ｍｇ／ｄＬ、１４日２６１ｍｇ／ｄＬ、１７日２８７ｍｇ／ｄＬ、２１日３４０ｍｇ／ｄＬとなり、実施例１０−１と同様に対照群に比べて低い血糖増加現象を示した。

１０−３：ロバリンの腹腔投与２８日後、ブドウ糖耐性検査検証
ロバリンの動物モデルにおける腹腔内ブドウ糖耐性検査（ＩＰＧＴＴ）を測定するために、下記のような実験を行った。
７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用い、対照群に２０％ＤＭＳＯを、実験群にロバリンを１０ｍｇ／ｋｇずつ毎日２８日間腹腔注射後、２０％ＤＭＳＯ及びロバリンを各々投与しなかった状態で１６時間空腹後、ブドウ糖（５００ｍｇ／ｍＬ、投与体積２００μＬ）を腹腔注射の方法で注入した後、０、１５、３０、６０、９０、１２０分に尾静脈で採取した血液サンプルで血糖変化を観察した。
２型糖尿動物でグルコース皮下投与によるブドウ糖耐性変化を測定した結果、図２１に示したように、対照群（２０％ＤＭＳＯ腹腔投与）の場合、ブドウ糖投与後、０分２９３ｍｇ／ｄＬ、１５分４２９ｍｇ／ｄＬ、３０分５５７ｍｇ／ｄＬ、６０分５５３ｍｇ／ｄＬ、９０分５３９ｍｇ／ｄＬ、１２０分５６８ｍｇ／ｄＬを示し、急激な血糖増加傾向及び非常に遅い血糖降下挙動を示すのに対して、ＰＴＰ−１ｂ活性抑制物質ロバリン１０ｍｇ／ｋｇを投与した実験群においては、各々０分１５３ｍｇ／ｄＬ、１５分３５８ｍｇ／ｄＬ、３０分４３６ｍｇ／ｄＬ、６０分３９０ｍｇ／ｄＬ、９０分３３５ｍｇ／ｄＬ、１２０分２９０ｍｇ／ｄＬとなり、薬品濃度依存性として低い血糖増加及び速い血糖降下に伴う血糖正常化を確認することができた。
このような実施例１０の１乃至３の結果は、本発明に係る新規化合物ロバリンが非常優れた抗糖尿効果を持つことを示す。

［実施例１１］
ロバル酸から新規化合物ロバスチンの製造
実施例１−２のロバル酸５０ｍｇを５０ｍＬのアセトンに溶解した後、水を５０ｍＬ添加して撹はんさせた。２Ｎ ＮａＯＨを０．２５ｍＬ添加して、常温で１５分間撹はんして０．５ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液を添加して、反応を終結させた。反応混合物は、濃縮した後、メチルクロライド及び水溶液（ｐＨ＝２）間の分配を介して、メチルクロライド溶解層を獲得し、濃縮して、下記式（６）の新規化合物を５０ｍｇを取得した後、これを「ロバスチン」と命名した：
一方、純度を高めるために、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、米国）を用いて逆相ＨＰＬＣで分析した。用いられた溶媒システムは、０．１％ギ酸が混ざった水（Ａ ｌｉｎｅ）と０．１％ギ酸が混ざったアセトニトリル（Ｂ ｌｉｎｅ）を用いた。開始は、アセトニトリル４０％から５０％まで５分、５０％から８０％まで１５分、８０％から９０％まで１０分で分析を進行して、最終純度は９７．６％であった（図２２）。

［実施例１２］
新規化合物ロバスチンの構造分析
実施例１１で合成されたロバスチンの分子構造は、高分解能質量分析（ＨＲＥＳＩＭＳ）及びＮＭＲ分光分析を介して解析した。ＨＲＥＳＩＭＳの陰イオン分析は、Ｑ−ＴＯＦ ｍｉｃｒｏ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）を用いて測定し、図２３に示したように、ロバスチンは、ｍ／z４５５．１７０８の分子イオンピークを示し、これはロバスチンの分子式がＣ_２５Ｈ_２８Ｏ_８であることを提示した。
ロバスチンのＮＭＲスペクトルは、ＤＭＳＯ−ｄ_６溶媒に溶解した後、ＪＥＯＬ ＥＣＰ−４００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定し、化学的移動値は、溶媒として用いたＤＭＳＯ−ｄ_６の化学的移動値（δＣ／δＨ＝４０．０／２．５０ｐｐｍ）を基準に表示した。ＨＳＱＣ（1H-Detected heteronuclear Single-Quantum Coherence）の場合、１ＪＣＨ＝１４０Ｈｚに設定して測定し、ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple-Bond Coherence）実験は、ｎＪＣＨ＝８Ｈｚに設定した後、実行した。
先ず、^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトル結果を見ると、図２４及び図２５に示したように、ロバスチンの^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、式（４）のロバリンのＮＭＲスペクトルと非常に類似する様子を示した：

従って、ロバスチンの構造は、ロバリンと非常に類似の構造を持って、分子量の差が１８ダルトンであることを勘案すると、ロバリンから水分子の除去反応を介して生成された化合物であることを予測することができた。ロバリンのＮＭＲ資料とロバスチンのＮＭＲ資料を比較すると、特に^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでロバリンで観察される低磁場領域（down field shifted）で吸収ピークを示すｓｐ^３混成炭素（ロバスチンのＣ−８番、１０６．３ｐｐｍ）と脂肪族メチレン炭素の吸収ピークが消えて、代りに２個の二重結合領域で観察される吸収ピークが観察された。また、^１Ｈ ＮＭＲでロバリン化合物では存在しなかったオレフィン族水素が典型的に現れる磁場領域の吸収ピーク（６.００ｐｐｍ）が観察され、また、このピークは脂肪族メチレン基とスピン−スピンカップリングされていることがＣＯＳＹ資料の分析から確認された（図２６）。従って、ロバスチンの構造は、ロバリンで存在した三次アルコール作用基が脱水反応を介して取り除かれ８番及び９番炭素に二重結合が形成された化合物と予測された。以上のように予測されたロバスチンの構造は、追加的な二次元ＮＭＲ分光分析法であるＨＳＱＣ及びＨＭＢＣの分析を介して確定された（表６）。ＨＳＱＣ（図２７）及びＨＭＢＣ資料（図２８）の分析によってロバスチンの各炭素及び水素に該当するピークの位置を確認し、特にロバスチン構造内のＨ−５、９、１０及び１１から観察されるＨＭＢＣ相関は、提示されたロバスチンの構造を解析する重要な資料として提供された。また、Ｃ−８及びＣ−９に形成された二重結合の幾何学的立体構造は、Ｚ−型（シース型）であることが、Ｈ−５とＨ−９との間のＮＯＥ相関観察から確認された（図２９）。

［実施例１３］
ロバスチンのＰＴＰ−１ｂ抑制活性分析
ロバスチンのＰＴＰ−１ｂ抑制活性を分析するために、分光学的に酵素活性を測定した。即ち、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＰＴＰ−１ｂ（バイオニア、韓国）、ＰＴＰ−１ｂ緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ，ｐＨ８．０，０．７５ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ β−メルカプトエタノール，５０％グリセロール）にロバスチン、０、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００ｎｍと基質［ｐＴｙＲ１１４６］インシュリン受容体（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加した後、常温で１０〜３０分間反応させた後、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加して、常温で１０分間反応させて、ＰＴＰ−１ｂ阻害用化合物ロバスチン及び基質との反応を終了させた後、６２０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図３０に示したように、ロバスチンのＰＴＰ−１ｂに対する抑制活性度を分析した結果、ＩＣ_５０＝１５４.６ｎＭとなり、優れたＰＴＰ−１ｂ抑制効果を示し、濃度依存的に阻害率が増加するとことを確認して、糖尿病及び肥満に対する薬学的な治療及び予防が可能な物質であることを確認した。

［実施例１４］
ロバスチンの蛋白質チロシンリン酸化酵素族に対する選択性分析
ロバスチンの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べるために、ＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７及びＰＴＰＮ１３に対する抑制活性を分光学的に酵素活性を測定を介して調べた。先ず、０．５ｕｎｉｔ濃度のＰＴＰ−１ｂ、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ５、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ７、ＰＴＰＮ１３（バイオニア、韓国）と蛋白質チロシン脱リン酸酵素緩衝溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ，ｐＨ８．０，０．７５ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ β−メルカプトエタノール，５０％グリセロール）に、ロバスチン０、５０、１００、２００ｎＭと基質［ｐＴｙＲ１１４６]インシュリン受容体（１１４２−１１５３、シグマ、米国）を添加した後、常温で１０〜３０分間反応させた後、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｍｏｌｙｂｄａｔｅ Ｄｙｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シグマ、米国）を添加して、常温で１０分間反応させて、基質との反応を終了させた後、６２０ｎｍで吸光度を測定した。
ロバスチンの蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する選択性を調べた結果、図３１に示したように、２００ｎＭロバスチンでＰＴＰ−１ｂに対するＩＣ_５０阻害率は、４７．９６％であり、特にＴＣ−ＰＴＰ（ＰＴＰＮ２）を含んだ他の蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族に対する阻害活性はないことが分かった（図３１）。
これにより、蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用することを示す前記実験結果は、本発明に係る化合物であるロバスチンがＰＴＰ−１ｂ阻害剤として糖尿治療に利用可能であることを提示する。

［実施例１５］
ロバスチンの糖尿病疾患モデル動物に対する効能検証
１５−１：ロバスチンを腹腔投与した後、血糖変化観察
ロバスチンに対する予備実験、効力実験、毒性実験、資料を基に、投与量（実験物質（ｍｇ）／実験動物の体重（Ｋｇ）で表す）を定めた。７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用い、対照群にＰＢＳ２００μＬを、実験群にロバスチン１０ｍｇ／ｋｇを毎日腹腔投与して、一週間に二回ずつ血糖を測定した。
７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）にロバスチンの腹腔注射による血糖変化を測定した結果、図３２に示したように、対照群（ｎ＝６）においては、平均０日２７１ｍｇ／ｄＬ、７日３２６ｍｇ／ｄＬ、１４日４７９ｍｇ／ｄＬ、２１日４８６ｍｇ／ｄＬとなり、急激な血糖増加現象が現れたが、ロバスチン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した実験群（ｎ＝６）においては、平均０日２９９ｍｇ／ｄＬ、７日２５９ｍｇ／ｄＬ、１４日２６７ｍｇ／ｄＬ、２１日２４２ｍｇ／ｄＬとなり、対照群に比べて低い血糖増加現象が現れることを確認することができた（図３２）。

１５−２：ロバスチンを腹腔投与してから６時間空腹後、血糖変化観察
ロバスチンに対するより正確な抗糖尿効果測定のために、７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用いて、対照群にＰＢＳ２００μＬを、実験群にロバスチンを１０ｍｇ／ｋｇずつ毎日腹腔注射後、一週間に二回ずつ血糖を測定した。この時、腹腔注射してから６時間断食させた後、血糖を測定した。
その結果、図３３に示したように、対照群（ｎ＝６）においては、平均０日１３４ｍｇ／ｄＬ、７日２３８ｍｇ／ｄＬ、１４日３５０ｍｇ／ｄＬ、２１日４７９ｍｇ／ｄＬとなり、急激な血糖増加現象が現れたが、ロバスチン１０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した実験群（ｎ＝６）においては、平均０日１３４ｍｇ／ｄＬ、７日１８２ｍｇ／ｄＬ、１４日１６２ｍｇ／ｄＬ、２１日２０４ｍｇ／ｄＬとなり、実施例５−１と同様に対照群に比べて低い血糖増加現象を見せた。

１５−３：ロバスチンの腹腔投与２８日後、ブドウ糖耐性検査検証
動物モデルにロバスチンを腹腔投与した後、ブドウ糖耐性検査（ＩＰＧＴＴ）を行うために、下記のような実験を行った。
７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿モデル動物、Ｃ５７／ＢＬＫＳ／Ｊ−ｄｂ／ｄｂ、韓国生命工学研究院）を用い、対照群に２０％ＤＭＳＯを、実験群にロバスチンを１０ｍｇ／ｋｇずつ毎日２８日間腹腔注射後、２０％ＤＭＳＯ及びロバスチンを各々投与しなかった状態で１６時間空腹後、ブドウ糖（５００ｍｇ／ｍＬ、投与体積２００μＬ）を腹腔注射の方法で注入した後、０、１５、３０、６０、９０、１２０分に尾静脈で採取した血液サンプルで血糖変化を観察した。

２型糖尿動物でグルコース皮下投与によるブドウ糖耐性変化を測定した結果、図３４に示したように、対照群（２０％ＤＭＳＯ腹腔投与）の場合、ブドウ糖投与後、０分２０４ｍｇ／ｄＬ、１５分４９６ｍｇ／ｄＬ、３０分５７２ｍｇ／ｄＬ、６０分５４２ｍｇ／ｄＬ、９０分４８３ｍｇ／ｄＬ、１２０分４２４ｍｇ／ｄＬを示し、急激な血糖増加傾向及び非常に遅い血糖降下挙動を示すのに対して、ロバスチン１０ｍｇ／ｋｇを投与した実験群においては、各々０分１５２ｍｇ／ｄＬ、１５分２２９ｍｇ／ｄＬ、３０分３０７ｍｇ／ｄＬ、６０分２０５ｍｇ／ｄＬ、９０分１６２ｍｇ／ｄＬ、１２０分１４７ｍｇ／ｄＬとなり、薬品濃度依存性として低い血糖増加及び速い血糖降下に伴う血糖正常化を確認することができた（図３４）。このような実施例１５−１乃至１５−３の結果は、本発明に係る新規ロバスチンが非常に優秀な抗糖尿効果を持つことを示す。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

以上述べたように、本発明に係る新規化合物は、ＰＴＰ−１ｂ阻害活性が非常に優れており、蛋白質チロシン脱リン酸化酵素族中ＰＴＰ−１ｂにだけ選択的に作用して、実質的なＰＴＰ−１ｂ阻害剤として糖尿治療に利用可能であるため、糖尿病及び肥満の予防、または治療に効果的である。

Claims (18)

1. 下記式（３）で表される化合物：
   （ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される）。
2. 前記化合物は、下記式（４）で表されることを特徴とする請求項１に記載の化合物：
   
3. 下記の工程を含む下記式（４）で表される化合物の製造方法：
   （ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
   （ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
   （ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）、またはメタノール水溶液で溶出させ、ロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
   （ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、塩基を添加して撹はんした後、酸性溶液を添加して反応を終結させた後、下記式（４）で表される化合物を取得する工程：
   
4. 前記工程（ｄ）で溶媒はアセトンであり、塩基はＮａＯＨまたはＫＯＨであり、酸性溶液はＨＣｌ溶液、Ｈ_２ＳＯ_４溶液またはＨＮＯ_３溶液であることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
5. 前記工程（ｄ）の終結した反応液を濃縮した後、メチレンクロライド、クロロホルム、またはエチレンクロライド及び水溶液間の分配を介してメチレンクロライド、クロロホルムまたはエチレンクロライド溶解層を獲得し、濃縮して下記式（４）で表される化合物を取得することを特徴とする請求項３に記載の製造方法：
   
6. 下記式（３）で表される化合物、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物：
   （ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される）。
7. 前記化合物は、下記式（４）で表されることを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物：
   
8. 下記式（３）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品：
   （ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される）。
9. 前記化合物は、下記式（４）で表されることを特徴とする請求項８に記載の機能性食品：
   
10. 下記式（５）で表される化合物：
    （ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される）。
11. 前記化合物は、下記式（６）で表されることを特徴とする請求項１０に記載の化合物：
    
12. 下記の工程を含む下記式（６）で表される化合物の製造方法：
    （ａ）ステレオカウロンアルピヌムをメタノールで抽出する工程；
    （ｂ）工程（ａ）で取得されたステレオカウロンアルピヌム抽出物をカラムクロマトグラフィーを利用してメタノールまたはアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）水溶液で溶出する工程；
    （ｃ）工程（ｂ）で溶出された分画を逆相高速液体クロマトグラフィーを利用してアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）またはメタノール水溶液で溶出させロバル酸を含有する分画を取得する工程；及び
    （ｄ）前記ロバル酸を含有する分画を溶媒に溶解した後、水と塩基を添加して撹はんしてから、酸性溶液を添加して反応を終結させた後、下記式（６）で表される化合物を取得する工程：
    
13. 前記工程（ｄ）で溶媒はアセトンであり、塩基はＮａＯＨまたはＫＯＨであり、酸性溶液はＨＣｌ溶液、Ｈ_２ＳＯ_４溶液またはＨＮＯ_３溶液であることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
14. 前記工程（ｄ）の終結した反応液を濃縮した後、メチレンクロライド、クロロホルム、またはエチレンクロライド及び水溶液間の分配を介してメチレンクロライド、クロロホルムまたはエチレンクロライド溶解層を獲得し、濃縮して下記式（６）で表される化合物を取得することを特徴とする請求項１２に記載の製造方法：
    
15. 下記式（５）で表される化合物、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または治療用医薬組成物：
    （ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される）。
16. 前記化合物は、下記式（６）で表されることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物：
    
17. 下記式（５）で表される化合物を有効性分として含有する糖尿病若しくは肥満の予防、または改善用機能性食品：
    （ここで、前記Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、アリル基、アリールアルキル基及びアシル基からなる群から選択される）。
18. 前記化合物は、下記式（６）で表されることを特徴とする請求項１７に記載の機能性食品：